DE69933939T3 - HIGH STABILITY XYLANASES - Google Patents
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Abstract
Description
Die Erfindung betrifft thermostabile Xylanase-Enzyme. Spezieller ist die Erfindung auf thermostabile Xylanase-Enzyme, die hohe Aktivität bei oder nahe bei physiologischem pH und physiologischer Temperatur aufweisen, und deren Verwendung bei Futterpelletier-Anwendungen gerichtet.The invention relates to thermostable xylanase enzymes. More particularly, the invention is directed to thermostable xylanase enzymes having high activity at or near physiological pH and physiological temperature, and their use in feed pelleting applications.
HINTERGRUND DER ERFINDUNGBACKGROUND OF THE INVENTION
Natürliche Xylanase-Enzyme, wie jene des Pilzes Trichoderma reesei, sind zu Tierfutter hinzugesetzt worden, um die Effizienz der Verdauung und Assimilation von Nährstoffen zu erhöhen. Während des Verdauens von Futterkörnern, wie Weizen und Gerste, erhöhen Nicht-Stärke-Polysaccharide, einschließlich Xylan, die Viskosität des Nahrungsbreis in Abwesenheit von zugesetzten exogenen Enzymen. Dies interferiert mit der Diffusion der Verdauungsenzyme zu dem Futter und der nachfolgenden Assimilation der Nährstoffe. Der hochgradig viskose Nahrungsbrei erhöht das Auftreten von klebrigen Faeces, welche die Wahrscheinlichkeit von Erkrankungen erhöhen und Ablaufprobleme hinsichtlich der Ausscheidungen verursachen. Die Zugabe von Xylanase zu Futter baut das Xylan ab und verringert die Viskosität des Nahrungsbreis, wodurch dazu beigetragen wird, diese Probleme zu lindern. Xylanase erzeugt eine Kostenersparnis, indem die Effizienz der Futterumwandlung erhöht wird. Xylanase kann das Verhältnis von verzehrtem Futter zu Gewichtszunahme um 5–15% verringern (Viveros, A., Brenes, A., Pizarro, M., und Castano, M., 1994, Animal Feed Sci. Technol. 48: 237–251).Natural xylanase enzymes, such as those of the fungus Trichoderma reesei, have been added to animal feed to increase the efficiency of digestion and assimilation of nutrients. During digestion of feed grains such as wheat and barley, non-starch polysaccharides, including xylan, increase the viscosity of the pudding in the absence of added exogenous enzymes. This interferes with the diffusion of the digestive enzymes to the feed and the subsequent assimilation of the nutrients. The highly viscous porridge increases the incidence of sticky feces, which increase the likelihood of disease and cause drainage problems. The addition of xylanase to feed degrades xylan and reduces the viscosity of the porridge, thereby helping to alleviate these problems. Xylanase produces a cost savings by increasing the efficiency of feed conversion. Xylanase can reduce the ratio of consumed feed to weight gain by 5-15% (Viveros, A., Brenes, A., Pizarro, M., and Castano, M., 1994, Animal Feed Sci. Technol. 48: 237-251 ).
Xylanase-Enzyme, die für Futter verwendet werden, sind typischerweise wässrige Lösungen von aktivem Protein, Stabilisatoren, Konservierungsmitteln und anderen Zusätzen. Die Enzyme werden typischerweise auf das Futter in einer Konzentration von 100–2000 ml pro Tonne Futter gesprüht. Alternativ kann körnchenförmige oder pulverisierte Xylanase verwendet werden. Wird das Futter einmal von dem Tier als Nahrung aufgenommen, wirkt das Enzym auf Xylan, wenn das Futter verzehrt und im Darm verdaut wird. Schließlich wird die Xylanase, ein Proteinmolekül, durch die Verdauungsenzyme (Proteasen) zu Aminosäuren wie ein jegliches Protein im Futter hydrolysiert.Xylanase enzymes used for feed are typically aqueous solutions of active protein, stabilizers, preservatives and other additives. The enzymes are typically sprayed onto the feed at a concentration of 100-2000 ml per tonne of feed. Alternatively, granular or powdered xylanase can be used. Once the food is ingested by the animal, the enzyme acts on xylan when the food is consumed and digested in the intestine. Finally, the xylanase, a protein molecule, is hydrolyzed by the digestive enzymes (proteases) to amino acids, such as any protein in the feed.
Tierfutter-Präparate werden zunehmend bei hohen Temperaturen zur Sterilisation gegen schädliche Bakterien, beispielsweise Salmonella, pelletiert. Die Futterpelletierung wird ausgeführt, indem die Futterfeststoffe mit 100 bis 140°C heißem Dampf erwärmt und diese durch eine(n) Extruder/Pelletierschnecke geleitet werden, um Futterpellets zu bilden, die dann in einem Vorratsbunker abkühlen. Die typische Zeitspanne, die benötigt wird, um das Material durch das System zu leiten, beträgt 30 min. Wie in diesem Fachgebiet bekannt ist, können höhere Temperaturen mit kürzeren Pelletierzeiten und niedrigere Temperaturen mit längeren Pelletierzeiten verwendet werden, vorausgesetzt, dass die notwendigen Feuchtigkeitskonzentrationen erhalten werden. Die resultierende Gesamttemperatur innerhalb der Feststoffe vor, während und nach der Pelletbildung erreicht ungefähr 70–95°C für bis zu 30 min. Es ist wünschenswert, die Xylanase während des Futterpelletierprozesses zuzusetzen. Dieses würde den Futter-Formulierungsexperten den zusätzlichen Schritt ersparen, flüssige Xylanase zuzusetzen, welcher unbequem ist und mikrobielle Verunreinigungen in das Futter einführen kann. Die Option einer Zugabe von fester Xylanase als ein separater Schritt ist ebenfalls nicht wünschenswert, da die Feststoffe nicht gleichmäßig gemischt werden würden. Marquardt und Bedford (1997, Enzymes in Poultry and Swine Nutrition, Marquardt, R. R., und Han, Z., Hrsg., S. 129–138) geben an, dass, obgleich gegenwärtig verfügbare Enzyme für eine Verwendung als Futterzusätze nützlich sind, neue Enzyme, die hohe Aktivität und Beständigkeit gegenüber einer Wärmebehandlung zeigen, ebenfalls erwünscht sind; sie merken jedoch an, dass Enzyme, die diese Eigenschaften zeigen, nicht zur Verfügung stehen.Animal feed preparations are increasingly being pelleted at high temperatures for sterilization against harmful bacteria such as Salmonella. Feed pelleting is accomplished by heating the feed solids with 100 to 140 ° C hot steam and passing them through an extruder / pelletizing screw to form feed pellets, which are then cooled in a storage bin. The typical time required to pass the material through the system is 30 minutes. As is known in the art, higher temperatures with shorter pelletizing times and lower temperatures with longer pelletizing times may be used, provided that the necessary moisture levels are obtained. The resulting total temperature within the solids before, during and after pellet formation reaches approximately 70-95 ° C for up to 30 minutes. It is desirable to add the xylanase during the feed pelleting process. This would save the feed formulation expert the additional step of adding liquid xylanase, which is inconvenient and can introduce microbial contaminants into the feed. The option of adding solid xylanase as a separate step is also undesirable because the solids would not be uniformly mixed. Marquardt and Bedford (1997, Enzymes in Poultry and Swine Nutrition, Marquardt, RR, and Han, Z., Eds., Pp. 129-138) state that although currently available enzymes are useful for use as feed additives, new ones Enzymes which show high activity and resistance to heat treatment are also desirable; however, they note that enzymes that exhibit these properties are not available.
Xylanasen der Familie 11 (welche auch als Familie G-Xylanasen bezeichnet werden) haben aufgrund ihrer geringen Größe und hohen Aktivität mehrere Eigenschaften, die für Futteranwendungen geeignet sind. Ein Beispiel einer moderate Temperatur-Familie 11-Xylanase ist TrX, die aus Trichoderma reesei erhalten wird. Moderate Temperatur-Xylanasen sind bewährte Futterzusatz-Enzyme mit Temperatur- und pH-Optima, die mit den physiologischen Bedingungen im Verdauungssystem von Tieren verträglich sind. Diese Enzyme können jedoch die hohe Temperatur des Pelletierprozesses nicht aushalten und werden während dieses Schritts inaktiv.Xylanases of family 11 (also referred to as family G xylanases) have several properties suitable for feed applications due to their small size and high activity. An example of a moderate temperature family of 11-xylanase is TrX, which is obtained from Trichoderma reesei. Moderate temperature xylanases are proven feed additive enzymes with temperature and pH optima that are compatible with the physiological conditions in the digestive system of animals. However, these enzymes can not withstand the high temperature of the pelleting process and become inactive during this step.
Xylanasen aus Hochtemperatur-Mikroorganismen (z. B. einem Thermophilen), beispielsweise Thermomonospora fusca-Xylanase (welche als TfX, also eine Familie 11-Xylanase, bezeichnet wird), sind für die Futterpelletierung ebenfalls in Betracht gezogen worden. Die Thermostabilität von solchen Enzymen ist ausreichend, um die Pelletiertemperaturen auszuhalten. Jedoch weisen thermophile Xylanasen optimale Aktivität bei hohen Temperaturen (70–80°C) auf und mehrere von diesen Enzymen haben ein hohes pH-Optimum von 7–9. Wenn sie in das Verdauungssystem eines Tiers mit einer physiologischen Temperatur um 40°C (z. B. Geflügel: 43°C, eine ähnliche Temperatur wird innerhalb von Schweinen festgestellt) und einem pH von 3–5 im Nahrungsbrei eingebracht werden, funktionieren diese Enzyme nur schlecht.Xylanases from high temperature microorganisms (eg, a thermophile), for example, Thermomonospora fusca xylanase (which is referred to as TfX, that is, a
Familie 11-Xylanasen sind durch Protein-Engineering modifiziert worden, um die Eigenschaften dieser Enzyme für industrielle Anwendungen zu verbessern. Diese Modifikationen sind auf die Erhöhung der Temperatur- und pH-Optima zusammen mit der Thermostabilität von diesen Enzymen für bestimmte Anwendungen gerichtet gewesen. Beispielsweise ist
Die obigen Ergebnisse stimmen überein mit anderen Berichten, die feststellen, dass Disulfid-Bindungen nicht zu den Thermostabilisierungsmechanismen gehören, die durch thermophile Enzyme eingesetzt werden (Cowan, D. A., 1995, Essays Biochem. 29: 193–207), da das Disulfid bei Temperaturen über 80°C zu Dehydroalanin und Thiocystein gespalten werden kann. Dementsprechend ist die Erhöhung der Stabilität eines Enzyms unter Verwendung von Disulfid-Bindungen auf niedrigere Temperaturbereiche beschränkt. Die Disulfid-Bindung wird dementsprechend nicht empfohlen, um die Stabilität des Enzyms bei hohen Temperaturen zu verbessern (Gupta, M. N., 1991, Biotech. Applied Biochem. 14: 1–11; Cowan, D. A., 1995, Essays Biochem. 29: 193–207).The above results are consistent with other reports that find that disulfide bonds are not among the thermostabilizing mechanisms used by thermophilic enzymes (Cowan, DA, 1995, Essays Biochem 29: 193-207) because the disulfide is at temperatures above 80 ° C to dehydroalanine and thiocysteine can be cleaved. Accordingly, increasing the stability of an enzyme using disulfide bonds is limited to lower temperature ranges. Accordingly, disulfide bonding is not recommended to improve the stability of the enzyme at high temperatures (Gupta, MN, 1991, Biotech, Applied Biochem., 14: 1-11, Cowan, DA, 1995, Essays Biochem 29: 193- 207).
Keines der obigen Dokumente wendet sich an Verfahren zur Herstellung von Xylanase-Enzymen unter Verwendung von herkömmlichen Screening-Techniken oder durch Modifizieren von Xylanase-Enzymen, die die Eigenschaften von höherer Temperaturbeständigkeit zeigen, während optimale Leistungseigenschaften unter Bedingungen von physiologischem pH und physiologischer Temperatur beibehalten werden.None of the above documents are directed to methods of producing xylanase enzymes using conventional screening techniques or by modifying xylanase enzymes that exhibit the properties of higher temperature stability while maintaining optimal performance characteristics under conditions of physiological pH and physiological temperature ,
Über eine Verbesserung bei der Thermostabilität von Trichoderma reesei-Xylanase II wurde von Paloheimo et al. berichtet (Paloheimo, M., Mantyla, A., Vehmaanpera, J., Hakola, S., Lantto, R., Lahtinen, T., Parkkinen, E., Fagerstrom, R., und Suominen, P., 1997, in Carbohydrases from Trichoderma reesei and Other Microorganisms, S. 255–264). Von den fünf charakterisierten Mutanten behielt die am meisten verbesserte Mutante (Glutaminsäure-38-TrX) 50% der Aktivität bei 57°C nach 9 min bei, verglichen mit 7 min bei dem TrX-Wildtyp. Arase et al. (Arase, A., Yomo, T., Urabe, I., Hata, Y., Katsube, Y., und Okada, H., 1993, FEBS Lett. 316: 123–127) beschreiben mehrere Modifizierungen, um die Thermostabilität einer Bacillus pumilis-Xylanase (BpX) zu verbessern, jedoch wurden nach einer Inkubation dieser Enzyme bei einer Temperatur von 57°C für 20 min nur bis zu 40% der restlichen Enzymaktivität beibehalten. Obgleich in diesen beiden Studien die Auswirkungen einer erhöhten Thermostabilität auf die pH- und Temperaturoptima der Enzyme nicht bestimmt wurden, zeigen diese Enzyme für Futterpelletier-Anwendungen inadäquate Thermostabilität.An improvement in the thermostability of Trichoderma reesei xylanase II has been reported by Paloheimo et al. (Paloheimo, M., Mantyla, A., Vehmaanpera, J., Hakola, S., Lantto, R., Lahtinen, T., Parkkinen, E., Fagerstrom, R., and Suominen, P., 1997, in Carbohydrases from Trichoderma reesei and Other Microorganisms, pp. 255-264). Of the five characterized mutants, the most improved mutant (glutamic acid-38-TrX) retained 50% activity at 57 ° C after 9 min compared to 7 min in the TrX wild-type. Arase et al. (Arase, A., Yomo, T., Urabe, I., Hata, Y., Katsube, Y., and Okada, H., 1993, FEBS Lett. 316: 123-127) describe several modifications to thermostability of Bacillus pumilis xylanase (BpX), however, after incubation of these enzymes at a temperature of 57 ° C for 20 minutes, only up to 40% of the residual enzyme activity was retained. Although the effects of increased thermostability on the pH and temperature optima of the enzymes were not determined in these two studies, these enzymes show inadequate thermostability for feed pelleting applications.
Trotz eines breiten Spektrums an Erfahrungen beim Screenen, Testen und Modifizieren von Xylanase-Enzymen gibt es keine Berichte über Xylanasen, die die Kombination von Eigenschaften, die für Futterpelletier-Anwendungen benötigt werden, zeigen: hohe Thermostabilität mit optimaler Aktivität bei physiologischem pH und physiologischer Temperatur. Es sind weder natürliche Xylanasen selektiert worden, noch ist irgendeine Mutationsmethodik für die Familie 11-Xylanasen entwickelt worden, um die Thermostabilität von Xylanase-Enzymen zu erhöhen ohne eine jegliche Veränderung bei den Temperatur- und pH-Optima und ohne einen begleitenden Verlust der spezifischen Aktivität des Enzyms. Solche selektierten natürlichen Xylanasen oder Xylanasen, die unter Verwendung von Mutationsmethodiken hergestellt worden sind, würden den Vorteil einer Verbesserung der Futterverdaubarkeit und Verarbeitung beim Pelletieren bieten.Despite a broad spectrum of experience in screening, testing and modifying xylanase enzymes, there are no reports of xylanases that demonstrate the combination of properties required for feed pelleting applications: high thermostability with optimal activity at physiological pH and temperature , Neither natural xylanases have been selected, nor has any mutation methodology been developed for the
Die Erfindung ist darauf gerichtet, Xylanase-Enzyme zu erhalten, die die Eigenschaft erhöhter Thermostabilität zeigen, während die pH- und Temperaturoptima, die typischerweise unter physiologischen Bedingungen gefunden werden, beibehalten werden. The invention is directed to obtaining xylanase enzymes which exhibit the property of increased thermostability while maintaining the pH and temperature optima typically found under physiological conditions.
Es ist ein Gegenstand der Erfindung, Nachteile des Standes der Technik zu überwinden.It is an object of the invention to overcome disadvantages of the prior art.
Das obige Ziel wird erreicht durch die Kombinationen von Merkmalen der Hauptansprüche; die Unteransprüche offenbaren weitere vorteilhafte Ausführungsformen der Erfindung.The above object is achieved by the combinations of features of the main claims; the subclaims disclose further advantageous embodiments of the invention.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNGSUMMARY OF THE INVENTION
Die Erfindung betrifft thermostabile Xylanase-Enzyme. Spezieller ist die Erfindung auf thermostabile Xylanase-Enzyme, die hohe Aktivität bei oder nahe bei physiologischem pH und physiologischer Temperatur zeigen, und die Verwendung dieser Xylanase-Enzyme bei Futterpelletier-Anwendungen gerichtet.The invention relates to thermostable xylanase enzymes. More particularly, the invention is directed to thermostable xylanase enzymes which exhibit high activity at or near physiological pH and physiological temperature and the use of these xylanase enzymes in feed pelleting applications.
Gemäß der Erfindung wird eine isolierte modifizierte Trichoderma-, Streptomyces- oder Schizophyllum-Xylanase der Familie 11 bereitgestellt, umfassend mindestens eine intramolekulare Disulfid-Bindung und eine substituierte basische Aminosäure an Position 162 (Trichoderma reesei-Xylanase II-Nummerierung) oder deren Äquivalent, wobei diese Position aufgrund eines Sequenz-Alignments (auf Homologie basierende gegenseitige Ausrichtung von Sequenzen) der genannten isolierten Xylanase gegenüber der Trichoderma reesei-Xylanase II-Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO: 16 definiert ist, bestimmt wird, wobei die isolierte Xylanase wenigstens 40% der optimalen Aktivität von ungefähr pH 3,5 bis ungefähr pH 6,0 und von ungefähr 40 bis ungefähr 60°C und nach einem 30-minütigen Vorinkubationsschritt bei 70°C, 80°C Oder 90°C in Gegenwart von 40% Glycerol; einem 30- oder 60-minütigen Vorinkubationsschritt bei 62,5°C in Abwesenheit eines Stabilisators; oder einem 30-minütigen Vorinkubationsschritt bei 64°C oder 68°C in Abwesenheit eines Stabilisators wenigstens 30% der optimalen Aktivität zeigt. Die basische Aminosäure wird aus der Gruppe bestehend aus Lysin, Arginin und Histidin ausgewählt. Die basische Aminosäure ist vorzugsweise Histidin.According to the invention there is provided an isolated modified family Trichoderma, Streptomyces or Schizophyllum xylanase comprising at least one intramolecular disulfide bond and a substituted basic amino acid at position 162 (Trichoderma reesei xylanase II numbering) or its equivalent, wherein this position is determined by sequence alignment (homology-based alignment of sequences) of said isolated xylanase against the Trichoderma reesei xylanase II amino acid sequence defined in SEQ ID NO: 16, wherein the isolated xylanase is at least 40% the optimal activity from about pH 3.5 to about pH 6.0 and from about 40 to about 60 ° C and after a 30 minute preincubation step at 70 ° C, 80 ° C or 90 ° C in the presence of 40% glycerol; a 30 or 60 minute preincubation step at 62.5 ° C in the absence of a stabilizer; or a 30 minute preincubation step at 64 ° C or 68 ° C in the absence of a stabilizer exhibits at least 30% of the optimal activity. The basic amino acid is selected from the group consisting of lysine, arginine and histidine. The basic amino acid is preferably histidine.
Die modifizierte Xylanase der Erfindung umfasst wenigstens eine Disulfid-Brücke. Die modifizierte Xylanase umfasst vorzugsweise eine oder zwei Disulfid-Brücken.The modified xylanase of the invention comprises at least one disulfide bridge. The modified xylanase preferably comprises one or two disulfide bridges.
Die Erfindung ist auch auf die isolierte Xylanase, wie oben definiert, gerichtet, wobei die Xylanase aus der Gruppe bestehend aus TrX-162H-DS1, TrX-162H-DS2 und TrX-162H-DS4 ausgewählt wird.The invention is also directed to the isolated xylanase as defined above, wherein the xylanase is selected from the group consisting of TrX-162H-DS1, TrX-162H-DS2 and TrX-162H-DS4.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung von Tierfutter, wobei das Verfahren ein Aufbringen der isolierten, modifizierten Familie 11-Xylanase, wie oben definiert, auf das Tierfutter, um eine Xylanase-Tierfutter-Kombination zu erzeugen, und ein Hitzesterilisieren der Xylanase-Tierfutter-Kombination umfasst. Das Tierfutter ist vorzugsweise ein Geflügel- oder Schweinefutter.The invention also relates to a method of producing animal feed, the method comprising applying the isolated, modified
Die Erfindung ist darauf gerichtet, Xylanase-Enzyme zu erhalten, die pH- und Temperaturoptima zeigen, die innerhalb des Nahrungsbreis eines Tiers gefunden werden, während das Xylanase-Molekül zur gleichen Zeit Thermostabilität zeigt und dementsprechend Verfahrensschritten, die mit dem Sterilisieren und Herstellen von pelletiertem Futter verbunden sind, widerstehen kann. Der Stand der Technik offenbart, thermostabile Enzyme entweder durch Selektion von nativen Enzymen oder durch Gentechnologie zu erhalten; jedoch zeigen diese Enzyme keine physiologischen pH- und Temperaturoptima. Der Stand der Technik offenbart auch Xylanase-Enzyme, die optimale Enzymaktivität bei physiologischem pH und physiologischer Temperatur zeigen; diese Enzyme sind jedoch nicht thermisch stabil. Darüber hinaus gibt es im Stand der Technik nichts, was nahe legen würde, dass native Xylanase-Enzyme oder dass Xylanase-Enzyme modifiziert werden können, wie hier offenbart, um Xylanase-Enzyme zu erhalten, die hohe Temperaturtoleranz, die für ein Futterpelletieren geeignet ist, zeigen und optimale enzymatische Aktivität bei oder nahe bei physiologischen Bedingungen bewahren.The invention is directed to obtaining xylanase enzymes which exhibit pH and temperature optima found within the food pulp of an animal, while the xylanase molecule exhibits thermostability at the same time and, accordingly, process steps associated with the sterilization and production of pelleted Food can withstand, can withstand. The prior art discloses to obtain thermostable enzymes either by selection of native enzymes or by genetic engineering; however, these enzymes show no physiological pH and temperature optima. The prior art also discloses xylanase enzymes which exhibit optimal enzyme activity at physiological pH and physiological temperature; however, these enzymes are not thermally stable. Moreover, there is nothing in the prior art that would suggest that native xylanase enzymes or that xylanase enzymes can be modified as disclosed herein to obtain xylanase enzymes, the high temperature tolerance suitable for food pelleting , show and maintain optimal enzymatic activity at or near physiological conditions.
Diese Zusammenfassung der Erfindung beschreibt nicht notwendigerweise alle notwendigen Merkmale der Erfindung, sondern dass die Erfindung vielmehr auch in einer Unterkombination der beschriebenen Merkmale liegen kann.This summary of the invention does not necessarily describe all necessary features of the invention, but rather that the invention may be in a sub-combination of the described features.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGENBRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS
Diese und andere Merkmale der Erfindung werden besser ersichtlich aus der folgenden Beschreibung, in welcher auf die beigefügten Zeichnungen verwiesen wird, in denen:These and other features of the invention will become more apparent from the following description in which reference is made to the accompanying drawings, in which:
BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMDESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENT
Die Erfindung betrifft thermostabile Xylanase-Enzyme und deren Verwendung als Futterzusätze Spezieller ist die Erfindung auf thermostabile Xylanase-Enzyme, die gute Thermostabilität zeigen und hohe Aktivität bei oder nahe bei physiologischem pH und physiologischer Temperatur zeigen, gerichtet.The invention relates to thermostable xylanase enzymes and their use as feed additives. More particularly, the invention is directed to thermostable xylanase enzymes which exhibit good thermostability and exhibit high activity at or near physiological pH and physiological temperature.
Die folgende Beschreibung ist lediglich beispielhaft jene einer bevorzugten Ausführungsform und ohne Einschränkung hinsichtlich der Kombination von Merkmalen, die erforderlich sind, um die Erfindung in die Praxis umzusetzen.The following description is merely illustrative of one preferred embodiment and without limitation as to the combination of features necessary to practice the invention.
Mit physiologischem pH und physiologischer Temperatur ist der Temperatur- und pH-Bereich gemeint, der mit dem Verdauungsssystem innerhalb eines Tiers, beispielsweise Geflügel und Schweine, jedoch nicht darauf beschränkt, verträglich ist. Ein geeigneter physiologischer Temperaturbereich erstreckt sich beispielsweise von ungefähr 35 bis ungefähr 60°C; dieser Bereich erstreckt sich mehr bevorzugt von ungefähr 40 bis ungefähr 50°C. In ähnlicher Weise erstreckt sich ein geeigneter physiologischer pH-Bereich von ungefähr pH 3,0 bis ungefähr 7,0; dieser Bereich erstreckt sich vorzugsweise von ungefähr pH 3,5 bis ungefähr 6,0. Die Zeit, die für die Verdauung von Futter innerhalb des Darms eines Tieres benötigt wird, variiert von Tier zu Tier. Beispielsweise benötigt in Schweinen die Verdauung von Futter ungefähr 2 bis ungefähr 4 h, während sie bei Geflügel bis zu ungefähr 12 h beträgt.By physiological pH and physiological temperature is meant the temperature and pH range that is compatible with the digestive system within an animal, such as, but not limited to, poultry and swine. For example, a suitable physiological temperature range is from about 35 to about 60 ° C; this range more preferably ranges from about 40 to about 50 ° C. Similarly, a suitable physiological pH range is from about pH 3.0 to about 7.0; this range preferably ranges from about pH 3.5 to about 6.0. The time required for the digestion of food within the intestine of an animal varies from animal to animal. For example, in pigs digestion of feed takes about 2 to about 4 hours, while in poultry it takes up to about 12 hours.
Mit hoher Aktivität bei physiologischem pH und physiologischer Temperatur ist gemeint, dass das Enzym wenigstens 40% von seiner optimalen Aktivität bei physiologischem pH und physiologischer Temperatur zeigt. Der optimale pH- und Temperaturbereich kann außerhalb des physiologischen Bereichs liegen, vorausgesetzt, dass das Enzym wenigstens 40% seiner optimalen Aktivität innerhalb des physiologischen Bereichs, beispielsweise von ungefähr 40 bis ungefähr 50°C und bei einem pH von ungefähr 3,5 bis ungefähr 6, zeigt. Die Beispiele 4 und 5 beschreiben die Bestimmung eines geeigneten Xylanase-Enzyms, das diese Eigenschaften zeigt. By high activity at physiological pH and physiological temperature, it is meant that the enzyme exhibits at least 40% of its optimal activity at physiological pH and temperature. The optimum pH and temperature range may be outside the physiological range, provided that the enzyme has at least 40% of its optimal activity within the physiological range, for example from about 40 to about 50 ° C and at a pH of about 3.5 to about 6 , shows. Examples 4 and 5 describe the determination of a suitable xylanase enzyme which exhibits these properties.
„Thermostabil” oder „Thermostabilität”, wie hier verwendet, bezieht sich auf eine Eigenschaft eines Enzyms. Ein Enzym wird als thermostabil angesehen, wenn es wenigstens eine der folgenden Eigenschaften zeigt:
- 1) das Enzym zeigt wenigstens 30% seiner optimalen Aktivität nach einem 30-minütigen Vorinkubationsschritt bei 70°C, 80°C oder 90°C bei
5,0 in Gegenwart eines stabilisierenden Mittels,pH wie 40% Glycerol. Das Enzym zeigt vorzugsweise wenigstens 40% seiner optimalen Aktivität nach einem 30-minütigen Vorinkubationsschritt bei 70°C in Glycerol, beispielsweise, aber nicht beschränkt auf TrX-162H-DS1 (5 ); - 2) das Enzym zeigt 30% seiner optimalen Aktivität nach einem 30- oder 60-
minütigen Vorinkubationsschritt bei 62,5°C in Abwesenheit eines Stabilisators. Das Enzym zeigt vorzugsweise wenigstens 40% seiner optimalen Aktivität nach einer 30-minütigen Vorinkubation, beispielsweise, aber nicht beschränkt auf TrX-162H-DS1 und TrX-162H-DS4 (3 ); - 3) das Enzym zeigt wenigstens 30% seiner optimalen Aktivität nach einem 30-minütigen Vorinkubationsschritt bei 64°C in Abwesenheit eines Stabilisators. Das Enzym zeigt vorzugsweise wenigstens 40% seiner optimalen Aktivität nach dem 30-minütigen Vorinkubationsschritt bei 64°C, beispielsweise, aber nicht beschränkt auf TrX-162H-DS1 und TrX-162H-DS4 (
4 ); oder - 4) das Enzym zeigt wenigstens 30% seiner optimalen Aktivität nach einem 30-minütigen Vorinkubationsschritt bei 68°C in Abwesenheit eines Stabilisators. Das Enzym zeigt vorzugsweise wenigstens 40% seiner optimalen Aktivität nach dem 30-minütigen Vorinkubationsschritt bei 68°C, beispielsweise, aber nicht beschränkt auf TrX-162H-DS1 und TrX-162H-DS4 (
4 ).
- 1) the enzyme exhibits at least 30% of its optimal activity after a 30 minute preincubation step at 70 ° C, 80 ° C or 90 ° C at pH 5.0 in the presence of a stabilizing agent such as 40% glycerol. The enzyme preferably exhibits at least 40% of its optimal activity after a 30 minute preincubation step at 70 ° C in glycerol, for example, but not limited to, TrX-162H-DS1 (
5 ); - 2) the enzyme shows 30% of its optimal activity after a 30 or 60 minute preincubation step at 62.5 ° C in the absence of a stabilizer. The enzyme preferably exhibits at least 40% of its optimal activity after a 30 min preincubation, for example, but not limited to, TrX-162H-DS1 and TrX-162H-DS4 (
3 ); - 3) the enzyme exhibits at least 30% of its optimal activity after a 30 minute preincubation step at 64 ° C in the absence of a stabilizer. The enzyme preferably exhibits at least 40% of its optimal activity after the 30 min preincubation step at 64 ° C, for example but not limited to TrX-162H-DS1 and TrX-162H-DS4 (
4 ); or - 4) the enzyme exhibits at least 30% of its optimal activity after a 30 min preincubation step at 68 ° C in the absence of a stabilizer. The enzyme preferably exhibits at least 40% of its optimal activity after the 30 min preincubation step at 68 ° C, for example but not limited to TrX-162H-DS1 and TrX-162H-DS4 (
4 ).
In jedem der obigen Fälle wird die optimale Aktivität des Enzyms bei einem optimalen pH und einer optimalen Temperatur für jenes Enzym in Gegenwart oder in Abwesenheit von Stabilisator, wie erforderlich, bestimmt.In each of the above cases, the optimum activity of the enzyme is determined at an optimum pH and temperature for that enzyme in the presence or absence of stabilizer as required.
Mit „TrX-Nummerierung” ist die Nummerierung gemeint, die mit der Position von Aminosäuren basierend auf der Aminosäuresequen von TrX (XynII – Tabelle 1; Tr2 –
Mit modifizierter Xylanase ist die Veränderung eines Xylanase-Moleküls unter Verwendung von Techniken, die einem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt sind, gemeint. Diese Techniken umfassen, sind aber nicht beschränkt auf ortsgerichtete Mutagenese, Kassetten-Mutagenese, Konstruktion von synthetischen Oligonukleotiden, Klonierung und andere Techniken der Gentechnologie. Veränderungen eines Xylanase-Enzyms, um eine modifizierte Xylanase herzustellen, können auch entstehen als ein Ergebnis einer Anwendung von Techniken, die darauf gerichtet sind, Mutationen innerhalb von nativen oder gentechnologisch modifizierten Xylanasen zu induzieren über die Zugabe von bekannten chemischen Mutagenen, UV-Exposition oder andere Behandlungen, die dafür bekannt sind, eine Mutagenese innerhalb von Wirtsorganismen, die eine Xylanase von Interesse exprimieren, zu induzieren. Solche Techniken sind innerhalb dieses Fachgebiets wohlbekannt.By modified xylanase is meant the alteration of a xylanase molecule using techniques known to those skilled in the art. These techniques include, but are not limited to, site-directed mutagenesis, cassette mutagenesis, construction of synthetic oligonucleotides, cloning, and other genetic engineering techniques. Alterations of a xylanase enzyme to produce a modified xylanase may also arise as a result of application of techniques directed to induce mutations within native or genetically engineered xylanases via the addition of known chemical mutagens, UV exposure, or other treatments known to induce mutagenesis within host organisms expressing a xylanase of interest. Such techniques are well known in the art.
Tabelle 1 listet die Familie 11-Xylanasen, die frei von Cellulase-Aktivität sind, auf. Diese Enzyme weisen gemeinsam umfassende Aminosäuresequenzähnlichkeit auf und besitzen Aminosäuren, die der Familie 11 gemein sind, beispielsweise zwei Glutaminsäure (E)-Reste, die als die essentiellen katalytischen Reste dienen, die Aminosäuren 86 und 177 (bei Verwendung der TrX-Nummerierung). Strukturvergleiche von mehreren Familie 11-Xylanasen über Röntgenkristallographie zeigen an, dass diese Familie 11-Xylanasen von bakterieller oder pilzlicher Herkunft die gleiche generelle molekulare Struktur aufweisen (siehe beispielsweise
TABELLE 1: Familie 11-Xylanasen TABLE 1 Family 11-xylanases
Es wird als innerhalb des Umfangs der Erfindung angesehen, dass Xylanasen, einschließlich Familie 11-Xylanasen, beispielsweise, aber nicht beschränkt auf Trichoderma reesei-Xylanase II, Trichoderma reesei-Xylanase I, Trichoderma viride-Xylanase, Streptomyces lividans-Xylanase B und Streptomyces lividans-Xylanase C, modifiziert werden können, indem der allgemeinen Strategie und Methodik, wie sie hier erläutert werden, gefolgt wird.It is contemplated that within the scope of the invention xylanases, including but not limited to family 11-xylanases, include, but are not limited to, Trichoderma reesei xylanase II, Trichoderma reesei xylanase I, Trichoderma viride xylanase, Streptomyces lividans xylanase B, and Streptomyces lividans -Xylanase C can be modified by following the general strategy and methodology as discussed herein.
Die Erfindung betrifft auch modifizierte Xylanase-Enzyme, die erhöhte Thermostabilität zeigen, während sie hohe Aktivität bei physiologischem pH und physiologischer Temperatur beibehalten. Beispielsweise und ohne die Erfindung in irgend einer Weise beschränken zu wollen, wird eine modifizierte Trichoderma reesei-Xylanase (TrX) offenbart, die erhöhte Thermostabilität zeigt, während pH- und Temperaturoptima bei oder nahe dem physiologischen Bereich beibehalten werden. Es wurden zwei Modifizierungen in der TrX kombiniert, um eine neue Xylanase (TrX-162H-DS1) zu erhalten. Die erste Modifizierung umfasst eine doppelte Mutation, um zwei Cysteine für die Bildung einer einzelnen Disulfid-Bindung zu erzeugen. Eine solche Modifizierung ist für Bacillus circulans-Xylanase (C100/C148; BcX-Aminosäurenummerierung) in
Eine andere mutierte Xylanase im Rahmen der Erfindung, TrX-162H-DS4, unterscheidet sich von TrX-162H-DS1 dadurch, dass sie ein zusätzliches Disulfid (108/158, d. h. zwischen den Positionen 108 und 158) aufweist. Diese Art von doppelter Disulfid-Mutante ist zuvor für die Xylanase von Bacillus circulans beschrieben worden (C98/C152, 100/148; BcX-Aminosäurenummerierung; Wakarchuck et al., 1994, Protein Engineering, 7: 1379–1386). Die BcX-Mutante umfasst keine äquivalente basische Aminosäure (z. B. H für Q an Position 162)-Substitution, wie hier offenbart. Die mutierte TrX-162H-DS4 zeigt eine dramatische Zunahme der Thermostabilität (siehe
Die Erfindung betrifft auch zusätzliche Mutationen, von denen festgestellt worden ist, dass sie wirksam sind bei der Herstellung einer Xylanase, die Thermostabilität und ein wünschenswertes pH-Profil aufweist. Ein Beispiel für solche Mutationen kann in TrX-DS8 gefunden werden, ist aber nicht darauf beschränkt. TrX-DS8 umfasst die für N1-TX13 aufgelisteten Mutationen, wie in
Über isolierte Xylanase-Enzyme, welche die Substitution von H anstelle von Q an Position 162 umfassen (bezeichnet als Q162H), ist in
Indem den Verfahren der Erfindung gefolgt wird, können neue Xylanase-Enzyme erhalten werden, die viel geeigneter für Futterpelletier-Anwendungen sind als Enzyme, die gegenwärtig zur Verfügung stehen. Ähnliche Modifizierungen können bei anderen Familie 11-Xylanasen vorgenommen werden, einschließlich Xylanase-Enzyme, die aus Trichoderma, Streptomyces und Schizophyllum erhalten werden.By following the methods of the invention, new xylanase enzymes can be obtained which are much more suitable for feed pelleting applications than enzymes currently available. Similar modifications can be made to
Bei einer Verwendung kann die Formulierung des Futterenzyms die Thermostabilität des Enzyms verbessern, da eine Adsorption in das Futter die Stabilität verbessert, wenn das Enzym in Kontakt mit dessen Substrat gebracht wird. Dementsprechend wurden bei der Bestimmung der Thermostabilität der Xylanasen der Erfindung Xylanasen in Gegenwart und Abwesenheit von stabilisierenden Mitteln, beispielsweise, aber nicht beschränkt auf Glycerol, charakterisiert. Fisk und Simpson (1993) haben berichtet, dass 40% Glycerol die Temperaturtoleranz von Wildtyp-TrX um weniger als +10°C erhöhte; dies ist jedoch viel weniger Stabilität als bei den Enzymen der Erfindung. Die durch Kombination mutierten Xylanasen der Erfindung können eine Inkubation in Puffer bei einer höheren Temperatur (59–69°C) verglichen mit natürlicher Xylanase (55°C; siehe auch
Eine der Modifizierungen an der durch Kombination mutierten Xylanase, wie hier vorgeschlagen, ist die Substitution der Aminosäure 162 (TrX-Nummerierung basierend auf Tr2 in
Der Histidin-162-Rest (TrX-Nummerierung) in der Kombinationsmutante wird an der entsprechenden Position in mehreren natürlichen Familie 11-Xylanasen gefunden, wie jenen aus Trichoderma harzianum, Aspergillus niger, var. awamori, Aspergillus tubigensis, Thermomonospora fusca, Bacillus circulans und Bacillus subtilis. In ähnlicher Weise umfasst Clostridium acetobutylicum ein Lysin an dieser äquivalenten Position. Jedoch werden alle von diesen Xylanasen mit der Ausnahme der Thermomonospora fusca-Xylanase durch mesophile Wirte produziert und zeigen geringe Thermostabilität. Als ein Ergebnis gibt es keinen Hinweis darauf, eine jegliche vorteilhafte Wirkung auf die Thermostabilität durch das Vorhandensein eines basischen Aminosäurerests an dieser Position zu vermuten. Bei der Thermomonospora fusca-Xylanase ist gezeigt worden, dass die N-terminale Sequenz (1-29), die von der Stelle der Erfindung entfernt liegt, zur Thermostabilität beiträgt, und es gibt keinen Hinweis, zu vermuten, dass Thermostabilität mit einem Histidin an dieser äquivalenten Position (d. h. TrX 162) assoziiert sein könnte.The
Diese Erfindung ist auch auf Trichoderma-, Streptomyces- oder Schizophyllum-Xylanasen gerichtet, die wenigstens eine Modifizierung umfassen, die zu erhöhter Thermostabilität führt, während hohe Aktivität bei physiologischem pH und physiologischer Temperatur beibehalten wird. Beispielsweise weist native Schizophyllum commune-Xylanase eine Disulfid-Bindung an den Positionen 110/154 (TrX-Nummerierung) auf. Dieses Enzym zeigt jedoch geringe Thermostabilität. Dementsprechend kann dieses Enzym modifiziert werden unter Verwendung der Verfahren der Erfindung, um eine basische Aminosäure, entweder Histidin, Arginin oder Lysin, anstelle des natürlich vorkommenden Leucins an Position 200 von Schizophyllum commune (welche äquivalent zu Position 162 bei Verwendung der TrX-Nummerierung ist; siehe
Als ebenfalls innerhalb des Umfangs der Erfindung angesehen werden Trichoderma-, Streptomyces- oder Schizophyllum-Kombinationsmutanten, welche sowohl eine intramolekulare Disulfid-Bindung als auch eine basische Aminosäure-Substitution, wie oben erläutert, umfassen. Die intramolekulare Disulfid-Bindung kann entstehen als Ergebnis einer Mutation an einem oder mehreren spezifischen Resten, beispielsweise (anhand der TrX-Nummerierung);
- • den Resten -110/-154; beispielsweise, aber nicht beschränkt auf TrX-162H-DS1 oder Trx-DS8;
- • den Resten -108/-158; beispielsweise, aber nicht beschränkt auf TrX-162H-DS2 oder
- • den Resten -108/-158, -110/-154; beispielsweise, aber nicht beschränkt auf TrX-162H-DS4.
- • residues -110 / -154; for example but not limited to TrX-162H-DS1 or Trx-DS8;
- • residues -108 / -158; for example, but not limited to TrX-162H-DS2 or
- • residues -108 / -158, -110 / -154; for example, but not limited to TrX-162H-DS4.
Auch als innerhalb des Umfangs der Erfindung angesehen werden beispielsweise Modifizierungen von thermostabilen Trichoderma-, Streptomyces- oder Schizophyllum-Xylanasen.Also considered to be within the scope of the invention are, for example, modifications of thermostable Trichoderma, Streptomyces or Schizophyllum xylanases.
Diese Modifizierungen halten die Thermostabilität des nativen Enzyms aufrecht, verändern aber die pH- und Temperaturoptima, so dass sie hohe Aktivität bei physiologischem pH und physiologischer Temperatur, die normalerweise mit dem Enzym nicht verbunden ist, zeigen. TABELLE 2: Modifizierte Xylanasen
Die Erfindung wird in den folgenden Beispielen weiter veranschaulicht werden. Es versteht sich jedoch, dass diese Beispiele allein Veranschaulichungszwecken dienen und nicht verwendet werden sollten, um den Umfang der Erfindung in irgendeiner Weise einzuschränken.The invention will be further illustrated in the following examples. It should be understood, however, that these examples are for the purpose of illustration only and should not be used to limit the scope of the invention in any way.
Beispiele:Examples:
Beispiel 1: Konstruktion der mutierten Trichoderma reesei-XylanasenExample 1: Construction of mutant Trichoderma reesei xylanases
Grundlegende in vitro-DNA-Rekombinationsmethoden, wie Plasmid-Präparation, Restriktionsenzymverdau, Polymerasekettenreaktion, Oligonukleotid-Phosphorylierung, Ligation, Transformation und DNA-Hybridisierung wurden ausgeführt gemäß wohl etablierten Protokollen, die den Fachleuten auf diesem Gebiet geläufig sind (Sung, W. L., Yao, F.-L., Zahab, D. M., und Narang, S. A. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 561–565) oder wie durch den Hersteller der Enzyme oder des Kits empfohlen. Die Puffer für viele Enzyme sind als Teil eines Kits geliefert worden oder hergestellt worden, indem den Anweisungen der Hersteller gefolgt wurde. Restriktionsenzyme, T4-Polynukleotidkinase und T4-DNA-Ligase wurden von New England BioLabs LTD, Mississauga, Oft., erworben. Ein Vorläufer-Plasmid, pXYbc, ist zuvor hergestellt und veröffentlicht worden (Sung, W. L., Luk, C. K., Zahab, D. M., und Wakarchuk, W. (1993) Protein Expression Purif, 4: 200–206;
A. Konstruktion des Vorläufer-Plasmids pTrXA. Construction of precursor plasmid pTrX
Das Vorläufer-Plasmid pTrX für alle nachfolgenden Mutationen ist veröffentlicht (Sung et al., 1995). Dieses Plasmid ist von einem pUC119-Plasmid mittels einer synthetischen Nukleotidsequenz, welche eine Trichoderma reesei-Xylanase kodiert, die inseriert wurde, abgeleitet (
Anfänglich wurden zehn überlappende Oligonukleotide: welche die TrX(92-190)-Sequenz kodieren (
Für die Herstellung einer Hybridisierungssonde wurde eines der Oligonukleotide XyTv-110 (10 pmol, 1 l) mittels 32P-ATP (10 pmol, 3 l) in T4-DNA-Kinase (1 l), 10X Kinasepuffer (1 l) und Wasser (4 l) bei 37°C 1 h phosphoryliert.For the preparation of a hybridization probe, one of the oligonucleotides XyTv-110 (10 pmol, 1 L) was amplified by 32 P-ATP (10 pmol, 3 L) in T4 DNA kinase (1 L), 10X kinase buffer (1 L) and water (4 l) phosphorylated at 37 ° C for 1 h.
Transformanten wurden zufällig für eine Hybridisierungsanalyse ausgewählt. Kolonien wurden auf Nylonfiltern auf YT-Platten mit Ampicillin über Nacht kultiviert. Sie wurden dann mit 0,5 N NaOH – 1,5 M NaCl denaturiert (10 min) und mit 0,5 N Tris-HCl (pH 7,0) – 1,5 M NaCl neutralisiert (10 min). Nach Bestrahlen durch UV von 254 nm für 8 min wurden die Filter mit 6X SSC – 0,05% Triton X-100 30 min gewaschen. Zellrückstände wurden vollständig abgekratzt. Nach weiteren 30 min in frischer Lösung wurden die doppelt erstellten Filter individuell in separate Mischungen von 6X SSC – 1% Dextransulfat – 0,05% Triton X-100 – 1X Denhardt's-Hybridisierungsfluid transferiert. Die 32P-markierte Sonde wurde zu dem Filter hinzugegeben. Nach 16 h bei 45°C wurde der Filter zweimal mit 6X SSC – 0,05% Triton X-100 bei Raumtemperatur 5 min und dann bei 65°C 30 min gewaschen. Positiv hybridisierte Klone mit dem intermediären Plasmid pBcX.TrX wurden durch autoradiographische Analyse identifiziert.Transformants were randomly selected for hybridization analysis. Colonies were cultured on nylon filters on YT plates with ampicillin overnight. They were then denatured with 0.5 N NaOH-1.5 M NaCl (10 min) and neutralized with 0.5 N Tris-HCl (pH 7.0) - 1.5 M NaCl (10 min). After irradiation by UV of 254 nm for 8 min, the filters were washed with 6X SSC - 0.05% Triton X-100 for 30 min. Cell debris was scraped off completely. After a further 30 min in fresh solution, the duplicate filters were individually transferred to separate mixtures of 6X SSC - 1% dextran sulfate - 0.05% Triton X-100 - 1X Denhardt's hybridization fluid. The 32 P-labeled probe was added to the filter. After 16 h at 45 ° C, the filter was washed twice with 6X SSC - 0.05% Triton X-100 at room temperature for 5 min and then at 65 ° C for 30 min. Positively hybridized clones with the intermediate plasmid pBcX.TrX were identified by autoradiographic analysis.
Das obige Protokoll, welches eine enzymatische Phosphorylierung von synthetischen überlappenden Oligonukleotiden und eine Ligation in ein linearisiertes Plasmid umfasst, ist erneut bei dem Zusammenbau der TrX(1-92)-Region und bei der Kassetten-Mutagenese für die nachfolgende Erzeugung von anderen Mutantenreihen, die in dieser Erfindung beschrieben werden, verwendet worden.The above protocol, which involves enzymatic phosphorylation of synthetic overlapping oligonucleotides and ligation into a linearized plasmid, is again in the assembly of the TrX (1-92) region and in cassette mutagenesis for subsequent generation of other mutant series described in this invention have been used.
Für den Zusammenbau der TrX(1-92)-Region, um das Trichoderma-Volllängen-Gen zu vervollständigen, wurde das intermediäre Plasmid pBcX.TrX durch NheI- und KpnI-Endonukleasen linearisiert, um das DNA-Insert für BcX(1-83) freizusetzen. Mit kohäsiven NheI- und KpnI-Enden wurden acht überlappende Oligonukleotide: welche die veröffentlichte TrX(1-91)-Sequenz kodierten, in das linearisierte Plasmid pBcX.TrX (
Alle mutierten Xylanasen, die nachfolgend beschrieben werden, sind über die Methode der Kassetten-Mutagenese, wie oben beschrieben, konstruiert worden. Das Protokoll für die Kassetten-Mutagenese war identisch zu jenem für den Genzusammenbau, das oben vollständig beschrieben wurde. Eine solche Kassetten-Mutagenese umfasste (i) eine enzymatische Phosphorylierung von überlappenden synthetischen Oligonukleotiden, (ii) deren Ligation mit dem linearisierten Plasmid, (iii) eine Transformation der kompetenten E. coli-HB101-Zellen damit, (iv) eine Identifizierung der mutierten Transformanten über eine Hybridisierung mit dem markierten Oligonukleotid als Sonde und (v) eine Bestätigung der Mutation durch Didesoxynukleotid-Sequenzierung.All mutant xylanases described below have been constructed by the method of cassette mutagenesis as described above. The cassette mutagenesis protocol was identical to that for gene assembly, fully described above. Such cassette mutagenesis involved (i) enzymatic phosphorylation of overlapping synthetic oligonucleotides, (ii) their ligation with the linearized plasmid, (iii) transformation of the competent E. coli HB101 cells therewith, (iv) identification of the mutant Transformants via hybridization with the labeled oligonucleotide as a probe and (v) confirmation of the mutation by dideoxynucleotide sequencing.
B. Konstruktion des Plasmids pTrX-DS1B. Construction of plasmid pTrX-DS1
Die mutierte TrX-DS1 (SEQ ID NOs: 54, 55) war identisch mit TrX mit einer kovalenten Disulfid-Bindung zwischen den Resten -110 und 154. Dies wurde bewerkstelligt durch zwei einzelne Mutationen, d. h. eine Umwandlung von beiden Resten Serin-110 und Asparagin-154 zu Cystein. Nach einer Expression der mutierten Xylanase werden diese beiden Cysteinreste eine Disulfid-Bindung ausbilden. Die Konstruktion des Plasmids pTrX-DS1 erfolgte durch Ligation der folgenden überlappenden phosphorylierten Oligonukleotide: in ein durch KasI/AvrII linearisiertes pTrX-Plasmid in einer Kassetten-Mutagenese, wie nachfolgend gezeigt.The mutant TrX-DS1 (SEQ ID NOs: 54, 55) was identical to TrX with a covalent disulfide bond between residues -110 and 154. This was accomplished by two single mutations, ie, a conversion of both serine-110 and residues Asparagine-154 to cysteine. Upon expression of the mutant xylanase, these two cysteine residues will form a disulfide bond. The construction of the plasmid pTrX-DS1 was carried out by ligation of the following overlapping phosphorylated oligonucleotides: into a KasI / AvrII linearized pTrX plasmid in cassette mutagenesis, as shown below.
C. Konstruktion des Plasmids pTrX-162H-DS1C. Construction of plasmid pTrX-162H-DS1
Die mutierte TrX-162H-DS1 (SEQ ID NO: 56) war identisch mit TrX-DS1 mit einer einzelnen Mutation von Glutamin-162 zu Histidin. Die Konstruktion des Plasmids pTrX-162D-DS1 erfolgte durch Ligation der Oligonukleotide: in das durch SphI/AvrII linearisierte pTrX-DS1-Plasmid in einer Kassetten-Mutagenese, wie nachfolgend gezeigt.The mutant TrX-162H-DS1 (SEQ ID NO: 56) was identical to TrX-DS1 with a single mutation of glutamine-162 to histidine. The construction of the plasmid pTrX-162D-DS1 was carried out by ligation of the oligonucleotides: into the SphI / AvrII linearized pTrX-DS1 plasmid in cassette mutagenesis, as shown below.
D. Konstruktion des Plasmids pTrX-162H-DS2D. Construction of plasmid pTrX-162H-DS2
Die mutierte TrX-162H-DS2 (SEQ ID NOs: 57, 58) war identisch zu TrX, aber mit einer kovalenten Disulfid-Bindung zwischen den Resten -108 und -158 und einer Mutation von Glutamin-162 zu Histidin. Das 108/110-Disulfid erforderte zwei einzelne Mutationen, d. h. eine Umwandlung von beiden Resten Valin-108 und Alanin-158 zu Cystein. Nach Expression der mutierten Xylanase werden diese beiden Cysteinreste eine Disulfid-Bindung bilden. Die Konstruktion des Plasmids pTrX-162H-DS2 erfolgte durch Ligation der folgenden überlappenden phosphorylierten Oligonukleotide: in das mit KasI/AvrII linearisierte pTrX-Plasmid in einer Kassetten-Mutagenese, wie nachfolgend gezeigt.The mutant TrX-162H-DS2 (SEQ ID NOs: 57, 58) was identical to TrX but with a covalent disulfide bond between residues -108 and -158 and a mutation of glutamine-162 to histidine. The 108/110 disulfide required two single mutations, ie, a conversion of both valine-108 residues and alanine-158 to cysteine. Upon expression of the mutant xylanase, these two cysteine residues will form a disulfide bond. The construction of the plasmid pTrX-162H-DS2 was carried out by ligation of the following overlapping phosphorylated oligonucleotides: into the KasI / AvrII linearized pTrX plasmid in cassette mutagenesis, as shown below.
E. Konstruktion des Plasmids pTrX-162H-DS4 E. Construction of plasmid pTrX-162H-DS4
Die mutierte TrX-162H-DS4 (SEQ ID NOs: 59,60) war identisch mit TrX, aber mit zwei kovalenten Disulfid-Bindungen 108/158 und 110/154 und einer Mutation von Glutamin-162 zu Histidin. Die beiden Disulfide erforderten vier einzelne Mutationen, d. h. eine Umwandlung der Reste Valin-108, Serin-110, Asparagin-154 und Alanin-158 zu Cystein. Nach Expression der mutierten Xylanase werden diese vier Cysteinreste zwei Disulfid-Bindungen ausbilden. Die Konstruktion des Plasmids pTrX-162H-DS4 erfolgte durch Ligation der folgenden überlappenden phosphorylierten Oligonukleotide: in das mit KasI/AvrII linearisierte pTrX-Plasmid in einer Kassetten-Mutagenese, wie nachfolgend gezeigt.The mutant TrX-162H-DS4 (SEQ ID NOs: 59.60) was identical to TrX but with two
F. Konstruktion von TrX-DS8F. Construction of TrX-DS8
Die mutierte TrX-DS8 wurde hergestellt unter Verwendung von analogen Verfahren zu jenen, die oben in den Abschnitten A bis E für die Herstellung von modifizierten Xylanasen erläutert worden sind. TrX-DS8 umfasst die Mutationen, die in N1-TX13, wie in
TrX-DS8 zeigt die Eigenschaft von Thermostabilität (
Beispiel 2: Charakterisierung von mutierten XylanasenExample 2: Characterization of mutant xylanases
A. Herstellung von XylanasenA. Preparation of xylanases
Die Kulturbedingungen waren identisch zu dem wohl etablierten Protokoll, das für andere durch E. coli exprimierte Xylanasen beschrieben worden ist. 5 ml eines Übernachtkultur-Inokulums in 2YT-Medium (16 g Hefeextrakt, 10 g Bakto-Trypton, 5 g NaCl, 1 l Wasser), enthaltend Ampicillin (100 mg/l) wurden zu 2YT-Medium (1 l) mit Ampicillin zugegeben. Die Kulturen wurden unter Schütteln (200 Upm) bei 37°C kultiviert. Nach 16 h wurden Zellen geerntet.Culture conditions were identical to the well established protocol described for other E. coli expressed xylanases. 5 ml of an overnight culture inoculum in 2YT medium (16 g. yeast extract, 10 g bacto tryptone, 5 g NaCl, 1 L water) containing ampicillin (100 mg / L) was added to 2YT medium (1 L) with ampicillin. The cultures were cultured with shaking (200 rpm) at 37 ° C. After 16 h, cells were harvested.
B. Reinigung von unterschiedlichen Disulfid-Bindungen enthaltenden mutierten XylanasenB. Purification of mutant xylanases containing different disulfide bonds
Aus Zellen wurden Proteinproben hergestellt, indem zuerst ein Extrakt der Zellen durch Vermahlen von 10 g der Zellpaste mit 25 g Aluminiumoxid-Pulver hergestellt wurde. Nach dem Vermahlen zu einer glatten Mischung wurden geringe Mengen (5 ml) von eiskaltem Puffer A (10 mM Natriumacetat, pH 5,5, für BcX-Mutanten) oder Puffer B (10 mM Natriumacetat, pH 4,6, für TX-Mutanten) zugegeben und die Mischung zwischen den Zugaben kräftig vermahlen. Das Aluminiumoxid und die Zellrückstände wurden durch Zentrifugation der Mischung bei 8000 × g für 30 min entfernt.Protein samples were prepared from cells by first making an extract of the cells by grinding 10 g of the cell paste with 25 g of alumina powder. After milling to a smooth mixture, small amounts (5 ml) of ice-cold buffer A (10 mM sodium acetate, pH 5.5, for BcX mutants) or buffer B (10 mM sodium acetate, pH 4.6, for TX mutants ) and vigorously milled the mixture between additions. The alumina and cell debris were removed by centrifuging the mixture at 8,000 x g for 30 min.
Der Rohextrakt wurde bei 60°C 15 min erwärmt und zentrifugiert, um eine große Menge des Niederschlags zu entfernen. Der Überstand wurde auf pH 4,6 angesäuert, bei –20°C über Nacht eingefroren, aufgetaut und zentrifugiert, um mehr Niederschlag zu entfernen.The crude extract was heated at 60 ° C for 15 minutes and centrifuged to remove a large amount of the precipitate. The supernatant was acidified to pH 4.6, frozen at -20 ° C overnight, thawed and centrifuged to remove more precipitate.
Nach der obigen Vorbehandlung wurde der Zellextrakt einer Säulenchromatographie unterzogen und wurde auf eine Kationenaustauschersäule mit S-Sepharose fast flow, 50 ml-Bettvolumen (Kabi-Pharmacia, Kanada), die in Puffer A äquilibriert worden war, gepumpt. Die Xylanase wurde mit 300 ml eines linearen Gradienten von 0 bis 0,3 M NaCl in Puffer A mit einer Flussrate von 3 ml/min eluiert. Die Xylanase eluiert bei 100 bis 150 ml des Gradienten. Die Fraktionen werden mittels SDS-PAGE überprüft und jene Fraktionen, die die Hauptmenge der Xylanase aufweisen, wurden vereinigt und durch Ultrafiltration unter Verwendung von Membranen mit einem Molekulargewichtsausschluss von 3000 Dalton (Amicon YM3) aufkonzentriert. Das aufkonzentrierte Material (5 ml) wurde dann auf eine 1,5 cm × 85 cm-TSK-HW50S-Gelfiltrationssäule, die in 50 mM Ammoniumacetat, pH 6, äquilibriert worden war, aufgetragen. Die Xylanase eluierte bei einem Volumen von 90 bis 100 ml. Diese Fraktionen wurden durch SDS-PAGE analysiert und die Peaks als reine Xylanase vereinigt. Das Protein wurde unter Verwendung des Extinktionskoeffizienten bei 280 nm quantifiziert.After the above pretreatment, the cell extract was subjected to column chromatography and was pumped onto a cation exchange column with S-Sepharose fast flow, 50 ml bed volume (Kabi-Pharmacia, Canada) equilibrated in Buffer A. The xylanase was eluted with 300 ml of a linear gradient from 0 to 0.3 M NaCl in Buffer A at a flow rate of 3 ml / min. The xylanase elutes at 100 to 150 ml of the gradient. The fractions are checked by SDS-PAGE and those fractions containing the majority of the xylanase were pooled and concentrated by ultrafiltration using 3000 dalton molecular weight cutoff membranes (Amicon YM3). The concentrated material (5 ml) was then applied to a 1.5 cm x 85 cm TSK HW50S gel filtration column equilibrated in 50 mM ammonium acetate,
C. Standardassay für die Messung von enzymatischer AktivitätC. Standard assay for the measurement of enzymatic activity
Der quantitative Assay bestimmte die Anzahl von reduzierenden Zuckerenden, die ausgehend von löslichem Xylan erzeugt werden. Das Substrat für diesen Assay war die Fraktion von Birkenholz-Xylan, die sich in Wasser ausgehend von einer 5%-igen Suspension von Birkenholz-Xylan (Sigma Chemical Co.) löste. Nach Entfernen der unlöslichen Fraktion wurde der Überstand gefriergetrocknet und in einem Exsiccator aufbewahrt. Die Messung der spezifischen Aktivität wurde, wie folgt, ausgeführt. Reaktionsmischungen, enthaltend 100 l 30 mg/ml Xylan, zuvor verdünnt in Assaypuffer (50 mM Natriumcitrat, pH 5,5 oder das pH-Optimum der getesteten Xylanase), 150 l Assaypuffer, 50 l in Assaypuffer verdünntes Enzym, wurden bei 40°C inkubiert. Nach verschiedenen Zeitabständen wurden 50 l-Anteile entfernt und die Reaktion wurde durch Verdünnen in 1 ml 5 mM NaOH gestoppt. Die Menge an reduzierenden Zuckern wurde mit dem Hydroxybenzoesäurehydrazid-Reagens (HBAH) (Lever, 1972, Analytical Biochem. 47: 273–279) bestimmt. Eine Einheit von Enzymaktivität wurde als jene Menge definiert, die 1 Mol reduzierenden Zucker in 1 min bei 40°C erzeugte.The quantitative assay determined the number of reducing sugar ends generated from soluble xylan. The substrate for this assay was the fraction of birchwood xylan which dissolved in water from a 5% suspension of birchwood xylan (Sigma Chemical Co.). After removing the insoluble fraction, the supernatant was freeze-dried and stored in a desiccator. The measurement of the specific activity was carried out as follows. Reaction mixtures containing 100 L of 30 mg / mL xylan previously diluted in assay buffer (50 mM sodium citrate, pH 5.5 or the pH optimum of the xylanase tested), 150 L of assay buffer, 50 L of enzyme buffer diluted enzyme were assayed at 40 ° C incubated. After various time intervals, 50 L portions were removed and the reaction was stopped by dilution in 1 mL of 5 mM NaOH. The amount of reducing sugars was determined with the hydroxybenzoic acid hydrazide reagent (HBAH) (Lever, 1972, Analytical Biochem 47: 273-279). One unit of enzyme activity was defined as the amount that produced 1 mole of reducing sugar in 1 minute at 40 ° C.
Für den Vergleich zwischen mutierten Xylanasen und der Wildtyp-Xylanase (TABELLE 3) wurden die spezifischen Aktivitäten einer Xylanase umgewandelt in die relative Aktivität, die als Prozentsatz verglichen mit der spezifischen Aktivität der natürlichen Xylanase berechnet wird. TABELLE 3. Relative Aktivität von TrX-Xylanasen
Wie aus Tabelle 3 ersehen werden kann, sind verglichen mit den natürlichen Xylanasen die spezifischen enzymatischen Aktivitäten der mutierten Xylanasen bei 40°C nicht signifikant verändert worden. As can be seen from Table 3, compared to the natural xylanases, the specific enzymatic activities of the mutant xylanases were not significantly altered at 40 ° C.
Beispiel 3: Thermostabilität von mutierten XylanasenExample 3 Thermostability of mutant xylanases
Dies war ein Test der Toleranz von Xylanasen gegenüber einer Inkubation bei einer festgelegten Temperatur ohne jegliches Substrat. Die Xylanase (150 g/ml) in Assaypuffer (50 mM Natriumcitrat) wurde bei einer festgelegten Temperatur oder eine festgelegte Zeitspanne inkubiert. Aliquots wurden auf Raumtemperatur (ungefähr 20°C) abgekühlt, die restliche enzymatische Aktivität aller Proben wurde mittels des HBAH-Assays bei 40°C bestimmt, wie in Beispiel 2C angegeben.This was a test of the tolerance of xylanases to incubation at a fixed temperature without any substrate. The xylanase (150 g / ml) in assay buffer (50 mM sodium citrate) was incubated at a fixed temperature or for a fixed period of time. Aliquots were cooled to room temperature (approximately 20 ° C), the residual enzymatic activity of all samples was determined by the HBAH assay at 40 ° C as indicated in Example 2C.
(A) Auswirkung der Inkubationslänge(A) Effect of incubation length
Die Auswirkung der Länge der Inkubation auf die Aktivität von Xylanase-Proben wurde bei 62,5°C bei pH 5,5 bestimmt (
Nach 5 min Inkubation hatten die Wildtyp-TrX und die Q162H-Mutante TrX-162H (
(B) Auswirkung von Inkubationstemperaturen auf die restliche Aktivität von mutierter TrX.(B) Effect of incubation temperatures on the residual activity of mutant TrX.
Die Thermostabilität von mutierten TrX-Enzymen wurde auch bestimmt anhand der Toleranz von unterschiedlichen Inkubationstemperaturen. Proben von Xylanasen wurden in 50 mM Natriumcitrat-Puffer (pH 5,5) bei unterschiedlichen Temperaturen (48, 52, 56, 60, 64, 68, 70 und 72°C) 30 min inkubiert. Die restliche Enzymaktivität der Proben wurde bestimmt, wobei die restliche Aktivität bei 48°C zu 100% normalisiert wurde (siehe
Ohne auf irgendeine Theorie festgelegt werden zu wollen, zeigt die höhere T50 von TrX-162H-DS1 (65°C) gegenüber TrX-DS1 (61°C) die Verbesserung der Thermostabilität durch die Mutation Q162H in den Disulfid-Mutanten. Die doppelte Disulfid-Mutante TrX-162H-DS4 zeigte ebenfalls hohe Stabilität mit einer T50-Zunahme von +14°C gegenüber der natürlichen TrX. Ein Vergleich der T50 von TrX-162H-DS1 (65°C) und TrX-162H-DS2 (59°C) zeigt an, dass das 110/154-Disulfid in TrX-162H-DS1 zu der letztgenannten mehr Thermostabilität als das 108/158-Disulfid beiträgt. TrX-DS8 zeigte ebenfalls hohe Thermostabilität mit einer T50-Zunahme von +16°C bei Vergleich mit natürlicher TrX.Without wishing to be bound by theory, the higher T 50 of TrX-162H-DS1 (65 ° C) versus TrX-DS1 (61 ° C) indicates the improvement in thermostability by the mutation Q162H in the disulfide mutants. The double disulphide mutant TrX-162H-DS4 also showed high stability with a T 50 increase of + 14 ° C over the natural TrX. Comparison of the T 50 of TrX-162H-DS1 (65 ° C) and TrX-162H-DS2 (59 ° C) indicates that the 110/154 disulfide in TrX-162H-DS1 is more thermostable than the latter 108/158 disulfide contributes. TrX-DS8 also showed high thermal stability with a T 50 increase of + 16 ° C when compared to natural TrX.
(C) Effektive Inkubationstemperatur(C) Effective incubation temperature
In dem folgenden Beispiel wurde eine Modelluntersuchung der Auswirkung der Enzymformulierung auf die Thermostabilität der Kombinationsmutante in Gegenwart eines Zusatzstoffs, Glycerol, ausgeführt. Die unmodifizierte TrX und die mutierten TrX-Xylanasen wurden 30 min bei 20, 50, 60, 70, 80 und 90°C in einem Puffer (pH 5,0) mit 40% Glycerol inkubiert. Die restliche Aktivität wurde durch den HBAH-Assay bestimmt. Die restliche Enzymaktivität bei 0 min wurde zu 100% normalisiert (
Bei 50°C behielten alle TrX-Proben ihre enzymatische Aktivität bei. Bei 60°C behielt die Wildtyp-TrX 75% von ihrer Aktivität bei, während TrX-DS1 und TrX-162H-DS1 80 bzw. 100% beibehielten (
(D) Auswirkung der Inkubationsdauer auf die restliche Aktivität von TrX-162H-DS1 bei 90°C(D) Effect of incubation time on the residual activity of TrX-162H-DS1 at 90 ° C
Eine Probe von TrX-162H-DS1 in 40% Glycerol und Puffer wurden in einem abgedeckten zirkulierenden Wasserbad (Haake Typ F4391, mit einer Schwankung von 0,1°C) bei 90°C inkubiert. Die Temperatur des Wasserbads wurde mit einem Thermoelement bestätigt. Aliquots wurden nach 0, 5, 10 und 30 min für eine Bestimmung der restlichen Aktivität entfernt. Die restliche Enzymaktivität bei 0 min wurde zu 100% normalisiert.A sample of TrX-162H-DS1 in 40% glycerol and buffer was incubated in a covered circulating water bath (Haake type F4391, with a variation of 0.1 ° C) at 90 ° C. The temperature of the Water bath was confirmed with a thermocouple. Aliquots were removed at 0, 5, 10, and 30 min for determination of residual activity. The residual enzyme activity at 0 min was normalized to 100%.
Nach 5, 10 und 30 min behielt TrX-162H-DS1 90, 85 bzw. 65% der restlichen Aktivität bei (
Beispiel 4: Temperatur-/Aktivitätsprofil von mutierten XylanasenExample 4: Temperature / activity profile of mutant xylanases
Dies war ein Test hinsichtlich der Auswirkung von unterschiedlichen Temperaturen auf die enzymatische Aktivität der Xylanase bei der Hydrolyse von löslichem Xylan, Die Vorgehensweise war identisch zu dem Standardassay (Beispiel 2 C) mit Veränderungen bei der Inkubationstemperatur und -dauer. Die Enzyme (1,5 μg/ml) und lösliche Xylanase in 50 mM Natriumcitrat-Puffer, pH 4,5, wurden gemischt und in einem zirkulierenden Wasserbad bei unterschiedlichen Temperaturen inkubiert. Nach 30 min wurde die Menge von reduzierenden Zuckern, die aus Xylan freigesetzt worden waren, durch HBAH bestimmt und wurde als relative Aktivität mit dem Wert beim Temperaturoptimum als 100% berechnet.This was a test for the effect of different temperatures on the enzymatic activity of xylanase in the hydrolysis of soluble xylan. The procedure was identical to the standard assay (Example 2C) with changes in incubation temperature and time. The enzymes (1.5 μg / ml) and soluble xylanase in 50 mM sodium citrate buffer, pH 4.5, were mixed and incubated in a circulating water bath at different temperatures. After 30 minutes, the amount of reducing sugars released from xylan was determined by HBAH and was calculated as relative activity with the value at the temperature optimum as 100%.
Die Auswirkung von Temperatur auf die Hydrolyse von Xylan wurde in
Beispiel 5: pH-/Aktivitätsprofil von mutierten XylanasenExample 5: pH / activity profile of mutant xylanases
Dies war ein Test hinsichtlich der Auswirkung von unterschiedlichen pH-Werten auf die enzymatische Aktivität der Xylanase bei der Hydrolyse von löslichem Xylan bei der ungefähren physiologischen Temperatur von Nahrungsbrei.This was a test for the effect of varying pH on the enzymatic activity of xylanase in the hydrolysis of soluble xylan at the approximate physiological temperature of porridge.
Die Vorgehensweise war identisch zu dem Standardassay (Beispiel 2 C) mit Veränderungen bei der Inkubationstemperatur und -dauer. Die Trichoderma-Enzyme natürliche TrX und mutierte TrX (30 μg/ml) und lösliches Xylan in 50 mM Natriumcitrat-Puffern mit pH 3–8 wurden zusammen bei 40°C 7 min inkubiert. Die Menge an reduzierenden Zuckern, die aus dem Xylan freigesetzt wurden, wurde durch HBAH bestimmt und wurde als relative Aktivität mit dem Wert beim pH-Optimum als 100% berechnet.The procedure was identical to the standard assay (Example 2C) with changes in incubation temperature and time. The Trichoderma enzymes natural TrX and mutant TrX (30 μg / ml) and soluble xylan in 50 mM pH 3-8 sodium citrate buffers were incubated together at 40 ° C for 7 min. The amount of reducing sugars released from the xylan was determined by HBAH and was calculated as relative activity with the value at pH optimum as 100%.
Das Profil der Auswirkung des pH auf die enzymatische Aktivität von TrX, TrX-162H-DS1 und TrX-162H-DS2 (
Die doppelte Disulfid-Mutante TrX-162H-DS4 unterschied sich, indem sie bei dem pH-Bereich über 6 eine geringfügig höhere Aktivität zeigte. Bei dem sauren pH von 4–6 bewahrten TrX, TrX-162H-DS1, TrX-162H-DS2 und TrX-162H-DS4 wenigstens 75% der optimalen Aktivität.The double disulfide mutant TrX-162H-DS4 differed by exhibiting slightly higher activity at the pH range above 6. At the acidic pH of 4-6, TrX, TrX-162H-DS1, TrX-162H-DS2 and TrX-162H-DS4 retained at least 75% of the optimal activity.
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