DK172991B1 - Præparat omfattende rekombinant produceret aminoterminusacetyleret human sur fibroblastvækstfaktor, fremgangsmåde til frems - Google Patents

Description

DK 172991 B1 i

Opfindelsen angår alment produktion af humane, sure fibroblastvækstfaktorer (FGF'er) under anvendelse af rekombinant DNA-teknologi og især ekspression af autentiske sure FGF'er i gærceller.

5 Mere specifikt angår opfindelsen et præparat med mitogenisk aktivitet over for menneskeforhuds-fibro-blaster; en fremgangsmåde til fremstilling af et præparat af en human sur fibroblastvækstfaktor (FGF), hvor FGF præparatet omfatter aminoterminus-acetyleret FGF, 10 der opviser mitogenisk aktivitet over for menneskeforhuds- fibroblaster; en DNA-konstruktion til brug ved en sådan fremgangsmåde, hvor konstruktionen er i stand til at dirigere den intracellulære ekspression i gær til opnåelse af en bearbejdet sur fibroblastvækstfaktor 15 (FGF), der opviser mitogenisk aktivitet mod menneske-forhuds-fibroblaster; og en med en sådan konstruktion transformeret gærværtcelle.

FGF blev først identificeret som et mitogenisk hypofysehormon i 1970’eme (Gospodarowicz, D. (1974) 20 Nature 249:123-127). Derefter viste man, at faktorer, der først og fremmest fandtes i hjernevæv og hypofysevæv var i stand til at stimulere væksten af en række forskellige celletyper, deriblandt endotheliale celler, fibroblastceller, retinale celler og andre. Det er 25 først for nyligt med kloning af gener, der koder for de forskellige vfækstfaktorer, blevet klart, at de fleste af aktiviteterne findes hos to mikroheterogene proteiner, basiske og sure FGF'er (se Gospodarowicz, D.

(1986) Mol. and Cell. Endocrin. 46:187-204).

30 Man har nu isoleret basiske og sure FGF'er fra mange forskellige kildert og ved en række oprensnings-fremgangsmåder. Selv om produktionen af cDNA og genomi-ske kloner, der koder for FGF precursorer, har vist en fælles identitet for de forskellige vækstfaktorer, er 35 der opstået nye problemer angående deres biologi. F.

2 DK 172991 B1 eks. inkluderede cDNA klonerne for FGF'erne ikke klassiske signalsekvenser, der almindeligvis står i forbindelse med udskilte proteiner. Forskellige forskergrupper har også meddelt forskellige NI^-terminale amino-I 5 syrer samt forskellige længder for de totale FGF pro teiner.

Til opnåelse af en nøjagtig dechifrering af de forskellige biologiske karakteristika, hvis sådanne findes, for de mikrohe te rogene former for FGF er det 10 nødvendigt at konstruere rekombinante ekspressionssystemer for produktion af de forskellige FGF former. Sådanne ekspressionssystemer skal være i stand til translationel modifikation på nativ måde, deriblandt amino-terminal acetylering. Systemerne skal også ideelt set 15 tilvejebringe høje ekspressionsniveauer for proteinerne på former, der uden videre kan oprenses, og alt dette så økonomisk som muligt. Opfindelsen opfylder dette og andre behov.

EP-A-259 953 beskriver rekombinant produktion af 20 human sur FGF i E. coli, men nævner eller antyder ikke aminoterminus-acetyleret human sur FGF eller rekombinant fremstilling deraf i gær.

Dette er imidlertid overraskende lykkedes for opfinderne.

25 I overenstemmeIse hermed er præparatet ifølge op findelsen ejendommeligt ved det i krav l's kendetegnende del angivne, og fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved det i krav 6's kendetegnende del angivne.

30 Det ses således, at opfindelsen tilvejebringer præparater og fremgangsmåder til produktion i gærarter af human, sur FGF, der typisk i det væsentlige er ami-noterminalt acetyleret. Disse autentisk aminoterminalt bearbejdede proteiner eksprimeres med høje niveauer og 35 intracellulært i gærarterne (uden udskillelse) og op- 3 DK 172991 B1 renses let til i det væsentlige homogenitet. For humane, sure FGF polypeptider opnåede man en specifik aktivitet på mindst ca. 0,61 x 10"^ enheder/mg.

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen vil typisk 5 mellem 30-100% af FGF polypeptiderne blive aminotermi-nalt acetylerede. FGF polypeptiderne er ofte mikro-heterogene, idet de indeholder fra ca. 2 til ca. 5 modificerede former. Hver af disse polypeptider kan oprenses til homogenitet under anvendelse af f. eks. en 10 heparin affinitetskolonne og/eller en HPLC kolonne.

DNA konstruktioner ifølge opfindelsen er ejendommelige ved det i krav 16's kendetegnende del angivne.

I præparaterne ifølge opfindelsen, der indeholder de acetylerede humane sure FGF'er, har disse typisk i 15 det væsentlige hele den primære strukturelle konfor-mation og en eller flere af de naturligt tilknyttede biologiske egenskaber hos native FGF'er. Sådanne præparater vil være i det væsentlige fri for bakterielt protein og andre pattedyrproteiner og vil typisk ikke in-20 kludere en første methionin-aminosyrerest.

KORT BESKRIVELSE AF TEGNINGEN

Figur 1 viser aminosyresekvensen for human sur FGF (1-154).

25 Figur 2 er en skematisk repræsentaton af plasmid- konstruktioner til ekspression af bovine og humane FGF'er. (a) ptac5SOD/bFGF, afledt fra ptac5S0D, tillader transkription af SOD sammen med bovin sur FGF (1-140) RNA som dicistronisk budskab, (b) pAB24a/GaF-baFGF 30 (1-140) gærsekretionsplasmid for eksprimering og bearbejdning af a-faktor leader bFGF fusionsproteiner i S. cerevisiae. Transkriptionen drives af den glucoseregu-lerbare ADH-2/GAPHD promotor, (c) pAB24 A/G haFGF plasmid for glucoseregulerbar intracellulær ekspression af 35 humane FGF precursorer. Igen drives transkriptionen af 4 DK 172991 B1 ADA-2/GAPHD promotoren. Den oprindelige gærvektor pAB24 indeholder LEU2 og URA3 gener til udvælgelse af trans-formanter under leucin- eller uracilmanglende betingel-1 ser. Detaljerede DNA sekvenser og deraf kodede aminosy- 5 resekvenser omkring promotoren og sekretionssignal-FGF fusionerne vises på Figur 3.

. Figur 3 viser syntetiske DNA og deraf kodede ami- nosyreforbindelsessekvenser i sure FGF (D-F) konstruktioner til ekspression i E. coli (D) , udskillelse fra 10 S. cerevisiae (E) og til intracellulær ekspression i S. cerevisiae.

Som nævnt tilvejebringes fremgangsmåder og præparater til effektiv ekspression af autentiske FGF poly-peptider, især sure FGF'er, der acetyleres ved amino-15 terminus under intracellulær gærekspression. Fremgangsmåderne benytter DNA sekvenser, der koder for aminosy-resekvensen for den ønslede FGF, sammen med en translationsinitieringsregion, der er optimeret med henblik på ekspression i gærceller. Generne er indsat i en vektor, 20 der er i stand til intracellulær ekspression (d.v.s. i det væsentlige uden udskillelse), hvorfor man kun kan indhøste FGF polypeptiderne efter lysering af cellerne.

Derefter kan man oprense disse FGF til en række anvendelser, deriblandt at forstærke in vitro vækst af mod-25 tagelige celler og som terapeutiske midler.

Præparater ifølge opfindelsen vil omfatte humane, sure FGF'er, der er acetylerede. I denne forbindelse skal acetylering henføre til en addition af en acetyl-gruppe ved aminoterminus for proteinerne, således som 30 det beskrives i den samtidige commonly assigned U.S.

S.N. 609,412, indleveret 5. november 1984.

Acetylering er ønskværdigt af en række grunde, især til opnåelse af et produkt med en passende nativ struktur og konformation. Således vil i forbindelse med 35 farmaceutiske anvendelser de acetylerede FGF'er i det 5 DK 172991 B1 væsentlige reducere eller eliminere immunogeniteten, når de indgives til en vært. Yderligere mener man, at acetylerede polypeptider er mere stabile og modstandsdygtige mod nedbrydning, når de benyttes in vivo og 5 tillader en forlænget opholdstid i værten. Præparater ifølge opfindelsen kan omfatte 100% acetylerede polypeptider, men acetyleringen vil mere typisk ligge i området ca. 70-50% og kan efter ønske være så lav som 30% eller mindre.

10 De ifølge opfindelsen fremstillede sure FGF'er har alment en pi-værdi, der i det væsentlige er mindre end 7,0, typisk ca. 5,0-6,0, og de er også i stand til at binde til heparin. Alment er sur FGF aktiv som et mitogen på mange celletyper såsom fibroblaster, vaskulære 15 og corneale endothelialceller, chondrocytter, osteo-blaster, myeloblaster, celler fra glatte muskler og gliale celler. En foretrukket sur FGF er på ca. 154 aminosyrer, når man benytter nummersystemet som vist på Figur i (se EP patentansøgning nr. 87 306 066.9, of-20 fentliggjort 16. marts 1988).

Sure FGF'er vides at eksistere på forskellige mikroheterogene former, d.v.s. de 154 aminosyrer kan især være udsat for proteolyse, men også for yderligere modifikationer. Således er eksempler på yderligere 25 former de humane sure FGF'er (9-154), (13-154) og (16-154). Således vil i denne forbindelse autentisk aminoterminalt behandlede FGF'er referere til sådanne mikroheterogene former, hvoraf visse vil være acetylerede. Naturligvis vil fagmanden kunne indse, at 30 FGF'er fremstillet ifølge opfindelsen også kan være underkastet alleliske forskelle og standardmutationer, såsom indre sletninger, additioner eller substitutioner af mange af aminosyreresterne, forudsat at en eller flere af de ønskede biologiske aktiviteter stadig er 35 til stede.

6 DK 172991 B1

Til fremstilling ifølge opfindelsen af FGF poly-peptiderne i gærarter må man først enten isolere eller ved samling ifølge kendt teknik af nucleotidbaser kemisk syntetisere de relevante DNA sekvenser, der koder 5 for polypeptiderne. Man vil foretrukket anvende kemisk syntese, hvorved alle nucleotiderne svarer til sekvenser fra begge strenge i det ønskede gen; eller syntetiseres i overlappende sektioner, der senere kan samles i gener af fuld længde.

10 Når disse gener først er opnået, vil de blive ind sat i vektorer, såsom gær ekstrachromosomale elementer, der indeholder en gærpromotor, der er i stand til at dirigere intern eksprimering af de ønskede proteiner.

Disse vektorer vil typisk også inkludere et initie-15 ringskodon tilsluttet umiddelbart opstrøms for genet og et termineringskodon umiddelbart nedstrøms for genet.

Egnede kraftige promotorer inkluderer alkoholdehydro-genase 1 og 2, triosephosphatisomerase og en hvilken som helst af andre, velkendte promotorer. Til opnåelse 20 af korrekt acetylering undgår man imidlertid sekreto-riske signalsekvenser. En almen gærterminatorsekvens såsom TPi-i-terminatoren kan også anvendes. Alle disse DNA fragmenter kan sammenføjes ved velkendt teknik, såsom beskrevet i Maniatis et al., Molecular Cloning: 25 A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories (1982) .

Efter fremstilling af den ønskede DNA-konstruktion transformeres vektoren i den ønskede gærvært ved standardteknik. En foretrukket vært er S. cerevisiae med 30 reducerede proteaseniveauer, men foretrukket en anden end NAT 1 (N-terminal acetyltransferase) minus mutanten. En særlig foretrukket stamme af S. cerevisiae er betegnet JSC302 og er deponeret hos American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA. Ved overeks-35 primering af NAT 1 og ARD 1 (standsningsdefekt), der DK 172991 B1 7 øjensynlig må eksprimeres sammen til opnåelse af yderligere acetylaseaktivitet, kan man producere FGF med en væsentligt forøget acetylering. til opnåelse af en sådan overeksprimering integreres NAT 1 og ARD 1 under 5 kontrol af kraftige promotorer i hver sine værter, der derefter kobles til opnåelse af diploider, der er egnede til transformation af den ønskede ekspressionsvektor, der indeholder FGF.

De transformerede gærceller kan udvælges ved hjælp 10 af vækst på sædvanligt komplekst medium, der kan variere afhængig af den specielt anvendte vektor. Når transformanterne først er udvalft, kloner man dem, udvælger sådanne med høj produktion og dyrker dem i et passende medium.

15 Når gærcellerne er dyrket til den ønskede densi tet, kan man opnå de omhandlede intracellulære FGF'er ved først at lysere cellernre og derefter isolere det ønskede protein ved standardoprensningsteknik. Sådanne teknikker er velkendt af fagmanden og kan inkludere af-20 finitetschromatografi (især baseret på heparin), elek-troforese, dialyse, HPLC eller andre typer for søjle-ch roma tograf i. FGF'er kan oprenses til homogenitet, typisk til mindst 95% renhed og op til 98-99% renhed eller mere.

25 De omhandlede sure FGF'er vil i det væsentlige have samme aminosyresekvewnser som de naturligt forekommende proteiner. Som tidligere bemærket kan mikro-heterogenitet føre til spaltning af forskellige amino-syrestrækninger fra proteinet, typisk fra den aminoter-30 minale ende. Fem eller flere former for et FGF polypep-tid kan oprenses fra en enkelt gærkultur, men mere typisk produceres to eller tre former. Sædvanligvis vil mindst ca. 50% eller mere af FGF formerne være acetyle-ret, idet de andre former varierer fra et minimum på 2-35 5% op til ca. 40-50% af blandingen.

m * 8 DK 172991 B1 Særlgit foretrukne præparater indeholder kun en enkelt form for FGF. Et sådant præparat kan opnås fra mikroheterogene FGF præparater ved yderligere chromato-grafi- eller elektroforesetrin.

5 De omhandlede, i det væsentlige rene FGF polypep- tider kan kombineres med en farmaceutisk acceptabel bærer til opnåelse af farmaceutiske præparater, der kan j indgives til patienter enten intravenøst, subcutant, intramuskulært eller oralt. De krævede doser vil natur-10 ligvis variere med den tilstand, der skal behandles, med alvoren af tilstanden og med varigheden af den ønskede behandling. Egnede koncentrationer kan også variere bredt og vil sædvanligvis ligge mellem ca. 1-50 mg/ml, foretrukket 10-100 mg/ml. En terapeutisk effek-15 tiv mængde, der er tilstrækkelig til at forhøje hastigheden for tilsynekomst og vækst af nye fibroblaster in vivo, vil være i området 1-5 ml af det koncentrerede præparat. Lignende koncentrationer, men typisk noget lavere, kan benyttes til at forstærke vækst eller leve-20 dygtighed for FGF modtagelige celler in vivo, såsom i cellekulturer.

Disse proteiner indgives ofte på form af farmaceutisk acceptable ugiftige salte såsom syreadditions-salte, eller metalkomplekser, f. eks. med zink eller 25 jern. Proteinerne skal indgives under opsyn af en læge.

Hvis det ønskes, kan proteinerne indgives i forbindelse med passende bærere, fortyndingsmidler i stabiliserende midler, såvel som andre terapeutiske midler, såsom andre mitogener, deriblandt blodpladeafledt vækstfaktor, 3 0 epidermisk vækstfaktor, insulinagtige faktorer og hvilke som helst af de velkendte transformerede vækstfaktorer såsom TGF-a eller TGF- .

35 9 DK 172991 B1

Man har vist, at de rensede omhandlede autentiske FGF'er er aktive i en række systemer, disse inkluderer standardassays for celleproliferation, såsom for fibro-blaster og endotheliale celler, såvel som i modeller 5 for angiogenese. Således kan disse FGF'er benyttes i en bred række anvendelser, ved hvilke andre FGF'er har vist sig at være aktive. Disse inkluderer in vivo modeller for nerveregenerering, heling af sår, iskæmi og heling af cornea. Ydeligere vil de omhandlede FGF'er 10 som en neutrofisk faktor, der er i stand til at fremme overlevelse og differentiering af neuroner, tillade udvikling af terapeutiske produkter, der er nyttige i det centrale og perifere nervesystem, såsom til behandling af ældning af celler, neuronal regression og celledød.

15 De følgende Eksempler illustrerer opfindelsen.

20 25 30 35 DK 172991 B1 10

EKSPERIMENTAL DEL

I. Materialer og metoder.

Man benyttede de følgende almene fremgangsmåder 5 og materialer til at fremstille DNA konstruktioner og eksprimerede FGF proteiner ifølge opfindelsen. Hver af de citerede referencer inkorporeres specifikt heri under reference. Der benyttes iøvrigt følgende forkortelser: 10 baFGF henfører til bovint sur FGF, haFGF henfører til human sur FGF, bbFGF henfører til bovint basisk FGF og hbFGF henfører til human basisk FGF.

15 A. DNA syntese og samling af gener.

Man syntetiserede oligonucleotider ved phospho-ramiditmetoden under anvendelse af Applied Biosystems 380A synthesizers. Man benyttede cyanoethoxyphosphora-miditmellemprodukter (American Bionetlcs, Hayward, 20 California), og o-nitrophenyltetrazolaktiverende middel (American Bionetics) til syntese af oligonucleotider, der i længde varierede mellem 18-45 baser. Typisk var et fuldstændigt gen omfattet af ca. 22 af sådanne oligonucleotider med maksimalt overlap mellem komplementæ-25 re oligonucleotider. Rensning og phosphorylering for ethvert oligonucleotid findes beskrevt i Urdea, M., et al., (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:7461-7465.

De blandede oligonucleotider blev opvarmet til 90*C og i løbet af 3 timer afkølet til 25 C i en puffer inde-30 holdende 20 mM Tris-KCl, pH 8,0, lOmM MgCl2 og 10 mM dithiothreitol. Efter sammenføjning tilpassede man blandingen til 3 mM ATP. Ligering i 15 minutter ved 25 C med T4 DNA ligase (5 ml, New England Biolabs, 4 x 105U/ml) blev fulgt af ethanoludfældning og fordøjelse 35 med Xba-1 og Sal-1. Hvert syntetisk bovint gen blev renset ved polyacrylamid gelelektroforese på 7% acryla- 11 DK 172991 B1 mid, elektroeluering og kloning i Xba-l/Sall fordøjet pHGlOO. På lignende måde blev de tilsvarende humane gener klonet i Nco-/Sal-l fordøjet pBSlOO (Barr, P., et al., (1987) Vaccine 5:90-101). Disse plasmider blev 5 fordøjet med BamHl til frigivelse af ekspressionskassetter, der blev klonet i det BamHl fordøjede og med alkalisk phosphatase behandlede gærplasmid pAB24 (fig.

3). Gensekvenser og følgende ekspressionsvektor sammenføjningssekvenser blev bekræftet ved hjælp af Ml 3 10 didesoxysekvensopdeling. For de mange især G-C-rige regioner i de basiske FGF gener benyttede man dGTP ana-logen 7-deaza-dGTP til at opløse områder med komprimeret sekvensinformation (Barr, P., et al., (1986) Bio- ;Techniques 4:428-432).

15 ' B. Plasmider.

pHGlOO er et pBR322 afledt plasmid, der er analogt til pAB114 (Brake, A., et al., (1984) Proc. Natl.

Acad. Sci. U.S.A. 81:4642-4646). Hvert plasmid indehol-20 der S. cerevisiae a-faktor promoter, leader- og termi-natorsekvenser, der flankerer det strukturelle gen for a-faktoren i pAB114, og et syntetisk humant interleu-kin-2 (hIL-2) gen i pHGlOO. Derudover modificerede man pHGlOO ved at indføre tavse mutationer, der kodede for 25 et unikt xba-1 kloningssted umiddelbart 5’-stillet til den modne hIL-2 kodende sekvens (Fig. 4). Til ekspressionsstudier benyttede man disse a-faktor leader-syn-tetiske genkonstruktioner til DH-2/GAPDH promoteren (Barr, P., et al., (1987) Vaccine 5:90-101) til opnåel-30 se af vektorer, der blev betegnet pA/Ga-faktor bFGF'er (Fig. 3[b]). pBSlOO indeholder en BamHl ekspressionskassette bestående af den hybride ADH-2/GAPDH promoter og GAPDH transkriptionel terminator. Disse kontrolelementer flankerer en region for det humane immundefek-35 tvirus (HIV) env gen (Barr, P.# et al., (1987) vaccine 5:90-101). xloningssteder for disse konstruktioner er 12 DK 172991 B1

Nco-l, der koder for methionininitieringskodon (Fig.

4[c]), og Sal-l, der er anbragt nedstrøms for termine-ringskodoner for det gen, der skal eksprimeres. Gær-[ plasmidet pAB24, beskrevet 1 Barr P., et al., (1986) 5_' BioTechnology 5:486-489, indeholder udvælgelige markører til vækst i enten uracil- eller leucindefekte medier (Fig. 3). Anvendelse af ptacSSOD for ekspression af hSOD fusionsproteiner i E. coll findes beskrevet i Steimer, K., et al., (1986) J. Virol. 58:9-16.

10 C. Stammer.

Til transformation og ekspression i E. coli benyttede man stammen D1210 (Maniatis, T., et al., (1982)

Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Springs 15 Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York). De anvendte S. cerevlsiae stammer er som følger: AB110 .(Mata, leu 2-3, 112ura 3-52, pep4-3, his4-580 [cir]); 2150-2-3 (Mata leu2, adel, [cir]; AB116 (Mata, leu2, j trp-1, ura3-52, prBl-1122, pep4-3, rCl-407, [cir]}. Man 20. udførte gsrtransformationer som tidligere beskrevet i Hinnen, A., et al., (1978) Proc. Natl. Acad. Sci.

U.S.A. 75:1919-1933.

D. Oprensning af FGF'ere fra rekombinante bakterie- og 25 gærkulturer.

Hver af de rekombinante FGF'er blev oprenset ved heparin Sepharose chromatografi (Shing, Y., et al., (1984) Science 223:1296-1299). Kort fortalt satte man ekstrakter fra lyserede bakterier eller gærceller di-30 rekte på kolonner med heparin Sepharose (Pharmacia) i Tris-CL puffer (lOmM, pH 7,0, ImM EDTA) og eluerede med 0,6M NaCl (for sure FGF'er) og 1,0M NaCl (for basiske FGF'er). For E. coli-afledt baFGF benyttede man chromatografi på CM-sephadex (Pharmacia) før heparlnkolonnen.

35 Til eluering fra heparin Sepharose benyttede man NaCl gradienter op til 2,OM (sure FGF'er) og 3,OM (basiske 13 DK 172991 B1 FGF'er). Til endelig rensning af E. coli-afledt bbFGF var gelfiltrering på Ultrogel AcA54 (LKB) i 20mM Tris-CL puffer, (pH 7,5, 0,lmM EDTA, 0,3M NaCl) også inkluderet.

5 De N-terminalt acetylerede og ikke blokerede former for hbFGF blev adskilt ved revers fase HPLC på en Vydac C-4 kolonne (0,46 x 25 cm). Kolonnen blev bragt i ligevægt med 0,1% trifluoreddikesyre (TFA) og hbFGF'er blev elueret under anvendelse af en gradient 10 med 32-34% acetonitril. Man udførte N-termlnal sekvensanalyse for alle rensede FGF'ere under anvendelse af en Applied Biosystems 470A gasfase sekvensopdeler med on-line HPLC analyse af PTH-aminosyrerne.

15 E. Kortlægning af peptider.

De to former for hbFGF, der var adskilt ved hjælp af HPLC, blev reduceret med DTT og behandlet med vinylpyridin for at blokere cysteinresterne. Efter fordøjelse med Staphylococcus aureus ve protease adskilte 20 man peptiderne ved HPLC på en Vydac C-18 kolonne (0,46 x 25 cm) i 0,1% TFA under anvendelse af en 50 minutters gradient på 10-40% acetonitril. Hver top blev indsamlet og senere identificeret ved analyse for aminosyresam-mensætning.

25 F. Massespektrometri.

Man opløste proteinet (1-2 nmol) i ammoniumbi-carbonat (150 ml, 50mM, pH 7,8, 0,lmM i Ca2+) og trypsin (1 vægt%) blev tilsat. Man inkuberede prøverne ved 30 stuetemperatur. Efter en times forløb tilsatte man yderligere 1 vægt% trypsin og fortsatte fordøjelsen i en yderligere time. Fordøjelsen blev afsluttet ved frysning og frysetørring.

Indordningen af de protonerede molekylioner fra 35 de N-terminale peptider blev foretaget under anvendelse af et Kratos MS50S dobbeltfokuserende instrument forsy- 14 DK 172991 B1 net med en magnet med kraftig felt LSIMS kilde og en detektor (lOKeV) efter acceleratoren i positiv ionmode (Aberth, W., et al., (1982) Anal. Chem. 54:2029-2034). j Prøverne blev sat på spidsen af sonden og tørret under 5] vakuum. Man påførte en bærer af thioglycerol:glycerol (1:1) med indhold af 0,1M saltsyre før indførelse i kilden. Spektrene blev undersøgt for m/z 3000-300.

G. Mitogenassay for FGF.

10 Man analyserede den mitogeniske aktivitet af de forskellige FGF'er under anvendelse af densitetsstandsede humane forhudsfibroblaster (HFF), vaskulære endot-heliale celler og kapillære endotheliale celler. Man udplattede HFF celler (1 x 104/brønd) i 96 brønds mik-15 rotiterplader i Dulbecco’s Modified Eagles Medium (DMEM) med 5% kalvefosterserum (Hyclone, Ogden, Utah).

Efter 5 dages forløb tilsatte man fortyndinger af forskellige FGF præparater i 10 ml serumfrit DMEM. Omkring 18 timer senere tilsatte man 3H thymidin (lmCi/brønd; 20 Amersham, 25Ci/mmol, 103 mCi/mg). Derefter inkuberede man pladerne i 24 timer og vaskede kulturen med phosp-hatpufret saltvand (PBS). Man satte 5% trichloreddike-syre (5%) til brøndene i 15 minutter fulgt af methanol i 15 minutter. Derefter overhældte man pladerne med 25 methanol og tørrede dem i luft. Indholdet af hver brønd blev solubiliseret i 50 ml 0,3N NaOH og overført til småglas, der indeholdt scintillationsvæske til tælling.

Hver fortynding af en FGF prøve blev analyseret tredobbelt. En aktivitetsenhed er den mængde af FGF, 30 der kræves for at stimulere halv-maksimal 3H-thymidin-inkorporering. Man bestemte den specifikke aktivitet for forskellige præparater ved at dividere den reciprokke værdi af fortyndingen, der gav halvmaksimal inkorporering, med proteinkoncentrationen.

35 De biologiske aktiviteter af FGF'erne blev også fastslået I modeller, der følger den differentierede 15 DK 172991 B1 funktion. Disse inkluderede neuritudvækst af PC12 celle (Gospondarowicz, D., et al., (1986) J. Cell Physiol. 127:121-136), prolactinfrigivelse af GH3 celler (Gospodarowicz, D., et al., (1962) J. Biol. Chem.

5 257:1266-12278) og aromataseaktivitet i fibroblaster og granulosaceller (Gospodarovicz, D. (1984) Methods for Preparation of Media, Supplements and Substrata for Serum Free Animal Celle Culture, s. 275-293, Alan R.

Liss, Inc., New York). Den angiogeniske aktivitet af 10 vækstfaktorerne blev afprøvet i en kyllingechorioallan-toisk membran (Gospodarowicz, D., et al., (1984) Proc.

Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:6963-6967), rottehjerne (Gimbrone, M., et al., (1974) J. Natl. Cancer Inst. 52:413-427) og nyrekapsel (Risua, w. (1986) Proc. Natl.

15 Acad. Sci. U.S.A. 83:3855-3859).

II. Eksempler

Man syntetiserede 435 bp genet for baFGF (1-140) 20 (nummereret ifølge Gimenez-Gallego, G. et al., (1985)

Science 230:1385-1388). Konstruktionen inkorporerede unikke restriktionsenzymmål for Hind-III og Nar-I nær ved 5'-enden for baFGF genet. Dette tillod en let overførsel af genet i de ønskede ekspressionssystemer under 25 anvendelse af syntetiske adaptorer. På lignende måde syntetiserede man haFGF precursorgenet (Jaye, M. et al., (1986) Science 233:541-545) og klonede det under anvendelse af oligonucleotider på 29-44 baser.

30 EKSEMPEL 1

Bovin FGF geneksoression

Man eksprimerede det syntetiske gen for baFGF (1-140) i B. coli under anvendelse af et to-cistron budskab drevet af tac-1 promotoren (Hallewell, R. et al., 35 (1986) Nucleic Acids Res. 13:2017-2033) (Fig. 2(a)).

16 DK 172991 B1

Man har tidligere vist, at anvendelse af to-cistron budskaber kan overvinde transslationsinitieringsproblemer, der er blevet henført til dannelse af stamme-løkke strukturer rundt om ribosombindingsstedet. (Scho-5 ner, B. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:5403-5407). Det kraftigt eksprimerede humane peroxiddismuta-se (hSOD) gen tilvejebragte den første cistron i budskabet. Dette gen var fulgt af et nyt ribosombindings-sted, et stopkodon og et initieringskodon for det bovi-10 ne FGF gen (Fig. 3) . IPTG induktion af E. coli stamme D1210 celler transformeret med et sådant plasmid tillod en ekspression på moderat niveau af bovin FGF.

Genet blev endvidere eksprimeret som fusion med gær a-faktor, mating pheromon leadersekvens (Brake, A.

15 et al., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:4642-4 64 6) . Man benyttede syntetiske adaptorer til at sammensmelte genet til sekvenser, der koder for dette udskillelses- og bearbejdningssignal (Fig. 3). Dette hybridgen var flankeret af den glucoseregulerbare alko-20 holdehydrogenase-2 (ADH-2)/glyceraldehyd-3-phosphatde-hydrogenase (GAPHD) hybrid-promotor beskrevet i Cou-sens, L. et al., (1987) Gene (Amst.) 61:265-275 og Barr, P. et al., (1987) J. Exp. Med. 165:1160-1171, og den a-faktor transkriptionelle terminator (Brake, A. et 25 al., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:4642-4646).

I hvert tilfælde påviste man udskilt FGF i supernatan-ter fra gæren ved SDS-PAGE analyse af udskilt protein fra medier behandlet med TCA og ved hjælp af bioassays.

Med henblik på akkurat at definere N-terminale 30 aminosyrestrukturer og specifikke aktiviteter for hver rekombinant bovin FGF oprensede man hvert protein både fra E. coli celler og S. cerevisiae dyrkningsmedier.

Dette blev udført ved heparin-Sepharose® chromatografi.

Under anvendelse af denne fremgangsmåde opnåede man bo-35 vine FGF prøver med mere end 98% renhed. Man udførte Ν'- 17 DK 172991 B1 terminal aminosyresekvensanalyse på hver af de rensede prøver, og resultaterne vises i Tabel 1.

Man observerede kun en homogen N-terminus i baFGF (1-140), eksprimeret i E. coli. Imidlertid repræsente-5 rede selv dette polypeptid ikke et autentisk baFGF(1-140) molekyle, idet som meddelt tildigere for baFGF eksprimeret i E. coli det initieringskodonafledte N-terminale methionin ikke blev fjernet in vivo. Man kunne også vise, at den bovine FGF havde en heterogen N-10 terminus, når den blev udskilt og oprenset fra gær. Ud over den naturlige spaltning af det parrede basiske aminosyrebearbejdningssted medieret af kex-2 genproduktet (Julius, D. et al., (1984) Cell 37:1075-1089), blev baFGF yderligere nedbrudt ved N-terminus (Tabel 1) .

15 EKSEMPEL 2

Ekspression af human FGF precursor På grund af den N-terminale heterogenitet af re-kombinant bovin FGF eksprimerede man tilsvarende human 20 FGF som precursorform under anvendelse af et intracel-lulært gærekspressionssystem. Under anvendelse af initieringskodoner, der kunne beregnes ud fra proteinanalyse (Story, M. et al., (1987) Biochem. Biophys. Res.

Coimun., 142:702-709) og DNA sekvensdata for haFGF 25 (ECCF) (Jaye, M. et al., (1986) Science 233:541-545) føjede man direkte det syntetiske precursorgen til ADH-2/GAPDH hybridpromotoren (Fig. 3 [c]). Man benyttede et plasmid indeholdende en sådan sekvens (Fig. 2[c]) til at transformere gær under betingelser med leucinudvæl-30 gelse. Induktion af FGF genekspression foregik samtidig med faldende mængder af glucose i gærmediet under vækst af kulturen (Cousens, L. et al., (1987) Gene (Amst.), 61:265-275). Man indhøstede cellerne og analyserede dem for FGF ekspression som nævnt ovenfor. Da FGF'er er 35 celleassocierede i pattedyr in vitro modeller, under- 18 DK 172991 B1 søgte man supernatanter fra disse kulturer for udskilte FGF'er. I hvert tilfælde fandt man kun FGF polypeptider i den opløselige fraktion af brudte gærceller. Ligesom ved pattedyrssystemerne indeholdt dyrkningsmedier kun 5 meget lidt FGF (mindre end ca. 5% af den totale mængde) .

EKSEMPEL 3

Sekvensanalvse for humane FGF'er eksprimret i aær 10 Man kunne let rense opløselig haFGF polypeptid på heparin-Sepharose®. Man undersøgte virkningen af endogene gærvacuolare proteaser på haFGF ekspression under anvendelse af pep4-3 wild type stammen 2150. Her fandt man en tydelig forskel i gelelektroforetisk mobilitet 15 mellem haFGF eksprimeret i ABI16 og en sådan fra 2150.

I overens ternmel se hermed blev hver renset hFGF underkastet N-terminal sekvensanalyse og massespektrometri.

Man fandt, at haFGF precursoren var kvantitativt blokeret ved N-terminus lige som LSOD (Hallewell, R. et al., 20 (1987) Biotechnology 5:363-366). Massespektralanalyse af tryptiske fragmenter fra dette polypeptid viste en protoneret molekylion, der svarede til det acetylerede N-terminale peptid Ac-AEGEITTFRALTEK ved m/e 1552. Man kunne ikke observere noget peptid svarende til m/e 1510 25 (ikke blokeret N-terminus). Således kunne man som ved naturlig hSOD gærafledt rekombinant hSOD (Hallewell, R. et al., (1987) Biotechnology 5:363-366), naturlig haFGF (ECGF) (Burgess, W. et al., (1986) Proc. Natl. Acad.

Sci. USA 83:7216-7220) og baFGF (prostatropin) (Crabb, 30 J. et al., (1986) Biochemistry 25:4988-4993), vise, at den blokerende gruppe var en acetylenhed. Denne oplysning sammen med aminosyresekvensanalyse viste også, at endogen gærmethionylaminopeptidase var i stand til effektivt at fraspalte den initieringskodonafledte meth-35 ioninrest før acetyleringen.

19 DK 172991 B1

Man viste, at haFGF oprenset fra gærstamme 2150 var en blanding af tre vigtige specier spaltet efter resterne PheS (26%) , Thrl2 (11%), Phel5 (7%) sammen med den blokerede precursor (54%). Denne iagttagelse under-5 streger følsomheden for de N-terminale aminosyresekven-ser i FGF'er for proteolyse af aspartylproteaser, således som det meddeles med henblik på bbFGF (Klagsbrun, M. et al., (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:1839-1842) .

10 EKSEMPEL 4

Biologiske aktiviteter hos rekombinante FGF'er

Til en kvantitativ vurdering af den specifikke aktivitet for hvert polypeptid eller blanding af beslaeg-15 tede polypeptider foretog man en analyse af den mitoge-niske aktivitet for humane forhudsfibroblaster. De specifikke aktiviteter for de forskellige præparater ses i Tabel 1. Evnen hos de rekombinante proteiner til at stimulere proliferation af endotheliale celler kan ikke 20 skelnes fra evnen hos de native mitogener.

25 30 35 20 DK 172991 B1

Jj

O

* U

tf ^ - s s

iJ o o _< O O

<3

X

X

£ ff 0 λ1 & s V) w-

^ g ?H S ? H

. * § S"” § a c -

O-ι CJ

\4 rM >1-0 Λ C *J

o o a “o !, iio 3 £ hk

irf I ^ J JS I I I

•hw> i, cfc ^ T· ** k %l « ^ s c η λ S S 4? ϊ 5 ] Jj U O ^ C« < < 5 5 7 7* i »j o > tf i i. o o L a g Μ -P ^ 2 2 S V jC rt ri O ^ α i <u v S g < < οΗ-«θ^< . 2 z « n 2 Λ ^

: H

M

U s s £ Η « a 2 « o t o « o i ii 5 5 ja S3 “i I g g g a si o s« II uil </> vi uj

•Sr- El. t«. ri U

S · g g S % SS i S 2 2 V ti c o =3 S- Ω W **

Claims (22)

1. Præparat med mitogenisk aktivitet over for men-neskeforhuds-fibroblaster, kendetegnet ved, at det omfatter en rekombinant produceret aminotermi- 5 nus-acetyleret human sur fibroblastvækstfaktor (FGF) med den aminosyresekvens, der er vist ved positionerne 1-154 på Figur 2.

2. Præparat ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det yderligere omfatter ikke acetyleret human 10 sur FGF.

3. Præparat ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at acetyleret FGF omfatter omkring 50% af total FGF.

4. Præparat ifølge et hvilket som helst af kravene 15. til 3, kendetegnet ved, at det yderligere omfatter mindst en human sur FGF valgt fra gruppen af FGF'er bestående af FGF'erne (9-154), (13-154) og (16- 154. med aminosyresekvenser afbildet ved henholdsvis positionerne 9-154, 13-154 og 16-154 på Figur 2.

5. Præparat ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 4, kendetegnet ved, at den specifikke aktivitet for FGF mindst er ca. 0,61 x 10~5 enheder/mg.

6. Fremgangsmåde til fremstilling af et præparat af en human sur fibroblastvækstfaktor (FGF), hvor FGF 25 præparatet omfatter aminoterminus-acetyleret FGF, der opviser mitogenisk aktivitet over for menneskeforhuds-fibroblaster, kendetegnet ved, at man a) transformerer gær med et ekspressionsplasmid omfattende et DNA-molekyle, der koder for en human sur

30 FGF, hvor molekylet er under transkriptionskontrol af en i gær fungerende promotor; b) dyrker den transformerede gær under egnede betingelser for ekspression af FGF til intracellulær produktion af FGF; og 35 c) skiller FGF fra de transformerede gærceller. i DK 172991 B1

7. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendetegne t ved, at mindst 30% af FGF polypeptiderne er ami-noterminus-acetylerede.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendeteg-5 n e t ved, at mindst 50% af FGF polypeptiderne er ami- noterminus-acetylerede,

9. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendetegnet ved, at i det væsentlige alle FGF polypeptiderne er aminoterminus-acetylerede.

10. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendeteg ne t ved, at FGF omfatter en aminosyre sekvens som repræsenteret af aminosyreresterne 1-154 fra Figur 2.

11. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 6 til 10, kendetegnet ved, at man 15 derudover renser den fraskilte FGF med en heparinaffi-nitetskolonne.

12. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 6 til 10, kendetegnet ved, at man derudover renser den fraskilte FGF med en HPLC kolonne.

13. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 6 til 12, kendetegnet ved, at man derudover skiller acetyleret FGF fra ikke acetyleret FGF.

14. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af 25 kravene 6 til 13, kendetegnet ved, at man derudover behandler FGF med phosphataseenzym.

15. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 6 til 14, kendetegnet ved, at man som gærværtscelle til transformation benytter en sådan 30 stammende fra S. cerevisiae stamme AB 110, AB 116, 2150 eller JSC302. 35 m m DK 172991 B1

16. DNA-konstruktion til brug ved fremgangsmåden ifølge krav 6, hvor konstruktionen er i stand til at dirigere den intracellulære ekspression i gær til opnåelse af en bearbejdet sur fibroblastvækstfaktor (FGP), 5 der opviser mitogenisk aktivitet mod menneskeforhuds-fibroblaster, kendetegnet ved, at DNA-kon-struktionen omfatter en transkriptionel promotor DNA-region for gær opstrøms for et initieringskodon, et DNA-molekyle kodende for sur FGF og en transkriptions- 10 terminator, idet promotoren ved sin 3'-ende er føjet til 5'-enden af DNA-molekylet, og DNA-molekylet ned-strøms efterfølges af transkriptionsterminatoren, og DNA-konstruktionen ikke er i stand til at dirigere udskillelse af den basiske FGF fra gæren.

17. DNA-konstruktion ifølge krav 16, kende tegnet ved, at promotoren er glucoseregulerbar.

18. DNA-konstruktion ifølge krav 17, kende -tegnet ved, at promotoren er en hybridpromotor omfattende promotorsekvenser fra alkoholdehydrogenase-2 20 og glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase.

19. DNA-konstruktion ifølge et hvilket som helst af kravene 16 til 18, kendetegnet ved, at DNA-molekylet koder for en human sur FGF omfattende en aminosyresekvens som repræsenteret af aminosyrerester- 25 ne 1-154 fra Figur 2.

20. Gærværtscelle, kendetegnet ved, at den er transformeret med en DNA-konstruktion ifølge et hvilket som helst af kravene 16 til 19.

21. Gærværtscelle ifølge krav 20, kende- 30 tegnet ved, at cellen, før transformationen, stammer fra S. cerevisiae stamme AB 110, AB 116, 2150 eller JSC302.

22. Gærværtscelle ifølge krav 21, kende tegnet ved, at gærstammen er JSC302 (ATCC 20967). 35