DE930651C - Process for the purification and separation of the B group vitamins by partition chromatography - Google Patents
Process for the purification and separation of the B group vitamins by partition chromatographyInfo
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Description
Verfahren zur Reinigung und Trennung der Vitamine der Bl2-Gruppe durch Verteilungs chromatographie Die zweidimensionale Verteilungschromatographie von Konzentraten des Vitamin B12 bzw. der B2-Gruppe auf Zellulose ist unter dem Namen Papiefchromat,ographie bekannt. W. A. ÄVinsten und E. Eigen (J. biol. Chem. I77, 989; I8I, I09 {1949]) trennten Vitamin B12 und Desoxyriboside unter Benutzung von n-Butanol als mobile Phase. H. L. A.Process for purifying and separating the vitamins of the Bl2 group by Partition chromatography The two-dimensional partition chromatography of concentrates of vitamin B12 or the B2 group on cellulose is available under the name Papiefchromat, ographie known. W. A. ÄVinsten and E. Eigen (J. biol. Chem. I77, 989; I8I, I09 {1949]) separated vitamin B12 and deoxyriboside using n-butanol as a mobile Phase. H. L. A.
Tarr, B. A. Southcott und P. W. Ney (Food.Tarr, B. A. Southcott, and P. W. Ney (Food.
Technol., 4, 354 [I9501) trennten ebenfalls Vitamin B12 und Desoxyriboside unter den gleichen Versuchsbedingungen. E. Lester Smith et al.Technol., 4, 354 [I9501) also separated vitamin B12 and deoxyribosides under the same experimental conditions. E. Lester Smith et al.
(deutsches Patent 890 265) benutzten die Papierchromatographie bzw. die aus den Papierchromatogrammen errechneten Rf-Werte zur Unterscheidung zwischen den Vitaminen B12, B12b und BI2C- Sie verwendeten wassergesättigten sec.-Butylalkohol als Entwickler. E. Lester Smith, W.F.J.Cuthbertson, A. Walker und K. A. Lees (Feder. Proc. 9, Nr. I [I950]) benutzten als Entwickler höhere Alkohole bzw. Ketone zur papierchromatographischen Trennung der Vitamine B12 und B12b von Desoxyribosiden. V. Kocher, R. Karrer und H. R. Müller (Intern. Z. Vitaminforschg. 2I, 403 [I950]) befaßten sich mit der papierchromatographischen Trennung von Vitamin B12 und Desoxyribosiden unter Benutzung von Phenol, gesättigt mit einer wäßrigen 2 n-Na Cl-Lösung bzw. von wassergesättigtem n-Butanol oder wassergesättigtem Col- lidin. H. B. Woodruff und J. C. Foster (J, biol. (German patent 890 265) used paper chromatography resp. the Rf values calculated from the paper chromatograms to distinguish between the vitamins B12, B12b and BI2C- They used water-saturated sec-butyl alcohol as a developer. E. Lester Smith, W.F.J.Cuthbertson, A. Walker, and K. A. Lees (Feder. Proc. 9, No. I [1950]) used higher alcohols or ketones as developers paper chromatographic separation of vitamins B12 and B12b from deoxyribosides. V. Kocher, R. Karrer and H. R. Müller (Intern. Z. Vitaminforschg. 2I, 403 [I950]) dealt with the separation of vitamin B12 and deoxyribosides by paper chromatography using phenol, saturated with an aqueous 2N Na Cl solution or from water-saturated n-butanol or water-saturated col- lidine. H. B. Woodruff and J. C. Foster (J, biol.
Chem. I83, 569 [Ig501) versuchten, durch Sättigung der papierchromatographischen Streifen mit Salzlösungen die Wanderungsgeschwindigkeit der Vitamine BI2 und B12 a im n-Butanol-Wasser-Papierchromatogramm zu erhöhen. Sie erreichten das Ziel durch Verwendung von o,66-molaren K H2 P 04 Lösungen, in die die Papierstreifen eingetaucht und anschließend getrocknet wurden. So konnten die äußerst niedrigen Rf-Werte des Vitamin B12 (0,03 bis 0,I0) bzw. des Vitamin B12 a (o,o bis 0,03) erhöht werden. H. G. Wij menga (Dissertation, Utrecht 1951) trennte die Vitamine B12 und B12 b sowie seine Bl2-Faktoren WAB, WR und B12 m unter Benutzung von n-Butanol-Wasser bzw. n-Butanol-Eisessig-Wasser mit bzw. ohne KCN-Zusatz als Entwickler. Bei Verwendung von n-Butanol-Wasser entwickelte er die Papierchromatogramme während 67 bis 72 Stunden bei I6 bis I80. Der Trenneffekt war äußerst gering, was auch verständlich ist, weil alle Vitamin-Bl2-Faktoren Wijmengas im allgemeinen einen niedrigeren Rf-Wert haben als Vitamin B12 selbst. Durch Verwendung von n-Butanol-Eisessig-Wasser bzw. durch Sättigung der Papierstreifen mit KH2PO4 (unter Benutzung von n-Butanol-Wasser als Entwickler) konnte der Verfasser allerdings die Rf-Werte wesentlich steigern. Über die Trennschärfe unter diesen Bedingungen kann man sich keine Vorstellung machen, da die Substanzen dieses Verfassers nach späteren Ermittlungen nicht einheitlich waren. J. E. Ford, S. K.Chem. I83, 569 [Ig501) tried by saturation of the paper chromatographic Strip with salt solutions the migration speed of vitamins BI2 and B12 a in the n-butanol-water paper chromatogram. They reached the goal through Use of 0.66 molar K H2 P 04 solutions in which the paper strips are immersed and then dried. The extremely low Rf values of the Vitamin B12 (0.03 to 0, 10) or vitamin B12 a (0.03 to 0.03) can be increased. H. G. Wij menga (dissertation, Utrecht 1951) separated the vitamins B12 and B12 b as well as its BI2 factors WAB, WR and B12 m using n-butanol-water or n-butanol-glacial acetic acid-water with or without the addition of KCN as a developer. Using of n-butanol-water he developed the paper chromatograms for 67 to 72 hours at I6 to I80. The separation effect was extremely low, which is understandable because all vitamin Bl2 factors Wijmengas generally have a lower Rf value as vitamin B12 itself. By using n-butanol-glacial acetic acid-water or by Saturation of the paper strips with KH2PO4 (using n-butanol-water as Developer) the author was able to significantly increase the Rf values. Above the selectivity under these conditions cannot be imagined, since the substances of this author are not uniform according to later investigations was. J. E. Ford, S. K.
Kon und J. W. G. Porter (Biochem. J. 50, Proc. IX [I95I]) benutzten die Papierchromatographie zum Nachweis und zur Trennung von Vitamin-B12-Faktoren in Fäzes und Rumen. Unter Benutzung von sec.-Butanol als Entwickler und in Gegenwart von Cyanid konnten sie zwei neue Vitamin-Bl2-Faktoren, nämlich Faktor A (Rf o,I3) und Faktor B (Rf 0,54) neben Vitamin B12 (Rf 0,2g) bioautographisch mit E. Coli nachweisen. M. F.Kon and J. W. G. Porter (Biochem. J. 50, Proc. IX [195I]) used paper chromatography for the detection and separation of vitamin B12 factors in faeces and spaces. Using sec-butanol as a developer and in the presence from cyanide they were able to create two new vitamin Bl2 factors, namely factor A (Rf o, I3) and factor B (Rf 0.54) in addition to vitamin B12 (Rf 0.2g) bioautographically with E. Coli prove. M. F.
Patte (aus. pharm. Franc. 9, 747 [I95I]) trennte die Vitamine B12 und B12 b unter Verwendung von n-Butanol-Eisessig-Wasser als Entwickler. E. A.Patte (from. Pharm. Franc. 9, 747 [I95I]) separated the vitamins B12 and B12 b using n-butanol-glacial acetic acid-water as developer. E. A.
Kaczka, R. G. Denkewalter, A. Holland und K. Folkers (J. Am. Chem. Soc. 73, 335 [I95I]) untersuchten papierchromatographisch die Vitamine B12a und B1Zb unter Benutzung eines Gemisches aus IO°/o Eisessig, 400/0 n-Butanol und 500/o Wasser; sie stellten für die beiden Vitamine den gleichen Rt-Wert o,I4 fest. U. J. Lewis, D. V.Kaczka, R. G. Denkewalter, A. Holland and K. Folkers (J. Am. Chem. Soc. 73, 335 [I95I]) examined the vitamins B12a and B12a by paper chromatography B1Zb using a mixture of 10% glacial acetic acid, 400/0 n-butanol and 500 / o Water; they found the same Rt value 0.14 for the two vitamins. U. J. Lewis, D. V.
Tappanund CA. Elvehj em (J. biol. Chem. I94, 539; 199, 5I7 [1952]) untersuchten papierchromatographisch, unter Benutzung von wassergesättigtem n-Butanol sowie wassergesättigtem sec.-Butanol als Entwickler, Extrakte aus Rattenfäzes, in denen sie mit Hilfe dieser Methode einen neuen Vitamin-Bl2-Faktor, das Vitamin Bl2f, fanden. E. Lester Smith et al. (Biochem. J. 52, 389 [1952]) geben für Whatman-4-Papier und sec.-Butanol-Wasser folgende Rf-Werte an: 0,05 für Bl2b, etwa 0,2 für B12 und etwa 0,25 für B,,,. Z. G. Bánhidiund L. E. Ericson (Acta Chem. Scand. 7, 7I3 [1953]) wiesen papierchromatographisch unter Benutzung von n-Butanol-Wasser-Eisessig-Gemisch als Entwickler Vitamin B12 b in verschiedenen Algen nach. A. G. M.Tappan and CA. Elvehj em (J. biol. Chem. I94, 539; 199, 5I7 [1952]) examined by paper chromatography, using water-saturated n-butanol and water-saturated sec-butanol as a developer, extracts from rat faeces, in who, with the help of this method, obtain a new vitamin Bl2 factor, the vitamin Bl2f, found. E. Lester Smith et al. (Biochem. J. 52, 389 [1952]) give for Whatman-4 paper and sec-butanol-water have the following Rf values: 0.05 for Bl2b, about 0.2 for B12 and about 0.25 for B ,,,. Z. G. Bánhidi and L. E. Ericson (Acta Chem. Scand. 7, 7I3 [1953]) showed paper chromatography using a n-butanol-water-glacial acetic acid mixture as a developer of vitamin B12 b in various algae. A. G. M.
Sjöström und L. E. Ericson (Acta Chem.Sjöström and L. E. Ericson (Acta Chem.
Scand. 7, 870 [I953]) trennten papierchromatographisch, unter Benutzung von wassergesättigtem sec.-Butanol, enthaltend 3 O/o Eisessig und eine Spur KCN als Entwickler, Extrakte aus Flechten und wiesen unter anderem die VitamineBl2, Bl2s und den Faktor C nach.Scand. 7, 870 [I953]) separated by paper chromatography, using of water-saturated sec-butanol, containing 3 O / o glacial acetic acid and a trace of KCN as a developer, extracts from lichens and showed, among other things, the VitaminsBl2, Bl2s and the factor C.
Die Papierchromatographie dient ganz allgemein lediglich analytischen Zwecken und wird nur vereinzelt für präparative Zwecke verwendet; in diesen Fällen werden entweder dicke Kartons oder sogar Kolonnen, bestehend aus aufeinandergelegten Papierscheiben, verwendet. Beide Methoden können selbstverständlich nur besonderen wissenschaftlichen Zwecken dienen und fanden bis jetzt wegen ihrer Umständlichkeit bzw. Kostspieligkeit keinen allgemeinen Eingang in das Laboratorium; von ihrer Anwendung in der Technik kann wohl vorläufig keine Rede sein. In general, paper chromatography is only used for analytical purposes Purposes and is only used occasionally for preparative purposes; in these cases are either thick cardboard boxes or even columns, consisting of one on top of the other Paper discs, used. Both methods can of course only be special Serve scientific purposes and found until now because of their awkwardness or costliness no general entry into the laboratory; of their application in technology there can be no question for the time being.
Es ist auch bekannt, verschiedene Stoffgemische auf Chromatographiersäulen zu trennen, die aus Zellulosebrei bestehen (vgl. H. G. Cassidy, »Adsorption and Chromatography«, New York I95I) bzw. aus Zellulosepulver (J. N. Balston und B. E. Talbot, »Aguideto filter paper and cellulose powder chromatography«, London I952; F. Cramer, »Papierchromatographie«, 2. Aufl., Heidelberg 1953). It is also known to use different mixtures of substances on chromatography columns to separate, which consist of cellulose pulp (cf. H. G. Cassidy, »Adsorption and Chromatography ", New York 195I) or from cellulose powder (J. N. Balston and B. E. Talbot, "Aguideto filter paper and cellulose powder chromatography," London I952; F. Cramer, "Papierchromatographie", 2nd edition, Heidelberg 1953).
In manchen zusammenfassenden Werken (siehe F. Cramer, »Papierchromatographie«) wird die Ansicht vertreten, daß in der Regel auf der Säule die gleichen Rf-Werte erhalten werden wie im gewöhnlichen Papierchromatogramm. Danach müßte erwartet werden, daß die Trennung von Vitaminen der Bl2-Gruppe auf Säulen, bestehend aus Zellulose, n-Butanol und Wasser, praktisch undurchführbar ist- in Analogie zu den papierchromatographischen Erfahrungen. Im Gegensatz zu dieser Annahme wurde die völlig überraschende und unerwartete Beobachtung gemacht, daß bei Verwendung von entsprechend zubereiteten Chromatographiersäulen aus Zellulosepulver bzw. Zelluloseflocken, n-Butanol und Wasser sowie von wassergesättigtem n-Butanol (erforderlichenfalls mit Cyanidionenzusatz) als Entwickler ausgezeichnete Trennungen von Vitaminen der Bl2-Gruppe bei sehr großerLaufgeschwindigkeit der Zonen erreicht werden. Abgesehen von der großen Schärfe der Zonen werden bei der neuen chromatographischen Methode relative R-Werte R-Wet - Verschiebung der Bande Senkung der Flüssigkeitssäule über der Kolonne) .erzielt, die bei keiner der bisher bekannten papierchromatographischen bzw. chromatographischen Methoden zur Trennung der Vitamin-B12-Komponenten erreichbar waren. Die neue Beobachtung ist deshalb völlig überraschend, weil die Trennung der gleichen Gemische der Vitamin-Bl2-Gruppe mit Hilfe der papierchromatographischen Methode unter Verwendung des gleichen Entwicklers völlig versagt (was mit dem Stand der Technik auf Grund der obigen Literaturangaben übereinstimmt). Die Tatsache des sehr unterschiedlichen Verhaltens der gleichen Gemische von Vitamin-Bl2-Faktoren bei der verteilungschromatographischen Trennung auf dem Papier und in der Zellulosesäule bei Verwendung des gleichen Entwicklers ist wohl dadurch zu erklären, daß es sich hier um zwei verschiedenartige Trennungsmechanismen handelt. In some summarizing works (see F. Cramer, "Paper Chromatography") is of the opinion that, as a rule, the same Rf values on the column can be obtained as in the usual paper chromatogram. Then it would have to be expected that the separation of vitamins of the Bl2 group on columns, consisting of cellulose, n-Butanol and water, is practically impracticable - in analogy to the paper chromatographic Experience. Contrary to this assumption, the most surprising and unexpected Observation made that when using appropriately prepared chromatography columns from cellulose powder or cellulose flakes, n-butanol and water as well as from water-saturated n-Butanol (with the addition of cyanide ions if necessary) is an excellent developer Separation of vitamins of the Bl2 group at very high speed of the zones can be achieved. Apart from the great sharpness of the zones, the new chromatographic method relative R-values R-Wet - shift of the band lowering the liquid column above the column). achieves that in none of the previously known paper chromatographic or chromatographic methods for separating the vitamin B12 components were attainable. The new observation is completely surprising because the Separation of the same mixtures of the vitamin Bl2 group using paper chromatography Method under Using the same developer totally fails (which agrees with the state of the art based on the above literature). The fact of the very different behavior of the same mixtures of vitamin Bl2 factors in partition chromatographic separation on paper and in the cellulose column if the same developer is used, this can be explained by the fact that it is we are dealing here with two different types of separation mechanisms.
I. Bei der papierchromatographischen Trennung bewegt sich das Lösungsmittel im Papier dank der kapillaren Kräfte der Zellulosefaser. Dabei werden vermutlich die beiden Bestandteile des Lösungsmittelgemisches nicht in gleichem Maße aufgesaugt, so daß die Zusammensetzung des Entwicklers im Papier anders ist als in der Vorratsflüssigkeit. I. In the separation by paper chromatography, the solvent moves in paper thanks to the capillary forces of the cellulose fiber. This will presumably the two components of the solvent mixture are not absorbed to the same extent, so that the composition of the developer in the paper is different from that in the stock liquid.
2. Bei der Säulenchromatographie wird erfindungsgemäß die Zellulose vor der Einfüllung in die Säule mit genügend n-Butanol und Wasser gemischt. Bei der Entwicklung des Chromatogrammes kommen keine kapillaren Kräfte zur Geltung, es kann also keine Entmischung des Entwicklers stattfinden. 2. In column chromatography, according to the invention, the cellulose mixed with enough n-butanol and water before filling into the column. at no capillary forces come into play during the development of the chromatogram, no segregation of the developer can therefore take place.
Es ist natürlich möglich, daß noch weitere Faktoren für den Unterschied in der Wirksamkeit dieser beiden Methoden verantwortlich sind. Es erscheint jedenfalls völlig ausgeschlossen, daß dafür Unterschiede in der Zellulosequalität verantwortlich sind, denn es konnten bei der Säulenchromatographie praktisch mit jeder gut gereinigten und nicht zu stark abgebauten Zellulosesorte - sowohl aus Baumwolle als auch aus Holz - die gleichen Effekte erzielt werden. It is of course possible that other factors make up the difference are responsible in the effectiveness of these two methods. It appears anyway completely excluded that differences in the cellulose quality are responsible for this are, because column chromatography could be used to purify practically any well and not too degraded type of cellulose - both from cotton and from Wood - the same effects can be achieved.
Es wurde versucht, durch Variation der Arbeitsbedingungen bei der Papierchromatographie von Vitamin-B12-Faktoren den Trenneffekt zu erhöhen in der Annahme, daß durch teilweise Sättigung der Papierstreifen mit Wasser ähnliche Bedingungen erzielt und auch ähnliche Trenneffekte geschaffen werden wie bei der Säulenchromatographie. Wie aus der Tabelle I zu ersehen ist, schlugen diese Versuche fehl. Auch bei Sättigung der Papierstreifen mit Salzen konnten keine der erfindungsgemäßen Säulenchromatographie annähernd gleichen Effekte erzielt werden. An attempt was made by varying the working conditions at the Paper chromatography of vitamin B12 factors increase the separating effect in the Assumption that by partially saturating the paper strips with water similar conditions achieved and similar separation effects are created as in column chromatography. As can be seen from Table I, these attempts failed. Even with saturation the paper strips with salts could not use any of the column chromatography according to the invention approximately the same effects can be achieved.
Durch diese Versuche erscheint ausreichend bewiesen, daß die Säulenchromatographie in ihrem Wesen von der Papierchromatographie verschieden ist und daß unter keinen Versuchsbedingungen eine Angleichung der beiden Methoden möglich ist. These experiments seem to have sufficiently proven that column chromatography is different in essence from paper chromatography and that under none Test conditions an approximation of the two methods is possible.
Die Ergebnisse dieser Versuche sind in der Tabelle I zusammengestellt. Wie aus dieser Tabelle zu ersehen ist, konnte durch Erhöhung des Feuchtigkeitsgrades der Papierstreifen kein Effekt erzielt werden. Durch Sättigung der Papierstreifen mit Phosphatpuffer vom PH 7,0 konnte zwar eine schnellere Wanderung der Zonen erreicht werden, dieselben waren jedoch sehr undeutlich und gingen zum Teil ineinander über. Eine Übertragung dieser Arbeitstechnik auf die Zellulosesäule wäre - abgesehen von der mangelhaften Trennung - durch die Notwendigkeit der Verwendung von puffernden Salzen praktisch wertlos, da die Salze von den Vitamin-Bl2-Faktoren schwer abtrennbar sind. Die Trennbarkeit der Vitamin-Bl2-Faktoren I und II mit Hilfe von sec.-Butanol ist bei Verwendung von unbehandeltem Papier verhältnismäßig gut; die Faktoren III und V lassen sich aber im allgemeinen nicht gut trennen; auf mit Phosphatpuffer vom PH 7,0 imprägniertem Papier lassen sich zwar auch die Faktoren III und V trennen, die Zonen sind jedoch viel weniger scharf als ohne Verwendung von Salzen. The results of these tests are summarized in Table I. As can be seen from this table, by increasing the humidity level the paper strip no effect can be achieved. By saturating the paper strips with phosphate buffer of pH 7.0 a faster migration of the zones could be achieved but they were very indistinct and partly merged into one another. A transfer of this working technique to the cellulose column would be - apart from the inadequate separation - due to the need to use buffering Salts are practically worthless, as the salts are difficult to separate from the vitamin B12 factors are. The separability of the vitamin B12 factors I and II with the help of sec-butanol is relatively good when using untreated paper; the factors III In general, however, and V cannot be separated easily; on with phosphate buffer Factors III and V can be separated from the PH 7.0 impregnated paper, however, the zones are much less sharp than without the use of salts.
Tabelle I Papierchromatographie eines Gemisches der Vitamin-Bl2-Faktoren I, II, III und V, gewonnen aus Faulschlamm. Table I Paper Chromatography of a Mixture of Vitamin Bl2 Factors I, II, III and V, obtained from digested sludge.
Papier Whatman I. Temperatur I8-20°C.
Aus höheren Alkoholen bzw. Ketonen plus niederen Alkoholen kann man Gemische herstellen, deren Aufnahmefähigkeit für Wasser derjenigen für n-Butanol ähnlich ist und die daher etwa gleiche Trenneffekte wie n-Butanol ergeben. Die Verwendung von Lösungsmittelmischungen bietet jedoch gegenüber n-Butanol keine Vorteile. From higher alcohols or ketones plus lower alcohols one can Prepare mixtures whose water absorption capacity is that of n-butanol is similar and therefore give about the same separation effects as n-butanol. The usage However, solvent mixtures have no advantages over n-butanol.
Von den geprüften Zellulosesorten eignen sich sowohl solche aus Baumwolle als auch solche aus Holzzellstoff. Gewisse Unterschiede in der Wirksamkeit sind offenbar durch den Reinheitsgrad und die unterschiedliche Nachbehandlung bedingt. Of the types of cellulose tested, both those made of cotton are suitable as well as those made from wood pulp. There are certain differences in effectiveness apparently due to the degree of purity and the different aftertreatment.
Die mit Hilfe von sec.-Butanol in der Zellulosesäule erzielten Trenneffekte übertrafen die entsprechenden papierchromatographischen Ergebnisse. Die Trennung der B12-Komponenten III und V war jedoch trotzdem mangelhaft, wie folgender Versuch zeigt: 5 g Zellulosepulver wurden mit 50 ccm cyanidhaltigem wäßrigem sec.-Butanol geschüttelt und über Nacht stehengelassen. Sodann wurde dieses Gemisch in der weiter unten näher beschriebenen Weise in eine Kolonne eingefüllt. Als Entwickler diente ein Gemisch aus I60 ccm sec.-Butanol, 35 ccm Wasser und 5 ccm einer o,z0/oigen wäßrigen NaCN-Lösung vom pA 7,0. Bei der Entwicklung wurden folgende R-Werte beobachtet: Vitamin-Bl2-Faktor R-Wert I 0,35 - 0,46 II 0,11-0,18 III 0,04 - 0,07 V 0,03 - 0,05 Ein Vergleich dieser Werte mit den entsprechenden Werten der Tabelle I zeigt, daß unter Benutzung von sec.-Butanol die Säule-einen besseren Trenneffekt verursacht als das Papier. Infolge der zu geringen Unterschiede der R-Werte der beiden letzten Zonen gehen hier aber die Bl2-Faktoren III und V ineinander über. The separation effects achieved with the help of sec-butanol in the cellulose column exceeded the corresponding paper chromatographic results. The separation However, the B12 components III and V were still inadequate, as was the case in the following experiment shows: 5 g of cellulose powder were mixed with 50 ccm of cyanide-containing aqueous sec-butanol shaken and left to stand overnight. This mixture was then used in the next Filled into a column in the manner described in more detail below. Served as developer a mixture of 160 cc sec-butanol, 35 cc water and 5 cc of an o, z0 / o aqueous NaCN solution of pA 7.0. The following R values were observed during development: Vitamin B1 factor R value I 0.35 - 0.46 II 0.11-0.18 III 0.04 - 0.07 V 0.03 - 0.05 A comparison of these values with the corresponding values in Table I shows that Using sec-butanol, the column causes a better separation effect than the paper. As a result of the insufficient differences in the R values of the last two However, here the Bl2 factors III and V merge into one another.
Dagegen ergab die verteilungschromatographische Trennung der Vitamin-B12-Faktoren mit Hilfe von Zellulosesäulen unter Verwendung von n-Butanol-Wasser als Entwickler ausgezeichnete Ergebnisse, die weitaus besser sind als bei Benutzung aller anderen geprüften Alkohole und die daher die Basis für das erfindungsgemäße Verfahren vorstellen, das nachfoi gen d genau beschrieben wird. In contrast, the partition chromatographic separation of the vitamin B12 factors revealed with the help of cellulose columns using n-butanol-water as a developer excellent results far better than using any other tested alcohols and which therefore present the basis for the method according to the invention, the follow-up d is described in detail.
Entwickler. IOOO ccm n-Butanol werden mit 25 ccm einer z. B. o,20/oigen Natriumcyanidlösung vom p, 7,0 gemischt und dann mit kohlensäurefreiem Wasser bis zur Sättigung geschüttelt. Der Entwickler wird dann durch Stehenlassen oder Filtration geklärt. n-Butanol, das kleinere Mengen an Wasser enthält, z. B. IoO/o, eignet sich infolge der viel langsameren Entwicklung weniger als wassergesättigtes n-Butanol. Developer. 100 cc of n-butanol are mixed with 25 cc of a z. B. o.20 / oigen Sodium cyanide solution of p, 7.0 mixed and then with non-carbonated water up shaken to saturation. The developer is then left standing or by filtration clarified. n-butanol, which contains smaller amounts of water, e.g. B. IoO / o is suitable as a result of the much slower development less than water-saturated n-butanol.
Bereitung der Säule. Es werden z. B. 50 g Zellulosepulver mit 500 ccm n-Butanol, gesättigt mit kohlensäurefreiem Wasser, gemischt. Diese Mischung muß mindestens so viel an Cyanid-Ionen enthalten, als die Zellulose zu adsorbieren vermag. Preparation of the column. There are z. B. 50 g cellulose powder with 500 cc of n-butanol, saturated with non-carbonated water, mixed. This mixture must contain at least as much cyanide ions as the cellulose to adsorb able.
Anschließend werden unter kräftigem Schütteln oder Rühren z. B. 20 ccm kohlensäurefreies Wasser zugegeben. Es wird so lange geschüttelt oder gerührt, bis das Material völlig homogen ist. Nach mehrstündigem Stehen ist der Zellulosebrei gebrauchsfertig.Then, with vigorous shaking or stirring, z. B. 20 ccm of non-carbonated water was added. It is shaken or stirred for so long until the material is completely homogeneous. After standing for several hours, the cellulose pulp is ready to use.
Die adsorptive Sättigung der Zellulose mit Cyanidionen ist neben der Einhaltung eines neutralen pH-Wertes dazu notwendig, um alle Vitamin-Bt2-Faktoren stets in der gleichen Komplexform zu erhalten, damit definierte und reproduzierbare R-Werte erzielt werden. The adsorptive saturation of the cellulose with cyanide ions is next the maintenance of a neutral pH value is necessary for all vitamin Bt2 factors always to be obtained in the same complex form, so that it is defined and reproducible R values can be achieved.
Bei Verwendung von Zelluloseflocken wird entsprechend mehr an wassergesättigtem n-Butanol verwendet, da sonst die Masse zu dick wird. When using cellulose flakes, more water-saturated is produced accordingly n-butanol is used, otherwise the mass will be too thick.
Die zu füllende Säule, die üblicherweise unten mit einem Hahn verschlossen ist, wird mit der Entwicklerlösung zum Teil gefüllt. Anschließend wird in die Säule der n-Butanol-Zellulosebrei durch einen Trichter unter gleichzeitigem Öffnen des Ablaßhahnes eingebracht. Während des Absetzens der Zelluloseflocken wird die Säule immer wieder um ihre vertikale Achse gedreht, damit die Füllung gleichmäßig erfolgt. Der Zellulosebrei wird so lange nachgegossen, bis die abgesetzteFüllmasse ungefähr die doppelte Höhe der gewünschten Säule, also z. B. The column to be filled, which is usually closed at the bottom with a tap is partially filled with the developer solution. Then it is in the column the n-butanol cellulose pulp through a funnel while opening the Drain cock introduced. During the settling of the cellulose flakes, the column becomes always rotated around its vertical axis so that the filling takes place evenly. The cellulose pulp is poured in until the settled filling mass is approximately twice the height of the desired column, e.g. B.
I4 cm, besitzt, und der Flüssigkeitsspiegel 2 bis 3 cm iiber der Zellulosemasse liegt. Es wird nun in die Kolonne ein passendes Filterscheibchen eingesetzt (ohne das Luftbläschen unter das Scheibchens gelangen) und mit Hilfe eines passenden Stampfers die Zellulosesäule auf t/2 bis 2/3 der ursprünglichen Höhe zusammengedrückt. Sobald der Entwickler so weit abgetropft ist, daß der Flüssigkeitsspiegel fast verschwunden ist, wird der Hahn geschlossen und das zu chromatographierende Material, gelöst in wassergesättigtem n-Butanol oder aufgetragen auf ein trockenes Material, wie z. B. Kieselgur, durch einen Trichter in das Rohr eingefüllt. Falls das Material als Trockenprodukt aufgetragen wurde, wird es mit etwas wassergesättigtem n-Butanol angefeuchtet und nach Auflegen eines zweiten Filterpapierscheibchens mit Hilfe eines Stampfers leicht zusammengedrückt. Nach dem Öffnen des Hahnes werden nun durch Zugabe sehr geringer Mengen an Entwickler die Vitamin-B12-Faktoren in die eigentliche Säule gespült, wonach die Entwicklung beginnen kann.14 cm, and the liquid level 2 to 3 cm above the cellulose mass lies. A suitable filter disc is now inserted into the column (without the air bubble get under the disc) and with the help of a suitable tamper the cellulose column is compressed to t / 2 to 2/3 of the original height. As soon the developer has drained so far that the liquid level has almost disappeared the valve is closed and the material to be chromatographed is released in water-saturated n-butanol or applied to a dry material such as z. B. Kieselguhr, filled into the tube through a funnel. If the material was applied as a dry product, it is mixed with a little water-saturated n-butanol moistened and after placing a second piece of filter paper with the help of a The rammer slightly squeezed. After opening the tap are now by adding very small amounts of developer bring the vitamin B12 factors into the actual column flushed, after which development can begin.
Verlauf der Chromatographie. Es wurde durch zahlreiche Versuche, vor allem mit reinenVitaminen der Bi2-Gruppe, ermittelt, daß die Reihenfolge der Vitamin-B12-Faktoren bei der Entwicklung in der Zellulosesäule die gleiche ist wie im Papierchromatogramm bzw. auf der Aluminiumoxydsäule. Bei der Chromatographie eines Gemisches der Faktoren I und II läuft der Faktor I voran (vgl. Abb. I), bei einem Gemisch der Faktoren III und V der Faktor III (vgl. Abb. 2). Bei zahlreichen Chromatogrammen der Faktoren I, II, III und V wurden bestimmte, für jeden Faktor charakteristischeR-Werte beobachtet: Vitamin-B12-Faktor R-Wert I 0,40 - 0,59 II 0,21 - 0,29 III 0,08-0,123 V 0,04 - 0,059 Die Schwankungen der R-Werte sind auf die unterschiedliche Herstellungsweise der Säule zurückzuführen, da es nicht möglich ist, diesen Prozeß absolut gleichartig vorzunehmen. Während die relativen R-Werte vom Wassergehalt der Säule weitgehend unabhängig sind, hängen die absoluten R-Werte von der Menge des eingerührten Wassers sehr stark ab. Es empfiehlt sich daher, stets die gleiche Menge Wasser in den Zellulosebrei einzurühren, und zwar jene Menge an Wasser, bei der die optimale Trennschärfe der Vitamin-B12-Faktoren erzielbar ist. Eine Versuchsreihe, bei der je 5 g Zellulosepulver und 50 ccm n-Butanol, gesättigt mit Wasser, unter Zugabe verschiedener zusätzlicher Mengen Wasser geschüttelt worden waren, ergab, daß die optimale Menge an Wasser zwischen 1 und 3 ccm liegt. Ohne zusätzliches Wasser durchgeführte Versuche ergaben diffuse Zonen. Bei mehr als 3 ccm Wasser bildet das Zellulosepulver schwer zu beseitigende Zusammenballungen, wodurch die Zonen gleichfalls unscharf werden. Die absoluten R-Werte vermindern sich mit steigendem Wasserzusatz. Course of the chromatography. It has been proven through numerous attempts especially with pure vitamins of the Bi2 group, determined that the order of Vitamin B12 in development in the cellulose column is the same as factors in the paper chromatogram or on the aluminum oxide column. In chromatography a mixture of factors I and II is preceded by factor I (see Fig. I) a mixture of factors III and V, factor III (see Fig. 2). With numerous Chromatograms of factors I, II, III, and V were determined for each factor characteristic R values observed: vitamin B12 factor R value I 0.40 - 0.59 II 0.21 - 0.29 III 0.08-0.123 V 0.04 - 0.059 The fluctuations in the R values are on due to the different manufacturing methods of the column, as it is not possible is to undertake this process in an absolutely similar manner. While the relative R values are largely independent of the water content of the column, the absolute R values depend strongly depends on the amount of water stirred in. It is therefore advisable to always stir the same amount of water into the cellulose pulp, namely that amount of Water with which the optimal selectivity of the vitamin B12 factors can be achieved. A series of experiments in which 5 g of cellulose powder and 50 ccm of n-butanol are saturated with water, with the addition of various additional amounts of water showed that the optimal amount of water is between 1 and 3 cc. Without Tests carried out with additional water resulted in diffuse zones. If more than 3 ccm of water the cellulose powder forms agglomerations that are difficult to remove, whereby the zones are also blurred. Reduce the absolute R-values with increasing addition of water.
DieVorteile der geschilderten erfindungsgemäßen chromatographischen Methode sind vor allem folgende: I. Eine einfache Herstellbarkeit der Chromatographiersäule, 2. Eine kurze Entwicklungsdauer. Die Faktoren I und II können in 5 bis 6 Stunden entwickelt und eluiert werden. Die Faktoren III bis V benötigen I2 bis I8 Stunden. The advantages of the outlined inventive chromatographic The main methods are as follows: I. A simple manufacture of the chromatography column, 2. A short development period. Factors I and II can be used in 5 to 6 hours developed and eluted. The factors III to V take I2 to I8 hours.
3. Eine ungewöhnlich hohe Trennschärfe. Bei sorgfältiger Durchführung und bei nicht zu starker Verunreinigung mit Salzen bzw. mit organischen Fremdstoffen kann in einem Chromatogramm eine praktisch quantitative Trennung der Komponenten I, II, III und V erzielt werden (vgl. Abb. 3) 4. Die Billigkeit und die leichteRegenerierbarkeit des Entwicklers. Nach Extraktion der Vitamine der Bt2-Gruppe aus dem Eluat mit Wasser ist der Butylalkohol nach einer einfachen Destillation wieder gebrauchsfähig. 3. An unusually high degree of selectivity. With careful implementation and if the contamination with salts or organic foreign matter is not too great In a chromatogram, a practically quantitative separation of the components can be achieved I, II, III and V can be achieved (see Fig. 3) 4. Cheap and easy to regenerate of the developer. After extracting the vitamins of the Bt2 group from the eluate with water the butyl alcohol can be used again after a simple distillation.
5. Ein geringer Bedarf an Entwickler. Zur Durchführung der Chromatographie werden äußerst geringe Mengen an wassergesättigtem n-Butanol benötigt, was auch aus den Abb. I bis 3 zu ersehen ist. 5. A low need for developers. To carry out the chromatography extremely small amounts of water-saturated n-butanol are required, which also from Fig. I to 3 can be seen.
Die Abszisse zeigt das Volumen an benötigtem Entwickler, die Ordinate die Menge an eluiertem Vitamin-B12-Faktor; der letztgenannte Wert ist für die Faktoren II und III mit Hilfe folgender Formel zu errechnen: Vitamin-B12-Faktor ~ optische Dichte bei 36I m, in Gamma/ccm = oho207 Die Trennung der verschiedenen Vitamin-B,2-Arten aus Faulschlamm mit Hilfe der adsorptionschromatographischen Methode ist nur in bestimmter Ausführungsform durchführbar, nämlich besonders unter Verwendung von Aluminiumoxyd in Gegenwart von Cyanidionen im pH-Bereich 6 bis 8, vor allem unter Benutzung von Mischungen von Aceton mit Wasser, indem man die Konzentration an Wasser im Verlauf der Entwicklung des Chromatogramms allmählich steigert. Trotz der Brauchbarkeit dieser Methode hat sie aber im Vergleich mit dem erfindungsgemäßen Verfahren folgende Nachteile: I. Eine verhältnismäßig umständliche Herstellbarkeit der Adsorptionskolonne, 2. Eine lange Entwicklungsdauer. Ein Chromatogramm dauert oft mehrere Tage.The abscissa shows the volume of developer required, the ordinate the amount of vitamin B12 factor eluted; the latter value is for the factors II and III can be calculated using the following formula: Vitamin B12 factor ~ optical Density at 36I m, in gamma / ccm = oho207 The separation of the different vitamin B, 2 types from digested sludge using the adsorption chromatographic method is only available in certain embodiment feasible, namely especially using Aluminum oxide in the presence of cyanide ions in the pH range 6 to 8, especially below Use of mixtures of acetone with water by changing the concentration of water gradually increases in the course of the development of the chromatogram. Despite the usefulness However, this method has the following in comparison with the method according to the invention Disadvantages: I. A relatively laborious manufacture of the adsorption column, 2. A long development period. A chromatogram often takes several days.
3. Eine verhältnismäßig geringe Trennschärfe. 3. A relatively low selectivity.
In einem Chromatogramm kann nur der Faktor I praktisch quantitativ abgetrennt werden. Andere Faktoren müssen rechromatographiert werden.Only factor I can be used in a chromatogram practically be separated quantitatively. Other factors must be rechromatographed.
4. Hohe Verluste an Entwickler (z. B. Aceton) durch Verdunstung. Schwierigere Regenerierbarkeit des Entwicklers (z. B. Entwässerung von Aceton) . 4. High losses of developer (e.g. acetone) through evaporation. More difficult to regenerate the developer (e.g. dehydration of acetone).
5. Der Verbrauch an Entwickler beträgt das Vielfache des Volumens an wassergesättigtem n-Butanol im erfindungsgemäßen Verfahren. 5. The consumption of developer is a multiple of the volume of water-saturated n-butanol in the process according to the invention.
Es muß ausdrücklich betont werden, daß bei dem geschilderten Verfahren, dessen Nachteile gegenüber dem erfindungsgemäßen Verfahren auseinandergesetzt wurden, ein Adsorptionsmittel wie besonders Aluminiumoxyd verwendet wird, daß es sich also dabei um eine adsorptionschromatographische Methode handelt, bei der die Vitamine der B12-Gruppe an der Säule adsorbiert und durch den Entwickler eluiert werden. Dagegen beschreibt das erfindungsgemäße Verfahren eine verteilungschromatographische Methode, bei der keine Adsorption der Vitamin-B12-Faktoren an das Säulenmaterial stattfindet, sondern vielmehr eine Verteilung der Vitamine der Bl2-Gruppe zwischen dem in der Zellulosefaser festgehaltenen Wasser und dem vorbeifließenden Eluens. Die Vitamine der Bl2-Gruppe werden an Zellulose nicht adsorbiert. It must be expressly emphasized that in the process described, whose disadvantages compared to the method according to the invention have been discussed, an adsorbent such as aluminum oxide is used, so that it is this is an adsorption chromatographic method in which the vitamins of the B12 group are adsorbed on the column and eluted by the developer. In contrast, the method according to the invention describes a distribution chromatographic method Method in which there is no adsorption of the vitamin B12 factors on the column material takes place, but rather a distribution of vitamins of the Bl2 group between the water retained in the cellulose fiber and the eluent flowing past. The vitamins of the Bl2 group are not adsorbed on cellulose.
Verteilungschromatographische Methoden zur Trennung der Vitamine der Bl2-Gruppe in Chromatographiersäulen wurden bisher nur vereinzelt verwendet. So reinigten E. Lester Smith et al. (Proc. Distribution chromatographic methods for the separation of vitamins of the B1 group in chromatography columns have so far only been used sporadically. Thus, E. Lester Smith et al. (Proc.
Biochem. Soc. vom 29. 5. I948; Feder.. Proc. 9, Nr. I [I950]) den Antiperniziosafaktor mit Hilfe von Silikagelkolonnen, wobei sie als Entwickler zu zwei Drittel mit Wasser gesättigtes n-Butanol -allein oder mit Phenolzusatz - benutzten. Sie erhielten auch bei Verwendung von n-Propanol bzw.Biochem. Soc. from May 29, 1948; Spring .. proc. 9, No. I [1950]) den Antiperniziosafactor with the help of silica gel columns, using them as a developer too two-thirds of the water-saturated n-butanol, alone or with the addition of phenol, were used. Even when using n-propanol or
Isopropanol, enthaltend IO bis 20 O/o Wasser, zufriedenstellende Chromatogramme. Die gleichen Autoren verwendeten auch Stärke an Stelle von Silikagel. Sie beobachteten auf Stärkekolonnen R-Werte von 0,5 bzw. I,2 für die Vitamine B12b bzw. Bl2. K. H. Fantes et al. (Proc. Roy. Soc.Isopropanol containing 10 to 20% water, satisfactory chromatograms. The same authors also used starch in place of silica gel. They watched on starch columns R values of 0.5 and 1.2 for vitamins B12b and Bl2. K. H. Fantes et al. (Proc. Roy. Soc.
B I36, 592, [I950]) benutzten zur Entwicklung der Silikagel -Verteilungschromatogramme n-Butanol, enthaltend II bis I2 O/o Wasser. Diese Verfasser beschrieben auch Versuche mit Silikagelkolonnen unter Verwendung von Mischungen aus n-Butanol und Phenol bzw. Kresol an Stelle von reinem n-Butanol.B I36, 592, [I950]) used to develop the silica gel distribution chromatograms n-butanol containing II to I2 O / o water. These authors also described experiments with silica gel columns using mixtures of n-butanol and phenol or Cresol instead of pure n-butanol.
Sie fanden, daß diese Mischungen keine nennenswerten Vorteile gegenüber n-Butanol haben, bis auf eine etwas raschere Elution. Bei Verwendung von Mischungen aus n-Propanol bzw. Isopropanol und IO bis 25 0/o Wasser als Entwickler wurden Verteilungschromatogramme erhalten, die den mit n-Butanol-Wasser erzielbaren sehr ähnlich waren.They found that these blends had no appreciable advantages over them have n-butanol, except for a somewhat faster elution. When using mixtures distribution chromatograms were obtained from n-propanol or isopropanol and 10 to 25% water as developer obtained that were very similar to those achievable with n-butanol-water.
U. J. Louis Lewis et al. (J. Biol. Chem. I94, 539, cm9521) chromatographierten das aus Fäzes gewonnene Vitamin-Bl2-aktive Material mit Hilfe von Silikagelsäulen unter Benutzung von wassergesättigtem Butanol als Entwickler Die Vitamin-Bl2-Faktoren, die am oberen Ende der Kolonne festgehalten waren (die also nicht entwickelt wurden), entfernten die Verfasser samt dem Silikagel und eluierten daraus das aktive Material mit 650/oigen Athanol. J. E. Ford und J. W. G. Porter (Biochem. J. 51, Proc. V [1952]) chromatographierten die aus Kalbsfäzes gewonnenen Vitamine der Bl2-Gruppe an feuchtem Silikagel unter Benutzung von wassergesättigtem sec.-Butanol, enthaltend eine Spur an Cyanid. Sie trennten mit Hilfe dieser Methode das Gemisch von Vitamin-B12-Faktoren in zwei Fraktionen, von denen die eine Vitamin B12 und den Faktor B enthielt, die andere den Faktor A, allerdings nicht in völlig reinem Zustand.Louis Lewis, U. J. et al. (J. Biol. Chem. I94, 539, cm9521) the vitamin Bl2-active material obtained from faeces with the help of silica gel columns using water-saturated butanol as a developer The vitamin Bl2 factors, that were held at the top of the column (that were not developed), the authors removed together with the silica gel and eluted the active material from it with 650% ethanol. J. E. Ford and J. W. G. Porter (Biochem. J. 51, Proc. V [1952]) The vitamins of the Bl2 group obtained from calf faeces were chromatographed on moist Silica gel using water-saturated sec-butanol, containing a trace of cyanide. With the help of this method, they separated the mixture of vitamin B12 factors in two fractions, one of which contained vitamin B12 and factor B, the others the factor A, but not in a completely pure state.
Die verteilungschromatographischen Versuche mit Stärkesäulen ergaben, daß sich dieses Material zur Trennung von Gemischen von Vitamin-B12-Faktoren aus Faulschlamm nicht eignet. Es wurden mehrere Stärkesorten unter Verwendung verschiedener Entwickler untersucht, wobei stets sehr diffuse Chromatogramme ohne Zonenbildung erhalten wurden. The partition chromatographic experiments with starch columns showed that this material is used to separate mixtures of vitamin B12 factors Digested sludge is not suitable. Several types of starch have been made using different ones Investigated developer, with always very diffuse chromatograms without zone formation were obtained.
Auch Silikagelkolonnen erlaubten bei Verwendung von mit Wasser völlig mischbaren Alkoholen mit dem üblichen Gehalt an Wasser und Cyanid keine Trennung von Gemischen der Vitamin-B12-Faktoren aus Faulschlamm. Nicht viel besser verhielt sich in diesem Fall wassergesättigtes sec.-Butanol. Eine teilweise Trennung gelang bei Verwendung von wassergesättigtem n-Butanol, allerdings nur bei Anwendung sehr großer Volumina an Entwickler und bei mehrtägiger Entwicklungsdauer. Es wurde in einem Beispiel ein aus Faulschlamm gewonnenes gereinigtes Konzentrat der Vitamine der Bl2-Gruppe mit Hilfe einer Silikagelsäule unter Verwendung von wassergesättigtem n-Butanol und Cyanid als Entwickler chromatographiert, im Prinzip nach der Vorschrift von E. Lester Smith et al. (Biochem. J. 52, 389 [1952]). Wie aus der Abb. 4 zu ersehen ist, konnten auf diese Weise die Vitamine der Bl2-Gruppe in vier Fraktionen (I bis 4) aufgeteilt werden. Zwecks genauerer Identifizierung dieser Fraktionen wurden die Eluate fraktionsweise vereint und nach entsprechender Konzentrierung mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens auf Zellulose-n-Butanol-Wasser-Kolonnen chromatographiert. Das Ergebnis ist in Tabelle 2 wiedergegeben. Even silica gel columns completely allowed when using with water Miscible alcohols with the usual content of water and cyanide do not separate of mixtures of vitamin B12 factors from digested sludge. Not much better behaved in this case water-saturated sec-butanol. A partial separation succeeded when using water-saturated n-butanol, but only when using very large volumes of developer and development time of several days. It was in an example of a purified concentrate of vitamins obtained from digested sludge the Bl2 group with the help of a silica gel column using water-saturated Chromatographed n-butanol and cyanide as developers, in principle according to the instructions by E. Lester Smith et al. (Biochem. J. 52, 389 [1952]). As can be seen from Fig. 4 is, in this way the vitamins of the Bl2 group could be divided into four fractions (I to 4) be split. In order to more accurately identify these fractions were the eluates are combined in fractions and, after appropriate concentration, with the aid of the process according to the invention is chromatographed on cellulose-n-butanol-water columns. The result is shown in Table 2.
Aus der Tabelle 2 ist zu ersehen, daß die mit Hilfe der Silikagelsäule erhaltenen Fraktionen, mit Ausnahme der Fraktion I, mit den Nachbarfraktionen verunreinigt waren. Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens konnten aber die Fraktionen I bis 4 mit Leichtigkeit gereinigt werden. From Table 2 it can be seen that with the help of the silica gel column obtained fractions, with the exception of fraction I, contaminated with the neighboring fractions was. With the help of the method according to the invention, however, the fractions I to 4 can be cleaned with ease.
Auch eine Wiederholung der Chromatographie ergab völlig homogene Zonen.A repetition of the chromatography also gave completely homogeneous zones.
Das neue erfindungsgemäße Verfahren wird durch folgendes Beispiel
näher erläutert: Beispiel Ein aus Faulschlamm gewonnenes und vorgereinigtes Gemisch
von Vitamin-Bl2-Faktoren, niedergeschlagen auf Kieselgur und getrocknet, wird auf
eine Säule aufgetragen, die nach obiger Beschreibung aus Zellulosepulver, n-Butanol
und Wasser unter Zusatz der üblichen Menge an
Tabelle 2 Verteilungschromatographie
der Fraktionen I bis 4 (aus der Silikagelchromatographie) auf einer Zellulose-n-Butanol-Wasser-Kolonne.
Nach Entwicklung mitwassergesättigtem n-Butanol, enthaltend die übliche Menge an Natriumcyanid, werden die einzelnen Vitamin-Bl2-Faktoren in praktisch völlig getrennter Form im Eluat aufgefangen. Die Faktoren II und III können dann ohne weitere Reinigung zur Kristallisation gebracht werden (vgl. dazu Abb. 3). After development with water-saturated n-butanol containing the usual Amount of sodium cyanide, the individual vitamin Bl2 factors are in practically completely separated form in the eluate. The factors II and III can then without further Purification can be brought to crystallization (see Fig. 3).
Abb. 1 zeigt die Verteilungschromatographie eines Gemisches der Vitamin-Bl2-Faktoren I und II aus Faulschlamm mit Hilfe einer Kolonne aus Zellulosepulver, n-Butanol und Wasser unter Zusatz von Cyanid. Entwickler: wassergesättigtes und C N'haltiges n-Butanol, Säulendurchmesser 11.5 mm, Höhe 70 mm; Abb. 2 zeigt die Verteilungschromatographie eines Gemisches der Vitamin-Bl.,-Faktoren III und V aus Faulschlamm; Versuchsbedingungen wie Abb. I; Abb. 3 zeigt die Verteilungschromatographie eines Gemisches der Vitamin-Bl2-Faktoren I, II, III und V aus Faulschlamm; Versuchsbedingungen wie Abb. I; Abb. 4 zeigt die Verteilungschromatographie eines gereinigten Faulschlammkonzentrats mit Hilfe einer Kolonne aus Silikagel, n-Butanol und Wasser unter Zusatz von Cyanid. Entwickler: wassergesättigtes und C N'haltiges n-Butanol. Fig. 1 shows the partition chromatography of a mixture of the vitamin B12 factors I and II from digested sludge using a column made of cellulose powder, n-butanol and water with the addition of cyanide. Developer: water-saturated and C N'-containing n-butanol, column diameter 11.5 mm, height 70 mm; Fig. 2 shows the partition chromatography a mixture of vitamin Bl., - factors III and V from digested sludge; Test conditions like Fig. I; Fig. 3 shows the partition chromatography of a mixture of the vitamin B12 factors I, II, III and V from digested sludge; Test conditions as in Fig. I; Fig. 4 shows the Partition chromatography of a purified digested sludge concentrate using a Column made of silica gel, n-butanol and water with the addition of cyanide. Developer: water-saturated and C N'-containing n-butanol.
Säulendurchmesser 26 mm, Höhe 200 mm.Column diameter 26 mm, height 200 mm.
Claims (6)
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DEA19312A DE930651C (en) | 1953-12-11 | 1953-12-11 | Process for the purification and separation of the B group vitamins by partition chromatography |
Applications Claiming Priority (1)
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DEA19312A DE930651C (en) | 1953-12-11 | 1953-12-11 | Process for the purification and separation of the B group vitamins by partition chromatography |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE930651C true DE930651C (en) | 1955-07-21 |
Family
ID=6924413
Family Applications (1)
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DEA19312A Expired DE930651C (en) | 1953-12-11 | 1953-12-11 | Process for the purification and separation of the B group vitamins by partition chromatography |
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Country | Link |
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DE (1) | DE930651C (en) |
-
1953
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