DK175801B1 - Anvendelse af substituerede alkylidendithio-bis-(substituerede)-phenoler til fremstilling af et lægemiddel til inhibering af interleukin-1-medierede virkninger bortset fra atherosklerose og/eller hyperlipidæmi - Google Patents

Description

i DK 175801 B1 i

Opfindelsen angår anvendelsen af substituerede alkyli-dendithio-bis-(substituerede)-phenoler til fremstilling af et lægemiddel til inhibering af interleukin-1-medierede virkninger bortset fra atherosklerose og/eller hyperlipidæmi.

5 De substituerede alkylidendithio-bis-(substitueret)- -phenoler, som anvendes ifølge opfindelsen, er forbindelser af den type, som er beskrevet i US patentskrifterne nr. 3.576.883, 3.786.100, 3.862.332 og 3.897.500, og de kan fremstilles ved de metoder, som er beskrevet i disse patent -10 skrifter. En af alkylidendithio-bis-(substitueret)-pheno-lerne, 4,4'-(isopropylidendithio)-bis-(2,6-di-tert.butyl)-1 phenol, er kendt under det generiske navn "probucol" og anvendes som hypercholesterolenisk medikament. Det er kendt, at probucol sænker serumcholesterol og nedsætter både lipo-1 15 proteincholesterol med høj vægtfylde (HDL) og lipoprotein- I cholesterol med lav vægtfylde (LDL). Det er blevet vist, at den inhiberer oxidativ modifikation af LDL, en virkning, hvorom den hypotese er fremsat, at den muligvis inhiberer atherogenese, jf. Naruszewicz et al., Journal of Lipid Re-20 search, bind 25, 1206 (1984), og Parthasarathy et al., J.

Clin. Invest., bind 77, 641 (1985).

Interleukin-1 (IL-1) er navnet på en familie af molekyler, som har flere biologiske virkninger. Navnet inter-leukin-1 blev foreslået i 1979, og tidligere litteraturrap-25 porter refererer dertil ved et andet navn, jf. Murphy,

British Journal of Rheumatology, 1985, 24 (suppl. 1), 6-9, og Oppenheim et al., Immunology Today, bind 2, 45-55 (1986) .

IL-1 udskilles af stimulerede makrofager og har flere signifikante biologiske virkninger, såsom mediering af T-lym-3 0 phocytformering og pyrogene og proinflammatoriske virkninger.

IL-l-aktiviteter er opsummeret i de ovenfor nævnte to artikler. IL-1 er blevet beskrevet som medierende akutfasereaktionen ved betændelse og som havende pyrogene og proinflammatoriske virkninger. IL-1 fremkalder bindevævs-3 5 ændringer, og det er blevet vist, at det fremkalder frigivelsen af sønderdelende enzymer fra mesenchymalceller, som er

I DK 175801 B1 I

I i

I til stede på steder med knogleerosion ved inflammatoriske I

I sygdomstilstande, såsom rheumatoid arthritis, jf. Billingham, I

I Brit. J. Rheumatology, 1985, 24 (suppl. 1), 25-28, Dayer, I

I Brit. J. Rheumatology, 1985, 24 (suppl. 1), 15-20. Produk- i I

I 5 tionen af akutfaseproteiner i hepatocyterne under den akutte I

I fase af betændelse er medieret af IL-1 og andre cytokiner, I

såsom IL-6, Whicher, Brit. J. Rheumatology, 1985, 24 (suppl. | I 1), 21-24. |l I IL-l er også involveret som en mediator ved den in- j |

I 10 flammatoriske hudsygdom psoriasis, Camp. et al., J. Immu- I

I nology 1986, 137, 3469-3474, og Ristow, Proc. Natl. Acad. I

I Sci. USA 1987, 84, 1940-1944. Det er cytotoksisk for in- I

I sulinproducerende β-celler i pancreas, og det er således en I årsagsfaktor ved udviklingen af visse former for diabetes | I 15 mellitus, jf. Bendtzen et al., Science 1986, 232, 1545-1547, | I og Marx, Science 1988, 239, 257-258. IL-1 ser også ud til | I at være involveret ved udviklingen af atherosclerotisk pla- | | que, jf. Marx, Science 1988, 239, 257-258. IL-1 stimulerer | I væksten og formeringen af vaskulære celler i de glatte musk- I 20 ler, en virkning, som er større ved fraværelsen eller under- I trykkeisen af endogene prostaglandiner, som kunne føre til | fortykkelse af karvægge, således som det sker ved atherogene- | I se, jf. Libby et al., Fed. Proc., 1. marts 1987, bind 46, | I nr. 3, 975, sammendrag 3837. |

I 25 Det ville være en fordel at kontrollere frigivelsen I

I af IL-1 og at være i stand til at behandle IL-1-medierede I

| virkninger. Det ville også være fordelagtigt at kontrollere I

| eller behandle IL-l-medieret betændelse uden frembringelse | I af ledsagende bivirkninger, som vides at ledsage anvendelsen I 30 af antiinflammatoriske steroider og ikke-steroide, antiin- | I flammatoriske midler. | I Det har nu vist sig, at substitueret alkylidendithio- |

-bis-(substitueret)-phenoler svarende til formlen I

I 35 I

i i DK 175801 B1 i ! i ; 3 ! ao-t)""5 “i”' ' R- R" R' K2 10 hvor R betyder tertiært butyl eller tertiært pentyl, R' og R" betyder hydrogen, methyl, ethyl, propyl, butyl eller pentyl, idet dog R' og R" ikke er isopropyl, R^ betyder hy-15 drogen, methyl eller ethyl, og R2 betyder alkyl med 1-6 carbonatomer eller ketosubstitueret alkyl med 3-6 carbon-atomer, eller R2 betyder en gruppe svarende til formlen

20 I

R {CH2jn / (II) 25 R· R1 R’ hvor n er 2, 3 eller 4, og R, R', R" og har den ovenfor 3 0 anførte betydning, kan anvendes til inhibering af IL-l-medie-rede virkninger bortset fra atherosklerose og/eller hyper-lipidæmi. Forbindelserne kan indgives til dyr til inhibering af sekretion af IL-1, til inhibering eller behandling af IL-1-medierede virkninger og til inhibering eller behandling 35 af IL-1-medieret inflammation. Forbindelserne kan indgives til inhibering eller behandling af IL-1-medierede virkninger

I DK 175801 B1 I

I 4 I

ved tilstande såsom inflammation, psoriasis og diabetes. , I

Ved den her omhandlede anvendelse indgives en effektiv I

I mængde af en eller flere af forbindelserne svarende til I

I ovenstående formel til et dyr, typisk til et pattedyr, med I

I 5 behov for inhibering af IL-1-udskillelse, inhibering af I

I IL-1-medierede virkninger eller inhibering af IL-1-medieret I

inflammation, i en mængde, som er effektiv til frembringelse

I i af en sådan inhibering. Forbindelserne er relativt frie for ! I

skadelige bivirkninger ved doser, som inhiberer IL-l-udskil- 1 I

10 lelse. Den omhandlede anvendelse kan benyttes til inhibering I

af udskillelse af IL-1 uden ledsagende inhiberende virkninger I

på T-lymfocytformering frembragt af concanavalin A og B- I

lymfocyt formering fremkaldt af lipopolysaccharid eller på I

udskillelsen af de immunologiske mediatorer interleukin 2 I

I 15 og interleukin 3. I

I Selvom hydroxylgrupperne kan være i enten ortho- I

I eller para-stilling i forhold til thiosvovlatomerne, er en

I foretrukket gruppe forbindelser til anvendelse ifølge opfind- I

I elsen dem, hvori hydroxyl er para-stillet til svovl. Disse I

I 20 forbindelser er 4,4'-substituerede alkylidendithio--bis-(2- I

I tert.butyl-6-alkylphenoler) svarende til formlen I

I 25 'l _/=^_ I

I Η0·^>-5-;-5-\_Γ (IM I

I R* R2 R* I

30 35 hvor R' og R" betyder hydrogen, methyl, ethyl, propyl, butyl Η

H eller pentyl, idet dog R' og R1' ikke er isopropyl, R^ betyder I

DK 175801 B1 5 hydrogen, methyl eller ethyl, og R2 betyder alkyl med 1-6 carbonatomer eller ketosubstitueret alkyl med 3-6 carbon-• atomer, eller R2 er en gruppe svarende til formlen 5

V_ <CH2)n \S

„ -0—i—Q- R* Ri R" 15 hvor n er 2, 3 eller 4, og R', R" og Rj^ har den ovenfor anførte betydning.

Foretrukne forbindelser til anvendelsen ifølge opfindelsen er dem, hvori alle alkylphenolgrupperne er ens, dem med formel I, hvori begge R-grupper og R' og R'1 alle er 20 tertiært butyl (tert-butyl eller t-butyl) eller alle tertiært pentyl, dem med formel I', hvori R' og R" begge er tertiært butyl, dem, hvori R^ er methyl, og dem, hvori R2 er methyl eller ethyl eller propyl. Når R2 er ketosubstitueret alkyl, er R2 fortrinsvis en 2-ketoalkylgruppe. Når R2 svarer til 25 formel II, er n fortrinsvis 2, og R' og R" er fortrinsvis t-butyl. En specielt foretrukket forbindelse er den forbindelse, som svarer til formel I', hvori begge R-grupper, R' og R" er tert-butyl, og R^ og R2 begge er methyl. Denne forbindelse er generisk kendt som "probucol". Det er blevet 30 vist, at probucol har lav toksicitet og er fri for skadelige bivirkninger over et bredt interval af doseringer.

Adskillige af forbindelserne er beskrevet i US patentskrifterne nr. 3.576.883, 3.786.100, 3.862.332 og 3.897.500, og alle forbindelserne kan fremstilles ved de metoder, som 35 er beskrevet i disse patentskrifter, eller ved analoge metoder til fremstilling af mercaptaler og mercaptoler, meto- Η

DK 175801 B1 I

der, som alle er velkendte for en organisk kemiker. Almin- I

deligvis fremstilles forbindelserne ved omsætning af 1 mol I

af det hensigtsmæssige aldehyd eller keton med 2 mol af den I

hensigtsmæssige thiophenol. Omsætningen gennemføres hen- I

5 sigtsmæssigt, ved at thiophenolen dispergeres i et indif- I

ferent organisk opløsningsmiddel, såsom methanol, og saltsyre I

tilsættes (ca. 0,05 mol HCl pr. mol thiophenol) som kataly- I

sator. Derefter tilsættes ketonen eller aldehydet, og bian-

dingen opvarmes til fra ca. 30°C til kogetemperaturen i fra I

10 ca. 1 til ca. 6 timer. Når R2 er en gruppe med formel II I

eller II-'-; er aldehyd- eller ketonreaktanten et dialdehyd,

et ketoaldehyd eller en diketon, og molforholdet af thio- I

phenolreaktanten forøges til ca. 4 mol thiophenol pr. mol I

aldehyd- eller ketonreaktant. I

15 Forbindelserne kan indgives på konventionel måde, I

idet oral indgift foretrækkes. De samme doseringer og ind- I

giftsveje, som anvendes til nedsættelse af cholesterol med

alkyliden-dithio-bis-(substitueret)-phenoler, kan alminde- I

ligvis anvendes ved udøvelse af den foreliggende opfindelse. H

20 Den dosis, som skal anvendes, vil variere i overensstemmelse I

med sådanne faktorer som art, alder, vægt og tilstand af H

det specielle dyr, som behandles, og den specielle forbin- I

delse, som anvendes. Optimale doser i specielle situationer H

kan bestemmes ved konventionel teknik til bestemmelse af H

25 dosisinterval. I

I almindelighed kan kendte dosisniveauer for forbin- I

delsen, såsom dem, som er beskrevet i US patentskrift nr. I

3.862.332, anvendes. Forbindelserne indgives fortrinsvis I

oralt i daglige doser fra ca. 1 til ca. 3 00 mg aktiv in-

30 grediens pr. kg dyrelegemsvægt. Værdifulde resultater ved I

inhibering af IL-1-frigivelse og lindring af IL-l-medieret I

betændelse er blevet opnået med en daglig oral dosis på 100 · I

og 200 mg/kg dyrelegemsvægt (mg/kg). Forbindelserne absor- I

beres langsomt fra fordøjelseskanalen, og det er hyppigt I

35 ønskeligt at fortsætte indgivelsen i nogle dage eller en I

eller to uger eller mere til opnåelse af optimale virkninger. I

DK 175801 B1 7

Der er visse variationer efter dyreart på reaktionen på de forbindelser, som anvendes ifølge opfindelsen. Hos mus giver probucol f.eks. god inhibering af IL-1-frigivelse og antiinflammatoriske resultater ved en daglig dosis på 5 100 mg/kg, medens de resultater, som er opnået ved et anti inf lammatori sk forsøg med rotter ved denne dosismængde, har vist sig ikke at være statistisk forskellig fra kontrollerne.

Den formindskelse i IL-1-udskillelse, som er opnået ved indgift af 150 mg/kg til rotter, er mindre end den, som ses 10 med 100 mg/kg hos mus. Forskellen efter dyreart i reaktionsevne' mellem rotter og mus kan også ses, hvad angår chole-sterolformindskelse ved hjælp af probucol, idet rotter reagerer dårligt eller slet ikke på probucol indgivet i lave doser, som giver gode cholesterolnedsætteiser hos mus og 15 andre dyrearter, såsom hunde og primater.

Grundene til disse forskelle efter dyreart kan omfatte sådanne faktorer som forskelle i gastrisk absorption, forskellige hastigheder for udskillelse af forbindelsen fra blodstrømmen osv. Selvom forbindelserne vides at være rela-20 tivt ikke-toksiske og frie for uheldige bivirkninger, foretrækkes det almindeligvis at indgive forbindelserne i de laveste doser, som giver de ønskede resultater. Hvor der er tale om variationer efter dyreart, foretrækkes pattedyrarter, som reagerer på forbindelserne. Dyreartreaktionen kan be-25 stemmes ved forsøg til inhibering af IL-l-frigivelse eller inhibering af IL-1-medierede virkninger. De cholesterol-sænkende reaktioner hos en dyreart på probucol eller en eller flere af de kendte, cholesterolsænkende forbindelser kan også være til hjælp ved forudsigelse af dyreartens reak-30 tionsevne eller ikke-reaktionsevne på de IL-l-relaterede virkninger af forbindelserne, idet den cholesterolsænkende reaktion hos denne dyreart kan antyde, om signifikante mængder af forbindelsen absorberes eller fastholdes i kredsløbssystemet eller ikke.

35 Selvom forbindelserne anvendt ifølge opfindelsen, og probucol i særdeleshed, vides at være i stand til at sænke

I DK 175801 B1 I

I I

cholesterol samt formindske LDL- og HDL-cholesterol og in- I

hiberer oxidation af LDL-cholesterol, er det ikke nødvendigt I

for opfindelsens formål, at forbindelserne indgives til et I

dyr med behov for forbindelsernes cholesterolsænkende, lipid- I

5 sænkende eller cholesteroloxidationsinhiberende egenskaber. I

H Nogle af de forbindelser, som har værdifulde IL-l-frigivel- I

sesinhiberende egenskaber, har kun ringe eller negligerbar I

cholesterolsænkende aktivitet. Forbindelserne kan indgives I

H til et ikke-hypercholesterolæmisk pattedyr, som lider af I

I 10 IL-1-medieret betændelse, med fordelagtige resultater til I

nedsættelse eller eliminering af betændelsen. I

Forbindelserne anvendt ifølge opfindelsen kan for- I

muleres i konventionelle, farmaceutisk acceptable bærestoffer I

I til tilvejebringelse af enhedsdoseringsformer, som er be- I

H 15 kvemme til indgift. Almindeligvis kan kendte doseringsformer I

H og bærestofmaterialer, såsom dem, som er beskrevet i US pat- I

entskrift nr. 3.862.332, anvendes. Foretrukne former er I

I tabletter indeholdende 250 eller 500 mg af den aktive for- I

H bindelse, såsom de probucoltabletter, som for tiden anvendes I

I 20 til behandling af hypercholesterolæmi. I

Opfindelsen er yderligere illustreret i de efterføl- I

I gende eksempler. I

I Eksempel 1 I

I 25 I

Stimulering in vivo af IL-l-frigivelse. I

I Hanmus (CD-I-stamme, Charles River Laboratory), som I

I er 6-10 uger gamle, anvendes til studium af virkningen af I

forbindelser på IL-l-frigivelse. Musene injiceres intravenøst I

30 (i.v.) med en zymosansuspension indeholdende 2 mg zymosan i I

0,5 ml saltopløsning pr. mus 2 uger før afprøvning. En I

IL-l-fremkaldt akutfasereaktion kan derefter påvises 6 timer I

efter intravenøs injektion af lipopolysaccharid (LPS) i en I

dosis på 100 /ig/mus. Det anvendte LPS er fra Salmonella I

35 typhimurium, Re-mutant, Ribi Immunochemicals, Hamilton, MO. I

Den i.v. injektion af LPS i de zymosanbehandlede mus resul- I

DK 175801 B1 9 terer i en IL-1-fremkaldt produktion af akutfaseproteiner.

Et. akutfaseprotein, metallothionein, bevirker fjernelsen af zink fra kredsløbet, hvilket giver anledning til et hurtigt fald i serumzinkmængder, som kan måles ved atomabsorption.

5 Én gruppe zymosanbehandlede mus får indgivet probucol oralt (per os, p.o.) i en daglig dosismængde på 100 mg/kg (indgivet en gang dagligt) i 14 dage før afprøvning. En anden gruppe får indgivet vand p.o. uden probucol for at tjene som kontrolgruppe.

10 På den 14. dag afprøves to undergrupper af mus, en vand-saltopløsning-kontrolundergruppe og en probucol-saltopløsning alene-undergruppe, får serumzinkniveauer uden indgivelse af LPS. To andre undergrupper, en vand-LPS-alene-og en probucol-LPS-gruppe, for indgivet LPS som ovenfor 15 ' beskrevet, idet vand-LPS-undergruppen har fået vand uden probucol. 6 timer efter indgivelse af LPS opsamles perifert blod fra de individuelle mus og afprøves for zink. Antallet af mus pr. gruppe (N) og resultaterne i dele pr. million (ppm) for zink er'vist i nedenstående tabel.

20

Inhibering af LPS-fremkaldt fald i serumzink (Middel ± standardafvigelse fra middel) (N)

Afprøv- Vand Vand Probucul Probucol

25 ning p.o.- p.o.-LPS p.o.- p.o.-LPS

saltop- i.v. saltop- i.v.

løsning løsning i.v. i.v.

kontrol 30 _' _

Zink 1,34 ± 0,59 ± 1,35 ± 1,03 ± (ppm) 0,06* (11) 0,04 (6) 0,03* (9) 0,29* (5) 35 * Signifikant forskellig fra kontrol (vand p.o., LPS i.v.) p s 0,01.

I DK 175801 B1 I

I 10 I

Eksempel 2 I

Protokollen fra eksempel 1 gentages, og serumzink- I

niveauerne måles igen. I

5 Inhibering af LPS-fremkaldt fald i serumzink ; I

I (Middel ± standardafvigelse fra middel) (N) ' I

Afprøv- Vand Vand Probucul Probucol I

ning p.o.- p.o.-LPS p.o.- p.o.-LPS I

10 saltop- i.v. saltop- i.v. I

løsning løsning I

i.v. i.v. :

I kontrol I

I 15 Zink 1,24±0,02 0,25± 1,15± 0,63+ I

I (ppm) (7) 0,04 (5) 0,05 (9) 0,08* (9) I

* Signifikant forskellig fra kontrol (vand p.o., LPS i.v.) I

20 p s 0,01 I

I Eksempel 3 I

Behandlino af IL-l-medieret betændelse. I

25 Kronisk betændelse fremkaldes hos mus ved injektion I

af varmedræbt Mycobacterium butyricum (0,1 ml af en 25 mg/ml I

I suspension i mineralolie) subcutant i musenes bagpoter. Ved I

I denne metode injiceres den ene bagpote, og den anden efter- I

I lades ubehandlet. Injektionen resulterer i en lokaliseret I

30 granuloma, som udvikles i løbet af ca. 1 uge og derefter I

I langsomt formindskes i løbet af de næste flere uger·. Opsvulm- I

ningen af de granulomatøse poter måles volumetrisk og sammen- I

I lignes med de ikke-injicerede poter. Denne metode gennemføres I

med fire grupper mus, idet poteopsvulmningsmålinger foretages I

I 35 en, to og fem uger efter injektion af Mycobacterium·butyri- I

I cum. Den ene gruppe får indgivet vand for at tjene som kon- I

DK 175801 B1 11 ' trol. De tre andre grupper får oralt indgivet en forsøgsfor bindelse, prednison, probucol eller ibuprofen, i en dosismængde på 100 mg/kg pr. dag, idet der startes på dagen for granulomafremkaldelsen. Den gennemsnitlige poteopsvulmning 5 udtrykt som en procentvis stigning i volumen (± standardaf vigelse) sammenlignet med den modsatte, ikke-injicerede pote, den procentvise formindskelse af opsvulmning opnået med forsøgsforbindelser, niveauet for statistisk signifikant forskel fra resultaterne med kontrolgruppen (p-værdi) og ' 10 antallet af mus pr. gruppe (N) er vist i nedenstående tabel.

'

112 DK 175801 B1 I

lO I

co r* ;

rH

C CN O rH O O O

(D i—I rH rH t—I o¥> i—I

u-t c*p — -η m *— n—'

O Ή 00 (N HH rH

, k m η ^ in in

Qj in o » o η o X) cn O CN O rH o

j^MCTl VI rH ViCTi VI

-Η I

Ϊ CN eV> — ^ oY> r-s r- I

Jr rH OJO rH 10 O - # O

Jjj rH rnrHrHVHin CNrH

O U +1 HH I

x 3 n rH rH in

‘-‘'XJ-OOOCDO

i^tHrHOCTlOrHO I

^jOjrHvioovir'Vi

cC-OOJHt^i.* I

5 O id oVt-h ih o\° o\ r~ éP ca r! ro r- — t'- —· iN— V -H +1 C" HH in +1 ·ςΓ

I. C rH rH rH H

^ΌΓΗ O CM O rH O

ti>H{-OOOrHO

j^fcn.virvivDvi

ø rH HH OHHiShHiS I

ν’ ^H t" 1—0 I Η I

Λ u H

u, C <h i i in i

O VD i VD O

03 X! rH rH rH

10 rH (Ud)· fl) ^ Di 0) S u u 3 3 js T3 <U (U 0) « ή O') CH 0) Hna .

g Η h 3 oj 3 m3

I ε ϊ Ϊ I

! H η D

n UH K-l -

£ °> V U

Λ a) <u cu

w ro m u U

— rH . rH λ rH Q Q H

<d) <d) <C(D ΌΌ

DllO^- DlMJir Olllliir, c ros c rose ms corn •H HH Ti ^ -rH +i ό — -H +1 i3 — 3 3

CCGGCCEE

C Η Ή Ή E Η ·Η Ή E rH -ri -Η Η

Η H) Ε Ό η (1) Ε Ό rH <D E Ό CC

3 Τ3 >Η >η 3 Β k h 3Ό>η>η ω U

>· Ό 0 W > Ό 0 tø > Β 0 Κ 0)-Hi»H>[n-H‘W>CI3-H<W> & 2 ι α 2 α 2 « * ο — # a ο w «*ρ Οι * * i

Eksempel 4 DK 175801 B1 13

Inhibering ex vivo af IL-l-udskillelse.

Peritoneale makrofager opnået fra. CD-l-mus indsamles 5 og vaskes en gang med RPI-1640-medium (GIBCO, Grand Island,

New York) indeholdende 100 enheder/ml penicillin, 100 /ig/ml streptomycin og 25 μg/ml fungizon (GIBCO, Grand Island, NY).

Cellerne suspenderes med 6 x 106 pr. ml, og portioner på 1 ml fyldes på plader med seks fladbundede huller. Efter 1 10 times inkubering ved 37°C i et fugteluftkammer indeholdende 5% CO2 fjernes ikke-adhærerende celler, og 1 ml RPMI-medium (med eller uden lipopolysaccharid - 100 /xg/hul) sættes til hvert enkelt hul. Som diskuteret ovenfor i eksempel 1 stimulerer LPS makrofager til frigivelse af IL-1. Inkubering 15 fortsættes i 6 timer, hvorefter den ovenstående kulturvæske indsamles og filtreres gennem 0,22 μπι "Acrodisc"-filtre (Gelman, Ann Arbor, MI). Væsken opbevares ved en temperatur på -70°C indtil afprøvning for IL-1-aktivitet.

IL-1-aktiviteten bestemmes ved C3H/HeJ-thymocytfor-20 meringsafprøvningen ifølge Mizel et al., J. Immunol. 120, 1497 (1978). Ved denne metode inkuberes thymocyter fra C3H/HeJ-mus med den ovenstående makrofagkulturvæske i nærværelse af phytohæmagglutinin og pulseres ved inkubering med ^H-thymidin. Derefter høstes cellerne, og radioaktivi-25 teten bestemmes ved væskescintillationstælling. IL-l-aktivi-teten udtrykkes som enheder defineret ifølge Mizel et al., J. Immunol. 120, 1497 (1978).

Forbindelserne afprøves ved denne metode ved oral indgift til CD-l-mus 40, 24 og 16 timer før indsamling af 30 peritoneale makrofager. Den anvendte dosis er 100 mg/kg.

Ved et forsøg giver peritoneale makrofager fra ubehandlede kontrolmus resultater på 677 + 59 IL-l-enheder/ml, medens den probucolbehandlede gruppe giver afprøvningsresultater på kun 171 ± 15 IL-l-enhéder/ml, hvilket viser, at en ! 35 inhibering på 75% af IL-l-udskillelse er opnået med oral j indgift af probucol. Ved et andet forsøg giver kontrolgruppen

I DK 175801 B1 I

I ! I

I af mus 960 + 42 IL-l-enheder/ml sammenlignet med 153 + 18 I

enheder/ml i den probucolbehandlede gruppe, en formindskelse I

I på 84%. Ved et tredje forsøg er kontrolgruppen 779 +90 I

I IL-l-enheder/ml, medens probucolgruppeafprøvningen er I

I 5 114 ± 13 IL-l-enheder/ml, hvilket viser, at der er opnået I

I en inhibering af IL-l-udskillelse på 86% ved indgiften af I

I probucol. Ved et fjerde forsøg er rotter blevet anvendt som I

I forsøgsdyr, og probucoldosis er 150 mg/kg. Ved dette forsøg I

I giver kontrolgruppen 271 ±6 enheder/ml, og de probucol- I

10 behandlede rotter giver 187 + 15 enheder/ml, en formindskelse I

I på 31%. Ovenstående resultater er udtrykt som gennemsnittet I

I + standardafvigelsen fra middel. Alle probucolrésultater er I

I signifikant forskellige fra kontrollen med p s0,01. I

I 15 Eksempel 5 I

I Fremgangsmåden ifølge eksempel 4 gentages ved anven-

I delse af forskellige alkylidendithio-bis-(substitueret)- I

I phenolforbindelser. Den procentvise formindskelse af IL-1- I

udskillelse, som er opnået med forbindelserne (afrundet til I

20 nærmeste hele procent) er vist i nedenstående tabel. I

I I

Ϊ DK 175801 B1 15

Formindskelse af IL-l-udskillelse %formind-skelse af 5 R’ og OH til IL-l-ud- R R" R-j^ R2 S* skillelse t-butyl t-butyl methyl n-propyl para 55 t-butyl t-butyl H ethyl para 54 10 t-butyl t-butyl ethyl ethyl para 96 t-butyl t-butyl methyl 2-ketopro- para 68 pyl t-butyl t-butyl methyl n-hexyl para 90 t-butyl t-butyl methyl formel II, para 92 15 n=2, R,R' og R"=tert--butyl, R^smethyl t-butyl methyl H methyl para 92 20 t-butyl methyl methyl ethyl para 72 t-butyl methyl methyl n-butyl para 45 t-pentyl t-pentyl methyl methyl para 65 t-butyl t-butyl methyl methyl ortho 89 25 * Angiver stillingen af hydroxylgruppen på phenolringen i forhold til thiosvovlatomet.

Η

I DK 175801 B1 ' I

I I

I Eksempel 6 I

I Virkning på udskillelse af interleukiner 2 og 3 oq virkninger I

I på lvmfocvtformering, I

I 5 IL-2 er nødvendig til frembringelse af T-lymfocyter I

I i og til klonal ekspansion af T-lymfocyter# og IL-3 er en I

vækstfaktor for granulocyter. Virkningen af probucol på I

I udskillelsen af interleukin-2 og interleukin-3 (IL-2 og I

I IL-3) er blevet studeret ved en metode mage til den, som er I

I 10 beskrevet af Bowlin et al., Cellular Immunology, 98, I

I 341-350 (1986), ved anvendelse af miltceller fra mus doseret

I med probucol som i eksempel 4 og cellestimulering med con- I

canavalin-A. I

I Når miltcellerne fra probucoldoserede mus stimuleres I

15 med concanavalin-A in vitro, udskiller cellerne ikke mindre H

I IL-2 og IL-3 end normale miltceller (fra mus, som ikke er H

I behandlet med probucol). Disse resultater viser, at probu- I

I colbehandlingen ikke inhiberer frembringelsen, syntesen og H

udskillelsen af de immunologiske mediatorer IL-2 og IL-3. H

I 20 Ved andre forsøg er mitogenerne lipopolysaccharider I

(LPS) og concanavalin-A blevet anvendt til frembringelse af I formering af henholdsvis B- og T-lymfocyter fra både normale, I ubehandlede musemiltceller og miltceller fra mus, som har

I fået indgivet probucol (100 mg/kg oralt indgivet 40, 24 og I

I 25 16 timer forud for forsøget) . Formeringen af miltcellerne I

I fra probucolbehandlede mus er ikke inhiberet sammenlignet I

I med kontrollen, normale miltcellekulturer, hvilket viser, I

I at der ikke er nogen inhiberende virkning på mitogenfremkaldt . I

I miltcelleformering ved en probucoldosis, som inhiberer H

I 30 IL-l-frigivelse. I

Claims (15)

1. Anvendelse af en forbindelse svarende til formlen ,.-0--;—ø-

2. Anvendelse ifølge krav l,kendetegnet I ved, at der anvendes en forbindelse, hvori R, R' og R" alle I betyder tertiært butyl. I

3. Anvendelse ifølge krav 2,kendetegnet I H , 5 ved, at der anvendes en forbindelse, hvori R er tertiært I butyl, Ri er methyl, og R2 er alkyl med 1-3 carbonatomer. I

4. Anvendelse ifølge krav 1, kendetegnet I ved, at forbindelsen svarer til formlen I I 10 I I v _>r I I (i,) I I R’ R2 R· I 20 hvor R betyder tertiært butyl eller tertiært pentyl, R' og I R" betyder hydrogen, methyl, ethyl, propyl, butyl eller I I pentyl, idet dog R' og R" ikke er isopropyl, R^ betyder I hydrogen, methyl eller ethyl, og R2 betydér alkyl med 1-6 I I carbonatomer eller ketosubstitueret alkyl med 3-6 carbon- I H 25 atomer, eller R2 betyder en gruppe svarende til formlen I I I I R (CH2)n J I - -0~-1-0~ I * I R· *1 R I 1 35 I hvor n er 2, 3 eller 4. I DK 175801 B1 I 19

5. Anvendelse ifølge krav 4, kendetegnet ved, at forbindselsen svarer til formlen ** S hojø^s-|-s-<Q^o8 R' R2 Η* 10 j hvor R er tertiært butyl eller tertiært pentyl, R' og R'’ er hydrogen, methyl, ethyl, propyl, butyl eller pentyl, 15 idet dog R' og R'' ikke er isopropyl, R^ er hydrogen, methyl eller ethyl, og R2 er alkyl med 1-6 carbonatomer eller keto-substitueret alkyl med 3-6 carbonatomer.

6. Anvendelse ifølge krav 5, kendetegnet ved, at der anvendes en forbindelse, R-± betyder methyl, og

20 R2 betyder alkyl med 1-3 carbonatomer.

7. Anvendelse ifølge krav 5, kendetegnet ved, at forbindelsen er probucol.

8. Anvendelse ifølge krav 5,kendetegnet ved, at R og R' begge er tertiært butyl, R^ er methyl, og

25 R2 er n-propyl.

9. Anvendelse ifølge krav 5, kendetegnet ved, at R og R' begge er tertiært butyl, R^ er methyl, og , R2 er 2-ketopropyl.

10. Anvendelse ifølge krav 5, kendetegnet 30 ved, at R og R' begge er tertiært butyl, R^ er hydrogen, og R2 er ethyl.

10 R· R2 Il ls hvor R betyder tertiært butyl eller tertiært pentyl, R' og R" betyder hydrogen, methyl, ethyl, propyl, butyl eller pentyl, idet dog R' og R" ikke er isopropyl, R^ betyder hydrogen, methyl eller ethyl, og R2 betyder alkyl med 1-6 carbonatomer eller ketosubstitueret alkyl med 3-6 car-20 bonatomer, eller R2 betyder en gruppe svarende til formlen R’ Ri R" 30 hvor n er 2, 3 eller 4, til fremstilling af et lægemiddel til inhibering af interleukin-1-medierede virkninger bortset 35 fra atherosklerose og/eller hyperlipidæmi. I DK 175801 B1 I I i

11. Anvendelse ifølge krav l, kendetegnet ved, at lægemidlet skal indgives til et ikke-hyperchole-sterolæmisk pattedyr.

12. Anvendelse ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den interleukin-1-medierede virkning er inflamma- I DK 175801 B1 I tion. I

13. Anvendelse ifølge krav 12,kendetegnet I ved, at forbindelsen er probucol. I

14. Anvendelse ifølge krav l, kendetegnet I 5 ved, at den interleukin-1-medierede virkning er diabetes.

15. Anvendelse ifølge krav 1, kendetegnet I ved, at den interleukin-1-medierede virkning er psoriasis. I H H