DK143234B - Fremgangsmaade til fremstilling af enzympraeparater med bete-galactosidaseaktivitet - Google Patents

Description

\£B

di) FREMLÆGGELSESSKRIFT 143234 DANMARK <«) mt. ci> c 12 Nem «(21) Ansøgning nr. 4080/77 (22, 14. sep. 1977 124) Lebedag l4* sep. 1977 (44) Ansøgningen fremlagt og fremlæggelsesskriftet offentliggjort den 27 · juli 1 9^1

DIREKTORATET FOR

PATENT-OG VAREMÆRKEVÆSENET (30> Prioritet begæret fra den

14. sep. 1976, 58ΟΟ2/76, GB

(41) Aim. tilg. 15* mar. 1978 (71) IMPERIAL CHEMICAL INDUSTRIES LIMITED, Thames House North, Millbank, Lon= ’Son SW1P 4QG, GB.

(72) Opfinder: Stephen John Bungard, Norton Hall, The Green, Norton, Stockton-on-Tees, CleveTand, GB: David Byrom, Norton Hall, The Green, Norton, Stockton-on-Tees, Cleveland, GB.

(74) Fuldmægtig under sagens behandling:

Firmaet Chas. Hude.

(54) Fremgangsmåde til fremstilling af enz ympræp ar at er med beta-galactosi= daseaktivitet.

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til fremstilling af enzympræparater med β-galactosidaseaktivitet.

8-galactosidase eller lactase er et enzym, som er i stand til at hydrolysere lactose til dannelse af en blanding af galactose og glucose, der kan koncentreres til en sirup. Lactose betragtes sædvanligvis som et spildprodukt og har et meget begrænset marked. Ved behandling med β-galactosidase kan lactose omdannes til et nyttigt produkt.

De fleste β-galactosidaseenzymer inhiberes af calciumioner, og mange er ikke stabile ved højere temperaturer, dvs. temperaturer på 50°C eller mere.

Ifølge opfindelsen tilvejebringes en fremgangsmåde til fremstilling af et enzympræparat indeholdende β-galactosidaseaktivitet, hvorhos mikroorganismen LT-2 (NCIB nr: 11259) (hvis egenskaber beskrives i det følgende) dyrkes i et medium indeholdende carbon- og nitrogen= 2 143234 kilder og uorganiske næringsmidler herunder fortrinsvis lactose eller galactose.

Mikroorganismen LT-2 er en grampositiv stavbakterie, som ikke er co-ryneform og har de i tabel 1 anførte egenskaber. Af velaccepterede slægter, hvori den kan klassificeres, er de nærmeste Bacillus, Kurtia og Lactobacillus. LT-2 har imidlertid vigtige forskelle i sammenligning med egenskaberne, der er beskrevet for disse slægter, f.eks. fraværelse af sporer, forskelligt GC-indhold, således at LT-2 tilhører en ny slægt, som fremover vil blive benævnt som LT-2-slægten.

En kultur af den hidtil ukendte stamme LT-2 er blevet deponeret i National Collection of Industrial Bacteria (NCIB),Torry Research Station, Aberdeen, Skotland, Storbritannien og har fået NCIB acces-sionsnummer: 11259.

Stammen LT-2's mikrobiologiske egenskaber bestemt ved hjælp af standard-mikrobiologiske teste er anført i tabel 1.

TABEL 1 λ / λ r> λ / 1 A Ο <- ο 4 3

Karakteristik-test Egenskab af LT-2

Kolonibeskrivelse 1-2 mm. Uregelmæssigt afgrænset (Basalsalte + 0,1% gærekstrakt konveks ru/rynket overflade, creme-+ 0,5% pepton + 1,5% oxoid farvet, tæt, dispergeret let.

renset agar) 50°C 18 timer

Gram stamme Medium til lange, pleomorfe stave, (medium som ovenfor) Slank/kraftig. Nogle let kurvefor- 50°C 18 timer mede. Gram +ve/-ve. Nogle celler delvis +ve, delvis -ve, incl. nogle med +ve-ender. Enkelte celler og grupper. Nogle kæder, ofte med en blanding af +ve og -ve-celler i en enkelt kæde. Celler har parallelle sider, lige akser og afrundede ender.

^Bevægelighed

Anaerob vækst +

Gelatine hydrolyse (plade) svagt + (3 dage)

Lakmusmælk sur + størknet masse (3 dage)

Stivelseshydrolyse NO" - N0-

Oxidase xKatalase +

Lecithinase (æggeblommeplade) - (vægt +) wMR +

vP

Indol

Cellulosehydrolyse *Phenylalanindeaminering xArabinosea syre x a gas

Mannitol syre x gas

Xylose3 syre x a gas

Glucose syre + gas Vækst ved 55°C + 23°C +

4°C

*Vækst i 5% NaCl vækst i 7% NaCl *Vækst i 10% NaCl BVækst i 0,001% lysozyme BVækst i Sabourauddextroseagar + sVækst i Sabourauddextrosesuppe + G + C-indhold - 51,7 mol%

Patogenicitet Ikke patogen

Roser's citrat Arginin dihydrolase Møllars Vækst ved pH-værdi 8,5 + 9,5 143234 4 xDisse forsøg blev gennemført med kulturer dyrket ved både 37°C og 50°C. Alle andre forsøg blev gennemført med celler dyrket kun ved 50°C. Den eneste konstaterede forskel mellem kulturer dyrket ved de to temperaturer var tykkere vækst i 7% NaCl ved 37°C.

aPepton -vand-sukker, Andrade' s indikator .

Ved fremgangsmåden til fremstilling af et enzympræparat indeholdende β-galactosidase dyrkes stamme LT-2 i et vækstmedium indeholdende en passende carbonkilde og andre passende næringsmedier til således at danne enzymet. Væksten kan ske chargesvis eller ved kontinuerlig dyrkning. Et inoculum indeholdende stamme LT-2 fremstilles f.eks. på en skråagar og anvendes til at pode et egnet dyrkningsmedium. Her får mikroorganismen lov til at udvikle sig og danne β-galactosidase. Inkubationsperioden kan variere inden for et bredt interval afhængig af dyrkningsmediet. Den er fortrinsvis mellem 4 og 48 timer. En prøve eller hele kulturen anvendes til inoculering af et større volumen næringsmedium. Dette kan gentages en eller flere gange.

Mikrobielle celler indeholdende enzymet kan separeres fra dyrkningsmediet til sidst på enhver kendt måde. Der anvendes fortrinsvis hele celler til gennemførelse af hydrolysen af lactose. Om ønsket kan enzymet imidlertid ekstraheres fra cellerne ved hjælp af enhver egnet metode eller det endelige kulturmedium kan selv anvendes uden separering af cellerne til hydrolyse af lactose.

Dyrkningsmediet eller kulturmediet til dannelse af enzympræparatet indeholder ’fortrinsvis som carbonkilde et passende carbohy-drat, f.eks. lactose eller galactose. Det kan også indeholde komplekse organiske næringsmedier, såsom en vitaminrig suppe omfattende gærekstrakt, kødekstrakt etc.. Nitrogenkilden er hensigtsmæssig ammoniak, et nitrat eller en aminosyre og phosphorkilden er hensigtsmæssigt en phosphat. Andre bestanddele, som indgår, omfatter fortrinsvis magnesium, kalium og svovl, f.eks. alt tilsat som mag= nesiumsulfat og kaliumsulfat og sporstoffer, såsom jern, kobolt, zink, kobber, mangan, calcium etc..

De foretrukne mængder, hvori de forskellige næringsmidler indgår i dyrkningsmediet til fremstillingen af enzymet vil i nogen grad variere · Passende mængder i et specielt tilfælde kan let bestemmes af en mikrobiolog.

5 U323/*

Ved fremstilling af β-galactosidase holdes dyrkningsmediet fortrinsvis ved en temperatur i intervallet fra 30°C til 60°C, specielt 45°C til 55°C. Mediets pH-værdi holdes fortrinsvis i intervallet fra 4,5 til 8,0, specielt 6,5 til 7,0.

Hydrolysen af lactose til glucose og galactose kan forløbe i alt væsentligt fuldstændigt til dannelse af en 1:1 blanding af glucose og galactose. Under optimale betingelser for en industriel proces får reaktionen ikke lov til at forløbe fuldstændigt, og produktet er en sirup indeholdende lactose, glucose og galactose. Under hydrolysen holdes temperaturen passende i intervallet fra 20°C til 70°C, fortrinsvis 40°C til 60°C, idet temperaturer på ca. 50°C specielt foretrækkes. pH-værdien af det lactoseholdige medium, som hydrolyseres, holdes fortrinsvis i intervallet fra 4,0 til 8,0, specielt 6,0 til 7,5, om nødvendigt under anvendelse af et passende puffersystem, f.eks. phosphat-puffer. Ved processer i stor målestok undgås anvendelse af puffersystemer imidlertid om muligt. Enzymet eller enzympræparatet kan meget passende immobiliseres og anvendes som en del af en kontinuerlig søjleproces, f.eks. under anvendelse af fremgangsmåden ifølge britisk patentskrift nr. 1.368.650.

Lactosen selv kan indgå i mediet til hydrolyseprocessen i mængder i intervallet fra 5 til 40 vægt%. Den kan findes helt eller delvis i valle eller mælk, hvilke begge indeholder lactose. Til hydrolysen af lactose kan enzymet forefindes i hele celler eller i opløselig form, idet mikroorganismecellerne, der er blevet spaltet, åbnes^ og nedbrudt materiale, såsom cellevægge,skilles fra.

Det ifølge opfindelsen fremstillede enzympræparat har fordele ved, at det ikke inhiberes af calciumioner og er stabilt ved temperaturer, såsom 50°C. Hydrolyseprocessen kan således gennemføres ved temperaturer, såsom 50°C, ved hvilke højere temperaturer forurening med uønskede mikroorganismer reduceres i høj grad.

Den ved hydrolyse af lactose dannede sirup kan anvendes som et almindeligt sødemiddel. Det er også meget nyttigt i forbindelse med brygning som en erstatning for glucose.

β-galactosidasen t der fås ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan undersøges med hensyn til dets lactosehydrolyserende virkning ved hjælp af følgende undersøgelsesmetode: , U3234 6 β-galactosidase-undersøgelsesmetode.

En undersøgelse af aktiviteten af det lactosehydrolyserende enzym blev gennemført i følgende reaktionsblandinger: 0,05 M phosphatpuffer pH-værdi 6,5 0,5 ml 4,7% (vægt/volumen) KF 0,5 ml 5,0% (vægt/volumen) lactose 5,0 ml

Bakteriekultur (tolueniseret i 10 minutter) eller enzymopløsning 1,0 ml

Reaktionsblandingen blev inkuberet ved 50°C i 10 minutter. Reaktionen blev startet ved tilsætning af lactosen og standset ved tilsætning af 5 ml 10% (vægt/volumen) trichloreddikesyre. Glucose blev bestemt ved anvendelsen af Beckman Glucose Analyser. En kontrolundersøgelse blev gennemført på reaktionsblandingen.

Enzymmængden, der er nødvendig til at danne 1 mg glucose pr. time ved 50°C under de ovennævnte betingelser, blev defineret som én enzymenhed .

Aktivitetsniveau på over 60 enheder pr. ml kultur er rutinemæssigt blevet bestemt i prøver fra kontinuerlige kulturer af LT-2.

Opfindelsen illustreres ved hjælp af følgende eksempel:

Eksempel

Der blev dannet lactase ved dyrkning af mikroorganismen LT-2 i kontinuerlig kultur ved en fortyndingsrate på 0,2 h 1 i et medium med følgende sammensætning:

MgS04 1,2 g/1 K2S04 0,45 g/1

Na2S04 0,1 g/1

Bacto-pepton 3,0 g/1 "Difco" gærekstrakt 1,0 g/1

Lactose 20 g/1 1,1 M phosphorsyre 24 ml/1

Opløsning af sporstoffer 24 ml/1