DE86649T1

DE86649T1 - Molekulare klonierung und charakterisierung der fuer das schweine-relaxin kodierenden gen-sequenz.

Info

Publication number: DE86649T1
Application number: DE1983300714
Authority: DE
Inventors: John Douglas Hawthorn Victoria Haley; Peter John Bulleen Victoria Hudson; Hugh David Elwood Victoria Niall; John Australian Capital Territory Shine
Original assignee: Howard Florey Institute of Experimental Physiology and Medicine
Current assignee: Florey Institute of Neuroscience and Mental Health
Priority date: 1982-02-12
Filing date: 1983-02-11
Publication date: 1985-04-11

Claims

ΒΟΕΗΜΕΚΓ& M)EMMERTj ^. ^ Ansprüche

1. Gen für die Expression von Schweinepräproelaxin, oder einer Untereinheit desselben oder ein Äquivalent eines derartigen Gens oder Untereinheit.

2. Doppelsträngiges DNA-Fragment für die Expression von
Schweinepräprorelaxin dadurch gekennzeichnet, daß es einen kodierenden Strang und einen komplementären Strang, entsprechend der nachfolgenden vollständigen mRNA Sequenz aufweist:

AUG CCG CGC CUG UUC UCC UAC CUC CUA GGU GUC UGG CUG CUC CUG AGC CAA CUU CCC AGA GAA AUC CCA GGC CAG AGU ACG AAC GAU UUU AUU AAG GCA UGC GGC CGA GAA UUA GUC CGU CUG UGG GUG GAG AUC UGU GGC UCC GUC UCC UGG GGA AGA ACU GCU CUC AGC CUG GAA GAG CCU CAG CUG GAA ACU GGA CCC CCG GCA GAA ACC AUG CCA UCC UCC AUC ACC AAA GAU GCA GAA AUC UUA AAG AUG AUG UUG GAA UUU GUU CCU AAU UUG CCA CAG GAG CUG AAG GCA ACA UUG UCU GAG AGG CAA CCA UCA CUG AGA GAG CUA CAA CAA UCA GCA UCA AAG GAU UCG AAU CUU AAC UUU GAA GAA UUU AAG AAA AUU AUU CUU AAC AGA CAA AAU GAA GCA GAA GAC AAA AGU CUU UUA GAA UUA AAA AAC UUA GGU UUA GAU AAA CAU UCC AGA AAA AAG AGA CUG UUC CGU AUG ACA CUG AGC GAG AAA UGU UGU CAA GUA GGU UGU AUC AGA AAA GAU AUU GCU AGA UUA UGC UGAAAAGGAGCUAAUGAUAUAUUUUAUAUAAUGUUCACAUGUAUUCUCAGUGACA UAUUCACUUAUGCCUCUGUCACCCACUGAUUAUUAGCACUGUUUAGUGUUUAGGU UUUUCAUUUUAUGUGUAAGAAAAUGUCCCUUGCAUUAAUGUAGUUUCUGCUAAUA AUAUUUUUUUAAACUAAAAGGUAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

BOBH]StERPS

oder eine Unterheit desselben oder ein Äquivalent eines derartigen Gens oder Untereinheit.

3. Untereinheit des in Anspruch 1 oder Anspruch 2 beanspruchten Gens.

4. Gen für die Expression von Schweineprorelaxin, oder einer Unterheit desselben oder eines Äquivanlenten eines derartigen Gens oder Untereinheit.

5. Doppelsträngiges DNA-Fragment für die Expression von Schweineprorelaxin, dadurch gekennzeichent, daß es einen kodierenden Strang und einen komplementären Strang, entsprechend der folgenden mRNA Sequenz aufweist: CAG AGU ACG AAC

GAU UUU AUU AAG GCA UGC GGC CGA GAA UUA GUC CGU CUG UGG GUG GAG AUC UGU GGC UCC GUC UCC UGG GGA AGA ACU GCU CUC AGC CUG GAA GAG CCU CAG CUG GAA ACU GGA CCC CCG GCA GAA ACC AUG CCA UCC UCC AUC ACC AAA GAU GCA GAA AUC UUA AAG AUG AUG UUG GAA UUU GUU CCU AAU UUG CCA CAG GAG CUG AAG GCA ACA UUG UCU GAG AGG CAA CCA UCA CUG AGA GAG CUA CAA CAA UCA GCA UCA AAG GAU UCG AAU CUU AAC UUU GAA GAA UUU AAG AAA AUU AUU CUU AAC AGA CAA AAU GAA GCA GAA GAC AAA AGU CUU UUA GAA UUA AAA AAC UUA GGU UUA GAU AAA CAU UCC AGA AAA AAG AGA CUG UUC CGU AUG ACA CUG AGC GAG AAA UGU UGU CAA GUA GGU UGU AUC AGA AAA GAU AUU GCU AGA UUA UGC

oder eine Untereinheit desselben oder ein Äquivalent eines eines derartigen Gens oder Untereinheit.

6. Gen für alleinige Expression der Signal-, A,B oder C-Peptid-Ketten von Schweinerelaxin oder irgendeiner Kombination von zwei oder mehreren dieser Ketten.

BOEHMERT & BOEHMERT .

7. Doppelsträngiges DNA Fragment für die Expression der Signalpeptidkette von Schweinepraprorelaxin, dadurch gekennzeichnet, daß es einen kodierenden Strang und einen komplementären Strang, entsprechend der nachfolgenden mRNA Sequenz,aufweist:

AUG CCG CGC CUG UUC UCC UAC CUC CUA GGU GUC UGG CUG CUC . CUG AGC CAA CUU CCC AGA GAA AUC CCA GGC

oder eine Untereinheit desselben oder ein Äquivalent eines derartigen Gens oder Untereinheit.

8. Doppelsträngiges DNA-Fragment für die Expression der A-Peptidkette von Schweinepraprorelaxin, dadurch gekennzeichnet, daß es einen kodierenden Strang und einen komplementären Strang, entsprechend der nachfolgenden mRNA-Sequenz,aufweist:

CGU AUG ACA CUG AGC GAG AAA UGU

UGU CAA GUA GGU UGU AUC AGA AAA GAU AUU GCU AGA UUA UGC

9. Doppelsträngiges--DNA-Fragment für die Expression der B= Peptidkette von Schweinepraprorelaxin, dadurch gekennzeichnet, daß es einen kodierenden Strang und einen komplementären Strang, entsprechend der nachfolgenden mRNA-Sequenz, aufweist:

CAG AGU ACG AAC

GAU UUU AUU AAG GCA UGC GGC CGA GAA UUA GUC CGU CUG UGG GUG GAG AUC UGU GGC UCC GUC UCC UGG GGA AGA ACU GCU CUC

BÜBHMüKl <fe

10. Döppelsträngiges DNA Frapgment für die Expression der C-Peptidkette von Schweinepraprorelaxxn, dadurch gekennzeichnet, daß es einen kodierenden Strang und einen komplementären Strang, entsprechend der folgenden mRNA-Sequenz,aufweist:

AGC CUG GAA GAG CCU CAG CUG GAA ACU GGA CCC CCG GCA GAA

ACC AUG CCA UCC UCC AUC ACC AAA GAU GCA GAA AUC UUA AAG

AUG AUG UUG GAA UUU GUU CCU AAU UUG CCA CAG GAG CUG, AAG

GCA ACA UUG UCU GAG AGG CAA CCA UCA CUG AGA GAG CUA CAA

CAA UCA GCA UCA AAG GAU UCG AAU CUU AAC UUU GAA GAA UUU

AAG AAA AUU AUU CUU AAC AGA CAA AAU GAA GCA GAA GAC AAA

AGU CUU UUA GAA UUA AAA AAC UUA GGU UUA GAU AAA CAU UCC

AGA AAA AAG AGA CUG UUC

11. Döppelsträngiges DNA-Fragment für die Expression eines aus einer Kombination von irgendwelchen zwei oder mehreren der Signal·, A, B und C Peptidketten von Schweinepraprprelaxin bestehenden Peptides, dadurch gekennzeichnet, daß es einen kodierenden Strang und einen komplementären Strang, entsprechend der geeigneten Kombination der mRNA-Sequenzen, die in den vorangehenden Ansprüchen 7 bis 10 gegeben sind, aufweist,

12. Döppelsträngiges DNA-Fragment, ausgewählt aus den folgenden:

BOEKMERT &

00?6649

3'

GAAGAATTTAAGAAAA CTTCTTAAATTCTTTT

AGGAGCTGAAGGCA TCCTCGACTTCCGT

CAAAGATGCAGA GTTTCTACGTCT

TGTCTGAGAGGC ACAGACTCTCCG

TGAAGCAGAAGA ACTTCGTCTTCT

AGAGCTACAACAA TCTCGATGTTGTT

AAAAACTTAGG TTTTTGAATCC

GGTTGTATCAGAA CCAACATAGTCTT.

13. Verfahren für die Isolation eines chromosomalen Relaxingens von Menschen oder anderen Primaten oder verwandten Spezies, dadurch gekennzeichnet, daß es den Einsatz einer Untereinheit des Gens, wie es in irgendeinem der Ansprüche 1 bis definiert ist, oder eines Äquivalenten einer derartigen Untereinheit als Probe aufweist.

14. Verfahren für die Herstellung eines Gens oder eines Äquivalenten desselben oder einer Untereinheit desselben, wie in irgendeinem der vorangehenden Ansprüche beschrieben, dadurch gekennzeichnet, daß es Einsatz von rekombinanten

— D —

DNA Techniken aufweist, um eine cDNA Kloh^-Bähk aus vollständiger mRNA herzustellen, einsetzt, welche aus Schweineeorpora luteaisoliert worden ist, und Screenen der Klon-Bank unter Verwendung einer cDNA-Probe, welche durch das

r 5 ' 3 Ί

synthetische Oligonucleotd-d L ATCTCCAGCA J initiiert wird.

15. DNA-Transfervektor, dadurch gekennzeichnet, daß er eine cDNA-Deoxynucleotidsequenz entsprechend einem Gen, wie in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 11 definiert, oder eine Untereinheit eines derartigen Gens oder ein Äquivalent eines derartigen Gens oder Untereinheit enthält.

16. Gen- oder DNA-Transfervektor, wie in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 1.1 und 15 beansprucht, dadurch gekennzeichnet, daß ein oder mehrere natürliche Kodons oder ihre cDNA-Äquivalente durch ein anderen Kodon ersetzt sind, welches für die gleiche Aminosäure kodiert.

17. Gen- oder DNA-Transfervektor, wie in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 11 und 15 beansprucht, dadurch gekennzeichnet, daß ein oder mehrere der natürlichen Kodons fehlen und/öder durch Kodons ersetzt sind, die für andere Aminosäuren kodieren, als diejenigen, die im natürlichen Kodon kodieren, und/oder weitere Kodons an die natürliche Squenz angefügt sind.

18. DNA-Transfervektor, wie in irgendeinem der Ansprüche 15

bis 17 beansprucht, dadurch gekennzeichnet, daß er ein bakterielles Plasmid ist.

19. DNA-Transfervektor, wie in irgendeinem der Ansprüche 15 bis 17 beansprucht, der Bakteriophagen-DNA ist.

BOEKMERT St B

20. Durch einen Transfervektor, wie in irgendeinem der Ansprüche 15 bis 17 beansprucht, transformierte Zelle.

21. Verfahren zum Herstellen eines..DNA-Transfervektors,

zum Lrhalt und Vervielfachen einer Deoxynukleotid-Sequenz, die für Schweinepräprorelaxin oder eine Untereinheit desselben kodiert, dadurch gekennzeichnet, daß es das Umsetzen der geeigneten Oeoxynukleotid-Sequenz von Schweinepräprorelaxin oder der Untereinheit mit einem DNA-Molekül, welches durch Schneiden eines Tranfervektors mit einem Restriktionsenzym hergestellt wird, aufweist.

22. Verfahren zum Herstellen eines DNA-Transfervektors zum Einsatz beim Erhalt und Vervielfachen einer Deoxynukleotid-Sequenz/ die für Schweineprorelaxin kodiert, dadurch gekennzeichnet, daß es das Umsetzen der geeigneten Deoxynukletid Sequenz von Schweineprorelaxin mit einem DNA Molekül aufweist, das durch ^Schneiden eines Transfervektors mit einem Restriktionsenzym hergestellt wurde.

23. Verfahren zum Herstellen eines DNA-Transfervektors zum Einsatz beim Erhalt und Vervielfachen einer Deoxynukleotid-Sequenz, die für das Signalpeptid oder die A, B oder C-Kettenpeptide von Schweinepräprorelaxin oder irgendeiner Kombination von zwei oder mehreren Peptide kodiert, dadurch gekennzeichnet, daß es das Umsetzen der geeigneten D.eoxynukleotid-Sequenz mit einem DNA-Molekül, welches durch Schneiden eines Transfervektors mit einem Restriktionsenzym hergestellt wurde, aufweist.

24. Verfahren zum Herstellen eines Fusionsproteins, welches eine Aminosäuresequenz, die aus der vollständigen oder Teilen der Aminosäuresequenz von Schweinepräprorexlaxin als C-terminale Sequenz und einem Abschnitt eines Prokaryonten-Proteins als N-terminale Sequenz besteht, aufweist, dadurch

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gekennzeichnet, daß es das Inkubieren eines mit einen Expressionstransfervektor transformierten Mikroorganismus aufweist, der die geeignete Deoxynakleotid-Saquenz aufweist..

25. Verfahren zum Synthetisieren von Schweineprorelaxin, welches die A und B-Peptide, die voneinander durch ein C-Peptide getrennt sind, aufweist, dadurch gekennzeichnet, daß es das Inkubieren eines Mikroorganismus, welcher durch einen Expressionstransfervektor, der eine für das Schweineprorelaxin unter für die Expression der für Schweineprorelaxin kodierenden Sequenz günstige Bedingang kodierende Deoxynukleotid Sequenz aufweist, und Reinigen des Schweineprorelaxins aus dem Lysat oder Kulturmedium des Mikroorganismus.

26. Fusionsprotein, welches eine Aminosäuresequenz aufweist, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus der vollständigen oder Teilen der Aminosäuresequenz von Schweinepräprorelaxin als C-terminale Sequenz und einem Abschnitt eines Prokaryonten-Proteins als N-terminale Sequenz besteht.

27. Synthetisches Schweinepräprorelaxin.

28. Synthetisches Schweineprorelaxin.

29. Synthetische A, B oder C-Peptidketten von Schweineprorelaxin.