DK154804B - Fremgangsmaade til fremstilling af en modificeret levende pasteurella haemolytica vaccine - Google Patents

Description

1 DK 154804 B

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af en modificeret levende Pasteurella haemolytica vaccine, der er i stand til at inducere immunitet i kvag uden alvorlige bivirkninger.

Pasteurella haemolytica er kendt for at smitte kvæg og forårsage åndedrætssygdomme og har været impliceret i etiologien af 5 transportfebersyndromet. [Jensen m.fl., "Diseases of Feedlot

Cattle”, 3. udgave, Lea & Febiger, Philadelphia (1979), side 59-65]. For tiden bekæmpes pasteurellosis hos husdyr med varierende grad af held ved administration af vacciner, antimikro-bielle midler eller en kombination af disse.

10

Kendte vacciner til pasteurellosis indeholder dræbte hele celler (bakteriner), levende svækkede bakterier eller cellefraktioner, med eller uden en adjuvant. De manglede effektivitet i ugiftige doser.

15 I handelen værende bakteriner, der i reglen indeholder en eller flere stammer af formalindræbte Pasteurella, er uønskede på grund af flere faktorer. Mindst to doser af en. sådan vaccine givet med flere dages mellemrum, er nødvendigt til effektiv 20 beskyttelse (Collins, supra). De er ofte ikke vellykkede og har været iagttaget at forårsage forbigående endotolsisk chok [Larsonm.fi., J.Am.Vet.Med. Assn. 155:495(1969)].

Der kendes og anvendes også et antal kombinationsvacciner 25 indeholdende dræbt Pasteurella. For eksempel er dræbt Pasteu rella blevet kombineret til brug hos kvæg med kvæginfektionerne rhinotracheitis virus [Matsuoka m.fl., J.Am.Vet.Med.Assn. 160 (3):333 (1972)], med kvægparainfluenza-3 virus [Sampson m.fl.. Vet.Méd.Small Anim. Clin. 67(12):1354 (1972), amerikansk patent 50 nr. 3.501.770 og amerikansk patent nr. 3.526.696], i kvadriva- lent form med kvæginfektiøs rhinotracheitis virus, kvægviral diarré-mucosal sygdomsvirus og kvæg-parainfluenza-3 virus (amerikansk patent nr. 3.634.587) og med Salmonella typhimurium (amerikansk patent nr. 4.167.560). Fuglevacciner, især til 55 brug irod fjerkrækolera, indeholdende, dræbt Pasteurella alene

2 DK 154804 B

eller i kombination med andre bakterier eller virus kendes også.

Fuglevacciner og kvægvacciner indeholdende levende Pasteurella har også været udviklet.

5 Fornylig er en kvægvaccine til transportfeber, administreret ved intradermal injektion og omfattende en levende kultur af en markstamme af Pasteurella haemolytica i en hjerne/hjerte-in-fusionssuppe, beskrevet i amerikansk patent nr. 4.171.354.

jLQ Ribosomale vacciner fremstillet af forskellige organismer, herunder Pasteurella haemolytica, er beskrevet i belgisk patent nr. 857.014. En kaliumthiocyanat-ekstrakt af Pasteurella haemolytica serotype 1 viste sig at være immunogen og at frembringe kryds-immunitet hos mus over for Pasteurella multocida 15 type Å [Mukkur, Infect. Immun. 18(3):583 (1977)].

Indtil den foreliggende opfindelse har man ikke ment, at kemisk modifikation af Pasteurella bakterier og fremstilling af en sikker og meget effektiv vaccine til beskyttelse af dyr, 2Q især økonomisk vigtige dyr til menneskeføde, mod ødelæggelser ne af transportfeber og andre sygdomme, der står i forbindelse med Pasteurella, har været opnået. Vaccinen fremstillet af de hidtil ukendte modificerede Pasteurella organismer har også vist sig at være krydsbeskyttende mod forskellige markisola-25 ter af Pasteurella arter.

En side af fremgangsmåden ifølge opfindelsen består i sikre og effektive vacciner til beskyttelse af kvæg mod sygdomme i de . øvre åndedrætsorganer, der står i forbindel-2g se med Pasteurella infektion, herunder den, der almindeligvis kaldes transportfeber ("shipping fever"). Modificeret levende Pasteurella haemolytica monovalent vaccine er blevet'fremstillet til administration ad den subkutane, intranasale eller, fortrinsvis,intramuskulære vej. . tu administration 35 til kvæg indeholder denne -vaccine fortrinsvis fra ca.

3

DK 154804 B

7 11 1,0 x 10 til ca. 1,0 x 10 CFU (kolonidannende enheder) pr. dosis af de modificerede levende Pasteurella haemoly-5 tica organismer sammen med en egnet bærer og/eller stabi lisator. Vaccinen administreres i en eller to doser, fortrinsvis to, på fra 2,0 til 5,0 ml hver, afhængende af arten og størrelsen af dyret, der vaccineres, samt organismetallet, d.v.s. antallet af organismer pr. dosis.

10

En bivalent vaccine bestående af vaccinale mængder af den modificerede levende Pasteurella haemolytica og den i ans. nr. 1187/81 beskrevne modificerede levende Pasteurella multocida kan også anvendes.

ΤΠ administration til kvæg indeholder en sådan vaccine fra ca. 1,0 x io7 til ca. 1,0 x 10H CFU pr. dosis af hver af de modificerede levende Pasteurella stammer sammen med en egnet 20 bærer og/eller stabilisator. Denne vaccine kan administreres ad den subkutane, intranasale eller, fortrinsvis, intramusku-lære vej i en eller to doser, fortrinsvis to, på fra 2,0 ml til 5,0 ml hver.

25

En anden side af fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse består af den hidtil ukendte modificerede Pasteurella haemolytica organisme. Denne blev deponeret i The American Type Culture Collection i Rockville, Maryland, den 5. marts 1980 og har fået deponeringsnummer 31612. Organismerne er frit til-30 gængelige ved henvendelse efter udstedelse af den foreliggende ansøgning eller anden ækvivalent ansøgning i et andet land som patent for en periode af mindst 30 år eller mindst 5 år efter sidste forespørgsel.

35 4

DK 154804 B

Pasteurella bakterierne, der anvendes til at fremstille vaccinen fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, blev isoleret af lungevæv fra inficerede dyr og identificeret ved standard-identifikationsmetoder. Isolatet viste sig at være 5 virulente ved vaccination af mus og hamstere. Formering af bakterierne blev udført i et flydende medium bestående af tryptosesuppe suppleret med thiamin (Difco Laboratories, Detroit, Michigan). Tryptose-agar med 5% fåreblod blev anvendt som medium til at bestemme koloniegenskaberne af hver af Pa-10 steurella forældrebakterierne. Forældre Pasteurella stammen modificeres kemisk med acridiniumsalte, såsom 3,6-bis-dime-thylaminoacridiniumchlorid (acri di n-orange), 2,8(3,6)diamino- 10-methylacridiniumchlorid og 2,8(3,6)diaminoacridiniumchlorid (acriflavin HC1) i koncentrationer fra ca. 0,1 pg pr. ml til 15 ca. 150 pg pr. ml i et medium bestående af tryptose suppleret med thiaminsuppe. Organismerne passeres 10 til 30 gange. Efter modifikation ændres de morfologiske egenskaber af bakterierne fra glatte, skinnende og slimagtige kolonier med en diameter på 1,5 - 2,0 mm efter inkubation ved 37eC i 18 timer til ru, 20 matte og punktformede kolonier med en diameter på 0,5 - 1,0 mm efter inkubation. Der er ikke andre forskelle på baktierne før og efter modifikationen. Alle andre egenskaber er som beskrevet i Bergeys Manual of Determinative Bakterio1ogy, 8. udgave 1974. De kemisk modificerede bakterier kan dyrkes videre og 25 passeres i ethvert egnet vækstmedium, f.eks. i tryptoseboui1-Ion suppleret med thiamin, eller i det medium, som er beskrevet i den foreliggende ansøgning.

Vaccinen fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen 30 fremstilles ved standardmetoder, der er velkendt inden for faget, f.eks. ved at kombinere bakterierne med en egnet bærer og/eller stabilisator.

Opfindelsen angår således en fremgangsmåde til fremstilling af 35 en modificeret levende Pasteurella haemolytica vaccine, der er i stand til at inducere immunitet i kvæg uden alvorlige bivirkninger, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved kemisk modificering af den virulente Pasteurella haemolytica stamme

DK 154804 B

5 ATCC nr. 31611 ved 10 - 30 passager af den i nærværelse af et acridiniumsalt, hvorefter den opnåede modificerede bakterie Pasteurella haemolytica ATCC nr. 31612 dyrkes i et egnet vækstmedium og kombineres med en bærer til vaccinen.

5 DETALJERET BESKRIVELSE AF OPFINDELSEN.

Fremgangsmåde ifølge opfindelsen udføres hensigtsmæssigt ved, at vækstmediet har sammensætningen: 10

Bestanddele gram/liter vand

Lavmolekylært stof fremkommet ved hydrolyse af proteiner... 10,0 - 40,0 15 Saltsyrehydrolysat af casein. 5,0 - 20,0

Bankreatisk hydrolysat af casein, indeholdende alle aminosyrer, der oprindeligt findes i casein............ 5,0 - 20,0 20 eankreatisk hydrolysat af casein, indeholdende aminosyrer, peptider og større proteinfraktioner...... 5,0 - 20,0 Gærekstrakt................. 5,0 - 20,0 N.atriumchlorid.............. 0,5 - 3,0 25

Ovenstående bestanddele forenes og steriliseres ved autoklavering. En opløsning af 20,0 - 80,0 gram pr. liter saccharose steriliseres separat ved autoklavering og sættes 30 til de andre bestanddele, når den er kold. pH-værdien indstilles til 7,4 - 7,6 med 10N natriumhydroxidopløsning.

Fra 1 til 4 dele af vækstmediet indeholdende den modifice-de organisme forenes med 1 del stabilisator og lyofiliseres.

35 Et eksempel på en egnet stabilisator er følgende:

6 DK 154804 B

Opløsning 1

Bestanddele ’· Gram/liter vand

Kaliumhydroxid (vandfri) 0,2 - 0,8 L-glutaminsyre 0,5-2,0

Kaliumphosphat,dibasisk (vandfri) 1,0 - 4,0 5 Kaliumphosphat,monobasisk ( " ) 0,3 - 1,5

Saccharose 50,0 - 200,0

Bestanddelene forenes og steriliseres ved autoklavering.

10 Opløsning 2

Bestanddele Gram/liter vand

Gelatine (Knox) 100,0 - 300,0 15 Autoklaveret i 4 timer for at hydrolysere.

2 dele af opløsning 2 sættes til 3 dele af opløsning 1 for at fremstille stabilisatoropløsningen.

N

20 !§2i®£i22i_f2H§£i22_22_}£§i2iskjnodifikation_af_Pasteurella haem2lytica_vaccine_stammeiu

Pasteurella haemolytica forældrestammen, der blev anvendt til at fremstille den modificerede levende organisme 25 ifølge opfindelsen (ATCC nr. 31611) blev isoleret af lungevæv, der var aseptisk udtaget af en kalv, indleveret til University of Nebraska, Department of Veterinary Sciences, og som var død af transportfeber og frosset ved -50°C.

30

Prøver af det frosne væv blev optøet og udstreget på overfladerne af fåreblod-agar-plader. Efter inkubation ved 37°C i 24 timer blev iagttaget en ren kultur af kolonier, der lignede Pasteurella arter. Flere kolonier blev udvalgt 35 og podet på forsøgsmedier til identifikation. Resulta terne af prøverne viste, at organismen var Pasteurella

7 DK 154804 B

Andre kolonier af organismen blev podet på et medium af tryptosebouillin suppleret med thiamin. Efter inkubation ved 37°C i 24 timer blev foretaget en yderligere passage i samme medium. Et rumfang stabilisatoropløsning, som beskrevet ovenfor, blev sat til organismens vækst. Blandingen af vækst og stabilisator blev dispenseret i 2,0 ml portioner og underkastet lyofilisering. Den lyofi-- liserede forældreorganisme blev lagret ved 4°C. Kolonier 5 o af forældreorganismen efter inkubation ved 37 C i 24 timer var cirkulære, skinnende og alimagtige. Kolonierne var ca. 2,0 mm i diameter.

En lyofiliseret prøve af forældreorganismen blev rehydra-tiseret, podet på et medium af tryptosebouillon suppleret med 1,5 pg acriflavin HCl/ml og blev underkastet tre\ passager i denne bouillon. Ved følgende passager blev koncentrationen af acriflavin HCl forøget. Ved den 6.passage var koncentrationen.af acriflavin HCl 15,0 pg pr. ml.

15

Ved den 10. passage var kolonierne af organismen punktformede, matte og ru med en diameter på ca. 0,5 mm.

Jævnsides med forandringerne i størrelsen og egenskaberne 2q af kolonierne af de acriflavin-behandlede organismer blev iagttaget en udtalt reduktion i virulensen af de modificerede organismer. LD5Q-værdierne på mus for forældrestammen og de kemisk modificerede stammer var henholdsvis 2,9 x 103 og 7,3 x 106 CFU. På hamstere 25 var LD^q-værdierne for forældreorganismen og for den ke misk modificerede stamme henholdsvis 1,1 x 10^ og - 6,2 x 108 CFU.

Efter 12 passager i medium suppleret med acriflavin HCl blev 3Q den modificerede organisme passeret 15 gange i et medium, der ikke var suppleret med acriflavin HCl. Materialet fra den 15. passage gav LDsg-værdier på mus og hamster, der næsten var identiske med dem, der blev frembragt af materiale før passage i acriflavinfrit medium, men efter modifikation i acriflavin 25 HCl suppleret med medium, hvilket viser, at modifikationen er stabi1.

Claims (5)

8 DK 154804 B Fremstilling og anvendelse af den modificeredelevende Til fremstilling af en vaccine dyrkes yderligere mængder af den modificerede Pasteurella haemolytica (12.passage) i et egnet medium, såsom det der er beskrevet ovenfor kombineret med en stabilisator og lyofiliseret. Et ek-5 sempel på en stabilisator, der kan anvendes, er beskrevet ovenfor. Vaccinens anvendelse til og virkning på.kvæg er beskrevet i en artikel i American Journal af Veterinary Research, 10 Bind 44, No 10, (1983) side 1848-1852. v»

1. Fremgangsmåde til fremstilling af en modificeret levende Pasteurella haemolytica vaccine, der er i stand til at inducere immunitet i kvæg uden alvorlige: bivirkninger, kendetegnet ved, kemisk modificering af den ' virulente Pasteurella haemolytica stamme ATCC nr. 31611 ved 20 10-30 passager af den i nærværelse af et acridiniumsalt, hvorefter den opnåede modificerede bakterie Pasteurella haemolytica ATCC nr. 31612 dyrkes i et egnet vækstmedium og kombineres med en bærer til vaccinen.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1 til fremstilling af en yder ligere mængde af de modificerede Pasteurella haemolytica bakterier, kendetegnet ved, dyrkning af bakterierne i en tilstrækkelig tid.til at muliggøre vækst af en større mængde af bakterierne. 30

3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at vækstmediet er tryptosebouillon suppleret med thiamin.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, 35 at vækstmediet har sammensætningen: DK 154804 B Bestanddele Gram/liter vand Lavmolekylært stof fremkommet ved hydrolyse af proteiner... 10,0 - 40,0 Saltsyrehydrolysat af casein. 5,0' - 20,0

5 Pankreatisk hydrolysat af casein, indeholdende alle aminosyrer, der oprindeligt findes i casein............ 5,0 - 20,0 Pankreatisk hydrolysat af casein, jLo indeholdende aminosyrer, peptider og større proteinfraktioner...... 5,0 - 20,0 Gærekstrakt....... 5,0 - 20,0 v Natriumchlorid.............. 0,5 - 3,0 ]_5 5. Fremgangsmåde ifølge krav 2,3 eller 4, kendeteg net ved, at vækstmediet indeholder en stabilisator. 20 25 30 35