DE69935221T3

DE69935221T3 - Methoden und medium zur in vitro-kultivierung von menschlichen embryos

Info

Publication number: DE69935221T3
Application number: DE69935221.5T
Authority: DE
Inventors: Sarah Robertson; Matts WIKLAND; Cecilia Sjoblom
Original assignee: Adelaide Research and Innovation Pty Ltd
Current assignee: Adelaide Research and Innovation Pty Ltd
Priority date: 1998-06-19
Filing date: 1999-06-18
Publication date: 2015-03-26
Anticipated expiration: 2019-06-19
Also published as: WO1999067364A1; ES2281965T3; ATE354642T1; EP1088057A4; EP1088057B1; CA2331890A1; DE69935221T2; ES2281965T5; AUPP421298A0; EP1088057A1; DE69935221D1; EP1088057B2; US6605468B1; CA2331890C

Description

Unfruchtbarkeit ist eine große Sorge für viele Paare, welche Empfängnis wünschen. Das Verhältnis von Paaren, welche nicht in der Lage sind, auf natürlichem Wege zu empfangen, ist bemerkenswert hoch. In den USA spricht man davon, dass von 10 bis 15% der Paare im fortpflanzungsfähigen Alter nicht in der Lage sind, Kinder zu haben, wohingegen im Vereinigten Königreich das Verhältnis als bei 14% liegend eingeschätzt wurde.
In den letzten 20 Jahren in etwa ist einige Hoffnung für unfruchtbare Paare mit der Entwicklung der in vitro Befruchtungstechniken (IVF) aufgekommen. Diese IVF-Techniken verlaufen generell nach der Form, dass die Frau stimuliert wird, einen Eisprung zu haben, dass die aufgenommenen Eizellen mit Sperma in vitro in Kontakt gebracht wird und nach Befruchtung der Eizellen in den Uterus eingeführt werden. Es gibt ebenfalls vielfältige Abwandlungen dieses allgemeinen Verfahrens. Trotz bemerkenswerter Forschung und technischer Fortschritte im Bereich der IVF ist die Rate der erfolgreichen Schwangerschaften auf IVF-Behandlung folgend immer noch eher niedrig und liegt bei der Größenordnung von 15 bis 25% pro Zyklus.
Sich einem IVF-Programm zu unterziehen, verursacht oft große Angst, besonders wenn keine erfolgreiche Schwangerschaft daraus resultiert. Es wird derzeit geglaubt, dass die schlechte Erfolgsrate für die IVF-Behandlung aufgrund einer außergewöhnlich hohen Rate an frühen Embryonenverlusten oder Implantationsfehlern liegt (Weinberg et al., 1988; Lenton et al., 1988).
Die geringe Wirksamkeit von IVF zusammen mit ihren hohen Kosten und dem damit verbundenen psychologischen Trauma wiederholter Behandlungsfehlschläge macht es wünschenswert, dass es bei diesem Verfahren Verbesserungen gibt. Gegenwärtige Verfahren der verbesserten Schwangerschaftsraten während der IVF-Behandlung umfassen das Einsetzen mehrerer Embryonen (2–5) in die Gebärmutter. Dieses ist nicht immer erfolgreich und bringt ferner ein höheres Risiko der Mehrfachschwangerschaft mit sich.
Bei den meisten in vitro Befruchtungseinheiten werden die Embryonen zwei Tage nach der Befruchtung (4–8 Zellen) in den Uterus übertragen. Eine Ansicht ist, dass die Verwendung von Embryonen in diesem frühen Stadium wesentlich zu dem geringen Schwangerschaftserfolg der IVF-Programme beiträgt, und dass es wünschenswerter ist, Embryonen im Blastozystenstadium, welches nach 5–7 Tagen des Kultivierens erreicht wird, einzusetzen. Die vorgeschlagenen Verbesserungen umfassen die verbesserte Synchronisierung zwischen Embryo und Uterus, und die Fähigkeit, Embryonen von besserer Qualität über die längere Kultivierungsdauer auszuwählen. Der Blastozysten-Transfer kann ebenfalls dabei helfen, durch die Auswahl geringerer Anzahlen von besser geeigneten Embryonen pro Übertragung, die Anzahl von aus IVF resultierenden multiplen Geburten zu reduzieren.
Unglücklicherweise versagt in Standardkulturmedien die Mehrheit der Embryonen (etwa 75%), sich über das 4–8-Stadium hinaus zu entwickeln. Dennoch wird unter bestimmten klinischen Indikationen die Implantierung menschlicher Embryonen im Blastozystenstadium trotz der geringen Anteile der Embryonen, die sich zum Blastozysten entwickeln, durchgeführt. Einige jüngere Untersuchungen haben Ko-Kulturtechniken untersucht, wobei Embryonen mit Nährstoffzellen ko-kultiviert wurden, beispielsweise Vero Zellen, wobei bei dieser Technik die Blastozystenbildungsraten mehr als doppelt so hoch waren (Ménézo et al., 1990; Plachot et al., 1995). Es gab eine Anzahl von Untersuchungen, welche diese Ko-Kultivierungstechniken verwendet haben, die verbesserte Implantationsraten nach Blastozysten-Transfer (Ménézo et al., 1992), gezeigt haben, besonders bei Frauen mit wiederholten vorangegangenen Implantationsversagen (Oliveness et al., 1955; Plachot et al., 1955).
Die Ko-Kultivierung ist zeitaufwändig und teuer und es wurden bezüglich der möglichen Übertragung von Krankheiten durch kontaminierte Kulturen (Oliveness et al., 1955), Bedenken zum Ausdruck gebracht, insbesondere gibt es Bedenken hinsichtlich der viralen Kontaminierung, wobei es als nahezu unmöglich angesehen wird, diese Kontaminierung vollständig zu eliminieren. Eine sichererer und praktikablerer Ansatz ist der Versuch, ein Kulturmedium herzustellen, welches geeignet ist, die Embryo-Entwicklung durch das Blastozystenstadium zu erhalten, unabhängig von Ko-Kultivierung.
Eine Ansatz zur Verbesserung der in-vitro-Embryo-Entwicklung, ohne Ko-Kulturtechniken zu verwenden, ist, das Definieren von Faktoren zu versuchen, die verwendet werden könnten, um die Embryo-Entwicklung in der in-vitro-Kultur zu verbessern. Eine Anzahl von Anstrengungen wurde bereits unternommen, um die Faktoren zu identifizieren, die helfen könnten, und unter den vielversprechenden Faktoren sind verschiedene Anregungsfaktoren, bekannt als Zytokine. Ein solcher Faktor, der Leukämie-Inhibitorfaktor (LIF), wurde bereits in dieser Hinsicht als positiver Faktor für Menschen angezeigt (Dunglison et al., 1996) und Viehzuchtarten, US. Pat. No. 5418159 .
Einer der vielen Faktoren, die derzeit sowohl bei Tieren als auch bei Menschen hinsichtlich der Empfängnis und der Embryonen-Entwicklung untersucht werden, ist der Granulozyten-Makrophagenkolonie stimulierende Faktor (GM-CSF). Um es jedoch genau anzugeben, gab es noch keine bestimmte Indikation, dass ein Medium, welchem GM-CSF zugesetzt wurde, ausreichend wäre, um die in-vitro-Entwicklung der Embryonen zum Blastozystenstadium in einem bestimmten Kulturmedium zu verbessern.
GM-CSF ist ein 23–29 kD Glykoprotein, welches, obwohl es in einer löslichen Form in-vitro ausgeschieden wurde, eines der vielen Zytokine ist, von denen bekannt ist, dass sie in der ECM (extrazellulären Matrix) in vivo durch die Verbindung mit Heparansulfat markiert und immobilisiert wurde. GM-CSF wurde ursprünglich als ein hämopoietischer Regulator und als bestimmender Faktor für die Reifung und für das Verhalten der myeloiden Leukozyten in peripheren Geweben charakterisiert. Es ist nun bekannt, dass GM-CSF von einer Vielzahl von Zelltypen, einschließlich T-Lymphozyten, Monozyten, Makrophagen, Fibroblasten, Endothelzellen und Epithelzellen produziert wird.
Das Gebärmutter Epithel wurde durch in-situ Hybridisierung und durch in-vitro Zell-Isolationsstudien als eine Hauptquelle für GM-CSF im Mausuterus (Rob. et al., 1992, Ro. et al. 1994) und im menschlichen Eileiter (Zhao and Chegini 1994, Giacomini et al. 1995) identifiziert. Eine Rolle für GM-CSF bei Fortpflanzungsschritten wurde gestützt durch Studien, in denen die zytokine Umgebung während Frühschwangerschaften in vivo (Tartakovsky and Ben Yair, 1991) gestört wurde und durch Experimente, welche beeinträchtigte Fruchtbarkeit bei genetisch GM-CSF defizienten Mäusen zeigten (Robertson et al. 1999).
Untersuchungen mit radiomarkierter Ligandenbindung zeigen deutlich, dass murine Blastozysten ¹²⁵I-GM-CSF-spezifisch binden, wodurch angezeigt wird, dass sie zumindest die niedrige Affinitätsform des GM-CSF-Rezeptors exprimieren. Dieser Schluss wurde durch RT-PCR-Analyse gestützt, wobei gezeigt wurde, dass Blastozysten mRNA für die α-Untereinheit des GM-CSF-Rezeptorkomplexes exprimieren. Es wurde herausgefunden, dass eine ähnliche Situation bei menschlichen Embryonen existiert. GM-CSF-R wurde mit ähnlichen Pegeln während der ersten vier Tage der murinen- und menschlichen Embryo-Entwicklung exprimiert, von der Befruchtung zum Blastozystenstadium. mRNA wurde jedoch für die β-Untereinheit von GM-CSF-Rezeptorkomplexen in Embryonen bei der Spezies durch die RT-PCR-Technik nicht detektiert. Zusammengenommen suggerieren diese Daten, dass die Embryonen den GM-CSF-Rezeptor zumindest so früh wie ab dem Befruchtungsstadium exprimieren, wobei er jedoch von der niederaffinen Form sein kann. Das Embryo fällt insofern unter dieselbe Kategorie wie die Endothelzellen und andere nicht-hemopoietische Zellen, welche biologisches Ansprechen auf GM-CSF zeigen, obwohl sie nur niederaffine Rezeptoren exprimieren. Obwohl es klar scheint, dass in hemopoietischen Zellen die α-Untereinheit des GM-CSF-Rezeptors nicht selbst das proliferierende Signal übertragen kann, ist es nicht bekannt, ob die α-Untereinheit unter einigen Umständen das Ansprechen der Zellen bei Abwesenheit der β-Untereinheit initiieren kann. Die jüngste Entdeckung unkonventioneller Formen des GM-CSF-Rezeptors im Menschen suggeriert, dass dies möglich sein könnte.
Es wurde ebenfalls gezeigt, dass die Bindung von verwandten Liganden an die GM-CSF-Rezeptor α-Untereinheit in Isolation einen erhöhten Glukosetransport über einen von der Phosphorylierung unabhängigen Reaktionsweg vermitteln kann (Ding et. al., 1994). Jüngere Experimente des Erfinders zeigen, dass die Kultivierung mit rekombinantem Maus-GM-CSF (mGM-CSF) eine gesteigerte Glukoseaufnahme im Murine Blastozysten anregt, bis zu einem Ausmaß, welches mit bekannten Glukosetransport-Stimulanzien wie einem insulinähnlichen Wachstumsfaktor 1 erreichbar ist, wodurch suggeriert wird, dass dieses Zytokin den Metabolismus in Maus-Embryonen anregen könnte.
Es gibt einige Beweise, die anzeigen, dass GM-CSF ferner bei der Regulierung des Embryonenwachstums teilnimmt. Es wurde festgestellt, dass konditionierte Medien, welche reich an mGM-CSF sind, insbesondere bei der Förderung des Blastozystenwachstums wirksam sind, insbesondere bei der Anlagerung von geschlüpften Blastozysten an Serum anlagernden Faktoren in Plastikkulturschalen (Robertson et al., 1991).
Das Medium wurde durch Zellen aus LPS-aktiviertem Maus-Lungengewebe konditioniert und enthält eine Anzahl anderer Faktoren, welche zur embryotrophen Aktivität beitragen könnten.
In weiteren Untersuchungen des Erfinders wurde eine Zelle und acht Mauszellen-Embryonen mit oder ohne rekombinantem Maus-GM-CSF (rmGM-CSF) in einem bestimmten Medium optimiert, und es gab erneut eine beachtliche Steigerung der Rate, mit welcher bebrütete Blastozysten an die Kulturschalen anlagerten. Das Verhältnis der Embryonen, die sich zum acht Zellen- oder Blastozystenstadium entwickelten, wurde durch Zytokine nicht verändert. Die Rate, mit welcher sich Embryonen zum Blastozystenstadium entwickelten und die aus der Zona Pellucida schlüpften, war ebenfalls gleich, ohne Berücksichtigung, ob Zytokin vorlag oder nicht.
Bei weiteren Experimenten wurde gezeigt, dass das Überleben und/oder die Proliferation von Blastomeren innerhalb der sich entwickelnden Mausblastozysten, insbesondere der inneren Zellmassen, verbessert wurde, indem sie nativem GM-CSF in vivo oder rekombinantem GM-CSF in vitro (Robertson et al., 1998) ausgesetzt wurden.
Einige Gruppen haben sowohl von positiver als auch von negativer Wirkung von GM-CSF auf unterschiedliche Stadien der Embryo-Frühentwicklung berichtet. Hill et al. (1987) haben herausgefunden, dass GM-CSF in hohen Dosen (> 1000 U/ml) die Entwicklung von 2-Zellen-Embyronen zu Morulae inhibierte. Bei zwei Studien wurde herausgefunden, dass ektoplazentale Konus-Throphoblasten als Antwort auf GM-CSF proliferieren (Armstrong und Chaouat 1989; Lea und Clark 1993), im zweiten Versuch wurde jedoch eine Wirkung mit nativer, nicht jedoch rekombinanter Zytokine erhalten. Haimovoci et al. (1991) haben gefunden, dass 250 U/ml oder mehr an GM-CSF die Anlagerung von Blastozysten an mit Fibronektin beschichteten Kulturschalen in der Abwesenheit von Serum inhibierte. Lea und Clark (1993) haben berichtet, dass rekombinantes GM-CSF (zwischen 10 und 100 U/ml) die Inkorporierung von ³H-Thymidin in auswachsende implantierte Blastozysten in einer von der Dosis abhängigen Weise inhibierte. Tartakovsky und Ben-Yair (1991) haben gefunden, dass eine systematische GM-CSF Verabreichung bemerkenswert die Entwicklung der frühen embryonischen Entwicklung in vivo verbesserte, sie haben jedoch keinen Effekt von GM-CSF auf die embryonische in-vitro-Entwicklung bemerkt. Diese Ergebnisse sind schwer in Einklang zu bringen. Es ist jedoch wahrscheinlich, dass die Unterschiede mit den untersuchten Entwicklungsstadien in Zusammenhang stehen, mit den Verfahren der Embryokultivierung, den Maus-Strängen und den Quellen und Konzentrationen des verwendeten Zytokins. Beispielsweise können manche Zytokin-Zubereitungen potentielle embryotoxische Kontaminanten wie Endotoxin enthalten. Zusätzlich gibt es einen deutlichen Beleg, dass es mehr als einen Mechanismus (durch welchen GM-CSF in der Lage ist, seine Wirkungen auf Zielzellen auszuüben) gibt, und es ist möglich, dass der Glykolisierungszustand des Zytokins (welcher ebenfalls von seiner Quelle abhängen würde) wichtig sein könnte für die Bindung an unkonventionelle Rezeptoren.
Eine Studie von Rinderembryonen (de Moraes und Hansen 1997) hat rekombinante Bovine GM-CSF (rbGM-CSF) in der Absicht verwendet, die Embryo-Entwicklung zum Blastozystenstadium zu verbessern. Die rGM-CSF hatte nur leider bei sehr hohen Pegeln von 10 ng/ml einen bedeutenden Einfluss auf das Verhältnis der Embryonen, die sich zum Blastozystenstadium entwickelten, und die Anzahlen von Embryonen, die untersucht worden waren, waren relativ niedrig, so dass die Ergebnisse mit einigem Bedenken betrachtet werden sollten. Außerdem wurde jedoch auf irgendeine Weise gefunden, dass die Verhältnisse der Blastozysten, die sich ausdehnten oder schlüpften, bei 10 ng/ml rbGM-CSF und 1 ng/ml rbGM-CSF bedeutend fielen, und es kann daher als ein gegenteiliger Effekt auf die Kapazität der Blastozysten, die nachfolgend verwendet wurden, angesehen werden, da ihre Entwicklung im Wesentlichen in vitro terminiert wurde.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung resultiert daraus, dass gefunden wurde, dass rekombinantes humanes GM-CSF (rhGM-CSF) dabei wirksam ist, die Verhältnisse früher menschlicher Embryonen, die sich zu Blastozysten entwickeln, zu steigern, und die Verhältnisse derjenigen Embryos zu vergrößern, welche fortfahren, sich zum Blastozystenstadium und dann zum bebrüteten Entwicklungsstadium zu entwickeln. Das Nettoergebnis ist dieses, dass ein wesentlich größerer Anteil an Embryonen nun zum Blastozystenstadium aufgezogen werden kann und für die Implantation im IVF-Programm in Menschen verwendet werden kann.
Dies kontrastiert mit den gemischten Ergebnissen bei anderen Spezies, bei welchen lediglich gemäßigte und inkonsistente Wirkungen auf die Entwicklung des Blastozystenstadiums und danach berichtet worden waren.
Dieses Ergebnis birgt Implikationen bezüglich der Formulierung von Medien zur Verwendung von in vitro Kulturivierung von Embryonen zum Blastozystenstadium und bezüglich der Verfahren zum Aufziehen solcher Embryonen und der Weise, in welcher IVF-Programme durchgeführt werden. Es wird vorweggenommen, dass diese Erfindung zu einer größeren Erfolgsrate in solchen IVF-Programmen führen wird.
Daher könnte gemäß einer breiten Form eines ersten Aspekts gesagt werden, dass die Erfindung der Verwendung in eines Mediums zur Entwicklung von menschlichen Frühstadien-Embryonen zum Blastozystenstadium liegt, wobei das Medium eine wirksame Menge von menschlichem GM-CSF enthält, um den Prozentsatz der Prä-Blastozysten-Embryonen, welche sich zu übertragungsbereiten Blastozysten entwickeln, zu verbessern.
Blastozysten, die übertragungsbereit sind, sind Embryonen, die bis zu dem Stadium entwickelt wurden, in dem die Blastozystenhöhle deutlich sichtbar ist und mehr als 50% des Volumens des Embryos einnimmt. Dieses Stadium würde bei der in vivo Situation normalerweise nach 4 bis 5 Tagen nach der Befruchtung erreicht sein, bald nachdem der Embryo den Eileiter passiert hat und in der Gebärmutter ankommt.
Gemäß einer Form ist das Medium ein serumfreies Medium. Das serumfreie Medium ist insofern wünschenswert, als es das Risiko der Kontaminierung dramatisch verringert. Der Begriff „serumfrei”, wenn er in dieser Bedeutung verwendet wird, bezieht sich auf ein Medium, welches kein Serum oder irgendeine partiell definierte Serumsfraktion als Additiv umfasst, kann jedoch ein Medium umfassen, welches aus Serum gewonnene Komponenten enthält, welche im Wesentlichen aus Serum gereinigt und die modifiziert oder nicht modifiziert worden sind.
In einer weiteren Form könnte das Medium ein vollständig definiertes Medium sein.
Es wird am meisten bevorzugt, dass das menschliche GM-CSF in gereinigter Form, und am meisten bevorzugt, aus einer nicht tierischen und nicht menschlichen Quelle vorliegt, es könnte daher auch aus einem rekombinanten Mikroorganismus gereinigt sein.
Die GM-CSF-Rezeptoren von Embryonen scheinen auf irgendeine Weise in ihrer Zusammensetzung einzigartig zu sein, verglichen mit GM-CSF-Rezeptoren sonst wo, und es ist daher wahrscheinlich, dass die Unterstützung des Embryo-Wachstums nicht unbedingt ein vollständig natives GM-CSF erfordert. Das hGM-CSF kann daher auf irgendeine einer Vielzahl von Arten modifiziert oder verändert sein und muss nicht notwendigerweise glykosyliert sein. Das hGM-CSF kann trunkiert sein, Aminosäuren-Deletionen und -Substitutionen aufweisen oder kann ein rekombinantes Molekül mit einem anderen Wachstumsfaktor sein, wie vielleicht LIF.
Wenn rhGM-CSF verwendet wird, wird vorweggenommen, dass der Pegel von rhGM-CSF in dem Medium wie verwendet bei etwa 1 ng/ml liegt, welches ein physiologisch normaler Pegel ist. Es sind jedoch auch Konzentrationsbereiche möglich, und es wird antizipiert, dass Konzentrationen, die von etwa 0,01 ng/ml bis etwa 5 ng/ml reichen, eine erhöhte Abhängigkeit der spezifischen Aktivität der rekombinanten oder nativen GM-CSF Zubereitung ergeben. Es muss jedoch verstanden werden, dass gefunden werden kann, dass außerhalb liegende Konzentrationen ebenfalls zu einem positiven Effekt führen könnten.
Ein Basismedium, dem hGM-CSF zugefügt wird, könnte ein beliebiges dem Fachmann bekanntes sein.
Das Medium, in welchem die Erfindung verwendet werden könnte, kann jegliches Medium sein, das für die Verwendung der in vitro Unterstützung der Embryo-Entwicklung und des Wachstums geeignet ist. Ein geeignetes Medium könnte HTF-Medium (Quinn, 1985a), Modified Whittens Medium (Trounson, 1984), Whittinghams T6 Medium (Trounson, 1984), Hams F10 (Trounson et al, 1982a), Earles solution (Edwards und Purdy, 1982), IVF50 (Scandinavian IVF Science), S2 (Scandinavian IVF Science), G1.2 (Scandinavian IVF Science) und G2.2 (Scandinavian IVF Science), deren Referenzen durch Referenzierung der Bezüge auf die Medien hierin umfasst sind, umfassen, ist jedoch nicht darauf beschränkt.
Gemäß einer breiten Form des zweiten Aspekts könnte von der Erfindung gesagt werden, dass sie in der Verwendung eines Mediums zum Aufziehen von menschliche Frühstadien-Embryonen zu übertragungsbereiten Blastozysten liegt, umfassend des Schritts des Inkubierens des Embryos in vitro während einer Zeit und unter Bedingungen zur Steigerung des Verhältnisses der übertragungsbereiten Blastozysten in einem Kulturmedium, welches eine wirksame Menge an menschlichem GM-CSF umfasst.
Es wird vorweggenommen, dass die menschlichen Frühstadien-Embryonen grundsätzlich in einem frühen Stadium mit GM-CSF kontaktiert werden. Das Frühstadium der Embryonen kann von sofort nach der Befruchtung bis hin zu einigen Tagen nach der Befruchtung reichen, jedoch vorzugsweise vor Ablauf von 4 Tagen. Am meisten bevorzugt ist der Kontakt innerhalb von 2 Tagen nach der Befruchtung. Es muss verstanden werden, dass diese bei den 2- bis 16-Zellern, der Morula oder Prä-Blastozysten sein werden. Generell wird ein 1 Tag altes Embryo 2 Zellen haben, bei 3 Tagen liegt 16-Zeller oder Morula vor, und nach 4 bis 5 Tagen wird es sich zum Blastozysten entwickeln. Ein Blastozyst ist dadurch gekennzeichnet, dass er eine deutlich sichtbare Keimblase aufweist.
Es wird antizipiert, dass das in vitro Wachstum fortgeführt wird, bis die Blastozysten das Tag 5 bis 6 Stadium erreichen, in bestimmten Ausführungsformen der Erfindung jedoch kann das Kultivieren zum Embryo zu einem früheren oder späteren Stadium erfolgen.
In einer Form umfasst dieser zweite Aspekt der Erfindung die Verwendung eines Mediums für das Kultivieren des menschlichen Embryos in einem serumfreien Medium einschließlich menschlichem GM-CSF, bis das Blastozystenstadium erreicht wird, und dann die Übertragung in ein zweites Medium, welches menschliches GM-CSF zur weiteren Kultivierung enthält.
Gemäß einer breiten Form des dritten Aspekts offenbart das Patent, dass die Erfindung in einem IVF-Programm liegt, welches die Schritte umfasst:

– Kontaktieren eines menschlichen Eis mit einem menschlichen Sperma, um ein befruchtetes Ei zu bilden,
– Aufziehen des resultierenden befruchteten Eis in vitro während einer Zeit und unter Bedingungen, um die Wahrscheinlichkeit des Erreichens eines übertragungsfähigen Blastozysten zu steigern, in einem definierten Kulturmedium, welches eine wirksame Menge von menschlichen GM-CSF enthält, zumindest bis nachdem sich das 8-Zell-Stadium-Embryo gebildet hat,
– Übertragen des übertragungsfähigen Blastozysten in einen kompatiblen menschlichen Uterus

Zum besseren Verständnis wird die Erfindung nun unter Bezug auf eine Anzahl von Beispielen beschrieben.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1: Wirkung von GM-CSF auf die Entwicklung von Embryonen zu Blastozysten entsprechend der Embryoqualität. Die Daten geben die Anzahl von Embryonen an, die aus den Experimenten 1, 2 und 3 kombiniert zu Blastozysten entwickelt worden sind, ausgedrückt in Prozent der ursprünglichen Anzahl von gespaltenen (2–4 Zellen) Embryonen. Die Anzahl von Embryonen in jeder Gruppe ist in Klammern angegeben.
2: Die Wirkung von GM-CSF auf die Entwicklung von Embryonen zu Blastozysten, Schlüpfen und Anlagerungsstadien. Die Daten geben die Anzahl der Embryonen an, die sich aus den Experimenten 1, 2 und 3 kombiniert bis zu oder bis nach jedem Stadium ergeben haben, ausgedrückt in Prozent bezüglich der ursprünglichen Anzahl von gespaltenen (2–4 Zellen) Embryonen. 2 – C = 2-Zellen-Embryonen; 8 – C = 8-Zellen-Embryos; M = Morulla; B = Blastozysten; Exp B = ausgedehnte Blastozysten; H = Schlüpfen; A = angelagert mit Trophektoderm-Auswuchs.
3: Die Wirkung von GM-CSF auf die Entwicklungsrate von Embryonen zu Blastozysten. Die Daten geben die Anzahl von Blastozysten zu jedem Zeitpunkt an aus den Experimenten 1, 2 und 3 kombiniert, ausgedrückt als Prozentsatz der Gesamtzahl der Blastozysten bei 144 h nach Insemination.
4: RT-PCR Analyse von GM-CSF Rezeptoren mRNA Expression in menschlichen Blastozysten. Gesamte zelluläre RNA wurde aus TF-1 Zellen extrahiert, und jede von zwei Kohorten von Blastozysten (BΦ1 und BΦ2), revers transkribiert durch Random Priming, und amplifiziert mittels PCR mit GM-Rα, GM-Rβ oder Aktin-spezifischen Primern unter Verwendung der Bedingungen, die in Tabelle 7 aufgelistet sind.
5: Die Wirkung von GM-CSF auf die Entwicklungsrate der Embryonen zum Blastozystenstadium; (A) ein früher Blastozyst (Tag 5, 112 h nach Insemination) aus der Kontrollgruppe; (B) ein ausgedehnter Blastozyst (Tag 5, 112 h nach Insemination), kultiviert in rhGM-CSF; (C) ein voll geschlüpfter Blastozyst, angelagert an die Kulturschale (Tag 6, 144 h nach Insemination); (D) ein angelagerter Blastozyst, kultiviert in rhGM-CSF, der Trophektoderm-Auswuchs zeigt, (Pfeil; Tag 8, 200 h nach Insemination).
6: Die Wirkung von GM-CSF auf die Anzahl von Gesamtzellen (TCN), inneren Zellmasse-(ICM)Zellen und Trophektoderm-(TE)Zellen bei Tag 5 Blastozysten (120–124 h nach Insemination). Die Werte sind Mittelwerte ±SD der Blastozysten, die in 2 ng/ml rhGM-CSF (n = 11) kultiviert worden sind, und Blastozysten, die allein in Medien (n = 10) kultiviert worden sind.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
BEISPIEL 1.
Messung der embryonischen Lebensfähigkeit und Entwicklung
Material und Methoden
Die Embryonen, die in dieser Studie verwendet wurden, wurden von Paaren gegeben, welche die IVF-Behandlung im Befruchtungszentrum AB, Göteborg, Schweden, durchlaufen haben. Embryonen, die im 2–4 Zellstadium eingefroren wurden, wurden aufgetaut bei oder nach ihrem einjährigen Lagerungslimit in flüssigem Stickstoff. Die ethische Abnahme der Untersuchung wurde vom Forschungskomitee für Ethik der Universität von Göteborg (Nummer 700-96) erlangt.
Stimulation des Eisprungs und in vitro Befruchtung
Die Patienten erhielten 300 μg Buserelin Gonadotrophin-freisetzenden Hormonagonisten (GnRHa; Suprekur; Hoechst, Frankfurt, Deutschland) drei Mal täglich intranasal, beginnend 1 Woche vor der erwarteten Menstruation und über die Dauer von zwei Wochen. Das Herunterregeln wurde durch ein Serum von Estradiol mit einem Gehalt von < 0,2 nmol/l sicher gestellt. Den Patienten wurde dann rekombinantes Follikel stimulierendes Hormon (r-FSH; Gonal-F; Serono Laboratorien, Aubonn, Schweiz; 150–225 IU/Tag Subkutan). Die Startdosis war abhängig vom Patientenalter und/oder vorangegangenem Ansprechen während der Eisprungstimulation (Wikland et al., 1994). Das Ansprechen auf den Eisprung wurde durch Ultraschall angezeigt und die Pegel des Estradiolserums, wie vorstehend beschrieben (Bergh et al., 1997). GnRHa und rFSH wurden verabreicht, bis es zumindest ein Follikel > 18 mm an mittlerem Durchmesser und zwei weitere mit > 16 mm Durchmesser gab. Schließlich wurde die Gelbkörperreifung getriggert durch eine subkutane Injektion von 10.000 IU an hCG (Profasi; Serono Laboratorien).
Die Gelbkörper wurden nach 36–38 h nach Verabreichung von hCG aufgenommen, morphologisch geprüft und in vitro befruchtet. Die Embryonen wurden in IVF-50 kultiviert (Scandinavian IVF Science AB, Göteborg, Schweden) und am Tag 2 eingefroren unter Verwendung eines 3-Schritt Propandiol Kryo-Schutz-Kits (Freeze Kit 1, Scandinavian IVF Science) entsprechend der Anweisung der Hersteller.
Rekombinantes GM-CSF
Rekombinantes menschliches (rh)GM-CSF wurde aus R & D Systems Europe Ltd, Oxon, UK erhalten. Die biologische Aktivität der rekombinanten Zytokin-Darstellung wurde in einem Bioassay gemessen, unter Verwendung einer GM-CSF ansprechenden Zelllinie (menschliche myeloide TF-1 Zelllinie), insbesondere wie beschrieben durch (Kitamura et al. 1989). Duplizierte 1:2 Reihenverdünnungen wurden mit 2000 TF-1 Zellen in 200 μl RPMi-1640 (Gibco) inkubiert, ergänzt mit 10% fetalem Kalbserum (FCS; Commonwealth Serum Laboratories, Australia), 5 × 10^–5 M β-Merkaptoethanol und Antibiotika. Nach 2 Tagen wurden die Kulturen mit 1 uCi von ³H-Thymidin (Amersham, Arlington Heights, IL) 6 Stunden lang gepulst, und auf Glasfaserpapier aufgenommen unter Verwendung eines automatisierten Zellenernters von Titretech, und die Radioaktivität wurde in einem β-Flüssigkeits-Szintillationszähler gemessen.
Auftauen der Embryonen, Allokation und Kultivierung

Gefrorene 2–4-Zellen Embryonen wurden in vier Schritten unter Verwendung eines Propandiol-Verfahrens zur Embryo-Auftauung (Tau-Kit 1, Scandinavian IVF Science) aufgetaut unter Befolgen der vom Hersteller angegebenen Anweisungen. Die lebensfähigen Embryonen wurden klassifiziert und gemäß der Kriterien, die in Tabelle 1 aufgelistet sind, eingeteilt. Tabelle 1: Embryo Klassifizierungskriterien

Embryo Klassen	Morphologie
A	Gleichmäßige Blastomeren ohne Fragmente
B	Gleichmäßige oder ungleichmäßige Blastomeren mit bis zu 30% Fragmenten
C	Gleichmäßige oder ungleichmäßige Blastomeren mit mehr als 30% Fragmenten
D	50% der Blastomeren tot nach auftauen

Um Verzerrungen zu vermeiden, wurden die Embryonen im Hinblick auf Patienten und Embryogüte in unterschiedliche Kulturgruppen wahllos zugeteilt (Tabelle 2). Die Embryonen wurden in Gruppen von fünf Embryonen pro Tropfen kultiviert. Um die toxischen Effekte von Ammonium zu vermeiden, die aufgrund von Metabolismus und Abbau von Aminosäuren freigesetzt werden, wurde das Kulturmedium alle 48 h erneuert, bis das Ausschlüpfen stattfand. In zwei Experimenten wurden die Embryonen in 20 μl-Tropfen von IVF-50 (Scandinavian IVF Science), die 2 ng/ml rhGM-CSF (verdünnt 1:25.000 vom Ausgangsmaterial) oder Träger (2 ng/ml BSA, verdünnt 1:1.000 vom Ausgangsmaterial) enthielt, kultiviert. Die Kulturtropfen wurden mit 4 ml Ovolil-200 (Scandinavian IVF Science) in Falkon 3004-Schalen (Becton-Dickinson Labware, Franklin Lakes; NJ, USA) bedeckt. Als Blastozysten detektiert wurden, wurden diese in 1 ml S2 (Scandinavian IVF Science) in Falkon 3037-Schalen übertragen, die 5% FCS und 2 ng/ml rhGM-CSF oder Träger enthielten. Wachstumsstadium wurde alle 8 h vom Auftauen bis 2300 h an Tag 8 (200 h nach Insemination) bewertet.
In einem dritten Experiment wurden die Embryonen 6–8-Zellstadium von IVF-50 in S2 Medium (Scandinavian IVF Science) übertragen. Zusätze von GM-CSF und Träger waren dieselben wie in den beiden vorangegangenen Experimenten. Als Blastozysten detektiert wurden, wurden diese in Falkon 3037-Schalen übertragen, nachdem sie 24 h lang mit Biomatrix EHS (Boehringer Ingelheim Bioproducts, Heidelberg, Germany) bedeckt worden waren. Wachstumsstadium wurde alle 8 h vom Tauen bis 2300 h an Tag 8 (200 h nach Insemination) bewertet. Die Embryo-Bewertung bei jedem der Experimente wurde von derselben Person (CS) durchgeführt.
Statistische Analysen wurden durchgeführt unter der Verwendung von Fisher's Exakttest und unabhängigem Proben t-Test (StaSoft, Inc.). Unterschiede bezüglich der Daten wurden als signifikant angesehen, wenn P < 0,05. Tabelle 2: Verteilung der Güteklassen unter aufgetauten 2–4-Zellenembryonen

Embryo Güteklasse Kontrolle (%) GM-CSF (%)

A 20 20

B 22 27

C 32 33

D 26 20

N 50 49

Die Gütegrade sind definiert in Tabelle 1.
Ergebnisse

Die Rate und die Ausdehnung der Entwicklung von 2–4-Zellembryonen zum Blastozysten und zu geschlüpften Blastozystenstadien wurden durch die Zugabe von rhGM-CSF zum Kulturmedium signifikant gesteigert (Tabelle 3). Tabelle 3: Rate und Ausdehnung der Embryo-Entwicklung in der Gegenwart oder Abwesenheit von rhGM-CSF

	N	%BΦ	T₅₀	%H	N	%BΦ	T₅₀	%H
Expt	Kontrolle				RhGM-CSF
1	16	38	122	50	15	60	121	89
2	16	38	116	50	16	81	98	100
3	18	17	127	33	18	83	105	53
Total	50	31	122	47	49	76^a	108^b	78^c
%BΦ = % der lebensfähigen aufgetauten 2–4-Zellen, die das Blastozystenstadium erreichen. ^ap < 0,0001 T₅₀ = Anzahl von Stunden nach Insemination, in welchem 50% der Blastozysten sich entwickeln. ^bp = 0,0002 bei 112 h PI %H = %an Blastozysten, welche vollständig oderteilweise schlüpfen. ^cp = 0,009

Ein Vergleich zwischen den Verhältnissen der Embryonen, die das Blastozystenstadium und darüber hinaus in Experiment 1 und 2 (Kulturmedien, die 5% FCS ab Tag 5 enthalten) und Experiment 3 (serumfreies Medium) erreichen, sind in Tabelle 4 dargestellt. Es gibt keine signifikanten Unterschiede zwischen den beiden Gruppen, was zeigt, dass der nutzbringende Effekt von GM-CSF nicht von der Gegenwart von FCS abhängig ist. Tabelle 4: Prozentangaben von Embryonen, die sich bis zu jedem Entwicklungsstadium im Experiment 1 und 2 (FCS hinzugefügt) entwickelt haben, oder darüber hinaus, verglichen mit Experiment 3 (kein FCS hinzugefügt).

	N	%BΦ	Exp BΦ	% Schlüpfen	angelagert
Kontrolle^(exp1+2) GM-CSF^(exp1+2)	32 31	37 71	28 68	19 68	0 38
Kontrolle^(exp3) GM-CSF^(exp3)	18 18	17 83	6 61	6 44	0 22
BΦ = Blastozyst; Exp BΦ = ausgedehnter Blastozyst

Obwohl weniger Embryonen von schlechter Qualität (Güteklassen C & D) das Blastozystenstadium erreichen als Embryonen von guter Qualität (Güteklassen A & B), übte GM-CSF einen vergleichbaren Effekt in allen Gruppen aus, mit ähnlichen oder geringfügig höheren Verbesserungen im Verhältnis der schlechten verglichen mit den Embryonen guter Qualität, die das Blastozystenstadium erreichen (1).
Die Mehrheit der Embryonen, die allein in Medien gezogen wurden, waren in 4–16-Zellstadium abgestorben. Die nutzbringende Wirkung von GM-CSF auf Blastozysten-Entwicklung schien aus der Rettung von diesem Absterben zu resultieren, mit einer 80% Steigerung der Anzahlen der Embryonen, die das Morula-Stadium der Entwicklung (2) erreichten. Ferner wurde das Entwicklungspotenzial von Blastozysten durch Kultivierung in GM-CSF gesteigert, da die Schlüpfrate für Embryonen, die in GM-CSF gezogen wurden, größer war. Die Blastozysten, die in GM-CSF (15/29), nicht jedoch in Kontrollmedien (0/15) gezogen wurden, lagerten an die Kulturschale an und zeigten Trophoblasten-Auswüchse (2 und 5).
Schließlich zeigten die Embryonen, die in der Gegenwart von rhGM-CSF kultiviert wurden, eine signifikant höhere Rate an Entwicklungen, wobei 50% der Blastozysten Entwicklung 14 Stunden eher in GM-CSF erreicht wurde, im Vergleich zu der Kontrollgruppe (3).
Diese Ergebnisse unterstützen die Hypothese, dass GM-CSF, das in den weiblichen Geburtstrakt während Frühschwangerschaften abgegeben wird, das Embryowachstum und die Entwicklung fördert. Die Zugabe von GM-CSF zu Kulturmedien fördert die Bildung von Blastozysten selbst, wenn die Embryos nach dem Auftauen eine schlechte Qualität aufweisen. Unsere Resultate zeigen außerdem einen nutzbringenden Effekt auf GM-CSF auf Blastozysten Ausdehnung, Schlüpfen, Anlagern und das Auswachsen des Trophektoderms. Obwohl die funktionelle Bedeutung des in vitro Schlüpfens unbekannt ist, ist die Blastozysten-Ausdehnung eines der besten Kriterien für die Lebensfähigkeit des Blastozysten und sein Entwicklungspotential.
Die Teilungsrate von Embryonen wird als ein Indikator für die Embryo Qualität vorgeschlagen (Shoukir et al., 1997) und es ist bekannt, dass die Rate der Embryo-Entwicklung in vivo höher sein muss. Wesentlich ist, dass die Entwicklung der Embryonen zu Blastozysten in der Gegenwart von rhGM-CSF bedeutend früher erreicht wurde.
BEISPIEL 2
Messung der embryonischen Lebensfähigkeit und Entwicklung – Variation des Mediums und Quelle für GM-CSF
Materialien und Verfahren
Die Embryonen, die in dieser Studie verwendet wurden, wurden von Ehepaaren nach der Eisprungsstimulation und in vitro Befruchtung, wie in Beispiel 1 beschrieben, gegeben. Zur Durchführung von Kulturexperimenten wurden Embryonen, die im 2–4-Zellstadium eingefroren worden waren, bei oder nach ihrem einjährigen Lagerungslimit in flüssigen Stickstoff aufgetaut. Die Blastozysten, die für das differenzierende Anfärbe-Experiment verwendet wurden, wurden aus überschüssigen Embryonen kultiviert, überzählig für Behandlungs- und Einfriererfordernisse.
Rekombinantes GM-CSF
Zwei unterschiedliche kommerzielle Quellen an rekombinantem menschlichen (rh) GM-CSF wurden für diese Experimente verwendet. Eine Aufbereitung von Laborgüte wurde erhalten von R & D Systems Europe Ltd, Oxon, UK, und eine Aufbereitung von pharmazeutischer Güte, Molgramostim (Leukomax) wurde von Schering & Plough, Madison, NJ, USA erhalten. Die biologische Aktivität beider rekombinanter Zytokin-Aufbereitungen wurde in einem Bioassay gemessen unter Verwendung einer auf GM-CSF ansprechenden Zelllinie (menschliche myeloide TF-1 Zelllinie) wie beschrieben in Beispiel 1.
Embryo auftauen, Allokation und Kultivierung
Gefrorene 2–4-Zellembryonen wurden aufgetaut und zufällig auf experimentelle Gruppen verteilt, wie beschrieben in Beispiel 1. Die Embryokultur wurde durchgeführt wie beschrieben in Beispiel 1, in zwei unterschiedlichen sequenziellen Medium-Systemen, unter Verwendung zweier unterschiedlicher kommerzieller Quellen an rhGM-CSF. Nach dem Auftauen wurden die Embryonen zuerst in G1.2 (Scandinavian IVF Science) oder IVF-50 kultiviert. Im 6–8-Zellstadium wurden die Embryonen in G2.2 (Scandinavian IVF Science) oder S2 übertragen. Das Experiment umfasste 6 Gruppen: (a) G1.2/G2.2 allein, (b) G1.2/G2.2, das 2 ng/ml rhGM-CSF (R & D Systems) enthielt (c) G1.2/G2.2, das 2 ng/ml Molgramostim (Schering & Plough; verdünnt 1:75.000 vom Ausgangsmaterial) enthielt, (d) IVF-50/S2 allein, (e) IVF-50/S2, das 2 ng/ml rhGM-CSF (R & D Systems) enthielt, (f) IVF-50/S2, das 2 ng/ml Molgramostim enthielt. Die Entwicklungsrate wurde alle acht Stunden bewertet bis zum ausgedehnten Blastozystenstadium. Die Blastozysten wurden am Tag 5 bei 120 h nach Insemination gemäß den vorstehend beschriebenen Kriterien untersucht (Dokras et al., 1993). Kurz, Blastozysten vom Gütegrad A zeigten eine ausgedehnte Höhle mit deutlich erkennbarem Trophektoderm (TE) und einer exzentrisch angeordneten inneren Zellmasse (ICM); Blastozysten vom Gütegrad B waren noch nicht ausgedehnt, aber sonst morphologisch identisch mit A; und Blastozysten vom Gütegrad C zeigten eine schlechte Morphologie durch eine Anzahl degenerativer Stellen in dem ICM und TE und durch eine schlecht entwickelte Keimhöhle gekennzeichnet war. Bewerten der Embryonen bei jedem Experiment wurde von derselben Person (CS) durchgeführt.
Statistische Analysen wurden unter Verwendung von Fisher's Exakttest und dem unabhängigen Proben t-Test (StatSoft, Inc.) durchgeführt. Unterschiede bezüglich der Daten wurden als signifikant erachtet, wenn P < 0,05.
Differenzierendes Markieren der Blastozysten
Differenzierendes Markieren wurde unter Verwendung einer Modifikation eines Protokolls durchgeführt, wie vorstehend beschrieben wurde (Handyside and Hunter, 1984). Menschliche Blastozysten wurden aus überschüssigen Embryonen, die für die Behandlung und das Einfrieren überzählig waren, kultiviert. Bei Tag 5 der Kultivierung (120–128 h nach Insemination) wurde die Zona in saurer Tyrode-Lösung entfernt, die 4 mg/ml PVP (360.000 Mw) enthielt, und die Embryonen wurden einmal in Gamete-100 (Scandinavian IVF Science) gewaschen und dreimal in albuminfreiem S2, das 4 mg/ml PVP (S2-PVP) enthielt. Die Blastozysten wurden in Trinitro-Benzolsulfonsäure (TNBS, Sigma Chemical Co., St Louis, MO, USA; 10 mM in S2-PVP, pH 8,5, 4°C/20 min im Dunkeln) inkubiert und dreimal in Gamete-100 gewaschen. Die TNBS behandelten Blastozysten wurden in Antidinitro-Phenyl Antikörpern (Anti-DNP; Sigma, 0,2 mg/ml, verdünnt in Gamete-100; 37°C/30 min) inkubiert. Die Embryonen wurden dann gewaschen und in Meerschweinchen-Komplement-Serum (Sigma; verdünnt 1:10 in Gamete-100; 37°C/30 min) inkubiert. Die Embryonen wurden erneut gewaschen und mit Flourochromen markiert (Sigma; 0,05 mM Bis-Benzimid und 10 μg/ml Propidium Iodid in Gamete-100, 37°C/30 min). Nach extensivem Waschen wurden die Embryonen kurz in 1%-igem Paraformaldehyd und 0,5%-igem Glutaradehyd in PBS fixiert, unter Deckgläsern in 20%-igem Glyzerin in PBS angeordnet und mittels Fluoreszenz Mikroskopie unter Verwendung eines 400 nm-Anregungsfilters untersucht. Kerne, die pink gefärbt waren, wurden als lysierte Trophektodermzellen (TE) bestimmt, und blaue Kerne wurden als lebensfähige innere Zellmassenzellen (ICM) bewertet.
Ergebnisse

Dieses Experiment demonstriert die Wirkung der Kultur Medien und Quellen der rekombinanten Zytokine auf GM-CSF stimulierte Blastozysten-Entwicklung. Es wurde herausgefunden, dass Zytokin-Zusammensetzungen in zwei unterschiedlichen sequenziellen Kulturmedien-Systemen äquivalente Bioaktivitäten im PF-1-Zellen-Proliferations-Assay (Daten nicht gezeigt) haben. Es gab keine bemerkenswerten Unterschiede zwischen den Blastulationsraten, die in den zwei unterschiedlichen Kulturmedien-Systemen erreicht worden sind (Tabelle 5). Sowohl die Rate als auch das Ausmaß der Entwicklung von 2–4-Zellenembryonen zu Blastozysten wurde signifikant durch die Zugabe von 2 ng/ml rhGM-CSF gesteigert. Die Wirkung bezüglich des Ausmaßes war vergleichbar sowohl in G1.2/G2.2 als auch in IVF-50/S2 sequentiellen Medienkombinationen. Ferner wurde die Verbesserung bezüglich der Blastozysten-Entwicklung ungeachtet der Zusammensetzung der rekombinanten Zytokine erreicht. Die Ergebnisse zeigen außerdem, dass die Verteilung in morphologische Klassen, obwohl die Kultivierung der rhGM-CSF bewirkt, dass mehr Blastozysten sich entwickeln, vergleichbar zu der Behandlung und Kontrollgruppen war (Tabelle 5). Tabelle 5: Die Wirkung von Kulturmedium und Quelle rekombinanter Zytokine auf GM-CSF stimulierten Blastozysten-Entwicklung

	N	%BΦ	A/B/C (%)
G1.2/G2.2 allein	23	30	57/29/14
G1.2/G2.2 + rhGM-CSF (R & D)	21	71**	67/20/13
G1.2/G2 + Molgramostim	19	63*	67/17/17
IVF-50/S2 allein	38	37	57/29/14
IVF-50/S2 + rhGM-CSF (R & D)	38	79***	67/26/7
IVF-50/S2 + Molgramostim	20	65*	70/15/15
P < 0,05; P < 0,01; **P < 0,001

Die Wirkung der Kultivierung in GM-CSF auf Blastomeranzahl und Allokation
Um die Wirkung der Kultivierung mit GM-CSF auf die Zellenanzahl und Allokation bezüglich der inneren Zellmassen und Trophektoderm Zellverzweigung zu untersuchen, wurden die Blastozysten mit und ohne rhGM-CSF kultiviert, analysiert durch Immunochirurgie und differenzierendes Anfärben. Blastozysten, die in der Gegenwart von rhGM-CSF kultiviert worden sind, hatten eine bedeutend höhere Gesamtzellanzahl, verglichen zu Blastozysten, die in Medien allein kultiviert wurden (6). Eine Steigerung der Anzahl von Trophektodermzellen, und insbesondere der Anzahl der inneren Massenzellen trugen beide zu der größeren Zellenanzahl in GM-CSF stimulierten Blastozysten bei.
BEISPIEL 3
IVF Medien
Die Techniken und Medien, die für die Embryo-Kultivierung in IVF-Verfahren verwendet wurden, haben sich seit den 80-er Jahren nicht wesentlich verändert. Diese Verfahren sind insbesondere deutlich in Kerin et al (1983), Trouson et al (1980), Trouson et al (1982), und Quinn et al (1985) ausgeführt, wobei diese Referenzen hierin unter Bezug auf die Verhältnisse zu diesen Verfahren inkorporiert sind.
Das Medium, in welchem diese Erfindung verwendet werden kann, kann jedes Medium sein, das geeignet ist für die in vitro Unterstützung der Embryo-Entwicklung und des Wachstums. Dieses Medium kann HTF Medium (Quinn, 1985a), Modified Whittens Medium (Trounson, 1984), Whittinghams T6 Medium (Trounson, 1984), Hams F10 (Trouson et al, 1982a), Earles solution (Edwards and Purdy, 1982), IVF50 (Scandinavian IVF Science), S2 (Scandinavian IVF Science), G1.2 (Scandinavian IVF Science) und G2.2 (Scandinavian IVF Science) umfassen, muss jedoch nicht darauf beschränkt sein, wobei diese hinsichtlich der Medien durch Bezugnahme auf die Referenzstellen inkorporiert sind.
BEISPIEL 4
Verfahren zur IVF-Behandlung
Die Techniken und Medien, die für die Embryo-Kultivierung in IVF-Verfahren verwendet wurden, haben sich seit den 80-Jahren nicht wesentlich verändert. Diese Verfahren sind insbesondere deutlich in Kerin et al (1983), Trouson et al (1980), Trouson et al (1982), und Quinn et al (1985) ausgeführt, wobei diese Referenzen hierin unter Bezug auf die Verhältnisse dieser Verfahren inkorporiert sind.
BEISPIEL 5
Die Exprimierung von GM-CSF Rezeptoren durch menschliche Prä-Implantationsembryonen in vitro
Material und Verfahren
Die Embryonen, die in dieser Studie verwendet wurden, wurden von Ehepaaren nach Eizellstimulation und in vitro Befruchtung, wie beschrieben in Beispiel 1, gegeben. Überschüssige 2–4-Zellembryonen, die für die Erfordernisse der Patienten überzählig waren, wurden in 20 ml Tropfen von IVF-50 kultiviert und mit Paraffinöl überschichtet. Am Tag 3 (72 h nach Insemination) wurden die Embryonen in S2 übertragen. Die Embryonen wurden im Blastozystenstadium der Entwicklung aufgenommen. Die Embryonen wurden in PBS gewaschen, in flüssigem Stickstoff schockgefrostet und bei –70°C vor der RNA Extraktion gelagert.
Die gesamte zelluläre RNA wurde aus auf menschliches GM-CSF ansprechenden Myeloidzellen (TF-1 Zelllinie) extrahiert, und aus zwei Kohorten jeder der zwanzig Blastozysten unter Verwendung eines von (Arcellana-Panlilio & Schultz, 1993) beschriebenen Verfahrens. Verbleibende chromosomale DNA wurde durch Behandlung mit RNAse-freier DNAse (Boehringer Mannheim), 60 Minuten lang bei 37°C behandelt. Der erste Strang cDNA Synthese wurde durch reverse Transkription (RT) von RNA, die mit zufälligen Hexameren unter Verwendung eines Superscript RNase H-reverse Transkriptase Kits (Gibco) geprimed wurde, erreicht, im Wesentlichen gemäß den Anweisungen des Herstellers. Die Detektion von mRNA durch RT-PCR wurde unter Verwendung von Primer-Paaren, die spezifisch für die α-Kette und β-Kette des GM-CSF Rezeptors (GM-Rα und GM-Rβ) sind und β-Aktin (detailliert in Tabelle 7) und Reagenzien, die durch einen Rezeptor (GM-α und GM-β) bereit gestellt wurden, und β-Aktiv (detailliert in Tabelle 7) und Reagenzien, die in einem Taq DNA-Polymerase-Kit (Biotech International Ltd., Perth) bereit gestellt wurden, im Wesentlichen wie vorstehend beschrieben. Die Anzahl der Zyklen und die Annealing-Temperatur, die für jedes Primer-Paar verwendet wurde, sind ebenfalls in Tabelle 7 angegeben. Um die Sensitivität der GM-Rβ PCR zu steigern, wurde ein verschachteltes Primer-Design vergewendet, wobei cDNA durch 30 Zyklen mit GM-Rb „externen”-Primern, gefolgt von 25 Zyklen mit GM-Rβ „internen”-Primern amplifiziert wurde. Jedes PCR-Produkt wurde mittels Elektrophorese durch ein 2%-iges Agarose-Gel analysiert, welches EtBr enthielt, analysiert und im Durchlicht mit UV-Licht visualisiert. Die Gele wurden fotografiert, und die Größe der PCR-Produkte wurde durch Vergleich ihrer relativen Beweglichkeit bezüglich der Molekulargewichtsmarker verifiziert. Tabelle 7: Primer Sequenzen
Ergebnisse
Die Exprimierung der GM-CSF Rezeptor Exprimierung durch in vitro erzeugte Blastozysten wurde durch RT-PCR überprüft. Es wurde herausgefunden, dass jede von zwei Aufbereitungen der Blastozysten mRNA für die α-Kette des GM-CSF-Rezeptors exprimiert, aber mRNA für die β-Kette wurde nicht detektiert, selbst wenn ein hochsensitives verschachteltes PCR-Protokoll verwendet wurde (4).
Schlussfolgerung
Exprimierung der GM-CSF-Rezeptor α-Ketten mRNA wurde in jedem der zweiten Blastozysten cDNA Aufbereitungen detektiert. Diese Ergebnisse indizieren, dass menschliche Blastozysten die molekulare Fähigkeit haben, an GM-CSF zu binden und darauf anzusprechen. Die Expression der α-Untereinheit in der Abwesenheit der β-Kette kann nutzbringend für den Blastozysten-Glukosetransport sein, und daher die Kulturumgebung verbessern. Es ist wahrscheinlich, dass die erhöhte Glukoseaufnahme die metabolische Aktivität der Blastomeren fördert und damit die Zellteilung, und sie könnte daher das Überleben der Zellen durch die Verhinderung von Apoptose verbessern.
REFERENZEN

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Claims

Verwendung von menschlichem GM-CSF zur Herstellung eines Mediums zur Weiterentwicklung von menschlichen Frühstadium-Embryos zum Blastozysten-Stadium in einem IVF-Programm.
Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei das menschliche GM-CSF in gereinigter Form vorliegt.
Verwendung gemäß Anspruch 2, wobei das menschliche GM-CSF aus einer nicht tierischen und nicht menschlichen Quelle gereinigt wurde.
Verwendung gemäß Anspruch 3, wobei das menschliche GM-CSF aus einem rekombinanten Mikroorganismus gereinigt wurde.
Verwendung gemäß Anspruch 2, wobei das menschliche GM-CSF nicht vollständig arteigen ist und modifiziert oder verändert ist.
Verwendung gemäß Anspruch 5, wobei das menschliche GM-CSF auf irgend eine oder mehrere der Arten ausgewählt aus Trunkierung, Aminosäuren-Deletion, Aminosäuren-Substitution und molekularer Rekombination mit einem anderen Wachstumsfaktor modifiziert oder verändert ist.
Verwendung gemäß irgend einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Menge von menschlichem GM-CSF in dem Medium zwischen 0,01 ng/ml und 5 ng/ml beträgt.
Verwendung gemäß Anspruch 7, wobei die Menge von menschlichem GM-CSF in dem Medium 0,01 ng/ml beträgt.
Verwendung gemäß Anspruch 7, wobei die Menge von menschlichem GM-CSF in dem Medium 2 ng/ml beträgt.
Verwendung gemäß irgend einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das Medium ein serumfreies Medium ist.
Verwendung gemäß Anspruch 7, wobei das serumfreie Medium einem Serum entnommene Bestandteile umfasst, die im Wesentlichen aus Serum gereinigt worden sind.
Verwendung gemäß irgend einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das Medium ein vollständig definiertes Medium ist.
Verwendung gemäß irgend einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei die Weiterentwicklung von menschlichen Embryos den Schritt des in vitro Inkubierens des Embryos in dem Medium, welches das menschliche GM-GSF enthält, während einer Zeit und unter Bedingungen zum Erhöhen des Anteils der zur Übertragung bereiten Blastozysten umfasst.
Verwendung gemäß Anspruch 13, wobei die Embryos in einem frühen Stadium mit GM-CSF in Kontakt gebracht werden.
Verwendung gemäß Anspruch 14, wobei das Frühstadium der Embryos von sofort nach der Befruchtung bis hin zu einigen Tagen nach der Befruchtung reicht.
Verwendung gemäß Anspruch 15, wobei das Frühstadium der Embryos weniger als vier Tage ist.
Verwendung gemäß Anspruch 16, wobei der Kontakt innerhalb von 2 Tagen nach der Befruchtung erfolgt.
Verwendung gemäß Anspruch 15, wobei das in vitro Wachstum fortgeführt wird bis die Blastozysten das 5 bis 6-Tages-Stadium erreichen.
Verwendung gemäß Anspruch 18, wobei die Embryos in dem Medium kultiviert werden, das das menschliche GM-CSF enthält, bis das Blastozysten-Stadium erreicht ist, und dann in ein zweites Medium transferiert werden, das menschliches GM-CSF zum weiteren Kultivieren enthält.
Verwendung gemäß Anspruch 13, wobei die Embryos zumindest inkubiert werden bis sich zumindest der 8-Zellen-Stadium-Embryo gebildet hat.