EA006478B1 - Способ мелиорации посредством взрывной и биологической обработки и применение микроорганизмов для осуществления этого способа - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к способу увеличения плодородия земель (мелиорации) предпочтительно путем рекультивации почвы, включающему следующие этапы: (i) размещение в почве веществ, пригодных для улучшения почвы, и взрывчатых веществ; и (ii) перемешивание материалов, пригодных для улучшения (восстановления) почвы, с загрязненной почвой путем взрыва. Изобретение также относится к способам получения выделения микроорганизмов, пригодных для разложения гидрофобных загрязняющих веществ, компонентов и производных нефти путем их отбора и выделения из почвы, к самим микроорганизмам, их применениям и к наборам для увеличения и восстановления плодородия почвы. Изобретение может быть использовано, в частности, при рекультивации почв, загрязненных компонентами нефти и ее производными.

Description

Область техники

Данное изобретение направлено на решение задач, связанных с мелиорацией - увеличением плодородия почвы, достигаемого путем перемешивания почвы с материалами, необходимыми для ее восстановления, при помощи взрывной обработки. Изобретение посвящено способам восстановления загрязненных почв посредством использования специально выведенных микроорганизмов. Изобретение также относится к способам получения микроорганизмов в изолированной форме, к самим микроорганизмам, их применению, а также к наборам для мелиорации и рекультивации почвы.

Способ восстановления плодородия почв (рекультивации) предпочтительно включает следующие этапы:

размещение на загрязненной почве или вблизи от нее, под поверхностью почвы микроорганизмов, пригодных для разложения или инактивирования по меньшей мере одного вида загрязняющих веществ и способных эффективно действовать как в аэробных, так и в анаэробных условиях, а также взрывчатых веществ;

перемешивание загрязненной почвы с микроорганизмами и факультативно используемыми добавками, улучшающими условия существования микроорганизмов, осуществляемое посредством взрыва; и предоставление возможности микроорганизмам действовать в почве.

Предшествующий уровень техники

В большинстве случаев рекультивация загрязненной почвы происходит при помощи живых организмов, и обычно с этой целью используются микроорганизмы (1, 2).

Эффективная биологическая рекультивация может быть достигнута, если микроорганизмы (11), устойчивые к определенным загрязняющим веществам и способные их разлагать, используются в их естественных условиях (параметрами которых являются температура, влажность, концентрация кислорода, питание). Таким образом, представляется важным внесение добавок, оказывающих положительное влияние на функции микроорганизмов и их эффективность в восстановлении почвы (например, микро- и макроэлементов, углерода, азота, фосфора, серы, марганца и др.) (11).

При этом является важным, чтобы необходимые добавки и микроорганизмы, применяемые при биологической очистке, были рассеяны или иным образом распределены в загрязненной среде. В настоящее время существует несколько путей решения этой проблемы.

При восстановлении почв добавляемые вещества и микроорганизмы обычно вносятся путем фильтрации (с использованием силы тяжести), впрыскивания или перемешивания с землей (5, 6). Эти технологии либо не обеспечивают необходимого перемешивания, либо требуемое распределение веществ в загрязненной почве происходит очень медленно. К тому же этот процесс сложно контролировать.

При использовании другого метода, часто применяемого на практике, образцы загрязненной почвы перемешиваются с веществами, увеличивающими разложение загрязняющих веществ, и далее эта смесь возвращается на поле (призменная технология). Этот метод является весьма дорогостоящим, особенно при очистке от глубоко расположенных загрязнений или в случае больших размеров обрабатываемой территории.

Настоящее изобретение основано на том, что вышеперечисленные проблемы могут быть экономично и эффективно решены путем перемешивания почвы и выбранных для этой цели микроорганизмов (предпочтительно с применением добавок) методом взрывания. Новый способ был назван биовзрывом.

Из предшествующего уровня техники известны микроорганизмы, разрушающие различные загрязняющие вещества, компоненты нефти (минеральные масла) и их производные. Известны и методы их селекции. Принцип этих методов заключается в том, что эти микроорганизмы питаются веществом, подлежащим разложению, в качестве единственного источника углерода. Насколько известно авторам настоящего изобретения, способность микроорганизмов к выработке поверхностно-активных веществ не была исследована.

Например, таковыми являются микроорганизмы, производимые компанией 011 С1еашпд ΒίοРтобис18 Ыб. Р.О.Вох 46, ЕоуДоп. НетЙотбкЫге 808 9ΡΌ и.К., в том числе продукты Недгет и НедЬооД (описания продуктов прилагаются).

Однако необходимость дальнейшего развития способов селекции, которые приведут к выведению эффективно действующих микроорганизмов с высокой степенью надежности, и которые имеют четкие критерии отбора, еще существует.

Используемые термины

Термин почва включает в себя целый комплекс почвенных слоев, начиная от поверхностных (горизонт А или гумусный слой) и заканчивая глубочайшим, находящимся в непосредственном контакте с материнской породой или непроницаемым слоем, так называемым слитым слоем (геологический слой или Ό-горизонт).

Фраза, что лунки расположены по существу в чередующемся порядке относится к расположению лунок, согласно которому лунки с идентичным содержимым не могут находиться в непосредственной близости друг к другу в большом количестве; предпочтительно не более 5 лунок, а более предпочтительно не более 3 лунок с идентичным содержанием могут находиться вблизи друг от друга.

Термин по существу одинаковые расстояния используется в связи с расположением лунок, со

- 1 006478 гласно которому на данной части области, содержащей лунки, расстояние между лунками является, по существу, идентичным, т.е. расстояния варьируют не более чем на 50, на 40, на 30, на 20%, а наиболее предпочтительно не более чем на 10 или 5% по меньшей мере в одном направлении, предпочтительно во всех направлениях в плоскости.

Под термином компонент нефти (нефтяной компонент) имеется в виду любой компонент, фракция или любая смесь из нефтяного сырья.

Словосочетание производное нефти означает любое искусственное производное нефти или любого ее компонента или производное, полученное путем негеологического процесса.

Термин поверхностно-активное вещество обозначает любое поверхностно-активное вещество (сурфактант).

Под термином микроорганизм понимается живой организм, имеющий одно-, много- или неклеточную структуру. Предпочтительными являются одноклеточные организмы, которые являются предметом изучения микробиологии. Микроорганизмами являются преимущественно водоросли (особенно сине-зеленые), бактерии и грибы.

Штамм микроорганизмов - это чистая культура микроорганизмов, развившаяся из одиночной клетки, предпочтительно самоподдерживающая культура данного вида или культура, поддерживаемая путем регулярного субкультивирования.

Сущность изобретения

Таким образом, в одном из аспектов изобретение относится к способу улучшения качества почвы, который включает в себя следующие этапы:

(ί) размещение в почве материалов, пригодных для улучшения почв, и взрывчатых веществ, (й) перемешивание материалов, пригодных для улучшения (восстановления) почвы, с загрязненной почвой путем взрыва.

Предпочтительно в способе согласно изобретению степень загрязненности почвы снижается путем (ί) размещения в загрязненной почве или вблизи от нее, под поверхностью почвы микроорганизмов, пригодных для разложения и инактивирования по меньшей мере одного вида вещества, вызывающего загрязнение, которые, при желании (факультативно), могут быть устойчивы к указанному веществу, взрывчатых веществ и предпочтительно добавок, улучшающих условия существования микроорганизмов, и/или способствующих их распространению, и/или их почвоулучшающему действию;

(й) перемешивания загрязненной почвы и внесенных веществ и микроорганизмов путем взрывания;

(ш) предоставления возможности микроорганизмам действовать в почве.

Предпочтительно микроорганизмы, взрывчатые вещества и факультативно добавляемые вещества размещаются в лунках, вырытых (пробуренных) в почве. Лунки располагаются на расстоянии от 0,5 до 5 м, предпочтительно на расстоянии от 1,5 до 2 м друг от друга, при этом предпочтительно, чтобы микроорганизмы и взрывчатые вещества располагались в различных лунках. Лунки, содержащие взрывчатые вещества и не содержащие их, должны чередоваться предпочтительно, по существу, через равные расстояния, более предпочтительно они должны располагаться с образованием геометрической сетки.

Предпочтительно добавки, улучшающие условия существования микроорганизмов и/или способствующие разложению, вносятся в почву после взрыва, например, путем аэрации, инфильтрации или впрыскивания. В качестве наиболее предпочтительных могут применяться следующие добавки:

вещества, способствующие бескислородному дыханию, предпочтительно окислительно-восстановительные системы, и/или акцепторы электронов, и/или акцепторы протонов; более предпочтительны соединения металлов, имеющие более чем одну степень окисления и/или нитрит-, нитрат-, хлорит-, хлорат-, перхлорат-, фосфат-, пирофосфат-, сульфит-, сульфат-, пиросульфат-ионы или их соли;

ионы металлов, микроэлементы, увеличивающие активность ферментов, в частности ионы Ее, Си, N1, Со, Мп, Мд, Ζη, Са;

источники углерода, предпочтительно глюкоза, сахароза, меласса, глицерин, соли уксусной кислоты, ксантан;

источники азота, предпочтительно пептон, нитрит-, нитрат-ионы, ион аммония или их соли;

источники фосфора, предпочтительно фосфат-, пирофосфат-ионы или их соли;

источники серы; сульфат-, пиросульфат-ионы и их соли; поверхностно-активные вещества и/или сурфактанты, предпочтительно Т\гееп 20, Т\гееп 40, Т\гееп 80, нонит, ДМСО (диметилсульфоксид);

вещества, увеличивающие адгезию к поверхности, предпочтительно биологически деградируемые, ксантан.

Сила взрыва предпочтительно выбирается таким образом, чтобы в результате взрыва происходило, как максимум, повреждение лишь малой части микроорганизмов. Более предпочтительно, чтобы в результате взрыва вообще не происходило повреждения микроорганизмов или их «обнажения» (т.е. попадания или выхода на поверхность почвы).

В соответствии с наиболее предпочтительной формой осуществления изобретения веществом, вы- 2 006478 зывающим загрязнение (загрязняющим веществом или загрязнителем) являются компоненты нефти или их производные.

Еще в одном аспекте изобретение относится к способу получения микроорганизмов в изолированной форме. Указанные микроорганизмы являются пригодными для разложения гидрофобных загрязняющих веществ, компонентов нефти или их производных и способны проявлять активность в их разложении на границе гидрофобной фазы, включающей в себя указанные гидрофобные загрязняющие вещества, компоненты нефти или их производные, и гидрофильной фазы. Указанный способ включает в себя следующие этапы:

(ί) нанесение пленки, содержащей компоненты нефти или их производные на минимальную среду с недостатком углерода;

(ίί) инокуляция указанной среды пробой, содержащей смесь микроорганизмов, причем указанная проба получена из нефтяного загрязняющего вещества, и инкубирование среды после инокуляции, по меньшей мере, до момента образования обнаружимых колоний микроорганизмов;

причем, если формирования колоний не происходит в течение произвольно определенного периода времени, то этапы (ί) и (й) повторяют;

(ίίί) определение разлагающей активности микроорганизмов из образовавшихся колоний, осуществляемое по краю колоний;

(ίν) проверка способности микроорганизмов, обладающих разлагающей активностью, полученных из образовавшихся колоний, к продуцированию поверхностно-активных веществ, и отбор микроорганизмов, способных к продуцированию поверхностно-активных веществ.

Предпочтительно микроорганизмы являются факультативными анаэробами, которые получают путем использования минимальной (питательной) среды, включающей вещества, способствующие бескислородному (аноксическому) дыханию, предпочтительно акцепторы электронов и/или источники кислорода, в частности, один или более из следующих: соединения титана (Τί), соединения марганца (Мп), нитрит-, нитрат-, фосфат-, пирофосфат-ионы или их соли. При этом предпочтительно инкубацию осуществляют, по меньшей мере, частично в анаэробных условиях.

В предпочтительной форме осуществления изобретения разлагающая активность определяется путем анализа концентрации загрязняющего вещества в пробе, взятой в близком окружении, и/или в непосредственной близости от колоний, и/или на основании оценки диаметра разложившейся области.

В качестве активности разложения может определяться, например, активность разложения парафина или ферментативная активность разложения типичных загрязняющих компонентов нефти (нефтепродуктов) предпочтительно путем взятия образцов (проб), их экстракции в растворителе и последующего использования метода газовой хроматографии. Для изучения способности микроорганизмов из полученных колоний к продуцированию поверхностно-активных веществ может использоваться, например, метод гидрофобно-гидрофильных капельных проб.

Еще в одном аспекте изобретение относится к микроорганизмам, пригодным для разложения компонентов нефти или их производных, которые способны проявлять активность в разложении указанных веществ на границе гидрофобной фазы, включающей указанные гидрофобные загрязняющие вещества, компоненты нефти или их производные, и гидрофильной фазы, причем указанные микроорганизмы продуцируют по меньшей мере один фермент, способный разлагать компоненты нефти или их производные, и по меньшей мере одно поверхностно-активное вещество.

Предпочтительно микроорганизмы являются штаммами видов Вас111ик киЫ1Шк, ВасШик сегеик, рода Ркеиботопак или рода ХапШотоиак и предпочтительно представляют собой факультативные анаэробы.

Особенно предпочтительно, чтобы разлагающая активность микроорганизмов, определяемая путем культивирования в среде, загрязненной любым из следующих нефтяных загрязняющих веществ: гидрофобные отложения, асфальтен, мальтен, 5% асфальтен в смеси с нефтью, была в среднем по меньшей мере в 1,2 раза, более предпочтительно в 1,5 или 2 раза, а наиболее предпочтительно в 3 раза выше, чем наблюдаемая у микроорганизмов Недгет и НедЫоок!.

Изобретение также относится к микроорганизмам, которые могут быть получены способом согласно изобретению, предпочтительно к любому из следующих штаммов, депонированных 17 апреля 2002 г. в Национальной Коллекции Сельскохозяйственных и Промышленных Микроорганизмов (Иа1юпа1 Со11ес1юп о£ Адг1си11ига1 апб 1пбик1па1 Мюгоогдашктк, ЫСА1М): ЫСА1М (Р) В 1304, ЫСА1М (Р) В 1305, Νί,’ΑΙΜ (Р) В 1306, ЫСА1М (Р) В 1307, ЫСА1М (Р) В 1308, или любому штамму, полученному из них.

Микроорганизмы могут быть генетически модифицированы, предпочтительно они могут содержать фрагмент ДНК с известной последовательностью, встроенный в их геном.

Еще в одном аспекте изобретение относится к применению микроорганизмов согласно изобретению для разложения загрязнения почвы, вызванного компонентами нефти или их производными.

Еще в одном аспекте изобретение относится к набору для рекультивации почв или мелиорации почв, включающему носитель информации с инструкцией по применению, содержащей инструкции по осуществлению любого этапа любого из способов, согласно изобретению, как они определены в любом из пунктов с 1 по 9 нижеследующей формулы изобретения, причем указанный набор дополнительно включает по меньшей мере один вид веществ, применимых в способах, согласно изобретению, как они

- 3 006478 определены в любом из пп. с 1 по 9 нижеследующей формулы изобретения.

Указанный набор содержит предпочтительно микроорганизмы согласно изобретению и наиболее предпочтительно дополнительно содержит один или более элементов из группы, включающей взрывчатые вещества, вспомогательные средства для взрывания, добавки, обеспечивающие или улучшающие условия существования микроорганизмов, или повышающие их эффективность. Наиболее предпочтительно набор содержит один или более видов из указанных добавок.

Краткое описание графических материалов

На фиг. 1 показаны колонии выделенных (изолированных) бактерий, штрихами посеянные (инокулированные) на тонкую пленку загрязняющего вещества в трех чашках Петри. Можно видеть, что загрязняющие вещества, окружающие колонии, разложены или трансформированы. Этот эффект наблюдается в виде очищенного или обесцвеченного участка вокруг колоний. Для характеристики разлагающей активности микроорганизмов можно измерить ширину (диаметр) осветленной (обесцвеченной) полосы.

Фиг. 2 иллюстрирует исследование способности полученных штаммов микроорганизмов (фили) к продуцированию поверхностно-активных веществ. При помощи метода гидрофобно-гидрофильных капельных проб можно оценить разницу между растекающимися и нерастекающимися каплями.

На фиг. 3 показано действие некоторых штаммов микроорганизмов - описанное с использованием метода хроматографии - на содержание углерода в парафиновом образце (для образца V см. фиг. 3а, для образца II см. фиг. 3б) после инкубации в течение одной недели. На столбчатой диаграмме показано (выраженное в процентах) отношение площади под характеристической кривой неразложившейся пробы к площади под кривой всей неразложившейся массы. Отметки на вертикальной оси означают следующие штаммы микроорганизмов:_________________________________________________________

КеП	Недгет’
Ре! II	НедЬоогГ
А	МОБ-2	ΝΟΑΙΜ (Р) В 1304
В	МОБ-32	ΝΟΑΙΜ (Р) В 1305
С	МОБ-51	ΝΟΑΙΜ (Р) В 1306
0	МОБ-66	ΝΟΑΙΜ (Р) В 1307
Е	МОБ-107	ΝΟΑΙΜ (Р) В 1308
Е	МОБ-113	Штамм рода Рзеидотопаз, полученный изобретателями

* производятся компанией Ой С1еапт§ Вю-РгойисГз Ый. Р.О.Вох 46, Κον^Ιοη. НегПогйзЫге 808 9РБ и.К., см. также описания продуктов в Интернете на сайте производителя: млхлг.осЬр.со.ик.

На фиг. 4а и 4б показано использованное на практике размещение лунок, выкопанных в почве. Микроорганизмы могут находиться в одних и тех же или в разных лунках.

На фиг. 5а можно видеть уменьшение количества загрязняющих веществ в почве, выраженное в процентах, в зависимости от времени.

На фиг. 5б показаны этапы экспериментов на почве.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

В приведенных ниже примерах, не ограничивающих объема изобретения, описаны некоторые примеры осуществления изобретения, например ) условия взрыва, вещества и параметры, благоприятно воздействующие на условия существования микроорганизмов во взорванной почве,

2) способ селекции, используемый для отбора микроорганизмов, пригодных для биологической очистки почвы, и свойства отобранных предпочтительных микроорганизмов.

Почва, обработанная путем биовзрыва, становится сильно разрыхленной в результате такого воздействия. Сила взрыва может быть установлена в зависимости от структуры почвы, концентрации загрязняющих веществ и их расположения по глубине, и рассчитывается в зависимости от поверхности и площади загрязнения. Для достижения поставленной цели представляется целесообразным полное перемешивание микроорганизмов и веществ, обеспечивающих или увеличивающих их жизненные функции (добавок), с загрязненной почвой, при этом необходимо избегать попадания этих веществ и микроорганизмов на поверхность почвы. С этой целью необходимо рассчитать силу взрыва и, в любом случае, она должна быть умеренной.

В большинстве случаев предпочтительно равномерное распределение микроорганизмов и добавок, а также, по возможности, одинаковое распределение силы взрыва. Безусловно, если почва негомогенна, или распределение загрязняющих веществ неравномерно, другие аспекты также следует принимать во внимание.

Таким образом, при применении способа согласно изобретению микроорганизмы, взрывчатые вещества и факультативно используемые другие вещества располагаются в вырытых в земле (почве) лун

- 4 006478 ках, которые находятся на расстоянии от 0,5 до 5 м, предпочтительно от 1 до 3 м, более предпочтительно от 1,5 до 2 м друг от друга. Эффективность биологической очистки почвы, в зависимости от загрязняющего вещества, может контролироваться путем изменения расстояния между лунками и количества микроорганизмов.

Микроорганизмы, взрывчатые вещества и, по желанию, добавки могут быть расположены в одних и тех же лунках (в таких случаях взрывчатые вещества целесообразно располагать ниже), при этом необходимо обеспечить, чтобы в месте взрыва выжило количество микроорганизмов, достаточное для достижения желаемого эффекта биологического восстановления (рекультивации). (В некоторых случаях для защиты микроорганизмов может применяться защитный слой). Более предпочтительным является вариант, при котором взрывчатые вещества и микроорганизм(ы) (при желании вместе с добавкой(добавками)) располагаются в различных лунках. Наиболее предпочтительно, чтобы взрывчатые вещества, микроорганизмы и добавки располагались в отдельных лунках.

Глубина лунок, расположение в них микроорганизмов, взрывчатых веществ и добавок и сила взрыва выбираются таким образом, чтобы избежать повреждений, по меньшей мере, больших, чем это необходимо, и попадания веществ (микроорганизмов и добавок) на поверхность почвы (см. пример 5). Предпочтительная сила взрыва в большинстве случаев сравнительно невелика.

В предпочтительной форме осуществления лунки располагаются, по существу, на одинаковых расстояниях друг от друга, предпочтительно, по существу, образуя геометрическую сетку, например, рядами и/или колонками. Наиболее предпочтительным является чередующееся расположение лунок, содержащих взрывчатые вещества и не содержащих их. Например, если в лунках заключено всего два вида содержимого (например, микроорганизмы и взрывчатое вещество), они обычно располагаются в шахматном порядке, а если три типа (например, микроорганизмы, взрывчатое вещество и добавка), то предпочтительной является триангуляционная модель размещения. Взрыв может осуществляться даже в грунтовых (подземных) водах, ниже уровня грунтовых вод, если взрывчатое вещество является водостойким или не чувствительным к воде. Например, он может быть заключен в специальные пластиковые сосуды (ампулы) или пакеты, например в тонкие длинные гибкие трубки (шланги), которые защищают инициирующий заряд и взрыватель от воды. В качестве материала для таких средств может использоваться поливинилхлорид или любая подходящая полимерная пленка.

Глубина взрыва и площадь взрываемой территории определяются расположением загрязняющих веществ (или площадью поверхности почвы, подлежащей регенерации). При необходимости взрыв может быть произведен на произвольной глубине, т.е. можно обрабатывать не только поверхностные слои почвы, но и ее глубинные слои, при этом целесообразно осуществлять обработку вплоть до первого непроницаемого слоя. Таким образом, рекультивация почв может осуществляться и в глубинных слоях почвы при использовании микроорганизмов, стойких к анаэробным условиям.

Предпочтительными взрывчатыми веществами являются те, которые не имеют слишком высокой скорости детонации (скорости горения заряда) и не наносят микроорганизмам повреждений или наносят минимальные повреждения. Такой эффект, безусловно, зависит и от расположения лунок и находящихся в них материалов. Скорость детонации выбранных взрывчатых веществ, кроме деструктивного эффекта, оказывает также значительное, если не доминирующее, выбрасывающее действие (взрывчатые вещества замедленного действия). Таким образом, предпочтительными являются взрывчатые вещества, используемые при разработке полезных ископаемых (в горной промышленности, при минировании). Предпочтительно, чтобы скорость детонации была меньше чем 7000 м/с, более предпочтительно меньше чем 6000 м/с, еще более предпочтительно меньше чем 5000 м/с, но в то же время больше чем 500 или 1000 м/с, предпочтительно более 2000 или 3000 м/с, например от 3500 до 4000 м/с. Разумеется, эффективность и сила взрыва зависят не только от скорости детонации, но и от расположения и количества взрывчатых веществ и других свойств взрывчатых веществ, например, таких как теплота взрыва, удельный объем газа, удельное давление и т. д. Выбор взрывчатых веществ с соответствующими параметрами (характеристиками) для решения конкретной задачи и определение необходимого размещения используемых материалов могут быть определены специалистом в данной области.

Предпочтительно, чтобы компоненты, образующиеся после взрыва из взрывчатых веществ, не причиняли ущерба почве и микроорганизмам (чтобы они не были токсичны для микроорганизмов), при этом предпочтительным является применение таких материалов, которые приводят к образованию полезных веществ. Например, к таким относятся вещества, содержащие нитрат-ион или нитратную группу, например, взрывчатые вещества, включающие в свой состав ΝΗ₄ΝΟ₃, в частности паксит.

На основе настоящего описания специалист в области пиротехники может легко рассчитать условия и необходимую силу взрыва.

При желании дополнительным этапом предложенного способа может быть послевзрывная обработка. Примером такой обработки может быть аэрация, инфильтрация, впрыскивание или обработка паром (распаривание).

Аэрация осуществляется, например, при использовании аэробных микроорганизмов или при таком состоянии почвы, при котором наблюдается нехватка кислорода. Трещин и разломов в почве, образовавшихся в результате детонации, может быть недостаточно для обеспечения достаточного поступления

- 5 006478 кислорода. В этом случае кислород закачивается в почву после взрывной обработки, например путем размещения в почве перфорированных трубок. Для закачивания воздуха используется компрессор.

Аэрация особенно важна, если трещин вовсе не образовалось либо они быстро исчезли, например при работе с рыхлым почвенным грунтом, таким как песок или влажная земля. Также представляется целесообразным проведение аэрации, если загрязняющие вещества располагаются в низколежащих слоях почвы и взрыв осуществляется там же.

После детонации также может оказаться полезным введение в почву активных веществ предпочтительно с использованием методов инфильтрации и впрыскивания для улучшения условий существования микроорганизмов и/или увеличения скорости разложения загрязняющих веществ. Так, например, могут быть добавлены разбавленные растворы нитратов, сульфатов или фосфатов. Данная процедура особенно важна в случае истощенности почвы по источникам этих веществ, или если при взрывании эти вещества были внесены в почву в недостаточном количестве. Последующее улучшение почвы является важным и в иных аспектах, при этом предпочтительно добавлять только те вещества, которые не конкурируют с микроорганизмами.

При образовании достаточного количества трещин лучшим способом для дополнительной обработки является инфильтрация. Другим используемым методом является впрыскивание, которое осуществляется путем использования перфорированных трубок.

Влажность и/или температурный режим почвы могут быть улучшены при использовании обработки паром.

Способ согласно изобретению может использоваться и просто для увеличения плодородия почвы. В этом случае взрывчатые вещества вместе с веществами, увеличивающими плодородие почвы, вносятся в грунт и взрываются вышеописанным способом.

Технология биологического взрыва (биовзрыва) может быть использована для любых биологически разложимых загрязняющих веществ. Для осуществления этого метода могут использоваться любые микроорганизмы, способные к эффективному разложению и/или инактивирования загрязняющих веществ. Эта технология универсальна, поскольку некоторые микроорганизмы, обладающие необходимыми свойствами, хорошо известны, а много большая часть еще будет выделена в будущем, и они также смогут применяться в этой технологии.

Микроорганизмы, используемые для разложения загрязняющих веществ, могут быть выделены из окружающей среды, предпочтительно из загрязненной почвы, или могут использоваться коммерчески доступные микроорганизмы или генетически улучшенные штаммы, такие как описанные ранее (3, 4).

Безусловным преимуществом является устойчивость микроорганизмов к действию загрязняющих веществ (7), а также их способность к продуцированию поверхностно-активных веществ или ферментов, способных к разложению загрязняющих веществ, а предпочтительно и того, и другого.

С точки зрения потребления кислорода, различают аэробные, анаэробные и факультативно анаэробные микроорганизмы (11). С точки зрения устойчивости используемых микроорганизмов к температурным условиям, различают микроорганизмы, предпочитающие низкие температуры (психрофильные), микроорганизмы, предпочитающие средние температурные условия (мезофильные) и микроорганизмы, предпочитающие повышенные температуры (термофильные). При биологической рекультивации почвы мезофильно-аэробные, термофильно-анаэробные и факультативно анаэробные микроорганизмы превосходят другие по эффективности действия и рентабельности.

В некоторых случаях может требоваться, чтобы микроорганизмы, используемые при биологической рекультивации, были непатогенными (1, 2), другими словами, они не должны вызывать заболеваний ни у растений, ни у животных, ни у людей. В других случаях могут использоваться даже микроорганизмы, способные вызывать заболевания, при условии их дальнейшей гибели или в случаях, если они не оказывают воздействия на людей, в таком случае они могут применяться одновременно в качестве пестицидов или гербицидов.

Микроорганизмы могут быть генетически модифицированы, например, полезным является включение в их геном фрагментов ДНК с известной последовательностью в качестве маркеров.

Для достижения максимального эффекта биологической очистки (восстановления) почв, может осуществляться улучшение условий существования микроорганизмов, например, посредством регулирования температурного режима, влажности, концентрации кислорода или путем внесения добавок, таких как питательные добавки, макро- и микроэлементы (вещества, содержащие углерод, азот, фосфор, серу и др.) (11) (см. ниже).

В случае гидрофобных или плохо растворимых загрязняющих веществ, способность микроорганизмов к биологической очистке может быть увеличена путем введения поверхностно-активных веществ в загрязненную воду или почву (8, 9).

В анаэробных условиях (например, в низкозалегающих почвенных слоях или во влажной почве) активность факультативно анаэробных организмов может поддерживаться акцепторами электронов и акцепторами водорода, способствующими анаэробному дыханию, такими как соли нитритов (ΝΟ₂ ^-), нитратов (ΝΟ3^-), фосфатов (РО4^3-), сульфатов (8Ο₄ ^2-) (10).

Также с этой целью могут использоваться другие добавки (ΝΟ₂, ΝΟ₃, РО₃, РО₄, Р₂О₄, Р₂О₇, С1О₂,

- 6 006478

С1О₃, С1О₄, ВО₄, В2О7), а также их неорганические соли и даже органические соединения.

Подходящими могут быть растворы добавок, обеспечивающих акцепторы электронов, которые катализируют неорганическое дыхание, такие как ионы металлов и их соли, предпочтительно ионы цинка Ζη²⁺ или титана Τί²⁺, например, в форме соли Т1С1₂.

При выборе добавок следует принимать во внимание качество почвы и ее состав. Например, анионы, содержащие N и Р встречаются достаточно редко, в то время как анионы, содержащие 8(8О₄ ^2-) и катионы, такие как К⁺ и Са²⁺, широко распространены. Также является важным обеспечить получение бактериями ионов, которые хотя и редки в почве, но жизненно необходимы для каталитической функции ферментов, например, ионов Μη, Мо, Τι и Ζη.

Наряду с микроорганизмами при биовзрыве могут использоваться источники органического углерода (например, глюкоза, сахароза, меласса, соли уксусной кислоты, глицерин).

Некоторые из добавок, используемых при биовзрыве и усиливающих функции микроорганизмов и их активность в отношении разложения загрязняющих веществ, представлены в табл. 1 в соответствии с их функциями.

Таблица 1

Вещества, увеличивающие анаэробное (бескислородное) дыхание: восстановительно-окислительные системы и/или акцепторы электронов и/или акцепторы водорода, подходящие соединения металлов, имеющими более чем одну степень окисления (например, ионы Ее, Си, Τϊ, Мп или Мо или манганаты и/или молибденаты), а также нитрит-, нитрат-, хлорит-, хлорат-, перхлорат-, фосфат-, пирофосфат-, сульфит-, сульфат-, пиросульфат-ионы или их соли.

Источники углерода: предпочтительными являются глюкоза, сахароза, меласса, глицерин, соли уксусной кислоты, ксантан.

Ионы металлов и микроэлементы, увеличивающие ферментативную активность: подходящими являются Ее-, Си-, Νΐ-, Со-, Μη-, Мд-, Ζη- или Саионы, предпочтительно Мп²*, Мд²*, Ζη²*Η Са²*.

Источники азота: подходящими являются пептон, нитрит-, нитрат-ионы, ион аммония или их соли.

Источники фосфора: предпочтительны фосфат-, пирофосфат-ионы или их соли.

Источники серы: сульфат-, пиросульфат-ионы или их соли.

Поверхностно-активные вещества: предпочтительны Тшееп 20, Тшееп 40, Тчуееп 60, Тигееп 80, нонит, диметилсульфоксид (ДМСО).

Вещества, улучшающие адгезию к поверхности: предпочтительны все природные или синтетические полимеры, например полиакриламид, поливиниловый полимер, более предпочтительны биологически разлагаемые полимеры, такие как гидроколлоиды, наиболее предпочтителен ксантан.

Добавки используются в нетоксичных концентрациях. Например, раствор диметилсульфоксида в концентрациях до 20% не токсичен.

Органические добавки не причиняют вреда окружающей среде и со временем разлагаются.

Эти добавки могут быть частично внесены в почву после взрывания. Рыхлая структура почвы после воздействия значительно облегчает процесс внесения добавок.

Загрязняющие вещества, для ликвидации последствий действия которых может использоваться метод биовзрыва все парафиновые асфальтены, углеводородсодержащие мальтены; полиароматические углеводороды, фенол, производные фенола; автомобильное, самолетное топливо;

галогенизированные углеводороды и их производные с замещением серы (дихлорфенол, бензтиофен и др.);

органические молекулы, увеличивающие октановое число (метил-трет-бутиловый эфир и др.);

- 7 006478 диоксины;

гетероциклические вещества (лекарственные средства, компоненты лекарственных средств); пестициды, фунгициды, гербициды;

циансодержащие вещества.

Безусловно, описываемая технология может использоваться в комбинации с другими методами.

Другое преимущество данной технологии состоит в том, что она может использоваться для обработки не только верхних слоев грунта, но и нижних его слоев, таким образом, восстановление почвы может осуществляться так, что верхние слои почвы не будут затронуты.

Если генетически немодифицированные микроорганизмы являются выделенными из среды обитания, то для их культивирования применяется либо так называемая стерильная твердая минимальная питательная культуральная среда, либо предпочтительно твердая культуральная среда на основе силикагеля (процесс культивирования может происходить на чашках Петри).

При выделении организмов, обладающих как аэробной, так и анаэробной активностью, рекомендуется использовать культуральную среду, содержащую азот, серу, соли фосфора и агар-агар, предпочтительно твердую культуральную среду на основе силикагеля.

Важно, чтобы специфические гидрофобные загрязняющие вещества или другие гидрофобные компоненты (углеводороды, нефть, ее компоненты и их производные), подлежащие разложению, вносились на питательную среду в растворенном виде, например растворенными в некоторых летучих органических растворителях, (спирт, ацетон, эфир), предпочтительно в пентане, гексане или метилбензоле, в виде тонкой пленки. Затем полученные в результате селекции микроорганизмы из свежей культуры, наносятся полосами на эту пленку и далее инкубируются в условиях, подходящих для развития штамма (психрофильных, мезофильных, термофильных, и аэробных или анаэробных). По прошествии некоторого времени микроорганизмы, устойчивые к загрязняющему веществу и способные к его разложению, формируют колонии, обычно плотные или с ярко выраженными морфологическими характеристиками и пигментацией.

Микроорганизмы выделяют в пространство, окружающее колонии, ферменты, которые способны разлагать гидрофобные вещества, такие как углеводороды, а также они выделяют поверхностноактивные вещества (фиг. 1 и 2).

Количество выделяемых ферментов может быть определено путем измерения ширины полосы, окружающей колонию (очищенной или потерявшей окраску). При этом в основном оценивается интенсивность выработки ферментов (см. фиг. 1). Активность продуцируемых ферментов может быть определена путем взятия пробы из области, окружающей колонию. Состав загрязняющего вещества определяется методом газовой хроматографии (фиг. 3 а и 3б). Далее осуществляется селекция (отбор) микроорганизмов, проявляющих наивысшую способностью к выработке ферментов.

Микроорганизмы, выделяющие поверхностно-активные вещества, могут быть отобраны с использованием анализа методом гидрофобно-гидрофильных капельных проб (например, с использованием капель воды, затем с использованием капель парафина; см. фиг. 2).

Варьируя условия селекции (отбора) микроорганизмов, можно определить не только способность микроорганизмов к разложению загрязняющих веществ, но и условия, необходимые для их существования. Таким образом, микроорганизмы, используемые при биологическом восстановлении, могут относиться к предпочитающим низкие температуры (психрофильным), средние температуры (мезофильным) и высокие температуры (термофильным).

Учитывая потребность в кислороде, могут быть выделены следующие группы микроорганизмов: аэробные, анаэробные и факультативно анаэробные. При рекультивации почв обычно используются мезофильно-аэробные, термофильно-анаэробные и факультативно анаэробные микроорганизмы, поскольку они превосходят остальные по эффективности действия и рентабельности, предпочтительными являются факультативно анаэробные микроорганизмы. При их селекции, кроме известных условий, таких как необходимость содержания в культуральной среде соединений, обеспечивающих анаэробное дыхание, также важным условием является инкубация колоний в анаэробных условиях.

В некоторых случаях может требоваться, чтобы микроорганизмы, используемые при рекультивации, были непатогенны (1 , 2), другими словами, они не должны вызывать заболеваний ни у растений, ни у животных, ни у людей. В других случаях могут использоваться даже микроорганизмы, способные вызывать заболевания, при условии их дальнейшей гибели или в случаях, если они не оказывают воздействия на людей; в таком случае они могут применяться одновременно в качестве пестицидов или гербицидов.

Используя вышеуказанный метод селекции, авторы настоящего изобретения выделили из почв, загрязненных нефтью, следующие микроорганизмы: ВасШик киЬИНк. ВасШик сегеик, рода Ркеийотоиак и рода ХаиШотоиак, которые были депонированы в Национальной Коллекции Сельскохозяйственных и Промышленных Микроорганизмов в Будапеште согласно Будапештскому Договору 17 апреля 2002 г.

- 8 006478

Молекулярный номер	Регистрационный номер
ΜΟί-2	ΝΘΑΙΜ (Р) В 1304
ΜΟί-32	ΝΟΑΙΜ (Р) В 1305
ΜΟί-51	ΝΟΑΙΜ (Р) В 1306
МОЬ-66	ΝΟΑΙΜ (Р) В 1307
МОЫ07	ΝΟΑΙΜ (Р) В 1306

Микроорганизмы могут быть генетически модифицированы, например, полезным является включение в их геном фрагментов ДНК с известной последовательностью в качестве маркеров.

При селекции факультативно анаэробных микроорганизмов можно использовать следующие вещества, как правило, акцепторы электронов и акцепторы водорода, способствующие бескислородному дыханию: нитриты (ΝΟ₂ ^-), нитраты (ΝΟ3^-), хлориты (С1О2^-), фосфаты (РО4^3-) или сульфаты (8О4²) и т.д., и их соли. Также могут быть использованы неорганические соли других соединений, которые тоже способствуют бескислородному дыханию (ΝΟ₂, ΝΟ₃, РО₃, РО₄, Р₂О₄, Р₂О₇, С1О₄, ВО₄, В₂О₇), или даже органические соединения.

Наиболее подходящими растворами являются растворы, содержащие электрон-акцепторные добавки, которые катализируют неорганическое дыхание, такие как ионы металлов и их солей, предпочтительно ионы цинка Ζη²⁺ или титана Τί²⁺, например, в форме соли Т1С1₂.

При селекции микроорганизмов, выбирая добавки, следует принимать во внимание качество и состав почвы, в которой предполагается применять микроорганизмы.

Например, обрабатываемой средой может являться почва, где в нижнем слое анионы, содержащие N и Р, встречаются достаточно редко, в то время как анионы, содержащие 8(8О₄ ^2-) и катионы, такие как К⁺ и Са²⁺, широко распространены. Также является важным обеспечить получение бактериями ионов, которые хотя и редки в почве, но жизненно необходимы для каталитической функции ферментов, например ионов Μη, Мо, Τι и Ζη.

Некоторые добавки, увеличивающие активность микроорганизмов, выведенных предложенным способом селекции (отбора), приведены в табл. 1.

Представляется очевидным, что добавки должны добавляться в почву в концентрации, нетоксичной для микроорганизмов.

Описание примеров осуществления изобретения

Пример 1 . Культивирование микроорганизмов на минимальной питательной среде.

1-20% суспензии почвенных проб, содержащих загрязняющие вещества (компоненты нефти, парафины, асфальтены, мальтены и т.д. или производные нефти), диспергируют в физиологическом солевом растворе или в физиологически применимом буфере с рН 6,5-7,6. Определенные разведения таких суспензий были нанесены на поверхность минимальной питательной культуральной среды на основе агарагара и инкубировались при температуре 0-80°С на протяжении произвольно выбранного промежутка времени, предпочтительно в течение 1 2-72 ч. Дальнейший отбор изолированных колоний микроорганизмов производился в соответствии с их способностью к разложению загрязняющих веществ.

Состав минимальной питательной культуральной среды на основе агар-агара (на 1000 г дистиллированной воды)

0,1-3 г, предпочтительно 2,5 г №ьНРО₄

0,1-3 г, предпочтительно 1,5 г КН₂РО₄

0,1-3 г, предпочтительно 0,5 г (ΝΗ₄)₂8Ο₄

0,01-3 г, предпочтительно 0,05 г СаС1₂

0,5-3 г, предпочтительно 2,0 г агар-агара

0,1-5 г, предпочтительно 1,5 г ΝαΝΟ₃

Очевидно, что в состав вышеприведенной среды включены ионы, усиливающие аноксическое (бескислородное) дыхание (РО₄ ^3- и его протонированные формы, 8О4^2-, ΝΟ3^-), иначе говоря, она содержит акцепторы электронов, которые позволяют производить селекцию аэробных и факультативно аэробных микроорганизмов.

В некоторых случаях в вышеупомянутую среду может быть добавлено 50 или 10 мл следующего раствора (на 1 000 мл):

0,1-0,5 г, предпочтительно 0,25 г Н₃ВО₄

0,1-1,0 г, предпочтительно 0,25 г СоС1

0,1-2,0 г, предпочтительно 0,25 г СиС1₂

0,05-2,0 г, предпочтительно 0,25 г Те8О₄

0,01-1,0 г, предпочтительно 0,025 г МпС1₂

0,01-1,0 г, предпочтительно 0,025 г Ν;·ιΜοΟ₄

0,01-1,0 г, предпочтительно 0,025 г №С1₂

0,01-1,0 г, предпочтительно 0,025 г Т1С1₄

- 9 006478

Ионы металлов с различными степенями окисления (например, ионы Τι, Мп, Мо) также усиливают аноксическое дыхание, действуя в качестве окислительно-восстановительных систем.

Пример 2. Культуральная среда на основе силикагеля.

Микрофлора загрязненного образца почвы может быть выращена на так называемой минимальной культуральной среде на основе силикагеля, которая является вариацией твердой культуральной среды Виноградского (12) и отличается от нее добавлением веществ, указанных в примере 1.

На такой среде могут быть выращены термофильные (50-80°С) и экстремально термофильные (80110°С) микроорганизмы.

Пример 3. Методы изучения активности разложения загрязняющих веществ.

Разлагающая активность микроорганизмов, выделенных из минимальной питательной культуральной среды, может также быть исследована с использованием подобной твердой среды. В таком случае на среду в виде тонкой пленки наносится гидрофобное загрязняющее вещество (углеводороды, жироподобные вещества и др.), растворенное в определенных растворителях, например в некоторых летучих органических растворителях (спирт, ацетон, эфир), предпочтительно в пентане или гексане. Затем на этот слой загрязнений полосами наносятся микроорганизмы, подлежащие исследованию (фиг. 1 ).

Колонии инкубируются при желаемой температуре с заданной концентрацией кислорода на протяжении требуемого периода времени, предпочтительно в течение 12-96 ч, оптимально в течение 48 ч, затем с ростом колоний эти действия повторяются 2-3 раза.

Контролируемый уровень концентрации кислорода позволяет осуществлять предложенный метод и в аэробных и в анаэробных условиях. Таким образом, можно выделить организмы, проявляющие активность как в аэробных, так и в анаэробных условиях. При выделении таких факультативно анаэробных микроорганизмов часть роста колоний осуществлялась в анаэробных условиях, а питательная среда содержала вещества, способствующие бескислородному дыханию.

Когда микроорганизмы, выделенные описанным выше образом, наносятся на пленку загрязняющих веществ, в области, прилежащей к колониям, может наблюдаться очищение от пленки или ее обесцвечивание, указывающие на то, что произошло преобразование или разложение загрязняющего вещества (фиг. 1).

Ниже будет продемонстрировано, каким образом определялась эффективность разложения, а также степень разложения загрязняющих веществ на очищенной области с течением времени (фиг. 2). Таким образом изучалась ферментативная активность отобранных микроорганизмов. Также можно определить участие в процессе разложения других веществ, особенно поверхностно-активных веществ, облегчающих этот процесс (фиг. 2).

Безусловно, специалисты могут использовать для этого другие методы.

Пример 4. Изучение действия микроорганизмов.

Действие ферментов при разложении нефти

На поверхность стерильной чашки Петри 10 см диаметра, содержащей 15 мл минимальной питательной культуральной среды на основе агар-агара или силикагеля, наносили тонкую пленку загрязняющего вещества (нефтепродукты, растворенные в 5% растворе гексана или метилбензола). На эту пленку с помощью платиновой петли вносили микроорганизмы, выделенные из загрязненной среды (почва, грунтовые воды и т. д.) и выращенные в жидкой среде. Затем микроорганизмы инкубировались при желаемых условиях (аэробных или анаэробных) при выбранной температуре (15-20°С, 30-35°С или 50-85°С) в течение желаемого времени (24-240 ч) до образования отчетливо различимых колоний. Если в углеводородной пленке наблюдались какие-либо изменения (очищение, обесцвечивание), из этих зон брали образцы, экстрагировали их растворителем (гексан, метилбензол и др.), а затем производили количественный и качественный анализ нефтепродуктов с использованием метода газовой хроматографии.

Эффективность продуцирования ферментов, способных к разложению нефти, (а также жизнеспособность) может быть охарактеризована шириной очищенной зоны. Активность ферментов может быть определена путем оценки степени уменьшения количества углеводородных компонентов в нефтепродуктах.

Активность некоторых выделенных штаммов сравнивали с активностью известных штаммов (табл. 2, 3). Буквы в таблице означают следующее:

НеП	Недгет*
Ке1И	НедЬооз!*
А	МОЬ-2	ΝΟΑΙΜ (Р) В 1304
В	МОБ-32	ΝΟΑΙΜ (Р) В 1305
с	МОЬ-51	ΝΟΑΙΜ (Р) В 1306
β	МОЬ-66	ΝΟΑΙΜ (Р) В 1307
Е	МОЫ07	ΝΟΑΙΜ (Р> В 1308
г	МОЬ-113	Штамм рода Рзеидотопаз, полученный изобретателями

* производятся компанией Ой С1еапт§ Вю-РгойисГз Ый. Р.О.Вох 46, КоузГоп, НегПогйзЫге 808 9РБ и.К., см.

также описания продуктов на сайте производителя в Интернете: млхлт.осЬр.со.ик.

- 10 006478

Влияние различных групп бактерий на парафины с различными точками плавления

Обозначение группы	Парафин
	ОУУ6266	ϋνν 7580	т\! 5456	ϋνν 5658	ϋνν 5052
ВО-1 е	+ 6	+ 5	+ 6	+ 6-8	+ 4-7
КО-1 е	+ 6	+ 6	++ 4-11	+ 3-6	++ 5-12
А 1	++++ 15-18	+ 5-3	+++ 10-15	++++ 11-19	+++ 11-16
В '	+++ 5-11	+ 5-6	+++ 10-15	++++ 13-20	+++ 10-16
С 1	+++ 10-15	± 4	+++ 14-17	+++ 14-18	+++ 11-14
□ хч	+ 5-7	+ 4-5	++++ 10-22	++++ 10-34	+ 4-7
	+ 6-7	+++ 10-13	+++ 13-17	+++ 11-13	+++ 13-16
р ®(0	++ 9-12	++ 6-10	++ 7-12	++ 4-10	++ 7-12

I - действие поверхностно-активных веществ е - ферментативная активность действие:

+ - незначительное ++ - частичное +++ _ удовлетворительное ++++ - выдающееся числа - диаметр разложившейся площади

Таблица 2

Таблица 3

Выпадение в осадок продуктов распада нефти при использовании групп бактерий при температуре 37°С после 96 ч воздействия

Обозначение	Г идрофобные*	Асфальтен	Мальтен	5% асфальтен + А1д #571 нефть
ВО-1	+		+	++
	4-7	9	4-7	6-12
РО-1	+		+	++++
	4-10	7	4-8	15-18
А	+	++++	±	++++
	5	10-38	2	22-25
В	+	++++	+	++++
	4-8	14-20	4-7	34-37
С	+	++	±	++++
	4-6	7-12	2-4	25-30
0	+	+	+	++++
	3-6	4	4-8	30-35
Е	++++	+	++++	++++
	22-25	5-7	20-25	30-35
Е	+	+	++++
	4-5	4-5	10-35	20-35

I - действие поверхностно-активных веществ е - ферментативная активность действие:

+ - незначительное ++ - частичное ⁺⁺⁺ - удовлетворительное ++++ - выдающееся числа - диаметр разложившейся площади

- 11 006478

При сравнении фиг. 3 с таблицами можно видеть, что активность ферментов (измеренная методом газовой хроматографии), вырабатываемых штаммами, выделенными авторами, соответствует их активности, наблюдаемой у известных до настоящего времени штаммов. В то же время, эффективность разложения (характеризуемая средним значением ширины очищенного пространства), при учете загрязняющих веществ, значительно превышает эффективность известных штаммов. В случае использования продуктов Недгет и НедЬооз! не было выявлено продуцирования каких-либо поверхностно-активных веществ. Применение способа согласно изобретению позволяет получить специфично селектированные микроорганизмы, которые могут быть произведены и использованы избирательно для каждого загрязняющего вещества, который они разлагают наиболее эффективно.

Изучение продуцирования микроорганизмами поверхностно-активных веществ с помощью метода гидрофильно-гидрофобных капельных проб

Была повторена процедура, описанная в примере 4, касающаяся ферментов, способных к разложению нефти, с одним исключением: в очистившееся пространство, окружающее колонии отобранных микроорганизмов, на поверхность среды при желаемых условиях вносились несколько капель дистиллированной воды или расплавленного парафина. В зоне, содержащей поверхностно-активные вещества, капля дистиллированной воды растекалась, в то время как в неочищенном (гидрофобном) пространстве застывала в форме слезы. Капля расплавленного парафина также растекалась в пространстве с поверхностно-активными веществами, в то время как ее попадание в гидрофобную зону делало растекание невозможным (фиг. 2).

Критический угол поверхности капли может быть измерен и может использоваться для количественного описания продуцирования поверхностно-активных веществ, при фиксированных других параметрах (время роста, размер капли).

Пример 5. Способ биологического восстановления почв.

Смесь микроорганизмов В. еегеив, В. зиЫШз и Рзеиботопаз ер., выделенных методом, описанным в примерах 1-4, в равном соотношении и в одинаковом количестве, в концентрации 10⁴-10¹² (предпочтительно 10¹¹) микроорганизмов на килограмм загрязненной почвы, вносили в загрязненную среду в пробуравленные лунки заданной глубины (до уровня залегания грунтовых вод), расположенные на определенном расстоянии друг от друга (0,5-6 м, предпочтительно 1,5-2 м). Лунки располагались по углам квадрата, в одну из этих лунок поместили микроорганизмы, в другой располагались добавки и питательные вещества, в свободных лунках симметричным образом разместили взрывчатые вещества (фиг. 4). Затем был произведен биовзрыв (фиг. 5б).

После биовзрыва почву оставили на время, составляющее 1-120 дней, предпочтительно 5-6 дней, затем произвели послевзрывную обработку (с использованием методов аэрации, инфильтрации, впрыскивания, обработки паром и т. д.).

Разложение нефтяных загрязняющих веществ с концентрацией 40-60 г/кг на глубине 4-6 м после взрывания и без применения последующей обработки показано на фиг. 5а.

Загрязнение почвы таким же загрязняющим веществом было создано ех зйи, при этом загрязняющее вещество было перемешано с почвой (с использованием призменного метода) и удалено при применении микроорганизмов и добавок такого же качественного и количественного состава, как при методе биовзрыва ίη 8Йи.

Согласно расчетам авторов, стоимость данных методов составляет соответственно

Ех 811и (призменный) метод: 40-60 υδΌ/ тонну

Ιη 8Йи (био-взрыв) метод: 8-16 υδΌ/тонну

Исходя из результатов проведенных экспериментов, можно утверждать, что технология биовзрыва по цене способна конкурировать с призменными технологиями восстановления земель, а по эффективности превосходит их.

Выполнение взрыва

В первую очередь была выяснена локализация загрязняющих веществ, а затем степень загрязнения почвы по горизонтали и вертикали. После этого в грунте на необходимом расстоянии друг от друга были пробурены лунки требуемого диаметра и глубины, расположенные квадратичным образом. Все лунки залегали до уровня грунтовых вод. Взрывчатые вещества с требуемыми свойствами (к примеру, паксит) и в необходимом количестве были помещены в пластиковые трубки, которые опускались в каждую нечетную лунку. Таким образом было достигнуто желаемое действие взрыва (фиг. 4).

Взрывчатые вещества были снабжены электрическим запалом, а провода параллельно соединены таким образом, что взрыв мог происходить как одновременно по всей поверхности, так и требуемыми порциями (фиг. 3б).

Далее необходимое количество добавок было растворено в воде и размещено по пластиковым трубкам, которые затем опускались в четные лунки, либо поверх взрывчатых веществ, либо в пустые лунки. Микроорганизмы также помещались в пластиковые трубки и размещались по пустым четным пронумерованным лункам.

Наконец, осуществлялся биовзрыв добавок и микроорганизмов. При этом сила взрыва выбиралась такой, чтобы достичь эффекта максимального перемешивания добавок и микроорганизмов без попадания

- 12 006478 их на поверхность почвы.

Пример 6. Процесс аэрации.

До уровня залегания грунтовых вод в загрязненном грунте, взрыхленном взрывом, в квадратичном порядке были размещены металлические трубки. В их определенной части (на уровне 1/3 или 1/4 длины) было просверлено желаемое количество отверстий необходимого диаметра. При помощи компрессора через них вводится кислород или водяной пар. В качестве альтернативы при помощи насоса могут быть введены новые порции добавок и/или веществ, усиливающих разложение загрязняющего вещества.

Пример 7. Применение технологии.

Данная технология может использоваться при очищении загрязненных почв, грунтовых вод и свалок от нефти, смазок, топлива, других углеводородов и их производных (в том числе галогенированных) или пестицидов, гербицидов, токсических отходов, или от обычно биологически разлагаемых/нейтральных ксенобиотиков. Применение данной технологии при определенных условиях может быть ограничено. Так, в населенной местности или вблизи газовых станций использование данной технологии может быть недопустимо или ограничено.

Кроме описанных выше применений, способ согласно изобретению может использоваться для смягчения воздействия природных катаклизмов, приведших к загрязнению почвы (взрыв природного газа или воздействие термальных вод и т. д.), или опасного загрязнения почвы, возникшего в результате дефектов трубопроводов (нефтепроводов, газопроводов), загрязнения цианидами, или в результате наводнений, разливов внутренних вод, разрыва сточных труб и т. д. Данная технология также может использоваться при очищении от загрязняющих веществ, расположенных между поверхностью почвы и уровнем грунтовых вод. В некоторых случаях она может также использоваться против загрязняющих веществ, уже достигших уровня грунтовых вод.

Использованная литература

1) 011 С1еап1пд Вю-ргойис!к Ь!й.: Ргекк ге1еа8е оп Недгет Вас!епа

2) 011 С1еашпд Вю-ргойис!к Ый.: Ргекк ге1еаке оп НедЬоок! Ьас!епа

3) Тйотак 1.М. апй Аагй С.Н. (1989): Епуйоп. кс1. 1ес1то1. 23 760-766

4) Уап йег Меег е! а1. (1992): М1сгоЬю1. Ксу. 56. 677-694

5) Корр-Но11Мексйе В. е! а1., (1992): Вю!есй. Рогит Еигоре. N. 6

6) 81оап В., (1987): 011 апй Сак 1. 61-66

7) Воимег Е.1. апй /ейпйег А., ТВ. (1993): Т1ВТЕСН 11. 360-367

8) Р1итЬ В.Н.1. (1991): Сгоипй\\а1ег топйогшд Ксу. 11.157-164

9) Вупайк Н.Н. е! а1. (1990): Епуйоп. 8сг Тес1то1. 24. 1349-1354

10) Воимег Е.1. апй Аагй С.Н. (1989): Епуйоп 8сг Тес1то1. 23. 760-766

11) Вегдеу'к Мапиа1 о£ 8ук!етайс Вас!еого1оду Уо1. 01.1984

12) А.8. 0|е1х. А.А. Уауапок, Арр1. апй Епуйопт. МюгоЬю1. 36, 966 (1978)

Claims (18)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Способ снижения степени загрязнения почв, включающий в себя следующие этапы:

   (ί) размещение в загрязненной почве или вблизи от нее, под поверхностью почвы микроорганизмов, пригодных для разложения или инактивирования по меньшей мере одного вида вещества, вызывающего загрязнение, и взрывчатого вещества;

   (ίί) перемешивание загрязненной почвы и микроорганизмов путем взрывания, посредством которого осуществляется разрыхление почвы.
2. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что на этапе (1) под поверхностью почвы также размещают добавки, улучшающие условия существования микроорганизмов и/или способствующие их распространению и/или почвоулучшающему действию, а на этапе (ίί) указанные добавки также перемешиваются с микроорганизмами и загрязненной почвой.
3. 3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что микроорганизмы, взрывчатые вещества и факультативно вводимые добавки располагают в лунках, вырытых в земле.
4. 4. Способ по п.3, отличающийся тем, что микроорганизмы и взрывчатые вещества располагают в различных лунках.
5. 5. Способ по п.3, отличающийся тем, что микроорганизмы и взрывчатые вещества располагают в одних и тех же лунках друг над другом, причем предпочтительно взрывчатые вещества располагают ниже микроорганизмов.
6. 6. Способ по любому из пп.3-5, отличающийся тем, что микроорганизмы, взрывчатые вещества и предпочтительно добавки помещают в пластиковые трубки, которые затем размещают в лунках.
7. 7. Способ по любому из пп.2-6, отличающийся тем, что после взрыва в почву вносят добавки, улучшающие условия существования микроорганизмов и/или способствующие разложению, например, путем аэрации, инфильтрации или впрыскивания, причем предпочтительно вносят одну или несколько из следующих добавок: вещества, способствующие бескислородному дыханию, ионы металлов, микроэле- 13 006478 менты, источники углерода, источники азота, источники фосфора, источники серы, поверхностноактивные вещества, вещества, увеличивающие адгезию к поверхности.
8. 8. Способ по любому из пп.3-6, отличающийся тем, что лунки располагают на расстоянии от 0,5 до 5 м, предпочтительно от 1,5 до 2 м друг от друга, а величину силы взрыва выбирают такой, чтобы в результате взрыва происходило, как максимум, повреждение малой части микроорганизмов, более предпочтительно, чтобы не происходило повреждения микроорганизмов и их попадания на поверхность почвы.
9. 9. Способ по любому из пп.1-8, отличающийся тем, что загрязняющим веществом является компонент или производное нефти.
10. 10. Способ по любому из пп. 1-9, отличающийся тем, что указанные микроорганизмы устойчивы к загрязняющему веществу.
11. 11. Применение факультативно анаэробных микроорганизмов рода Рзеиботопаз, продуцирующих по меньшей мере один фермент, способный разлагать компонент или производное нефти, и по меньшей мере одно поверхностно-активное вещество, для разложения гидрофобного вещества, загрязняющего почву, содержащего компонент или производное нефти, в процессе рекультивации почвы, осуществляемой с помощью способа по пп. 1-9.
12. 12. Применение по п. 11, отличающееся тем, что активность микроорганизмов в разложении нефтяного загрязняющего вещества, определяемая путем культивирования в среде, загрязненной любым из следующих нефтяных загрязняющих веществ: гидрофобные отложения, асфальтен, мальтен, 5% асфальтен в смеси с нефтью, в среднем, по меньшей мере в 1 ,5 раза выше, чем активность, наблюдаемая у микроорганизмов Недгет и НедЪоозЬ
13. 13. Применение по любому из пп. 11 или 12, отличающееся тем, что микроорганизмы представляют собой любые из следующих микроорганизмов: ΝΟΆΙΜ (Р) В 1304, ΝΟΆΙΜ (Р) В 1305, ΝΟΆΙΜ (Р) В 1306, ΝΟΆΙΜ (Р) В 1307, ΝΟΆΙΜ (Р) В 1308, или любой штамм, полученный из них.
14. 14. Набор для разложения в процессе рекультивации почвы гидрофобного вещества, загрязняющего почву, содержащего компонент или производное нефти, включающий в себя, по меньшей мере, микроорганизмы, применимые для разложения или инактивирования по меньшей мере одного вида вещества, вызывающего загрязнение, взрывчатое вещество и носитель информации с инструкцией по применению, содержащей инструкции по осуществлению любого из способов по пп. 1-10.
15. 15. Набор по п. 14, отличающийся тем, что микроорганизмы представляют собой факультативно анаэробные микроорганизмы рода Рзеиботопаз, продуцирующие по меньшей мере один фермент, способный разлагать компонент или производное нефти, и по меньшей мере одно поверхностно-активное вещество.
16. 16. Набор по п. 14 или 15, отличающийся тем, что дополнительно содержит один или более элементов из группы, включающей вспомогательные средства для взрывания, добавки, обеспечивающие или улучшающие условия существования микроорганизмов или повышающие их эффективность.
17. 17. Набор по любому из пп. 14-16, отличающийся тем, что указанные микроорганизмы устойчивы к загрязняющему веществу.
18. 18. Набор по любому из пп. 14-17, отличающийся тем, что микроорганизмы выбраны из следующих микроорганизмов: ΝΟΆΙΜ (Р) В 1304, ΝΟΆΙΜ (Р) В 1305, ΝΟΆΙΜ (Р) В 1306, ΝΟΆΙΜ (Р) В 1307, ΝΟΆΙΜ (Р) В 1308 или любой штамм, полученный из них.