DK150814B - Fremgangsmaade til stabilisering af en vaccine indeholdende et levende virus og stabilisator til brug ved fremgangsmaaden - Google Patents

Description

150814

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til stabilisering af en vaccine som den i krav l's indledning angivne.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved det i krav l's kendetegnende del anførte.

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen anvendes som nævnt sorbitol, mannitol eller dulcitol. Det foretrækkes at anvende sorbitol.

Den delvis hydrolyserede gelatine med en molekylvægt på ca. 3000 har omtrent samme aminosyresammensætning som gelatine. Til forskel fra gelatind, som danner geler, men som er uopløselig i koldt vand, danner hydrolyseret gelatine ikke geler, men er opløselig i koldt vand og i andre almindelige væsker som mælk og appelsinsaft.

Vandige opløsninger indeholdende op til ca. 10% hydrolyseret gelatine forøger ikke deres viskositet væsentligt.

Over denne koncentration forøges viskositeten langsomt.

Ved ca. 50%'s koncentration er opløsningen ret viskøs.

I det følgende er anført den typiske aminosyresammensæt-ning af hydrolyseret gelatine:

Alanin 8,5%

Arginin 7,9%

Asparaginsyre 5,7%

Cystin 0,08%

Glutaminsyre 9,5%

Glycin 22,8%

Histidin 0,77%

Hydroxyprolin 13-14%

Isoleucin 1,3%

Leucin 2,9%

Lysin 4,2% 2 150814

Methionin 0,78¾

Phenylalanin 2,0¾

Prolin 13,8¾

Serin 3,3¾

Threonin 1,9¾

Tyrosin 0,40¾

Valin 2,4¾

Delvis hydrolyseret gelatine kan fremstilles ved enzymatisk hydrolyse af gelatine ved hjælp af et proteolytisk enzym, som f. eks. papain, chymopapain og bromelin, skønt andre kendte metoder til hydrolyse kan anvendes, f. eks. syrehydrolyse. Passende hydrolyseret gelatine kan fås fra firmaet Wilson and Co., Inc., Calumet City,

Illinois under varemærket S0L-U-PR0.

Den sure puffer kan være en hvilken som helst fysiologisk acceptabel puffer, som vil holde den ønskede pH-værdi på ca. 6 til ca. 6,5, f. eks. en phosphatpuffer, acetat-puffer eller citratpuffer. Foretrukkent en phosphatpuffer.

For lyofiliserede vacciner er vægtforholdet mellem gelatine, sorbitol og cellekultursubstrat, som f. eks. Medium 199 i forhold til vægten af natriumphosphatpufferen fra ca. 3 til ca. 8, foretrukkent ca. 5,5.

Ved et cellekultursubstrat forstås et næringssubstrat, som tillader vækst af celler in vitro. Særlige nærings-substrater er f. eks. Medium 199, Morgan et al., Proc.

Soc. Exp. Biol. & Med., 7_3: 1-8. 1950; Basal Medium Eagle,

Eagle, Science, 122, 501-504, 1955; In Vitro, bind 6, 2, 1970; Dulbecco's Modificeret Eagle's Medium, Dulbecco et al., Virology, 8, 396, 1959; Smith et al., J. Virol., 12, 185-196, 1960; In Vitro, bind 6, nr. 2. 1970; Minimum Essential Medium (Eagle), Science, 130, 432 (1959) og RPMI Media, Moore et al., 199, 519-524, 1967; In Vitro, bind 6, nr. 2, 1970.

150814 3

Medium 199 har følgende sammensætning:

Katalog nr. 12-109 med NaHCO^

Katalog nr. 12-110 uden NaHCO^

Katalog nr. 12-119 (Earle's BSS) med NaHC03

Aminosyrer: mq/liter L-Alanin 25,0 L-Arginin-HCl 70,0 L-Aspartinsyre 30,0 L-Cystein-HCl 0,1 L-Cystin 20,0 L-Glutaminsyre 67,0’ L-Glutamin 100,0 L-Glycin 50,0 L-Histidin-HCl-H20 22,0

Hydroxy-L-prolin 10,0 L-Isoleucin 20,0 L-Leucin 60,0 L-Lysin-HCl 70,0 L-Methionin 15,0 L-Phenylalanin 25,0 L-Prolin 40,0 L-Serin 25,0 L-Threonin 30,0 L-Tryptophan 10,0 L-Tyrosin 40,0 L-Valin 25,0

Vitaminer mq/liter p-Aminobenzoesyre 0,050

Ascorbinsyre 0,050 D-Biotin 0,010 4 150814 (fortsat)

Vitaminer mq/liter

Calciferol 0,100 D-Ca-pantothenat 0,010

Cholesterol 0,200

Cholin-chlorid 0,500 Γ olinsyre 0,010 i-Inositol 0,050

Menadion 0,010

Nicotinamid 0,025

Nicotinsyre 0,025

Pyridoxal-HCl 0,025

Pyridoxin-HCl 0,025

Riboflavin 0,010

Thiamin-HCl 0,010 DL-ce-Tocopherolphosphat (Na2) 0,010

Tween 80 5,000

Vitamin A-acetat 0,140

Andet mq/liter

Adenin-HCl-2H20 12,10

Adenosin-5'-monophosphorsyre, dihydrat (AMP) (muskel-adenylsyre) 0,20

Adenosin-5'-triphosphat, dinatrium, tetrahydrat (ATP) 1,08

Deoxyribose 0,50

Dextrose 1000,00

Glutathion (reduceret) 0,05

Guanin-HCl-H^O 0,33

Hypoxanthin 0,30

Ribose 0,50 5 150814 (fortsat)

Andet mg/liter

Natriumacetat-3H20 83,00

Thymin 0,30

Uracil 0,30

Xanthin 0,34

Uorganiske salte (12-119) (12-109)

CaCl2-2H20 265,0 186,0

Fe(N03)3-9H20 0,7 0,7 KC1 400,0 400,0 KH2P04 --- 60,0

MgS04-7H20 200,0 200,0

NaC1 6800,0 8000,0

NaHC03 2200,0 1400,0

Na2HP04-7H20 -- 90,0

NaH2P04-H20 140,0

Phenolrødt 10,0 20,0

En særligt foretrukken udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at den anvendte stabilisator hovedsageligt består af ca. 3,6 vægtdele delvis hydrolyseret gelatine, ca. 3,6 vægtdele sorbitol, ca. 1,1 vægtdele "Medium 199" og en sådan mængde phosphat-puffer, som er tilstrækkelig til at indstille pH-værdien på ca. 6,0 til ca. 6,5.

En særligt foretrukken udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at den anvendte stabilisator hovedsageligt består af ca. 3,6 vægtdele delvis hydrolyseret gelatine, ca. 53 vægtdele sorbitol, ca. 1,1 vægtdele "Medium 199" og en sådan mængde phosphat- 6 150814 puffer, som er tilstrækkelig til at indstille pH-værdien på ca. 6,0 til ca. 6,5.

En særligt foretrukken udførelsesform for fremgangsmåden ifølge krav 1 er ejendommelig v/ed, at der til vaccinen sættes ca. 2 til ca. 12 volumen stabilisator pr. volumen vaccine.

Opfindelsen angår endvidere en stabilisator til brug ved udøvelse af fremgangsmåden ifølge opfindelsen af den i indledningen til krav 7 anførte art. Stabilisatoren ifølge opfindelsen er ejendommelig ved det i krav 7's kendetegnende del anførte.

En stabilisatorblanding ifølge opfindelsen kan indeholde følgende bestanddele i følgende omtrentlige mængder:

Bestanddel Væqtdele

Delvis hydrolyseret gelatine 2-5

Sorbitol, mannitol eller dulcitol 2-55 Næringssubstrat (fast stof) 0,5 - 1,7 fysiologisk acceptabel puffer til justering af pH til 6,0 - 6,5 tilstrækkelig mængde Når det drejer sig om en flydende vaccine, er sorbitol normalt til stede i en mængde henimod den øvre del af intervallet, hvorimod når det drejer sig om en frysetørret vaccine, er sorbitol normalt til stede i en mængde henimod den nedre del af intervallet.

Den nærmere sammensætning af virusvaccinestabilisatoren ifølge opfindelsen er anført i det følgende. Formulering B foretrækkes for en frysetørret vaccine.

150814 7

A B

Delvis hydrolyseret gelatine 35,7 g 35,7 g

Sorbitol 526 g 35,7 g

Medium 199 11,06 g 11,06 g

Natriumphosphatpuffer, 1 M, pH 6,0 100 ml 100 ml

Destilleret vand til 1 liter til 1 liter

Stabilisatoren kan valgfrit, men dog foretrukkent, indeholde en lille mængde NaHCO^ og phenolrødt. Når det drejer sig om de ovenfor nævnte formuleringer, kan NaHCO^ være til stede i en mængde på ca. 1,2 g og phenolrødt i en mængde på ca. 0,01 g. Mens man ovenfor har anført detaljerede formuleringer, må det forstås, at variationen i mængdeforhold og koncentration af hver enkelt bestanddel kan tænkes.

Et rumfang vaccine i bulk fortyndes normalt med ca. 2 til ca. 12 rumfang stabilisator.

US patentskrift nr. 2 879 202 omhandler stabiliseringen af levende virale vacciner ved tilsætning af en alkohol med 6 hydroxylgrupper til vaccinen. Intet heri foregriber imidlertid den i det foregående beskrevne stabilisator og dens anvendelse. Fordelen ved opfindelsen er, at der tilvejebringes en forbedret stabilisator, som bevarer vaccinetiteren i længere tid end det hidtil har været muligt ved hjælp af til teknikkens stade hørende stabilisatorer. Eksemplerne i den foreliggende opfindelse viser f. eks., at vaccinetiteren var i alt væsentligt uændret efter opbevaring i 4 måneder for væskeformige vacciner (eksempel 1 i det følgende) og efter opbevaring 1 uge ved 27 °C i tilfælde af lyofiliseret vaccine (eksempel 3). I hvert tilfælde var titeren i alt væsentligt uændret ved afslutningen af opbevaringstiden. I modsætning hertil faldt titerne væsentligt ved afslutningen af opbevaringsperioden i tilfælde med en fra ovennævnte US patentskrift kendt stabilisator.

150814 8

De efterfølgende eksempler belyser den foreliggende opfindelse.

EKSEMPEL 1 80 ml mæslingeviruskoncentrat, som er blevet opbevaret ved -70 °C, optøs i et vandbad ved 25 °C og holdes derpå ved 4-8 °C. Det flydende viruskoncentrat deles derpå i to lige store portioner.

a) den ene portion af denne virusvæske fortyndes med 210 ml af den tidligere beskrevne sterile stabilisator med formulering B. Sammenblandingen udføres under aseptiske betingelser og i sterilt arbejdsområde af den såkaldte clean-bench type. Til forhindring af mikrobiel vækst sættes 10,5 neomycin til blandingen. Den fortyndede vaccine overføres til 2 ml glasampuller (0,7 ml vaccine pr. ampul), som umiddelbart efter flammeforsegles og opbevares 4-8 °C.

b) den anden portion behandles ligesom den første, med undtagelse af, at man i stedet for stabilisator ifølge formulering B anvender et standardiseret, kommercielt tilgængeligt vaccinefortyndingsmiddel (SPGA, som indeholder saccharose, phosphat, glutamin og albumin). Lager-holdbarheden af vaccinerne er beskrevet i efterfølgende tabel: 9 150814

Tid Titer^^ for flydende vacciner opbevaret ved 2 - 8 °C_

Stabilisator iflg. SPGA

formulering B_ Stabilisator 0 3,4 3,6 4 måneder 3,2 0,6

Titer udtrykkes som TCID^g/0,1 ml.

EKSEMPEL 2 32 ml mæslingeviruskoncentrat, som er blevet opbevaret ved -70 °C, optøs i et vandbad ved 25 °C og holdes derpå ved 4-8 °C. Det flydende viruskoncentrat deles derpå 1 to lige store portioner.

a) den ene portion af denne virusvæske fortyndes med 48 ml af den tidligere beskrevne sterile stabilisator med formulering B. Sammenblandingen udføres under aseptiske betingelser i sterilt arbejdsområde af typen clean-bench. Til forhindring af mikrobiel vækst sættes 2,5 mg neomycin til blandingen. Den fortyndede vaccine overføres til 2 ml glasampuller (0,7 ml vaccine pr. ampul), som umiddelbart efter flamme forsegles og opbevares ved 37 °C.

b) den anden portion behandles ligesom den første med undtagelse af, at man i stedet for stabilisator ifølge formulering B anvender stabilisator ifølge formulering A. Lagerholdbarheden af vaccinerne beskrives i efterfølgende tabel: 10 150814

Tid Titer^·*·^ for flydende vacciner opbevaret ved 37 °C_

Stabilisator med Stabilisator formulering B med formu-

_ lerinq A

0 2,9 2,7 24 timer 1,6 2,1 48 timer 1,2 1,8 72 timer 0,6 1,4 ^^ Titer udtrykkes som TCID^g/0,1 ml.

EKSEMPEL 3 80 ml mæslingeviruskoncentrat, som er blevet opbevaret ved -70 °C, optøs i et vandbad ved 20 °C og holdes derpå ved 4-8 °C. Det flydende viruskoncentrat deles i to lige store portioner.

a) den ene portion af denne virusvæske fortyndes i 210 ml af den tidligere beskrevne sterile stabilisator med formulering B. Sammenblandingen udføres under aseptiske betingelser i sterilt arbejdsområde af typen clean-bench. Til forhindring af mikrobiel vækst sættes 10,5 mg neomycin til blandingen. Den fortyndede vaccine overføres til 3 ml glasbeholdere (0,7 ml vaccine pr. beholder), som derpå frysetørres, tilproppes og opbevares ved 37 °C.

b) den anden portion virusvæske behandles som den første med undtagelse af, at man i stedet for stabilisator ifølge formulering B anvender et standardiseret, kommercielt tilgængeligt fortyndingsmiddel (Medium 199 indeholdende SPGA).

150814 π

Lagerstabiliteten af disse vacciner er beskrevet i efterfølgende tabel:

Tid Titer^·^ af frysetørret vaccine opbevaret ved 37 °C_

Stabilisator med SPGA

formulering B Stabilisator 0 3,5 3,5 7 dage 3,6 0,6

Titer udtrykkes som log TCID^g/0,1 ml.

EKSEMPEL 4

Frysetørret vaccine som fremstillet i eksempel 3 rekonstitueres med destilleret vand (0,7 ml pr. beholder) og opbevares ved 2-8 °C.

Lagerholdbarheden af disse vacciner er beskrevet i efterfølgende tabel: (1)

Tid Titer rekonstitueret vaccine opbevaret ved 2 - 8 °C_

Stabilisator med SPGA

formulering B Stabilisator 0 3,70 3,43 4 dage 3,17 2,20 1 uge 3,23 2 8 uger 3,03 tab (I0g/uge) 0,030 0,649

Titer udtrykkes som log TCID^g/0,1 ml.

Claims (5)

150814

1. Fremgangsmåde til stabilisering af en vaccine indeholdende et levende virus, specielt et mæslinge-, fåresyge-, røde hunde-, skoldkopper-, polio- eller hepatitis-, herpes simplex 1-, herpes simplex 2-virus eller kombinationer deraf, ved hvilken man til vaccinen sætter en stabilisator indeholdende sorbitol, mannitol eller dulci-tol, kendetegnet ved, at mængden af sorbitol, mannitol eller dulcitol udgør ca. 2 til ca. 55 vægtdele, og at stabilisatoren yderligere i hovedsagen består af ca. 2 til ca. 5 vægtdele delvis hydrolyseret gelatine med en molekylvægt på ca. 3000, ca. 0,5 til ca. 1,7 vægtdele cellekultursubstrat og en fysiologisk acceptabel puffer i en sådan mængde, at pH indstilles på ca. 6,0 til ca. 6,5.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at stabilisatoren indeholder sorbitol.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den anvendte puffer er en phosphatpuffer.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den anvendte stabilisator hovedsageligt består af ca. 3,6 vægtdele delvis hydrolyseret gelatine, ca. 3,6 vægtdele sorbitol, ca. 1,1 vægtdele af det i beskrivelsen definerede "Medium 199" som cellekultursubstrat-bestanddel og en sådan mængde phosphatpuffer, som er tilstrækkelig til at indstille pH-værdien på ca. 6,0 til ca. 6,5.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den anvendte stabilisator hovedsageligt består