DK173678B1 - Farmaceutiske præparater indeholdende en serinproteaseinhibitor - Google Patents
Farmaceutiske præparater indeholdende en serinproteaseinhibitor Download PDFInfo
- Publication number
- DK173678B1 DK173678B1 DK198603742A DK374286A DK173678B1 DK 173678 B1 DK173678 B1 DK 173678B1 DK 198603742 A DK198603742 A DK 198603742A DK 374286 A DK374286 A DK 374286A DK 173678 B1 DK173678 B1 DK 173678B1
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- cys
- lys
- pro
- inhibitor
- gly
- Prior art date
Links
- 101710102218 Serine protease inhibitor Proteins 0.000 title claims abstract description 27
- 108010028275 Leukocyte Elastase Proteins 0.000 title description 17
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 title description 12
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 title description 12
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 title description 12
- LKDMKWNDBAVNQZ-UHFFFAOYSA-N 4-[[1-[[1-[2-[[1-(4-nitroanilino)-1-oxo-3-phenylpropan-2-yl]carbamoyl]pyrrolidin-1-yl]-1-oxopropan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC(=O)CCC(=O)NC(C)C(=O)NC(C)C(=O)N1CCCC1C(=O)NC(C(=O)NC=1C=CC(=CC=1)[N+]([O-])=O)CC1=CC=CC=C1 LKDMKWNDBAVNQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 title description 5
- 108090000617 Cathepsin G Proteins 0.000 title description 5
- 102000004173 Cathepsin G Human genes 0.000 title description 5
- 102000016387 Pancreatic elastase Human genes 0.000 title description 4
- 108010067372 Pancreatic elastase Proteins 0.000 title description 4
- 102000016799 Leukocyte elastase Human genes 0.000 title 1
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims abstract description 22
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 34
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 34
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 28
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims description 24
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 21
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 claims description 14
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 claims description 14
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 13
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 11
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 2
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 abstract description 46
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 46
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 46
- 239000003001 serine protease inhibitor Substances 0.000 abstract description 27
- 229940122055 Serine protease inhibitor Drugs 0.000 abstract description 21
- 230000028327 secretion Effects 0.000 abstract description 21
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 7
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 abstract description 7
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 abstract description 6
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 5
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 abstract description 3
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 abstract description 3
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 3
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 abstract description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 abstract description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 abstract description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 abstract description 2
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 abstract 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 abstract 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 abstract 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 abstract 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 abstract 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 abstract 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 abstract 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 abstract 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 56
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 45
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 40
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 35
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 33
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 21
- 102100033174 Neutrophil elastase Human genes 0.000 description 18
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 17
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 17
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 16
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 15
- 239000000463 material Substances 0.000 description 13
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 12
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 12
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 description 12
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 12
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 9
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 9
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 8
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 8
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 8
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 7
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 7
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 101710091916 Leukocyte elastase inhibitor Proteins 0.000 description 6
- 102100030635 Leukocyte elastase inhibitor Human genes 0.000 description 6
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 6
- 239000003591 leukocyte elastase inhibitor Substances 0.000 description 6
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 6
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 5
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 5
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 5
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 5
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 5
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 5
- 206010014561 Emphysema Diseases 0.000 description 4
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 4
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 241001573961 Parotis Species 0.000 description 3
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 3
- 230000002939 deleterious effect Effects 0.000 description 3
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 3
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 229940122858 Elastase inhibitor Drugs 0.000 description 2
- 101001010513 Homo sapiens Leukocyte elastase inhibitor Proteins 0.000 description 2
- 101000851058 Homo sapiens Neutrophil elastase Proteins 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- CNGOEHJCLVCJHN-SRVKXCTJSA-N Lys-Pro-Glu Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O CNGOEHJCLVCJHN-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- 101001018085 Lysobacter enzymogenes Lysyl endopeptidase Proteins 0.000 description 2
- 102000035092 Neutral proteases Human genes 0.000 description 2
- 108091005507 Neutral proteases Proteins 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 206010033645 Pancreatitis Diseases 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 2
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 2
- 229940122618 Trypsin inhibitor Drugs 0.000 description 2
- 101710162629 Trypsin inhibitor Proteins 0.000 description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 2
- 239000011149 active material Substances 0.000 description 2
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 2
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 108090001092 clostripain Proteins 0.000 description 2
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 2
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000003292 diminished effect Effects 0.000 description 2
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 2
- 239000003602 elastase inhibitor Substances 0.000 description 2
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 2
- 239000002532 enzyme inhibitor Substances 0.000 description 2
- 229940125532 enzyme inhibitor Drugs 0.000 description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 2
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 2
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 102000055165 human SERPINB1 Human genes 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 2
- VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N perchloric acid Chemical compound OCl(=O)(=O)=O VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 150000003355 serines Chemical class 0.000 description 2
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010000830 Acute leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 102100033312 Alpha-2-macroglobulin Human genes 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 1
- 101100335897 Caenorhabditis elegans gly-9 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000017667 Chronic Disease Diseases 0.000 description 1
- 206010018364 Glomerulonephritis Diseases 0.000 description 1
- 108010051815 Glutamyl endopeptidase Proteins 0.000 description 1
- 108010053070 Glutathione Disulfide Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000933179 Homo sapiens Cathepsin G Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- ZUKPVRWZDMRIEO-VKHMYHEASA-N L-cysteinylglycine Chemical compound SC[C@H]([NH3+])C(=O)NCC([O-])=O ZUKPVRWZDMRIEO-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000019693 Lung disease Diseases 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 101100205189 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) leu-5 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 208000037273 Pathologic Processes Diseases 0.000 description 1
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010015078 Pregnancy-Associated alpha 2-Macroglobulins Proteins 0.000 description 1
- IIRBTQHFVNGPMQ-AVGNSLFASA-N Pro-Val-Lys Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 IIRBTQHFVNGPMQ-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 1
- 241000208474 Protea Species 0.000 description 1
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101150006914 TRP1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108090001109 Thermolysin Proteins 0.000 description 1
- HYLXOQURIOCKIH-VQVTYTSYSA-N Thr-Arg Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N HYLXOQURIOCKIH-VQVTYTSYSA-N 0.000 description 1
- LVTKHGUGBGNBPL-UHFFFAOYSA-N Trp-P-1 Chemical compound N1C2=CC=CC=C2C2=C1C(C)=C(N)N=C2C LVTKHGUGBGNBPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010064390 Tumour invasion Diseases 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000002730 additional effect Effects 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 230000009400 cancer invasion Effects 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000003541 chymotrypsin inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 1
- 230000024203 complement activation Effects 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 239000012045 crude solution Substances 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010016616 cysteinylglycine Proteins 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000002849 elastaseinhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N glutathione disulfide Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CSSC[C@@H](C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CC[C@H](N)C(O)=O YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000052896 human CTSG Human genes 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 208000026278 immune system disease Diseases 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000001524 infective effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 1
- JDNTWHVOXJZDSN-UHFFFAOYSA-N iodoacetic acid Chemical compound OC(=O)CI JDNTWHVOXJZDSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000003387 muscular Effects 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- YPZRWBKMTBYPTK-UHFFFAOYSA-N oxidized gamma-L-glutamyl-L-cysteinylglycine Natural products OC(=O)C(N)CCC(=O)NC(C(=O)NCC(O)=O)CSSCC(C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CCC(N)C(O)=O YPZRWBKMTBYPTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004923 pancreatic tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000003071 parasitic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009054 pathological process Effects 0.000 description 1
- 201000001245 periodontitis Diseases 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 description 1
- XEBWQGVWTUSTLN-UHFFFAOYSA-M phenylmercury acetate Chemical compound CC(=O)O[Hg]C1=CC=CC=C1 XEBWQGVWTUSTLN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- -1 proline Chemical class 0.000 description 1
- 239000003380 propellant Substances 0.000 description 1
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 1
- 230000012743 protein tagging Effects 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- 210000002955 secretory cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 1
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 1
- 230000005477 standard model Effects 0.000 description 1
- 238000012799 strong cation exchange Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 1
- WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N tfa trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F.OC(=O)C(F)(F)F WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 229960002898 threonine Drugs 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/81—Protease inhibitors
- C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
- C07K14/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
DK 173678 B1 i
Farmaceutiske præparater indeholdende en serinprotease-inhibitor
Opfindelsen angår hidtil ukendte farmaceutiske præparater indeholdende et serinproteaseinhibitor-protein, som inhi-5 berer proteaseaktiviteten af mindst én serinprotease.
OPFINDELSENS BAGGRUND
Endogene proteolytiske enzymer tjener til at nedbryde invaderende organismer, antigen-antistof-komplekser og visse vævsproteiner, som ikke længere er nødvendige eller 10 nyttige for organismen. I en normalt fungerende organisme produceres proteolytiske enzymer i begrænset mængde og reguleres til dels via syntesen af proteaseinhibitorer.
Et stort antal naturligt forekommende proteaseinhibitorer tjener til at kontrollere de endogene proteaser ved at 15 begrænse deres reaktioner lokalt og temporalt. Desuden kan proteaseinhibitorerne inhibere proteaser indført i kroppen af infektive og parasitiske agenser. Væv, som er særligt udsat for proteolytisk angreb og infektion, f. eks. sådanne i åndedrætesvejene, er rige på proteaseinhi-20 bitorer.
Proteaseinhibitorer omfatter tilnærmelsesvis 10% af de humane plasmaproteiner. Mindst otte inhibitorer er blevet isoleret fra denne kilde og karakteriseret i litteraturen. Disse inkluderer a2-macroglobulin (o^M), o^-protea-25 seinhibitor (α,ΡΙ), o^-antichymotrypsin (a,Achy), β,-anti-collagenase (β(Α0) og inter-a-trypsin-inhibitor (lal).
En forstyrrelse af protease/proteaseinhibitor-balancen kan føre til proteaseformidlet vævsdestruktion, herunder emphysema, arthritis, glomerulonephritis, periodontitis, 30 muskulær dystrophia, tumorinvasion og forskellige andre patologiske tilstande. I visse situationer, f. eks. al- 2 DK 173678 B1 vorlige patologiske processer, såsom sepsis eller akut leukæmia, forøges den tilstedeværende mængde af frie pro-teolytiske enzymer p.g.a. frigørelsen af enzym fra de se-kretoriske celler. Desuden, eller separat i andre situa-5 tioner, kan en formindsket regulerende inhibitorkapacitet i organismen også forårsage ændringer i protease/prote-aseinhibitor-balancen. Et eksempel på en sådan formindsket regulerende inhibitorkapacitet er otj-proteaseinhi-bitor-deficiens, som er højkorreleret med udviklingen af 10 pulmonært emphysema.
I organismer, hvor sådanne afvigende tilstande forekommer, kan der ske alvorlig skade på organismen, med mindre der tages forholdsregler til at kontrollere de proteoly-tiske enzymer. Derfor er der blevet søgt efter protea-15 seinhibitorer, som er i stand til at ingives en organisme for at kontrollere de proteolytiske enzymer.
Leukocytelastase er et eksempel på en serinprotease af særlig interesse fra et farmakologisk standpunkt. Når leukocytelastase frigøres ekstracellulært, nedbryder den 20 bindevæv og andre værdifulde proteiner. Selv om det er nødvendigt for en normalt fungerende organisme at nedbryde en vis mængde bindevæv og andre proteiner, er forekomsten af en overskydende mængde leukocytelastase blevet forbundet med forskellige patologiske tilstande, såsom 25 emphysema og rheumatoid arthritis. For at modvirke virkningerne af leukocytelastase, når den er tilstede i større mængder end normalt, er der blevet søgt efter en pro-teaseinhibitor, som er effektiv over for leukocytelastase. En sådan proteaseinhibitor ville være særlig nyttig, 30 hvis den kunne fremstilles via en rekombinant-DNA-metode i renset form og i tilstrækkelige mængder til at være farmaceutisk anvendelig.
3 DK 173678 B1
Tidligere er der blevet identificeret mindst to leukocy-telastaseinhibitorer i litteraturen. Et protein, beskrevet i Schiessler et al., "Acid-Stable Inhibitors of Granulocyte Neutral Proteases in Human Mucous Secretions: 5 Biochemistry and Possible Biological Function", i bogen Neutral Proteases of Human Polymorphoneuclear Leucocytes, Havemann et al. (eds), Urban and Schwazenberg, Inc.
(1978), blev isoleret fra humant seminalt plasma og sputum og blev karakteriseret som værende af en størrelse på 10 omkring 11 kilodalton med tyrosin som den N-terminale aminosyre. Litteraturrapporterne om dette protein har kun givet en delvis aminosyresekvens, men selv denne delvise sekvens viser, at dette protein varierer væsentligt fra proteinet ifølge den foreliggende opfindelse. Rapporterne 15 om sekvensen af dette protein i kombination med aminosy-resekvensdata for proteinet ifølge opfindelsen siger de nærværende opfindere, at det produkt, som er sekvensbestemt af Schiessler et al., kan have været et nedbrudt protein, som ikke var en enkeltpolypeptidkæde.
20 Et andet protein, isoleret i et tilfælde fra humant plasma, er blevet navngivet α,-proteaseinhibitor. Arbejde på dette protein er blevet sammenfattet i en oversigt af Travis og Salvesen, Annual Review of Biochemistry 52: 655-709 (1983). Rapporterne om dette proteins aminosyre-25 sekvens viser, at det også adskiller sig væsentligt fra proteinerne ifølge den foreliggende opfindelse.
På grund af de væsentlige forskelle i struktur mellem en-keltpolypeptidkæde-proteinerne ifølge den foreliggende opfindelse og alle hidtil kendte enkeltpolypeptidkæde-30 serinproteaseinhibitorer, er de kendte enkeltpolypeptid-kæde-serinproteaseinhibitorer ikke "væsentligt homologe" med proteinerne ifølge den foreliggende opfindelse.
4 DK 173678 B1
Trypsin er en anden protease af særlig interesse fra et farmakologisk standpunkt. Trypsin er kendt for at starte nedbrydning af visse bløde organvæv, såsom pancreasvæv, under en række forskellige akutte tilstande, såsom pan-5 creatitis. Forskellige anstrengelser har været rettet mod behandlingen af disse tilstande via anvendelsen af proteiner, som man håbede ville inhibere virkningen af trypsin, men uden særligt held. Belysende for sådanne anstrengelser er forsøg på at anvende exogene oksetrypsi-10 ninhibitorer til behandling af human pancreatitis. Selv om sådanne teknikker er blevet forsøgt i Europa, er de ikke blevet godkendt som effektive af the U.S. Food and Drug Administration. Således er der behov for en protea-seinhibitor, som er effektiv til neutralisering af over-15 skud af trypsin ved en række forskellige akutte og kroniske tilstande. Som det var tilfældet med den ovenfor omtalte leukocytelastaseinhibitor, ville en trypsininhibi-tor være særlig nyttig, hvis den kunne isoleres og fremstilles ved rekombinant-DNA-metoder i renset form og i 20 tilstrækkelige mængder til at være farmaceutisk anvendelige.
Cathepsin G er en anden protease, som er tilstede i store mængder i leukocytter. Cathepsin G vides at være i stand til at nedbryde in vitro en række forskellige værdifulde 25 proteiner, herunder dem i komplementreaktionsvejen. Pan-creatisk elastase er en anden protease, som kan spille en rolle ved pancreatitis. Således er inhibitorer for disse proteaser også af potentiel farmaceutisk værdi.
Leukocytelastase, trypsin, cathepsin G og pancreatisk 30 elastase er eksempler på en klasse af proteaser, kendt som serinproteaser, som har elementer af fælles struktur og mekanisme. Deres aktivitet over for forskellige substrater og deres følsomhed for forskellige inhibitorer antages at stamme fra ændringer i kun nogle få aminosyre- 5 DK 173678 B1 rester. Ved analogi er det muligt at udtænke en klasse af serinproteaseinhibitorer, som også har fælles elementer af struktur og mekanisme, hvorved ændringer i relativt få aminosyrer vil resultere i inhibering af forskellige pro-5 teaser, idet det antages at mindst ét medlem af denne klasse vil inhibere enhver serinprotease af den førnævnte klasse. Klassen af serinproteaseinhibitorer ville så være af væsentlig værdi.
SAMMENFATNING AF OPFINDELSEN
10 Denne opfindelse angår et farmaceutisk præparet indeholdende en inhibitor rettet mod humane polymorfkernet (PMN) granulocyt-proteaser. Især angår opfindelsen et farmaceutisk præparet indeholdende en inhibitor for serinprotea-ser, herunder human leukocytelastase og trypsin.
15 Et formål for opfindelsen er tilvejebringelse af farmaceutiske præparater, som indeholder en renset form af en sådan proteaseinhibitor og udøver aktivitet over for leukocytelastase og andre serinproteaser.
Der er fundet en 12 kDa proteaseinhibitor, isoleret i 20 renset form fra parotissekretioner, hvori aminosyrese-kvensen varierer stærkt fra de tidligere rapporterede sekvenser af enkeltpolypeptidkæde-serinproteaseinhibitorer.
Denne proteaseinhibitor antages at have mindst to aktive sites. Et site udøver leukocytelastase-inhiberende egen-25 skaber, medens et andet site udøver aktivitet overfor trypsin. Opfinderne i denne sag har nøjagtigt sekvensbestemt hele længden af den omhandlede proteaseinhibitor.
I overensstemmelse hermed tilvejebringes ifølge opfindelsen farmaceutiske præparater, der som mindst én af de ak-30 tive ingredienser indeholder et renset serinproteaseinhi-bitor-protein omfattende en enkelt ufragmenteret polypep-tidkæde, hvilken serinprotease-inhibitor inhiberer pro- 6 DK 173678 B1 teaseaktiviteten af mindst én serinprotease og omfatter aminosyresekvensen:
Ser-Gly-Lys-Ser-Phe-Lys-Ala-Gly-Val-Cys-Pro-Pro-Lys-Lys-Ser-Ala-Gln-Cys-Leu-Arg-Tyr-Lys-5 Lys-Pro-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp-Trp-Gln-Cys-Pro-
Gly-Lys-Lys-Arg-Cys-Cys-Pro-Asp-Thr-Cys-Gly-Ile-Lys-Cys-Leu-Asp-Pro-Val-Asp-Thr-Pro-Asn-Pro-Thr-Arg-Arg-Lys-Pro-Gly-Lys-Cys-Pro-Val-Thr-Tyr-Gly-Gln-Cys-Leu-Met-Leu-Asn-Pro-Pro-10 Asn-Phe-Cys-Glu-Met-Asp-Gly-Gln-Cys-Lys-Arg-
Asp-Leu-Lys-Cys-Cys-Met-Gly-Met-Cys-Gly-Lys-Ser-Cys-Val-Ser-Pro-Val-Lys-Ala.
Serinproteaseinhibitoren har evnen til, efter at være fuldstændigt denatureret, at danne eller gendanne disul-15 fidbindinger og undergå passsende ikke-kovalente samvirk-ninger, som er nødvendige for at antage eller genantage en aktiv tertiær struktur, der er i stand til at udøve den ønskede serinproteaseinhibitor-aktivitet i fravær af enhver biokemisk stimulus.
20 BESKRIVELSE AF DEH FORETRUKNE UDFØRELSESFORM
I det følgende skal mere detaljeret beskrives den for tiden foretrukne udførelsesform af opfindelsen, som sammen med de efterfølgende eksempler tjener til at forklare opfindelsens principper.
25 Serinproteaseinhibitoren, som indgår i de farmaceutiske præparater ifølge opfindelsen, er bemærkelsesværdigt resistent over for denaturering p.g.a. varme og syrer og resistent over for tab af aktivietet, når den udsættes for mange proteolytiske enzymer, herunder chymotrypsin, 30 muse-submaxillær-protease og clostripain. Inhibitoren har også evnen til at danne de nødvendige disulfidbindinger og undergå passende ikke-kovalente samvirkninger for at 7 DK 173678 B1 antage en aktiv tertiær struktur, som er i stand til at udøve serinproteaseinhibitor-aktivitet i fravær af en biokemisk stimulus eller, hvis disulfidbindingerne er blevet brudt, og de ikke-kovalente samvirkninger er ble-5 vet afbrudt, at gendanne sådanne bindinger og samvirknin-ger for at genopnå en sådan aktiv tertiær struktur i fravær af biokemisk stimulus.
Den omhandlede serinproteaseinhibitor er blevet opdaget i parotissekretioner og er blevet isoleret i renset form. I 10 denne beskrivelse med krav skal "ren form" eller "renset form", når de anvendes om den her omhandlede proteasein-- hibitor, betyde i det væsentlige fri for andre proteiner, som ikke er serinproteaseinhibitor-proteiner. Fortrinsvis er denne proteaseinhibitor mindst 90% ren og fortrinsvis 15 95% ren.
I en foretrukken form af opfindelsen opnås parotissekretioner fra mennesker. Imidlertid forudses det, at parotissekretioner opnået fra andre pattedyrkilder vil være anvendelige til fremstilling af proteaseinhibitorer med 20 ækvivalent aktivitet til den omhandlede inhibitor.
Serinproteaseinhibitoren til anvendelse i de farmaceutiske præparater ifølge opfindelsen kan isoleres i ren form fra parotissekretioner ved en fremgangsmåde, hvorved (a) der opsamles pattedyr-parotis-sekretioner, 25 (b) inhibitoren isoleres fra parotissekretionerne ved fraktionering af det proteinholdige materiale i sekretionerne, (c) de fraktioner, som har serinproteaseinhibitor-akti-vitet, fortrinsvis leukocytelastaseinhibitor-aktivitet, 30 isoleres, og 8 DK 173678 B1 (d) fraktionerne, som udviser serinproteaseinhibitor-aktiviteten, koncentreres.
Ved denne fremgangsmåde kan pattedyr-parotis-sekretioner opsamles ved hjælp af alle kendte midler. Det foretræk-5 kes, at de opsamles ved anvendelse af et sugeapparat anbragt over parotiskanalen for at forhindre indførelse i den opsamlede prøve af andre orale væsker, som kan indeholde enzymer, der ville modificere inhibitoren væsentligt.
10 I en foretrukken udførelsesform fraktioneres det protein-. holdige materiale i parotissekretionerne ved separation af materialet efter dets evne til at bindes til kation-byttermaterialer i nærvær af varierende koncentrationer af saltopløsninger. Det er almindeligvis blevet bemærket, 15 at proteaseinhibitoren ifølge opfindelsen vil blive elue-ret fra et stærkt kationbyttermateriale i en kromatografikolonne ved hjælp af en fraktion af natriumchlorid-elueringsmiddel med en koncentration i området 0,005-1,0 M og mere specifikt i området 0,4-0,8 M. Andre koncentra-20 tioner af saltopløsning kan imidlertid være nødvendige for at isolere proteaseinhibitoren afhængigt af den bestemte kationbytterkolonnes egenskaber.
De således opnåede fraktioner screenes for tilstedeværelse af serinproteaseinhibitor-aktivitet, fortrinsvis leu-25 kocytelastaseinhibitor-aktivitet. Fortrinsvis gennemføres dette ved blanding af fraktionerne med en kendt koncentration af protease, fortrinsvis leukocytelastase, og prøvning af det resterende aktive enzym ved hjælp af dets evne til at hydrolysere methoxysuccinyl-Ala-Ala-Pro-Val-30 p-nitroanilid, som iagttaget i et spektrofotometer. De proteinholdige materialer i de identificerede fraktioner separeres derpå efter størrelse, fortrinsvis ved gelfiltrering. Hvis der anvendes gelfiltrerings-separation, 9 DK 173678 B1 er et foretrukket elueringsmiddel en 0,5 M natriumchlori-dopløsning. Fraktioner, der udviser sådan aktivitet, koncentreres derpå ved midler, såsom ultrafiltrering, til opnåelse af en renset og koncentreret form af proteasein-5 hibitoren.
En proteaseinhibitor isoleret ved den ovenstående fremgangsmåde udviser almindeligvis støkiometrisk aktivitet i forhold til en serinprotease, såsom leukocytelastase. Ved støkiometrisk aktivitet forstås, at hvert molekyle pro-10 teaseinhibitor vil reagere med og derved væsentligt formindske aktiviteten af et molekyle leukocytelastase. I en opløsning af serinproteaseinhibitoren ifølge opfindelsen, hvori inhibitoren og leukocytelastase er tilstede i en koncentration større end eller lig med 10'* M, vil en så-15 dan inhibitor reagere med mindst 90% af en ækvivalent molekylær mængde leukocytelastase.
Som anført ovenfor er det lykkedes for opfinderne i denne sag at isolere en serinproteaseinhibitor fra parotis-sekretioner i en renset form. Isolering af dette enzym i 20 renset form var en forudsætning for den korrekte sekvensbestemmelse af inhibitoren og for udviklingen af farmaceutiske præparater indeholdende proteaseinhibitoren.
Den således isolerede serinproteaseinhibitor har aminosy-resekvensen: 25 Ser-Gly-Lys-Ser-Phe-Lys-Ala-Gly-Val-Cys-Pro-
Pro-Lys-Lys-Ser-Ala-Gln-Cys-Leu-Arg-Tyr-Lys-Lys-Pro-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp-Trp-Gln-Cys-Pro-Gly-Lys-Lys-Arg-Cys-Cys-Pro-Asp-Thr-Cys-Gly-Ile-Lys-Cys-Leu-Asp-Pro-Val-Asp-Thr-Pro-Asn-30 Pro-Thr-Arg-Arg-Lys-Pro-Gly-Lys-Cys-Pro-Val-
Thr-Tyr-Gly-Gln-Cys-Leu-Met-Leu-Asn-Pro-Pro-Asn-Phe-Cys-Glu-Met-Asp-Gly-Gln-Cys-Lys-Arg- 10 DK 173678 B1
Asp-Leu-Lys-Cys-Cys-Met-Gly-Met-Cys-Gly-Lys-Ser-Cys-Val-Ser-Pro-Val-Lys-Ala.
De ovenstående forkortelser svarer til polypeptidets ami-nosyrerester som følger: 5 _Aminosyre_Forkortelse_
Alanin Ala
Valin Val
Leucin Leu
Isoleucin Ile 10 Prolin Pro
Phenylalanin Phe
Tryptophan Trp
Methionin Met
Glycin Gly 15 Serin Ser
Threonin Thr
Cystein Cys
Tyrosin Tyr
Asparagin Asn 20 Glutamin Gin
Asparaginsyre Asp
Glutaminsyre Glu
Lysin Lys
Arginin Arg 25 Histidin His
Det har vist sig, at denne proteaseinhibitor har mere end ét distinkt domæne. Ved mere end ét distinkt domæne forstås, at proteinet har flere aktive sites, som er funktionelle over for forskellige enzymer. Tilstedeværelsen og 30 beliggenheden af disse sites er blevet bestemt ved opdagelsen af en væsentlig homologi mellem mindst to dele af proteaseinhibitoren. Det antages, at tilstedeværelsen af distinkte domæner tilfører serinproteaseinhibitoren iføl- 11 DK 173678 B1 ge opfindelsen evnen til at inhibere en række forskellige serinproteaser, herunder både leukocytelastase og trypsin.
Det er yderligere blevet bemærket, at denne proteaseinhi-5 bitor p.g.a. flerheden af distinkte domæner kan tjene som en ramme, hvori der kan konstrueres forskellige andre aktive sites til skabelse af proteaseinhibitorer med yderligere egenskaber. Den foretrukne udførelsesform af opfindelsen er en proteaseinhibitor, som inhiberer leukocy-10 telastase, cathepsin G og trypsin. Disse enzymer er alle medlemmer af en klasse af proteaser, kendt som serinproteaser, der har en fælles mekanisme og mange fælles strukturtræk.
Det erkendes af fagfolk, at mindre variationer i et pro-15 teins aminosyresekvens, selv hvis de ikke forbedrer proteinets funktion, frembringer analoge, som ikke har væsentligt formindsket aktivitet. Det forudsættes derfor, at analoge til den ovenfor omtalte proteaseinhibitor, hvori sekvenserne indeholder mindre variationer fra den 20 foretrukne sekvens, som anført ovenfor, er omfattet af opfindelsen. Især antages det, at mindre ændringer i ami-nosyresekvensen ved C- og N-termini ikke væsentligt vil hindre de angivne proteaseinhibitorers aktivitet. Specifikt antages udskiftning ved C- eller N-terminus med en 25 cycliseret aminosyre, f. eks. prolin, at resultere i en proteaseinhibitor med den ønskede serinprotease-inhibe-rende aktivitet. Ligeledes er analoge til den angivne proteaseinhibitor, som har ændringer ved C-eller N-terminus, der ikke ødelægger den analoges serinprotea-30 seinhibitor-egenskaber, omfattet af opfindelsen.
Det forudsættes også, at tilføjelser af polypeptidkæder til C- eller N-terminus af den omhandlede proteaseinhibitor vil være indenfor opfindelsens omfang. Især kan poly- 12 DK 173678 B1 peptidkæder tilføjes til den ene eller den anden terminus ved proteinfusionsteknik. Disse yderligere polypeptider kan tjene til at forhøje den omhandlede proteaseinhibi-tors farmakologiske effektivitet. For eksempel kan poly-5 peptidet ved fusion med andre proteiner gøres i stand til at forankres i slimhindemembraner og få proteaseinhibito-ren til at forblive på et bestemt sted, såsom lungerne.
I disse analoge bør variationen i aminosyresekvensen ikke være sådan, at den provokerer en skadelig immunologisk 10 reaktion i den organisme, hvortil proteaseinhibitoren indgives. Fremgangmåderne til at bestemme, om et biologisk molekyle vil provokere skadelig immunologisk reaktion, er kendte af almindelige fagfolk.
De ovenstående udskiftninger kan frembringes ved forskel-15 lige metoder. For eksempel kan de genetiske instruktioner, som anvendes til at producere inhibitoren ved rekom-binant-DNA-metoder, ændres således, at de får en værtsmikroorganisme til at syntetisere den ønskede analog. Sådanne rekombinant-metoder er angivet i US patentansøgnin-20 gerne nr. 678 822 og 678 823 begge med titlen "Recombinant Methods for Isolation of Serine Protease Inhibitors and DNA Sequenses Useful for Same" og begge indleveret den 6. december 1984 af Pradip K. Bandyopadhyay et al. og i de tilsvarende internationale patentansøgninger med 25 publikationsnumrene WO 86/03519 og WO 86/03497. Andre fremgangsmåder til biokemisk syntetisering af proteinanaloge er kendte af fagfolk og skal betragtes som omfattet af opfindelsen til frembringelse af disse og andre analoge.
30 Den omhandlede proteaseinhibitor og dens analoge er ifølge opfindelsen beregnet til humane og veterinære anvendelser i form af farmaceutiske produkter, som har serin-proteaseinhibitor-aktivitet, især leukocytelastaseinhibi- 13 DK 173678 B1 tor-aktivitet. Det forventes, at farmaceutiske præparater, der som mindst én af de aktive ingredienser indeholder den her omhandlede serinproteaseinhibitor, også vil indeholde passende farmaceutisk acceptable bærere, for-5 tyndingsmidler, fyldstoffer, bindemidler og andre exci-pienter afhængigt af den påtænkte doseringsform. Til oral indgivelse må der tages skridt til at forhindre nedbrydning af det aktive protein i fordøjelseskanalen. Enterisk overtrukne doseringsformer forudsættes som en form, der 10 er egnet til oral indgivelse. Hvis der vælges parenteral indgivelse, må præparatet indeholde en vand- eller saltvandsopløsning eller et andet farmaceutisk acceptabelt suspensionsmiddel. Almindeligvis vil det foretrækkes, at et præparat beregnet til parenteral indgivelse indeholder 15 natriumchlorid i tilstrækkelige koncentrationer til at gøre det samlede præparat isotonisk med kropsvæsker. Det forudsættes også, at farmaceutiske præparater indeholdende serinproteaseinhibitoren ifølge opfindelsen kan indgives lokalt, f. eks. ved injektion eller topisk påføring 20 til behandling af lokaliserede enzymubalancer. Den omhandlede inhibitor kan også indgives som en aerosol, især når den anvendes på lungerne, f. eks. ved behandling af emphysema. I disse situationer vil der blive anvendt passende bærere, fortyndingsmidler og drivmidler.
25 Mængden af proteaseinhibitoren, som skal indgives, vil i hver doseringssituation afhænge af den overskydende mængde proteolytisk enzym, som er tilstede i organismen. For at bestemme den passende dosering, vil man kvantificere den overskydende mænge proteolytisk enzym og, på basis af 30 aktiviteten af den bestemte art af proteaseinhibitor eller blanding af sådanne, som skal indgives, bestemme den totale mængde proteaseinhibitor, som er nødvendig for at neutralisere overskuddet af proteolytisk enzym. En sådan bestemmelse foretages rutinemæssigt af fagfolk i bestem-35 melsen af terapeutiske doseringer ved behandling af immu- 14 DK 173678 B1 nologiske forstyrrelser og ligger inden for omfanget af opgaver, som udføres rutinemæssigt af dem uden omfattende forsøg, især i lyset af standardprøvninger og de i denne beskrivelse angivne prøvninger. Imidlertid bør det bemær-5 kes, at det antages, at store overskud af proteaseinhibi-toren ifølge opfindelsen ikke vil være toxiske eller forårsage en skadelig reaktion, når de indgives en organisme med overskud af proteolytiske en2ymer. Således foretrækkes det, at der indgives et overskud i forhold til den 10 optimale mængde proteaseinhibitor, som skal indgives, fremfor en mindre mængde end optimum.
Det skal forstås, at anvendelsen af opfindelsens lære på et specifit problem eller miljø vil være inden for en almindelig fagmands evner i lyset af de her givne anvisnin-15 ger. Eksempler på produktet ifølge opfindelsen og repræsentative fremgangsmåder til isolering af serinprotea-seinhibitoren og fremstilling af farmaceutiske præparater fremgår af de følgende udførelseseksempler.
Eksempel 1 20 Rensning af en human leukocvtelastaseinhibitor fra paro-tissekretioner
Parotissekretioner blev opsamlet fra frivillige med en sugeindretning anbragt over parotiskanalernes udgang. Sekretionen blev stimuleret ved sutning på et surt bolsje.
25 To - tre liter sammenhældte parotissekretioner blev bragt til pH 6,0 med en natriumhydroxidopløsning og centrifugeret for at fjerne bundfaldet. Supernatanten blev påsat en 2,5 x 40,0 cm søjle af "SP Sephadex® C50" ækvilibreret med 0,05 M natriumacetat (pH 6,0) og 0,005 M natriumchlo-30 rid. Søjlen blev elueret med en lineær gradient af 0,005-1 M natriumchlorid. De opnåede fraktioner blev prøvet for tilstedeværelsen af inhibitor ved immunprøvning. Fraktionerne svarende til aktivitetstoppen var dem, som var ble- 15 DK 173678 B1 vet opnået nær ved 0,6 M. Disse fraktioner blev koncentreret til 3 ml ved ultrafiltrering igennem et "Anticon UM2"-filter, og koncentratet blev påsat en 1,6 x 100 cm søjle af "Sephadex® G50" ækvilibreret med 0,05 M "Tris"-5 HC1 (pH 7,4) og 0,5 M natriumchlorid. Søjlen blev derpå elueret med denne puffer, og fraktionerne prøvet ved immunprøvning. Aktive fraktioner blev hældt sammen og koncentreret ved ultrafiltrering som beskrevet ovenfor. Der blev udvundet mellem 2 og 4 mg inhibitor, som var i ho-10 vedsagen 100% aktiv.
Eksempel 2
Rensning af en human leukocytelastaseinhibitor fra purulent bronchial mucus
Bronchial mucus blev opsamlet fra hospitalpatienter, som 15 led af lungesygdomme og hældt sammen. De sammenhældte mængder blev frosset og lyophiliseret. Det lyophiliserede pulver blev suspenderet i en kold opløsning af 5%’s perchlorsyre, og blandingen blev omrørt kraftigt i 2 timer og neutraliseret ved tilsætning af 4 m kaliumhydro-20 xidopløsning. Blandingen blev centrifugeret ved 12 000 x g i 30 minutter ved 0 °C for at fjerne uopløseligt materiale.
Den rå opløsning af proteiner blev fraktioneret ved ultrafiltrering igennem membraner beregnet til at fjerne 25 alt materiale med molekylevægt større end 100 000 og mindre end 10 000 dalton. I det første trin ble opløsningen recirkuleret over en "Amicon XM100A"-membran i et tyndkanal ultrafiltreringsapparat. Materialet, som passerede igennem membranen, blev derpå sendt igennem det samme ap-30 parat med XMlOOA-membranen udskiftet med en YMlO-raembran.
Det var også muligt at fraktionere materialet ved indledende recirkulering over en "Millipore* 10OK"-membran i et Minitan-apparat. I dette tilfælde blev materialet, som 16 DK 173678 B1 passerede igennem filtret, derpåsendt igennem det samme apparat med en 10K-membran. I begge tilfælde blev materialet, som blev tilbageholdt af membranerne, udvundet til yderligere forarbejdning.
5 Ultrafiltraterne blev chromatograferet på en revers fase højtryksvæskechromatografi (HPLC)-kolonne. Omkring 1 ml indeholdende omkring 20 mg protein total og omkring 0,6 mg inhibitor blev påsat en RP8-kolonne (skaffet fra Synchrom Inc., Linden, Indiana, U.S.A.) med en strøm-10 ningshastighed på 1 ml/min. Proteinerne blev elueret med en 0,05% opløsning af trifluoreddikesyre i vand og derpå-med en lineær gradient på 0-50% opløsning af 0,05% trifluoreddikesyre (TFA) i acetonitril. Fraktioner blev opsamlet og prøvet for proteaseinhibitor-aktivitet ved 15 blanding med en kendt mængde chymotrypsin og efterfølgende bestemmelse af det resterende aktive chymotrypsin under anvendelse af de ovenfor beskrevne standardprocedurer. Aktivt materiale blev elueret mellem 25% og 30% ace-tonitrilopløsning. Disse fraktioner blev hældt sammen til 20 yderligere forarbejdning.
De sammenhældte fraktioner fra RP8-kolonnen blev lyophi-liseret og opløst i 0,05 M natriumphosphat (pH 6,0) og påsat en "Brownlee® CX300"-kationbytterkolonne ækvilibre-ret med den samme puffer. Kolonnen blev elueret med en 25 lineær gradient på 0-100% 0,5 M natriumphosphat (pH 6,0). Aktive fraktioner blev igen detekteret ved deres evne til at inhibere chymotrypsin. Der blev detekteret tre aktivi-tetmaxima, som eluerede ved 0,24 M 0,26 M og 0,28 M phosphat. Der foretoges tre sammenhældninger af aktivt 30 materiale, og disse blev afsaltet og koncentreret i et "Amicon"-apparat med en YM10-membran, før de blev opbevaret i frossen tilstand.
17 DK 173678 B1
Aktiviteten af hver fraktion blev bestemt ved prøvning over for chymotrypsin, og proteinkoncentrationen blev bestemt ved Bradford-prøvning (Analytical Biochem. 72;248 (1976)). Hvert maksimum havde en aktivitet over for chy-5 motrypsin, som var omkring 80% af den, der blev iagttaget for den inhibitor, som blev oprenset fra parotissekretio-nerne i eksempel 1.
Eksempel 3
Bestemmelse af aminosvresekvensen af leukocvtelastasein-10 hibitoren isoleret fra parotissekretioner
Den native inhibitor blev reduceret og carboxymethyleret ved standardprocedurer. 1,0 mg (80 nmol) af inhibitoren blev opløst i 600 liter af en opløsning på 6 M guanidi-niumhydrochlorid i 0,1 M "Tris"-HCl (pH 8,0) indeholdende 15 1,32 mol dithiothreitol og "Tris"-puffer (pH 8,0).
Efter en time ved 37 °C tilsattes 3,32 nmol (2-Ή)-iodeddikesyre, og inkubationen fortsattes ved 37 °C i endnu en time. Derpå tilsattes 0,66 nmol dithiothreitol og, efter en times inkubation ved 37 °C, endnu 1,36 nmol 20 (2-’H)-iodeddikesyre. Efter en times inkubation ved 37 °C blev reaktionsblandingen dialyseret omfattende over for "Tris"-puffer (pH 8,0) indeholdende 0,1 M natriumchlorid.
Den resulterende opløsning blev påsat en "Synchrom RP8" HPLC-kolonne, og produkterne blev elueret fra kolonnen 25 med 0,05% TFA i vand og derpå med en lineær gradient af 0,05% TFA i acetonitril. Det reducerede carboxymethylerede protein elueredes ved 22% acetonitrilopløsning som bestemt ved absorbansen ved 215 og 280 nm og ved disse fraktioners (3H)-indhold. Dette materiale blev tørret un-30 der vakuum til yderligere anvendelse.
Det reducerede carboxymethylerede protein blev sekvensbestemt ved automatisk Edman-nedbrydning resulterende i 18 DK 173678 B1 identifikationen af resterne 1 - 41 i aminosyresekvensen. Disse er som følger:
Ser-Gly-Lys-Ser-Phe-Lys-Ala-Gly-Val-Cys-Pro-Pro-Lys-Lys-Ser-Ala-Gln-Cys-Leu-Arg-Tyr-Lys-5 Lys-Pro-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp-Trp-Gln-Cys-Pro-
Gly-Lys-Lys-Arg-Cys-Cys-Pro-Asp-_-Cys-Gly-
Ile-Lys-Cys-Leu-Asp-(Pro)-Val-Asp-
Det reducerede carboxymethylerede protein blev underkastet nedbrydning med muse-submaxillær-protease, og de re-10 suiterende peptider adskilt ved revers-fase-HPLC på en "Synchrom RP8"-kolonne under anvendelse af de samme opløsninger og gradienter som ovenfor. Et af disse peptider, som elueredes ved 20% TFA i acetonitril, blev sekvensbestemt ved automatisk Edman-nedbrydning og gav den 15 følgende sekvens:
Tyr-Lys-Lys-Pro-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp-Trp-Gln-
Cys-Pro-Gly-Lys-Lys-Arg-Cys-Cys-Pro-Asp-Thr-
Cys-Gly
Dette samme peptid blev underkastet nedbrydning med chy-20 motrypsin, hvilket gav to nye peptider, som blev adskilt ved revers-fase-HPLC på en "Synchrom RP8"-kolonne, igen som anført ovenfor. Et af disse, som elueredes ved 17%
MeCN i acetonitril, blev sekvensbestemt ved automatisk Edman-nedbrydning og gav den følgende sekvens: 25 Gln-Cys-Pro-Gly-Lys-Lys-Arg-Cys-Cys-Pro-Asp-
Thr-Cys-Gly-Ile-Lys-Cys-Leu-Asp-Pro-Val-Asp-Thr-Pro-Asn-Pro-(Thr-Arg)
Det reducerede carboxymethylerede protein blev nedbrudt med Lys-C-protease, og de resulterende peptider blev ad-30 skilt ved revers-fase-HPLC på en "Synchrom RP8"-kolonne.
Et maksimum af (’H)-holdigt materiale, som elueredes mel- 19 DK 173678 B1 lem 13% og 15% acetonitril, blev underkastet Edman-nedbrydning, som gav den følgende sekvens:
Cys-Leu-Asp-Pro-Val-Thr-Asp-Pro-Asn-Pro-
Thr-Arg-Arg-Lys-Pro-Gly-Lys 5 Peptiderne opnået fra muse-submaxillær-protease-nedbryd-ningen af den reducerede carboxymethylerede inhibitor, og som elueredes mellem 26% og 28% acetonitril, blev sekvensbestemt ved automatisk Edman-nedbrydning og gav den følgende sekvens: 10 Arg-Lys-Pro-Gly-Lys-Cys-Pro-Val-Thr-Tyr-Gly- «
Gln-Cys-Leu-Met-Leu-Asn-Pro-Pro-Asn-Phe-Cys-Glu-Met-Asp-Gly-Gln-Cys-Lys-Arg-Asp-Leu-Lys-Cys-Cys-Met.....
Den reducerede carboxymethylerede inhibitor blev nedbrudt 15 med V8-protease, og peptiderne blev adskilt ved revers-fase-HPLC på en "Synchrom RP8"-kolonne. Peptidet, som elueredes ved 19% acetonitril, blev sekvensbestemt ved automatisk Edman-nedbrydning og gav den følgende sekvens:
Met-Asp-Gly-Gln-Cys-Lys-Arg-Asp-Leu-Lys-Cys-2 0 Cys-Met-Gly-Met-Cys-Gly-Lys-Ser-Cys-Val-Ser-
Pro-Val-Lys
Peptidet opnået fra nedbrydningen af den reducerede carboxymethylerede inhibitor med submaxillaer protease og eluerende mellem 26% og 28% acetonitril fra en "Synchrom 25 RP8"-kolonne blev nedbrudt yderligere med trypsin. De re sulterende peptider blev adskilt ved revers-fase-HPLC på den samme kolonne, og peptidet, som elueredes ved 9% acetonitril, blev sekvensbestemt ved manuel Edman-nedbrydning, hvilket gav den følgende sekvens: 30 Ser-Cys-Val-Ser-Pro-Val-Lys-Ala 20 DK 173678 B1
Et peptid med den samme sammensætning og sekvens kan isoleres fra en Lys-C-protease-nedbrydning af proteinet.
Dette peptid elueres mellem 8% og 10% acetonitril fra en "Synchrom RP8"-kolonne.
5 Det reducerede carboxymethylerede protein blev hydrolyseret ved opvarmning i 6 M saltsyre, og dets aminosyrebe-standdele blev på basis af en tilnærmet molekylvægt på 14 000 fra SDS-polyacrylamidgel-elektroforese bestemt at være: 10 Ala 3,5 Arg 5,8 Asp 8,5 Cys 15,7 Glu 5,2 Gly 10,6
His 0,0 Ile 1,0 Leu 5,0 Lys 16,2 Met 4,0 Phe 2,1
Pro 14,8 Ser 3,7 Thr 2,4 Tyr 2,1 Val 4,7.
Det blev bestemt, at de ovenstående data definerede et sæt af overlappende peptider opnået ud fra den reducerede 15 carboxymethylerede inhibitor. Inhibitorens fulde sekvens er derfor som følger:
Ser-Gly-Lys-Ser-Phe-Lys-Ala-Gly-Val-Cys-Pro-Pro-Lys-Lys-Ser-Ala-Gln-Cys-Leu-Arg-Tyr-Lys-Lys-Pro-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp-Trp-Gln-Cys-Pro-20 Gly-Lys-Lys-Arg-Cys-Cys-Pro-Asp-Thr-Cys-Gly-
Ile-Lys-Cys-Leu-Asp-Pro-Val-Asp-Thr-Pro-Asn-Pro-Thr-Arg-Arg-Lys-Pro-Gly-Lys-Cys-Pro-Val-Thr-Tyr-Gly-Gln-Cys-Leu-Met-Leu-Asn-Pro-Pro-Asn-Phe-Cys-Glu-Met-Asp-Gly-Gln-Cys-Lys-Arg-25 Asp-Leu-Lys-Cys-Cys-Met-Gly-Met-Cys-Gly-Lys-
Ser-Cys-Val-Ser-Pro-Val-Lys-Ala
Den forudsagte aminosyresammensætning ud fra et saltsyre-hydrolysat af dette protein ville være:
Ala 3 Arg 5 Asp 9 Cys 16 Gly 9 Glu 7 His 0 Ile 1 30 Leu 5 Lys 15 Met 4 Phe 2 Pro 13 Ser 6 Thr 4 Tyr 2
Trp 1 Val 5.
21 DK 173678 B1
Endvidere antages det, at alle Cys-resterne er forbundet med hinanden til dannelse af disulfidbindinger.
Eksempel 4
Identiteten af elastaseinhibitoren fra bronchial mucus 5 med den fra parotissekretioner
Inhibitoren, som elueredes fra "Brownlee CX300"-kolonnen med 0,28 M phosphat, blev karakteriseret som følger; (a) en prøve af inhibitoren blev hydrolyseret under standardbetingelser ved opvarmning i 6 M saltsyre. Inhibito- 10 rens aminosyresammensætning er;
Ala 3,8 Arg 5,0 Asp 8,8 Gly 11,3 Glu 6,3 His 0
Ile 1,3 Leu 5,0 Lys 13,8 Met 3,8 Phe 2,5 Pro 12,5
Ser 6,3 Thr 3,8 Tyr 1,3 Val 5,0.
Dette er ikke væsentligt forskelligt fra aminosyresammen-15 sætningen af inhibitoren fra parotis eller den, som udregnes fra den ovenfor beskrevne sekvens.
(b) Inhibitoren blev reduceret og carboxymethyleret under de betingelser, der er beskrevet ovenfor for inhibitoren fra parotis. Dette protein blev derpå nedbrudt med muse- 20 submaxillær-protease, og produkterne blev analyseret ved revers-fase-HPLC på en "Synchrom RP8"-kolonne. Nedbrydningsmønsteret ser ud til ikke at kunne skelnes fra mønsteret for den reducerede carboxymethylerede inhibitor fra parotis kørt samtidig, undtagen hvad angår formen af 25 det maksimum, som elueres mellem 31 og 35% acetonitril, hvilket maksimum varierer i elueringsposition selv mellem forskellige prøver af parotisinhibitoren. Dette stammer sandsynligvis fra kemiske modifikationer i et enkelt peptid.
22 DK 173678 B1 (c) Inhibitoren blev underkastet automatisk Edman-nedbrydning og gav den følgende aminosyresekvens for de første 14 aminosyrer: X-Gly-Lys-Y-Phe-Lys-Ala-Gly-Val-Z-Pro-Pro-Lys-Lys 5 hvor x, Y og z er aminosyrer udvundet i for lavt niveau til at kunne identificeres.
Den udstrakte lighed mellem inhibitoren isoleret fra bronchial mucus og den, som er isoleret fra parotissekre-tioner, sammen med fraværet af ethvert tegn på en forskel 10 mellem disse to proteiner viser, at de er identiske eller næsten identiske.
Eksempel 5
Identifikation af egenskaber hos inhibitoren, som gør den egnet til klinisk anvendelse som inhibitor for 15 leukocytelastase (a) En opløsning af parotisinhibitoren fra eksempel 1 sattes til en opløsning af leukocytelastase i nærvær af en pH 8,0 puffer og humant serumalbumin, og det resterende frie enzym blev bestemt ved prøvning af dets evne til 20 at hydrolysere methoxysuccinyl-Ala-Ala-Pro-Val-p-nitro-anilid. Dataene passer med en standardmodel af en enzym-inhibitor-omsætning, hvorved et mol inhibitor inaktivere-de et mol enzym, og dissociationskonstanten af enzym-inhibitor-komplekset er 5 x ΙΟ'10 M.
25 Ved analoge forsøg bestemtes inhibitorens evne til at in-hibere flere andre humane proteaser. Disse dissociationskonstanter er anført i den nedenstående tabel.
Dissociationskonstant af komplexet med inhibitoren
30 fra eksempel 1 ved 25 °G
Serinprotease _og pH 7,8_ 23 DK 173678 B1
human leukocytelastase 5 x 10*’° M
humant cathepsin G 1,5 x 10** M
humant trypsin 1,5 x 10'* M
humant chymotrypsin 1,5 x ΙΟ'50 M
5 human pancreatisk elastase 2 x 10** M
(b) En opløsning af parotisinhibitoren i 0,2 M "Tris"-HCl (pH 7,8) blev opvarmet til 70 °C i et tilproppet reagensglas, og der blev udtaget prøver til prøvning ved forskellige tider. Resultaterne viste, at inhibitoren miste-10 de aktivitet med tilnærmet første ordens kinetik og havde en halveringstid på omkring 10 timer. Denne grad af stabilitet er exceptionel for et protein i opløsning og udgør en væsentlig fordel ved sammensætningen af proteinet til klinisk anvendelse som elastaseinhibitor.
15 (c) En opløsning af inhibitoren i 70% myresyre blev holdt * ved 37 °C i 40 timer og fandtes, når den blev prøvet, at have bevaret mindst 80% af dens oprindelige aktivitet.
(d) En opløsning af inhibitoren blev behandlet med muse-submaxillær-protease, clostripain og thermolysin. Kun det 20 sidstnævnte enzym resulterede i noget væsentligt tab af inhiberende aktivitet i løbet af tre timer ved 37 °C.
Denne resistens over for nedbrydning ved hjælp af enzymer udgør en væsentlig fordel ved anvendelsen af dette protein som leukocytelastaseinhibitor in vivo, da den tyder på 25 inhibitorens almene resistens over for andre enzymer af en type, som kunne være tilstede i purulent bronchial mucus .
(e) En opløsning af inhibitoren i 6 M guanidiniumhydroch-lorid og 30 mM dithiothreitol, som ved analogi med andre 30 proteiner måtte antages at have mistet al defineret struktur, genvandt mindst 90% af dens native inhiberende aktivitet, når der tilsattes oxideret glutathion i tidobbelt overskud i forhold til det anvendte dithiothreitol, DK 173678 B1 24 og opløsningen blev fortyndet 10 gange med 25 mM "Tris"-HC1 (pH 9,0). Dette resultat viser, at proteinets aktive struktur er en stabil struktur af polypeptidkæden. Resultatet implicerer yderligere, at proteinet vil forblive 5 aktivt under en række forskellige skrappe behandlinger, og, selv under nogle betingelser, som ødelægger aktivitet, vil bevare evnen til at genvinde aktiviteten, når disse betingelser føres tilbage.
Claims (1)
- 25 DK 173678 B1 Farmaceutisk præparat indeholdende et serinproteaseinhi-bitor-protein, som inhiberer proteaseaktiviteten af mindst én serinprotease og omfatter en enkelt ufragmente-5 ret polypeptidkæde med aminosyresekvensen: Ser-Gly-Lys-Ser-Phe-Lys-Ala-Gly-Val-Cys-Pro-Pro-Lys-Lys-Ser-Ala-Gln-Cys-Leu-Arg-Tyr-Lys-Lys-Pro-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp-Trp-Gln-Cys-Pro-Gly-Lys-Lys-Arg-Cys-Cys-Pro-Asp-Thr-Cys-Gly-10 Ile-Lys-Cys-Leu-Asp-Pro-Val-Asp-Thr-Pro-Asn- Pro-Thr-Arg-Arg-Lys-Pro-Gly-Lys-Cys-Pro-Val-Thr-Tyr-Gly-Gln-Cys-Leu-Met-Leu-Asn-Pro-Pro-Asn-Phe-Cys-Glu-Met-Asp-Gly-Gln-Cys-Lys-Arg-Asp-Leu-Lys-Cys-Cys-Met-Gly-Met-Cys-Gly-Lys-15 Ser-Cys-Val-Ser-Pro-Val-Lys-Ala, og et farmaceutisk acceptabelt bærestof eller fortyndingsmiddel.
Applications Claiming Priority (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US67882384A | 1984-12-06 | 1984-12-06 | |
| US67882384 | 1984-12-06 | ||
| US80342385 | 1985-12-02 | ||
| US06/803,423 US4760130A (en) | 1984-12-06 | 1985-12-02 | Serine protease inhibitors and methods for isolation of same |
| US8502384 | 1985-12-04 | ||
| PCT/US1985/002384 WO1986003497A1 (en) | 1984-12-06 | 1985-12-04 | Serine protease inhibitors and methods for isolation of same |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK374286D0 DK374286D0 (da) | 1986-08-06 |
| DK374286A DK374286A (da) | 1986-08-06 |
| DK173678B1 true DK173678B1 (da) | 2001-06-11 |
Family
ID=27102097
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK198603742A DK173678B1 (da) | 1984-12-06 | 1986-08-06 | Farmaceutiske præparater indeholdende en serinproteaseinhibitor |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4760130A (da) |
| DK (1) | DK173678B1 (da) |
| IE (1) | IE61351B1 (da) |
| IL (1) | IL77226A (da) |
| MX (1) | MX9203520A (da) |
| NZ (1) | NZ214457A (da) |
Families Citing this family (29)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6291662B1 (en) | 1984-12-05 | 2001-09-18 | Amgen Inc. | Recombinant methods for production of serine protease inhibitors and DNA sequences |
| US5871956A (en) * | 1984-12-06 | 1999-02-16 | Amgen Inc. | Recombinant methods for production of serine inhibitors and DNA sequences useful for same |
| US5900400A (en) * | 1984-12-06 | 1999-05-04 | Amgen Inc. | Serine protease inhibitor analogs |
| US6132990A (en) * | 1984-12-06 | 2000-10-17 | Amgen Boulder Inc. | Recombinant methods for production of serine protease inhibitors and DNA sequences useful for same |
| GB2199582A (en) * | 1987-01-07 | 1988-07-13 | Bayer Ag | Analogues of pancreatic secretory trypsin inhibitor |
| US5851983A (en) * | 1987-12-28 | 1998-12-22 | Teijin Limited | Elastase inhibitory polypeptide and process for production thereof by recombinant gene technology |
| CA2001629A1 (en) * | 1988-10-27 | 1990-04-27 | George A. Digenis | Human leukocyte elastase inhibitors and methods of producing and using same |
| DE3841873A1 (de) * | 1988-12-13 | 1990-06-21 | Gruenenthal Gmbh | Neue serinprotease-inhibitor-proteine, diese enthaltende arzneimittel, dna-sequenzen, die fuer diese proteine codieren und verfahren zur herstellung dieser proteine, arzneimittel und dna-sequenzen |
| US5591431A (en) * | 1990-03-09 | 1997-01-07 | G.D. Searle & Co. | Enhancement of clot lysis |
| US5284097A (en) * | 1990-10-31 | 1994-02-08 | Loram Maintenance Of Way, Inc. | Ballast distribution, regulation and reclaiming railroad maintenance device |
| US6869925B1 (en) * | 1992-09-09 | 2005-03-22 | Amgen Inc. | Inhibition of retrovirus infection |
| US5462870A (en) * | 1993-04-23 | 1995-10-31 | Wayne State University | Human diploid salivary gland epithelial cell lines |
| FR2711371B1 (fr) * | 1993-10-18 | 1995-12-29 | Aetsrn | Procédé de préparation d'un concentré d'inter-alpha-trypsine inhibiteur à usage thérapeutique et concentré obtenu. |
| US6017880A (en) * | 1994-03-09 | 2000-01-25 | Amgen Inc. | Inhibition of retrovirus infection |
| PL316444A1 (en) * | 1994-03-23 | 1997-01-20 | Tokyo Tanabe Co | Novel agent against viral diseases of respiratory tracts |
| US5633227A (en) * | 1994-09-12 | 1997-05-27 | Miles, Inc. | Secretory leukocyte protease inhibitor as an inhibitor of tryptase |
| CA2266323A1 (en) | 1996-09-24 | 1998-04-02 | The Procter & Gamble Company | Stabilized proteinaceous protease inhibitors and variants thereof |
| AU3511500A (en) | 1999-03-05 | 2000-09-21 | Trustees Of University Technology Corporation, The | Inhibitors of serine protease activity, methods and compositions for treatment of nitric oxide-induced clinical conditions |
| WO2000051625A1 (en) * | 1999-03-05 | 2000-09-08 | The Trustees Of University Technology Corporation | Inhibitors of serine protease activity, methods and compositions for treatment of herpes viruses |
| US6849605B1 (en) * | 1999-03-05 | 2005-02-01 | The Trustees Of University Technology Corporation | Inhibitors of serine protease activity, methods and compositions for treatment of viral infections |
| WO2001098495A1 (fr) * | 2000-06-21 | 2001-12-27 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Nouvelle proteine et son adn |
| US7247704B2 (en) | 2000-12-18 | 2007-07-24 | Arriva Pharmaceuticals, Inc. | Multifunctional protease inhibitors and their use in treatment of disease |
| US6886964B2 (en) * | 2001-06-26 | 2005-05-03 | Allan Gardiner | Illuminator with filter array and bandwidth controller |
| DK2270052T3 (da) | 2001-06-26 | 2018-07-02 | Amgen Inc | Antistoffer mod OPGL |
| WO2003018620A2 (en) * | 2001-08-27 | 2003-03-06 | Les Laboratoires Aeterna Inc. | Serine protease inhibitor and processes for the preparation thereof |
| US20040220242A1 (en) * | 2003-05-02 | 2004-11-04 | Leland Shapiro | Inhibitors of serine protease activity, methods and compositions for treatment of nitric oxide induced clinical conditions |
| EP3192872A1 (en) | 2003-08-26 | 2017-07-19 | The Regents of the University of Colorado, a body corporate | Inhibitors of serine protease activity and their use in methods and compositions for treatment of bacterial infections |
| TW200736277A (en) | 2005-11-14 | 2007-10-01 | Amgen Inc | RANKL antibody-PTH/PTHrP chimeric molecules |
| WO2014160768A1 (en) | 2013-03-29 | 2014-10-02 | The Regents Of The University Of Colorado | Compositions and methods for preparing a subject for organ or non-organ implantation |
-
1985
- 1985-12-02 US US06/803,423 patent/US4760130A/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-12-04 IL IL77226A patent/IL77226A/xx not_active IP Right Cessation
- 1985-12-05 IE IE308285A patent/IE61351B1/en not_active IP Right Cessation
- 1985-12-06 NZ NZ214457A patent/NZ214457A/xx unknown
-
1986
- 1986-08-06 DK DK198603742A patent/DK173678B1/da not_active IP Right Cessation
-
1992
- 1992-06-26 MX MX9203520A patent/MX9203520A/es unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IL77226A (en) | 1993-02-21 |
| US4760130A (en) | 1988-07-26 |
| NZ214457A (en) | 1989-04-26 |
| MX9203520A (es) | 1992-08-01 |
| DK374286D0 (da) | 1986-08-06 |
| DK374286A (da) | 1986-08-06 |
| IE61351B1 (en) | 1994-11-02 |
| IE853082L (en) | 1986-06-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DK173678B1 (da) | Farmaceutiske præparater indeholdende en serinproteaseinhibitor | |
| Bjarnason et al. | Hemorrhagic toxins from Western diamondback rattlesnake (Crotalus atrox) venom: isolation and characterization of five toxins and the role of zinc in hemorrhagic toxin e | |
| DODT et al. | Isolation and characterization of hirudin isoinhibitors and sequence analysis of hirudin PA | |
| CA1230591A (en) | PURIFIED TRANSFORMING GROWTH FACTOR-.beta. DERIVED FROM HUMAN PLATELETS AND PLACENTAS | |
| ODANI et al. | Wheat germ trypsin inhibitors. Isolation and structural characterization of single-headed and double-headed inhibitors of the Bowman-Birk type | |
| TASHIRO et al. | The complete amino acid sequence of rice bran trypsin inhibitor | |
| Lai et al. | Chemistry of cholera toxin: the subunit structure | |
| Hirado et al. | Complete amino acid sequence of bovine colostrum low-Mr cysteine proteinase inhibitor | |
| AU591474B2 (en) | Serine protease inhibitors and methods for isolation of same | |
| KIM et al. | Novel angiotensin-I-converting enzyme inhibitory peptides derived from recombinant human αs1-casein expressed in Escherichia coli | |
| RU2050160C1 (ru) | Полипептид, полученный из ткани или секрета пиявок hirudinaria manillensis, специфически ингибирующий тромбин | |
| US4851509A (en) | Biologically active substances and compositions containing the same | |
| US5900400A (en) | Serine protease inhibitor analogs | |
| Guy et al. | The Structure of the Bovine Pancreatic Secretory Trypsin Inhibitor—Kazal's Inhibitor: III. DETERMINATION OF THE DISULFIDE BONDS AND PROTEOLYSIS BY THERMOLYSIN | |
| JPH10509589A (ja) | プロテアーゼ阻害剤および他の生物活性物質の新しい系 | |
| ODANI et al. | Studies on Soybean Trypsin Inhibitors: III. Isolation and Sequence Determination of the Tryptic Peptides of Bowman-Birk Soybean Proteinase Inhibitor | |
| Fritz et al. | Trypsin-plasmin inhibitors from leeches: Isolation, amino acid composition, inhibitory characteristics | |
| Maruyama et al. | Purification and amino acid analysis of plasma acid stable trypsin inhibitor | |
| JPH0717678B2 (ja) | セリンプロテアーゼインヒビターおよびこれを含有する医薬組成物 | |
| JP3460851B2 (ja) | 新規システインプロテアーゼインヒビター | |
| US5322926A (en) | Isohirudins | |
| Boswell et al. | Reactive site of α1-antitrypsin is C-terminal, not N-terminal | |
| Samuelsson et al. | The disulfide bonds of viscotoxin A3 from the European mistletoe (Viscum album L., Loranthaceae) | |
| US20010056180A1 (en) | Serine protease inhibitors and methods for isolation of same | |
| US5585350A (en) | Thrombin-inhibitory protein from ticks |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PUP | Patent expired |