DE8325958U1

DE8325958U1 - Device for immersion cryofixation of biological-medical objects

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Publication number: DE8325958U1
Application number: DE19838325958
Authority: DE
Original assignee: C Reichert Optische Werke AG
Current assignee: C Reichert Optische Werke AG
Priority date: 1983-09-09
Filing date: 1983-09-09
Publication date: 1985-07-11

Description

C. Reichert Optische Werke AG
Hernalser Hauptstr. 219, A-1170 WienC. Reichert Optische Werke AG
Hernalser Hauptstr. 219, A-1170 Vienna

Vorrichtung zur Immersions-Kryofixation von biologischmedizinischen Objekten f Device for immersion cryofixation of biological medical objects f

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Immersions-Kryofixation von biologisch-medizinischen Objekten, mit einer Injektionsvorrichtung und einem unter dieser angeordneten Kühlbadbehälter. Der Kühlbadbehälter dient zur Aufnahme des insbesondere heute zumeist verwendeten verflüssigten und auf nahe -19Ö°C abgekühlten Propans, in das mit einer Geschwindigkeit zwischen 5 und 15 m/sec biologisch-medizinische Objekte für eine nachfolgende mikroskopische, insbesondere elektronefttnikroskopische Untersuchung injiziert werden.The invention relates to a device for immersion cryofixation of biological-medical objects, with an injection device and one arranged below it Cooling bath tank. The cooling bath container is used to hold the liquefied liquid that is mostly used today and propane cooled to close to -19Ö ° C, into which at a speed of between 5 and 15 m / sec biological-medical objects for a subsequent microscopic, in particular electron microscopic Investigation to be injected.

Für zahlreiche Präparations3r5eiten,
ren ("Kryofixation") kleiner biologischer oder medizinischer Proben für nachfolgende mikroskopische Untersuchungen verwendet man Kühlbäder mit Temperaturen zwischen -100°C und -190⁰C mit einem Volum zwischen 5 und 100 ml. Das Ziel einer derartigen Abkühlung der eingebrachten Probe (Durchmesser meist zwischen 0,5 und 5 mm) kann nur dann erreicht werden, wenn der Oberfläche des Objekts binnen kürzester Zeit möglichst viel Wärme entzogen wird. Dies gilt vor allem für biologische oder medizinische Objekte ohne Vorbehandlung (d.h. ohne vorangehende Fixation und/oder Gefrierschutz-Behandiang), da in diesem Fall ausschließlich die Geschwindigkeit der Abkühlung ("Abkühlrate") darüber entscheidet, ob eine artefizielle Entmischung der wasserreichen plasmatischen Phasen stattfindet, welche eine sinnvolle mikroskopische Untersuchung unmöglich macht, oder ob das Objekt lebensgetreu glasig erstarrt (" Vitrifikation" bei Abkühlraten ^ 10.000 °C/sec). Die erforderlichen Abkühlraten 5^ 10.000°C/sec werden nur in einer Randzone des Objektes von maximal 30 μΐη Tiefe erreicht, wobei die Tiefe der einwandfrei vitrifizierten Randzone im Wesentlichen von der Temperatur und den spezifischen Eigenschaften des Kühlmediums sowie der Geschwindigkeit des eintretenden Objekt-For numerous preparation sides,
ren ( "cryofixation") is less biological or medical samples for subsequent microscopic examination using cooling baths with temperatures between -100 ° C and -190 ⁰ C with a volume of between 5 and 100 ml. The object of such cooling the introduced sample (diameter usually between 0.5 and 5 mm) can only be achieved if as much heat as possible is extracted from the surface of the object in the shortest possible time. This applies above all to biological or medical objects without pretreatment (ie without prior fixation and / or antifreeze treatment), since in this case only the speed of cooling ("cooling rate") decides whether an artificial segregation of the water-rich plasmatic phases takes place , which makes a meaningful microscopic examination impossible, or whether the object solidifies glassy true to life ("vitrification" at cooling rates of ^ 10,000 ° C / sec). The required cooling rates of 5 ^ 10,000 ° C / sec are only achieved in an edge zone of the object with a maximum depth of 30 μΐη, whereby the depth of the perfectly vitrified edge zone depends essentially on the temperature and the specific properties of the cooling medium as well as the speed of the entering object.

tes bestimmt warden. Nach dem Stand der Technik bietet verflüssigtes und bis nahe an seinen Gefrierpunkt (-190⁰C) abgekühltes Propan die besten Voraussetzungen. Man erreicht mit diesem Kühlmedium initiale Abkühlraten im Bereich um 100.000^oC/sec, muß aber hierfür das Objekt mit Geschwindigkeiten über 6m/sec in die Flüssigkeit einschießen. Während das Verflüssigen, das Abkühlen und das thermostatische Aufbewahren von Propan keine Probleme aufweist, sind mit dem Einschießen der Probe erhebliehe Probleme und Risiken verbun- ., den. Beim Einschießen der Probe mit höheren Geschwindigkeiten bis zu IS m/sec verspritzt stets eine erhebliche Menge der Kühlflüssig keit. Dies gilt besonders, wenn die Gesamtmenge des Kryogens im Hinblick auf die Risiken von Propan (Brennbarkeit, Explosionsgefahr) unter 100 ml gehalten, der Durchmesser der Probe und/oder des In jektors 3 mm überschreiten und für eine hinreichende Abkühlung der Probe eine Weglänge von 5 bis 10 cm im Kühlmedium benötigt wird. Zwar ist die Anwendung unbrennbarer Kühlmedien (z. B. halogenierte Kohlenwasserstoffe, wie FREON 13 mit einem Siedepunkt von -185⁰C) möglich, doch bleiben auch hierbei abgesehen von der um 20% geringeren Abkühlrate Probleme und Risken bestehen: So erzeugt auch das Verspritzen dieses Mediums wie alle anderen alternativ einsetzbaren Medien die Gefahr schwerer Verbrennungen, wenn derart tief abgekühlte Flüssigkeit auf die Haut oder gar auf das Auge trifft. Darüber -hinaus treten bei hohen Geschwindigkeiten ^. 10 m/sec und bei den üblichen Durchmessern der Proben und Probenhalter (rd. 3 bis 5 mm) sowie der Injektoren (rd. 5 mm) über 90% des Kühlmediums irreversibel aus dem Kühlbad aus. Die verbleibenden 10% reichen auch bei kleinen Proben und geringen Wärmekapazitäten der Probenhalterung und Injektionsvorrichtung nicht mehr zur einwandfreien Abkühlung aus. Vielmehr bewirkt die im Inneren des Objekts und/oder der Objekthal terung einschließlich des Injektors nach der stets nur oberflächlichen initialen Abkühlung verbliebene Wärmemenge in diesem Fall eine sekundäre Aufwärmung der Probenoberfläche und damit eine artefizielle Entmischung der zunächst einwandfrei vitrifizierten Probenoberfläche. On die Qualität der Kryofixation durch erhöhte Injektionsgeschwindigkeit steigern zu können, sowie auch aus Sicherheitsgründen, ist es daher wünschenswert, Vorkehrungen zu treffen, die das insbesondere bei höheren Injektionsgeschwindigkeiten auftretende Verspritzen des Kühlmediums verhindern. tes be determined. According to the prior art liquefied and to near its freezing point (-190 ⁰ C) cooled propane offers the best conditions. With this cooling medium, initial cooling rates in the region of 100,000 ^o C / sec can be achieved, but for this the object must be shot into the liquid at speeds of over 6 m / sec. While the liquefaction, cooling and thermostatic storage of propane presents no problems, there are significant problems and risks associated with injecting the sample. When the sample is injected at higher speeds of up to IS m / sec, a considerable amount of the cooling liquid always splatters. This applies in particular if the total amount of the cryogen is kept below 100 ml with regard to the risks of propane (flammability, risk of explosion), the diameter of the sample and / or the injector exceeds 3 mm and a path length of 5 mm for sufficient cooling of the sample up to 10 cm in the cooling medium is required. Although the application of non-flammable cooling media (e.g., halogenated hydrocarbons such as Freon 13 having a boiling point from -185 ⁰ C.) Is possible, but remain in this case, apart from the 20% less cooling problems and risks exist: So also generates the spattering This medium, like all other media that can be used as an alternative, carries the risk of severe burns if such a deeply cooled liquid hits the skin or even the eye. In addition, occur at high speeds ^. 10 m / sec and with the usual diameters of the samples and sample holders (approx. 3 to 5 mm) as well as the injectors (approx. 5 mm) over 90% of the cooling medium is irreversibly removed from the cooling bath. The remaining 10% is no longer sufficient for proper cooling, even with small samples and low heat capacities of the sample holder and injection device. Rather, the amount of heat remaining inside the object and / or the object holder including the injector after the always only superficial initial cooling causes secondary heating of the sample surface and thus an artificial segregation of the initially perfectly vitrified sample surface. In order to be able to increase the quality of the cryofixation by increasing the injection speed, as well as for safety reasons, it is therefore desirable to take precautions that prevent the cooling medium from splashing, which occurs particularly at higher injection speeds.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zu Grunde, die vorstehend genannten Nachteile zu vermeiden, d.h. eine Vorrichtung zu schaffen, durch die auch bei Injektionsgeschwindigkeiten über 5m/sec ein Verspritzen der Kühlflüssigkeit unterbleibt oder zumindest so reduziert wird, daß weder ein Sieherheitsrisiko noch eine Qualitätsminderung der Kryofixation eintritt.The invention is therefore based on the object mentioned above To avoid disadvantages, i.e. to create a device through which splashing occurs even at injection speeds above 5m / sec the coolant is omitted or at least reduced so that neither a security risk nor a reduction in quality cryofixation occurs.

Zur Lösung dieser Aufgilbe schlägt die Erfindung eine Ausgestaltung mit den Merkmalen nach den Kennzeichen des Sch'utzanspruches 1 vor.To solve this problem, the invention proposes an embodiment with the features according to the characteristics of the protection claim 1.

Die Erfindung sieht also vor, daß der gesamte Weg, den die Probe bei der Injektion nimmt, durch eine im Kühlbad vorgekühlte Hülse so abgeschirmt wird, daß dasi beim Eintritt und weiteren Eindringen des Injektors mit der auf dem Probenhalter befestigten Probe in die Kühlflüssigkeit unvermeidlich verdrängte und daher verspritzende Kühlmedium vornehmlich von den kalten Wänden der Hülse in das Kühlbad zurückgeleitet wird und dort augenblicklich wieder zum weiteren Wärmeentzug ("Nachkühlung") aus der Probe und Probenhalterung zur Verfügung steht. In einem werden auf diese Weise alle Risiken ausgeschaltet, die mit einem Verspritzen des Kühlmediums im Laboratorium verbunden sind.The invention therefore provides that the entire path that the sample takes during injection is through a sleeve pre-cooled in the cooling bath It is shielded that dasi upon entry and further penetration of the Injector with the sample attached to the sample holder in the coolant inevitably displaced and therefore splashing cooling medium is mainly fed back from the cold walls of the sleeve into the cooling bath and there instantly again for further heat extraction ("Post-cooling") from the sample and sample holder is available. In this way all risks are eliminated, which are associated with splashing of the cooling medium in the laboratory.

Ein System der ei findungsgemäßen Art kann in einfachster Ausbildung darin bestehen, daß in ein Kühlbad zylindrischer Form eine zylindrische Hülse eingesetzt wird, die unmittelbar vor der Auslösung der Injektion manuell mit einem geeigneten Werkzeug so angehoben wird, daß sie den Injektor mit Probe komplett abschließt. Das verspritzende Kühlmedium wird dabei vornehmlich von den Seitenwänden der Hülse, zum geringeren Teil von einer waagerechten Abschlußplatte geringer Wärmekapazität so in das Kühlbad zurückgeleitet, daß sie dieses binnen kürzester Zeit und ohne störende Aufwärmung wieder füllt.Unter den gegebenen Voraussetzungen können die Teile und ihre Wärmekapazitäten im Vergleich mit der Wärmekapazität des Kühlmediums so dimensioniert werden, daß die durch den Spritzschutz verursachte Aufwärmung des Kühlmediums maximal 30°C beträgt (z.B. Erwärmung bei Propan von -190 auf -160°C) , so daß der wesentliche Anteil der Wärmekapazität der Kühlflüssigkeit nach wie vor für die Abkühlung der Probe einschließlich der Probenhalterung und des Injektors zur Verfügung steht.A system of the type according to the invention can be of the simplest form consist in that a cylindrical sleeve is inserted into a cooling bath of cylindrical shape, which is immediately before the triggering of the injection is lifted manually with a suitable tool so that it completely closes the injector with the sample. The splashing one The cooling medium is mainly reduced from the side walls of the sleeve and, to a lesser extent, from a horizontal end plate Heat capacity fed back into the cooling bath in such a way that it fills it again within a very short time and without annoying warming up Given the given conditions, the parts and their heat capacities can be compared with the heat capacity of the cooling medium dimensioned so that the heating of the cooling medium caused by the splash guard does not exceed 30 ° C (e.g. heating with propane from -190 to -160 ° C), so that the majority of the Heat capacity of the coolant still for cooling the sample including the sample holder and the injector is available.

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Sinnvolle Ausgestaltungen der Erfindung können darin bestehen, daß das Anheben der Hülse entweder durch Druck- oder Zugfedern oder durch eine elektrische oder elektromagnetische Vorrichtung bekannter Art bewirkt wird. Der besondere Vorteil dieser Ausgestaltungen besteht in einer erheblichen Abkürzung der Hubzeit und damit in einer Reduktion des Risikos einer vorzeitigen Abkühlung der Probe durch die kalte Hülsenwandung sowie in einer einfacheren und sicheren Auslösung des Hubes.Sensible refinements of the invention can consist in that the lifting of the sleeve either by compression or tension springs or by an electrical or electromagnetic device is more known Kind is effected. The particular advantage of these designs consists in a considerable shortening of the lifting time and thus in a reduction of the risk of premature cooling of the sample the cold sleeve wall as well as a simpler and more reliable triggering of the stroke.

Eine weitere Ausgestaltung der Erfindung kann den für jede Kryofixation entscheidenden zeitlichen Ablauf dadurch weiter abkürzen und besser reproduzierbar machen« daß zwischen dem Hub der Hülse und dem Auslösen der Injektion eine Wirkverbindung hergestellt wird, welche sicherstellt, daß die Injektion zum frühest möglichen Zeitpunkt ausgelöst wird. Das Risiko einer vorzeitigen Abkühlung der Probe wird hierdurch weiter reduziert. Die Resultate der Kryofixation werden damit gänzlich unabhängig von der Geschicklichkeit und Übung der Bedienungsperson. Darüber hinaus wird das Risiko einer vorzeitigen Injektion ohne oder ohne zureichenden Spritzschutz ausgeschaltet und damit eine optimale Betriebssicherheit gewährleistet.A further embodiment of the invention can be used for every cryofixation further shorten the decisive time sequence and make it more reproducible «that between the stroke of the sleeve and the triggering of the injection an active connection is established, which ensures that the injection is carried out at the earliest possible point in time is triggered. The risk of premature cooling of the sample is increased further reduced as a result. The results of the cryofixation are thus completely independent of the skill and practice of the operator. In addition, the risk of a premature injection without or without adequate splash protection is eliminated and thus ensuring optimal operational safety.

Im Hinblick auf die zumeist im gleichen Instrument durchzuführendeWith regard to the mostly to be carried out in the same instrument

Verflüssigung des Kühlmediums (z.B. Propangas »flüssigesLiquefaction of the cooling medium (e.g. propane gas »liquid

Propan) und den durch eine genau eingepaßte Hülse möglichen Verschluß der Austrittsöffnung für das Kühlmedium in das Kühlbad kann durch eine spezielle Ausgestaltung der Erfindung mittels vertikal an der Hülsenaussenwand angebrachter Rillen im Verein mit entsprechenden ringförmigen Vertiefungen in der Austrittsöffnung sowie am unteren Hülsenende und entsprechenden Ausnehmungen am Fuß der Hülse vermieden werden, daß der Kryogenaustritt verhindert oder stets ein Entfernen der Hülse beim Füllen des Kühlbades erforderlich wird.Propane) and the closure possible through a precisely fitted sleeve the outlet opening for the cooling medium into the cooling bath can be connected vertically by means of a special embodiment of the invention the sleeve outer wall attached grooves in association with corresponding annular recesses in the outlet opening and at the lower end of the sleeve and corresponding recesses at the foot of the Sleeve can be avoided that prevents the cryogen from escaping or it is always necessary to remove the sleeve when filling the cooling bath will.

Schließlich wird durch die Spritzschutzhülse ein Entfernen brennbarer Kryogene aus dem Kühlbad durch ein Einsatzröhrchen erschwert. Sine weitere Ausgestaltung der Erfindung besteht daher darin, daß nach Entnahme der Hülse oder in die Hülse ein Röhrchen eingesetzt werden kann, an dessen Boden ein einfaches Ventil (z. B. ein Kugelventil) den Eintritt des Kühlmediums beim EinferwöOT des Entsor-Ultimately, the splash guard makes removal more flammable Cryogens from the cooling bath are made difficult by an insert tube. A further embodiment of the invention is therefore that After removing the sleeve or in the sleeve, a tube can be inserted, at the bottom of which a simple valve (e.g. a ball valve) the entry of the cooling medium at EinferwöOT of the disposal

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gungsbehälters gestattet, einen Ausfluß bei der Entnahme des Kühlmediums mit d,er}.En$sQrgungsr.öh;cchen jedoch verhindert.supply container allows an outflow when removing the cooling medium with d, er} .En $ sQrgungsr.öh; cchen, however, prevented.

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Ausfiihrungsbeispielider Erfindung werden nachfolgend anhand der beiliegenden Zeichnungen näher erläutert. In den Zeichnungisn zeigen:Ausfiihrungsbeispielider the invention are based on the explained in more detail in the accompanying drawings. In the drawings show:

Fig. 1 eine rein schematische Ansicht einer Injektionsvorrichtung mit Kühlbad nach dem Stand der Technik im Querschnitt;1 shows a purely schematic view of an injection device with a cooling bath according to the prior art in cross section;

Fig. 2 eine schematische Schnittdarstellung des erfindungsgemäßen Systems im Querschnitt mit einer manuell anhebbaren Spritzschutzhülse und Auslösebolzen für den Injektionsvorgang;Fig. 2 is a schematic sectional view of the invention System in cross-section with a manually liftable splash guard and release bolt for the injection process;

Fig. 3 eine schematische Schnitt-Darstellung einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Systems mit Druckfedern und Auslöser zum Anheben der Hülse sowie einer Lichtschranke zur automatischen Auslösung des Injektors;3 shows a schematic sectional illustration of a further embodiment of the system according to the invention with compression springs and a trigger for lifting the sleeve and a light barrier for automatic triggering of the injector;

Fig. 4 eine schematische Schnittdarstellung einer weiteren Ausgestaltung der Spritzschutzhülse für ein Kühlbad mit Gegenstromverflüssiger und einer Ausbildung der Hülse, die einen Abfluß des verflüssigten Kühlmediums in das Kühlbad ohne Entnahme der Spritzschutzhülse zuläßt, und4 shows a schematic sectional illustration of a further embodiment the splash protection sleeve for a cooling bath with countercurrent condenser and a design of the sleeve, the one Allowing the liquefied cooling medium to flow into the cooling bath without removing the splash guard, and

Fig. 5 eine schematische Schnittdarstellung einer weiteren Ausgestaltung, welche es trotz Verwendung der Spritzschutzhülse ermöglicht, brennbare und/oder gesundheitsschädliche Kühlflüssigkeiten zur Entsorgung aus dem Kühlbad zu entnehmen.5 shows a schematic sectional illustration of a further embodiment, which makes it possible to use flammable and / or noxious cooling liquids despite the use of the splash guard to be taken from the cooling bath for disposal.

Das in Fig. 1 rein schematisch in einem Querschnitt dargestellte System entspricht dem heutigen Stand der Technik. In einem isolie renden Behälter 1 befindet eich ein zylindrischer Metallbehälter 2 , der über den dünnwandigen Hohlzylinder 3 mit der zylindrischen Hülse 4 verbunden ist, welche einen direkten Kontakt zwischen dem als Kryogen verwendeten flüssigen Stickstoff 5 und dem Metallzylinder 2 im Stand by-Betrieb verhindert. Als Kühlmedium 6 wird in der Regel verflüssigtes Propan oder ein halogenierter Kohlenwasserstoff (z.B. FREON 13) verwendet. Da der Gefrierpunkt derartiger Kühlflüssigkeiten 6 über dem Siedepunkt des flüssigen Stickstoffs 5 liegt (z.B. Gefrierpunkte: Propan... -190⁰C, FREON 13... -185°C, FREON 22 ... -155°C; Siedepunkt von Ngfl . .. -196⁰C), würde dieThe system shown purely schematically in a cross section in FIG. 1 corresponds to the current state of the art. In an insulating container 1 there is a cylindrical metal container 2, which is connected to the cylindrical sleeve 4 via the thin-walled hollow cylinder 3, which prevents direct contact between the liquid nitrogen used as a cryogen 5 and the metal cylinder 2 in stand-by mode. As a rule, liquefied propane or a halogenated hydrocarbon (for example FREON 13) is used as the cooling medium 6. Since the freezing point of such coolants 6 above the boiling point of liquid nitrogen 5 is located (for example, freezing points: propan ... -190 ⁰ C, FREON 13 ... -185 ° C, FREON 22 ... -155 ° C; boiling point of NGFL . .. -196 ⁰ C), the

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Abkühlung des Mediums 6 über die Hülse 3 bzw. über das kalte StickstofJ'gas 7 , das sich infolge des stetigen Siedens des NgfL 5 im Behälter 1 befindet und das Kühlbad 2 vollständig umgibt, letztlich soweit voranschreiten, daß sich die Flüssigkeit 6 verfestigt. Dies wird durch eine Heizpatrone 8 verhindert, deren Heizleistung in der Regel mittels eines Temperaturfühlers 9 sowie eines nicht dargestellten elektronischen Regelkreises in technisch bekannter Weise so geregelt wird, daß die Temperatur des Zylinders 2 und damit der Kühlflüssigkeit 6 stets thermostatisch auf einem Wert gehalten wird, der nur knapp über dem Gefrierpunkt des Mediums 6 liegt. Da die meisten Kühlmedien brennbar und/oder gesundheitsschädlich sind und daher nach Abschluß der Kryopräparation nicht ohne weiteres in die Raumatmosphäre verdampft werden können, befindet sich oftmals eine Einsatzhülse 10 im Zylinder 2 , die auf einfache Weise eine "Entsorgung", d.h. eine Entnahme der Kühlflüssigkeit 6 gestattet, die auf andere Weise angesichts des Gewichtes und der Abmessungen des gesamten Instrumentes nur schwer möglich wäre, da diese ein Kippen oder Ausschütten des Kühlmediums erschweren oder unmöglich machen.Cooling of the medium 6 via the sleeve 3 or via the cold nitrogen gas 7, which is due to the constant boiling of the NgfL 5 is located in the container 1 and completely surrounds the cooling bath 2, ultimately proceeding so far that the liquid 6 solidifies. This is prevented by a heating cartridge 8, the heating power of which is usually not by means of a temperature sensor 9 and one not illustrated electronic control circuit in a technically known manner is regulated so that the temperature of the cylinder 2 and thus the cooling liquid 6 is always kept thermostatically at a value which is just above the freezing point of the medium 6. Since most cooling media are flammable and / or harmful are and therefore cannot easily be evaporated into the room atmosphere after completion of the cryopreparation, is often located an insert sleeve 10 in the cylinder 2, which allows "disposal", i.e. removal of the cooling liquid 6, in a simple manner, which would be difficult to do in any other way, given the weight and dimensions of the entire instrument, because this makes it difficult or impossible to tip over or pour out the cooling medium.

Nach Fig. 1 befindet sich das Objekt 11 in der Regel auf einem für die; nachfolgende Kryo-Ultramikrotomie (bzw. Gefrierätzung, Kryosubstitution oder Gefriertrocknung) geeigneten Träger 12, der seinerseits am Injektionsstab 13 montiert ist. Der Injektor 13 ist im Halter 14 geführt, wobei die Führung im einfachsten Fall eine zylindrische Bohrung darstellt. Soweit auf höhere Abkühlraten Wert gelegt, wird, muß der Injektionsstab 13 zusätzlich beschleunigt werden, da die durch einen freien Fall (Gravitation) erreichbare Geschwindigkeit zu gering ist, soweit man auf eine handliche Apparatur Wert legt und größere Vorlaufzeiten und -wege vermeiden möchte. Im einfachsten Fall erreicht man die notwendige Beschleunigung durch eine Druckfeder 15 , wobei man den Injektionsvorgang mittels eines Bolzens 16 auslöst, der entweder direkt manuell oder über einen elektrisch oder elektromagnetisch,/, Auslöser 17 in Pfeilrichtung zurückgezogen wird. Nach der Auslösung legt das Objekt 11 in der Regel eine Weglänge "1" von rd. 100 mm zurück und tritt auf diesem Weg mit einer Geschwindigkeit zwischen 5 und 15 m/sec in die Flüssigkeit 6 ein. Der großeAccording to Fig. 1, the object 11 is usually on a for the; subsequent cryo-ultramicrotomy (or freeze etching, cryosubstitution or freeze-drying) suitable carrier 12, which in turn is mounted on the injection rod 13. The injector 13 is in the holder 14 out, wherein the guide represents a cylindrical bore in the simplest case. Insofar as value is placed on higher cooling rates, is, the injection rod 13 must also be accelerated because the speed that can be achieved through a free fall (gravitation) is too low, as long as one attaches importance to a handy apparatus and would like to avoid longer lead times and routes. In the simplest case, the necessary acceleration is achieved using a compression spring 15, the injection process being carried out by means of a bolt 16 triggers, which is withdrawn either directly manually or via an electrical or electromagnetic, /, trigger 17 in the direction of the arrow. After the triggering, the object 11 generally covers a path length "1" of around 100 mm and steps along this path at one speed between 5 and 15 m / sec into the liquid 6. The great

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Nachteil derartiger Immersions systeme ist das bereits eingangs diskutierte Verspritzen des größten Teils des Kühlmediums 6 durch das mit hoher Geschwindigkeit eingeführte Objekt bzw. Injektionssystem. The disadvantage of such immersion systems is that already discussed at the beginning Most of the cooling medium 6 is splashed through the object or injection system introduced at high speed.

Die anhand von Fig. 1 erläuterte Unzukömmlichkeit aller technisch bekannten Lösungen zur Kryofixation durch rasche Immersion in eine Kühlflüssigkeit ("immersions-Kryofixation") läßt sich durch das in Fig. 2 bis 4 dargestellte erfindungsgemäße System auf einfachste Weise ausschalten. Nach Fig. 2 wird hierfür anstelle des in Fig. 1 dargestellten Röhrchens 10 eine zylindrische Hülse 18 in das Kühlbad eingeführt, an deren oberem Rand das Abschlußstück 19 befestigt ist, dessen Form das Anheben der kalten Hülse mit einem geeigneten Werkzeug 20 mit isolierendem Handgriff 21 zuläßt. Die Hülse 18 ist so dimensioniert, daß sie von der zylindrischen Bohrung des Kühlbades 2 gut geführt wird, so daß weder ein zu strenger Gang noch ein Verkanten oder Verkippen den Hub behindert und die Bahn der Hülse beim Hub (Pfeil Λ ) eindeutig vorgegeben ist. Der Hub wird durch die dünne Platte 22 'tegrenzt, die an dem Bolzen 23 am Injektionssystem 14' befestigt und so ausgebildet ist,, daß sie lediglich den Durchtritt des Injektorstabes 13' ermöglicht, ansonsten aber im Verein mit der angehobenen Hülse 18/19 (strichliert dargestellt) einen praktisch vollständigen Spritzschutz bildet, der die verspritzende Kühlflüssigkeit praktisch komplett in das Kühlbad 2 zurücklenkt. Da die Schutzhülse 18/19 bereits auf Kühlbadtemperatur abgekühlt und die Wärmekapazität des Plättchens 22 bewußt niedrig gehalten sowie der thermische Kontakt zur Injektorführung 14' bei entsprechender Dimensionierung der Bolzen 23 ebenfalls minimal ist, tritt bei diesem Zurückleiten keine störende, durch das Spritzschutzsystem 18/19/22/ 23 bedingte Erwärmung der Kühlflüssigkeit 6 ein. Die durch das System 18/19/22/23 bewirkte Erwärmung bleibt vielmehr stets unter 30⁰C bei entsprechender Optimierung unter 5°C und kann daher vernachlässigt werden.The inappropriateness of all technically known solutions for cryofixation by rapid immersion in a cooling liquid ("immersion cryofixation") explained with reference to FIG. 1 can be eliminated in the simplest manner by the system according to the invention shown in FIGS. 2 to 4. According to Fig. 2, instead of the tube 10 shown in Fig. 1, a cylindrical sleeve 18 is inserted into the cooling bath, on the upper edge of which the end piece 19 is attached, the shape of which allows the cold sleeve to be lifted with a suitable tool 20 with an insulating handle 21 allows. The sleeve 18 is dimensioned so that it is well guided by the cylindrical bore of the cooling bath 2, so that neither a too strict gait nor tilting or tilting hinders the stroke and the path of the sleeve during the stroke (arrow Λ) is clearly specified. The stroke is limited by the thin plate 22 'which is attached to the bolt 23 on the injection system 14' and is designed in such a way that it only allows the injector rod 13 'to pass through, but otherwise in conjunction with the raised sleeve 18/19 ( shown in dashed lines) forms a practically complete splash guard, which practically completely guides the sprayed coolant back into the cooling bath 2. Since the protective sleeve 18/19 has already cooled to the cooling bath temperature and the heat capacity of the plate 22 is deliberately kept low and the thermal contact to the injector guide 14 'is also minimal if the bolts 23 are appropriately dimensioned, there is no disruptive return caused by the spray protection system 18/19 / 22/23 conditional heating of the coolant 6 a. That caused by the system 18/19/22/23 warming remains rather always below 30 ⁰ C with appropriate optimization below 5 ° C and can therefore be neglected.

Eine weitere Ausgestaltung der Erfindung kann nach Fig. 2 darin bestehen, daß die Injektion des Objektes 11 mit dem Injektor 12/13' in technisch bekannter Weise über einen Bolzen 24 ausgelöst wird, wobei der Bolzen 24 seinerseits beispielsweise durch das Abschlußteil 19 der Hülse 18 in Pfeilrichtung bewegt wird. Die AuslösungAccording to FIG. 2, a further embodiment of the invention can consist in that the injection of the object 11 with the injector 12/13 'is triggered in a technically known manner via a bolt 24, the bolt 24 in turn being moved in the direction of the arrow, for example by the end part 19 of the sleeve 18. The trigger

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kann hierbei in unterschiedlichster, nicht näher zu beschreibender Weise, beispielsweise über mechanische Zwischenglieder, elektrisch oder elektromagnetisch vollzogen werden, wobei eine zusätzliche, mit der zweiten Hand zu betätigende nicht abgebildete Entriegelung verhindern kann, daß die Injektion ohne Anheben der Hülse, beispielsweise beim Anbringen des Objektes 11 oder des Objektträgers 12 am Injektor 13' durch Eindrücken des Bolzens 24 versehentlich ausgelöst wird. Ein derartiges System hat zwei wesentliche Vorteile: Auf der einen Seite findet die Injektion nach Anheben der Schutzhülse 18/ 19 ohne zeitlichen Verzug statt, womit vorzeitige Kälteschäden am Objekt 11 vermieden werden, welche durch ein längeres Verweilen des Objektes in unmittelbarer Nähe der tiefgekühlten Hülse 18 auf- ; treten könnten. Auf der anderen Seite ist durch die erzielte Wirkver-can here in the most varied, not to be described in more detail Way, for example via mechanical intermediate links, be carried out electrically or electromagnetically, with an additional, with the second hand to be operated unlocking, not shown, can prevent the injection without lifting the sleeve, for example accidentally triggered when the object 11 or the object carrier 12 is attached to the injector 13 'by pressing in the bolt 24 will. Such a system has two main advantages: On the one hand, the injection takes place after lifting the protective sleeve 18 / 19 takes place without delay, which avoids premature cold damage to the object 11, which is caused by a longer stay the object in the immediate vicinity of the frozen sleeve 18 up; could kick. On the other hand, the effect achieved

dung zwischen dem Hub der Schutzhülse 18/19 und der Auslösung des Injekti ons vorgange s im Verein mit der zusätzlich vorzusehenden Verriegelung die Gewähr dafür gegeben, daß jede Injektion ohne Schutzhülse mit Sicherheit unterbleibt.tion between the stroke of the protective sleeve 18/19 and the triggering of the injection process in conjunction with the additional provision to be made Interlocking guarantees that no injection will be made without a protective sleeve.

Durch die weitere Ausgestaltung der Erfindung nach Fig. 3 kann der Gesamtablauf "Anheben der Schutzhülse—* Auslösung der Injektion—* Einschuß des Objekts in die Kühlflüssigkeit" weiter beschleunige und ί die Durchführung der Kryofixation noch weiter vereinfacht werden.The further embodiment of the invention according to FIG. 3 can Complete sequence "lifting the protective sleeve - * triggering the injection - * Injection of the object into the coolant "further accelerate and ί the implementation of the cryofixation can be simplified even further.

Die Hülse 18/19' wird hierbei beispielsweise durch die Druckfedern 25/26 angehoben, wobei, der Hub durch geeignete ,Auslöser, beispielsweise die R/lemente 27/28 freigegeben wirdJHe Injektion der Probe 11 kann in diesem Fall entweder gleichzeitig oder entsprechend verzögert, beispielsweise durch eine Lichtschranke 29/ 30/31 über die Hülsenbewegung ausgelöst werden. Durch die gegenläufige und zumindest teilweise gleichzeitige Bewegung der Hülse 18/19' und des Injektionssystems 11/12/13' wird der Vorgang weiter abgekürzt und jede vorzeitige Kälteeinwirkung auf die Probe 11 auf das in jedem Fall unvermeidbare Minimum reduziert.The sleeve 18/19 'is here for example by the compression springs 25/26 raised, the stroke being triggered by suitable triggers, for example the R / lemente 27/28 is releasedJHe injection the sample 11 can in this case either simultaneously or delayed accordingly, for example by a light barrier 29 / 30/31 can be triggered by the sleeve movement. Due to the counter-rotating and at least partially simultaneous movement of the sleeve 18/19 'and the injection system 11/12/13' the process continues abbreviated and any premature exposure to cold on the sample 11 reduced to the in any case unavoidable minimum.

Ein möglicher Nachteil der Spritzschutzhülse 18/19 bzw. Ϊ8/19' gemäß Fig. 2 oder 3 könnte darin bestehen, daß der Einlauf Kühlflüssigkeit aus einem in dem Metallteil 2' integrierten Verfü ger 32 durch die eingeschobene Hülse blockiert wird. Diesem Nach-" teil iü+ nach Fig. 4 in erfindungsgemäßer Weise dadurch zu begegnen.A possible disadvantage of the 18/19 or Ϊ8 / 19 'splash guard 2 or 3 could consist in that the inlet cooling liquid from a Verfü integrated in the metal part 2 ' ger 32 is blocked by the inserted sleeve. To counter this disadvantage according to FIG. 4 in a manner according to the invention.

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daß die Hülse 18' an ihrem oberen und unteren Ende einen Durchmesser "d^" aufweist, der hinreichend vom Durchmesser "dj" des ; Kühlbades abweicht (d₂ -f dj) und damit eine Bewegung der Kühlflüs- \ sigkeit zwischen der zylindrischen Kühlbädwandung (d^) und der L-äußeren Hülsenwandung (d^) ermöglicht. Das Abfließen der Kühlflüs- * sigkeit zwischen der Kühlbadwandung und der im Hinblick auf eine .„ präzise Führung der Hülse 18' beim Hub entsprechend eingepaßten ^: Hülse erfolgt durch vertikal verlaufende Rillen 33 , der Austritt in das Lumen des Kühlbades durch eine oder mehrere Ausnehmungen ;? that the sleeve 18 'at its upper and lower ends has a diameter "d ^" which is sufficiently from the diameter "dj" des; Cooling bath is deviated (d ₂ f dj) and thus a movement of the coolant comes \ sigkeit between the cylindrical Kühlbädwandung (d ^) and the L-outer sleeve wall (d ^) allows. The outflow of the cooling liquid between the cooling bath wall and the appropriately fitted with a view to precise guidance of the sleeve 18 'during the stroke ^{: the} sleeve takes place through vertically extending grooves 33, the outlet into the lumen of the cooling bath through one or more recesses; ?

34 (oder Bohrungen) am unteren Ende der Hülse 18'. Die erfindungs- j gemäße Ausgestaltung ermöglicht ein Verflüssigen des Kühlmediums |' ohne Entnahme der Hülse 18' und eliminiert damit zugleich das Risi- f ko eines Überdrucks, der durch die Blockade des Abflusses beim Ver- | such einer Verflüssigung entstehen könnte. Im dargestellten Fall tritt | vielmehr das Gas (z.B. Propan oder FREON-Gas) durch den Stutzen i 34 (or bores) at the lower end of the sleeve 18 '. The design according to the invention enables the cooling medium to be liquefied | ' without removing the sleeve 18 'and thus at the same time eliminates the risk of overpressure caused by the blockage of the outflow during discharge such a liquefaction could occur. In the case shown, | rather, the gas (eg propane or FREON gas) through the nozzle i

35 (Pfeile!) in den Verflüssiger 32 , das verflüssigte Medium durch \ den Ausfluß 36 in das zylindrische Kühlbad und in diesem zwischen > der Wandung des Teils 2' und der Hülse 18' in den Ring der Hülse | 18' vertikal nach unten. Es füllt schließlich durch die Ausnehmungen ! 34 von unten das Kühlbad. ;35 (arrows!) Into the liquefier 32, the liquefied medium through \ the outflow 36 into the cylindrical cooling bath and in this between > the wall of the part 2 'and the sleeve 18' in the ring of the sleeve | 18 'vertically down. It eventually fills through the recesses! 34 the cooling bath from below. ;

Wie eingangs vergleichend anhand der beiden schematischen Schnitt-Darstellungen in Fig. 1 und 2 erläutert, wird die Spritz schutzhülse 18/19 (Fig. 2) sinngemäß anstelle des Kryogen-EntsorgungsbehälterS 10 in das Kühlbad 2'eingesetzt. Damit entfällt die oftmals wün- |As explained at the outset comparatively with reference to the two schematic sectional views in Fig. 1 and 2, the spray protection sleeve 18/19 (Fig. 2) analogously instead of the cryogen disposal container S. 10 inserted into the cooling bath 2 '. This eliminates the often desired |

sehenswerte Entsorgungsmöglichkeit für brennbare und/oder gesund- jj¹ Worth seeing disposal option for combustible and / or healthy- jj ¹

heitsschädliche Kühlmedien. Diese Möglichkeit kann nach Fig. 5 durch fharmful cooling media. This possibility can according to FIG. 5 by f

eine weitere Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Systems in einer | another embodiment of the system according to the invention in a |

modifizierten Weise erhalten werden. Hierzu wird die Hülse 18/19
(bzw. 18' und/oder 19 ^ nach Abschluß der Kryopräparation aus dem
Behälter 2 (bzw. 2") entnommen. An ihrer Stelle wird ein Behälter
10' mit Hilfe eines geeigneten Werkzeugs 37 in PfeilricMung (linkes
Schnittschema) eingeiührt, wobei durch ein einfaches System, z.B.die
Kugel 38 am Boden des Behälters 10', der Eintritt der Kühlflüssigkeit 6 in den Behälter 10' ermöglicht wird. Nach dem vollständigen
Einführen des Behälters 10' in das Kühlbad 2 kann die Kühlflüssigkeit 6 (rechtes Schnittschema) nunmehr in Pfeilrichtung nach oben mit modified manner can be obtained. For this purpose, the sleeve 18/19
(or 18 'and / or 19 ^ after completion of the cryopreparation from the
Container 2 (or 2 ") is removed. A container is used in its place
10 'with the aid of a suitable tool 37 in the direction of the arrow (left
Cutting scheme), whereby a simple system, e.g. the
Ball 38 at the bottom of the container 10 ', the entry of the cooling liquid 6 into the container 10' is made possible. After the complete
Introducing the container 10 'into the cooling bath 2, the cooling liquid 6 (right sectional diagram) can now with it in the direction of the arrow upwards

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dem Werkzeug 37 entnommen werden, da das Ventil (Kugel 38 ) am Boden des Behälters 10' den Austritt der Flüssigkeit 6 nun verhindert. Eine in Fig. 5 nicht dargestellte Druckfeder kann hierbei in bekannter Weise die Ventilfunktion verstärken. Der Behälter 10' / 38 ermöglicht ebenso wie der technisch bekannte Behälter 10 (Fig. 1) den Transfer des Mediums β in das Freie oder in einen Druckbehälter, der zur Lagerung oder zum Wiederverwenden bzw. zum Abfackeln brennbarer Medien in technisch bekannter Weise geeignet ist.can be removed from the tool 37, since the valve (ball 38) at the bottom of the container 10 'now prevents the liquid 6 from escaping. A compression spring, not shown in FIG. 5, can reinforce the valve function in a known manner. The container 10 '/ 38, like the technically known container 10 (Fig. 1), enables the transfer of the medium β into the open air or into a pressure vessel, which is suitable for storage, reuse or flaring of combustible media in a technically known manner.

Im Rahme« der Erfindung können gegenüber den vorstehend beschriebenen Ausführungsbeispielen nach Fig. 2 bis 5 Abänderungen getroffen werden, ohne daß hiervon der erfindungsgemäße Charakter der Anordnung berührt wird. So ist es möglich, das erfindungsgemäße Sy stern in verschiedenen technisch vorteilhaften Varianten zu fertigen, in dem man mehrere einzeln beschriebene Elemente zusammenfaßt oder in anderer Weise kombiniert, als dies in den Aueführungsbeispielen dargestellt und beschrieben ist. Dies gilt beispielsweise für das Prinzip und die konstruktive Ausbildung sowie Koppelung der Auslöseföiechanismen für den Hub der Hülse 18 bzw. 18' und die Bewegung des Injektors 13 bzw. 13'. Ebenso können elektrische und mechanische Elemente in unterschiedlicher Weise ausgeführt werden, ohne daß hierdurch der Erfindungsgedanke betroffen wird. So kann beispielsweise die Hülse 18 oder 18'abweichend von der Darstellung andere geometrische Formen und Querschnitte aufweisen, als Zylinder bzw. Kreis. Ebenso können anstelle der Ausnehmungen bzw. Rillen 33/34 in der Hülse 18' sinngemäß analoge Ausnehmungen in der Wand des Kühlbadbehälters 2' für den Austritt und Durchlauf des verflüssigten Kühlmediums sorgen. Ebenso kann die Entsorgungshülse 10'/38 eingeführt werden, ohne daß die Hülse 18 oder 18' aus dem Kühlbad entnommen wird, soweit dies vorteilhaft oder notwendig ist. Schließlich ist es für den Erfindungscharakter unerheblich, in welcher Weise das Injektionssystem, der Verflüssiger für das Kühlmedium und das Kühlbad ausgeführt sind, so lange die Injektion mit den angeführten Geschwindigkeiten in ein flüssiges Kühlmedium mit einer Temperatur unter -100°C durchgeführt wird.Within the scope of the invention, compared to those described above Embodiments according to FIGS. 2 to 5 modifications are made without this affecting the character of the arrangement according to the invention is touched. So it is possible to manufacture the Sy star according to the invention in various technically advantageous variants, in which one summarizes several individually described elements or combined in some other way than in the examples is shown and described. This applies, for example, to the principle and the constructive training as well as the coupling of the triggering mechanisms for the stroke of the sleeve 18 or 18 'and the movement of the injector 13 or 13'. Likewise, electrical and mechanical Elements are carried out in different ways, without this affecting the inventive concept. For example the sleeve 18 or 18 'deviating from the illustration others have geometric shapes and cross-sections, as a cylinder or circle. Likewise, instead of the recesses or grooves 33/34 in the sleeve 18 'analogous recesses in the wall of the cooling bath container 2' for the outlet and passage of the liquefied Provide cooling medium. Likewise, the disposal sleeve 10 '/ 38 can be inserted without the sleeve 18 or 18' from the cooling bath is removed if this is advantageous or necessary. Finally, it is irrelevant for the character of the invention in which way the injection system, the condenser for the cooling medium and the cooling bath are designed as long as the injection is carried out with the specified Speeds in a liquid cooling medium with a temperature below -100 ° C is carried out.

Claims

C. Reichert Optische Werke AG A - 1170 Vienna - 23 041 20 / h protection claims

1. Device for iranersion cryofixation of biological medical devices Objects, with an injection device and a Kuhlbadbehalter arranged under this, characterized by one arranged in the cooling bath container (2, 2 ') up to the lower limit (23) of the injection device (11 to 17; 13 ', 14') liftable, vertically oriented Sleeve (18, 19; 18 ', 19') in the raised state surrounds the injection path and the sample space.

2. Apparatus according to claim 1, characterized in that the sleeve is a cylinder sleeve which is in the cooling bath container is sliding.

3. Apparatus according to claim 1 or 2, characterized in that the outer surface of the sleeve (18 ') extending vertically Has depressions (33) and an area with a reduced diameter (d ") at its upper section, and that the lower end of the sleeve is also stepped down to a region of reduced diameter (d ^) and has at least one passage opening (34) for cooling medium.

4. Device according to one of claims 1 to 3, characterized in that the sleeve is positively locked by a Tool (20, 21) has engagement surface (19) which can be gripped from behind.

5. Device according to one of claims 1 to 3, characterized in that that the sleeve is urged in the vertical direction by springs (25, 26) and that releasable locking elements (27, 28) for holding the sleeve in the lowered state are provided.

k 6. A device according to any one of claims 1 to 3, marked by '- characterized in that for lifting the sleeve by a one. Electromagnet operable Flement is provided.

7. Device according to one of claims 1 to 6, characterized in that for locking the injector rod (12) of the

Injection device a locking device is provided is coupled to a sensing device (24) sensing the lifting state of the sleeve and through this is solvable.

8. Device, in particular according to one of claims 1 to 7, characterized in that one with its outer dimensions

ί on the inner dimensions of the cooling bath container (2) matched and sliding into the cooling bath container insertable cup-shaped container (10 ') is provided, which has a flow opening in its bottom and a flow opening against an outflow of contained in the container (10 ¹ )

'Has the non-return valve (38) blocking the cooling medium.