Verfahren zur Herstellung von Aminosäuren Freie Aminosäuren, ob einzelne
oder Gemische derselben, gewinnen u. a. für die Therapie verschiedener Stoffwechselerkrankungen
eine sich ständig steigernde Bedeutung. Sieht man von der Ausarbeitung der Synthese
verschiedener Vertreter dieser wichtigen Körperklasse gib, so ist die technische
Darstellung im wesentlichen immer noch an eine rationelle und schonende Aufspal
tung .geeigneter Eiweißkörper gebunden. Dieser Abbau von Eiweißkörpern läßt sich
in zwei Gruppen einteilen: nämlich enzymatische Spaltung und die Hydrolyse mittels
geeigneter chemischer Reagenzien, üblicherweise hochprozentiger Säuren oder Laugen.
Bei der chemischen Arbeitsweise besteht die Gefahr, daß die Hydrolyseprodukte noch
weitere Umgestaltung erfahren, so daß einzelne Aminosäuren zerstört oder umgelagert
werden. Das Reaktionsprodukt kann dann ,dem natürlichen Aminosäurebedürfnis .des
Organismus nicht mehr vollkommen genügen. Man hat deswegen auch immer wieder versucht,
den Abbau mittels bestimmter Enzyme durchzuführen, ohne jedoch bislang hierdurch
zu einem vor -allem hinsichtlich des erreichbaren Abbaugrades befriedigenden Ergebnis
zu gelangen. Das liegt vor -allem daran, daß einzelne Proteinasen bekanntlich nur
spezifisch wirken bzw. nur einen teilweisen Albau herbeiführen. Man hat so auch
mittels zu .diesem Zweck aus tierischen Organen isolierter Enzyme lediglich Gemische
von Aminosäuren, Di-, Tri- und Polypeptide ndbe-n unverändertem
Eiweiß
erhalten können. -Dabei hat sich gezeigt, daß der Pegtidanteil um so größer ist,
je weniger verschiedenartige Proteinasen, Peptidasen usw. in dem angewendeten Fermentpräparat
enthalten sind. So ist z. B. das Endprodukt der Spaltung von Kasein mit reinstem,
kristallisiertem Tryps.in annähernd -frei von Aminosäuren, während ein rohes Trypsinpräparat
immerhin so weit aufspaltet, @daß etwa 150!o des Gesamtstickstoffs in .Form freier
Aminosäuren vorliegt. Mit gemahlenen Pankreas,drüsen vom Schwein läßt sich der Abbau
nach Aktivierung durch Eiterokinase aus Darmschleimhaut maximal so weit treiben,
daß etwa 50% des Gesamtstickstoffs als Aminostickstoff im Hydrolysat enthalten sind.
Um die enzymatische Hydrolyse über das genannte Maß hinaus weiterzutreiben, mußte
man daher anschließend an die Spaltung mit Pankreasfermenten noch diejenigen aus
Darmschleimhaut zur Anwendung bringen, wobei es notwendig ist; Idas pH der Lösung
auf einen anderen Wert einzustellen. Aus diesen Beispielen geht hervor, daß sich
eine technisch befriedigende Darstellung von Aminosäuren auf enzymatischem Wege
bisher nicht hat finden lassen. Die Lukrativität dieser Arbeitsweise ist weiterhin
dadurch beeinträchtigt, däß sich die ungespaltenen Peptide einer Isolierung entziehen
bzw. bei einer Anwendung solcher Präparate zur parenteralen Ernährung im allgemeinen
vom Körper ungenutzt wieder ausgeschieden werden.Process for the production of amino acids Free amino acids, whether single
or mixtures thereof, win i.a. for the therapy of various metabolic diseases
an ever increasing importance. If you look at the drafting of the synthesis
different representatives of this important body class, so is the technical one
Representation still essentially in a rational and gentle Aufspal
suitable protein body bound. This breakdown of protein bodies can
divide into two groups: namely enzymatic cleavage and hydrolysis by means of
suitable chemical reagents, usually high-percentage acids or bases.
When working chemically, there is a risk that the hydrolysis products will still be
experience further remodeling, so that individual amino acids are destroyed or rearranged
will. The reaction product can then, the natural amino acid requirement .des
No longer completely sufficient for the organism. That’s why one has tried again and again
to carry out the degradation by means of certain enzymes, but without this so far
to a result that is particularly satisfactory in terms of the degree of degradation that can be achieved
to get. This is mainly due to the fact that individual proteinases are known to only
have a specific effect or only bring about a partial Albau. One has like that too
only mixtures by means of enzymes isolated from animal organs for this purpose
of amino acids, di-, tri- and polypeptides ndbe-n unchanged
protein
can get. -It has been shown that the proportion of pegtide is the greater,
the fewer the different types of proteinases, peptidases, etc. in the ferment preparation used
are included. So is z. B. the end product of the cleavage of casein with the purest,
crystallized Tryps.in almost free of amino acids, while a raw trypsin preparation
at least splits so far that about 150! o of the total nitrogen is freer in form
Amino acids is present. With ground pancreas, glands from pork can be broken down
after activation by pus kinase from the intestinal mucosa, max.
that about 50% of the total nitrogen is contained as amino nitrogen in the hydrolyzate.
In order to continue the enzymatic hydrolysis beyond the stated extent, one had to
therefore, after the cleavage with pancreatic ferments, those are still removed
Apply the intestinal mucosa, where necessary; Idas the pH of the solution
set to a different value. From these examples it can be seen that
a technically satisfactory representation of amino acids by enzymatic means
so far has not been found. The profitability of this way of working is still
impaired by the fact that the uncleaved peptides evade isolation
or when such preparations are used for parenteral nutrition in general
are excreted by the body unused.
Es wurde nun gefunden, daß man durch Züchtung von Schimmelpilzen besondere
Fermentgemische erhält, die sich u. a. durch ihre außerordentlich starke proteolytische
Wirksamkeit auszeichnen. Diese beruht auf (der Mannigfaltigkeit zahlreicher neben-
bzw. nacheinander angreifender Fermente verschiedenster Wirkungsrichtung, deren
Aktivitätsoptima bei den verschiedensten pH-Werten liegen. Wie bei der Verwendung
- bestimmter Enzyme tierischer Organe ist man also nicht mehr auf die Einstellung
und Einhaltung eines bestimmten pH-Wertes angewiesen, sondern es ergibt sich automatisch
ein gleitendes pH, so daß die Spaltung viel weiter führt. Während z. B. das Verhältnisdes
a-Aminostickstoffs zum Gesamtstickstoff beim tryptischen Abbau mit Pankreasferment
bei Kasein den Wert 47 bis 52 erreicht, was :der Hydrolyse von etwa 57 bis 630/9
der Peptidbindungen entspricht (vgl. S aynne »Outline of the amino aci,ds and proteins«
1j948}, S. 9o), wird mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens ein Verhältnis von
75 bis 8z0% erzielt, so daß ein über 95%iger Abbau herbeigeführt wind, welcher Wert
somit an den Eadabbau von Proteinen mittels Säuren heranreicht. -Während ferner
bei der Anwendung von Fermenten des Pankreas und der Darmschleimhaut der relativ
geringe Grad der Endspaltung erst nach mehreren Wochen erreicht wird, wird mittels
der erfindungsgemäß anzuwendenden Fermentgemivsche; unter denen sich die verschiedensten
katheptischen und ereptischen Proteasen und Peptidasen befinden> innerhalb weniger
Tage eine nahezu völlige Spaltung in einzelne Aminosäuren erzielt. Das Verfahren
der Erfindung besteht demgemäß darin, daß man auf Eiweißkörper solche Enzymgemische
zur Einwirkung bringt, welche bei der Kultivierung von Schimmelpilzen entstehen
und aus den Kulturen in üblicher Weise zu gewinnen sind. Da die katheptischen Pröteasen
fester an den Zellen verankert zu sein scheinen als,die tryptischen Fermente, bringt
man zwecks voller Entfaltung .der proteolytischen Aktivität der erfindungsgemäß
anzuwenden(den Enzymgemische die Zellen der sie enthaltenden Schimmelpilzkulturen
zum Platzen, ohne sie jedoch der Autolyse zu unterwerfen. Geeignete Verfahren sind
z. B. die Behandlung mit Salzlösungen hoher Konzentration öder wiederholtes Gefrieren
und Auftauen.It has now been found that by cultivating molds one can obtain special ones
Ferment mixtures obtained, which inter alia. by their extraordinarily strong proteolytic
Distinguish effectiveness. This is based on (the multiplicity of numerous adjacent
or successively attacking ferments of various directions of action, their
Activity optima lie at the most varied of pH values. As with the use
- So one is no longer on the attitude of certain enzymes of animal organs
and compliance with a certain pH value, but it arises automatically
a sliding pH so that the cleavage goes much further. While z. B. the relationship of the
α-amino nitrogen to total nitrogen in tryptic degradation with pancreatic ferment
with casein it reaches the value 47 to 52, which: the hydrolysis of about 57 to 630/9
corresponds to the peptide bonds (cf. Saynne "Outline of the amino aci, ds and proteins"
1j948}, p. 9o), a ratio of
75 to 80% achieved, so that a degradation of over 95% is brought about, which value
thus comes close to the degradation of proteins by means of acids. -While further
in the application of ferments of the pancreas and the intestinal mucosa of the relative
low degree of final cleavage is only reached after several weeks, is means
the fermentation mixture to be used according to the invention; among which are the most diverse
catheptic and ereptic proteases and peptidases are> within a few
Days achieved an almost complete breakdown into individual amino acids. The procedure
of the invention accordingly consists in using such enzyme mixtures on protein bodies
brings into action, which arise during the cultivation of molds
and can be obtained from the cultures in the usual way. There the catheptic proteases
appear to be more firmly anchored to the cells than that which tryptic ferments bring
for the purpose of full development .der proteolytic activity of the invention
apply (to the enzyme mixtures the cells of the mold cultures containing them
to burst, but without subjecting them to autolysis. Suitable procedures are
z. B. treatment with high concentration saline solutions or repeated freezing
and thawing.
Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens sind die verschiedensten
Schimmelpilze geeignet, so vor allem aber die Aspergillusarten, wie z. B. Aspergillws
parasiticus, Aspergillus orycae, Aspergillus wentii, Aspergillus alleaceus, Aspergillus
fumigatus, aber auch verschiedene Penicilliumarten, wie Penicillium roseo-citricum,
Penicillium .glaucum, Penicillium notatum usw.There are many different ways of carrying out the method according to the invention
Molds suitable, but especially the Aspergillus species, such as. B. Aspergillws
parasiticus, Aspergillus orycae, Aspergillus wentii, Aspergillus alleaceus, Aspergillus
fumigatus, but also various types of Penicillium, such as Penicillium roseo-citricum,
Penicillium glaucum, Penicillium notatum, etc.
Die gemäß der Erfindung erhaltenen Aminosäuregemische können als solche
pharmazeutische oder technische Anwendung finden oder auch zur Isolierung einzelner
Aminosäuren dienen. Beispiel 4,5 kg einer durch Züchtung von Asperg illus orycae
auf einem aus Weizenkleie und Fischmehl bestehenden Nährboden erhaltenen noch feuchten
Pilzmasse werden mit 4,5 kg Wasser angetei.gt und bei - ro°' ausgefroren, worauf
malt .die Masse wieder auftauen läßt und gegebenenfalls den Vorgang wiederholt.
Die Extraktion erfolgt durch mehrmaliges gründliches Vermischen mit Wasser und .anschließendes
Auspressen. Es werden so 251 Exttaktionsfiü ssigkeit erhalten, welche man auf eine
Aufquellung von 25 kg Kasein in 175 1 Wasser einwirken läßt. Nach dem Hinzufügen
von 1,51 Toluol als Konservierungsmittel wird langsam bei 45° digeriert. Der Verlauf
der Spaltung läßt sich .durch Formoltitration verfolgen. Sie ist bei einem Verhältnis
von formoltitrierbarem Stickstoff zum Gesamtstickstoff (Kjeldahl) von
0,75
bis 0,8o ,beendet. Nach beendeter Hydrolyse wird die Aminos-äurelösung
filtriert und gegebenenfalls zur Gewinnung eines Trockenproduktes unter Anwendung
der hierfür bekannten Verfahren der schonenden Trocknung unterworfen. Man erhält
so 32 kg eines Trockenpulvers, welches zur oralen oder, in geeigneter Lösung, zur
parenteralen Therapie Anwendung finden oder als Ausgangsmaterial für die Gewinnung
einzelner Aminosäuren dienen kann.The amino acid mixtures obtained according to the invention can be used as such in pharmaceutical or industrial applications or can also be used to isolate individual amino acids. Example 4.5 kg of a still moist mushroom mass obtained by cultivating Asperg illus orycae on a nutrient medium consisting of wheat bran and fish meal are mixed with 4.5 kg of water and frozen out at -ro °, whereupon the mass can be thawed again and repeat the process if necessary. The extraction is carried out by thoroughly mixing several times with water and then squeezing it out. In this way, 25 liters of exchange liquid are obtained, which are allowed to act on a swelling of 25 kg of casein in 175 liters of water. After adding 1.5 l of toluene as a preservative, digestion is carried out slowly at 45 °. The course of the cleavage can be followed by formol titration. It ends at a ratio of nitrogen that can be titrated by formol to total nitrogen (Kjeldahl) of 0.75 to 0.8o. After the hydrolysis has ended, the amino acid solution is filtered and, if necessary, subjected to gentle drying using the methods known for this in order to obtain a dry product. This gives 32 kg of a dry powder which can be used for oral or, in a suitable solution, for parenteral therapy or can be used as starting material for the production of individual amino acids.