DK160564B - Mikrobielle cyanidomdannende enzymer, deres fremstilling og anvendelse - Google Patents

Description

i

DK 160S64B

Den foreliggende opfindelse angår hidtil ukendte bakterielle cyanidomdannende enzymer, der er aktive ved høje koncentrationer af uorganisk cyanid under en lang række miljømæssige betingelser, deres fremstilling og anvendelse ved 5 omdannelsen af især uorganisk cyanid.

Udledning af industrispildevand indeholdende uorganisk cyanid i floder, søer og havvand giver alvorlige problemer med hensyn til forurening af miljøet. I det følgende omfatter 10 uorganisk cyanid cyanidioner og hydrogencyanid.

Spildevand indeholdende cyanid bliver dannet ved et stort antal processer i industrien såsom udvinding af ædelmetaller, galvanisering og produktion af syntetiske fibre, polymerer, fødevareadditiver og fødevarer.

15 På grund af dets høje toxicitet og udbredte anvendel se i industrielle fremgangsmåder, står uorganisk cyanid blandt de øverste på EPA's liste over forurenende stoffer (List of Priority Pollutants), se Environ.Sci.Technol. Γ3 (1979), 416 -422) .

20 Nogle europæiske lande har lavet forordninger, der kræver at spildevand, der udledes til vandområder, ikke må indeholde mere end ca. 0,5 ppm uorganisk cyanid.

Det er velkendt, at ca. 2.000 arter af højere planter 25 er cyanogenholdige (dvs. indeholder organiske cyanidforbindelser), og at disse planter afgiver betydelige mængder uorganisk cyanid, når de visner eller ved behandling efter høst. Cyanogenholdige planter omfatter mange vigtige landbrugsmæssige afgrøder, såsom kassava, durra, lucerne, bønner, ferskner og 30 mandler, af hvilke nogle kan have et højt indhold af cyanid (op til ca. 3 g cyanid pr. kg plantevæv).

I områder, hvor de ovennævnte afgrøder udgør den væsentlige føde, kan hele befolkninger lide af kronisk cyanidforgiftning (se side 101 og 122 i Cyanid in Biology, B. Vennes-35 land, E.E. Conn,C.J. Knowles, J. Westley og F. Wissing, Eds., 1981, Academic Press, London and New York).

2

DK 160564 B

Nedbrydning, omdannelse og detoxification af uorganisk cyanid er derfor af stor betydning i forbindelse med 1) behandling af spildevand, 2) kemisk industri og 3) menneskeføde.

5

Rene kemiske processer til omdannelse af uorganisk cyanid i spildevand har været brugt i mange år. Konventionelle kemiske behandlingsmetoder omfatter alkalisk klorering, hydro-genperoxydbehandling, ionbytning eller elektrolyse. Disse pro- 10 cesser er kostbare og i mange tilfælde uigennemførlige i stor målestok. Yderligere er alkalisk klorering en aldeles destruktiv fremgangsmåde, der kan føre til dannelsen af klorerede organiske forbindelser, der i sig selv er alvorlige forureninge-kilder.

15 Der er blevet foreslået og anvendt adskillige biolo giske metoder til behandling af spildevand indeholdende cyanid, derunder tilpassede slam-processer og forskellige biologiske filtersystemer (se Howe, R.H.L., 1965, Int.J.Air Water Poll. £, 463 - 478).

20 USA patentskrift nr. 3.756.947, 3.940.332, 4.461.834 og 3.660.278 omhandler brugen af specielt fremstillede slamprocesser omfattende 1) podning af aktiveret slam med cyanidomdannende mikroorganismer og 2) akklimatisering af de blandede systemer i én til adskillige uger før brug. De slam-baserede 25 systemer beskrevet i disse fire USA patentskrifter har ifølge kravene en meget begrænset evne til cyanidomdannelse - kun spildevand indeholdende mindre end 50 - 250 ppm (2-10 mM) cyanidioner kan renses effektivt. Industrispildevand kan indeholde væsentligt højere koncentrationer af cyanid.

30 Biologiske rensningssystemer, der anvender en hvilken som helst slags tilpasset slam med eller uden tilsætning af specifikke og levedygtige cyanidomdannende mikroorganismer, kan være vanskelige at holde i drift, og de er ikke egnede til at arbejde i lille målestok. Endvidere er slam-baserede systemer 3

DK 160564 B

begrænset til spildevandsbehandling og selvfølgelig ikke anvendelige til f.eks. cyanidomdannelse i fødevarefremstilling og for fjernelse af cyanidrester i spildevand fra kemisk industri.

5 Enzymatiske processer til omdannelse af cyanid til formamid under anvendelse af svampeceller eller immobili serede svampeceller er beskrevet i to europæiske patenter (publika-tionsnr. 61.249 og 116.423). Disse patenter omhandler brugen af enzymer (enzym: formamidhydro-lyase alias cyanidhydratase, EC 10 4.2.1.66), der alle produceres ud fra svampe, for det meste arter af kendte phytopathogene svampe. Cyanid blev omdannet 98% effektivt eller ned til ca. 1 ppm uorganisk cyanid ved en temperatur på 0 - 35°C og en pH-værdi på 6 - 10. Udstrakt teknisk anvendelse af cyanidomdannende enzymer produceret fra phyto-15 pathogene svampe er imidlertid problematisk, medmindre de kommercielle produkter gøres fuldstændig sterile med hensyn til produktionsstammer.

Der har været adskillige rapporter om isolering af cyanidomdannende bakterier (Knowles, C.J. Microorganisms and 20 cyanide, Bacteriol.Rev. 40: 652-680, (1976) og Knowles og Bunch (Adv.Micr.Physiol.(1986) 73-111, EDS.: A.H. Rose og D.W.

Tempest, Academic Press, London og New York). Nogle af disse bakteriestammer kan ikke længere fremskaffes til praktisk anvendelse, og for andre mikroroganismers vedkommende har det 25 ved senere efterprøvninger ikke været muligt at påvise cyanidomdannende aktivitet. Efter hvad der vides, producerer ingen af disse bakterier enzymer, der kan omdanne høje koncentrationer af uorganisk cyanid til meget lave koncentrationer.

30 I ingen af disse ovennævnte rapporter er der ført bevis for eksistensen af et cyanidaseenzym, der katalyserer en entrinsomdannelse af cyanid til myresyre og ammoniak.

Det blev hævdet, at f.eks. de bakterielle isolater ATCC 39204 (USA patentskrift nr. 4.461.834); ATCC 21697 og ATCC 35 21698 (USA patentskrift nr. 3.756.947); ATCC 21930 (USA patent skrift nr. 3.940.332) havde cyanidomdannende egenskaber. Stamme 4

DK 160564 B

ATCC 21697 og ATCC 21698, der i USA patentskrift nr. 3.756.947 er angivet at være Achromobacter nitriloclastes og Alcaligenes viscolactis, blev reklassificeret som henholdsvis Bacillus subtilis og Corynebacterium sp. ved deponeringen hos ATCC 5 (ATCC: American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, USA). Af de sidstnævnte 5 stammer, der således blev beskrevet som producenter af cyanidomdannende enzymer, var det kun Nocardia rubropertincta ATCC 21930 (senere af ATCC omklassificeret som Rhoducoccus rubropertincta), der i 10 virkeligheden udviste en sådan aktivitet, da de blev grundigt testet i vort laboratorium. Det cyanidomdannende enzymsystem af ATCC 21930 viste sig imidlertid hurtigt at blive inaktiveret ved lave cyanidkoncentrationer (mindre end eller lig med 20 mM). Ved koncentrationer større end 30 mM viste enzymsystemet 15 sig at være komplet inaktivt.

De videnskabelige informationer, der er tilgængelige gennem patenter nævnt i det foregående og artikler, der er citeret i en nyere artikel ved Knowles og Bunch (Adv.Mier.Physiol. (1986), 73 - 111, Eds.: A.H. Rose og D.W.

20 Tempest, Academic Press, London and New York), tyder på, at faktorer som phytopathogenecitet af produktionsstammer, enzymhæmning og enzyminaktivering med cyanid er de væsentligste hindringer for den tekniske anvendelse af enzymer til cyanid-detoxifikation.

25 Det har nu overraskende vist sig at visse gram negative bakterieisolater tilhørende slægten Alcaligenes producerer cyanidomdannende enzymer med egenskaber, som er helt enestående i forhold til de hidtil beskrevne enzymer. Disse egenskaber inkluderer f.eks. tolerance overfor høje cyanid-30 koncentratoner og substratkinetiske egenskaber, som muliggør afgiftning af cyanid til meget lave koncentrationer. To bakterieisolater, der producerer sådanne enestående cyanidomdannende enzymer er begge identificeret af DSM (Deutsche Sammlung von Mikoroorganismen, Gottingen, Vest 35 Tyskland) som arter af Alcaligenes denitrificans subs.

denitrificans, og de er deponeret hos DSM under numrene DSM

DK 160564B

5 4009 og DSM 4010 i forbindelse med den nuværende patentbeskrivelse. De cyanidomdannende enzymer af DSM 4009 og DSM 4010, som katalyserer den direkte hydrolyse af uorganisk cyanid til myresyre og ammoniak adskiller sig tydeligt fra 5 andre kendte cyanidomdannende enzymer såsom: Cyanid hydratase (formamid hydro-lyase E.C. 4.2.1.66), cyanidoxygenase, β-cyanoalaninsynthase og andre, som er beskrevet i afhandlingen af Knowles og Bunch (i Adv. Mier. Physiol. (1986), 73-111, jf. ovenfor).

10 Cyanidase er derfor foreslået som nyt navn for denne nye enzymtype produceret af DSM 4009 og DSM 4010; en enzymgruppe, som katalyserer den direkte omdannelse af uorganisk cyanid til myresyre og ammoniak (d.v.s. uden formamid som mellemled).

Cyanidomdannende enzymer (inklusiv cyanidase) har 15 ikke tidligere været beskrevet i andre Alcaligenes arter, og undersøgelser i vort laboratorie har vist, at de hverken bliver produceret konstitutivt eller inducerbart af registrerede typestammer af Alcaligenes denitrificans subs, denitrificans (DSM 30026 og NCIB 1196 (National Collection of Industrial 20 Bacteria, Torry Research Station, Aberdeen, Scotland) eller af Alcaligenes arter deponeret som NCIB 10109, NCIB 8687, ATCC 31371 og DSM 30030.

Det ville derfor være passende at anerkende de to isolater DSM 4009 og DSM 4010 af denne opfindelse enten som nye 25 arter af Alcaligenes eller som nye undertyper (varianter) af Alcaligenes denitrificans karakteriseret ved, at de inkluderer en hidtil ukendt type cyanidhydrolyserende enzym - en såkaldt Cyanidase.

De omhandlede enzymer, der kan omdanne (f.eks. ved 30 hydrolyse) uorganisk cyanid, betegnes derfor i det følgende "cyanidaser" eller "cyanidomdannende enzymer".

Opfindelsen angår således et cyanidomdannende enzym af bakteriel oprindelse, som er ejendommeligt ved, at det er 35 aktivt i nærværelse af uorganisk cyanid i en koncentration på over 10 mM, er i stand til at formindske indholdet af uorganisk 6

DK 160564 B

cyanid til under 1 ppm, at cyanid omdannes til myresyre (format) og ammoniak og at det er identisk med det enzym, der kan dannes af stammer tilhørende slægten Alcaligenes.

I en særlig udførelsesform angår opfindelsen et 5 enzym, der er ejendommeligt ved, at det er identisk med det enzym, der kan dannes af stammen Alcaligenes denitrificans subsp. denitrificans DMS 4009 eller stammen Alcaligenes denitrificans subsp. denitrificans DMS 4010, eller mutanter heraf med væsentlig samme egenskaber.

10 Et yderligere formål med denne opfindelse er cyanidomdannende enzymer, der er aktive i nærværelse af organiske opløsningsmidler, såsom acetone og methanol eller nitriler, såsom acrylnitril eller methacrylnitril.

Endnu et formål med opfindelsen er cyanidomdannende 15 enzymer, der kan omdanne cyanid ved temperaturer over 40°C.

Et yderligere formål med denne opfindelse er cyanidomdannende enzymer, der er i stand til at omdanne cyanid i nærværelse af metalioner, såsom zink (Zn ), nikkel (Ni ), 2+ 3+ + + jern (Fe , Fe ), guld (Au ) eller sølv (Ag ).

20 Som angivet ovenfor har det nu overraskende vist sig, at visse bakterier, f.eks. stammer af Alcaligenes denitrificans subsp. denitrificans, kan producere cyanidomdannende enzymer med forbedrede egenskaber som f.eks. høj tolerance og affinitet over for uorganisk cyanid, og at der endvidere kan fremstilles 25 enzymer, der opfylder de fleste eller alle de ovennævnte formål. Tilstedeværelsen af sådanne enzymer i bakterier er ikke tidligere påvist. Enzymer med disse egenskaber produceres heller ikke af registerede typestammer af Alcaligenes denitrificans subsp. denitrificans (f.eks. DSM 30026 eller NCIB 11961 30 (NCIB er The National Collection of Industrial Bacteria, Torry Research Station, Aberdeen Scotland)) eller af Alcaligenes-ar-ter deponeret som NCIB 10109, NCIB 8687, ATCC 31371 og DSM 30030.

7

DK 160564 B

De hidtil ukendte enzymer ifølge denne opfindelse er aktive ved koncentrationer op til mindst 26.000 ppm uorganisk cyanid. Det uorganiske cyanid omdannes til myresyre og ammoniak ved hjælp af enzymerne.

5 De cyanidomdannende enzymer ifølge den foreliggende opfindelse kan fås fra Alcaligenes denitrificans subsp. deni-trificans og Alcaligenes sp., hvoraf to stammer er deponeret hos Deutsche Sammlung von Mikroorganismen, Gottingen, Vesttyskland (i det følgende betegnet DSM), den 23. februar 1987 10 henholdsvis under numrerne DSM 4009 og DSM 4010 til patenteringsformål i henhold til Budapesttraktaten. Disse bakterier er blot eksempler på mikroorganismer, der kan anvendes ifølge den foreliggende opfindelse. Enhver bakterie, der er i stand til at producere cyanidomdannende enzymer med de ønskede egenskaber, 15 kan således anvendes.

Opfindelsen angår således også en fremgangsmåde til fremstilling af det cyanidomdannende enzym ifølge krav 1, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at en stamme tilhørende slægten Alcaligenes, dyrkes i nærværelse af kilder 20 for assimilerbart nitrogen, carbon og oxygen samt essentielle næringsstoffer, og at det cyanidomdannende enzym efterfølgende udvindes på i og for sig kendt vis.

En særlig udførelsesform herfor er ejendommelig ved, at stammen er Alcaligenes denitrificans subsp. denitrificans 25 DMS 4009 eller stammen Alcaligenes denitrificans subsp.

denitrificans DMS 4010 eller mutanter heraf med væsentlig samme egenskaber.

Cyanidomdannende enzymer kan fremstilles ved dyrkning af de nævnte mikroorganismer i et flydende medium i nærværelse 30 af cyanid, når der anvendes inducerbare stammer. Dyrkning i et cyanidholdigt medium er ikke nødvendigt, når der anvendes kon-stitutive stammer eller mutanter. Dyrkningen udføres aerobt ved en temperatur på ca. 20 - 40°C, fortrinsvis ca. 30°C, og en pH-værdi i området fra ca. 6 til 9.

8

DK 160564 B

De omhandlede cyanidaser kan også produceres ved at indsætte et gen, der koder for udtrykkeisen af en cyanidase, ifølge krav 1, ind i en passende vært, og dyrke denne vært.

Den cyanidomdannende proces udføres ved en pH-værdi 5 tæt på det specifikke enzyms pH-optimum. Denne pH-værdi vil typisk være omtrent neutral. Til behandling af spildevand med sure eller basiske pH-værdier, kan der anvendes enzymer med henholdsvis lavt eller højt pH-optimum. pH-værdien kan være i området fra ca. 4 til 11, fortrinsvis pH 6-9. Under reaktionen 10 bør temperaturen være over reaktionsblandingens frysepunkt og fortrinsvis under ca. 60°C, f.eks. i området fra ca. 15 til ca. 40°C, fortrinsvis 27°C-45°C og helst ca. 35°C.

De cyanidomdannende enzymer kan anvendes i præparater, hvilket præparat er ejendommeligt ved, at det 15 indeholder enzymet ifølge opfindelsen, der er til stede som intakte celler, behandlede celler, tørrede celler, rå celleekstrakt eller rent enzym, enten alene eller i blanding med et passende additiv, hvilket præparat kan være i tværbundet eller immobiliseret form.

20 Cyanidaserne produceret af DSM 4009 og 4010 har vist sig at være cellulært bundne.

Nogle cyanidomdannende enzymer ifølge denne opfindelse er særdeles stabile. F.eks. har vasket celleopslæmning af DSM 4009 vist sig at bibeholde mere end 95% af den oprindelige 25 enzymaktivitet, når den opbevares i en lang periode, f.eks. mere end 30 dage ved 22°C. Ved lavere temperaturer forøges enzymstabiliteten yderligere.

Enzymerne ifølge denne opfindelse har høj tolerance og affinitet over for uorganisk cyanid, nogle kan afgifte op-30 løsninger indeholdende mindst 26.000 ppm cyanidion, dvs. ca.

1,0 M. Restkoncentrationen af uorganisk cyanid i opløsninger, hvortil enzymer ifølge denne opfindelse tilsættes, kan reduceres til mindre end ca. 0,03 ppm. Yderligere værdifulde træk ved nogle af enzymerne ifølge denne opfindelse er deres evne til 35 effektivt at omdanne uorganisk cyanid i nærværelse af organiske opløsningsmidler og nitriler (f.eks. acetone, methanol, meth-

DK 160564B

9 acrylnitril og acrylnitril) og forskellige metalioner. Organiske opløsningsmidler og nitriler og/eller metalioner er ofte til stede sammen med cyanid i industrispildevand fra f.eks. produktion af syntetiske fibre, galvanisering og minedrift og 5 behandling af kassava og bitre mandler.

De cyanidomdannende enzymer ifølge denne opfindelse er i laboratorieforsøg blevet anvendt med gunstige resultater på adskillige cyanidholdige spildevandsprøver med højst forskellig kemisk sammensætning.

10 Opfindelsen angår således også anvendelsen af enzympræparater ifølge opfindelsen til afgiftning af cyanid i spildevand, såsom industriprocesvand eller spildevand, der indeholder metalioner.

Denne opfindelse illustreres yderligere ved hjælp af 15 de følgende eksempler. Det testede cyanidomdannende enzym blev fremstillet ved dyrkning af den stamme, der er deponeret under DSM nr. 4009. I eksemplerne 1-19 beskrives der forskellige test. Disse eksempler henviser til test og grænser, der er angivet i nogle af de følgende krav.

20 Enzymaktiviteter i de følgende eksempler er angivet som internationale enheder (i det følgende forkortet IU). En IU svarer til den mængde enzym, der katalyserer omdannelsen af 1 μιηοΐ cyanid pr. minut ved en pH-værdi på 7,0, en temperatur på 30°C og 60 mM NaCN.

25 BESKRIVELSE AF ENZYMPRÆPARAT Optimal pH: 7.8 30 Stabilt og aktivt pH-område: 6-9 Optimal temperatur: 40°C.

Aktivt temperaturområde (over 20%): 15°C-50°C.

10

DK 160564 B

Taksonomi af stammerne DSM 4009 og 4010

Stammernes egenskaber_DSM 400 9_DSM 4010 5 Cellernes form stave bredde μια 0.5-0.7 0.5-0.7 længde μπι 0.8-2.5 0.8-2.5

Bevægelighed + + 10

Svingtråde peritrikke peritrikke

Gramreakton

Lyse med 3% KOH + + 15 Aminopetidase (Cerny) + +

Sporer

Oxidase + + 20 Catalase + + Vækst

Anaerob 37/41°C +/- +/- 25 pH 5.6 + +

Mac-Conkey-Agar + + SS-Agar + +

Cetrimid-Agar + + autotrof med hydrogen 30

Pigmenter ikke spredbar spredbar fluorescerende 35 pyocyanin 11

DK 160564 B

Syre fra (OF-forsøg) glukose aerob glukose anaerob 5 Gas fra glukose

Syre fra (ASS) glukose fruktose 10 xylose

ONPG

ADH

15

LDC

VP - 20 Indol NC>2 fra NO + +

Denitrifikation + + 25

Phenylalanin deaminase Levan fra sukrose 30 Lecithinase Urease 12

DK 160564 B

Hydrolyse af stivelse gelatine casein 5 DNA

Tween 80 æskulin

Tyrosin nedbrydning - (nd) 10 Vækstfaktorkrav Udnyttelse af acetat + 15 adipat + caprat citrat + glycolat - (nd) levulinat 20 malat + malonat - (nd) phenylacetat + + L-arabinose fruktose 25 glukose mannose maltose xylose mannitol 30 glukonat - + 2-ketoglukonat - (nd) N-acetylglucosamin L-serin + (nd) 35

DK 160564 B

13

Resultat: = Alcaligenes denitrificans susp. denitrificans 5 (nd) = ikke bestemt Eksempel 1

10 TEST FOR VIRKNINGEN AF CYANIDDETOXIFIKATION

2,5 IU af det cyanidomdannende enzym sættes til 5 ml 0,1 M phosphatpuffer (pH-værdi: 7), der er 0,1 M med hensyn til NaCN. Denne blanding inkuberes under svag omrøring ved 37°C.

15 Efter inkubering i 60 minutter analyseres koncentrationen af uorganisk cyanidrest i reaktionsblandingen (der anvendes Merck Aguaquant® 14429 test-kit).

Ved anvendelse af cyanidomdannende enzym fra DSM nr. 4009 var restkoncentrationen af uorganisk cyanid mindre end 20 0,03 ppm. Den resterende koncentration af uorganisk cyanid målt med førnævnte Aquaquant test-kit blev målt med regelmæssige mellemrum under anvendelse af pyridin-barbitursyremetoden (jfr. American Standard Methods, 15. udg., 1980, 412 D, 320 - 322) for at verificere, at det uorganiske cyanid virkelig blev redu-25 ceret til en koncentration under 0,03 ppm.

Uorganisk cyanid blev ikke hydrolyseret i kontrolforsøg uden enzym og heller ikke i forsøg, hvor der blev anvendt kogt enzym, hvilket beviser, at omdannelsen af uorganisk cyanid udelukkende var enzymatisk.

30

TEST FOR VIRKNINGEN AF CYANIDDETOXIFIKATION

Eksempel 2 14

DK 160564 B

5 Ti ml af pufferen fra Eksempel 1 indeholdende 200 mM

NaCN (pH-værdi: 7,5) behandles med 25 IU cyanidomdannende enzym ved 30°C under svag omrøring. Efter inkubering i 2 timer måles koncentrationen af uorganisk cyanid i reaktionsblandingen.

Ved anvendelse af cyanidomdannende enzym fra DSM nr.

10 4009 var restkoncentrationen af uorganisk cyanid under 0,03 ppm. Ammoniakkoncentrationen var ca. 200 mM. Ammoniak blev bestemt efter Chaney og Marbachs metode (Clin.Chem. 8 (1962), 130 - 132).

15

Eksempel 3

TEST FOR CYANIDTOLERANCE

20 En opløsning af 600 mM NaCN i pufferen fra Eksempel 1 (pH-værdi iagttaget til mellem 7,0 og 7,6) behandles med det cyanidomdannende enzym (6 IU pr. ml opløsning) ved 30°C under svag omrøring. Efter inkubering i 5 timer måles koncentrationen af uorganisk cyanid i reaktionsblandingen.

25 Ved anvendelse af cyanidomdannende enzym fra DSM nr.

4009 var restkoncentrationen af cyanid under 0,03 ppm. Ammoniakkoncentrationen var ca. 600 mM.

TEST FOR CYANIDTOLERANCE

Eksempel 4 15

DK 160564 B

5 En 1.000 mM (ca. 49.000 ppm) opløsning af NaCN i puf feren fra Eksempel 1 (pH-værdi iagttaget til mellem 7,0 og 7,5) behandles med cyanidomdannende enzym (8,5 IU per ml reaktionsblanding målt ved 30°C) og inkuberes ved 22°C under svag omrøring.

10 Efter 48 timers inkubation måles koncentrationen af uorganisk cyanid i reaktionsblandingen.

Ved anvendelse af cyanidomdannende enzym fra DSM nr. 4009 var cyanidrestkoncentrationen under 0,03 ppm. Ammoniak-koncentrationen var ca. 1.000 mM.

15 Ved et kontrolforsøg (dvs. uden enzymtilsætning) for svandt mindre end 5% af det oprindelige cyanid på grund af luftuddrivning.

20 Eksempel 5

TEST FOR VARMESTABILITET

Testen beskrevet i eksempel 3 gentages bortset fra, 25 at temperaturen er 45°C. Efter inkubation i 4 timer måles koncentrationen af uorganisk cyanid i reaktionsblandingen.

Ved anvendelse af cyanidomdannende enzym fra DSM 4009 var restkoncentrationen af uorganisk cyanid mindre end 0,03 ppm.

30

TEST FOR VARMESTABILITET

Eksempel 6 16

DK 160564 B

5 Testen beskrevet i eksempel 2 gentages, bortset fra at temperaturen er 45°C. Efter inkubation i 4 timer måles koncentrationen af uorganisk cyanid i reaktionsblandingen.

Ved anvendelse af cyanidomdannende enzym fra DSM 4009 var restkoncentrationen af uorganisk cyanid mindre end 0,03 10 ppm.

Eksempel 7 15 TEST FOR STABILITET OVER FOR ACETONE (5%)

Pufferen fra Eksempel 1 indeholdende 5% acetone (rum-fang/rumfang) gøres 100 mM med hensyn til NaCN. Denne opløsning (totalt rumfang 10 ml, pH-værdi indstillet til 7,5 med fosfor-20 syre) behandles med 13 IU cyanidomdannende enzym og inkuberes under svag omrøring ved 22°C. Efter inkubation i 3 timer måles koncentrationen af uorganisk cyanid i reaktionsblandingen.

Ved anvendelse af cyanidomdannende enzym fra DSM nr. 4009 var restkoncentrationen af uorganisk cyanid under 0,03 2 5 ppm.

Eksempel 8 30 TEST FOR STABILITET OVER FOR ACETONE (10%)

Testen beskrevet i eksempel 7 gentages bortset fra, at den vandige opløsning indeholder 10% (rumfang/rumfang) acetone. Efter inkubation i 5 timer måles koncentrationen af 35 uorganisk cyanid i reaktionsblandingen.

17

DK 160564 B

Ved anvendelse af cyanidomdannende enzym fra DSM 4009 var restkoncentrationen af uorganisk cyanid under 0,03 ppm.

5 Eksempel 9 TEST FOR STABILITET OVER FOR METHACRYLNITRIL (100 mM)

Tretten enheder af det cyanidomdannende enzym sættes 10 til 10 ml 0,1 M phosphatpuffer (0,1 M NaCN, 0,1 M methacryl- nitril, pH-værdi 7,5). Efter inkubation i 2,3 timer ved ca.

22°C måles koncentrationen af uorganisk cyanid.

Ved anvendelse af cyanidomdannende enzym fra DSM nr.

4009 var restkoncentrationen af uorganisk cyanid under 0,03 15 ppm. Methacrylnitril blev ikke nedbrudt i reaktionsblandingen, hvilket blev vist ved HPLC analyse med en "reverse phase" C,0- lo søjle.

20 Eksempel 10 TEST FOR STABILITET OVER FOR METHACRYLNITRIL (200 mM)

Testen beskrevet i eksempel 9 gentages bortset fra, 25 at opløsningen indeholder 200 mM methacrylnitril og koncentrationen af uorganisk cyanid måles efter inkubation i 5,5 timer.

Ved anvendelse af cyanidomdannende enzym fra DSM 4009 var restkoncentrationen af uorganisk cyanid i reaktionsblandingen under 0,03 ppm. Koncentrationen af methacrylnitril forblev 30 konstant under forsøget.

TEST FOR STABILITET OVER FOR ACRYLNITRIL (100 mM)

Eksempel 11 18

DK 160564 B

5 25 IU af det cyanidomdannende enzym sættes til 10 ml af en 0,1 M phosphatpuffer (0,12 M NaCN, 0,1 M acrylnitril, pH-værdi 7,5). Efter inkubation i 2 timer ved 25°C måles koncentrationen af uorganisk cyanid.

Ved anvendelse af cyanidomdannende enzym fra DSM nr.

10 4009 var restkoncentrationen af uorganisk cyanid under 0,03 ppm. Acrylnitril blev ikke nedbrudt, hvilket blev vist ved HPLC analyse med en "reverse phase" C^g-søjle.

15 Eksempel 12 TEST FOR STABILITET OVER FOR ACRYLNITRIL (200 mM)

Testen beskrevet i eksempel 11 gentages bortset fra, 20 at den vandige opløsning indeholder 1,2 IU enzym pr. ml og 200 mM acrylnitril.

Ved anvendelse af cyanidomdannende enzym fra DSM 4009 blev 98,4% af det oprindelige uorganiske cyanid nedbrudt efter 2,5 timer. Efter 6 timer var restkoncentrationen af uorganisk 25 cyanid under 0,03 ppm.

Eksempel 13

30 TEST FOR STABILITET OVER FOR ACRYLNITRIL OG METHACRYLNITRIL

Den omhandlede cyanidase sættes til en 0,1 M fosfatpuffer (0,05 M NaCN, 0,05 M methacrylnitril, 0,05 M acrylnitril, pH 7,5) til en koncentration på 0,8 IU/ml reaktionsblan-35 ding. Efter 4 timers inkubation ved 22°C måles koncentrationen af cyanid.

19

DK 160564 B

Ved anvendelse af cyanidomdannende enzym fra DSM 4009 var restkoncentrationen af uorganisk cyanid under 0,03 ppm. Acrylnitril og methacrylnitril var ikke nedbrudt i reaktionsblandingen.

5

Eksempel 14

TEST FOR STABILITET OVER FOR METHANOL

10

Det cyanidomdannende enzym fra DSM 4009 blev afprøvet for dets aktivitet og stabilitet i nærværelse af forskellige methanolkoncentrationer (herefter forkortet MeOH). De opnåede resultater er anført i Tabel IA og IB.

20

DK 160564 B

Tabel IA

%MeOH Startaktivitet* (v/v) (%) 5 0 = kontrol 100 10 98 - 100 20 60 - 66 30 11 - 15 10

Tabel IB** % Restaktivitet %MeOH % Restaktivitet 15 efter 6 dage (v/v) efter 5 dage 90 0 85 66 10 20 23 20 * Startaktiviteten blev målt ved 22°C, pH 7,5 og en substratkoncentration på 60 mM NaCN i 0,1 M. fosfatpuffer. Reaktionsblandingen (10 ml) indeholdende 5 IU cyanidomdannende enzym anbragtes i glasprøverør med teflonforede skruelåg og 25 monteredes i et rotationsapparat. Det anvendte enzym var et immobiliseret præparat fremstillet ved tværbinding af DSM 4009-celler med glutaraldehyd ved almindelige immobiliseringsmetoder .

30 ** Reaktionsblandingerne fra Tabel IA opbevaredes (tæt tillukkede) i henholdsvis 5 og 6 dage ved 22°C i laboratoriet. Enzymgranulatet blev udvundet ved centrifugering, vaskedes én gang med fosfatpuffer og undersøgtes for aktivitet som beskrevet ovenfor.

35

Eksempel 15 21

DK 160564 B

AFGIFTNING AF CYANID I SPILDEVAND FRA ET ZINKGALVANISERINGSBAD

5 Skyllevand fra et galvaniseringsanlægs alkaliske zinkbad indeholdende frit cyanid og zink behandles med en cyanidase ifølge opfindelsen.

Med enzymet fra DSM 4009 i en mængde på 0,6 IU per ml spildevand indeholdende 62 ppm frit cyanid og 50 ppm zink, 10 reduceredes koncentrationen af frit cyanid til mindre end 1 ppm efter 1,5 timers omsætning ved 22°C. Reaktionsblandingens pH blev iagttaget til 7,5 ± 0,5 under hele forsøget 15 Eksempel 16

AFGIFTNING AF CYANID FRA ET ZINKGALVANISERINGSBAD

Spildevandet fra Eksempel 15 fortyndedes 3 gange med 20 vandværksvand, hvorefter det viste sig at indeholde 20 ppm frit cyanid og 17 ppm zink.

Med cyanidasen fra DSM 4009 i en koncentration på 0,6 IU per ml reaktionsblanding reduceredes koncentrationen af frit cyanid til mindre end 1 ppm på 30 minutter ved 22°C. Under 25 omsætningen blev pH iagttaget til at være 7,5 i 0,5 under hele forsøget

Eksempel 17 30

AFGIFTNING AF CYANID I SPILDEVAND FRA MARCIPANFREMSTILLING

Cyanidasen fra DSM 4009 anvendtes til afgiftning af spildevand fra afbitring af abrikoskerner ved fremstillingen af 35 marcipan. Spildevandet indeholdt 95 ppm frit cyanid. Ved at omsætte dette spildevand ved 22°C i 4 timer med 0,6 IU cyani- 22

DK 160564 B

dase per ml reaktionsblanding, mens blandingens pH holdtes på 7,5 ved tilsætning af fortyndet natriumhydroxid, blev cyanidindholdet reduceret til mindre end 1 ppm frit cyanid.

5

Eksempel 18

AFGIFTNING AF CYANID I NÆRVÆRELSE AF METALIONER

10 Cyanidasen fra DSM 4009 anvendtes til afgiftning af 2+ 2+ 2+ 3+ cyanid i opløsniger af metalioner (Zn , Ni , Fe , Fe ) i pufferen fra Eksempel 1.

Ved at omsætte opløsninger af hver af ovennævnte metalioner indeholdende frit cyanid med den omhandlede cyani-15 dase, blev indholdet af frit cyanid reduceret som vist i Tabel II og III nedenfor.

Tabel II

20 Reduktion af frit cyanid i opløsniger på 2 mM metalion og 60 mM NaCN, pH 7,8

Cyanidase CN~ ved IU/ml 72 timer 25 Metal reaktionsbi. ppm

Zn2+ 0,41 0,03

Ni2+ 0,43 0,3

Fe2+ 0,44 0,03 30 Fe3+ 0,40 0,03

Kontrol 0,33 0,03

Tabel III

23

DK 160564 B

Reduktion af frit cyanid i opløsninger på 4 mM metalion og 120 mM NaCN, pH 7,8 5

Cyanidase CN ved IU/ml 22 timer

Metal reaktionsbi. ppm 10 Zn2+ 0,67 0,03

Ni2+ 0,67 0,03

Fe2+ 0,64 0,03

Fe3+ 0,58 0,03

Kontrol 0,70 0,03 15

Af tabellerne fremgår det, at det omhandlede cyanidase enzym er effektivt til at reducere væsentlige cyanidmængder til meget lave niveauer i nærværelse af forskellige metalioner .

20

Eksempel 19 TEST FOR STABILITET VED OPBEVARING 25

Vaskede celler, der er fremstillet som beskrevet i eksempel 20, opbevares i klare glasflasker (0,1 M phosphatpuf-fer, pH-værdi 7) i laboratoriet under almindelige lysforhold og ved en temperatur på 22°C ± 2°C.

30 Efter 30 dages opbevaring var der stadig mere end 95% af den oprindelige enzymaktivitet i cellerne ved anvendelse af et enzym fra DSM 4009.

Eksempel 20 24

DK 160564 B

Dyrkning af stammer (DSM 4009) 5 Stammerne blev opbevaret på plader med næringsvæske indeholdende 2% agar. Næringsvæske købtes fra Difco Laboratories (Detroit, Michigan, USA). Flydende dyrkning blev udført i 500 ml rystekolber indeholdende 100 ml næringsvæskemedium tilsat 1% glycerol. Inkubering ved 30°C i ca. 24 timer 10 under god beluftning. Induktion af cyanidomdannende enzymer blev foretaget efter 8-10 timers vækst ved tilsætning af NaCN (1 mM) til den voksende kultur. Bakterieceller blev udvundet ved centrifugering, og de blev vasket og opbevaret ved 4°C eller frysetørret. Om ønsket kan de cyanidomdannende enzymer iso-15 leres og renses ved hjælp af velkendte metoder.

Eksempel 21 20 Fremstilling af enzympræparat (hele celler) fra DSM 4009

Celler, der var dyrket som i Eksempel 20, høstedes ved centrifugering og vaskedes en til tre gange med 0,1 M fosfatpuffer (pH 7).

25 Vaskede cellesuspensioner med forskellige celletæt- heder (og dermed forskellig aktivitet) opbevaredes ved 4°C i 0,1 M fosfatpuffer. Alternativt blev vaskede cellesuspensioner frysetørret eller opbevaret ved -25°C.

Vaskede cellesuspensioner anvendtes ved de forsøg, 30 der er beskrevet i Eksemplerne 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 17 og 19.

Eksempel 22 25

DK 160564 B

Fremstilling af et immobiliseret cellepræparat af DSM 4009 5 Den cellebundne cyanidase fra DSM 4009 blev immobili- seret ved tværbinding af hele vaskede celler (fremstillet som beskrevet i Eksempel 21) ved almindelige immobiliseringsteknikker under anvendelse af f. eks. glutaraldehyd som tværbindingsmi dde 1.

10 Celler immobiliseret ved tværbinding med glutar aldehyd anvendtes i Eksemplerne 4, 14 og 18

Claims (9)

1. Cyanidomdannende enzym af bakteriel oprindelse kendetegnet ved, at det er aktivt i nærværelse af uorganisk cyanid i en koncentration på over 10 mM, er i stand til at 15 formindske indholdet af uorganisk cyanid til under 1 ppm, at cyanid omdannes til myresyre (format) og ammoniak, og at det er identisk med det enzym, der kan dannes af stammer tilhørende slægten Alcalicenes .

2. Enzym ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det er 20 identisk med det enzym, der kan dannes af stammen Alcaliaenes denitrificans subsp. denitrificans DMS 4009 eller stammen Alcaliqenes denitrificans subsp. denitrificans DMS 4010, eller mutanter heraf med væsentlig samme egenskaber.

3. Enzym ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, 25 at det kan omdanne cyanid i nærværelse af organiske opløsningsmidler, såsom methanol eller acetone, eller nitriler, såsom aerylnitril eller methaerylnitril.

4. Enzym ifølge krav 1, 2 eller 3, kendetegnet ved, at det kan omdanne cyanid ved temperaturer over 40°C. DK 160564 B

5. Enzym ifølge et vilkårligt af kravene 1 til 4, kendetegnet ved, at det er i stand til at omdanne cyanid i nærværelse af metalioner, såsom fra zink (Zn2+), nikkel (Ni2+) , jern (Fe2+, Fe3+) , guld (Au+) eller sølv (Ag+) .

6. Fremgangsmåde til fremstilling af et cyanidomdannende enzym ifølge krav 1, kendetegnet ved, at en stamme tilhørende slægten Alcaliaenes. dyrkes i nærværelse af kilder for assimilerbart nitrogen, carbon og oxygen samt essentielle næringsstoffer, og at det cyanidomdannende enzym 10 efterfølgende udvindes på i og for sig kendt vis.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendetegnet ved, at stammen er Alcaliaenes denitrificans subsp. denitrificans DMS 4009 eller stammen Alcaliaenes denitrificans subsp. denitrificans DMS 4010 eller mutanter heraf med væsentlig 15 samme egenskaber.

8. Enzympræparat, kendetegnet ved, at det indeholder et enzym ifølge et vilkårligt af kravene 1 til 5, der er til stede som intakte celler, behandlede celler, tørrede celler, rå celleekstrakt eller rent enzym, enten 20 alene eller i blanding med et passende additiv, hvilket præparat kan være i tværbundet eller immobiliseret form.

9. Anvendelse af et enzympræparat ifølge krav 8 til afgiftning af cyanid i spildevand, såsom industriproces-vand eller spildevand, der indeholder metalioner.