DE945948C

DE945948C - Process for making a poliomyelitis vaccine

Info

Publication number: DE945948C
Application number: DEP14395A
Authority: DE
Inventors: I William Mclean Jun
Original assignee: Parke Davis and Co LLC
Current assignee: Parke Davis and Co LLC
Priority date: 1955-03-30
Filing date: 1955-07-02
Publication date: 1956-07-19
Also published as: CH340953A

Description

Verfahren zur Herstellung einer Polwomyelitis-Vaccine Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zu der Herstellung von Vaccinen gegen Poliomyelitis.Process for the manufacture of a polwomyelitis vaccine The invention relates to a process for the manufacture of vaccines against poliomyelitis.

Es ist bekannt, daß Poliomyelitis eine Virus krankheit ist, die tödlich sein kann oder zu weitreichenden Verkrüpplungen führt. Wegen der Natur dieser Krankheit liegt der einzige brauchbare Zugang zu diesem Problem in einer Prophylaxis, d. h. in einer Entwicklung von Mitteln, die das Auftreten der Krankheit verhindern. Kürzlich wurde eine Vaccine aus abgetöteter Poliomyelitis entwickelt, die aus abgetöteten, aber antigenen Poliomyelitisvirusarten der Typen I, 2 und 3 zusammengesetzt ist, und diese wurden einer erschöpfenden klinischen Prüfung unterworfen. Diese Poliomyelitis-Vaccine stellt gleich vielen anderen Vaccinen eine wäßrige Zubereitung dar, die durch Injektion verabreicht wird. Deswegen ist es notwendig, daß die Vaccine steril ist, d. h. frei von schädlichen Bakterien und Schimmelpilzen, nicht nur während der Herstellungs- und Verpackungszeit, sondern auch zur Zeit der Verabreichung. Wenngleich es vielleicht, theoretisch wenigstens, möglich ist, die Vaccine unter aseptischen Bedingungen herzustellen und zu verpacken, können solche Vaccinen zur Zeit der Verabreichung durchaus verunreinigt sein, insbesondere wenn die Verpackung, wie allgemein im Handel bekannt ist, eine Mehrfach-Dosen-Packung darstellt. Darüber hinaus ist die Herstellung unter vollständig aseptischen Bedingungen vom Standpunkt der Kosten aus nicht angängig und gänzlich undurchführbar. Bei einem Versuch, sicher zustellen, daß die Vaccine des Poliomyelitis-Virus frei von verunreinigenden Bakterien, Schimmelpilzen und Pilzen ist und dieses sicher bleibt, wurde vorgeschlagen, eine Quecksilberbindung, insbesondere Thiomerosal (Natriumäthylquecksilberthiosalicylat), als Schutzmittel zuzugeben. Wenngleich dieser Versuch eine Lösung für das Problem der Verunreinigung ergeben hat, hat er ein anderes und vielleicht noch ernsthafteres aufsteigen lassen. Das Thiomerosal verursacht nämlich, daß die Poliomyelitis-Vaccine ihre Wirksamkeit verlieren. Deswegen müssen Poliomyelitis-Vaccine-Produkte, die Thiomerosal als Schutzmittel enthalten, bald nach ihrer Ilerstellung verabreicht werden. Dies ist natürlich höchst unerwünscht, da die Vaccine schwierig und kostspielig herzustellen ist und unter solchen Umständen die Herstellung auf bekannte kurze Zeiträume des Bedarfs beschränkt werden muß. Im Hinblick hierauf und weil die Vaccine mehrere Monate für die Herstellung erfordert, ist es undurchführbar, hinreichend Vaccine herzustellen, um einem unerwarteten Notbedarf zu entsprechen. Es ist daher ein dringender Bedarf für eine Poliomyelitis-Vaccine vorhanden, die nicht nur sicher frei von verunreinigenden Bakterien und Schimmelpilzen zur Zeit der Verabreichung ist, sondern die auch ihre Wirkung, d. h. ihre antigene Wirkung über eine beträchtliche Zeitdauer unter normalen Bedingungen einer Lagerung behält. It is known that poliomyelitis is a viral disease that is fatal can be or leads to far-reaching cripples. Because of the nature of this disease the only useful approach to this problem is prophylaxis; H. in a development of means that prevent the occurrence of the disease. Recently a vaccine was developed from killed poliomyelitis, which consists of killed, but is composed of antigenic poliomyelitis virus types I, 2 and 3, and these have been subjected to exhaustive clinical testing. This poliomyelitis vaccine Like many other vaccines, it is an aqueous preparation made by injection is administered. Therefore, it is necessary that the vaccine be sterile, i. H. free of harmful bacteria and mold, not only during the manufacturing and packaging time, but also at the time of administration. Though it may theoretically at least, it is possible to manufacture the vaccine under aseptic conditions and to be packaged, such vaccines can be contaminated at the time of administration especially if the packaging, as is well known in the trade, is a Represents multiple doses pack. In addition, the manufacture is under complete aseptic conditions not acceptable from a cost point of view and utterly impracticable. When trying to make sure the vaccine of the poliomyelitis virus free of contaminating bacteria, mold and Mushrooms and this remains safe, it has been suggested that a mercury bond, especially thiomerosal (sodium ethylmercury thiosalicylate) as a protective agent admit it. Although this attempt does provide a solution to the pollution problem has revealed, he has raised a different and perhaps even more serious one. It is the thiomerosal that causes the poliomyelitis vaccines to stop working lose. Because of this, poliomyelitis vaccine products must contain thiomerosal as a protective agent should be administered soon after their preparation. This, of course, is great undesirable as the vaccine is difficult and expensive to manufacture and under under such circumstances manufacture is limited to known short periods of need must become. In view of this and because the vaccine takes several months to manufacture requires, it is impractical to produce enough vaccine to avoid an unexpected To meet emergency needs. There is therefore an urgent need for a poliomyelitis vaccine present that are not only safe from contaminating bacteria and mold at the time of administration, but also its effect, i. H. their antigens Effect over a considerable period of time under normal storage conditions retains.

Es ist Ziel der Erfindung, eine Poliomyelitis-Vaccine zu schaffen, die sicher frei von verunreinigenden Bakterien, Pilzen und Scliimmelpilzen ist und es über eine beträchtliche Zeitdauer unter normalen Bedingungen einer Lagerung und der Verwendung bleibt. It is the aim of the invention to create a poliomyelitis vaccine, which is safely free of contaminating bacteria, fungi and mold and it for a considerable period of time under normal conditions of storage and use the use remains.

Es ist weiter ein Ziel der Erfindung, eine Poliomyelitis-Vaccine zu schaffen, die ihre antigene Wirkung über eine beträchtliche Zeitdauer unter normalen Lagerungsbedingungen beibehält. It is also an object of the invention to provide a poliomyelitis vaccine to create their antigenic effects over a considerable period of time below normal Maintains storage conditions.

Überraschenderweise werden diese Ziele sowie auch andere Ziele, die hernach ersichtlich werden, erreicht und die vorgenannten Schwierigkeiten bei Poliomyelitis-Vaccinen überwunden gemäß der Erfindung, indem man in eine abgetötete-Poliomyelitis-Vaccine, d. h. in eine wäßrige Lösung, die einen nichtinfektiösen, sondern antigenen Poliomyelitis-Virus enthält, eine Substanz einverleibt, die zur Klasse der Verbindungen gehört, die als Eiweißfällung und Denaturungsmittel bekannt ist. Insbesondere umfaßt die vorliegende Erfindung das Einverleiben von Benzäthoniumchlorid in eine wäßrige abgetötete Poliomyelitis-Vaccine in einer Konzentration (Gramm auf Kubikzentimeter) im Bereich von etwa 1 : 20 000 bis 1: 50 000. Das Benzäthoniumchlorid wird der Vaccine vorzugsweise durch langsame Zugabe einer verdünnten wäßrigen Lösung von Benzäthoniumchlorid einverleibt. Es ist bekannt als Benzyldimethyl [2-(2-(p-I, I, 3, 3-Tetramethylbutyl-phenoxy)-äthoxy)-äthyl] -ammoniumchlorid-Monohydrat und besitzt die Formel Die bevorzugten Produkte sind solche, die Benzäthoniumchlorid in einer Konzentration im Bereich von I : 20 000 bis I : 40 000 enthalten.Surprisingly, these goals, as well as other goals which will become apparent hereinafter, are achieved and the aforementioned difficulties in poliomyelitis vaccines are overcome according to the invention by placing in a killed poliomyelitis vaccine, ie in an aqueous solution which is non-infectious but antigenic Poliomyelitis virus contains a substance that belongs to a class of compounds known as protein precipitants and denaturants. In particular, the present invention comprises the incorporation of benzethonium chloride in an aqueous killed poliomyelitis vaccine in a concentration (grams per cubic centimeter) in the range of about 1: 20,000 to 1: 50,000. The benzethonium chloride is the vaccine preferably by slowly adding a dilute aqueous Incorporated solution of benzethonium chloride. It is known as benzyldimethyl [2- (2- (pI, I, 3, 3-tetramethylbutylphenoxy) ethoxy) ethyl] ammonium chloride monohydrate and has the formula The preferred products are those containing benzethonium chloride in a concentration in the range of I: 20,000 to I: 40,000.

Die bei der Herstellung von Produkten nach der Erfindung verwendeten wäßrigen abgetöteten Poliomyelitis-Vaccine können irgendeinen oder alle verschiedenen Typen des Poliomyelitis-Virus enthalten. Those used in the manufacture of products according to the invention Aqueous killed polio vaccines can be any or all of several Types of Poliomyelitis Virus included.

Die bevorzugten Vaccinen sind solche, die die Typen I, 2, 3 des Poliomyelitis-Virus enthalten. Besonders geeignete Vaccine sind solche, die einen relativ niedrigen Eiweißgehalt aufweisen, vorzugsweise solche, die weniger als I8 bis 20 y Eiweißstickstoff je cm3 aufweisen. Solche Vaccinen können auf mehreren verschiedenen Wegen hergestellt werden, zum Beispiel kann ein zerkleinertes GelF. ebe aus Affennieren mit Trypsin behandelt werden, um fremde Gewebe zu entfernen. Die restlichen Zellen läßt man sich vervielfältigen, das Medium wird mit Poliomyelitis-Virus beimpft, das Gemisch dann entwickelt, die Flüssigkeit gesammelt und der lebende Virus durch Esehandlung mit Formaldehyd, Ultraviolettbestrahlmg oder andere geeignete Mittel inaktiviert. Gegebenenfalls können auch Vaccinen verwendet werden, die unter Fortlassung der Trypsinbehandlungsstufe hergestellt wurden, aber in diesem Fall kann der Eiweißgehalt der Vaccine übermäßig hoch sein und sollte daher vor der Verwendung bestimmt werden. Bei der Herstellung von gemischten Vaccinen, d. h. von Vaccinen, die mehr als eine Art von Poliomyelitis-Virus enthalten, ist es üblich, die gesammelten Flüssigkeiten, die die verschiedenen Arten enthalten, nach der Inaktivierungsstufezusammen zuzugeben oder zu vermischen, obgleich gegebenenfalls dies auch vorher geschehen kann. Bei Verwendung von mit Formaldehyd inaktivierten Vaccinen werden die besten Ergebnisse gemäß vorliegender Erfindung erzielt durch Verwendung von Vaccinen, denen kein Natriumbisultit zugesetzt war, um den Formaldehydgehalt zu reduzieren.The preferred vaccines are those containing types I, 2, 3 of the poliomyelitis virus contain. Particularly suitable vaccines are those that have a relatively low Have protein content, preferably those containing less than 18 to 20 y of protein nitrogen per cm3. Such vaccines can be made in several different ways can be, for example, a crushed GelF. ebe from monkey kidneys with trypsin treated to remove foreign tissues. The remaining cells are left multiply, the medium is inoculated with poliomyelitis virus, the mixture then developed, the fluid collected, and the live virus by action inactivated with formaldehyde, ultraviolet radiation or other suitable means. If necessary, vaccines can also be used which omit the Trypsin treatment stage were made, but in this case the protein content can the vaccine may be excessively high and should therefore be determined prior to use. In the manufacture of mixed vaccines, i. H. of vaccines that are more than one Containing type of poliomyelitis virus, it is common to use the collected fluids, which contain the different ways to add together after the inactivation stage or to mix, although this can also be done beforehand if necessary. at Use of formaldehyde inactivated vaccines will give the best results according to the present invention achieved by using vaccines which do not contain sodium bisultitol was added to reduce the formaldehyde content.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele erläutert: Beispiel I Für die Entwicklung von Poliomyelitis-Virus werden Zellen hergestellt nach dem Verfahren von Dulbecco, Journal of Experimental Medicine, Bd. 99, S. I67, (1952). In Kürze besteht dieses Verfahren darin, daß man zunächst eine Suspension der Epithel-Zellen von Nieren von Affen herstellt (s. Dulbecco, Proc. Nat. The invention is illustrated by the following examples: Example I For the development of poliomyelitis virus, cells are made according to the Method of Dulbecco, Journal of Experimental Medicine, Vol. 99, p. I67, (1952). In brief, this procedure consists of first making a suspension of the epithelial cells made by kidneys of monkeys (see Dulbecco, Proc. Nat.

Acad. Sci., Bd. 38, S. 747, [I954]) durch Behandlung von mazeriertem Nierengewebe von gesunden Cynomalgus- oder Rhesus-Affen mit Trypsin zur Entfernung von Fremdstoffen und zum Herauslösen der einzelnen Zellen. Diese Zellen läßt man sich auf einer Glasfläche in einem-beliebigen Gewebskulturmedium vervielfältigen. Die so erhaltene Schicht von entwickelten Nierenzellen wird dann mit einer Impfkultur von Poliomyelitis-Virus, Type I (Mahoney), beimpft und das Gemisch bei 36 bis 37° entwickelt, bis die Zerstörung der Zellen vollständig ist und große Mengen von neuem Virus freigesetzt wurden. Die Flüssigkeit, die den Virus enthält, wird dann gesammelt und durch eine ultrafeine gefrittete Glaskerze filtriert. Das Filtrat, das den lebenden Poliomyelitis-Virus, Type I, enthält, wird auf den Virusgehalt, die Bakteriensterilität und die Stammeinheit untersucht. Acad. Sci., Vol. 38, p. 747, [I954]) by treating macerated Kidney tissue from healthy cynomalgus or rhesus monkeys trypsinized for removal of foreign substances and to detach the individual cells. These cells are left multiply on a glass surface in any tissue culture medium. The thus obtained layer of developed kidney cells is then cultured with an inoculum of poliomyelitis virus, Type I (Mahoney), inoculated and the mixture at 36 to 37 ° develops until the destruction of the cells is complete and in large quantities anew Virus were released. The fluid that contains the virus is then collected and filtered through an ultra-fine fritted glass candle. The filtrate that the living Poliomyelitis Virus, Type I, will affect virus levels, bacterial sterility and examines the parent unit.

Ein Filtrat, das den lebenden Poliomyelitis-Virus, Type 2 (MEF-I-Stamm), enthält, wird nach dem oben für die Herstellung des Filtrats mit Poliomyelitis-Virus, Type 1, beschriebenen Verfahren hergestellt. A filtrate containing live poliomyelitis virus, type 2 (MEF-I strain), contains, is used according to the above for the preparation of the filtrate with poliomyelitis virus, Type 1, method described.

Ein Filtrat mit einem lebenden Poliomyelitis-Virus, Type 3 (Saukett-Stamm), wird nach dem gleichen Verfahren hergestellt.A filtrate with a live poliomyelitis virus, type 3 (Saukett strain), is made using the same process.

Die lebenden Virusarten, die in den einzelnen Filtraten enthalten sind, werden durch Zugabe von Formaldehyd und durch Entwicklung der erhaltenen getrennten Mischungen gemäß der Arbeitsweise, die im einzelnen in der Verbesserung mit zu den mindesten Erfordernissen für Poliomyelitis-Vaccine beschrieben ist, veröffentlicht am 20. Mai I954 durch das United States Department of Health, Education and Welfare, inaktiviert. Es wird kein Natriumbisulfat zugegeben, um das überschüssige Formaldehyd zu neutralisieren. The live virus species contained in each filtrate are, are obtained by adding formaldehyde and developing the separated Mixtures according to the procedure, which in detail in the improvement with the minimum requirements for poliomyelitis vaccines is published on May 20, 1954 by the United States Department of Health, Education and Welfare, inactivated. No sodium bisulfate is added to remove the excess formaldehyde to neutralize.

Etwa gleiche Mengen. der Typen I, 2 und 3 der abgetöteten Poliomyelitis-Virus-Vaccine werden vereinigt, und die erhaltenen vereinigten Vaccine werden in aliquote Teile zerlegt, die bei der Herstellung von Produkten nach der Erfindung verwendet werden.About the same amount. of types I, 2 and 3 of the killed poliomyelitis virus vaccines are pooled and the resulting pooled vaccines are aliquoted disassembled, which are used in the manufacture of products according to the invention.

Ein aliquoter Teil wird in unveränderter Form für die Verwendung als Kontrollprobe zurückbehalten.An aliquot is left unaltered for use as a Retain control sample.

0,75 cm3 einer Holzigen Lösung von, Benzäthoniumchlorid werden langsam unter mäßigem, aber wirksamem Rühren zu I50 cm3 kalter wäßriger abgetöteter Poliomyelitis-Vaccine, die wie oben angegeben hergestellt war, zugegeben. Das anfallende Produkt wird in Ampullen in geeigneten Mengen bei der Verwendung bei der Immunisierung abgefüllt. Diese Poliomyelitis-Vaccine, die Benzäthonium in einer Konzentration von 1 : 20 000 enthält, behält seine Wirksamkeit unter den normalen Bedingungen einer Lagerung (Eisschranktemperatur) über mindestens 8 Monate. Sie bleibt auch frei von verunreinigenden Bakterien und Schimmelpilzen unter normalen Bedingungen der Verwendung und Lagerung. 0.75 cm3 of a woody solution of benzethonium chloride is slow with moderate but effective stirring to 150 cm3 of cold, aqueous, killed poliomyelitis vaccine, which was prepared as indicated above was added. The resulting product is in Ampoules filled in appropriate quantities when used in immunization. This poliomyelitis vaccine, the benzethonium in a concentration of 1:20 000 will retain its potency under normal storage conditions (Refrigerator temperature) for at least 8 months. It also remains free from contaminants Bacteria and mold under normal conditions of use and storage.

Die Bestimmungen der Wirksamkeit der Kontrollprobe des Vaccine-Produkts nach der Erfindung sind in Tabelle I unten angegeben. Diese Wirksamkeiten werden bestimmt durch das Verfahren der Serum-Neutralisation, beschrieben von Salk, Younger und Ward, American Journal of Hygiene, Bd. 60, S. 214, (1954). Die Ergebnisse sind angegeben in Werten eines geometrischen mittleren Titers. Kurz gesagt besteht das Untersuchungsverfahren darin, daß man Affen mit dreimal I-cm3-Dosen der Vaccineinwöchentlichen Intervallen impft, die Tiere am Ende der Behandlungsperiode zur Ader läßt, aus dem gesammelten Blut ein Serum gewinnt und die Zahl der im Serum vorhandenen Antikörper bestimmt. Diese Bestimmung wird durch serienmäßige Verdünnung des Serums mit Salzlösung und Vermischung der verdünnten aliquoten Teile mit einer Standardlösung vorgenommen, die eine bekannt Anzahl von Infektionseinheiten einer gegebenen Art von Poliomyelitis-Virus enthält, z. B. wenn man die Analyse auf Wirksamkeit des Typs I durchführt, verwendet man eine Standardlösung, die eine bekannte Anzahl von Infektionseinheiten des Typs I des Poliomyelitis-Virus enthält. The determinations of the effectiveness of the control sample of the vaccine product according to the invention are given in Table I below. These efficacies will be determined by the method of serum neutralization described by Salk, Younger and Ward, American Journal of Hygiene, Vol. 60, p. 214, (1954). The results are given in values of a geometric mean titer. In short, there is The test method is to give monkeys three 1 cm3 doses of the vaccine in weekly Intervals that the animals will vein at the end of the treatment period collected blood a serum wins and the number of antibodies present in the serum certainly. This determination is made by serial dilution of the serum with saline solution and the diluted aliquots are mixed with a standard solution, which is a known number of units of infection of a given type of poliomyelitis virus contains, e.g. When performing Type I efficacy analysis, used one standard solution containing a known number of infectious units of the type I contains the polio virus.

Für die Analyse auf Wirksamkeit des Typs 2 und des Iyps 3 verwendet man Standardlösungen des infektiösen Virus Typ 2 und Typ 3. Der Endpunkt der Titration ist die Verdünnung, bei der das Serum hinreichend Antikörper enthält, um eine genaue Neutralisation zu ergeben, d. h. sich mit der bekannten Anzahl von infektiösen Einheiten des Virus in der Standardlösung zu verbinden oder diese nicht infektiös zu machen. Eine Anzahl von Affen wird bei der Analyse der Wirksamkeit für jede Typenart von Poliomyelitis-Virus verwendet. Die so erhaltenen Ergebnisse werden für einen guten Vergleich und statistische Auswertung in eine geeignete Form gebracht, indem man den Logarithmus der Basis 2 der Endpunktverdünnung für das Serum für jeden Fall nimmt, diese Zahlenmittel und dann den Gegenwert des so erhaltenen Mittels verwendet. Dieser Gegenwert wird der geometrische Mitteltiter der Vaccine genannt und ist natürlich für jede Virusart, die in der Vaccine vorhanden ist, verschieden. Da der geometrische Mittelwert abhängig ist von der Wirksamkeit der Standardlösung des beim Versuch verwendeten infektiösen Poliomyelitis-Virus, ist es notwendig, die Zahl der infektiösen Einheiten des in der Standardlösung vorhandenen Poliomyelitis-Virus zu spezifizieren, um die richtige Kennzeichnung des geometrischen mittleren Titers wiederzugeben. Das Verfahren der Berechnung des geometrisch mittleren Titers ist im einzelnen dargelegt in der obenerwähnten Abänderung Nr. 2 der Mindesterfordernisse für Poliomyelitis Vaccine.Used for Type 2 and Iyps 3 efficacy analysis one standard solutions of the infectious virus type 2 and type 3. The end point of the titration is the dilution at which the serum contains sufficient antibodies to be accurate To give neutralization, d. H. deal with the known number of infectious units of the virus in the standard solution or to make it non-infectious. A number of monkeys will be used in analyzing the effectiveness for each type species of Poliomyelitis Virus Used. The results thus obtained are considered to be good Comparison and statistical evaluation put into a suitable form by one the log of base 2 of the endpoint dilution for the serum for each case takes this numerical mean and then uses the equivalent of the mean thus obtained. This equivalent is called the geometric mean titer of the vaccine and is natural different for each type of virus present in the vaccine. Since the geometric The mean value depends on the effectiveness of the standard solution used in the experiment used infectious poliomyelitis virus, it is necessary to count the number of infectious Specify units of poliomyelitis virus present in the standard solution, to reflect the correct identification of the geometric mean titer. The method of calculating the geometric mean titer is detailed in the aforementioned amendment 2 on minimum requirements for poliomyelitis Vaccine.

Um die Stabilität der antigenen Eigenschaften des Vaccine-Produktes nach der Erfindung bei der Lagerung zu bestimmen, wird die Vaccine eine Woche auf 37° erwärmt und dann 8 Wochen bei 4" gelagert. To ensure the stability of the antigenic properties of the vaccine product According to the invention to determine in storage, the vaccine is on for a week Heated to 37 ° and then stored at 4 "for 8 weeks.

Die Wirksamkeit jeder Virusart wird dann, wie oben beschrieben, bestimmt. Da ein Erwärmen auf 37° während einer Woche den gleichen Effekt auf die Wirksamkeit einer Vaccine hervorruft wie ein Lagern während 6 Monaten bei 4", entspricht die Aufbewahrung der Vaccine während des Versuchs einer Lagerung von 8 Monaten bei 4°. Das Kontrollmuster wurde 9 Wochen bei 4" gelagert, und dann wurde die Wirksamkeit jedes Stammes des Virus bestimmt, wie oben beschrieben wurde.The effectiveness of each virus type is then determined as described above. Since warming to 37 ° for a week has the same effect on the effectiveness a vaccine causes like a storage for 6 months at 4 ", corresponds to the Storage of the vaccine during the attempt of storage for 8 months at 4 °. The control sample was stored at 4 "for 9 weeks and then the effectiveness each strain of virus is determined as described above.

Tabelle I Nummer der Zahl der neutralisierten Geometrischer Untersuchungsmuster Virusart verwendeten Einheiten mittlerer Titer Affen von infektiösem Virus*) Kontrolle 1 8 101,6 256 2 8 101,5 650 3 8 12,8 41 Vaccine-Produkt, enthaltend 1 12 101,6 204 Benzäthoniumchlorid 2 12 101,5 540 (c = 1:20 000) 3 12 102,8 47 *) Wirksamkeit der Standardlösung, die bei den Versuchen verwendet wurde.Table I. Number of Number of neutralized Geometric Examination pattern virus type units used medium titer Monkeys of infectious Virus*) Control 1 8 101.6 256 2 8 101.5 650 3 8 12.8 41 Vaccine product containing 1 12 101.6 204 Benzethonium chloride 2 12 101.5 540 (c = 1: 20,000) 3 12 102.8 47 *) Effectiveness of the standard solution used in the experiments.

Wie aus den obigen Ergebnissen ersichtlich ist, behält die Vaccine nach der Erfindung ihre Wirksamkeit im Hinblick auf alle drei Virusarten über eine Lager zeit, die einer Lagerzeit bei 4° während 8 Monaten äquivalent ist. Im Gegensatz hierzu hatten Vaccine-Proben, denen Thiomerosal als Schutzstoff zugegeben war, ihre Wirksamkeit im Hinblick auf alle drei Virusarten unter den gleichen Bedingungen der Lagerung vollständig verloren. Dies wird durch die folgenden Versuche gezeigt: Eine mit Formaldehyd inaktivierte, Vaccine mit Poliomyelitis-Virus der Typen I, 2 und 3 wird, wie oben beschrieben, hergestellt und in aliquote Teile unterteilt. Ein aliquoter Teil wird als Kontrolle zurückgehalten, und zu einem anderen wurden hinreichend Thiomerosal zugegeben, um die Thiomerosalkonzentration aufl: 100000 zu bringen. Die Kontrollporobe und das Muster mit Thiomerosal wurden 1 Woche auf 37° erwärmt und 1 Woche bei 4° gelagert, und dann wurde die Wirksamkeit jeder Virusart nach dem oben beschriebenen Verfahren bestimmt. As can be seen from the above results, the vaccine retains according to the invention their effectiveness with regard to all three types of virus over one Storage time which is equivalent to a storage time at 4 ° for 8 months. In contrast for this purpose, vaccine samples to which thiomerosal was added as a protective substance had theirs Efficacy against all three types of virus under the same conditions completely lost from storage. This is shown by the following experiments: A formaldehyde-inactivated vaccine with poliomyelitis virus type I, 2 and 3 are prepared as described above and divided into aliquots. An aliquot is retained as a control, and transferred to another Sufficient thiomerosal added to bring the thiomerosal concentration to 100,000 bring to. The control porobe and the sample with Thiomerosal were opened for 1 week Heated to 37 ° and stored at 4 ° for 1 week, and then the effectiveness of each virus species determined by the method described above.

Das Erwärmen und Lagern dieser Muster entsprach einer Lagerung von 6 Monaten bei 4°. Die Ergebnisse der Bestimmung der Wirksamkeit sind in der Tabelle 2 wiedergegeben.The heating and storage of these samples corresponded to storage of 6 months at 4 °. The results of the determination of the effectiveness are in the table 2 reproduced.

Tabelle 2 Nummer der Zahl der neutralisierten Geometrischer Geometrischer Untersuchungsmuster Virusart verwendeten- Einheiten mittlerer Titer Affen von infektiösem Virus*) Kontrolle I II I01,5 284 2 II 101,5 809 3 II 100,8 773 Vaccine-Produkt, enthaltend I 12 101,5 <4 Thiomerosal 2 12 101,5 26 (C = 1: I00 000) 3 I2 100,8 9 *) Wirksamkeit der Standardlösung, die bei den Versuchen verwendet wurde.Table 2 Number of Number of geometrical neutralized Geometric Examination pattern virus type used - units medium titer Monkeys of infectious Virus*) Control I II I01.5 284 2 II 101.5 809 3 II 100.8 773 Vaccine product containing I 12 101.5 <4 Thiomerosal 2 12 101.5 26 (C = 1: I00000) 3 I2 100.8 9 *) Effectiveness of the standard solution used in the experiments.

Beispiel 2 Eine mit Formaldehyd inaktivierte Vaccine mit Poliomyelitis-Virus, Type I, 2 und 3, wurde hergestellt wie im Beispiel I und in aliquote Teile unterteilt. Ein aliquoter Teil wurde in unveränderter Form für die Verwendung als Kontrollmuster zurückbehalten. Example 2 A formaldehyde-inactivated vaccine with poliomyelitis virus, Type I, 2 and 3, were prepared as in Example I and divided into aliquots. An aliquot was left unaltered for use as a control retained.

Ein anderer aliquote Teil der Vaccine wurde in eine Vaccine nach der Erfindung bei tropfenweiser Zugabe von 5 cm3 einer Lösung von Benzäthoniumchlorid 1:200 im Verlauf von etwa 2 Minuten unter wirksamem Rühren in der Kälte zu je rl Vaccine hergestellt. Die anfallende Lösung mit Benzäthoniumchlorid in einer Konzentration von I : 40 ooo stellt die Vaccine nach der Erfindung dar. Another aliquot of the vaccine was placed in a vaccine after of the invention with the dropwise addition of 5 cm3 of a solution of benzethonium chloride 1: 200 in the course of about 2 minutes with effective stirring in the cold to each rl Vaccine manufactured. The resulting solution with benzethonium chloride in one concentration of I: 40,000 represents the vaccine according to the invention.

Um die Stabilität der antigenen Eigenscbaften der Vaccine nach der Erfindung bei der Lagerung zu bestimmen, wurde die Vaccine 4 Wochen bei 4° gelagert. Die Wirksamkeit jeder Virusart wurde dann, wie oben beschrieben, bestimmt. Die Kontrollprobe wurde gleichfalls 4 Wochen bei 4° gelagert, und dann wurde die Wirksamkeit jeder Virusart wie oben bestimmt. Die Ergebnisse dieser Wirksamkeitsversuche sind in Tabelle 3 wiedergegeben. In order to ensure the stability of the antigenic properties of the vaccine according to the To determine the invention during storage, the vaccine was stored for 4 weeks at 4 °. The effectiveness of each virus type was then determined as described above. The control sample was also stored at 4 ° for 4 weeks, and then the effectiveness of each Virus type as determined above. The results of these efficacy tests are shown in the table 3 reproduced.

Tabelle 3 Nummer der Zahl der neutralisierten Geometrischer Geometrischer Untersuchungsmuster Virusart verwendeten Einheiten mittlerer Titer Affen von infektiösem Virus*) Kontrolle 1 12 101,36 178 2 12 101,5 316 3 12 101,86 107 Vaccine-Produkt, enthaltend I 10 101,36 I52 Benzäthoniumchlorid 2 10 101,5 490 (c = I 40 ooo) 3 10 101,86 60 *) Wirksamkeit der Standardlösung, die bei den Versuchen verwendet wurde.Table 3 Number of Number of geometrical neutralized Geometric Examination pattern virus type units used medium titer Monkeys of infectious Virus*) Control 1 12 101.36 178 2 12 101.5 316 3 12 101.86 107 Vaccine product containing I 10 101.36 I52 Benzethonium chloride 2 10 101.5 490 (c = I 40,000) 3 10 101.86 60 *) Effectiveness of the standard solution used in the experiments.

Für Vergleichszwecke sind die Ergebnisse von Wirksamkeitsbestimmungen eines anderen Kontrollmusters und einer anderen Vaccine nach der Erfindung, die nach dem oben beschriebenen Verfahren, jedoch mit einer anderen mit Formaldehyd inaktivierten Vaccine, die die Typen I, 2 und 3 des Poliomyelitis-Virus enthielt, hergestellt wurden, in der Tabelle 4 wiedergegeben. For comparison purposes, the results are from effectiveness determinations another control sample and another vaccine according to the invention which according to the method described above, but with a different one with formaldehyde inactivated vaccines containing types I, 2 and 3 of the poliomyelitis virus, are shown in Table 4.

Tabelle 4 Nummer der Zahl der neutralisierten Geometrischer Geometrischer Untersuchungsmuster Virusart verwendeten Einheiten mittlerer Titer Affen von infektiösem Virus*) Kontrolle 1 II 101,36 68 2 II 101,5 I4I 3 II 101,86 76 Vaccine-Produkt, enthaltend 1 12 101,36 7I Benzäthoniumchlorid 2 12 I01,5 71 (c = I 40 ooo) 3 I2 101,86 76 *) Wirksamkeit der Standardlösung, die bei den Versuchen verwendet wurde.Table 4 Number of Number of geometrical neutralized Geometric Examination pattern virus type units used medium titer Monkeys of infectious Virus*) Control 1 II 101.36 68 2 II 101.5 I4I 3 II 101.86 76 Vaccine product containing 1 12 101.36 7I Benzethonium chloride 2 12 I01.5 71 (c = I 40,000) 3 I2 101.86 76 *) Effectiveness of the standard solution used in the experiments.

Wie aus den Ergebnissen der Tabellen 3 und 4 ersichtlich ist, behielten Vaccinen nach der Erfindung, die Benzäthoniumchlorid in einer Konzentration 1:40 ooo enthielten, ihre Wirksamkeit im Hinblick auf alle drei Virusarten bei einer Lagerung während 4 Wochen bei 4° bei. Die Kontrollproben behielten ihre Wirksamkeit unter den gleichen Bedingungen der Lagerung, aber waren empfindlich gegen eine Vergiftung durch Pilze und Schimmelpilze. Es ist auch ersichtlich, daß kein merklicher Unterschied zwischen der Wirksamkeit der Vaccinen, die Benzäthoniumchlorid enthielten, und der Wirksamkeit der Kontrollproben vorhanden war. As can be seen from the results in Tables 3 and 4, retained Vaccines according to the invention, the benzethonium chloride in a concentration of 1:40 ooo contained their effectiveness with respect to all three virus types in one Storage for 4 weeks at 4 ° at. The control samples retained their effectiveness under the same conditions of storage but were sensitive to poisoning through mushrooms and molds. It can also be seen that there is no noticeable difference between the effectiveness of vaccines containing benzethonium chloride and the Effectiveness of the control samples was present.

Claims

P A T E N T A N S P R Ü C H E: I. Method of making a Poliomyelitis vaccine, characterized in that an aqueous solution of poliomyelitis virus, which contains at least one killed or antigenic virus species, benzethonium chloride in a ratio of 1 g to 20,000 to 50,000 ccm, preferably 1 g to 40,000 ccm, Virus solution is added.

2. The method according to claim I, characterized in that the virus solution contains the killed or antigenic poliomyelitis virus types I, 2 and 3 and the Benzethonium chloride is used in aqueous solution.