DK162772B - Antibiotisk forbindelse af vancomycin-typen og fremgangsmaade til fremstilling deraf samt antibakterielt middel og dyrefoder omfattende forbindelsen - Google Patents

Description

DK 162772 B

Den foreliggende opfindelse angår en antibiotisk forbindelse af vancomycin-typen.

Forbindelsen ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at den 5 har strukturform 1 en (I)

T α i IH

10 Cjr χτ ΠΓ1ξοο,Η_^ T Η » X Η i 1 · Η Γ 111 Η ί I ο Τ Η I I 2 Η0 Ι^ιΊ Γΐΐ 15 --ί~2Η) C1 0Η C1 20 hvori Ri er hydrogen eller mannosyl, og R2 er hydrogen eller et glycolipidradikal med empirisk formel C15H28NO6, C17H30NO6 eller CisH32Nt:)6' idet enten Rj eller R2 eller begge er hydrogen, at den kan fremstilles ved partiel sur hydrolyse af et antibiotikum valgt blandt AAD 216 kompleks, AAD 126A, AAD 216B 25 og AAD 216C, og ajt forbindelsen, hvori Rj er mannosyl, og R2 er hydrogen, har følgende egenskaber: 30 (a) bleghvidt-gult fast stof, der dekomponerer ved 300-350*0, (b) en empirisk formel C55H55N7O24CI4, (c) en omtrentlig grundstofsammensætning på 47,54% carbon, 35 4,0% hydrogen, 5,89% nitrogen og 8,63% chlor, når vandind holdet i glycopeptidet, på tidspunktet for grundstofanalysen og bestemt ved Karl Fisher-titrering, er 12%,

DK 162772 B

2 (d) et infrarødt absorptionsspektrum i kaliumbromid, som viser toppe ved følgende bølgetal i cm-1: 3400, 1660, 1610, 1590, 1510, 1460, 1430, 1390, 1300, 5 1230, 1180, 1150, 1120, 1060, 1010, 970 og 810.

(e) et hurt igatombombardement (FAB) massespektrum med M+H ved 1458 (hovedgruppe), 10 (f) et ultraviolet spektrum i acetonitri1/vand (1:1), som gi ver et absorpt ionsmaks i um ved 281 nm under sure betingelser med en = 79,7 og ved 300 nm under basiske betin gelser med en = 136, 15 (g) et carbonmagnetisk resonansspektrum ved 90,56 MHz i CD3OD/D2O (1:9) ved en pH-værdi på 8,7, som giver følgende kemiske forskydninger i dele/million (ppm) i forhold til TMS som standard: 20 177,9, 174,6, 171,7, 170,9, 170,0, 169,2, 162,3, 158,8, 157,9, 155,2, 155,1, 153,9, 151,9, 149,7, 147,6, 147,2, 144.4, 141,0, 139,0, 138,8, 137,5, 136,1, 134,6, 130,7, 130,0, 129,8, 129,2, 128,9, 128,7, 127,5, 127,3, 126,9, 126.4, 126,0, 125,2, 122,7, 122,2, 121,1, 119,9, 119,7, 25 118,4, 116,6, 110,7, 110,4, 108,5, 104,4, 103,3, 100,5, 98.1, 74,0, 72,1, 71,6, 71,4, 70,8, 67,4, 65,8, 63,7, 62.2, 61,6, 60,2, 56,0, 55,9, 55,0 og 32,9 og (h) pKa-værdier i acetonitri1/vand (3:7) som følger: 30 3,3, 7,1, 8,3, 9,1, 10,0 og 11,2, pKa-værdier over 11,2 blev ikke bestemt, forbindelsen, hvori Rj er hydrogen, og R2 er et glycoli-35 pidradikal med en empirisk formel Ci6H28N06» har følgende egenskaber: 3

DK 162772 B

(a) bleghvidt-gult fast stof, som dekomponerer ved 300-350eC, (b) en empirisk formel C75H72N8O25CI4, 5 (c) en omtrentlig grundstofsammensætning på 49,76% carbon, 4,51% hydrogen, 5,99% nitrogen og 8,19% chlor, når vandindholdet, i glycopept idet, på tidspunktet for grundstof-analysen og bestemt ved Karl Fisher-titrer ing, var 9,4%, 10 (d) et infrarødt absorptionsspektrum i kaliumbromid, som giver toppe ved følgende bølgetal i cm"l: 3400, 2920, 1660, 1590, 1500, 1460, 1430, 1300, 1240, 1140, 1080, 1060 og 1010, 15 (e) et hurt igatombombardement (FAB) massespektrum med M+H ved 1625 (hovedgruppe), (f) et ultraviolet spektrum i acetonitri1/vand (1:1), som gi- 20 ver et absorptionsmaksimum ved 281 nm under sure betingel ser med en Ej% = 63,2 og ved 302 nm under basiske betingelser med en = 94, (g) et carbonmagnetisk resonansspektrum ved 90,56 MHz i 25 CD3OO/D2O (1:9) ved en pH-værdi på 9,4, som giver følgende kemiske forskydninger i ppm i forhold til TMS som standard: 178.2, 178,0, 176,0, 175,6, 171,6, 170,9, 170,6, 170,5, 30 169,3, 164,6, 161,4, 159,3, 157,1, 156,5, 153,5, 152,5, 151,8, 151,1, 146,4, 144,9, 141,7, 138,6, 138,4, 136,9, 134.5, 134,4, 133,9, 130,8, 129,8, 129,7, 129,4, 128,6, 128.5, 128,3, 127,7, 127,3, 125,9, 125,7, 125,5, 122,5, 122.5, 122,1, 120,1, 119,4, 118,0, 116,9, 109,6, 109,0, 35 108,7, 104,5, 104,4, 103,2, 98,9, 78,4, 74,3, 73,3, 72,1, 71.5, 66,2, 63,7, 61,9, 60,6, 56,9, 56,1, 55,8, 55,4, 37.2, 33,3, 32,0, 29,6, 29,4, 26,1, 22,9 og 14,4, og 4

DK 162772 B

(h) pKa-værdier i acetonitri1/vand (3:7) som følger: 3,0, 4,3, 7,4, 8,5, 9,9 og 10,9, pKa-værdier over 10,9 blev ikke bestemt, 5 forbindelsen, hvori Rj er hydrogen, og R2 er et glycoli-pidradikal med en empirisk formel C17H30NO6, har følgende egenskaber: 10 (a) hvidt fast stof, som dekomponerer ved 250-300°C, (b) en empirisk formel 076*174^035014, (c) en omtrentlig grundstofsammensætning på 48,98% carbon, 15 4,56% hydrogen, 5,64% nitrogen og 8,29% chlor, når vand indholdet i glycopeptidet, på tidspunktet for grundstofanalysen og bestemt ved Karl Fisher-titrering, var 6,9%, (d) et infrarødt absorptionsspektrum i kaliumbromid, som giver 20 toppe ved følgende bølgetal i cm'l: 3400, 2920, 1660, 1590, 1500, 1480, 1430, 1300, 1240, 1150, 1080, 1060 og 1010, 25 (e) et hurtigatombombardement (FAB) massespektrum med M+H ved 1639 (hovedgruppe), (f) et ultraviolet spektrum i acetonitri 1/vand (1:1), som giver et absorptionsmaksimum ved 281 nm under sure betingel- 30 ser med en = 61,8 og ved 303 nm under basiske betin gelser med en = 88, (g) et carbonmagnetisk resonansspektrum ved 90,56 MHz i CD3OD/D2O (1:9) ved en pH-værdi på 9,4, som giver følgende 35 kemiske forskydninger i ppm i forhold til TMS som stan dard: 5

DK 162772 B

178.3, 177,6, 175,9, 175,6, 171,5, 171,0, 170,7, 170,3, 169.4, 164,0, 159,3, 158,9, 156,4, 152,5, 151,7, 151,1, 146.2, 144,7, 141,8, 138,7, 138,6, 136,8, 134,4, 133,8, 130,9, 129,8, 129,5, 128,6, 128,4, 127,9, 127,3, 126,0, 5 125,8, 122,5, 119,9, 119,3, 118,2, 116,9, 109,3, 108,8, 104.3, 104,2, 103,0, 99,4, 78,7, 74,4, 73,5, 72,1, 71,6, 65,8, 63,8, 62,5, 60,6, 57,1, 56,1, 55,9, 55,4, 39,7, 37.3, 33,1, 30,3, 29,9, 29,7, 28,5, 28,0, 26,3 og 23,4, 10 medens forbindelsen, hvori Ri er hydrogen, og R2 er et glyco-lipidradikal med en empirisk formel C18H32NO6, har følgende egenskaber: (a) hvidt fast stof, som dekomponerer ved 250-300°C, 15 (b) en empirisk formel ¢77^5^025014, (c) en omtrentlig grundsstofsammensætning på 47,58% carbon, 4,51% hydrogen, 5,33% nitrogen og 8,08% chlor, når vand- 20 indholdet i glycopeptidet, på tidspunktet for grundstof analysen og bestemt ved Karl Fisher-titrering, var 7,8%, (d) et infrarødt absorptionsspektrum i kaliumbromid, som giver 25 toppe ved følgende bølgetal i cm-1: 3400, 2920, 1660, 1590, 1500, 1430, 1300, 1240, 1140, 1080, 1060 og 1010, 30 (e) et hurtigatombombardement (FAB) massespektrum med M+H ved 1653 (hovedgruppe), (f) et ultraviolet spektrum i acetonitri1/vand (1:1), som giver et absorptionsmaksimum ved 281 nm under sure betingel-35 ser med en Ei% = 60,0 og ved 303 nm under basiske betin gelser med en Ei% = 83,

DK 162772 B

6 (g) et carbonmagnetisk resonansspektrum ved 90,56 MHz i CD3OD/D2O (1:9) ved en pH-værdi på 9,4, som giver følgende kemiske forskydninger i ppm i forhold til TMS som standard: 5 178.1, 177,4, 175,5, 175,4, 171,4, 171,0, 170,7, 170,3, 169,3, 163,6, 159,1, 158,6, 156,5, 156,2, 152,7, 151,9, 151.8, 151,0, 146,2, 144,6, 142,0, 138,8, 138,6, 136,9, 134.8, 134,7, 134,0, 130,6, 129,9, 129,8, 129,4, 128,8, 10 128,3, 127,8, 127,5, 127,2, 126,4, 126,2, 125,8, 122,5, 122,0, 119,6, 119,1, 118,4, 116,9, 109,5, 109,2, 108,7, 104.2, 103,6, 99,8, 78,6, 74,6, 73,5, 72,1, 71,7, 66,0,- 63,7, 62,1, 60,6, 56,9, 56,1, 55,9, 55,4, 39,6, 37,3, 33.2, 30,4, 30,0, 29,8, 28,5, 27,9, 26,3 og 23,1.

15

Hidtil ukendte AAD 216 antibiotika af vancomycinklassen fremstilles ved dyrkning af den hidtil ukendte mikroorganisme Kib-delosporangiurn aridum Shearer, gen. nov., sp. nov. SK & F AAD 216 (ATCC 39323) i vandigt næringsmedium indeholdende assimi-20 lerbare carbon- og nitrogenkilder, under submerse aerobe betingelser, indtil en væsentlig mængde af AAD 216 antibiotikumkomplekset er dannet, og eventuelt udvinding af AAD 216 komplekset fra næringsmediet og isolering af de enkelte antibiotiske hovedfaktorer, AAD 216A, AAD 216B og AAD 216C. AAD 216-25 antibiotikaene og mikroorganismen K. aridium er beskrevet i DK-patentansøgning nr. 3387/84.

Det har vist sig, at AAD 216-antibiotikaene har følgende strukturformel: 30 35 7

DK 162772B

r /°^ ηϊ °l©r s ψ φτχΐ-οπ Υ η ϊΤη iΥ η r

CH. Ο ί Η Ο ί Η Ο I

"Η&^Οφτ'" c! y> α *2 eller er en desoxyanalog deraf, hvori Rj er mannosyl eller hy-15 drogen, og R2 er: fy Ηθ\^_y 20 NHCOR3 hvori R3 er en Cg_i2“a1Kyl" eller -alkenylgruppe, der er forgrenet eller lineær og eventuelt er substitueret med en hydroxy Igruppe.

25 Forbindelserne ifølge opfindelsen af vancomycin-typen er forbindelser, hvoraf den ene af grupperne Rj og R2 eller både Rj og R2 er hydrogen.

Fra US patentskrift nr. 4.322.343 kendes forbindelser med føl-30 gende strukturformel: 35 8

DK 162772 B

°Ho

(L-rirtounlat^O 0¾ Pi I jL

|α Y VCH: o l o l· 5 'c NHn'c NH o C-’ΚΗ I \/ / \ / /, Λ

^ΰ iT

HO OH OH CHj OH

10 hvilke forbindelser er beslægtede med forbindelserne ifølge opfindelsen, men AAD 216-glycopeptiderne ifølge opfindelsen afviger fra disse kendte forbi ndel ser ved, at de indeholder fire chloratomer, ikke har en ristoamingruppe på A-ringen, har 15 et mannosyl- eller glycolipidradikal og endelig ved at mangle methylgrupper forskellige steder på molekylet.

Disse forskelle mellem de kendte forbindelser og forbindelserne ifølge opfindelsen er så betydelige, at man ikke ud fra 20 kendskab til de kendte forbindelsers virkning kan drage nogen konklusion med hensyn til virkningen af en forbindelse ifølge den foreliggende opfindelse.

Opfindelsen angår endvidere en fremgangsmåde til fremstilling 25 af den omhandlede antibiotiske forbindelse.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved partiel sur hydrolyse af et antibiotikum valgt blandt AAD 216 kompleks, AAD 216A, AAD 216B og AAD 216C, indtil dannelse af en 30 væsentlig mængde af den ønskede antibiotiske forbindelse, og isolering af denne forbindelse.

Hydrolysen af AAD 216 antibiotikaene forløber ad to veje til dannelse af AAD 216 aglyconen med formlen (I), hvori og 35 R2 er hydr°9en' følgende måde: 9

DK 162772 B

AAD 216Δ AAD 216 antibiotika —-nnose·) AAD 216B pseudo-aglycon

vej AAD 216C

g -glycolipid vej A vej B - glycolipid AAD 216 pseudo-aglycon —e-J AAD 216 aglycon -mannose

Hydrolysevej A's første trin omfatter tabet af glycolipidradi-10 kalerne fra AAD 216 antibiotikaene til dannelse af pseudo-aglyconen med formlen (I), hvori R^ er mannosyl, og R2 er hydrogen. Denne pseudo-aglycon betegnes AAD 216 pseudo-aglycon, da den er uafhængig af hvilket AAD 216 antibiotikum, der hydrolyseres. Efterfølgende hydrolyse af AAD 216 pseudo-aglyconen 15.

giver AAD 216 aglyconen efter tab af mannosylradikalet.

Hydrolysevej B's begyndelsestrin omfatter tab af mannosyl- radikalet fra AAD 216 antibiotikaene til dannelse af pseudo- aglyconer med formlen (I), hvori R-, er hydrogen, og R- er 20 I* et glycolipidradikal af ukendt struktur, som er afledt af den hydrolyserede AAD 216 antibiotikumfaktor. Disse pseudo-

aglyconer betegnes følgeligt AAD 216A pseudo-aglycon, AAD

216B pseudo-aglycon eller AAD 216C pseudo-aglycon, afhængigt af den hydrolyserede AAD 216 antibiotikumfaktor. Hvor AAD 2 5 216 komplekset hydrolyseres, vil der opstå en blanding af disse pseudo-aglyconer.

AAD 216A pseudo-aglyconen indeholder et glycolipidradikal af ukendt struktur med en molekylvægt på 330 og en empi-30 risk formel ciøH28N06' Met^an°lysen pseudo-aglyconen danner to hovedprodukter, som blev identificeret som methyl= glycosidmethylesteren af en n-decanoyldeoxyaminoglycuronsyre og methylglycosidet af enten n-decanoyldeoxyaminoglycofurano- 3,6-lacton eller n-decanoyldeoxyaminoglycopyrano-3,6-lacton.

35 Diacetatderivatet af det første methanolysehovedprodukt af AAD 216A pseudo-aglycon blev sammenlignet med og viste sig at være identisk med diacetatderivatet af methyl-2-deoxy-

DK 162772B

10 2[(1-oxodecyl)amino]-a-D-glycopyranosiduronsyremethylester, som blev fremstillet ved en simpel totrins proces ud fra D-glucosamin. Ud fra de ovennævnte godtgørelser må strukturen af glycolipidradikalet af AAD 216A pseudo-aglyconen mest sand-5 synligt være som følger:

C0,H

(TV

10 Ho\_/ NHCO(CH2)gCH3

Da AAD 216A, AAD 216B og AAD 216C er homologe, har glycoli-pidradikalerne af AAD 216B pseudc-aglycon og AAD 216C pseudo-15 aglycon henholdsvis molekylvægten 344 og 358, og henholdsvis den empiriske formel c17H3qN06 °9 C18H^2N06’ Ve<^ anven<3else af sammenligningsundersøgelser af de x kernemagnetiske resonansspektre af AAD 216A, AAD 216B og AAD 216C samt en sammen-ligningsundersøgelse mellem fedtsyrehydrolyseprodukterne af 20 ophavsantibiotikumfaktorerne tilskrives glycolipidradikalerne af AAD 216B pseudo-aglycon og AAD 216C pseudo-aglycon henholdsvis følgende strukturer: co2h co2h NHCO (CH2) 7CH (CH3) 2 NHCO (0¾) gCH (CH3) 2 30

Forbindelserne ifølge den foreliggende opfindelse fremstilles hensigtsmæssigt ud fra AAD 216 antibiotikaene efter følgende retningslinier:

35 AAD 216 pseudo-aglyconen fremstilles ved at hydrolysere AAD

216 antibiotikaene, eksemplificeret ved AAD 216A, i· et vandigt organisk opløsningsmiddel og meget fortyndet mineral syre under tilbagesvaling, indtil der er dannet en væsentlig mængde af AAD 216 pseudo-aglyconen og efterfølgende isolering heraf fra reaktionsblandingen· Et eksempel på denne hydrolyseproces

DK 162772 B

11 er behandlingen af AAD 216A i 10% vandig acetonitril med Ο,ΟΟΙΝ saltsyre under tilbagesvaling i 48 timer og isolering af AAD 216A pseudo-aglyconen ad kromatografisk vej.

5 AAD 216 aglyconen, AAD 216A pseudo-aglyconen, AAD 216B pseudo-aglyconen og AAD 216C pseudo-aglyconen fremstilles ved hy= drolyse af de passende AAD 216A, AAD 216B og AAD 216C i et polært organisk opløsningsmiddel og fortyndet mineralsyre ved forhøjet temperatur, indtil dannelse af en væsentlig mængde 10 af hydrolyseprodukterne efterfulgt af isolering af de enkelte ønskede produkter. Et eksempel på denne hydrolyseproces er behandlingen af AAD 216A i dimethylsulfoxid med 5% saltsyre ved 100°C i 15 minutter. Isoleringen af den enkelte AAD 216 aglycon og AAD 216A pseudo-aglycon kan ske kromatografisk.

15 AAD 216 aglyconen og pseudo-aglyconerne kan alternativt fremstilles ved den sure hydrolyse af AAD 216 komplekset eller de enkelte faktorere efterfulgt af en kromatografisk isolering af de ønskede forbindelser.

20

Biologiske aktivitetsdata.

De minimale hæmningskoncentrationer in vitro (MIC) af AAD

25 216 aglyconen, AAD 216 pseudo-aglyconen, AAD 216A pseudo- aglyconen, AAD 216B pseudo-aglyconen, AAD 216C pseudo-agly= conen og vancomycin blev bestemt for en række mikroorganismer under anvendelse af standardmikrotiteranalysemetoder. AAD 216 aglyconen, AAD 216 pseudo-aglyconen, AAD 216A pseudo-agly= 30 conen, AAD 216B pseudo-aglyconen og AAD 216C pseudo-aglyconen blev neutraliseret med natriumbicarbonat før afprøvningen. Resultaterne er vist i de efterfølgenden tabeller A - F.

35

DK 162772 B

12

Antimikrobielt spektrum.

TABEL A.

5 Testorganisme MIC i. yg/ml AAD 216 AAD 216A Vancomycin AAD 216 , Pseudo- Pseudo-Aqlycon Aglycon Aglycon

Staph» aureus HH127 0,4 1,6 0,8 1,6

Staph. aureus SK&F 910 0,4 1,6 0,4 1,6 10 Strep, faecilis HH34358 0,8 1,6 0,4 3,1

Proteus mirabilis SK&F 444 25 100 100. 100 E. coli 12140 (SK&F 809) 100 >100 >100 100 k. pneumoniae >100 >100 >100 >100 4200 (SK&F 798) 15 Pseudomonas aeruginosa >100 >100 >100 >100 HH63

Serratia marcesens >100 >100 >100 >100 ATCC 13880

Proteus morgani SK&F 179 >100 >100 >100 >100

Providencia SK&F 276 >100 >100 >100 >100 20

Enterobacter cloacae >100 >100 >100 >100 HH31254

Salmonella gallinarum 25 25 o· 100 25 SK&F BC595

Staph, epidermidis 0,8 ^3,1 0,8 1,6 SK&F 2479 25

Listeria monocytogenes 0,8 1,6 0,4 1,6 SK&F 2255

Staph, epidermidis SK&F 651 3,1 12,5 3,1 1,6 30 35

DK 162772 B

13 - TABEL B (Methicillinfølsom)_

Testorganisme MIC i ug/ml AAD 216 AAD 216A Vancomycin AAD 216 Pseudo- Pseudo-

Aqlycon Aglycon Aqlycon ^ Staph. aureus HH127 0,4 1,6 0,4 1,6

Staph, aureus SK&F 674 0,8 3,1 0,8 1,6

Staph, aureus SK&F 910 0,8 3.,1 0,4 1,6

Staph, aureus SK&F 1761 0,8 3,1 0,4 1,6

Staph, aureus SK&F 2666 0,8 3,1 0,4 1,6 10

Staph, aureus SK&F 2677 0,8 3,1 0,4 1,6

Staph. aureus SK&F 2678 0,8 3,1 0,4 1,6

Staph, aureus SK&F 2680 0,8 3,1 0,8 1,6

Staph, aureus SK&F 2682 0,8 3,1 0,4 1,6

Staph, aureus SK&F 2736 0,8 *3,1 0,8 1,6 15 -c-- 7 7 7

Staph. aureus SK&F 2743 0,8 3,1 0,8 1,6

Staph, aureus SK&F 2776 3,1 3,1 1,6 1,6

Staph, aureus SK&F 2777 0,4 1,6 0,4 0,8

Staph, aureus SK&F 2613 0,4 1,6 0,4 1,6

Stanh. aureus SK&F 2615 0,8 3,1 0,8 3,1 20 ----- 7 7 7 7 TABEL C (Methicillinresistent)

Tes torganisme MIC i Uq/ml AAD 216 AAD 216A Vancomycin AAD 216 Pseudo- Pseudo- 25 Aqlycon Aqlycon Aqlycon

Staph. aureus SK&F 675 0,8 3,1 0,8 1,6

Staph, aureus SK&F 2612 0,8 3,1 ^0,8 1,6

Staph, aureus SK&F 2614 0,4 0,8 0,2 1,6

Staph, aureus SK&F 2616 0,4 1,6 0,2 0,8 30 Staph, aureus SK&F 2620 0,8 3,1 0,8 3,1

Staph, aureus SK&F 2621 0,4 1,6 0,4 1,6

Staph, aureus SK&F 2594 0,4 3,1 0,4 1,6

Staph, aureus SK&F 2589 0,4 3,1 0j4 1,6

Staph, aureus'SK&F 2590 0,4 3,1 0,4 1,6 35 Staph, aureus SK&F 2593 0,8 3,1 0,$ 1,6

Staph, aureus SK&F 2591 0,8 3,1 0,8 1,6 4 14:

DK 162772B

. TABEL C (Methicillinresistent)

Testorqanisme MIC i yq/ml AAD 216 AAD 216A Vancomycin AAD 216 Pseudo- Pseudo-

Aqlycon Aglycon Aqlycon.

5

Staph, aureus SK&F 2592 0,8 3*1 1*6 3*1

Staph, aureus SK&F 2595 0*8 3*1 1,6 1*6

Staph, aureus SK&F 2596 0*4 3*1 1*6 3,1

Staph, aureus SK&F 2597 0*8 3*1 1*6 3*1 10 TABEL p (Anaerober)

Testorganisme MIC i uq/ml AAD 216 AAD 216A Vancomycin AAD 216 Pseudo- Pseudo-

Aqlycon' Aqlycon Aqlycon 15 Bacteroides fragilis 32 >32 16 32 ATCC 25285 B. fragilis H145 32 >32 8 32 IL· fragilis SK&F 3060 32 >32 16 32 B. loeochis SK&F 3087 16 '32 8 32 B. thetaiotamicron 32 >32 16 32 20 SK&F. 3089

Fusobacterium nucle atum '32 >32 16 32 ATCC 25586

Clostridium perfringens <0*016 £0,016 <0,016 0.5 MCP-1 “ ~ C. perfringens MCP-2 £0*016 0*031 £0*016 0*5 C. perfringens 0.5 0*5 0*125 1*0 ATCC 19408

Clostridium difficile 2 2 0,125 2 SK&F 3062 C. difficile SK&F 3065 2 2 ' 0*25 4 30 C^ difficile SK&F 3091 £0*016 £0,016 0*125 2 C. difficile SK&F 3092 2 2 0*125 2 C^ difficile SK&F 3096 1*0 2 0*25 2 difficile SK&F 3098 £0*016 £0*016 £0*016 2 35 15

DK 162772 B

TABEL E

Testorganisme MIC i uq/ml AAD 216A AAD 216B AAD 216C Vancomycin

Pseudo- . Pseudo- Pseudo-

Aqlycon Aglycon Aqlycon

Staph, aureus HH127 0,4 0,4 0,2 1,6

Staph. aureus SK&F 910 0,4 0,2 0,8 1,6

Staph, aureus SK&F 209P 0,1 0,2 0,1 1,6

Staph, aureus SK&F 209P-mutant 100 50 50 100 10 Staph, aureus SK&F 674-P6-mutant 50 50 25 100

Staph. aureus SK&F 675 1,6 1,6 3,1 3,1

Staph, epidermidis SK&F 2479 3,1 6,3 6,3 3,1

Staph, epidermidis 15 SK&F 2683 6,3 3,1 6,3 3,1

Staph, epidermidis m SK&F 651 12,5 12,5 12,5 3;1

Staph, epidermidis ** SK&F 2265 12,5 6,3 12,5 3,1

Strep, faecalis SK&F 34358 0,2 0,1 0,1 3^,1 20 Strep, faecalis SK&F 657 0,4 0,1 0,1 3;1

Listeria monocytogenes SK&F 2255. 0,1 0,1 0,1 0^8 coli SK&F .12140 >100 >100 >100 >100

Salmonella gallinarum 25 BC-595 >100 >100 >100 >100

TABEL F

Testorganisme MIC i. uq/ml AAD 216A AAD £16B AAD 216C Vancomycin 30 Pseudo- Pseudo- Pseudo-

Aqlycon Aglycon Aqlycon

Bacteroides Fragilis ATCC >32 >32 32 >32 B. thetaiotomicron H-145 >32 >32 >32 >32 35 Fusobacterium nucleatum ATCC 25 58 6 >3 2 16 16 32 16 DK 162772 B j i

TABEL F

Testorganisme MIC i ug/ml AAD 216A AAD 216B AAD 216C Vancomycin Pseudo- Pseudo- Pseudo-

Aqlycon Aqlycon Aglycon 5 perfringens SK&F 2769 0,063 0;031 0;125 0^5 C. perfringens MCP-2 0^5 0;5 0^5 2,0 difficile SK&F 3062 0,125 0,125 0,125 0,5 difficile SK&F 3065 0,25 0,25 0,25 1,0 difficile SK&F 3092 0,25 0,25 0,5 0,5 10 difficile SK&F 3141 0,5 0,25 0,5 1,0

Aktiviteten in vivo af AAD 216 aglyconen, AAD 216 pseudo-agly= conen, AAD 216A pseudo-aglyconen og vancomycin, målt som ED^g, blev påvist mod intraperitoneale infektioner med 46,8 LDj.g-værdier af Staph, aureus HH 127 i mus ved behandling med antibiotikaene subkutant, 1 og 5 timer efter infektion. ED^g-værdi-erne var som følger: 7,6 mg/kg for AAD 216 aglycon, 7,6 mg/kg for AAD 216 pseudo-aglycon, 5,0 mg/kg for AAD 216A pseudo-aglycon, 1,56 mg/kg for vancomycin. På lignende måde var ED^g-20 værdierne for AAD 216A pseudo-aglycon, AAD 216B pseudo-aglycon, AAD 216C pseudo-aglycon og vancomycin, bestemt ved anvendelse af en lignende protokol, henholdsvis 12,5 mg/kg, 7,6 mg/kg, 10,8 mg/kg og 1,92 mg/kg.

25 De antibiotiske forbindelser ifølge den foreliggende opfind else, herunder AAD 216 aglycon, AAD 216 pseudo-aglycon og AAD 216A pseudo-aglycon, AAD 216B pseudo-aglycon, AAD 216C pseudo-aglycon og blandinger deraf, udviser antibakteriel aktivitet.

30

Opfindelsen angår også antibakterielle midler indeholdende mindst én af de ovennævnte antibiotiske forbindelser og en farmaceutisk acceptabel bærer. Midlerne kan også inde-35 holde andre aktive antibakterielle midler. Midlerne kan tilbe redes til en hvilken som helst farmaceutisk form, som er velegnet til den ønskede administrationsvej. Sådanné midler kan eksemplificeres ved hjælp af faste midler til oral administra-40 tion, såsom tabletter, kapsler, piller, pulvere og granula, flydende midler til oral administration, såsom opløsninger 17

DK 162772 B

og suspensioner, sirupper og eliksirer, og præparater til parenteral administration, såsom sterile opløsninger, suspensioner eller emulsioner.

5 Til anvendelse som antibakterielt middel administreres midlerne således, at koncentrationen af den aktive bestanddel er større end den minimale hæmningskoncentration for den specielt afprøvede organisme.

10 Aktiviteten af AAD 216 aglyconen, AAD 216 pseudo-aglyconen og AAD 216A pseudo-aglyconen blev påvist in vitro mod i alt 58 bovin-yverbetændelser (mastitis) isoleret ved anvendelse af konventionelle agar-fortyndingsmetoder til bestemmelse af de minimale hæmningskoncentrationer (MIC-). MIC for AAD 15 216 aglycon, AAD 216 pseudo-aglycon og AAD 216A pseudo-aglycon varierede fra henholdsvis 0,5 til >128 μg/ml, 0,25 - >128 μg/ml og 0,03 - >128 μg/ml. Til sammenligning hermed er vanco= mycin's MIC for de samme mikroorganismer af størrelsesordenen fra 0,25 til >128 ug/ml.

20 Vækstfremmende aktivitet.

De vækstfremmende aktiviteter af AAD 216 aglycon, AAD 216 pseudo-aglycon og AAD 216A pseudo-aglycon blev bestemt i en 25 in vitro svinemodel til forudsigelse af anvendeligheden i enmavede dyr, såsom svin og fjerkræ, og en in vitro vom-model til forudsigelse af anvendeligheden ved okse-, fjerkræ- og fåreproduktion.

30 In vitro svine-model♦

En kastreret Yorkshire-orne forsynet operativt enten med en ileal-kanyle, som er anbragt 15 cm fra det ileo-coecocoliske forbindelsespunkt, eller en coecal-kanyle, som er anbragt midt-35 vejs mellem spidsen (apex) og udspring af coecum. Dyret fodres 4 gange dagligt for at begrænse indtagelsen til 4,5% af legemsvægten i 30 kg dyr eller 2,5% af legemsvægten i et 100 kg dyr. Svinevækstrationen er: 18

DK 162772 B

(% vægt/vægt) (lbs/ton)

Mellemmalet afskallet majs 70,60 1412

Sojabønnefoder, 44% 22,00 440 5 Dehydratiseret lucernefoder, 17% 4,50 90

Calciumpropionat 0,15 3

Vitamin/mineral-forblanding 2,75 55

Prøveudtagning af stoffet, via kanylen, begynder 150 - 180 10 minutter efter den første morgenfodring og fortsætter 30 eller 120 minutter senere, afhængigt af den ønskede materialemængde. Prøven anbringes på knust is, der ikke er koldere end 5°C, og gasses kontinuerligt med carbondioxid. Det opsamlede materiale filtreres. Filtratet er det podestof, der anvendes 15 til inkubationer af test- og kontrolprøverne. Det gassede podestof, 2,25 ml, anbringes i hver af 10 gassede prøverør, hver indeholdende 0,75 ml af en næringsopløsning og 0,5 mg af hver testforbindelse. Fire rene kontrolrør inkuberes sammen med testrørene i 5 timer ved 37°C med omrøring. Der indgår 20 yderligere fire dræbte rør, som ikke inkuberes.

Rørene behandles hver med 0,60 ml af en 25% opløsning af metaphosphorsyre og lagres derpå ved -4°C indtil analysering. Prøver optøs og centrifugeres i 25 minutter med 20.000 om-25 drejninger/min.. Supernatantvæsken dekanteres fra og prøve udtages til gaskromatografi og automatisk analyse. Resultaterne overføres til en datamat til bearbejdning til opnåelse af tal, hvor blindværdien er 100%, se de efterfølgende tabeller. Virginiamycin og vancomycin og avoparcin anvendes som posi-30 tive kontroller.

DK 162772B

19 I. VFA* LYS* .GLU* LAC* (% kontrol) (% kontrol) (% kontrol) (% kontrol)

Forbindelse (ppm)

Virginiamycin (166.67) 93 163 197 81 (16.67) 130 127 191 76 (1.67) 248 82 182 70

Vancomycin (166.67) 250 48 190 64 (16.67) 280 42 189 59 (1.67) 92 83 100 99 AAD 216 Aglycon 15 (166,67) 255 65 180 62 (16.67) 307 39 182 58 (1.67) 86 91 94 101 AAD 216 Pseudo-aglycon 20 (166,67) 266 64 183 62 (16.67) 238 76 171 69 (1.67) 96 110 94 101 AAD 216A Pseudo-aglycon 25 (166,67) 302 52 ' 187 58 (16.67) 361 59 184 50 (1.67) 106 106 101 98 30 II. VFA* LYS* GLU* .LAC* (% kontrol) (% kontrol) (% kontrol) (% kontrol)

Forbindelse (ppm)

Virginiamycin (1.67) 240 96 837 21 35 _

Avoparcin (1.67) 85 101 115 102

DK 162772B

20 II. VFA* ,LYS* GLU*· LAC* (% kontrol) (% kontrol) (¾ kontrol) (% kontrol!

Forbindelse (ppm) AAD 216B Pseudo-aglycon - .

5 (16,67) 313 96 894 16 (1,67) 118 102 169 95 AAD 216C Pseudo-aglycon (16,67) 252 91 895 16 10 (1,67) 131 94 · 225 85 & VFA refererer til det samlede indhold af flygtige fedtsyrer, nemlig acetat, propionat, isobutyrat, butyrat, isovalerat og valerat. Lys er lysin, GLU er glucose og LAC er L-mælke-15 syre. .

In vitro vom-model.

Protokollen for in vitro vom-modellen er analog med protokollen 20 for in vitro svine-modellen med følgende modifikationer: (1) en stud på 400 kg forsynes operativt med en vom-kanyle.

(2) Dyret foders én gang dagligt med følgende ration: 25 Færdigt foder % vægt/vagt.

Bomuldsfrøskaller 44,0

Knækket majs 22,0

Lucernehø 1" 20,0 ΟΛ . . . *

Tilskuds:foderpiller 10,0

Flydende melasse 4,0 100,0 •k

Tilskudsfoderpiller % vaagtAra>rj+

Sojabønneoliefoder (50% protein) 50,0 35 Mellemmalet· majs 32,5 D/calciumphosphat 6,50

Almindeligt salt 2,50

Formalet kalksten (Thomasville) 3,50

Urinstof 2,50 40 Vitamin A & D2~forblanding** 2 ιοοΤδ 21

DK 162772 B

* *

Vitamin A & forblanding % vaqt/væqt.

Vitamin A (30.000 IU/g) 5,87

Vitamin D2 (16.000.000 IU/lb) 0,50

Finmalet majs 93,63 5 100,00 (3) Manipulation af VFA-produktion er beskrevet som produktionsforholdet af propionat som en procentdel af den samlede mængde dannede VFA.

10 (4) Prøveudtagning af materialet, via kanylen, sker 120 minutter efter fodringen.

III. VFA* LYS* GLU* Propionat % 15 (% kontrol) (% kontrol) (% kontrol) (% kontrol)

Forbindelse (ppm)

Vancomycin (50.0) 107 97 189 127 (5.0) 108 85 165 130 20 (0,5) 97 83 17 105

Avoparcin (50.0) 113 97 141 132 (5.0) 105 85 166 121 25 (0,5) 103 96 116 106

Monens innatrium (50.0) 109 147 0 156 (5.0) 104 141 126 149 30 (0,5) 94 109 11 119 AAD 216 Aglycon (50.0) 93 99 14 135 (5.0) 110 101 22 131 35 (0,5) 100 98 0 102 22

DK 162772 B

III. VFA1 LYS1 .GLU1 Propionat % (% kontrol) (% kontrol) (% kontrol) (% Kontrol)

Forbindelse (ppm) AAD 216 Pseudo-aglycon 5 (50,0) 104 101 104 127 (5.0) 95 96 0 115 (0,5) 88 118 47 101 AAD 216A Pseudo-aglycon 10 (50,0) 113 115 38 149 (5.0) 110 97 30 139 (0,5) 98 102 534 106 15 IV. VFA1 LYS1 Propionat % - (% -kontrol) (% kontrol) (% kontrol)

Forbindelse (ppm)

Avoparcin 20 (5,0) 109 157 122

Monens imatrium (5.0) 106 595 161 25 AAD 216B Pseudo-aglycon (5.0) 114 163 125 (0,5) 100 55 99 AAD 216C Pseudo-aglycon 30 (5,0) 104 99 133 (0,5) 104 65 100 VFA refererer til det samlede antal flygtige fedtsyrer, nemlig acetat, propionat, isobutyrat, butyrat, isovalerat 35 og valerat. LYS er lysin, og GLU er glucose.

23

DK 162772 B

Endelig angår opfindelsen et dyrefoder, der er suppleret med en ikke-toksisk mængde af en eller flere forbindelser ifølge opfindelsen, samt en dyrefoderforblanding, der omfatter en forblandingsbærer og en eller flere forbindelser ifølge opfin-5 delsen.

Fodermidlerne ifølge opfindelsen omfatter de normale foderrationer for kød- og mælkeproducerende dyr suppleret med en mængde af en aktiv bestanddel valgt fra gruppen bestående af 10 AAD 216 aglycon, AAD 216 pseudo-ag1ycon, AAD 216A pseudo-agly-con, AAD 216B pseudo-aglycon, AAD 216C pseudo-aglycon eller en blanding deraf, som effektivt kan forbedre vækstraten og fodereffektiviteten hos dyrene, men som ikke er toksiske eller usunde i en sådan grad, at dyrene vil nedsætte indtagelse af 15 rationen. Mængden af den aktive bestanddel vil som det er kendt variere med sådanne faktorer, som bestanddelens pris, dyrets art og størrelse, den relative aktivitet af forbindelsen med formlen I eller den som grundfoder anvendte type foderration.

20

Repræsentative foderrationer til svin og fjerkræ er som følger :

En svineration til opfodring af sving på 18 - 45 kg fremstil-25 les ved anvendelse af følgende sammensætning:

Majs, formalet 78,15%

Sojaoliefoder, 44% 17,0% Kødaffald, 50% 3,0% 30 Østersskalaroma 0,4%

Benmel 0,5%

Zinkoxid 0,01%

Vitamin A, B, B12 og D valgfrit tilskud 35

En fjerkræsration til slagtekyllinger fremstilles under anvendelse af følgende sammensætning: 24

DK 162772 B

Gult majsfoder 67,35%

Sojabønneoliefoder 24,00%

Menhaden fiskefoder 6,00%

Dampet benmel 1,00% 5 Formalet kalksten 1,00%

Jodberiget salt 0,34% 25% cholinchlorid 0,13%

Vitamin B·^ 0,10%

Mangansulfat 0,02% 10 Vitaminblanding 0,06%

Svinefoder fra afvænning til fedning eller færdigrationer kan suppleres. Svin æder dagligt en ration fra ca. 0,9 kg (til et svin på ca. 11 kg) til 4 kg (til et svin på 67 kg). De fleste 15 rationer indeholder et majsgrundlag suppleret med bælgplanteensilage, hvedeklid, havre, byg, melasse eller et proteintilskud .

Fjerkræsfoder omfatter starterrationer, slagtekyl1ingeratio-20 ner og læggerationer. Rationerne er sædvanligvis baseret på formalet majs, majsmel eller sojabønnemel. Slagtekyllingera-tionerne indeholder ofte et kraftigt energitilskud, såsom tilsatte fedtstoffer, proteiner og vitaminer. Kalkunrationer er tilsvarende, men omfatter kun en starterration og en voksera-25 tion. Høns og fasaner æder fra 13,5 til 135 g foder/dag, kalkuner dobbelst så meget. Den skønnede foderindtagelse afhænger af vægten og alderen af det kødproducerende dyr.

De aktive bestanddele valgt fra gruppen bestående af AAD 216 30 aglycon, AAD 216 pseudo-aglycon, AAD 216A pseudo-aglycon, AAD 216B pseudo-aglycon, AAD 216C pseudo-aglycon eller en blanding deraf blandes homogent med sådanne foderrationer til dannelse af supplerende rationer, som derpå gives på sædvanlig måde, hvilket oftest er ad libitum. For at gøre dette, fremstilles 35 hensigtsmæssigt en forblanding af det supplerende vækstfremmende middel ifølge opfindelsen, eventuelt kombineret med eller uden andre i teknikken kendte tilskud, såsom et anthelmin- 25

DK 162772 B

tikum, en nitrogenkiIde eller et antibiotikum, f.eks. virgi-niamycin eller oxytetracykl in, idet forblandingen foretages af fabrikanten med henblik på salg til fabrikanter eller personer, der fremstiller foderportioner. Koncentrationen af de ak-5 tive bestanddele valgt fra gruppen bestående af AAD 216 agly-con, AAD 216 pseudo-aglycon, AAD 216A pseudo-aglycon, AAD 216B pseudo-aglycon, AAD 216C pseudo-aglycon eller en blanding deraf i forblandingen er sædvanligvis fra 5 til 75 vægt* eller en koncentration, der er 100 - 200 gange større end koncentratio-10 nen i den færdige foderration. Forblandingen kan have form af en væske eller et fast stof. Bærere i forblandingen er majsolie, bomuldsfrøolie, melasse eller "distillers solubles" til dannelse af et flydende forblandingspræparat. Sucrose, lactose, majsfoder, malet majsmel, calciumcarbonat eller sojabøn-15 nefoder anvendes ofte som grundlag for faste forblandingspræparater. Forblandingen blandes derpå homogent med hele rationen, som gives som foder til det pågældende dyr. Sådanne forblandingssammensætninger omfattes af udtrykket "fodermidler", der anvendes heri.

20

Koncentrationen af de aktive bestanddele valgt fra gruppen bestående af AAD 216 aglycon, AAD 216 pseudo-aglycon, AAD 216A-pseudo-aglycon, AAD 216B pseudo-aglycon, AAD 216C pseudo-aglycon eller en blanding deraf i den færdige ration er en ikke-25 toksisk, men aktiv mængde valgt f.eks. fra et interval fra ca.

1 til 1.000 vægtdele aktiv bestanddel/mi11 ion dele af det færdige foder (ppm) eller ca. 2 - 115 g/ton. Der vælges hensigtsmæssigt en ikke-toksisk mængde aktiv bestanddel, som ligger i intervallet fra 10 til 50 ppm.

30

Anvendelsen af en forbindelse ifølge opfindelsen omfatter tilførsel til enmavede eller drøvtyggende kød- eller mælkeproducerende dyr, især kød- eller malkekvæg, får, svin og fjerkræ, af en effektiv vækstfremmende, men ikke-toksisk mængde af en ak-35 tive bestanddel valgt fra gruppen bestående af AAD 216 aglycon, AAD 216 pseudo-aglycon, AAD 216A pseudo-aglycon, AAD 216B pseudo-aglycon, AAD 216C pseudo-aglycon eller en blanding der- 26

DK 162772 B

af. Andre enmavede dyr, hvis fordøjelseskanal også indebærer fermentation i et coecum eller coecum-1 ignende kammer, er kaniner og heste.

5 De supplerede foderrationer, der er beskrevet ovenfor, gives til dyret på i teknikken kendt måde. Fodring ad libitum på græsningsstedet, i folden eller stalden er mest hensigtsmæssig til forøgelse af væksten og mælkeudbyttet fra dyret og til at forøge fodringseffektiviteten.

10

De følgende eksempler belyser fremstillingen, isoleringen og rensningen af antibiotikaene ifølge den foreliggende opfindelse .

15 Eksempel 1.

Fremstilling af AAD 216 pseudo-aglycon.

AAD 216A (1,2 g) blev delvis opløst i 10% vandig acetonitril 20 og 0,001N saltsyre (samlet volumen 1500 ml) og opvarmet under tilbagesvaling i 48 timer. Reaktionsblandingen blev lyofilise-ret og derpå kromatograferet på omvendt fasehøjtryksvæskekro-matografi (HPLC) med en søjle af Whatman "Partisil" 40® (0DS-3) (25 x 500 mm) ved en strømningshastighed på 15 ml/minut.

25 Søjlen blev elueret med 15% acetonitril - 0,1 M pH 3,2 phos- phatpuffer (2.000 ml) og 18% acetonitril-pufferopløsning (1.000 ml). De passende fraktioner blev forenet, lyofiliseret og afsaltet som beskrevet nedenfor til dannelse af den ønskede AAD 216 pseudo-aglycon.

30

Afsaltningen omfattede en opsamling af de passende fraktioner fra HPLC og fjernelse af acetonitri let under reduceret tryk.

De resulterende vandige prøver blev anbragt på en XAD-7-har-piks-søjle og elueret med deioniseret vand, indtil afløbets 35 ledningsevne var under 1,5 μΜΗΟ. Søjlen blev derpå elueret med vandig acetonitril (50%, og elueringsmidlet lyofiliseret til dannelse af det ønskede produkt.

27

DK 162772 B

Eksempel 2.

Fremstilling af AAD 216 aglycon og AAD 216A pseudo-aglycon.

5 AAD 216A (0,74 g) blev opløst i 5% koncentreret saltsyre og dimethylsulfoxid (40 ml) og opvarmet i 15 minutter til 100eC. Reaktionsblandingen blev fortyndet med 14% acetonitril, 0,1M pH 3,2, phosphatpuffer og kromatograferet med det i eksempel 1 beskrevne udstyr. Søjlen blev elueret med 14% acetonitri 1puf-10 feropløsning (1.000 ml) efterfulgt af 18% (500 ml), 22% (500 ml), 26% (500 ml) og 30% (1.000 ml) acetonitri 1-pufferopløsning. De passende fraktioner indeholdende AAD 216A pseudo-aglycon blev forenet, og de passende fraktioner indeholdende AAD 216 glycon blev forenet. Begge de forenede fraktioner blev 15 særskilt lyofiliseret og afsaltet under anvendelse af frem gangsmåden fra eksempel 1 til dannelse af de ønskede produkter.

Eksempel 3.

20

Fremstilling af AAD 216B pseudo-aglycon.

AAD 216B (1,64 g) blev opløst i dimethylsulfoxid (40 ml) og koncentreret saltsyre (2 ml) blev tilsat. Reaktionsblandingen 25 blev opvarmet til 100°C i 15 minutter og derpå fortyndet med 31% acetonitril, 0,1M, pH 6,5, phosphatpuffer (450 ml), som blev overført til en affinitetskromatografisøjle (700 ml - Af-figel 10 D-ala-D-ala). Søjlen blev vasket med 0,1M, pH 6,0, phosphatpuffer (1.000 ml), vand (2.000 ml) og 1% vandig aceto-30 nitril (1.000 ml). Reaktionsprodukterne blev elueret af affinitetskromatografi med 50% acetonitril i 0,15 N ammoniak (2.000 ml). Elueringsmidlet blev lyofiliseret, opløst i 10% acetonitril i 0,1M, pH 6,0, phosphatpuffer og kromatograferet på det i eksempel 1 beskrevne udstyr. Søjlen blev elueret med 35 10% acetonitril i 0,1M, pH 6,0, phosphatpuf fer (500 ml), ef terfulgt af 15% (750 ml), 18% (750 ml), 22% (500 ml), 26% (50 ml), 30% (500 ml) og 35% (1.000 ml) acetonitri 1-pufferopløs-

Claims (16)

1. Antibiotisk forbindelse af vancomycin-typen, kende tegnet ved, at den har strukturformlen (I) /OH OH HO X

2. Antibiotisk forbindelse ifølge krav 1 med strukturformlen (II)

30 OH 1 (^1 ø 1<C0,H ud τ' 0 I r 0 I h l*H

2. I Cl I I II LF XX CX γ,η-λ I O I o 1^" ιΗ (I) i η η i h i i . h i Ho HoT^oT 2 (‘2K) Cl 0H cl 30 hvori R^ er hydrogen eller mannosyl , og R2 er hydrogen eller et glycolipidradikal med empirisk formel Cjg^gNOg, C17H30NO0 eller CigH32N0g, idet enten Rj eller R2 eller begge er hydrogen, at den kan fremstilles ved partiel sur hydrolyse af et 35 antibiotikum valgt blandt AAD 216 kompleks, AAD 126A, AAD 216B og AAD 216C, og aj^ DK 162772B forbindelsen, hvori Rj er mannosyl, og R2 er hydrogen, har følgende egenskaber: (a) bleghvidt-gult fast stof, der dekomponerer ved 300-350°C, 5 (b) en empirisk formel ¢551155^024014, (c) en omtrentlig grundstofsammensætning på 47,54% carbon, 4,0% hydrogen, 5,89% nitrogen og 8,63% chlor, når vandind- 10 holdet i glycopeptidet, på tidspunktet for grundstofanaly sen og bestemt ved Karl Fisher-titrering, er 12%, (d) et infrarødt absorptionsspektrum i kaliumbromid, som viser toppe ved følgende bølgetal i cm"l: 15 3400, 1660, 1610, 1590, 1510, 1460, 1430, 1390, 1300, 1230, 1180, 1150, 1120, 1060, 1010, 970 og 810. (e) et hurtigatombombardement (FAB) massespektrum med M+H ved 20 1458 (hovedgruppe), (f) et ultraviolet spektrum i acetonitri1/vand (1:1), som giver et absorptionsmaksium ved 281 nm under sure betingelser med en Ei% = 79,7 og ved 300 nm under basiske betin- 25 gelser med en = 136, (g) et carbonmagneti sk resonansspektrum ved 90,56 MHz i CD3OD/D2O (1:9) ved en pH-værdi på 8,7, som giver følgende kemiske forskydninger i dele/mi11 ion (ppm) i forhold til

30 TMS som standard: 177.9, 174,6, 171,7, 170,9, 170,0, 169,2, 162,3, 158,8, 157.9, 155,2, 155,1, 153,9, 151,9, 149,7, 147,6, 147,2, 144.4, 141,0, 139,0, 138,8, 137,5, 136,1, 134,6, 130,7, 35 130,0, 129,8, 129,2, 128,9, 128,7, 127,5, 127,3, 126,9, 126.4, 126,0, 125,2, 122,7, 122,2, 121,1, 119,9, 119,7, 118.4, 116,6, 110,7, 110,4, 108,5, 104,4, 103,3, 100,5, DK 162772 B 98.1, 74,0, 72,1, 71,6, 71,4, 70,8, 67,4, 65,8, 63,7, 62.2, 61,6, 60,2, 56,0, 55,9, 55,0 og 32,9 og (h) pKa-værdier i acetonitri1/vand (3:7) som følger: 5 3,3, 7,1, 8,3, 9,1, 10,0 og 11,2, pKa-værdier over 11,2 blev ikke bestemt, forbindelsen, hvori R^ er hydrogen, og Rj er et glycoli-10 pidradikal med en empirisk formel Ci6H28N06r har følgende egenskaber: (a) bleghvidt-gult fast stof, som dekomponerer ved 300-350°C, 15 (b) en empirisk formel ¢75^2^025014, (c) en omtrentlig grundstofsammensætning på 49,76% carbon, 4,51% hydrogen, 5,99% nitrogen og 8,19% chlor, når vandindholdet, i glycopeptidet, på tidspunktet for grundstof- 20 analysen og bestemt ved Karl Fisher-titrering, var 9,4%, (d) et infrarødt absorptionsspektrum i kaliumbromid, som giver toppe ved følgende bølgetal i cm-1: 25 3400, 2920, 1660, 1590, 1500, 1460, 1430, 1300, 1240, 1140, 1080, 1060 og 1010, (e) et hurtigatombombardement (FAB) massespektrum med M+H ved 1625 (hovedgruppe), (f) et ultraviolet spektrum i acetonitri1/vand (1:1), som giver et absorptionsmaksimum ved 281 nm under sure betingelser med en Ei% = 63,2 og ved 302 nm under basiske betingelser med en = 94, 35 (g) et carbonmagnetisk resonansspektrum ved 90,56 MHz i CD3OD/D2O (1:9) ved en pH-værdi på 9,4, som giver følgende DK 162772 B kemiske forskydninger i ppm i forhold til TMS som standard : 178.2, 178,0, 176,0, 175,6, 171,6, 170,9, 170,6, 170,5, 5 169,3, 164,6, 161,4, 159,3, 157,1, 156,5, 153,5, 152,5, 151,8, 151,1, 146,4, 144,9, 141,7, 138,6, 138,4, 136,9, 134.5, 134,4, 133,9, 130,8, 129,8, 129,7, 129,4, 128,6, 128.5, 128,3, 127,7, 127,3, 125,9, 125,7, 125,5, 122,5, 122.5, 122,1, 120,1, 119,4, 118,0, 116,9, 109,6, 109,0, 10 108,7, 104,5, 104,4, 103,2, 98,9, 78,4, 74,3, 73,3, 72,1, 71.5, 66,2, 63,7, 61,9, 60,6, 56,9, 56,1, 55,8, 55,4, 37.2, 33,3, 32,0, 29,6, 29,4, 26,1, 22,9 og 14,4, og (h) pKa-værdier i acetonitri 1/vand (3:7) som følger: 15 3,0, 4,3, 7,4, 8,5, 9,9 og 10,9, pKa-værdier over 10,9 blev ikke bestemt, forbindelsen, hvori Ri er hydrogen, og R2 er et glycoli-20 pidradikal med en empirisk formel C17H30NO6, har følgende egenskaber: (a) hvidt fast stof, som dekomponerer ved 250-300eC, 25 (b) en empirisk formel ¢751174^025014, (c) en omtrentlig grundstofsammensætning på 48,98% carbon, 4,56% hydrogen, 5,64% nitrogen og 8,29% chlor, når vandindholdet i glycopeptidet, på tidspunktet for grundstof- 30 analysen og bestemt ved Karl Fisher-titrering, var 6,9%, (d) et infrarødt absorptionsspektrum i ka1 iumbromid, som giver toppe ved følgende bølgetal i cm"l: 35 3400, 2920, 1660, 1590, 1500, 1480, 1430, 1300, 1240, 1150, 1080, 1060 og 1010, DK 162772 B (e) et hurtigatombombardement (FAB) massespektrum med M+H ved 1639 (hovedgruppe), (f) et ultraviolet spektrum i acetonitri1/vand (1:1), som gi- 5 ver et absorptionsmaksimum ved 281 nm under sure betingelser med en = 61,8 og ved 303 nm under basiske betin gelser med en Εχ^ = 88, (g) et carbonmagnetisk resonansspektrum ved 90,56 MHz i

3. Fremgangsmåde til fremstilling af en antibiotisk forbin-5 delse ifølge krav 1, kendetegnet ved partiel sur hydrolyse af et antibiotikum valgt blandt AAD 216 kompleks, AAD 216A, AAD 216B og AAD 216C, indtil dannelse af en væsentlig mængde af den ønskede antibiotiske forbindelse, og isolering af denne forbindelse. 10

3. MeN^ T w T w ϊ T H o 1 o L ciAA H0' 1Ά1 ril °H ci L ci DK 162772B

4. Fremgangsmåde til fremstilling af forbindelsen ifølge krav 1, hvor er mannosyl, og R2 er hydrogen, kendetegnet ved partiel sur hydrolyse af et anti bi oti kum valgt fra gruppen bestående af AAD 216 kompleks, AAD 216A, AAD 216B og

5. Fremgangsmåde ifølge krav 4, kendetegnet ved, at antibiotiket, som hydrolyseres, er AAD 216A, AAD 216B eller

20 AAD 216C.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 5, kendetegnet ved, at hydrolysen gennemføres i vandigt, organisk opløsningsmiddel med meget fortyndet mineralsyre under tilbagesvaling. 25

7. Fremgangsmåde til fremstilling af forbindelsen ifølge krav 1, hvor Rj er hydrogen, og R2 er et glycol ipidradikal med empirisk formel Ciøf^sNOg, kendetegnet ved partiel sur hydrolyse af AAD 216A indtil dannelse af en væsentlig 30 mængde af den ønskede antibiotiske forbindelse og isolering af denne forbindelse.

8. Fremgangsmåde til fremstilling af forbindelsen ifølge krav 1, hvor Ri er hydrogen, og R2 er et glycol ipidradikal med 35 empirisk formel Cjf^øNOg, kendetegnet ved partiel sur hydrolyse af AAD 216B indtil dannelse af en væsentlig mængde af den ønskede antibiotiske forbindelse og isolering af denne forbindelse. DK 162772 B

9. Fremgangsmåde til fremstilling af forbindelsen ifølge krav 1, hvor Ri er hydrogen, og R2 er et glycol ipidradikal med empirisk formel Cigh^NOg, kendetegnet ved partiel sur hydrolyse af AAD 216C indtil dannelse af en væsentlig 5 mængde af den ønskede antibiotiske forbindelse og isolering af denne forbindelse.

10. Fremgangsmåde til fremstilling af antibiotikumforbindelsen ifølge krav 2, kendetegnet ved partiel hydrolyse 10 af et antibiotikum valgt fra gruppen bestående af AAD 216 kompleks, AAD 216A, AAD 1268 og AAD 216C, indtil dannelse af en væsentlig mængde af den ønskede antibiotiske forbindelse og isolering af denne forbindelse.

10 CD3OD/D2O (1:9) ved en pH-værdi på 9,4, som giver følgende kemiske forskydninger i ppm i forhold til TMS som standard : 178,3, 177,6, 175,9, 175,6, 171,5, 171,0, 170,7, 170,3, 15 .169,4, 164,0, 159,3, 158,9, 156,4, 152,5, 151,7, 151,1, 146.2, 144,7, 141,8, 138,7, 138,6, 136,8, 134,4, 133,8, 130,9, 129,8, 129,5, 128,6, 128,4, 127,9, 127,3, 126,0, 125,8, 122,5, 119,9, 119,3, 118,2, 116,9, 109,3, 108,8, 104.3, 104,2, 103,0, 99,4, 78,7, 74,4, 73,5, 72,1, 71,6, 20 65,8, 63,8, 62,5, 60,6, 57,1, 56,1, 55,9, 55,4, 39,7, 37.3, 33,1, 30,3, 29,9, 29,7, 28,5, 28,0, 26,3 og 23,4, medens forbindelsen, hvori er hydrogen, og R2 er et glyco-lipidradikal med en empirisk formel Ci8H32N06» har følgende 25 egenskaber: (a) hvidt fast stof, som dekomponerer ved 250-300°C, (b) en empirisk formel C77H76N8O25CI4, 30 (c) en omtrentlig grundsstofsammensætning på 47,58% carbon, 4,51% hydrogen, 5,33% nitrogen og 8,08% chlor, når vandindholdet i glycopeptidet, på tidspunktet for grundstof-analysen og bestemt ved Karl Fisher-titrering, var 7,8%, 35 (d) et infrarødt absorptionsspektrum i kaliumbromid, som giver toppe ved følgende bølgetal i cm“l; DK 162772 B 3400, 2920, 1660, 1590, 1500, 1430, 1300, 1240, 1140, 1080, 1060 og 1010, (e) et hurtigatombombardement (FAB) massespektrum med M+H ved 5 1653 (hovedgruppe), (f) et ultraviolet spektrum i acetonitri 1/vand (1:1), som giver et absorptionsmaksimum ved 281 nm under sure betingelser med en E^% = 60,0 og ved 303 nm under basiske betin- 10 gelser med en = 83, (g) et carbonmagnetisk resonansspektrum ved 90,56 MHz i CD3OD/D2O (1:9) ved en pH-værdi på 9,4, som giver følgende kemiske forskydninger i ppm i forhold til TMS som stan- 15 dard: 178.1, 177,4, 175,5, 175,4, 171,4, 171,0, 170,7, 170,3, 169.3, 163,6, 159,1, 158,6, 156,5, 156,2, 152,7, 151,9, 151,8, 151,0, 146,2, 144,6, 142,0, 138,8, 138,6, 136,9, 20 134,8, 134,7, 134,0, 130,6, 129,9, 129,8, 129,4, 128,8, 128.3, 127,8, 127,5, 127,2, 126,4, 126,2, 125,8, 122,5, 122,0, 119,6, 119,1, 118,4, 116,9, 109,5, 109,2, 108,7, 104.2, 103,6, 99,8, 78,6, 74,6, 73,5, 72,1, 71,7, 66,0, 63,7, 62,1, 60,6, 56,9, 56,1, 55,9, 55,4, 39,6, 37,3, 25 33,2, 30,4, 30,0, 29,8, 28,5, 27,9, 26,3 og 23,1.

11. Fremgangsmåde ifølge krav 10, kendetegnet ved, at antibiotiet, der hydrolyseres, er AAD 216A, AAD 216B eller AAD 216C.

12. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 7, 8, 9 eller 11, 20 kendetegnet ved, at hydrolysen gennemføres i et polært organisk opløsningsmiddel med fortyndet mineralsyre ved forhøjet temperatur. t

13. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 5, 7, 8, 9 eller 25 11, kendetegnet ved, at den antibiotiske forbindelse isoleres ad kromatografisk vej.

14. Anti bakterielt middel, kendetegnet ved, at det omfatter en forbindelse ifølge krav 1 og en farmaceutisk ac- 30 ceptabel bærer.

15. Dyrefoder suppleret med en ikke-toksisk mængde af en eller flere forbindelser ifølge krav 1.

15 AAD 216C indtil dannelse af en væsentlig mængde af den ønskede antibiotiske forbindelse og isolering af denne forbindelse.

16. Dyrefoderforblanding omfattende en forblandingsbærer og en eller flere forbindelser ifølge krav 1.