DK160840B - Kimaere alfa-amylaser og fremgangsmaade til fremstilling deraf - Google Patents

Description

DK 160840 B

Denne opfindelse angår stivelseshydrolyseenzymer.

Mere specifikt angår den foreliggende opfindelse kimære a-amylaser og en fremgangsmåde til fremstilling af sådanne kimære a-amylaser.

5 Den generelle enzymatiske proces, der almindeligvis anvendes af producenter af høj-DX-sirupper ud fra stivelse, hvor udtrykket DX betyder vægtprocent dextrose (D-glucose) beregnet på grundlag af tørstofindholdet (DS) i siruppen, er en to-trinsproces: forflydigelse og forsukring. Det første 10 trin forflydigelse indebærer hydrolyse af stivelse til en blanding af oligosaccharider, de såkaldte maltodextriner.

Denne proces katalyseres af a-amylaser ved en temperatur på mindst 75°C, fortrinsvis ved ca. 90°C, eller ved en lyn-kogningsproces, hvor stivelsesopslemningen opvarmes i adskillige 15 minutter til 105 - 110°C, sædvanligvis med en enkelt dosis a-amylase og derpå holdes på ca. 90°C i mindst en time.

Til brug i forflydningsprocessen er forskellige mikrobielle, især bakterielle α-amylaser kommercielt tilgæn-

TM

gelige, f.eks. BAN (fra Bacillus amyloliquefaciens) og 20 TERMAMYL® (fra Bacillus licheniformis), begge kan fås hos NOVO Industri A/S, Danmark, og THERMOLASE™ (fra Bacillus stearothermophilus), som fås fra Enzyme Development Corporation, N.Y., U.S.A.

Medens BAN a-amylase kun er stabil op til ca. 85°C

25 og derfor næppe egnet til lynkogningsprocessen, er både

TM

TERMAMYL® og THERMOLASE enzymer godt tilpassede til denne næsten globalt foretrukne fremgangsmåde til stivelsesforflydning, da de er varmestabile.

Forsukringstrinnet, hvor maltodextrinerne omdannes 30 til dextrose, katalyseres oftest med et glucoamylaseenzym. Kommercielle glucoamylasepræparater, oftest hidrørende fra

Aspergillus- eller Rhizopusarter, kan fås hos forskellige

TM

producenter, f.eks. som AMG 200L, et produkt stammende fra Aspergillus niger og fremstillet af NOVO Industri A/S, 35 Danmark.

- 2 .-

DK 160840 B

Med henblik på yderligere at øge dextroseudbyttet fra 30 - 40 vægtprocent DS maltodextrinopløsninger er det blevet almindeligt at udføre forsukringsprocessen med gluco-amylase sammen med et afgreningsenzym for at lette hydrolysen 5 af forgrenede oligosaccharider hidrørende fra amylopektin-delen i stivelse. Et sådant afgreningsenzym med maksimumaktivitet indenfor de samme pH- og temperaturområder som gluco-amylase er beskrevet i europæisk patentansøgning nr.

82302001.1 (publikation nr. 0063909). Afgreningsenzymet 10 forhandles af NOVO Industri A/S, Danmark, enten i ren tilstand eller som en blanding med passende tilsætning af glucoamylase under navnene henholdsvis PROMOZYME og DEXTROZYME.

Uheldigvis indebærer den ellers gunstige kombina-15 tion af B. licheniformis α-amylase til forflydning og gluco-amylase-PROMOZYME til forsukring i omdannelsen af stivelse til høj-DX-sirupper en ulempe. Man har iagttaget, at tilstedeværelsen af α-amylaserestaktivitet fra forflydningstrinnet har en negativ effekt på den maksimalt opnåelige DX ved 20 forsukring med glucoamylase-PROMOZYME. Problemet er størst for den termostabile B. licheniformis a-amylases vedkommende, som stadig er aktiv under de til forsukring foretrukne betingelser (pH og temperatur på henholdsvis ca. 4,6 og 60°C). Man har fundet en løsning, som består i inaktivering af a-amyla-25 sen inden forsukringen ved forsuring af den forflydigede stivelse til pH under 4,5, medens der opretholdes en temperatur på mindst 90°C. Efter inaktivering af α-amylasen indstilles temperaturen og pH på forsukringsbetingelser, hvilket betyder, at pH-værdien skal hæves til ca. 4,5. Denne yderli-30 gere pH-indstilling forøger uundgåeligt siruppens saltindhold, og dermed udgifterne i forbindelse med afsaltning af slutproduktet.

Formålet med den foreliggende opfindelse er at afhjælpe de tidligere nævnte ulemper, som stadig knytter sig 35 til anvendelsen af B. licheniformis α-amylase under omdannelsen af stivelse til en høj-DX-sirup. Dette og andre formål,

DK 160840 B

som vil blive omtalt i det følgende, opnås ved at udføre forflydningsprocessen med en hidtil ukendt type kimær a-amylase.

De kimære α-amylaseenzymer ifølge opfindelsen er 5 ejendommelige ved, at de kan fremstilles ved dyrkning af en værtsorganisme, der er transformeret med et i værtsorganismen funktionsdygtigt plasmid omfattende et hybrid a-amylasegen kodende for fra 55 til 85 N-terminale aminosyrerester i Bacillus amyloliquefaciens α-amylase og fra 426 til 395 C-10 terminale aminosyrerester i Bacillus licheniformis 584(ATCC 27811) α-amylase, og at den har den almene formel II: Q'-R-L' (II) 15 hvor Q' er de 55 N-terminale aminosyrerester i B. amyloliquefaciens α-amylase med den almene formel Ib 20 5 10 15

Val-Asn-Gly-Thr-Leu-Met-Gln-Tyr-Phe-Glu-Trp-Tyr-Thr-Pro-Asn-Asp- 20 _ 25 30

Gly-Gln-His-Trp-Lys-Arg-Leu-Gln-Asn-Asp-Ala-Glu-His-Leu-Ser-Asp- 35 40 45 50 25 Ile-Gly-Ile-Tnr-Ala-Val-Trp-Ile-Pro-Pro-Ala-Tyr-Lys-Gly-Leu-Ser- 55

Gln-Ser-Asp-Asn-Gly-Tyr-Gly (Ib) 30 L·' er de 395 C-terminale aminosyrerester i B. licheniformis 584 (ATCC 27811) α-amylase med den almene formel Ic

DK 160840 B

90 95 100

Ser-Leu-His-Ser-Arg-Asp-Ile-Asn-Val-Tyr-Gly-Asp-Val- 105 110 115

Val-Ile-Asn-His-Lys-Gly-Gly-Ala-Asp-Ala-Thr-Glu-Asp-Val-Thr- 5 120 125 130

Ala-Val-Glu-Val-Asp-Pro-Ala-Asp-Arg-Asn-Arg-Val-Ile-Ser-Gly- 1 135 140 145

Glu-His-Arg-Ile-Lys-Ala-Trp-Thr-His-Phe-His-Phe-Pro-Gly-Arg- 150 155 160 10 Gly-Ser-Thr-Tyr-Ser-Asp-Phe-Lys-Trp-His-Trp-Tyr-His-Phe-Asp- 165 170 175

Gly-Thr-Asp-Trp-Asp-Glu-Ser-Arg-Lys-Leu-Asn-Arg-Ile-Tyr-Lys- 180 185 190

Phe-Gln-Gly-Lys-Ala-Trp-Asp-Trp-Glu-Val-Ser-Asn-Glu-Asn-Gly- 15 195 200 205

Asn-Tyr-Asp-Tyr-Leu-Met-Tyr-Ala-Asp-Ile-Asp-Tyr-Asp-His-Pro- 210 215 220

Asp-Val-Ala-Ala-Glu-Ile-Lys-Arg-Trp-Gly-Thr-Trp-Tyr-Ala-Asn- 225 230 235 20 Glu-Leu-Gln-Leu-Asp-Gly-Phe-Arg-Leu-Asp-Ala-Val-Lys-His-Ile- 240 245 250

Lys-Phe-Ser-Phe-Leu-Arg-Asp-Trp-Val-Asn-His-Val-Arg-Glu-Lys- 255 260 265

Thr-Gly-L ys-Glu-Met-P he-Thr-Val-Ala-Glu-Tyr-Trp-Gln-Asn-Asp- 25 270 275 280

Leu-Gly-Ala-Leu-Glu-Asn-Tyr-Leu-Asn-Lys-Thr-Asn-Phe-Asn-His- 285 290 295

Ser-Val-Phe-Asp-Val-Pro-Leu-His-Tyr-Gln-Phe-His-Ala-Ala-Ser- 300 305 319 30 Thr-Gln-Gly-Gly-Gly-Tyr-Asp-Met-Arg-Lys-Leu-Leu-Asn-Ser-Thr- 315 320 325

Val-Val-Ser-Lys-His-Pro-Leu-Lys-Ala-Val-Thr-Phe-Val-Asp-Asn- 330 4 335 340

His-Asp-Thr-Gln-Pro-Gly-Gln-Ser-Leu-Glu-Ser-Thr-Val-Gln-Thr- 35 345 350 355

Trp-Phe-Lys-Pro-Leu-Ala-Tyr-Ala-Phe-Ile-Leu-Thr-Arg-Glu-Ser- 360 365 370 - 5 -

DK 160840 B

Gly-Tyr-Pro-Gln-Val-Phe-Tyr-Gly-Asp-Met-Tyr-Gly-Thr-Lys-Gly- 375 380 385

Asp-Ser-Gln-Arg-Glu-Ile-Pro-Ala-Leu-Lys-His-Lys-Ile-Glu-Pro- 390 395 400 5 Ile-Leu-Lys-Ala-Arg-Lys-Gln-Tyr-Ala-Tyr-Gly-Ala-Gln-His-Asp- ^05 410 415

Tyr-Phe-Asp-His-His-Asp-Ile-Val-Gly-Trp-Thr-Arg-Glu—Gly-Asp-420 425 430

Ser-Ser-Val-Ala-Asn-Ser-Gly-Leu-Ala-Ala-Leu-Ile-Thr-Asp-Gly-10 ,,, 435 440 445

Pro-Gly-Gly-Ala-Lys-Arg-Met-Tyr-Val-Gly-Arg-Gln-Asn-Ala-Gly- 450 455 460

Glu-Thr-Trp-His-Asp-Ile-Thr-Gly-Asn-Arg-Ser-Glu-Pro-Val-Val- 465 470 475 15 He-Asn-Ser-Glu-Gly-Trp-Gly-Glu-Phe-His-Val-Asn-Gly-Gly-Ser- 480 483

Val-Ser-Ile-Tyr-Val-Gln-Arg (1c) 20 og R er en polypeptidrest med den almene formel (la) 58 60 70

Pro-Tyr-Asp-Leu-Tyr-Asp-Leu-Gly-Glu-Phe-XQ-Gln-Lys- .

O

80 25 Gly-Thr-Val-Arg-Thr-Lys-Tyr-Gly-Thr-Lys-XQ-Glu-Leu- y 88

Gln-X-^Q-Ala-Ile-Gly (la) hvor Xg er His eller Gin, X^ er Gly eller Ser, X^q er Ser 30 eller Asp.

Kort sagt tilvejebringer den foreliggende opfindelse hidtil ukendte a-amylaser med den almene formel I

DK 160840 B

- 6 - Q-R-L (I) hvor Q er en N-terminal polypeptidrest med den ovennævnte formel Ib svarende til de N-terminale aminosyrerester i 5 Bacillus amyloliquefaciens a-amylasen (Takkinen et al., 1983, J.Biol.Chem. 258:1007-1013); R er en polypeptidrest med den ovennævnte formel la, og L er en C-terminal polypeptidrest med den ovennævnte formel Ic svarende til de C-terminale aminosyrerester i Bacillus licheniformis 584 (ATCC 27811) a-10 amylase (Stephens et al., 1984, J.Bacteriol., 158:369-372).

På grund af relevansen af Takkinen et al., supra og Stephens et al., supra ved definitionen af aminosyresekven-serne af de af B. amyloliquef aciens og B. licheniformis producerede a-amylaser, hvoraf dele af sekvenserne er inde-15 holdt i de kimære amylaser ifølge opfindelsen skal der her henvises til disse i deres helhed.

Aminosyresekvenserne i de kimære enzymer beskrevet og vist ovenfor kan modificeres ved substituering, deletion eller tilsætning af aminosyrerester inden for sekvensen, der 20 giver en tavs ændring i molekylet, således at produktet bibeholder sin aktivitet. Sådanne aminosyresubstitutioner kan foretages på basis af lighed i polaritet, ladning, opløselighed, hydrophobicitet, hydrophili og/eller den amphipatiske natur hos de involverede rester. For eksempel omfatter sure 25 aminosyrerester (negativt ladet ved pH 6,0) aspartansyre og glutaminsyre, basiske aminosyrer (positivt ladet ved pH 6,0) lysin og arginin; aminosyrer med uladede polære hovedgrupper eller ikke-polære hovedgrupper med samme hydrophile egenskaber omfatter følgende: leucin, isoleucin, valin, glycin, 30 alan'in, asparagin, glutamin, serin, threonin, phenylalanin, tyrosin.

Opfindelsen angår endvidere en fremgangsmåde til fremstilling af den hidtil ukehdte kimære α-amylase ifølge krav 1. 1

DK 160840 B

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen, er ejendommelig ved, at a) en værtsorganisme transformeres med et i værtsorganismen funktionsdygtigt plasmid omfattende et hybrid α-amylasegen kodende for fra 55 til 85 N-terminale 5 aminosyrerester i Bacillus amyloliquefaciens a-amylase og fra 426 til 395 C-terminale aminosyrerester i Bacillus licheni-formis 584(ATCC 27811) a-amylase, så den udtrykte a-amylase har den almene formel II: 10 Q'-R-L' (II) hvor Q', L1 og R er som defineret ovenfor, b) den transformerede værtsorganisme dyrkes i et egnet vækstmedium, og 15 c) den kimære a-amylase udvindes fra kulturen.

De omhandlede kimære a-amylaser kan iøvrigt fremstilles ved anvendelse af almindeligt kendte genmanipulationsteknikker såsom gensplejsning eller ved 20 anvendelse af in vivo rekombination som beskrives i det følgende eller ved kemiske synteseteknikker.

De omhandlede kimære α-amylaser kan anvendes på forflydningstrinnet i produktionen af høj-DX-sirupper, især i den tidligere omtalte lynkogningsproces.

25 De omhandlede kimære α-amylaser, viser overraskende

de udmærkede thermostabiliseringsegenskaber hos a-amylase fremkommet fra B. licheniformis, men på samme tid en mindsket negativ effekt på det maksimalt opnåelige DX uden at have været inaktiveret inden forsukringen. Opfindelsen skal her 30 illustreres ved eksempler, hvor et segment fra B. licheniformis α-amylase bestående af fra ca. aminosyrerestnummer 55 til ca. aminosyrerestnummer 85 beregnet fra den N-terminale ende af B. licheniformis a-amylase eller alternativt hele det N-terminale segment derfra udveks-35 les med det tilsvarende segment af B. amyloliquefaciens a-amylase. Restaktiviteten fra den kimære α-amylase har højst en ubetydelig negativ effekt på det maksimalt opnåelige DX

- 8 -

DK 160 840 B

ved forsukring med glucoamylase-PROMOZYME, medens den stadig bibeholder den udmærkede thermostabilitet, som er karakteristisk for B. licheniformis a-amylase.

De følgende udtryk har i denne beskrivelse den 5 nedenfor angivne betydning: DS = tørstof DX = vægtprocent dextrose (D-glucose).

10 Opfindelsen forklares nærmere i det følgende under henvisning til tegningerne/ hvor fig. 1 viser gel-permeationskromatogrammer af a-amylaser fra B. licheniformis, B. amyloliquefaciens og en kimær α-amylase ifølge opfindelsen, 15 fig. 2 viser restriktionskortet over plasmid pDN1822, fig. 3 viser restriktionskortet over plasmid pDNl850, og fig. 4 viser restriktionskortet over plasmid 20 pDNl864.

Som tidligere angivet angår opfindelsen kimære a-amylaser med den almene formel II

Q'-R-L·' (II) 25 hvor Q', R og L' defineres som beskrevet ovenfor. Foretrukne formler er beskrevet i de følgende afsnit.

En foretrukken kimær α-amylase med den almene formel II er en sådan, hvor aminosyreresterne Xg, X^ og X^q i 30 R er henholdsvis Gin, Ser og Asp.

I yderligere en foretrukket kimær α-amylase med den almene formel II er aminosyreresterne Xg, Xg og X^q i R henholdsvis His, Gly og Ser.

Yderligere foretrukne kimære a-amylaser ifølge 35 opfindelsen er sådanne, hvor værtsorganismen er B.subtilis.

Især sådanne hvor plasmidet er et af plasmiderne pDNl851, pDNl858, pDNl859, pDNl860, pDNl861, pDNl862 eller pDNl864.

DK 160840 B

Amylaserne ifølge opfindelsen er kimære enzymer og kan fremstilles på forskellige måder som beskrevet i det følgende.

Naturligt forekommende enzymer kan modificeres 5 genetisk ved tilfældig eller målrettet mutagenese, eller en del af et enzym kan erstattes med en del af et andet, så der fremkommer et kimært enzym. Denne udskiftning kan komme i stand enten ved konventionel in vitro gensplejsningsteknikker eller ved in vivo rekombination eller ved kombinationer af 10 begge teknikker. Ved anvendelse af konventionel in vitro gensplejsningsteknik kan en ønsket portion af den a-amylase genkodende sekvens fjernes ved at der bruges passende stedsspecifikke restriktionsenzymer; den fjernede del af kodningssekvensen kan derpå erstattes ved indsættelse af en ønsket 15 del af en anden a-amylasekodende sekvens, således at der fremstilles en kimær nucleotidsekvens, der koder for en ny α-amylase.

In vivo rekombinationsteknikkerne afhænger af, at forskellige DNA-segmenter med yderst homologe områder (DNA-20 sekvensidentitet) kan rekombinere, d.v.s. spalte og udveksle DNA, og etablere nye bindinger i de homologe områder. Derfor vil rekombination af homologe sekvenser in vivo, når kodningssekvenserne for to forskellige men homologe amylase-enzymer anvendes til at transformere en værtscelle, resultere 25 i produktionen af kimære gensekvenser. Translation af disse kodningssekvenser i værtscellen vil resultere i produktion af et kimært amylasegenprodukt.

a-amylasegenerne fra Bacillus licheniformis (i det følgende benævnt amyL) og fra Bacillus amyloliquefaciens (i 30 det følgende benævnt amyQ) er homologe for ca. 70 procents vedkommende på DNA niveau og egnede til hybriddannelse ved in vivo gensplejsning.

I en anden udførelsesform kan det kimære enzym syntetiseres ved allerede kendte standardkemiske metoder (se 35 f.eks. Hunkapiller et al., 1984, Nature 310: 105-111). Derfor

DK 160840 B

- 10 - kan peptider med de ovenfor beskrevne aminosyresekvenser syntetiseres helt eller delvis og forenes til dannelse af de kimære enzymer ifølge opfindelsen.

Som tidligere nævnt har restaktiviteten fra anven-5 delsen af den termostabile α-amylase fra B. licheniformis på forflydningstrinnet en negativ effekt på det maksimalt opnåelige D-glucoseudbytte på forsukringstrinnet ved anvendelse af A. niger glucoamylase og B. acidopullulyticus pullulanase.

Årsagen til denne negative effekt er ikke fuldt ud 10 kendt, men man antager, at B. licheniformis α-amylase udvikler "grænsedextriner", som er dårlige substrater for B. acidopullulyticus pullulanase, ved at hydrolysere 1,4-a-glucoside bindinger tæt på grenpunkterne i amylopektin. Disse grænsedextriner, som indeholder for få glucoseenheder i en 15 eller flere af sidekæderne vil være mindre følsomme overfor angreb af B. acidopullulyticus pullulanase.

I fig. 1 er angivet virkningsmønstrene for B. licheniformis α-amylase, B. amyloliquefaciens α-amylase og den kimære QL1864 α-amylase på amylopektin ved hjælp af 20 gelpermeationskromatogrammer af amylopektinnedbrydninger efter 48 timer.

Af figuren ses det, at virkningsmønstret for B. licheniformis α-amylase på amylopektin er forskelligt fra B. amyloliquefaciens α-amylases virkningsmønster. B. lichenifor-25 misenzymet producerer hovedsageligt DPg, DPg og DP^ initialt.

Ved forlænget hydrolyse hydrolyseres DP^ fraktionen yderligere, og de vigtigste komponenter er DP5, DP^ og DP2 med DP5 som langt den vigtigste. Når B. amyloliquefaciens a-amylase anvendes er hovedbestanddelen DP,_.

b 30 Virkningsmønstret for de kimære a-amylaser ifølge opfindelsen eksemplificeret ved QL1864 a-amylasen på amylopektin er tydeligt forskellig fra begge de naturligt forekommende a-amylaser idet der hovedsageligt produceres DP2, DP^ og DP^ i omtrent lige stor mængde. Som det vises i 35 det følgende, har dette ændrede virkningsmønster overraskende

" U " DK 160840B

medført, at B. licheniformis a-amylasens negative effekt på D-glucoseudbyttet er fjernet, medens termostabiliteten er bibeholdt.

Som følge heraf konkluderedes, at de kimære a-5 amylaser ifølge opfindelsen kan anvendes særdeles effektivt til forflydigelse af stivelse.

Eksempel 1 10 Fremstilling af hybrid QL1864

Ved konventionel teknik blev amyL og amyQ fra de samme mikroorganismer som anvendt af Stephens et al. og Takkinen et al. klonet i B. subtilis. Restriktionsenzymkortet for de to gener var i overensstemmelse med offentliggjorte 15 DNA sekvenser for generne for B. licheniformis amylase (amyL) (Stephens et al., J.Bacteriol. 158: 369 (1984) og B. amylo-liquefaciens amylase (amyQ) (Takkinen et al., J.Biol.Chem.

258: 1007, 1983).

amyQ (amyQ+) og en C-terminal del af amyL (amyL ) 20 blev anbragt parallelt på plasmid pDNl822. Dette er et B.

subtilis plasmid baseret på kloningsvektor pUBllO (Jalanko et al., Gene 14:325-328(1981)) og indeholdende kloramphenicol- p resistensgenet (Cam ) (cat gen) fra kloningsvektor pCl94 (Horinouchi og Weisblum, J. Bacteriol. 150:815-825(1982)).

25 Restriktionskortet over pDNl822 er vist i fig. 2, hvor generne er angivet med pile. Den C-terminale del af amyQ på pDN1822 blev derpå deleteret ved fraskæring af et Pvul-Pvul- fragment, som vist ved skravering på fig. 2, til opnåelse af plasmid pDNl850 (fig. 3). pDNl850 er amylasenegativ (Amy ), 30 men indeholder en N-terminal del af amyQ og en C-terminal del af amyL. Imidlertid forekommer rekombination mellem amyQ og -4 amyL med en hyppighed på ca. 10 , hvilket resulterer i plasmider indeholdende et hybrid QL amylasegen (amyQL+) og med en amylasepositiv fenotype (Amy+).

35 Transformering med et plasmidpræparat af pDNl850 til en plasmidfri B. subtilis vært, B. subtilis DN497, beskrevet i dansk patentansøgning nr. 5719/85 s. 11-12, og

DK 160840 B

R

selektering for Cam i agarplader indeholdende stivelse 4 resulterede i ca. 1:10 transformanter, der fremstillede en aktiv amylase. Transformanterne var omgivet af en ring af nedbrudt stivelse, som kunne påvises med ioddamp. Disse Amy+ 5 transformanter indeholdt et QL hybrid amylasegen på plas-midet. Fra disse transformanter blev plasmiderne pDNl851 til pDNl865 isoleret, og man fandt, at transformanter indeholdende plasmider pDNl851, pDNl858 til pDNl862 og pDNl864 fremstillede a-amylaser, som opfylder opfindelsens formål. Ved 10 restriktionsenzymkortlægning af plasmid pDNl864 blev amyQLl864 genet karakteriseret (fig. 4) og vist at indeholde et Ava2 site fra amyQ, men ikke det nærliggende EcoRI site fra amyQ. Følgelig skete rekombination mellem amyQ og amyL mellem de kodoner, der koder for aminosyre nr. 58 og nr. 67 i 15 B. licheniformis a-amylasen, som vist ved det skraverede område på fig. 3. B. subtilis QL1864 fremstiller derfor en kimær amylase, sammensat af ca. 1/6 amyQ amylase ved den N-terminale ende og 5/6 amyL amylase ved den C-terminale ende.

I de følgende undersøgelser defineres enzym-20 enhederne som vist nedenfor:

En NU (NOVO Unit) a-amylaseaktivitet er den mængde enzym, som nedbryder 5,26 mg opløst stivelse i timen ved 37°C, pH 5,6 og 0,0043 M Ca++ over en reaktionsperiode på 7 -20 minutter.

25 En AG enhed glucoamylaseaktivitet er den mængde enzym, som hydrolyserer et micromol maltose pr. minut ved 25°C og pH 4,3.

En pullulanaseenhed (PUN) defineres som den mængde enzym, som under standardbetingelser (temperatur 40°C og pH . 30 5,0) hydrolyserer pullulan med en hastighed svarende til dannelsen af "reducerende grupper" svarende til 1 μπιοί glucose pr. minut.

Forsukringsforsøg 35 Som tidligere nævnt har det vist sig, at. tilstede værelsen af en B. licheniformis a-amylaserestaktivitet hidrørende fra forflydningstrinnet har en negativ virkning på

DK 160840 B

det maksimale D-glucoseudbytte på forsukringstrinnet, når B. acidopullulyticus pullulanase og A. niger glucoamylase anvendes sammen.

For at evaluere indflydelsen af en restaktivitet 5 fra de kimære α-amylaser ifølge opfindelsen på forsukringstrinnet, blev de sammenlignet med B. licheniformis a-amylase på følgende måde:

Forsukringssubstrater blev fremstillet ved genopløsning af DE 8 (DE= Dextrose Equivalent (%reducerende 10 sukkerarter udtrykt som D-glucose)) forstøvningstørret malto-dextrin i deioniseret vand og opfyldning til ca. 30% DS (tørstof). Forsukringseksperimenter blev udført ved standard laboratoriebatchreaktioner på 500 ml.

pH blev målt ved forsukringstemperatur med pH-15 elektrode og pH-meter kalibreret og justeret i puffer ved 60 °C.

Følgende standardbetingelser anvendtes: Substratkoncentration 28,2% (initialt) 30,8% (finalt)

Temperatur 60°C

20 pH (initialt, ved 60°C) 4,6

Enzymdosering:

glucoamylase 0,15 AG/g DS

pullulanase 0,33 PUN/g DS

a-amylase 60 NU/g DS

25

Resultaterne af prøverne er vist i tabel 1.

DK 160840 B

Tabel 1

Reaktionsbetingelser 5 α-amylase Tid (h) pH %DP1 %DP2 %DP3 %DP4 24 4,5 92,8 2,5 1,1 3,6 48 4,4 96,7 1,8 0,7 0,8 ingen 72 4,4 96,8 2,0 0,6 0,6 10 (kontrol)_96_4,4 96, 8 2,2 0,5 0,5 B. licheniformis 24 4,5 92,4 2,5 2,4 2,7.

48 4,5 95,9 1,8 1,5 0,9 72 4,4 96,2 2,0 1,1 0,7 _96_4,4 96,4 2,1 0,9 0,6 15 QL1864 24 4,6 92,1 2,8 1,9 3,2 48 4,5 96,3 1,7 1,2 0,9 72 4,5 96,5 2,0 0,9 0,7 _96_4,5 96,6 2,1 0,8 0,6 20 Af tabellen ses, at skønt tilstedeværelsen af QL1864 α-amylase reducerede det maksimalt opnåelige DX med 0,2% (i sammenligning med kontrollen), repræsenterer den en forbedring-i forhold til B. licheniformis α-amylase, hvor reduktionen er 0,4%.

25

Termoaktivering og termostabilitet

For at evaluere termoaktiveringen af de kimære a-amylaser fremstillet med.de transformerede stammer, blev de kimære a-amylaser underkastet følgende forsøg: 30

Substrat: Phadebas tabletter (Phadebas® amylase test,

Pharmacia Diagnostics, Sverige) en tværbundet blåfarvet stivelsespolymer uopløselig i vand.

35 Puffer: 0,1 M fosfat, pH 6,1 og TRIS puffer pH 9,5.

Enzym: α-amylase fortyndet til 1-2 NU/ml i 0,09 M

CaCl2, pH 6,1.

DK 160840 B

Temperaturer: 37°C og 85°C.

1 ml α-amylase- fortynding blandes grundigt med 5 ml puffer og inkuberes i et vandbad ved den ønskede tempe-5 ratur inden tilsætning af en Phadebas tablet.

Reagensglasset rystes i 15 sekunder i en rysteblander, inden det igen anbringes i vandbadet.

Efter nøjagtig 15 minutter standses reaktionen ved tilsætning af 1 ml 1 M NaOH. Efter blanding filtreres blan-10 dingen gennem et 9 cm Whatman® GF/A eller FG/C filter.

Filtratets optiske tæthed måles ved en bølgelængde på 620 nm og er lineært relateret til aktiviteten af den tilsatte a-amylase.

Resultaterne er vist nedenfor sammen med værdierne 15 fra prøver med ren B. licheniformis og B. amyloliquefaciens α-amylaserne.

Tabel 2 20 α-amylase Phadebas 37°C Phadebas pH 6,1 _pH 6,1:pH 9,5 75°C:37°C_ B. licheniformis (kontrol) 0,4 3,7 QL1864 2,5 2,5 25 QL1861 2,2 2,2 QL1851 2,1 2,1 QL1862 2,0 2,0 QL1858 2,0 2,0 B. amyloliquefaciens 30 _(kontrol)_8/7_0,01_

Af tabellen ses, at de kimære a-amylaser ifølge opfindelsen er ligeså termoaktiverede som B. licheniformis 35 a-amylasen, og mindre følsomme overfor alkalisk pH end B. amyloliquefaciens a-amylase.

DK 160840B

For at evaluere stabiliteten af a-amylaserne ifølge opfindelsen blev følgende stålrørsprøver udført:

En DE 7 maltodextrin genopløst i afioniseret vand 5 blev anvendt som substrat under følgende betingelser:

Substrat: 32 - 33 procent

a-amylasedosering: 120 NU/g maltodextrin Temperatur: 105°C

10 pH: 5,5

Calciumindhold: 60 ppm

Ved hver prøve anbringes 5 stålrør indeholdende reaktionsblandingen i et oliebad ved 105°C og udtages efter 15 henholdsvis 10, 20, 30, 40 og 60 minutter, og a-amylase-restaktiviteten blev målt ifølge den tidligere omtalte Phadebas metode. Halveringstiden, Τ^2· beregnes ved lineær regression af log (restaktivitet) versus tid.

20 Resultaterne er vist i tabel 3 herunder.

Tabel 3 g-amylase_minutter 25 B. amyloliquefaciens (kontrol) 5 QL1851 22 QL1858 25 QL1861 18 30 QL1862 22.

QL1864 24 B. licheniformis _(kontrol)_23_ 35 Af tabellen fremgår det tydeligt, at de hybride oc- amylaser ifølge opfindelsen har bibeholdt stabiliteten af B. licheniformis ot-amylasen.

Claims (8)

1. Kimær α-amylase kendetegnet ved, at den kan fremstilles ved dyrkning af en værtsorganisme, der er transformeret med et i værtsorganismen funktionsdygtigt plasmid omfattende et hybrid α-amylasegen kodende for fra 55 15 til 85 N-terminale aminosyrerester i Bacillus amylolique-faciens α-amylase og fra 426 til 395 C-terminale aminosyrerester i Bacillus licheniformis 584(ATCC 27811) α-amylase, og at den har den almene formel II:

20 Q'-R-L' (II) hvor Q' er de 55 N-terminale aminosyrerester i B. amylolique-faciens α-amylase med den almene formel Ib 25 5 10 15 Val-Asn-Gly-Thr-Leu-Met-Gln-Tyr-Phe-Glu-Trp-Tyr-Thr-Pro-Asn-Asp- 20 25 30 Gly-Gln-His-Trp-Lys-Arg-Leu-Gln-Asn-Asp-Ala-Glu-His-Leu-Ser-Asp- 30 35 40 45 50 Ile-Gly-Ile-Thr-Ala-Val-Trp-Ile-Pro-Pro-Ala-Tyr-Lys-Gly-Leu-Ser- 55 Gln-Ser-Asp-Asn-Gly-Tyr-Gly (Ib) L' er de 395 C-terminale aminosyrerester i B. licheniformis 584 (ATCC 27811) a-amylase med den almene formel Ic

18. DK 160840B i j 5 go 95 100 ! Ser-Leu-His-Ser-Arg-Asp-Ile-Asn-Val-Tyr-Gly-Asp-Val- 105 110 115 Val-Ile-Asn-His-Lys-Gly-Gly-Ala-Asp-Ala-Thr-Glu-Asp-Val-Thr- 120 125 130

10 Ala-Val-Glu-Val-Asp-Pro-Ala-Asp-Arg-Asn-Arg-Val-Ile-Ser-Gly- 1 135 140 145 Glu-His-Arg-Ile-Lys-Ala-Trp-Thr-His-Phe-His-Phe-Pro-Gly-Arg- 150 155 160 Gly-Ser-Thr-Tyr-Ser-Asp-Phe-Lys-Trp-His-Trp-Tyr-His-Phe-Asp- 15 165 170 175 Gly-Thr-Asp-Trp-Asp-Glu-Ser-Arg-Lys-Leu-Asn-Arg-Ile-Tyr-Lys- 180 185 190 Phe-Gln-Gly-Lys-Ala-Trp-Asp-Trp-Glu-Val-Ser-Asn-Glu-Asn-Gly- 195 200 205

20 Asn-Tyr-Asp-Tyr-Leu-Met-Tyr-Ala-Asp-Ile-Asp-Tyr-Asp-His-Pro- 210 215 220 Asp-Val-Ala-Ala-Glu-Ile-Lys-Arg-Trp-Gly-Thr-Trp-Tyr-Ala-Asn- 225 230 235 Glu-Leu-Gln-Leu-Asp-Gly-Phe-Arg-Leu-Asp-Ala-Val-Lys-His-Ile- 25 240 245 250 Lys-Phe-Ser-Phe-Leu-Arg-Asp-Trp-Val-Asn-His-Val-Arg-Glu-Lys- 255 260 265 Thr-Gly-Lys-Glu-Met-Phe-Thr-Val-Ala-Glu-Tyr-Trp-Gln-Asn-Asp- 270 275 280

30 Leu-Gly-Ala-Leu-Glu-Asn-Tyr-Leu-Asn-Lys-Thr-Asn-Phe-Asn-His- 285 290 295 Ser-Val-Phe-Asp-Val-Pro-Leu-His-Tyr-Gln-Phe-His-Ala-Ala-Ser- 300 305 319 Thr-Gln-Gly-Gly-Gly-Tyr-Asp-Met-Arg-Lys-Leu-Leu-Asn-Ser-Thr- " 19 ' DK 160840B 315 320 325 Val-Val-Ser-Lys-His-Pro-Leu-Lys-Ala-Val-Thr-Phe-Val-Asp-Asn- 330 335 340 His-Asp-Thr-Gln-Pro-Gly-Gln-Ser-Leu-Glu-Ser-Thr-Val-Gln-Thr- 5 345 350 355 Trp-Phe-Lys-Pro-Leu-Ala-Tyr-Ala-Phe-Ile-Leu-Thr-Arg-Glu-Ser- 360 365 370 Gly-Tyr-Pro-Gln-Val-Phe-Tyr-Gly-Asp-Met-Tyr-Gly-Thr-Lys-Gly- 375 380 385

10 Asp-Ser-Gln-Arg-Glu-Ile-Pro-Ala-Leu-Lys-His-Lys-Ile-Glu-Pro- 390 395 400 Ile-Leu-Lys-Ala-Arg-Lys-Gln-Tyr-Ala-Tyr-Gly-Ala-Gln-His-Asp- 405 410 415 Tyr-Phe-Asp-His-His-Asp-Ile-Val-Gly-Trp-Thr-Arg-Glu-Gly-Asp- 15 420 425 430 Ser-Ser-Val-Ala-Asn-Ser-Gly-Leu-Ala-Ala-Leu-Ile-Thr-Asp-Gly- 435 440 445 Pro-Gly-Gly-Ala-Lys-Arg-Met-Tyr-Val-Gly-Arg-Gln-Asn-Ala-Gly- 450 455 460

20 Glu-Thr-Trp-His-Asp-Ile-Thr-Gly-Asn-Arg-Ser-Glu-Pro-Val-Val- 465 470 475 Ile-Asn-Ser-Glu-Gly-Trp-Gly-Glu-Phe-His-Val-Asn-Gly-Gly-Ser- 480 483 Val-Ser-Ile-Tyr-Val-Gln-Arg dc) 25 og R er en polypeptidrest med den almene formel (la) 58 60 70

30 Pro-Tyr-Asp-Leu-Tyr-Asp-Leu-Gly-Glu-Phe-Xg-Gin-Lys- 80 Gly-Thr-Val-Arg-Thr-Lys-Tyr-Gly-Thr-Lys-Xg-Glu-Leu- 88 Gln-X10-Ala-Ile-Gly (Ia) 20' DK 160840 Β hvor Xg er His eller Gin, Xg er Gly eller Ser, X^g er Ser eller Asp. 5

2. Kimær α-amylase ifølge krav 1, k e n d e-tegnet ved, at værtsorganismen er Bacillus subtilis. 10

3. Kimær α-amylase ifølge krav 2, k endete g n e t ved, at plasmidet er et af plasmiderne pDN 1851, pDN 1858, pDN 1859, pDN 1860, pDN 1861, pDN 1862 eller pDN 1864. 15

4. Kimær α-amylase ifølge krav 1, k endete g n e t ved, at Xg er His, Xg er Gly og X-^g er Ser.

5 Q'-R-L' (II) hvor Q', L' og R er som defineret i krav 1 b) den transformerede værtsorganisme dyrkes i et 10 egnet vækstmedium, og c) den kimære α-amylase udvindes fra kulturen.

5. Kimær α-amylase ifølge krav 1, kend e-tegnet ved, at Xg er Gin, Xg er Ser og X-^g er Asp. 25

5 - 17 - DK 160840 B NYE PATENTKRAV 10

6. Fremgangsmåde til fremstilling af en kimær α-amylase ifølge krav 1, kendetegnet ved, at a) en Værtsorganisme transformeres med et i værts- 30 organismen funktionsdygtigt plasmid omfattende et hybrid a-amylasegen kodende for fra 55 til 85 N-terminale aminosyre-rester i Bacillus amyloliquefaciens α-amylase og fra

21. DK 160840 B 426 til 395 C-terminale aminosyrerester i Bacillus licheni-formis 584(ATCC 27811) a-amylase/ så den udtrykte a-amylase har den almene formel II:

7. Fremgangsmåde til fremstilling af en kimær 15 α-amylase ifølge krav 6, kendetegnet ved, at værtsorganismen er Bacillus subtilis.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 7, kende- 20. e g n e t ved, at plasmidet er et af plasmiderne pDN 1851, pDN 1858, pDN 1859, pDN 1860, pDN 1861, pDN 1862 eller pDN 1864. \