DK159459B - Fremgangsmaade til immobilisering af carbonhydrid-udnyttende mikroorganismer paa en plastbaerer og anvendelse af de fremstillede plastbaerere, hvorpaa mikroorganismerne er blevet immobiliseret - Google Patents

Description

i

DK 159459 B

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til immobilisering af carbonhydrid-udnyttende mikroorganismer på en plastbærer.

Fra American Chemical Society (ACS) Symp. Ser. V 106, 1979, s. 73-86, er det kendt at immobilisere mikroorganismer såsom Pseudomo nas 5 aeruginosa på en plastbærer såsom polyvinylchlorid (PVC) og smelte-blæste polypropylen (PP) net. Pseudomonas aeruginosa immobiliseres på små stykker PVC (mindre end 1 cm^), som er løst pakket i en glas-søjle. Det tomme volumen fyldes med en steril mineralsaltopløsning.

Mineralsaltopløsningen inokuleres med en kultur af Pseudomonas aeru 10 ginosa ATCC 13388 i oksekødafkog. Mikroorganismen vokser på PVC-pla-sten under anvendelse af blødgøringsmidlerne i PVC som carbonkilde.

I artiklen fra ACS Symp. Ser. hævdes det, at plasten kan tjene som den eneste carbonkilde, der er nødvendig for opformeringen af bakterier, men at en yderligere carbonkilde fremmer den indledende fastgø-15 relsesfase på grund af en bedre adhæsion for et stort antal hurtigt formerende bakterier, hvilke bakterier bliver fastgjort som et nyt lag oven på det lag af bakterier, som sidder på plastoverfladen.

Med vand blandbare substrater som glucose og methanol nævnes som yderligere carbonkilder. I ACS Symp. Ser. V 106, 1979, s. 73-86, 20 beskrives endvidere, hvorledes Pseudomonas aeruginosa immobiliseres på polypropylen (PP). Smelteblæste, fine PP-tråde, som er inerte, underkastes først plasmabehandling for at forøge PP-nettets evne til at fastgøre bakterier. Derefter immobiliseres Pseudomonas aeruginosa-cellerne på plastfladerne ved at nedsænke plasten i en voksende 25 Pseudomonas aeruginosa-kultur i 72 timer.

Det har nu vist sig, at carbonhydrid-udnyttende mikroorganismer overraskende kan immobiliseres bedre på plastbærere, hvis immobiliseringen udføres i et vandigt næringsmedium, hvortil der er sat en mindre mængde af et med vand ikke blandbart carbonhydridsubstrat. En vigtig 30 fordel ved denne fremgangsmåde er, at plastbærerne ikke behøver at blive underkastet en plasmaforbehandling af plastoverfladen, og det er heller ikke nødvendigt, at de indeholder blødgøringsmidler. Den foreliggende opfindelse tilvejebringer således en fremgangsmåde til

DK 159459 B

2 immobilisering af én eller flere carbonhydrid-udnyttende mikroorganismer på en plastbærer, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at immobiliseringen udføres i et vandigt næringsmedium, hvortil der er sat et med vand ikke blandbart carbonhydridsubstrat i en mængde 5 på 0,1-3 ml pr. 100 cm^ plastbærerfladeareal.

Det med vand ikke blandbare carbonhydridsubstrat kan hensigtsmæssigt være et lineært eller cyclisk carbonhydrid eller en blanding deraf. Fortrinsvis vælges det med vand ikke blandbare carbonhydridsubstrat blandt gruppen bestående af alkaner med 12-18 carbonatomer eller 10 blandinger deraf. ~

De mest foretrukne carbonhydridsubstrater er hexadecan og dodecylcy-clohexan. Det vandige næringsmedium, hvoraf der skal være tilstrækkeligt til at nedsænke plastbæreren eller plastbærerne, omfatter hensigtsmæssigt assimilerbare nitrogenkilder og essentielle mineralsal-15 te.

Temperaturen, ved hvilken fremgangsmåden ifølge opfindelsen udføres, ligger fortrinsvis i området 25-37°C. Egnede plastbærere er syntetiske polymerer, blandt hvilke gruppen bestående af polytetrafluorethy-len, nylon, polyethylen og polyvinylchlorid foretrækkes. Af disse po-20 lymerer er polytetrafluorethylen og polyethylen de mest foretrukne. Mikroorganismer, som udnytter carbonhydrider som næringsmateriale, omfatter gærceller, fungi, alger og bakterier. Mikroorganismer, som fortrinsvis anvendes i fremgangsmåden ifølge opfindelsen, vælges blandt slægterne Mycobacterium, Corynebacterium, Arthrobacter og 25 Pseudomonas. Foretrukne arter er Mycobacterium rhodochrous 7E1C NCIB 9703, Mycobacterium lacticolum NCIB 9739 og Pseudomonas aeruginosa 473 (først beskrevet af Thijsse og van der Linden i Ant,v.Leeuwenhoek 24, 1958).

Den foreliggende opfindelse angår endvidere anvendelse i biokemiske \ 30 reaktorer af en plastbærer, hvorpå mikroorganismer er blevet immobi-liseret ifølge fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse. Den mikroorganisme-holdige plastbærer kan anvendes i fremgangsmåder til fjernelse af tungmetaller som beskrevet i ACS Symp. Ser. V 106, s.

73-86, 1979, og til omdannelse af carbonhydrider til syrer.

DK 159459 B

3

Den foreliggende opfindelse illustreres nærmere i de følgende eksempler.

Figur i viser resultaterne fra eksempel 3. Figuren angiver mængde protein i underlaget og i supernatanten i forhold til forskellige 5 volumenmængder hexadecan i rystekolber indeholdende autoklaveret polyethylen, Finnerty-medium og hexadecan. Proteinmængderne blev målt efter vækst af Mycobacterium rhodochrous på PE i 5 dage.

Figur 2 viser resultaterne fra eksempel 4. Figuren viser omdannelse af dodecylcyclohexan til cyclohexyleddikesyre under anvendelse af M.

10 rhodochrous immobiliseret på polyethylen.

EKSEMPEL 1

Immobilisering af mikroorganismer på polytetrafluorethylen (PTFE) i nærværelse af enten hexadecan, glucose eller natriumacetat

Autoklaverede rystekolber (250 ml) indeholdende underlaget (150 cm x 15 0,3 cm PTFE-bånd), 100 ml Finnerty-medium* (syntetisk mineralsalt medium), og enten 0,25% v/v hexadecan, 0,2% v/v glucose eller 0,5% v/v natriumacetat blev inokuleret med den ønskede organisme. Nogle organismer krævede nærværelse af 0,01% gærekstrakt til vækst. Organismerne blev dyrket ved 30“C på et rysteapparat med orbitalbevægeIse 20 ved 220 rpm i 4-5 dage. Mængden af celler på underlaget og i supernatanten blev analyseret ved proteinbestemmelse (som beskrevet i J. Biol. Chem. 193:262, 1951) med efterfølgende opløsning i 0,5N NaOH.

DK 159459 B

4 *

Sammensætning af Finnerty-medium gl'^ ' (NH4)2S04 5 5 KH2P04 4

Na2HP04 6

MgS04.7H20 0,2

CaCl2.2H20 0,05

FeS04 0,01 10 _

Mediets pH-værdi: 7,0

Resultaterne er udtrykt som g protein/m^ -underlag (tabel I) og som forholdet mellem totalprotein på underlaget og totalprotein i super-natanten (tabel II).

15 EKSEMPEL 2

Immobilisering af flere mikroorganismer på polyethylen (PE) i nærværelse af enten hexadecan, glucose eller natriumacetat

Immobiliseringen blev udført i lighed med eksempel 1 med undtagelse af, at polyethylenbåndet blev autoklaveret løst pakket på grund af 20 dets tendens til at sammenføjes til en kompakt masse igen. Resultaterne er vist i tabel I og tabel II.

- --¾¾ \

DK 159459 B

5

TABEL I

Mængde (g protein/m^ underlag)

PTFE

5 Hexadecan Glucose Natriumacetat M. rhodochrous 7E1C NCIB 9703 6,9 1,2 0,005 C. hydrocarboxydans 10 ATCC 21761 1,7 0,34 0,16

Ps. aeruginosa 473 2,3 0,60 0,32 A. paraffinens DSM 312 3,8 - M. lacticolum NCIB 9739 7,1 -

POLYETHYLEN

15 Hexadecan Glucose Natriumacetat M. rhodochrous 7E1C NCIB 9703 10,5 2,6 0,008 C. hydrocarboxydans 20 ATCC 21761 2,4 0,24 0,20

Ps. aeruginosa 473 5,9 1,4 0,55 A, paraffineus DSM 312 6,6 - M. lacticolum NCIB 9739 5,9 25 M = Mycobacterium C = Corynebacterium

Ps = Pseudomonas A = Arthrobacter 30 « ikke udført

DK 159459B

6

TABEL II

Forholdet mellem protein på underlaget og protein i supernatanten

5 PTFE

Hexadecan Glucose Natriumacetat M. rhodochrous 7E1C NCIB 9703 6,4 0,24 0,006 10 C. hydrocarboxydans ATCC 21761 1,4 0,05 0,03

Ps. aeruginosa 473 0,35 0,10 0,05 A. paraffineus DSM 312 1,6 - M. lacticolum NCIB 9739 17,7 -

15 POLYETHYLEN

Hexadecan Glucose Natriumacetat M. rhodochrous 7E1C NCIB 9703 / 33,0 0,30 0,005 20 C. hydrocarboxydans ATCC 21761 0,88 0,02 0,02

Ps. aeruginosa 473 0,63 0,08 0,04 A. paraffineus DSM 312 1,2 M. lacticolum NCIB 9739 5,8 - 25

De i tabel I og II angivne data viser klart den væsentligt bedre immobilisering, som finder sted, når immobiliseringsprocessen udføres i nærværelse af det med vand ikke blandbare carbonhydridsubstrat hexadecan i forhold til de med vand blandbare substrater glucose og 30 natriumacetat.

\

DK 159459 B

7 EKSEMPEL 3

Virkning af substratkoncentrationen på immobiliseringen af Mycobacterium rhodochrous på PE

Rystekolber indeholdende autoklaveret polyethylen, Finnerty-medium 5 (100 ml) og hexadecan (0,25, 0,5, 1,0 eller 1,5% v/v) blev inkuberet på et rysteapparat med orbitalbevægelse (30eC, 220 rpm). Vækst på underlaget (overfladeareal ca. 50 cm^) og i supematanten blev målt efter 5 dage. Fig. 1 angiver værdierne ved forskellige volumenmængder hexadecan i kolben og for de mængder protein, som fremkommer i super-10 natanten i #ig/ml. En maksimal mængde (immobilisering).mikroorganismer på 50 crn^ PE forekommer ved en hexadecanmængde på 1,0% v/v, hvilket svarer til 1 ml hexadecan.

EKSEMPEL 4

Omdannelse af dodecylcyclohexan til cyclohexyleddikesyre under an-15 vendelse af M. Rhodochrous immobiliseret på polyethylen M. Rhodochrous blev dyrket på Finnerty-medium i nærværelse af polyethylen (som beskrevet i eksempel 2) og 0,5% dodecylcyclohexan i 4 dage. De immobiliserede celler (20,8 mg protein) blev .gensuspenderet i nitrogenfrit medium (100 ml) indeholdende 0,2% dodecylcyclohexan og.

20 inkuberet ved 30°C og 220 rpm. Prøver (2,5 ml) blev taget i tidsintervaller, syrnet med 5N svovlsyre og ekstraheret i diethylether.

Ekstrakten blev testet for cyclohexyleddikesyre under anvendelse af gasvæskechromatografi på 2 mm x 50 cm, 3% QV-1 på WHP 100/120, programmeret til 60-220°C ved 10° pr. minut med nitrogen (30 ml/min) som 25 bærerfase.

Dannelsen af cyclohexyleddikesyre er vist i fig. 2.

Claims (10)

1. Fremgangsmåde til immobilisering af én eller flere carbonhydrid-udnyttende mikroorganismer på en plastbærer, kendetegnet ved, at immobiliseringen udføres i et vandigt 5 næringsmedium, til hvilket der er sat et med vand ikke blandbart carbonhydridsubstrat x en mængde på 0,1-3 ml pr. 100 cm^ plastbærer-overfladeareal.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at plastbæreren ikke indeholder et blød-10 gøringsmiddel og ikke er plasmabehandlet.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at det med vand ikke blandbare carbonhydridsubstrat er valgt blandt alkaner med 12-18 carbonatomer eller blandinger deraf.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet ved, at det med vand ikke blandbare carbonhydridsubstrat er hexadecan eller dodecylcyclohexan.

5. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-4, kendetegnet ved, at immobiliseringen udføres ved en tem- 20 peratur, som ligger i området 25-37eC.

6. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-5, kendetegnet ved, at plastbæreren er valgt blandt poly-tetrafluorethylen, nylon, polyethylen og polyvinylchlorid.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 6, 25 kendetegnet ved, at plastbæreren er polytetrafluorethylen eller polyethylen.

8. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-7, kendetegnet ved, at de carbonhydrid-udnyttende mikroorganismer er valgt blandt slægterne Mycobacterium, Corynebacterium,

30 Arthrobacter og Pseudomonas. DK 159459 B

9. Fremgangsmåde ifølge krav 8, kendetegnet ved, at den eller de carbonhydrid-udnyttende mikroorganismer er Mycobacterium rhodochrous 7E1C NCIB 9703, Mycobacterium lacticolum NCIB 9739 og/eller Pseudomonas aeruginosa 473.

10. Anvendelse i biokemiske reaktorer af en plastbærer, hvorpå mi kroorganismer er blevet immobiliseret ifølge et hvilket som helst af kravene 1-9.