DK149638B - Fremgangsmaade og apparat til separation af bakterier - Google Patents

Description

149638

Den foreliggende opfindelse vedrører en fremgangsmåde til separation af bakterier fra en væskeprøve indeholdende bakterier. Separationen sker i overensstemmelse med de i og for sig kendte gradientseparationsprincipper.

5 I "Encyclopedia of Chemical Technology" af Kirk-Othmer, 3. udgave, bind 5, pp. 214-218 er generelle principper for centrifugal- eller gradientseparation beskrevet sammen med kendte centrifugal- eller gradientseparationscentrifuger. Disse kendte centrifuger har cylindriske eller skålformede centrifugebeholdere.

10 I mange forskellige tilfælde er det ønskeligt at kunne separere bakterier fra en væskeprøve indeholdende bakterier, idet bakterieindholdet i prøven kan bestemmes, efter at bakterierne er separeret fra prøven ved simpel tælling af antallet af bakterier, der er separeret fra prøven, i et i og for sig kendt optisk måleapparat. Væskeprøven kan ha-15 ve en vilkårlig organisk oprindelse. Prøven kan således være en blodprøve eller en urinprøve eller en suspension eller opløsning af en fast prøve (fx en vandig opløsning eller en alkoholsuspension af en organisk komponent, fx en vævs- eller fødevareprøve). Et meget vigtigt eksempel på en væskeprøve indeholdende bakterier er en 20 mælkeprøve. Som man vil forstå bestemmes målingen af bakterieindhol det i den oprindelige væskeprøve i princippet af nøjagtigheden af separationen af bakterier fra væskeprøven. Følgelig er det af den yderste vigtighed at kunne foretage en meget nøjagtig separationsproces, ved hvilken udelukkende bakterierne separeres fra væskeprøven, 25 medens andre partikler, fx fedtdråber, blodceller eller lignende, ikke separeres fra væskeprøven.

Et formål med den foreliggende opfindelse er at tilvejebringe en fremgangsmåde af den ovenfor beskrevne type, i overensstemmelse med hvilken fremgangsmåde det bliver muligt at foretage en meget 30 nøjagtig separation af bakterier fra en væskeprøve indeholdende bakterier, idet andre partikler udelukkes fra at blive separeret fra væskeprøven, og i overensstemmelse med hvilken fremgangsmåde det er muligt at foretage separationen automatisk og med stor hastighed.

149638 2

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at fremgangsmåden udøves ved hjælp af en tallerkenlignende centrifugebehol-der, der har en øverste åbning, der afgrænses af en radialt indad rettet randdel, hvilken fremgangsmåde omfatter følgende sekvens af 5 trin: (a) rotation af centrifugebeholderen med stor rotationshastighed, (b) indføring af et volumen af en væskeformig komponent med stor massefylde i centrifugebeholderen, hvilken massefylde er større end bakteriernes massefylde, 10 (c) indføring af et volumen af en væskeformig komponent med lille massefylde i centrifugebeholderen, hvilken massefylde er mindre end massefylden af bakterierne, så at der dannes et tokomponent-gradi-entseparationslag i centrifugebeholderen, (d) indføring af en kontinuerlig strøm af væskeprøven med en masse-15 fylde, der er mindre end massefylden af den væskeformige komponent med lille massefylde, i centrifugebeholderen, hvorved bakterierne placeres i grænselaget mellem komponenterne med stor og lille massefylde i tokomponent-gradientseparationslaget, medens væskeprøven afgives gennem centrifugebeholderens øverste åbning, 20 (e) indføring af et skyllemiddel i centrifugebeholderen, idet skyl lemidlet afgives fra centrifugebeholderens øverste åbning, (f) decel leration af centrifugebeholderen og rotation af samme med lav rotationshastighed, (g) aktivering og bevægelse af en sugepipette fra en første stilling, i 25 hvilken pipetten har sin spids placeret i afstand fra inderfladen af centrifugebeholderens periferivæg, til en anden stilling, i hvilken pipetten har sin spids placeret grænsende op til inderfladen, så at væskesubstansen suges fra centrifugebeholderen, medens der indføres et volumen af en overføringsvæske i centrifugebeholderen uden afgi-30 velse af overføringsvæske gennem centrifugebeholderens øverste åbning, og (h) tilbageføring af sugepipetten til dens første stilling.

I overensstemmelse med den foreliggende opfindelse indføres komponenterne med stor og lille massefylde af tokomponent-gradientseparati-35 onslaget efter hinanden i centrifugebeholderen, medens denne ved hjælp af en tohastighedsmotor roterer med sin største rotationshastig- 149638 3 hed. Væskeprøven indføres i en kontinuerlig strøm og fremgangsmåden til separation af bakterier fra en væskeprøve indeholdende bakterier kan følgelig i princippet udføres som en kontinuerlig separationsproces. Ved indføringen af skyllemidlet i centrifugebeholderen, efter 5 at selve separationsprocessen er foretaget, skylles eventuelt materiale, der hæfter fast til tokomponent-gradientseparationslaget, fx fedtdråber eller lignende, bort og afgives fra centrifugebeholderens øverste åbning. Fjernelsen af tokomponent-gradientseparationslaget indeholdende bakterierne, der er separeret fra den oprindelige væs-10 keprøve, foretages i overensstemmelse med den foreliggende opfindelse ved hjælp af en sugepipette, der kan bevæges fra en første stilling til en anden stilling, i hvilken anden stilling pipetten har sin spids strakt ind i centrifugebeholderen, medens centrifugebeholderen renses ved hjælp af overføringsvæske.

15 I overensstemmelse med en foretrukken udførelsesform for opfindelsen omfatter denne følgende yderligere sekvens af trin efter trinene (a)-(h): (i) indføring af et lille volumen overføringsvæske i centrifugebeholderen uden afgivelse af væske gennem centrifugebeholderens øverste 20 åbning, (j) acceleration af centrifugebeholderen og rotation af denne med stor rotationshastighed og (k) gentagelse af trinene (f)-(h).

Ved indføring af et ekstra volumen af væsken i centrifugebeholderen 25 og acceleration af centrifugebeholderen til stor rotationshastighed bortskylles eventuelt resterende materiale af tokomponent-gradient-separationslaget eller eventuelle bakterier indeholdt i samme, fra centrifugebeholderen og overføres følgelig til målebeholderen.

For at rense centrifugebeholderen helt foretrækkes det at udføre føl-30 gende yderligere følge af trin efter trinene (a)-(k): (l) acceleration af centrifugebeholderen og rotation af samme med stor rotationshastighed, (m) intermitterende indføring af en strøm af skyllemidlet og varm luft i centrifugebeholderen i en spray til bortskylning af eventuelt mate- 35 riale, der hæfter fast til centrifugebeholderen, 149638 4 (n) deceleration af centrifugebeholderen og rotation af samme med lille rotationshastighed, (o) aktivering og bevægelse af sugepipetten fra dens første stilling til dens anden stilling, så at eventuel væskesubstans suges fra centrifu- 5 gebeholderen, og (p) tilbageføring af sugepipetten til dens første stilling.

I overensstemmelse med den foreliggende opfindelse kan væsken med fordel afgives fra centrifugebeholderens øverste åbning gennem et indsnit, som definerer en minimal bredde af centrifugebeholderens 10 radialt indad rettede randdel, så at der frembringes en forsinkelse af afgivelsen af væske fra centrifugebeholderen. Som følge af forsinkelsen af afgivelsen af væske fra centrifugebeholderen holdes væsken i centrifugebeholderen i et længere tidsrum, og følgelig kan tilførselshastigheden for væske til centrifugebeholderen forøges, så at der kan 15 opnås en større separationshastighed.

For at foretage separationen af bakterier fra væskeprøven indeholdende bakterier under kontrollerede betingelser foretrækkes det, at fremgangsmåden ifølge opfindelsen yderligere omfatter termostatering af centrifugebeholderen til en forudbestemt temperatur ved tilførsel af 20 luft med denne temperatur til centrifugebeholderen. Luften kan tilføres på en vilkårlig passende måde, fx nedefra, så at centrifugebeholderens ydre overflade holdes på den forudbestemte temperatur, og luften med den forudbestemte temperatur kan desuden eller i stedet tilføres til centrifugebeholderen oppefra, så at luften indføres i cen-25 trifugebeholderen gennem den øverste åbning af samme.

For at sikre, at den væske, som afgives fra centrifugebeholderens øverste åbning, ikke igen føres ind i centrifugebeholderen som følge af den sugevirkning, der frembringes, når centrifugebeholderen roterer med sin store rotationshastighed, foretrækkes det, at der 30 indføres en strøm af trykluft i centrifugebeholderen, medens denne roterer med sin store rotationshastighed. Trykluften er fortrinsvis termostateret til den nævnte forudbestemte temperatur, så at strømmen af trykluft yderligere tjener det formål at termostatere centrifugebeholderen.

149638 5 I en foretrukken udførelsesform for opfindelsen er den komponent med stor massefylde i tokomponent-gradientseparationslaget, som har en massefylde, der er større end massefylden af bakterierne, en vandig opløsning af dextran, og den komponent med lille massefylde i tokom-5 ponent-gradientseparationslaget, som har en massefylde, der er mindre end massefylden af bakterierne, er en vandig opløsning af saccharose. Overføringsvæsken, der tjener til at rense centrifugebeholderen, når tokomponent-gradientseparationslaget og de i dette indeholdte bakterier overføres fra centf rif ugebeholderen, og som desuden 10 tjener det formål at bortskylle eventuelt materiale af tokomponent-gra-dientseparationslaget og eventuelle bakterier indeholdt i dette, kan med fordel være en enzymopløsning, der desuden tjener det formål at forbehandle bakterierne til den ovenfor nævnte optiske tælleprocedure.

15 I den foretrukne udførelsesform for opfindelsen er centrifugebeholderens høje rotationshastighed af størrelsesordenen 45.000 omdrejninger pr. minut og centrifugebeholderens lave rotationshastighed af størrelsesordenen 250 omdrejninger pr. minut, det nettovolumen, som afgrænses i centrifugebeholderen, når denne roterer med sin høje 20 rotationshastighed, af størrelsesordenen 2 ml, volumenet af komponenten med stor massefylde i tokomponent-gradientseparationslaget af størrelsesordenen 0,5 ml, og volumenet af komponenten med lille massefylde i tokomponent-gradientseparationslaget er af størrelsesordenen 1,5 ml. Når centrifugebeholderen roterer med en rotationshas-25 tighed på 45.000 omdrejninger pr. minut, frembringes der et voldsomt virtuelt gravitationsfelt af størrelsesordenen 50.000 G i centrifugebeholderens indre rum, der har en indre diameter af størrelsesordenen 47 mm. Ved tilvejebringelse af et gravitationsfelt med en sådan ekstrem intensitet frembringes der en separation s kapacitet på 1,33 ml/s, 30 dvs. en 20 ml prøve separeres i løbet af 15 s.

Den foreliggende opfindelse vedrører desuden et apparat til separation af bakterier fra en væskeprøve indeholdende bakterier i overensstemmelse med den ovenfor beskrevne fremgangsmåde, hvilket apparat har 149638 6 en tallerkenlignende centrifugebeholder med en øverste åbning/ der afgrænses af en radialt indad rettet randdel, en tohastighedsmotor, der er forbundet til centrifugebeholderen, til selektiv rotation af denne med en lav rotationshastighed og en høj ro-5 tationshastighed, væsketilførselsorganer, der strækker sig ind i centrifugebeholderen til tilførsel af en komponent med stor massefylde, hvilken komponent har en massefylde, der er større end massefylden af bakterierne, til centrifugebeholderen, til tilførsel af en komponent med lille massefyl-10 de, hvilken komponent har en massefylde, der er mindre end massefylden af bakterierne, til centrifugebeholderen, til tilførsel af et skyllemiddel til centrifugebeholderen, til tilførsel af en overføringsvæske til centrifugebeholderen og til tilførsel af væskeprøven til centrifugebeholderen, samt 15 en sugepipette, der er monteret på en sådan måde, at den kan bevæges mellem en første stilling, i hvilken pipetten har sin spids placeret i afstand fra inderfladen af centrifugebeholderens perifere væg, og en anden stilling, i hvilken pipetten har sin spids placeret grænsende op til den nævnte inderflade, og som er indrettet til at blive aktiveret, 20 så at den suger væskesubstans fra centrifugebeholderen.

Ved hjælp af apparatet ifølge opfindelsen er det muligt at foretage separationen af bakterier fra en væskeprøve indeholdende bakterier i en automatiseret og meget nøjagtig separationsproces med høj hastighed.

Et specielt træk ved apparatet ifølge opfindelsen er sugepipetten, der 25 er monteret på en sådan måde, at den kan bevæges ind i centrifugebeholderen fra en første til en anden stilling. Ved brug af en sådan sugepipette opnås en meget pålidelig og nøjagtig overførsel af materiale, der er indeholdt i centrifugebeholderen, uden nogen risiko for beskadigelse af centrifugebeholderen, da sugepipettens spids altid 30 holdes ude af kontakt med centrifugebeholderens inderflade.

Selv om tilførselsorganerne kan udgøres af et enkelt organ til tilførsel af alle væsker og komponenter til centrifugebeholderen og kan ende i en vilkårlig del af denne, fx strække sig gennem centrifugebeholderens bundvæg, udgøres tilførselsorganerne fortrinsvis af individu-35 elle tilførselsrør, der strækker sig ind i centrifugebeholderen gennem 149638 7 den øverste åbning af denne til tilførsel af henholdsvis komponenten med stor massefylde, komponenten med lille massefylde, skyllemidlet, overføringsvæsken og væskeprøven.

Som forklaret ovenfor indføres der en strøm af trykluft i centrifuge-5 beholderen, medens denne roterer med sin høje rotationshastighed.

Trykluften tilføres fortrinsvis også fra et tilførselsrør, der strækker sig ind i centrifugebeholderen gennem den øverste åbning i centrifugebeholderen.

I overensstemmelse med en foretrukken udførelsesform for apparatet 10 ifølge opfindelsen har den tallerkenlignende beholder yderligere et indsnit, som definerer den minimale bredde af centrifugebeholderens radialt indadrettede randdel. Som følge af dette indsnit dannes der et væskereservoir inden i centrifugebeholderen, da væsken kun afgives fra centrifugebeholderens øverste åbning gennem indsnittet, og væs-15 ken holdes følgelig i centfrifugebeholderen i et længere tidsrum.

I den foretrukne udførelsesform for apparatet ifølge opfindelsen er den tallerkenlignende centrifugebeholder fremstillet af titan og har en indre overfladebelægning af polytetrafluorethylen. Centrifugebeholderens indre diameter er af størrelsesordenen 47 mm, og nettovolumenet 20 af centrifugebeholderens indre rum er af størrelsesordenen 2 ml. Ved tilvejebringelse af centrifugebeholderen som en titancentrifugebehol-der, opnås en meget stiv og stærk, men stadig ekstrem let centrifugebeholder.

Et ekstremt virtuelt gravitationsfelt af størrelsesordenen 50.000 G kan 25 frembringes i den ovenfor beskrevne centrifugebeholder ved rotation af centrifugebeholderen med den høje rotationshastighed, der er af størrelsesordenen 45.000 omdrejninger pr. minut. Centrifugebeholderens lave rotationshastighed er fortrinsvis af størrelsesordenen 250 omdrejninger pr. minut. I denne foretrukne udførelsesform for opfin-30 delsen er tohastighedsmotoren forbundet direkte til centrifugebeholderen via motorens aksel.

8 149638

Opfindelsen vil i det følgende blive nærmere forklaret under henvisning til tegningen, på hvilken fig. 1 viser et lodret snit gennem en foretrukken udførelsesform for et apparat til separation af bakterier fra en væskeprøve indeholdende 5 bakterier og fig. 2 delvis i snit og delvis skematisk den generelle separationsfremgangsmåde ifølge opfindelsen.

I fig. 1 er vist et apparat til separation af bakterier fra en væskeprøve indeholdende bakterier, fx en mælkeprøve. Apparatet er under 10 ét angivet med henvisningsbetegnelsen 10 og har en bunddel 11, på hvilken der er monteret en cylindrisk indkapsling 12. Den cylindriske indkapsling 12's 'nederste endedel er fastgjort til bunddeien 11 og optaget i en cylindrisk, periferisk udsparing i denne. Oven på den cylindriske indkapsling 12 er monteret et gulv 14. Gulvet 14 er i for-15 hold til den cylindriske indkapsling 12 fastgjort ved hjælp af en cylindrisk rand, der rager frem fra gulvet 14’s underside. I den cylindriske indkapsling 12 er indkapslet en motor 16. Motoren 16 er en tohastighedsmotor, der er indrettet til at frembringe en høj rotationshastighed af størrelsesordenen 45.000 omdrejninger pr. minut og 20 en lav rotationshastighed af størrelsesordenen 250 omdrejninger pr. minut. Motoren 16 har sin aksel 17 lejret i et topleje 18 og et bundleje 19, der er anbragt i henholdsvis gulvet 14 og bunddelen 11. Akselen 17 strækker sig forbi toplejet 18 og er ved sin øverste ende udformet med en konus 20, der spidser til indefter.

25 På akslen 17 er der monteret en tallerkenlignende centrifugebeholder 21, der ved sin nederste ende har en konisk reces, som spidser til udefter, med en tilspidsningsstigning, der er identisk med stigningen af akslen 17's konus 20, som spidser til indefter. Følgelig fastholder akslen 17's og den tallerkenlignende centrifugebeholder 21's konuser 30 centrifugebeholderen i forhold til motorakslen 17. Centrifugebeholderen 21, der er vist mere detaljeret i fig. 2, og som vil blive beskrevet nedenfor, har en konisk bunddel 22, en lodret cylindrisk del 23 og en indad rettet randdel 24, der afgrænser en øverste åbning 25 i centrifugebeholderen. I centrifugebeholderen 21's øverste åbning 25 35 har den indadrettede randdel 24 et indsnit 26, som definerer den 149638 9 minimale radiale bredde af randdelen. Centrifugebeholderen 21 har desuden et nedadragende adskillelsesskørt 27, der tjener det formål at forhindre væske i at komme i kontakt med toplejet 18. For yderligere at forhindre væske eller små dråber i at komme i kontakt med toplejet 5 18 tilføres der en luftstrøm, som yderligere tjener det formål at termostatere centrifugen til en forudbestemt temperatur, med den forudbestemte temperatur til centrifugebeholderen nedefra gennem et tilførselsrør, der ikke er vist på tegningen, så at der frembringes et adskillelseslufttæppe, som omslutter centrifugebeholderens nederste 10 del.

Oven på gulvet 14 er anbragt et hus 30, som indkapsler centrifugebeholderen 21. Huset 30 har i sin lodrette cylindriske sidevæg udløb 31, der tjener det formål at lede væske bort fra huset 30. Til tilførsel af en væskeprøve strækker der sig et tilførselsrør 32 ind i huset 30's 15 indre gennem en boring i huset 30 og videre gennem ceritrifugebehol- deren 21's øverste åbning 25 og ind i centrifugebeholderens indre.

Tilførsels røret 32 er fastgjort og tætnet i forhold til huset 30 ved hjælp af en tætningsring eller en pakning 33 og har i sin øverste ende en tilslutningsfitting 34, der tillader tilslutning til et passende 20 rør, som ikke er vist på tegningen. Tilførselsrøret 32 er indrettet til at blive forbundet til en ydre væskeprøvebeholder via en tilslutningsfitting 34 og det nævnte rør, der ikke er vist på tegningen.

I en anden cylindrisk boring i huset 30's top er placeret en sugepipette, der under ét er angivet med henvisningsbetegnelsen 40. Suge-25 pipetten 40 har et pipetterør 41, som strækker sig ind i huset 30's indre og videre gennem centrifugebeholderen 21's åbning 25 ind i centrifugebeholderens indre. I den øverste ende har pipetterøret 41 en tilslutningsfitting 42, der tillader tilslutning til ydre beholdere, der ikke er vist på tegningen, via passende rør og ventiler, der ikke 30 er vist på tegningen. Sugepipetten 40 har desuden et pipettehus 43, gennem hvilket pipetterøret 41 strækker sig. Som det fremgår af fig.

1, har pipetterøret 41 en stempeldel 44, der er monteret forskydeligt i pipettehuset 43. I pipettehuset 43 er der ligeledes anbragt en fjeder 45, som indgriber med stempeldelen 44's underside og forspænder 35 stempeldelen og dermed pipetterøret 41 udefter i forhold til huset 30's 149638 10 indre rum. En tilslutningsfitting 46 tilvejebringer adgang til oversiden af stempeldelen 44 og er indrettet til at blive forbundet til en trykluftkilde, der ikke er vist på tegningen, via et passende rør eller en passende slange, der ikke er vist på tegningen. Ved tilførsel af 5 trykluft til oversiden af stempeldelen 44 tvinges stempeldelen 44 nedefter i pipettehuset 43 mod den forspændingskraft, som tilføres til stempeldelen 44's underside fra fjederen 45 og bevæger dermed pipetterøret 4T's spids længere ind i centrifugebeholderen 2T's indre rum, 10 I centrum af huset 30 er der monteret et legeme 50. ! en gennemgående boring i huset 50 er der anbragt et rør 51, som er tætnet i forhold til legemet 50 ved hjælp af en tætningsring eller en pakning 52. Røret 51's øverste ende har en tilslutningsfitting 53, som tillader tilslutning til en ydre væskekilde, via et passende rør eller en pas-15 sende slange, der ikke er vist på tegningen. Vinkelret på legemet 50's gennemgående boring er der udformet en boring 54, der tilvejebringer en forbindelse til den gennemgående boring fra tilslutningsfittingen 55. Tilslutningsfittingen 55 er indrettet til at blive forbundet til en ydre trykluftkilde, der ikke er vist på tegningen, via 20 et passende rør eller en passende slange, der ikke er vist på tegningen, fx den ovennævnte trykkilde, som er forbundet til sugepipetten 40's tilslutningsfitting 46. Tilførsel af trykluft gennem tilslutningsfittingen 55 og videre gennem legemet 50's gennemgående boring tjener to formål. For det første tjener den luft, som holdes på 25 en forudbestemt temperatur, det formål at termostatere centrifugebeholderen til den forudbestemte temperatur. For det andet tjener trykluften det formål at forhindre væske i at blive opsamlet på huset 30's inderflade og i at blive suget ind i centrifugebeholderen, når denne roterer med sin høje rotationshastighed på 45.000 omdrejninger 30 pr. minut.

I fig. 2 er centrifugebeholderen 21 vist mere detaljeret. Medens centrifugebeholderen 21 roterer med sin høje rotationshastighed drevet af motoren 16 som angivet med en pil 64, anbringes et tokomponent-gradientseparationslag 60 i et perifert inderrum af centrifugebeholde-35 ren 21, hvilket rum defineres af det indsnit 26, som definerer den U9638 11 minimale bredde, i den indadrettede randdel 24. Tokomponentseparationslaget 60 har en komponent, der har stor massefylde og udgør et første lag 61, og en komponent, der har lille massefylde og udgør et andet lag 62, der er anbragt oven på det første lag 61. Komponenten 5 med stor massefylde og komponenten med lille massefylde i henholdsvis det første og det andet lag 61 og 62 har massefylder, der er henholdsvis større og mindre end massefylden af de bakterier, som skal separeres. I grænselaget mellem lagene 61 og 62 er vist et bakterielag 63. Væskeprøven tilføres til centrifugebeholderen 21's centrum via 10 tilførselsrøret 32 og afgives fra dette. Takket være den centrifugalkraft, som genereres ved rotation af centrifugebeholderen 21 med den store rotationshastighed, slynges væsken udefter fra centrifugebeholderens centrum og tvinges opefter langs laget 62's inderflade.

Væsken, der tilføres fra tilførselsrøret 32 i en kontinuerlig strøm, 15 frembringer et væskefilmlag 65 på indersiden af laget 62 af komponenten med lille massefylde og afgives fra indsnittet 26 som angivet med henvisningsbetegnelsen 66. Da væsken kun afgives gennem indsnittet 26, holdes væsken i centrifugebeholderen i et længere tidsrum sammenlignet med en tallerkenlignende centrifugebeholder, der ikke har 20 det indsnit 26, som definerer den minimale bredde, idet væsken i en sådan centrifugebeholder afgives fra hele den øverste åbning i centrifugebeholderen, og følgelig kan væsketilførselshastigheden til centrifugebeholderen med indsnittet 26 forøges yderligere, hvilket forøger bakterieseparationshastigheden i forhold til et apparat, der ikke har 25 indsnittet 26. Da bakterierne har en større massefylde end laget af komponenten med lille massefylde eller inderlaget 62, tvinges bakterierne radialt udefter gennem laget 62 til grænsefladen mellem lagene 61 og 62.

Apparatet 10’s drift beskrives i eksemplet nedenfor.

30 EKSEMPEL

I en praktisk udførelsesform af den type, som findes beskrevet ovenfor under henvisning til tegningen var den tallerkenlignende centrifugebeholder 21 fremstillet af titan og havde en indre overfladebelæg- 149638 12 ning af polytetrafluorethylen. Centrifugebeholderen 21's indre diameter var 47 mm. Motoren 16 var indrettet til at blive drevet med en lav rotationshastighed på 250 omdrejninger pr. minut og en høj rotationshastighed på 45.000 omdrejninger pr. minut, hvilket gav et virtuelt 5 gravitationsfelt i centrifugebeholderen af størrelsesordenen 50.000 G. Centrifugebeholderen 21's perifere inderrum, hvis højde blev defineret af indsnittet 26, som definerede den minimale bredde, i den indadret-tede randdel 24, var af størrelsesordenen 2 ml. I denne udførelsesform blev en 15 ml væskeprøve separeret i løbet af 15 s. Denne 15 ml 10 væskeprøve var en vandig opløsning af en 5 ml mælkeprøve. Gennem tilslutningsfittingen 55 og gennem legemet 50's gennemgående boring blev der kontinuerligt tilført en strøm af trykluft, der var opvarmet til en temperatur på 40°C, fra en 1,5 Bar trykkilde gennem en slange med en indre diameter på 1,5 mm og en længde på 250 mm. Som 15 nævnt ovenfor blev der ligeledes tilført en strøm af luft med en temperatur på 40°C til centrifugebeholderen nedefra.

Ved udførelse af separationsprocessen ifølge opfindelsen blev det ovenfor beskrevne apparat ifølge opfindelsen drevet i en automatiseret sekvens omfattende følgende trin: 20 (a) motoren 16 blev accelereret til sin høje rotationshastighed til ro tation af centrifugebeholderen 21 med dens høje rotationshastighed på 45.000 omdrejninger pr. minut, (b) en 0,5 ml vandig dextranopløsning, der udgjorde komponenten med stor massefylde, blev tilført fra et separat tilførselsrør, der ikke 25 er vist på tegningen, til centrifugebeholderens centrum, hvorefter den vandige dextranopløsning blev slynget ind i centrifugebeholderen 21’s perifere inderrum og ind i det i fig. 2 viste komponentlag med stor massefylde eller første lag 61, (c) en 1,5 ml saccharoseopløsning, der udgjorde komponenten med 30 lille massefylde, tilførtes gennem et separat tilførselsrør, der ikke er vist på tegningen, til centrifugebeholderens centrum, hvorefter sac-charoseopløsningen blev slynget ind i det i fig. 2 viste komponentlag med lille massefylde eller andet lag 62, medens eventuelt overskydende saccharosevolumen blev afgivet fra centrifugebeholderens øver-35 ste åbning 25 gennem det indsnit 26, som definerer den minimale bredde, i den indadrettede randdel 24, 149638 13 (d) væskeprøven blev tilført fra tilførselsrøret 32 i en kontinuerlig strøm, så at bakterierne blev anbragt i bakterielaget 63 i grænsefladen mellem det første og det andet lag henholdsvis 61 og 62, og væsken blev afgivet gennem centrifugebeholderens øverste åbning som 5 angivet med henvisningsbetegnelsen 66 i fig. 2, (e) efter således at have kontrolleret selve separationsprocessen, blev der tilført et skyllemiddel, der bestod af en enzymopløsning, fra et separat tilførselsrør, der ikke er vist på tegningen, til centrifugebeholderens centrum, så at eventuelle partikler, fx fedtdråber, der 10 kunne påvirke bakterietælleprocessen, som skulle udføres senere, blev renset bort og afgivet fra centrifugebeholderen 21, (f) motoren 16 blev decellereret til sin lave rotationshastighed til rotation af centrifugebeholderen 21 med dens lave rotationshastighed på 250 omdrejninger pr. minut, 15 (g) sugepipetten 40 blev aktiveret og flyttet fra en første stilling, i hvilken dens spids var placeret fjernt fra inderfladen af centrifugebeholderens periferivæg, til en anden stilling, i hvilken den havde sin spids anbragt grænsende op til denne inderflade, således som vist i fig. 2, medens et 1,5 ml volumen af enzymopløsningen blev tilført 20 fra det ovennævnte tilførselsrør, der ikke er vist på tegningen, til centrifugebeholderen 21's centrum, så at materialet i lagene 61 og 62 også indeholdende bakteriegrænsefladeaf lej ringen 63 blev overført i en enzymopløsning gennem pipetterøret 41 og videre gennem tilslutningsfittingen 42 og en ydre slange, der ikke er vist på tegningen, til en 25 ydre målebeholder eller et ydre måleudstyr, der ikke er vist på tegningen, (h) sugepipetten blev ført tilbage til sin første stilling, (i) et 1,5 ml volumen af enzymopløsningen blev tilført gennem det ovennævnte tilførselsrør, der ikke er vist på tegningen, til centrifu- 30 gebeholderen 21's centrum, (j) motoren 16 blev accelereret til rotation af centrifugebeholderen 21 med dens høje rotationshastighed på 45.000 omdrejninger pr. minut, så at eventuelt materiale placeret i centrifugebeholderen 21's perifere inderrum blev renset bort ved hjælp af enzymopløsningen, og 35 (k) derefter blev trinene (f)-(h) gentaget til overførsel af det rensende 1,5 ml volumen af enzymopløsningen sammen med et naturligt materiale opløst i dette til den ovennævnte målebeholder eller det ovennævnte måleudstyr, der ikke er vist på tegningen,

Claims (16)

149638 Til rensning af hele apparatet blev følgende sekvens af trin foretaget: (I) motoren 16 blev accelereret til rotation af centrifugebeholderen 21 med dens høje rotationshastighed på 45.000 omdrejninger pr. minut, 5 (m) et skyllemiddel tilført gennem tilførselsrøret 21 og luft tilført gennem boringen 54 fra en forvarmer, der opvarmede luften til en temperatur på ca. 40°C, blev intermitterende indført i inderrummet i huset 30, idet intervallet var af størrelsesordenen 0,5 s, i en spray, der tjente det formål at rense huset 30's inderflader og centrifuge-10 beholderen 21's yderflader, (n) motoren 16 blev decelereret til rotation af centrifugebeholderen med dens lave rotationshastighed på 250 omdrejninger pr. minut, (o) sugepipetten blev aktiveret og flyttet fra sin første til sin anden stilling, så at eventuel væske og eventuelt materiale, der fandtes i 15 centrifugebeholderen, blev suget bort og overført gennem pipetterøret 41 og videre gennem tilslutningsfittingen 42 og gennem en slange, der ikke er vist på tegningen, til en affaldsbeholder, og (p) sluttelig blev sugepipetten ført tilbage til sin første stilling, og motoren 16 blev slukket. 20 PATENTKRAV

1. Fremgangsmåde til separering af bakterier fra en væskeprøve indeholdende bakterier, kendetegnet ved, at fremgangsmåde udøves ved hjælp af en tallerkenlignende centrifugebeholder (21), der har en øverste 25 åbning (25), som afgrænses af en radialt indadrettet randdel (24), og at fremgangsmåden omfatter følgende sekvens af trin: (a) rotation af centrifugebeholderen (21) med stor rotationshastighed, (b) indføring af et volumen af en væskeformig komponent med stor massefylde i centrifugebeholderen, hvilken massefylde er større end 30 bakteriernes massefylde, (c) indføring af et volumen af en væskeformig komponent med lille massefylde i centrifugebeholderen, hvilken massefylde er mindre end massefylden af bakterierne, så at der dannes et tokomponent-gradi-entsepa rations lag (60, 61, 62) i centrifugebeholderen (21), 149638 (d) indføring af en kontinuerlig strøm af væskeprøven med en massefylde, der er mindre end massefylden af den væskeformige komponent med lille massefylde, i centrifugebeholderen (21), hvorved bakterierne placeres i grænselaget (63) mellem komponenterne med stor (61) og 5 lille (62) massefylde i tokomponent-gradientseparationslaget (60), medens væskeprøven afgives gennem centrifugebeholderens øverste åbning (25), (e) indføring af et skyllemiddel i centrifugebeholderen, idet skyllemidlet afgives fra centrifugebeholderens (21) øverste åbning (24), 10 (f) deceleration af centrifugebeholderen (21) og rotation af samme med lav rotationshastighed, (g) aktivering og bevægelse af en sugepipette (40) fra en første stilling, i hvilken pipetten har sin spids placeret i afstand fra inder-fladen af centrifugebeholderens (21) periferivæg (23), til en anden 15 stilling, i hvilken pipetten har sin spids placeret grænsende op til inderfladen, så at væskesubstansen suges fra centrifugebeholderen (21), medens der indføres et volumen af en overføringsvæske i centrifugebeholderen (21) uden afgivelse af overføringsvæske gennem centrifugebeholderens øverste åbning, og 20 (h) tilbageføring af sugepipetten til dens første stilling.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at fremgangsmåden yderligere omfatter følgende sekvens af trin efter trinene (a)-(h): (i) indføring af et lille volumen af overførings væske i centrifugebe-25 holderen (21) uden afgivelse af væske gennem centrifugebeholderens øverste åbning, (j) acceleration af centrifugebeholderen og rotation af denne med høj rotationshastighed og (k) gentagelse af trinene (f)-(h).

3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at fremgangsmåden yderligere omfatter følgende følge af trin efter trinene (a)-(k): (l) acceleration af centrifugebeholderen (21) og rotation af samme med stor rotationshastighed, 149638 (m) intermitterende indføring af en strøm af skyllemidlet og varm luft i centrifugebeholderen (21) i en spray til bortskylning af eventuelt materiale, der hæfter fast til centrifugebeholderen (21), (n) deceleration af centrifugebehoideren (21) og rotation af samme 5 med lille rotationshastighed, (o) aktivering og bevægelse af sugepipetten (40) fra dens første stilling til dens anden stilling, så at eventuel væskesubstans suges fra centrifugebeholderen, og (p) tilbageføring af sugepipetten (40) til dens første stilling.

4. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, kendetegnet ved, at væsken afgives fra centrifugebeholderens (21) øverste åbning (25) gennem et indsnit (26), som definerer en minimal bredde af centrifugebeholderens (21) indadrettede randdel (24), så at der frembringes en forsinkelse af væskens afgivelse fra 15 centrifugebeholderen.

5. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, kendetegnet ved, at centrifugebeholderen (21) termostateres til en forudbestemt temperatur ved tilførsel af luft med denne temperatur til centrifugebeholderen (21).

6. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, kendetegnet ved, at der indføres en strøm af trykluft i centrifugebeholderen (21), medens denne roterer med sin høje rotationshastighed.

7. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, 25 kendetegnet ved, at komponenten (61) med stor massefylde i tokomponent-gradientseparationslaget (60) er en vandig opløsning af dextran, og at komponenten (62) med lille massefylde i tokomponent-gradientseparationslaget (60) er en vandig opløsning af saccharose, og at skyllemidlet og overføringsvæsken er en enzymopløsning.

8. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, kendetegnet ved, at centrifugebeholderens (21) høje rotationshastighed er af størrelsesordenen 45.000 omdrejninger pr. minut, 149638 og at centrifugebeholderens (21) lave rotationshastighed er af størrelsesordenen 250 omdrejninger pr. minut.

9. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, kendetegnet ved, at det i centrifugebeholderen (21) af- 5 grænsede nettovolumen, når centrifugebeholderen roterer med sin høje rotationshastighed, er af størrelsesordenen 2 ml, at volumenet af komponenten (61) med stor massefylde i tokomponent-gradientseparati-onslaget (60) er af størrelsesordenen 0,5 ml, og at volumenet af komponenten (62) med lille massefylde i tokomponent-gradientseparati-10 onslaget (60) er af størrelsesordenen 1,5 ml.

10. Apparat til udøvelse af fremgangsmåden ifølge et hvilket som helst af kravene 1-9, kendetegnet ved, at apparatet (10) har: en tallerkenlignende centrifugebeholder (21) med en øverste åbning 15 (25), der afgrænses af en radialt indadrettet randdel (24), en tohastighedsmotor (16), der er forbundet til centrifugebeholderen (21), til selektiv rotation af denne med en lav rotationshastighed og med en høj rotationshastighed, væsketilførselsorganer (32), der strækker sig ind i centrifugebeholde-20 ren (21) til tilførsel af en komponent (61) med stor massefylde, hvilken komponent har en massefylde, der er større end massefylden af bakterierne, til centrifugebeholderen (21), til tilførsel af en komponent (62) med lille massefylde, hvilken komponent har en massefylde, der er mindre end massefylden af bakterierne, til centrifugebe-25 holderen, til tilførsel af et skyllemiddel til centrifugebeholderen, til tilførsel af en overføringsvæske til centrifugebeholderen og til tilførsel af væskeprøven til centrifugebeholderen, samt en sugepipette (40), der er monteret på en sådan måde, at den kan bevæges mellem en første stilling, i hvilken pipetten har sin spids 30 placeret i afstand fra inderfladen af centrifugebeholderens (21) perifere væg (23), og en anden stilling, i hvilken pipetten har sin spids placeret grænsende op til den nævnte inderflade, og som er indrettet til at blive aktiveret, så at den suger væskesubstans fra centrifugebeholderen. 149638

11. Apparat ifølge krav 10, kendetegnet ved, at tilførselsorganerne (32) udgøres af individuelle tilførsels rør, der strækker sig ind i centrifugebeholderen gennem den øverste åbning i samme og til tilførsel af henholdsvis 5 komponenten (61) med stor massefylde, komponenten (62) med lille massefylde, skyllemidlet, overføringsvæsken og væskeprøven.

12. Apparat ifølge krav 11, kendetegnet ved, at det yderligere har et tilførselsrør, der strækker sig ind i centrifugebeholderen gennem den øverste åb-10 ning i centrifugebeholderen, til tilførsel af trykluft til centrifugebeholderen.

13. Apparat ifølge et hvilket som helst af kravene 10-12, kendetegnet ved, at den tallerkenlignende centrifugebeholder (21) yderligere har et indsnit (26), som definerer den minimale 15 bredde af den radialt indadrettede randdel (24) af centrifugebeholderen (21).

14. Apparat ifølge et hvilket som helst af kravene 10-13, kendetegnet ved, at den tallerkenlignende centrifugebeholder (21) er fremstillet af titan og har en indre overfladebelægning af 20 polytetrafluorethylen, og at den indre diameter af den tallerkenlignende centrifugebeholder er af størrelsesordenen 47 mm.

15. Apparat ifølge et hvilket som helst af kravene 10-14, kendetegnet ved, at nettovolumenet af centrifugebeholderens (21) inderrum er af størrelsesordenen 2 ml.

16. Apparat ifølge et hvilket som helst af kravene 10-15, kendetegn et ved, at centrifugebeholderens (21) høje rotationshastighed er af størrelsesordenen 45.000 omdrejninger pr. minut, og at centrifugebeholderens (21) lave rotationshastighed er af størrelsesordenen 250 omdrejninger pr. minut.