DK172783B1 - Fremgangsmåde til fremstilling af et hydrolysat af dyriske mælkeproteiner, hydrolysat opnået ved fremgangsmåden, fremgangsm - Google Patents

Description

i DK 172783 B1 . Opfindelsen angår en fremgangsmåde til fremstil ling af et hydrolysat af dyriske mælkeproteiner, hvorved man enzymatisk i to separate hydrolysetrin hydrolyserer et valleprodukt og ad termisk vej inaktiverer en-5 zymet og ved en sådan fremgangsmåde opnåede hydrolysa-ter. Opfindelsen angår endvidere en fremgangsmåde til fremstilling af et hypoallergent fødemiddel samt anvendelse af et hydrolysat ifølge opfindelsen i diætfødemiddelpræparater .

10 Man ved, at allergier for komælk og for mælke produkter med indhold af komælk hos småbørn skyldes, at valleproteinerne i komælk afviger fra proteinerne i modermælk og kan fungere som allergener. Blandt de sidstnævnte er de vigtigste kendte allergener først og frem-15 mest σ-lactalbumin (aLA) og ø-lactoglobulin (bLG) og i mindre høj grad immunoglobullnerne (især IgG) og serumalbumin (BSA).

Man har søgt at eliminere den allergene karakter af disse ved ved hjælp af hydrolyse at omdanne dem 20 til peptider.

Ifølge US patentskrift nr. 4.293.571 fremstiller man et proteinhydrolysat ved pancreatisk hydrolyse, man koagulerer ikke hydrolyserede proteiner ved en varmebehandling, hvorefter man ultrafiltrerer hydrolysatet 25 for at fjerne de koagulerede restproteiner og de makro-peptider, der kunne udgøre allergener.

Man har også foreslået, se f.eks. Blatt et al.,

Anal. Biochem. 22: 161-165 eller EP patentansøgning nr. 22 019, direkte at hydrolysere valleproteiner i et 30 ultrafiltreringsanlæg og at indsamle peptiderne efterhånden, som de dannes. I en membranreaktionsbeholder af denne type vil de ikke hydrolyserede proteiner blive tilbageholdt og derefter tilbageført til hydrolyseafde- BNSDOCID: <DK_182783B1 J_> DK 172783 Bl 2 lingen, hvor de igen kan blive hydrolyserede. Selv under disse betingelser vil det tilsyneladende ikke i praksis være muligt fuldstændigt at hydrolysere alle valleproteinerne. F.eks. vil serumalbumin akkumuleres 5 i hydrolysereaktionsbeholderen. De forskellige typer lmmunoglobuliner er også modstandsdygtige mod hydrolyse af pancreatiske enzymer og vil kun delvis blive spaltet. De store fragmenter eller makropeptider opnået ved hydrolyse af immunoglobulin fra bovint kolostrum (igG) 10 ved hjælp af trypsin eller papain vil i temmelig høj grad opretholde den allergene karakter af IgG.

Det kan afsluttende nævnes, at det er accepteret, at det ikke er tilstrækkeligt at nedbryde aLA og bLG, idet BSA og IgG er allergener for mennesker, og 15 man har beskrevet dem som sådanne. Ved kendte fremgangsmåder til fysisk fraskillelse af disse vil mindre proteiner med høj næringsværdi gå tabt.

EP-A-B7 247 angår en fremgangsmåde til fremstilling af et proteinhydrolysat til hospitalsernæring, med 20 acceptabel organoleptisk kvalitet og uden bitre peptider, ved udnyttelse af et kombineret enzymatisk system baseret på en blanding af fungisk protease og pancrea-tin, der fører til en hurtig hydrolyse af'ægaTbumin eller sojaprotein. Idet hydrolysen foregår i to trin, be-25 nyttes der en mellemindskudt varmebehandling, hvis formål er en inaktivering af det” første énzymT så 'dette ikke digererer det andet enzym. Efter afsluttet behandling findes der stadig kendelige mængder af ikke hydrolyserede proteiner, der kan være allergener.

30 Opfindelsens formål er at tilvejebringe en frem gangsmåde til fremstilling af et hydrolysat af dyriske mælkeproteiner 1 det væsentlige fri for allergener af protean oprindelse, og hvorved man underkaster et val-leprodukt eifenzymatisk hydrolyser WSDOCID <DK 1β?783Β1 I > 3 DK 172783 B1

Dette formål opfyldes ved hjælp af en fremgangsmåde som ovenfor nævnt, der er ejendommelig ved, at man gennemfører de to hydrolysetrin med et proteoly-tisk enzym valgt blandt trypsin, chymotrypsin og en 5 blanding af trypsin og chymotrypsin og pancreatin, og at man varmebehandler hydrolysatet fra den første hydrolyse i vandig opløsning i 3-10 minutter ved 80-100'C og en pH-værdi på 6-9 på en sådan måde, at proteiner, der efter dén første "hydrolyse “er forblevet-"fhtakte 10 denatureres og således bliver modtagelige for den anden hydrolyse, så hydrolysatet efter den anden hydrolyse praktisk talt er frit for allergener såsom proteiner, proteinfragmenter eller makropeptider med molekylvægte over ca. 10 000.

15 Den vigtigste fordel ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen er, at man ikke behøver at fjerne restproteiner med høj næringsværdi ved fysisk adskillelse.

Det opnåede hydrolysat er især beregnet til fødemidler for småbørn, hvor der er en risiko for al-20 lergi eller hvor der ér "én'erhvervet allergi.

I opfindelsens sammenhæng skal betegnelsen "allergen" forstås som et protein eller makropeptid, der kan fremkalde allergiske reaktioner hos mennesker, især hos følsomme børn eller spædbørn. Et hydrolysat 25 eller et fødemiddel, der indeholder et sådant hydrolysat, vil blive betragtet som hypoallergent, når det ikke længere er muligt at påvise tilstedeværelse af proteiner, store fragmenter eller makropeptider med en molekylvægt over ca. 10.000 ved standardanalysefrem-30 gangsmåder, f.eks. ved højkapacitetsvæskechromatografi (HPLC), ved zoneelektroforese under anvendelse af en polyacrylamidgel (SDS-PAGE) eller, når disse fremgangsmåder ikke længere kan påvise antigener af protean BNSDOCID: <DK_182783B1 J_> 4 DK 172783 B1 eller makropeptid oprindelse, ved immunologiske fremgangsmåder f.eks. ved dobbelt immundiffusion (ID).

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan benyttes på et hvilket som helst enzymatisk hydrolysat af et 5 valleudgangsmateriale, der indeholder valleproteinerne.

Dette udgangsmateriale kan være valle fra ostefabrikation, især en sød valle såsom hvad man opnår fra en koagulering af kasein ved hjælp af osteløbe, en sur valle fra koagulation af kasein ved hjælp af en syre 10 eller forsurende fermenteringsmidler eller en blandet valle fra en koagulering ved hjælp af en syre og osteløbe.

Dette udgangsmateriale kan endvidere være en valletype demineraliseret ved lonbytning og/eller ved 15 elektrodialyse. Vallen kan være et koncentrat af valleproteiner mere eller mindre fri for lactose, f.eks. opnået ved ultrafiltrering eventuelt fulgt af dialyse. Udgangsmaterialet kan endog være en kombination af de ovenfor nævnte udgangsmaterialer og lactose. Materialet 20 kan være på form af en virkelig eller en kolloidal vandig opløsning eller på form af et pulver. I det sidste tilfælde opløser man pulveret, foretrukket i demineraliseret vand, til dannelse af en vandig opløsning. Man underkaster udgangsmaterialet en enzymatisk hydrolyse 25 ved kendt teknik under anvendelse af blandede eller rensede proteolytiske enzymer, der er aktive i basisk eller neutralt miljø, som nævnt trypsin, chymotrypsin eller pancreatin.

Den første hydrolyse kan udføres i en temmelig 30 kort tidsperiode, foretrukket 5-35 min., f.eks. 10 min. under anvendelse af en lille mængde enzym, f.eks.

10% af den totale mængde, der benyttes til hydrolysen.

Dette giver en besparelse i enzymer. I dette tilfælde SNSDOCID: <DK 182783B1 I > 5 DK 172783 B1 vil hydrolysen vxre delvis. Hydrolysen kan udføres i en reaktionsbeholder eller også kontinuerligt 1 et rør.

I tilfalde hvor substratet, der skal hydrolyse-5 res, har tendens til at koagulere under varmebehandlingen, kan man satte et chelaterende middel, såsom f.eks. calcium- eller magnesiumcitrat, til substratet, som f.eks. angivet 1 US patentskrift nr. 4.748.034.

Ifølge opfindelsen underkaster man hydrolysatet 10 en varmebehandling ved βθ-100'c i 3-10 min. og en pH-værdi på 6-8. Varigheden og temperaturen ved varmebehandlingen står naturligvis i forbindelse med hinanden, den laveste temperaturgrænse svarer til den øverst tidsgrænse og omvendt. I forbindelse med industrielle 15 varmevekslere har en temperatur på ca. 90*C og en opholdstid på ca. 5 min. vist sig at være tilstrækkelig til at denaturere mindre proteiner. Man har her fundet, at denaturering af sådanne proteiner gør dem modtagelige for en senere enzymatisk nedbrydning. Det bør næv-20 nes, at varmebehandlingen inaktiverer enzymet.

Hydrolysatet afkøles derefter til en temperatur på 40-60BC, foretrukket til en temperatur på ca. 55eC som er den optimale temperatur for den hydrolytiske aktivitet, og man tilpasser foretrukket pH-værdien til 25 ca. 7,5 ved at tilsætte en vandig opløsning af en base.

Betingelserne for den anden hydrolyse kan variere. i en første udførelsesform udfører _man_. den . anden hydrolyse diskontinuert 1 portioner i en termostatisk kontrolleret tank. Efter tilsstning af det proteolytis-30 ke enzym udvalgt blandt trypsin, chymotrypsin, pancrea-tin eller en blanding af trypsin og chymotrypsin i vandig opløsning udfører man denne hydrolyse i 60-180 min.

BNSDOCID: <DK_1827B3B1 J_> 6 DK 172783 B1 I en anden foretrukket udførelsesform foregår den anden hydrolyse kontinuerligt 1 1-60 min., foretrukket 2-20 min., i et rør, hvori reaktionen foregår under turbulens. I denne verlånt vil røret - afhængig 5 af dets længde - bestemme den nødvendige reaktionstid sammen med den gennemløbende mængde af det produkt, der skal hydrolyseres. I overensstemmelser hermed må enzymet kontinuerligt pumpes til indløbet af reaktionsrøret. Den opnåede høje turbulens giver en hurtig og in-10 tens kontakt mellem enzymet og substratet.

Uafhængigt af den valgte udførelsesform for den anden hydrolyse skal hydrolyseproduktet undergå en varmebehandling til Inaktivering af enzymet. Ved denne varmebehandling opvarmer man først hydrolysatet til en 15 temperatur på 75*C eller derover og holder det ved denne temperatur (foretrukket ved 75-85°C) i ca. 5 min. til fremme af autodigerering af enzymet, idet denne behandling med fordel følges af en sterilisering foretrukket ved ultrahøj temperatur, f.eks. ved 125-135°C, 20 12-3 min. ved Indsprøjtning af damp eller i en varmeveksler. Man kan derefter tørre hydrolysatet f.eks. ved forstøvningstørring eller frysetørring til forskellige anvendelser, eller det kan derudover yderligere behandles. I det sidste tilfælde kan man vente med 25 inaktivering af enzymet til den følgende behandling.

Hydrolysatet fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan ifølge opfindelsen anvendes 1 diætføderoiddelpræparater, især i fødemidler til småbørn eller rekonvalescenter, eller i let resorberbare føde-30 midler til anvendelse af allergikere.

Opfindelsen angår også en fremgangsmåde til fremstilling af et hypoallergent fødemiddel, fremgangsmåden er 'ejendommelig véd, at man sætter cårbon- SMSDOCID: <DK 182783B1J > 7 DK 172783 B1 hydrater, mineralske salte og flydende fedtstoffer, eventuelt med indhold af fedtopløselige vitaminer, til hydrolysatet opnået ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, man tilsætter eventuelt en vandig opløsning 5 af vandopløselige mineraler og sporgrundstoffer, hvorefter man tørrer.

Tørring kan udføres ved frysetørring eller foretrukket ved forstøvningstørring.

Han kan alternativt Inaktivere enzymet ved ste-10 rllisering ved ultrahøj temperatur, hvorefter man indpakker produktet på flydende form i stedet for at tørre det.

Opfindelsen illustreres ved følgende eksempler, hvor andele og procentværdier er på vægtbasis, med 15 mindre andet angives.

I eksemplerne skal analyserne ved de følgende fremgangsmåder demonstrere fravær af restproteiner eller makropeptider efter den anden hydrolyse: 20 I/SDS-PAGE, ifølge Laemmli, U.K. 1970, Nature 277:680 ff., under de nedenfor givne specielle betingelser: BNSDOCID: <DK_182783B1 _L> Θ DK 172783 B1

Parameter Koncentrations- Adskillelses- _gel_gel

Total acrylamid (%) 5,4 13,3 5 Tværbindende middel (%) 2,6 2,6

Natriumdodecylsulfat (SDS, %) 0,1 0,1 resten op til 100% består af destilleret vand 10 pH 6,8 8,8

Dimensioner for gellagene 102 x 73 x 0,5 på pladerne (mm)

Prøve (yg, beregnet som 5-15 total nitrogen, Nt) 15 Strømstyrke (mA/plade) 15

Fremkalder: Coomassie Brilliant blåt G-250 Pufferopløsning til elektroforesen: 0,025 M Tris, 0,19 M glycin, 0,1% SDS.

20

Fremstilling af prøverne: Man dispergerer prøverne i en vandig pufferopløsning, der indeholder 1% SDS og dithiothreitol som reducerende middel. Dispersionen opvarmes hurtigt til 100'c, hvorefter man alky-25 lerer med lfidaCJttamld i en.. XM..vandig opløsning af Trispuffer, pH 8 (16 mg i 0,1 ml pufferopløsning). I visse tilfælde udelader man bevist reduktion og alkylering for at vise proteinerne i ikke reduceret tilstand.

Følsomhed: Ved fremgangsmåden kan man påvise 30 ca. 0,1 ug af proteinerne BSA, aLA og bLG. Påvisnlngs-gransen for H og L kæderne af forskellige igG typer og af intakte (ikke reducerede) igG'er er højere på grund af den diffuse karakter af båndene.

3NSDOCID: <DK 182783B1 I > 9 DK 172783 B1 11/ΙΌ, ifølge Outcherloney, o, Acta. Pathol. Microbiol.

Scand. 26:507, under følgende specifikke eksperimentelle betingelser: 5 Parameter_Betingelser_

Vandig agaropløsning 1,5% (vægt/rumfang), type nr. I agar fra Calbio-chem i en saltopløsning af phosphatpuffer, pH 7,2, 10 Aagargeler på fikseringsfilm (pro dukt LKB nr. 1850-102)

Diameter af åbning (mm) 3

Farvning af de vaskede geler Coomassie Brilllantblåt R-250 i en opløsning af 15 ' ethanol, vand og eddike syre (45/45/10, % rumfang/rumfang)

Affarvning ditto 20 Fremgangsmåde: Den ikke fortyndede prøve er en fysiologisk saltopløsning med et indhold på 100 mg/ml.

Efter en rakke af fortyndinger 1 forholdet 2:1 fylder man åbningerne i rækkefølge på den ene side med prøven og på den anden side med det specielt udvalgte kanin-25 serum, henholdsvis anti-bLG, anti-aLA, anti-BSA og anti-IgG, med en koncentration på 1/16 af den oprindelige koncentration af prøven. Man påviser proteinet ved en antigen-antistof udfaldelsesreaktion. Den første fortynding (udtrykt som en brøkdel af den oprindelige 30 koncentration), hvor man ikke ser en reaktion, noteres ned.

Følsomhed af metoden: Koncentrationsgrænsen for påvisning af aLA og bLG er ca. 20 μ g/ml (prøveru m f a n g BNSDOCID: <DK_1B2783B1J > 10 DK 172783 B1 10 vi) og, for påvisning af BSA og TgG, ca. 40 yg/ml.

III/HPLC: ifølge Diosady, L.L. et al, 1980, Milch- wissenschaft 35:671 og Bican, P. et al, 1982, Milchwis-5 senschaft 37:592.

Analyse på en TSK 3000/SW kolonne bekræfter fravsret af en top for BSA og IgG efter den anden hydrolyse, når man sammenligner med de intakte proteiner under følgende betingelser: 10 Opløsningsmiddel: Pufferopløsning, 0,05 M Tris-HCl, 4 M guanidinium, pH 6,8,

Prøve : l mg hydrolysat eller protein (som kontrol), Påvisning : 280 nm, flow 1 ml/min., 15 Kolonnetemp. : 20"C, der benyttes en isokratisk gradient.

Eksempel l

Han dispergerer under omrøring 24 g deminerali-20 seret surt vallepulver (DWP) i demineraliseret vand og opvarmer langsomt til opløsning. Opløsningen har et rumfang på 80 ml og et tørstofindhold på 30%.

Det anvendte demineraliserede vallepulver har følgende sammensætning: 25 _%

Proteiner (N x 6,38) 11,9

Fedtstoffer 0,8

Lactose 81 30 Askebestanddele 2,8

Vand 3,5

Opløsningen anbringes i en dobbeltvægget reaktionsbeholder, hvis temperatur ved hjælp af en termo- =NSDOCID: «DK 1B2783B1 I » 11 DK 172783 B1 stat holdes ved 55 aC. pH-værdien af opløsningen forøges til 8 ved tilsætning af en 20% (vægt/rumfang) vandig dispersion af Ca(OH)2·

Ku tilsætter man 30 mg porcint trypsin med en 5 styrke på 1500 enheder/mg (United States Pharmacopeia).

Der ses et hurtigt fald i pH-værd len (på grund af den begyndende hydrolyse), der standses ved pH 7,5 ved tilsætning af en IN vandig opløsning af KOH, idet man holder pH ved denne værdi ved hjælp af en pH-stat, der 10 automatisk kompenserer ved hjælp af en IN vandig opløsning af KOH. Reaktionen fortsætter i 4 timer ved 55aC, hvorefter man ikke ved hjælp af titrering kan påvise nogen form for yderligere reaktion.

Hydrolysatet deles i 4 lige store portioner: 15 la: Man sætter en vandig opløsning med indhold af 6 mg sojatrypsininhibitor (STI) til 20 ml hydrolysat for at blokere virkningen af trypsin, hvorefter man frysetørrer opløsningen.

Ib: Man opvarmer 20 ml hydrolysat til 70"C i 1 min.

20 og holder det ved denne temperatur i 5 min.

lc: Man opvarmer 20 ml hydrolysat til 80aC i løbet af 2,5 min. og holder det ved denne temperatur 1 5 min.

Id: Resten af hydrolysatet opvarmes til 90aC i løbet 25 af 4 min. og holdes ved denne temperatur i 5 min.

Man afkøler hurtigt hydrolysaterne lb, lc og ld til 55’C, hvorefter man indfører dem i adskilte reaktionsbeholdere. Man sætter 30 mg af trypsin som før 30 til hver reaktionsbeholder. Reaktionen foregår nu 1 l time ved 55*C/pH 7,5, hvorefter man ikke længere kan påvise nogen reaktion ved titrering. Ku sættes 6 mg STI til hvert af hydrolysaterne, der hver for sig fry- BNSDOCID: <DK_1827B3B1_L> 12 DK 172783 B1 setørres. Disse hydrolysater betegnes henholdsvis le, lf og lg.

Resultatet af analyser ved elektroforese (SDS-PAGE) og dobbelt immundiffusion (ID), hvad angår ind-5 holdet af bovint serumalburpiJl. (BSA) og immunoglobulin G (IgG), ses i Tabel 1 nedenfor:

Tabel 1

BSA IgG

10 Prøve ved SDS-PAGE ved ID ved ID

la . +++ .1/32 .1/64. .

Ib +++ . . 1/32 1/16 1C +++ 1/8 1/1 15 ld +++ 1/8 0 le *++ 1/32 1/32 lf + 1/8 1/1 lg 0 0 0 20 Forklaring: +++:^ 1 yg i 10 yg Nt + :> 0,1 yg 1 10 yg Nt 0 : kan ikke påvises, >0,1 yg i 10yg Nt

Resultater: 25 Idet indholdet ifølge ID er aLA; 1/2S6 - 1/S12, bLG: 1/512 - 1/1024, BSA: 1/8 . - 1/32, og

IgG: 1/8 - 1/64 30 for en vandig opløsning af 100 mg/ml demineraliseret vallepulver, tillader SDS-PAGE og ID ikke, at man kan påvise tilstedeværelse af a-lactalbumin (aLA) eller p-lactoglobulin (bLG) 1 nogle af prøverne.

iNSOOCIO: <0K 182783Bf I > DK 172783 Bl 13

Hydrolyse er Ikke tilstrækkelig til at få allergenerne, der udgøres af proteinerne BSA og IgG, til at forsvinde (la).

Selv om man varmebehandler hydrolysatet er dette 5 ikke tilstrækkeligt til at fjerne BSA (lb, le, ld).

Til opnåelse af et hydrolysat med reduceret allergenitet skal man foretage en passende varmebehandling og derefter en anden hydrolyse (lf, lg).

10 Eksempel 2

Man dispergerer 150 g valleproteinkoncentrat opnået ved ultrafiltrering af sød valle (WPC) i 1 liter demineraliseret vand ved 50"C i en dobbeltvægget reaktionsbeholder, hvis temperatur ved hjælp af en termo- 15 stat holdes på 50BC.

Det anvendte valleproteinkoncentrat har følgende sammensætning: _« 20 Proteiner (N x 6,38) 77,2

Fedtstof 8

Lactose 3

Askebestanddele 7,3

Vand 4,5 25

Den oprindelige pH-værdi forøges fra 6,6-7,9 ved tilsætning af en 20% (vægt/rumfang) vandig dispersion af Ca(OH)2· Man indstiller pH-staten til at holde pH-værdien ved 7,3 ved en automatisk kompensation med 30 en 2N vandig opløsning af KOH.

Man tilsætter 7,5 g pancreatisk trypsin med en styrke på 3 Anson enheder (AU)/g for at starte hydrolysen og forårsage reaktion i 4 timer ved 500C. Man op- BNSDOCID: <DK_182783B1_L> 14 DK 172783 B1 varmer nu hydrolysatet til 90 "C ved at Indsprøjte damp, og det holdes ved denne temperatur i 5 min. Efter afkøling til 55*C indstiller man igen pH-værdien på 7,3 ved automatisk kompensation med 2N vandig opløsning af 5 KOH. Man tilsætter 2 g porcint trypsin (styrke 6 AU/g) for at påbegynde den anden hydrolyse, der fortsættes i 2 timer under automatisk kompensation for pH. Man varmebehandler hydrolysatet i 10 min. ved 90eC, køler hurtigt af og frysetørrer.

10 Til kontrol af hydrolysen udtager man_ på for skellige trin 1 ml prøver, sætter 6 ml STI til hver prøve, hvorefter man hurtigt fryser prøverne og tørrer dem ved frysetørring.

Resultatet af ID analyserne ses i Tabel 2 neden- 15 for.

l'NSDOCID <DK 182783B1 I > DK 172783 B1 15

Tabel 2

Prøve Hydrolysetrin/ varmebehandling Varmebehandling varighed (min.) efter første efter andet trin trin 5 temperatur (eC)/ temperatur (*C)/ _varighed (min.) varighed (min.) 2a første/25 2b første/70 10 2c første/ΙΘΟ 2d første/240 2e første/240 90/5 2f første/240+ 90/5 anden/60 15 2g første/240+ 90/5 90/10 anden/60

Tabel 2 fortsat 20 Prøve Fortynding ved ID1 for

alA bLg BSA IgG

2a 1/16 1/8 1/32 1/64 2b 1/2 1/2 1/32 1/32 2c 1/1 1/1 1/32 . .1/32 25 2d 1/1 1/1 1/32 1/32 2e 1/1 1/1 1/4 1/1 2f 0 0 0 0 2g 0 0 0 0

Kontrol - 30 Udgangsmateriale WPC 1/1048 1/1048 1/64 1/128

Forklaring: - : Ingen varmebehandling 35 1 : Oprindelig koncentration før fortynding, 25 mg tør- stof/ml.

BNSDOCID: cDK_182783B1 J_> 16 DK 172783 B1

Resultater:

Tabel 2 ovenfor viser, at man kun kan fjerne den antigene karakter af hydrolysatet ved en dobbelt hydrolyse med en mellemliggende varmebehandling.

5 Derudover viser analyse ved SDS-PAGE, at man ikke kan påvise bånd, der svarer til BSA for prøven 2f og 2g.

Eksempel 3 10 Man dispergerer 254,6 kg DWP, 91,3 kg WPC og 101,4 kg lactose af levnedsmiddelkvalitet i 800 kg demineraliseret vand ved 6o”C.

Den anvendte lactose har følgende sammensætning: 15 _%

Proteiner (Kx6,38) 0,5

Fedtstoffer

Lactose 94,5

Askebes tanddele 0,1 20 Vand 4,9

Denne dispersion anbringes 1 en dobbeltvcgget reaktionsbeholder, hvis temperatur ved hjælp af en termostat holdes på 55*C· Dispersionen har et tørstofind-25 hold på 30,1% og pH-værdien er 6,4. Man forøger værdien af pH til 7,8 ved tilsætning af en 20% vandig dispersion af Ca(0H)2· Derefter tilsætter man 1 kg porcln trypsin (styrke 6 AU/g, trypsin: chymotrypsinaktivi-tetsforhold 15:1-20:1 ved OSP) dispergeret i en ό,όϊ M 30 vandig opløsning af HCl ved 5-10*C til påbegyndelse af hydrolysen. Man standser det første hurtige fald 1 pH-værdien og holder værdien af pH konstant ved 7,3 under anvendelse af en pH-stat, der automatisk kompenserer med en 2N vandig KOH opløsning.

-MSDOC1D: <DK 182783B1 I > 17 DK 172783 B1

Man fortsætter hydrolysen 1 3 timer ved 55*C/pH

7,3, hvorefter man ved at stille på pH-staten foreger værdien af pH til 7,6. Nu lader man hydrolysatet passere en pladevarmeveksler, hvor det hurtigt opvarmes 5 til 90*C, derfra føres det til et reaktionsrør (flowhastighed 7,5 Ι/min., rumfang af rør 40 1, opholdstid 5 min) og derefter til en anden pladevarmeveksler, hvor det køles til 55*C.

Hydrolysatet pumpes nu med en hastighed på 7,5 10 1/min. gennem en τ-ventil ind i et reaktionsrør med en diameter på 0,025 m og et rumfang på 150 1, hvilket svarer til en opholdstid på 20 min. for hele længden af røret. 1 kg trypsin (samme dispersion som ovenfor) pumpes ind i hydrolysatstrømmen med en hastighed på T 5 6 1/time gennem T-ventilen ved indgangen til reaktions-røret. Reaktionsrøret er opdelt i sektioner til markering af voksende opholdstider på 40 sek.-20 min. Man udtager en prøve på nogle få ml af hydrolysatet ved indgangen til røret (opholdstid 0) og derefter for hver 20 markeret opholdstid, idet man øjeblikkeligt behandler prøverne med en passende mængde STI og nedfryser dem.

Efter en foreløbig opvarmning til 80*C og opretholdelse af denne temperatur i 5 min. pumper man resten af hydrolysatet (hvis opholdstid har været 20 min.) ind 25 i en sterilisator ved ultrahøj temperatur, hvor det opvarmes til 125’C i løbet af 2 min. til inaktivering af enzymet og sterilisering af hydrolysatet. Efter afkøling forstøvningstørrer man hydrolysatet.

Det opnåede pulver har følgende sammensætning: BNSDOCID <DK_\S27B3B1J > 18 DK 172783 B1 _%

Peptider 23

Lactose 68

Askebestanddele 4 5 Fedtstoffer 2

Vand 3

Hydrolysegraden, nitrogen x 100/total nitrogen (Nt), er 18%, og værdien af Nt er 3,56%.

10 Analyse ved hjælp af SDS-PAGE bekræfter fravær af proteinbånd med 139 μ g (5 yg Nt) og 500 yg (18 yg Nt) prøver af produktet. Især observerer man ingen bånd, der svarer til BSA, til H og L kæderne fra IgG, til aLA eller til bLG. Man ser et diffust farvet bånd 15 stammende fra de store peptider tæt ved den anodiske ende af gelen.

Man kan ikke ved ID påvise udfsldelse med anti-BSA, antl-IgG, anti-bLG eller anti-aLA sera og en prøve med 100 mg tørstof/ml før fortynding.

20 Nedenstående tabel 3 viser virkningen af op holdstiden ved den anden hydrolyse, især på BSA.

JSDOC1D. <DK 182783B1 I > DK 172783 B1 19

Tabel 3 ID1 fortyndinger

Prøve Opholds- BSA IgG bLG BSA ved

tid SDS-PAGE

5 (sek.) (500 pg ____prøve) 3a 1/Θ 1/2 1/4 +++ (kontrol uden 10 anden hydrolyse) 3b 40 1/4 1/1 0 + 3c 120 1/10 00 3d 360 1/10 00 eller 15 0 3e 720 1/10 00 eller 0 3f 10B0 1/10 0 0 20 eller 0 3g 10BO 0 0 0 0 (med en slut-varmebehandling 25 125*C/2 min.)

Forklaring: l: Den oprindelige koncentration før fortynding er 100 mg tørstof/ml.

BNSDOCID: <DK_1827B3B1 J_> 20 DK 172783 B1

Resultater: SDS-PAGE: Man ser en hurtig reduktion 1 Intensiteten af 6SA båndet efter kun 40 sek. Efter 2 min. forløb kan man næsten ikke påvise båndet, ved sammen-5 ligning med rækker af fortyndinger af ren BSA når man følsomhedsgrænsen for fremgangsmåden ved prøver på 50 ng (nanogram). Man kan påvise, at slutkoncentrationen af BSA i hydrolysatet efter en opholdstid på 20 min. er mindre end 0,01% tørstof sammenlignet med en op-10 rindelig koncentration, der kan skønnes at være 1,8-2,2%.

ID: En titer på 0 eller l nås efter en opholdstid på 6 min. Man kan se, at hydrolysen af de proteiner, der forbliver intakte efter den første hydrolyse, 15 finder sted temmelig hurtigt.

Eksempel 4

Forsøget udføres som i eksempel 3, men man halverer mængden af enzym, der tilsættes under den anden 20 hydrolyse (idet denne mængde repræsenterer 75% af den totale mængde enzym, der benyttes i eksempel 3, første og anden hydrolyse). Analysen for BSA ved ID viser et titer på 0 til 1 efter en opholdstid på 10 min. I overensstemmelse hermed kan man reducere mængden af 25 anvendt enzym, hvis man forøger opholdstiden under den anden hydrolyse.

Eksempel 5

Forsøget udføres som i eksempel i, idet dog va-30 righeden af den første hydrolyse er 2 timer og den anden hydrolyse finder i en reaktionsbeholder i løbet af 2 timer ved en konstant pH-værdi på 7,3. Analyser for BSA ved SDS-PAGE og ID viser, at proteinet er forsvun- iNSDOCID. <DK 182783B1 I > 21 DK 172783 B1 det i hydrolysatet.

Eksempel 6

Man benytter samme udgangsmateriale som 1 eksem-5 pel 3 og samme mængder, hvad angår DWP, WCP og vand, og man anbringer dispersionen 1 en dobbeltvægget reaktionsbeholder, hvis temperatur med en termostat.holdes på 55 *C. Nu tilsætter man 200 g trypsin og udfører hydrolysen 1 10 min., Idet man kompenserer for faldende 10 pH ved at tilsætte 2N XOH.

Hydrolysatet føres derefter gennem en pladevarmeveksler, hvor det opvarmes til 90eC 1 løbet af _5..mln. hvorefter det afkøles til 55*C. Det delvis hydrolyserede og varmebehandlede produkt anbringes derefter 1 re-15 aktionsbeholderen, hvis temperatur med en termostat holdes på på 55°C, og man tilsætter 1,8 kg trypsin dispergeret 1 en 0,01 M vandig HCl opløsning. Et fald i pH-værdi kompenseres ved tilsætning af 2N-KOH.

Efter 3 timers hydrolyse inaktiverer man enzy-20 met og lader det fordøje sig selv, idet man opvarmer hydrolysatet 1 5 min. til 80*C, hvorefter man steriliserer hydrolysatet 1 2 min. ved 125*C.

Eksempel 7 25 fremgangsmåden er som 1 eksempel 6, idet man dog udfører den første hydrolyse i løbet af 10 min. 1 et reaktionsrør. Varmebehandlingen finder sted i en varmeveksler i 5 min. ved 90*C. Den anden hydrolyse foregår i reaktionsbeholderen som i eksempel 6, og de øvrige 30 operationer udføres son i eksempel 6.

BNSDOC1D' <DK_182783B1 J_> DK 172783 B1 22

Eksempel 8

Fremgangsmåden er som 1 eksempel 3 op til afslutningen af den anden hydrolyse. Nu sætter man til hy-drolysatet en ækvivalent mængde af en opløsning af mal-5 todextrln og stivelse med et tørstofindhold på 50%, til hvilket man på forhånd har sat mineralsalte opløst i demineraliseret vand ved 60*C i en beholder, hvis tem-peratur bliver kontrolleret med en termostat. Man opvarmer blandingen til 75’C 1 en pladevarmeveksler, >0 hvorefter man indfører__fedtstoffer, nemlig palme- olein, kokosnøddeolie, saflorolie, lecithin og fedtopløselige vitaminer, idet man på forhånd havde smeltet fedtstofferne ved 65"C, og idet de udgjorde 10% af den ovennævnte blanding. Efter en første opvarmning til 15 80’C med en opholdstid på 5 min. steriliserer man den opnåede væske i 2 min._ ved 125eC_ ved direkte dampindsprøjtning, afkøler til 70’C ved ekspansion i en ekspansionsbeholder, homogeniserer 1 2 trin, først ved 200 bar, derefter ved 50 bar., afkøler til 10’C 1 20 en pladevarmeveksler og derefter i en mellemtank, hvorefter man tilsætter en 10% citronsyreopløsning i demineraliseret vand, vandopløselige vitaminer, sporgrundstoffer og taurin. Endelig opheder man blandingen til 75*C, homogeniserer ved et gennemløb ved 65-170 bar 25 og forstøvningstørrer.

Pulveret havde følgende sammensætning: susnocin *ηκ / » 23 DK 172783 B1 _%

Peptider 12,5

Fedtstoffer 26

Carbonhydrater 56,2 5 deraf lactose 39,3 maltodextrin 10,8 stivelse 6,1

Mineraler 2,3

Vitaminer og sporgrundstoffer spor 10 vand 3

Eksempel 9

Fremgangsmåden er som i eksempel 8. idet man dog efter den anden homogenisering steriliserer vssken i 15 2 min. ved 125'C, afkøler til 10*C og pakker den aseptisk i beholdere.

Vesken havde følgende sammensætning: _% 20 Peptider 1,6

Fedtstoffer 3,4

Carbonhydrater 7,4 deraf lactose 5,2 maltodextrin 1,4 25 stivelse 0,8

Mineraler 0,3 vitaminer og sporgrundstoffer spor

Vand 79,9 BNSDOCID: <DK_1827B3B1_L>

Claims (10)

1. Fremgangsmåde til fremstilling af et hydrolysat af dyriske mælkeproteiner, hvorved man enzymatisk i to separate hydrolysetrin hydrolyserer et valleprodukt og ad termisk vej inaktiverer enzymet, kendeteg- 5 net ved, at man gennemfører de to hydrolyset rin med et proteolytisk enzym valgt blandt trypsin, chymotryp-sin og en blanding af trypsin og chymotrypsin og pan-creatin, og at man varmebehandler hydrolysatet fra den første hydrolyse i vandig opløsning i 3-10 minutter ved 10 80-100eC og en pH-værdi på 6-8 på en sådan måde, at proteiner, der efter den første hydrolyse er forblevet intakte, denatureres og således bliver modtagelige for den anden hydrolyse, så hydrolysatet efter den anden hydrolyse praktisk talt er frit for allergener såsom 15 proteiner, proteinfragmenter eller makropeptider med molekylvægte over ca. 10 000.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at man anvender et valleprodukt udvalgt blandt valle, demineraliseret valle, demineraliserede 20 vallekoncentrater og blandinger deraf, eventuelt med lactose.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at man foretager den anden hydrolyse portionsvis i en reaktionsbeholder og med en varighed på 25 60-180 minutter.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at man foretager den anden hydrolyse kontinuerligt under turbulens i et rør og i løbet af 1-60 minutter, foretrukket 2-20 minutter.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendeteg net ved, at man inaktiverer enzymet ved først at opvarme hydrolysatet til en temperatur på 75-85eC og at holde det ved denne temperatur i 5 minutter, og derefter at udføre en sterilisering deraf. =,NSOOCID <DK 182783B1 I > DK 172783 B1

6. Hydrolysat, kendetegnet ved, at det er opnået ved udøvelse af fremgangsmåden ifølge et af kravene 1 til 5.

7. Fremgangsmåde til fremstilling af et hypoaller-5 gent fødemiddel, kendetegnet ved, at man sætter carbohydrater, mineralske salte og flydende fedtstoffer, eventuelt med indhold af fedtopløselige vitaminer, til hydrolysatet opnået ved fremgangsmåden ifølge krav 1, man tilsætter eventuelt en vandig opløs- 10 ning af vandopløselige vitaminer og sporgrundstoffer, hvorefter man tørrer.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 7, hvor det anvendte hydrolysat indeholder ikke inaktiveret enzym, kendetegnet ved, at man inaktiverer enzymet ad 15 termisk vej under fremstillingen af fødemidlet.

9. Fremgangsmåde ifølge krav 8, kendetegnet ved, at man inakt iverer enzymet ved føret at opvarme i ca. 5 minutter til 75-85eC og dernæst at foretage en sterilisering ved ultrahøj temperatur, 20 hvorefter man indpakker produktet aseptisk i stedet for at tørre det.

10. Anvendelse af et hydrolysat ifølge krav 6 i diætfødemiddelpræparater. ▼ BNSDOCID: <DK_182783B1_L>