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Bereich der
Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein neues Protein des Cytoskeletts,
Myotilin, das Ig-ähnliche
Domänen
homolog zu dem riesigen sarkomeren Strukturprotein Titin enthält. Myotilin
wird in Skelett- und Herzmuskeln exprimiert, es liegt zusammen mit α-Actinin
innerhalb der sarkomeren I-Banden und tritt direkt mit α-Actinin
in Wechselwirkung. Expression von Myotilin in Nicht-Muskelzellen
von Säugern
und in Hefe bewirkt Reorganisation von Actin in dicke F-Actin-Bündel und
verhindert das Wachstum von Hefezellen.
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Hintergrund
der Erfindung
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Unter
den zahlreichen Zelltypen in höheren
Organismen haben sich die gestreiften Muskelzellen differenziert,
um die Aufgabe der Krafterzeugung und -übertragung durchzuführen. Um
diese hoch spezialisierte Funktion zu erfüllen, exprimieren die Muskelzellen
viele Genprodukte oder mRNA-Spleißvarianten, die in anderen
Körperzellen
nicht gefunden werden. Viele der für Muskeln spezifischen Gene
codieren Cytoskelett-Proteine, durch welche eine hoch organisierte
sarkomere Architektur geschaffen wird [1, 2]. Die Hauptbestandteile von
dicken und dünnen
Filamenten, Actin und Myosin, sind an eine Reihe von Molekülen gebunden,
die den Aufbau, strukturelle Integrität und Funktion des gestreiften
Muskels regulieren. Zum Beispiel dient das riesige Protein Titin,
das sich von der M-Linie des dicken Filaments bis zur Z-Linie des
dünnen
Filaments erstreckt, als eine Feder und ein Regler des Sarkomers,
und α-Actinin,
ein Actin bindendes Protein, bewirkt eine Quervernetzung dünner Filamente
in antiparallele Bündel
in den Z-Streifen [2–8].
Die Kraft, die von Cytoskelett-Bestandteilen der kontrahierenden
Untereinheiten erzeugt wird, wird durch die Plasmamembran (Sarkolemma) auf
die extrazelluläre
Matrix über
einen verbindenden, aus zahlreichen Untereinheiten bestehenden Dystrophin-Glycoproteinkomplex übertragen
[9, 10].
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Die
Wichtigkeit der einzelnen Bestandteile der sarkomeren und Sarkolemma-Strukturen wird durch neue
Befunde hervorgehoben, welche zeigen, dass Mutationen in mehreren
verschiedenen Strukturproteinen zu muskulären Erkrankungen wie etwa Muskeldystropien
und Kardiomyopathien [9–12]
führen.
Viele der identifizierten Gene für
Muskelerkrankungen codieren Proteine des mit Dystrophin verbundenen
Sarkolemma-Komplexes, doch in neuerer Zeit gibt es Hinweise, dass
auch andere Molekültypen,
einschließlich
Regulatoren der sarkomeren Architektur, Anteil an der Pathogenese
bestimmter Krankheitsformen haben. Es wurde gezeigt, dass eine Mutation
in dem Gen für α-Tropomyosin,
TPM3, eine autosomale dominante Nemalinmyopathie (NEM1) verursacht
[13]. Das nebulin-Gen
ist ein Kandidat für
eine andere Nemalinmyopathie (NEM2) [14], und das titin-Gen ist ein Kandidat
für autosomale
dominante Dystrophie der Tibiamuskulatur [15].
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Trotz
der Fortschritte der letzten Zeit gibt es mehrere klinisch unterscheidbare
Formen muskulärer Dystrophie
mit nicht definierten Krankheitsgenen. Zwei Formen der muskulären Dystrophie,
eine dominante Form der Gliedergürtelmuskeldystrophie
(LGMD1A) und eine dominante Form distaler Myopathie mit Stimmband-
und Kehlkopfschwäche
(VCPMD) sind auf einer überlappenden
Stelle in 5q31 kartiert worden [16, 17].
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Zahlreiche
Studien haben gezeigt, dass das Actin-Cytoskelett in transformierten
Zellen wesentlich verändert
ist [Überblick
in 18, 19 und 20]. In Zellen unterliegen Actin-Moleküle dynamischer
Reorganisation, d.h. Polymerbildung aus Actin-Monomeren und Zerstörung oder Veränderung
von bestehenden Polymeren. Diese Vorgänge werden durch eine Reihe
von Actin bindenden Proteinen mit unterschiedlichen Aktivitäten kontrolliert.
Die komplexe, dynamische Regulierung von Filamenten des Cytoskeletts
ist von der Expression und Aktivität verschiedener Bestandteile
innerhalb der Zellen abhängig.
Interessanterweise kommt in den meisten Zelltypen eine große Actin-Fraktion
als Monomere vor, während
in Muskelzellen mehr als 99% des Actins in Filamenten vorliegt.
Dies legt nahe, dass Muskelzellen Protein(e) exprimieren, von denen
einige unbekannt sein mögen,
deren Funktion darin besteht, das Gleichgewicht der Actin-Moleküle in einem
polymerisierten Status zu halten. Unter Beachtung der wichtigen
Rolle des Actin-Cytoskeletts
für Funktionen,
die mit abnormem Zellwachstum und den Veränderungen bei der Actin-Organisation
in transformierten Zellen zusammenhängen, stellen Faktoren, die
die Actin-Organisation regulieren, attraktive Ziele für eine Krebs-Chemotherapie
dar. Eine solche Idee ist kürzlich
durch experimentelle Daten unterstützt worden, welche darauf hinwiesen,
dass zwei neue, Actin stabilisierende Bestandteile, Jasplakinolid
und Chondramide, das Wachstum transformierter Zellen hemmen [20,
21, 31].
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Wir
beschreiben hier die cDNA-Sequenz und Struktur des myotilin-Gens,
das einen neuen Bestandteil des Cytoskeletts der gestreiften und
der Herzmuskulatur codiert. Das Myotilin-Protein umfasst zwei Ig-ähnliche Domänen des
C2-Typs mit beachtlicher Homologie zu bestimmten Ig-Domänen von
Titin. Myotilin kommt sowohl im Sarkomer, wo es innerhalb der I-Banden
liegt und an ein α-Actinin
gebunden ist, als auch entlang der Sarkolemma-Membran vor. Das myotilin-Gen
liegt in Chromosom 5q31 innerhalb einer 2 Mb-Region, welche das
Gen für
die LGMD1A-Erkrankung
umfasst [16], und ist damit ein Kandidat für LGMD1A. Transfizierung von Myotilin
in Säugerzellen
und Hefezellen induziert die Bildung von dicken Actinbündeln und
reduziert das Wachstum von Hefezellen, wodurch angezeigt wird, dass
Myotilin eine Rolle bei der Organisation des Actin enthaltenden
Cytoskeletts spielt.
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Die
Bezeichnung „Myotilin" stammt von myofibrillärem Protein
mit Titin-änlichen
(engl.: Titin-like) Ig-Domänen.
Es sollte beachtet werden, dass die Bezeichnung „Myofilin", welche früher verwendet wurde, aufgrund
der Tatsache geändert
wurde, dass ein Muskel-spezifisches Gen von Echinococcus granulosus
zuvor „Myophilin" genannt worden war
[22]. Obwohl die Begriffe unterschiedlich buchstabiert werden, verursacht eine ähnliche
Aussprache die Möglichkeit
zur Verwirrung, und deshalb wurde die Bezeichnung „Myofilin" in „Myotilin" geändert.
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Expression
von Myotilin in Säugerzellen
und Hefe bewirkt Reorganisation von Actin in dicke Filamente. Die
Expression von Myotilin oder seinem C-terminalen Fragment (Aminosäuren 215–498) verändert die
Morphologie von Hefe und reduziert die Wachstumsrate. Die Actin
organisierenden und Wachstum hemmenden Eigenschaften legen nahe,
dass Myotilin oder seine Fragmente für die Entwicklung von Substanzen
verwendet werden können,
welche Zellwachstum unter verschiedenen pathologischen Bedingungen
kontrollieren können,
einschließlich
der Behandlung von Krebserkrankungen oder mikrobiellen Infektionen.
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Beschreibung
der Abbildungen
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1A. Abgeleitete
Aminosäuresequenz
von Myotilin.
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Das
abgeleitete, aus 498 Resten bestehende Myotilin-Polypeptid wird
dargestellt. Diese Sequenz ist ebenso im angehängten Sequenzprotokoll als
SEQ ID NO:2 angegeben. Die Ig-ähnliche
Domänen
enthaltenden Regionen sind umrandet. Die gestrichelte Linie kennzeichnet
das aus 17 Resten bestehende Peptid, das für die Herstellung von Kaninchen-Antiserum
verwendet wurde. Die Nucleotidsequenz der cDNA für Myotilin ist in der Gene
Bank-Datenbank hinterlegt worden (Zugangnummer AF144477). Die Nucleotidsequenz
wird als SEQ ID NO:1 angegeben.
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1B. Schematische
Struktur von Myotilin.
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Das
schematische Diagramm der Proteinstruktur zeigt die Serin-reiche
Region (grauer Kasten), die einen hydrophoben Abschnitt enthält (schwarzer
Kasten), und die beiden Ig-Domänen
(Schleifen). Die annähernden
Positionen verschiedener Regionen werden nachstehend angegeben.
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1C. Vergleich
der Myotilin-Sequenz mit Titin.
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Zwei
gepaarte Ig-Domänen
und flankierende Regionen von Myotilin und Titin des Menschen (Ig-Domänen 7 und
8) wurden unter Verwendung des Clustal-W-Verfahrens gegeneinander ausgerichtet.
Reste, die zu den Ig-ähnlichen
Domänen
gehören,
sind umrandet. Schwarze Kästen
kennzeichnen konservierte Reste, und graue Kästen kennzeichnen konservative
Substitutionen. Die Gene Bank-Zugangsnummer
für Titin
ist I38344.
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2. Organisation
des myotilin-Gens
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Exons
(vertikale schwarze Kästen),
mit römischen
Ziffern nummeriert, und Introns werden im gleichen Maßstab dargestellt.
Die Position des Startsignals für
die Translation in Exon II und das Translations-Stopp-Codon in Exon
X sind gekennzeichnet. Die Größen der
Introns sind in kB angegeben.
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3. Integrierte
Karte von Chromosom 5 in der Region des Myotilin-Gens.
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Abstände zwischen
den Markierungen beruhen auf kombinierten Informationen aus genetischer
und physikalischer Kartierung (http://www.genome.wi.mit.edu/). Das
Myotilin-Gen liegt auf Chromosom 5q31, 141 cM vom Anfang der Chromosom
5-Kopplungsgruppe
[24], und wird innerhalb der 2 Mb großen kritischen Region für Gliedergürtelmuskeldystophie
(LGMD1A) kartiert, wodurch es durch seine Position ein Gen-Kandidat für die Krankheit
ist. IL9 ist das Gen für
Interleukin-9. Die Ausrichtung des Chromosoms ist angegeben (Zentromer
auf der linken Seite).
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4. Northern-Blot-Analyse
von Myotilin.
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Auf
einen kommerziellen Filter mit RNA aus zahlreichen Geweben wurde
ein mit 32P markiertes, 320 Bp großes Fragment
der cDNA von Myotilin als Sonde gegeben. Der Filter wurde über 20 h
exponiert. Die Sonde hybridisierte stark mit Skelettmuskel-RNA und schwach mit
Herzmuskel-RNA, während
die anderen angegebenen Gewebe negativ waren. Die rechte Linie zeigt
eine Exposition von Skelettmuskel-RNA über
6 h, um zwei unterschiedliche Transkriptionsgrößen darzustellen (2,2 und 2,5
Kb).
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5A. In
vitro-Translation von Myotilin.
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Die
cDNA von Myotilin wurde unter Verwendung eines gekoppelten Retikulocyten-Lyase-Kits in vitro translatiert.
Eine Proteinbande mit 57 kDa, die das Protein in voller Größe darstellt,
wird nachgewiesen. Die kleinere Bande mit 45 kDa aus der Translation
der cDNA mit vollständiger
Länge geht
offensichtlich auf einen falschen Translations-Startpunkt in der
Sequenz zurück.
Myotilin215-498 ist eine Deletionskonstruktion,
die in Zwei-Hybrid-Experimenten verwendet worden ist. MG = Molekulargewichtsmarkierungen.
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5B. Western-Blot-Analyse
von Myotilin.
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Lysate
der angegebenen Gewebe wurden für
Immunblots mit affinitätsgereinigtem
Myotilin-Antikörper verwendet.
Der Western-Blot des Skelettmuskels vom Menschen ergab eine kräftige Bande
mit 57 kDa und eine schwächere
Bande mit 110 kDa (Pfeile), die Nicht-Muskelgewebe hingegen zeigten
keine Reaktivität.
Präabsorption
des Myotilin-Antikörpers
mit fünffach
molarem Überschuss
an antigenem Peptid führt
zum Verlust der Immunreaktivität
des Skelettmuskel-Lysats (rechte Linie).
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6. Immunlokalisierung
von Myotilin in gereinigten Myofibrillen.
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Myofibrillen-Bündel vom
Rind wurden isoliert, wie im Abschnitt Materialen und Verfahren
beschrieben, und mit Antikörpern
gegen Myotilin, α-Actinin,
Actin, Titin und präimmunem
IgG vom Kaninchen angefärbt.
Alle analysierten Proteine liegen auf I-Banden in Sarkomeren, aber
die Anfärbmuster
unterscheiden sich. Myotilin und α-Actinin
färben
die Mitte der I-Banden, während
die Actin-Färbung
mehr diffus ist. Titin wird als Doppel-Farbbande der Verbindungen
von A- und I-Banden nachgewiesen. Das Phasenkontrastbild zeigt die
sarkomere Struktur, wobei die hellen Banden dünne Filamente (I-Banden) und
die dunklen Banden dicke Filamente (A-Banden) sind. Balken = 5 μm.
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7A bis 7D.
Immunhistochemische Anfärbung
von Myotilin in tiefgefrorenen Schnitten von Skelettmuskeln des
Menschen.
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Tiefgefrorene
Schnitte des Skelettmuskels wurden durch Immunperoxidase-Technik
unter Verwendung eines affinitätsgereinigten
Myotilin-Antikörpers
(A–C)
oder eines Kontroll-Antiserums (D) analysiert. Myotilin-Anfärbung wird
in den I-Banden von Sarkomeren (A) und in Querschnitten wie auch
entlang des Sarkolemmas von Muskelfasern (B) nachgewiesen. Positive
Reaktivität
wird auch in den muskulären
Nerven nachgewiesen (C). (D) Eine Kontroll-Anfärbung mit Präimmun-Serum.
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8A bis 8E.
Homotypische Wechselwirkung von Myotilin und Verbindung mit α-Actinin.
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- (A) Struktur der Domänen von α-Actinin und Myotilin und der
Konstruktionen, die in Hefe Zwei-Hybrid- und in vitro-Bindungsuntersuchungen
verwendet wurden. ABD = Actin-Bindungsdomäne, R = Spectrin-ähnliche Wiederholungssequenz,
EF = EF-seitige-Region.
Der graue Kasten innerhalb des Myotilins kennzeichnet die Serinreiche
Region, und die Schleifen kennzeichnen Ig-ähnliche Domänen.
- (B) Eine Fotomikrografie der Zwei-Hybrid-Wechselwirkungen bei
Hefe. Auf der linken Seite liegen die exprimierten Köder-Fusionsproteine
und oben liegen die Beute-Fusionsproteine.
EG202 = leerer Köder-Vektor
und JG4-5 = Beute-Vektor. Die Farbreaktion ist ein Indikator für eine Wechselwirkung.
- (C) Quantifizierung der Werte für β-Galactosid. Die Köder- und
Beute-Fusionsproteine
sind wie in B. Die Werte für β-Galaktosidase
sind in folgende Kategorien unterteilt: – = < 20; + = 21–150; ++ = 151–300; +++ =
301–450.
- (D) Affinitätsniederschlag-Analyse
der Wechselwirkung Myotilin – α-Actinin.
Die NH2-terminalen
und COOH-terminalen Abschnitte von α-Actinin wurden als GST-Fusionsproteine exprimiert,
gereinigt und an Glutathion-Agaroseperlen gebunden. Man ließ Myotilin,
das mit 32S markiert und in vitro translatiert
worden war, an GST-α-Actinin-Fusionsprotein
enthaltende Perlen binden. Das gebundene Material wurde in dem SDS-PAGE-Verfahren
getrennt und eine Autoradiographie wurde durchgeführt. Myotilin
bindet die R3/R4/EF-Konstruktion, die ABD/R1/R2 und die GST-Kontrolle
sind dagegen nicht bindend.
- (E) In der Bindungsuntersuchung verwendete, mit Coomassie gefärbte SDS-PAGE,
die die Konstruktionen zeigt.
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9A bis 9F.
Wirkung von Myotilin bei der Organisation von Actin enthaltendem
Cytoskelett in COS-Zellen.
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Auf
der linken Seite COS-Zellen, die vorübergehend mit cDNA von Myotilin
transfiziert worden sind (mt 1–498);
in der Mitte Zellen, die mit einer COOH- terminalen Konstruktion, Myotilin215–498 (mt
215–498),
transfiziert worden sind; auf der rechten Seite eine cDNA für β-Galactosidase
(β-Gal)
als Transfektionskontrolle. (A–B)
zeigen Anfärbung
von Myotilin, (C) zeigt Anfärbung
von β-Galactosidase.
(D–F)
ist eine doppelte Anfärbung
der selben Zellen für
F-Actin. Man beachte die dicken, F-Actin und Myotilin enthaltenden Bündel in
(A) und (D). Myotilin215–498 tritt mit F-Actin
zusammen auf, aber die Organisation von Actin unterscheidet sich
nicht von der in den Kontrollzellen. Die β-Galactosidase-Kontrolle zeigt
keine spezifische Lage. Balken = 20 μm.
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10. Konfokalanalyse
von COS-Zellen, die Myotilin exprimieren.
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COS-Zellen,
die mit cDNA von Myotilin transfiziert worden waren, wurden fixiert,
auf F-Actin (ph) und Myotilin (my) doppelt angefärbt und mit einem Konfokalmikroskop
analysiert. Die Abbildungen oben rechts und in der Mitte rechts
sind Zusammensetzungen aus den entsprechenden Phalloidin- (rot)
und Myotilin- (grün)
Anfärbungen.
Gebiete mit überlappender
Verteilung erscheinen gelb. Man beachte die dicken, cytoplasmatischen,
F-Actin und Myotilin enthaltenden Strukturen in der oberen Reihe
und die submembranösen
Rindenstrukturen in der mittleren Reihe. In der unteren Reihe werden
zusammengesetzte Abbildungen von Phalloidin- (rot) und Myotilin-
(grün)
Anfärbungen
von einer transfizierten Zelle gezeigt, die, 2 μm (links) und 6 μm (Mitte) über dem
Nährsubstrat
dargestellt, eine zufällige
Anordnung der F-Actin
und Myotilin enthaltenden Strukturen aufweisen. Rechts unten wird
eine Überlagerung
von Myotilin-Anfärbung
in Sektionen mit 1 μm
Abstand durch die gesamte Zelle dargestellt. Die Farbcodierung zeigt
den Abstand vom Substrat (μm)
an. Man beachte die fehlende Anfärbung
an der ventralen Oberfläche
der Zelle. Balken = 10 μm.
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11A bis 11F. Die Wirkung von Myotilin auf Cytoskelett
und Wachstum von Hefezellen.
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Hefezellen,
die Myotilin exprimieren (A und B), und Kontrollzellen (C und D)
wurden mit Rhodamin-Phalloidin angefärbt, um F-Actin sichtbar zu
machen (A und C), oder mit Calcofluor, um Kohlenhydrate der Zellwand
anzufärben
(B und D). Man beachte, dass die Myotilin exprimierenden Zellen
länger
sind, in Reihen wachsen und mit dicken Actin-Bündeln verbunden sind, was ein
fehlerhaftes Zelltrennungsereignis nahelegt. E. Wachstumsrate von
Zellen, die verschiedene Myotilin-Fragmente exprimieren. Die Ziffern
kennzeichnen Aminosäuren
des Myotilin, die in die Konstruktionen eingeschlossen sind. Myotilin
in voller Länge
und Myotilin215–498 reduzieren das Zellwachstum.
JG4-5 = ein leerer Vektor. F. Wachstumsrate von Zellen, die Myotilin
und/oder Kontrollproteine in zwei verschiedenen Expressionsvektoren
exprimieren. Die stärkste,
das Wachstum hemmende Wirkung wird in beiden Vektoren durch Expression
von Myotilin oder seines COOH-terminalen Fragmentes verursacht.
Die Wachstumsrate von Zellen, die Ezrin, ein Actin organisierendes
Kontrollprotein, exprimieren, unterscheidet sich nicht vom Wachstum
der Zellen, die mit leeren Vektoren transfiziert worden sind. α-Actinin
= Spectrin-ähnliche
Wiederholungssequenzen von α-Actinin
aus dem Muskelmagen des Huhns, EG202 und JG4-5 = leere Vektoren.
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Genaue Beschreibung der
Erfindung
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Charakterisierung der
myotilin-cDNA
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Eine
teilweise cDNA, der Myotilin codiert, wurde zuerst entdeckt, beruhend
auf einer Zwei-Hybrid-Durchmusterung von Hefe auf neue Bestandteile
des Cytoskeletts. Mit der Verwendung dieser Sequenz als Sonde clonierten
wir eine 2244 Bp große
cDNA aus einer Skelettmuskel-Bibliothek des Menschen. Die cDNA enthält einen
1494 bp großen
offenen Leserahmen (Nucleotide 281 bis 1774), der ein Polypeptid
mit 498 Aminosäuren
codiert (SEQ ID NO:2), welches wir Myotilin genannt haben (1A).
Das Methionin-Startcodon weist eine teilweise Übereinstimmung mit der Kozak-Konsensussequenz
auf. Die NH2-terminale Sequenz ist besonders
reich an Serin-Resten,
die oft paarweise angeordnet sind, und enthält einen aus 23 Aminosäuren bestehenden
hydrophoben Abschnitt (Reste 57–79).
Nach Datenbankrecherchen ist die NH2-terminate
Sequenz einzigartig und enthält
keine bekannten Strukturdomänen.
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Vom
COOH-Terminus des Proteins wurde vorhergesagt, dass es zwei Ig-ähnliche
Domänen
mit konservativen Schlüssel-Resten
bildet (1B) [23]. Kürzlich ist gezeigt worden,
dass mehrere Cytoskelettproteine, die an der Organisation des Muskelsarkomers
beteiligt sind, solche strukturellen Einheiten enthalten. Durch
Vergleich der Sequenzen ist die höchste Homologie zwischen Myotilin
und der Region von Titin aus der gestreiften Muskulatur des Menschen
nachgewiesen worden, welches die mit der Z-Scheibe verbundenen Ig-Domänen 7 und
8 enthält
(1C) Reste 1406–1621 von Titin) [4]. Die Sequenzen
innerhalb der verglichenen Regionen sind zu 31% identisch und zu
53% konserviert ohne irgendwelche zwischengeschobenen Lücken. Ein Ähnlichkeitsvergleich
unter Verwendung des Clustal-Verfahrens zeigt 38,3% Ähnlichkeit
zwischen dieser Region von Myotilin und Titin. Die Ähnlichkeit
der Sequenzen zwischen Myotilin und Titin ist auf die Ig-Domänen von
Myotilin begrenzt. Andere charakteristische strukturelle Eigenschaften
von Titin, die Domänen
des fn(III)-Typs, die spezifischen Sequenzen der Z-Scheibe, I-Bande
und M-Bande oder das sich wiederholende KSP-Phosphorylierungsmotiv
[4] kommen in Myotilin nicht vor. Die Seugenzvorhersage für Myotilin ergibt
mehrere andere mögliche
Stellen für
die Phosphorylierung, drei davon liegen in der Serinreichen Region.
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Organisation des myotilin-Gens
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Die
Organisation des Myotilin-Gens wurde durch Vergleichen der cDNA
von Myotilin mit der genomischen Sequenz des Pac-Clons 9c13 von
Chromosom 5 (Genbank-Zugangsnummer
AC006084) bestimmt. Alle Spleiß-Verbindungssequenzen
befinden sich in Übereinstimmung
mit dem GT-AG-Konsensussequenz (Tabelle 1). Die Exon/Intron-Grenzen
wurden darüber
hinaus durch Amplifizierung jedes einzelnen Exons eines kommerziellen
P1-Clons mit für
Introns spezifischen Primern bestätigt (nicht dargestellt). Das
Gen ist aus zehn Exons zusammengesetzt, und das Initiationssignal
für die
Translation liegt in Exon II (2). Daher
wird das kleine erste Exon mit 69 bp nicht translatiert. Die Größe des gesamten
Gens liegt unter 20.000 bp ohne die Promotor-Region. Die Sequenzen,
die die Ig-Domänen
codieren, liegen in den Exons VI und VII (erste Ig-Domäne) und
in Exons VIII und IX (zweite Ig-Domäne).
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Chromosomale
Lage von myotilin
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Die
chromosomale Lage des myotilin-Gens wurde durch Radiationhybridkartierung
bestimmt. Das myotilin-Gen wurde auf Chromosom 5q31 zwischen den
Markern AFM350yb1 und D5S500 kartiert (3). Das Gen,
das eine autosomale, dominant vererbte Gliedergürtelmuskeldystrophie (LGMD)
1A verursacht, ist auf Chromosom 5q31 zwischen den Markern D5S479
und D5S594 kartiert worden [16]. Das myotilin-Gen befindet sich innerhalb dieses angegebenen
Bereichs. Werden all diese Daten zusammengenommen, ist myotilin
ein Gen-Kandidat für
LGMD1A.
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Expressionsmuster
von myotilin
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Durch
eine Northern-Blot-Analyse entdeckten wir zwei verschiedene Transkripte
(2,2 und 2,5 kB), die im Skelettmuskel stark und im Herzen schwach
exprimiert werden (4). Die beiden Transkripte werden
im Herzen nur nach einer verlängerten
Exposition festgestellt (nicht dargestellt). Glatte Muskulatur und
zahlreiche nicht-muskuläre Gewebe,
einschließlich
Gehirn, Plazenta, Lunge, Leber, Niere und Bauchspeicheldrüse, enthielten
keine nachweisbare mRNA. In vitro-Translation der cDNA in voller
Länge ergab
ein 57 kDa großes
Polypeptid, was sich mit der Masse von Myotilin, die aus der cDNA-Sequenz
abgeschätzt
wurde, in Übereinstimmung
befindet (5A).
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Wir
erstellten einen Antikörper
gegen Myotilin, indem wir Kaninchen mit einem synthetischen, verzweigten
Peptid aus 17 Aminosäuren,
welches die Reste 352–368
umfasste (vgl. 1A), immunisierten. In der Western-Blot-Analyse
zeigte dieser Antikörper
eine Proteinbande bei 57 kDa und eine schwächere Bande nahe 110 kDa bei
Skelettmuskulatur, nicht aber bei glatter Muskulatur oder nicht-muskulären Geweben (5B).
Die Reaktivität
konnte blockiert werden, indem der Antikörper mit fünffach molarem Überschuss
an entsprechendem Peptid inkubiert wurde (5B). Sowohl
die mRNA als auch die Daten aus dem Immunblot weisen daher darauf
hin, dass Myotilin ein muskuläres
Protein mit einem klar begrenzten Expressionsmuster ist. Die Identität der Bande
mit 110 kDa ist unklar. Da sie in einer Region von zweifacher Größe eines
Myotilin-Monomers wandert und da Myotilin in der Lage ist, intermolekulare
Wechselwirkungen auszubilden (vgl. nachstehend), repräsentiert
die Bande möglicherweise
ein Myotilin-Dimer. Bei Behandlung von Geweben mit 1% Triton X-100
oder mit 1 M KCl wurde Myotilin in der unlöslichen Fraktion zurückgehalten,
was eine Verbindung mit dem Zytoskelett nahelegt (Daten nicht dargestellt).
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Subzelluläre Lage
von Myotilin im Skelettmuskel
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Um
die subzelluläre
Lage von Myotilin zu charakterisieren, isolierten wir Bündel von
Myofibrillen der gestreiften Muskulatur und färbten sie unter Verwendung
von affinitätsgereinigtem
Peptid-Antiserum an. Das Immunfärbungsmuster
wurde mit mehreren charakterisierten Bestandteilen des Sarkomers
verglichen (6). Myotilin-Anfärbung wurde
in den I-Banden nachgewiesen. Das Färbungsmuster erinnerte an α-Actinin,
von dem bekannt ist, dass es in den Z-Streifen der I-Banden vorkommt.
Actin, der Hauptbestandteil der dünnen Filamente, ergab ein diffuseres
Färbungsmuster
entlang der gesamten I-Banden. Ein Titin-mAk, der ein Epitop auf
Verbindungen von dünnen
und dicken Filamenten erkennt, ergab ein Färbungsmuster einer Doppelbande
auf jedem Sarkomer. Die Daten der Immunlokalisierung zeigen, dass
Myotilin ein integraler Bestandteil der Sarkomere im gestreiften
Muskel ist.
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Um
die Lage von Myotilin im gestreiften Muskel darüber hinaus zu untersuchen,
führten
wir immunhistochemische Analysen an tiefgefrorenen Gewebeschnitten
mit dem Myotilin-Antikörper
durch. In senkrechten Schnitten, bei denen die Organisation von
Sarkomeren sichtbar war, konnten wir eine periodische, kreuzgestreifte
Anfärbung
von Myotilin nachweisen (7A), die
mit dem Muster in isolierten Myofibrillen übereinstimmte. Besonders in
Querschnitten (7B) lag die Anfärbung von
Myotilin an der Plasmamembran, was anzeigt, dass Myotilin auch am
Sarkolemma vorkommt. Zusätzlich
zu diesen Befunden färbte
der Myotilin-Antikörper
intramuskuläre
Nervenfasern an (7C). Das Präimmun-Serum ergab keine Reaktivität (7D).
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Myotilin bildet intermolekulare
Wechselwirkungen aus und bindet in vitro α-Actinin direkt
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Wir
verwendeten das Zwei-Hybrid-Verfahren bei Hefe, um Protein-Wechselwirkungen
von Myotilin zu untersuchen. Unter den untersuchten Partnern wurden
die stärksten
Wechselwirkungen zwischen Myotilin und α-Actinin (einer Konstruktion,
die Spectrin-ähnliche
Wiederholungssequenzen R1-R4 enthält) und zwischen Myotilin-Molekülen beobachtet
(8A–C).
Es ist bekannt, dass α-Actinin über Spectrin-ähnliche
Wiederholungssequenzen Dimere bildet [25, 26], und dies konnte auch
in unserer Zwei-Hybrid-Analyse bestätigt werden (8B).
Jedoch zeigte die Quantifizierung der Werte für β-Galactosidase, dass die Intensität der Reaktion schwächer als
die Wechselwirkung zwischen α-Actinin
und Myotilin und zwischen zwei Myotilin-Molekülen war (8C).
Eine NH2 terminate Deletionskonstruktion,
die die Ig-Domänen,
Myotilin215–498,
enthielt, band Myotilin in voller Länge, α-Actinin (R1–R4) wurde jedoch nicht gebunden.
Wir waren nicht in der Lage, Myotilin215–498 als einen
Köder zu
exprimieren, um zu testen, ob die intermolekulare Wechselwirkung
von Myotilin durch die die COOH-terminale Ig-Domäne
enthaltende Region oder durch NH2-terminale
Bindung an den COOH-terminalen Abschnitt
vermittelt wird. Die Wechselwirkung zwischen Myotilin und α-Actinin wurde darüber hinaus
durch einen Affinitäts-Niederschlagstest
untersucht, indem in vitro translatierte, mit 32S
markierte Myotilin- und GST-α-Actinin-Konstruktionen, gebunden
an Glutathion-Agarose, verwendet wurden. Myotilin band die COOH-terminale
Hälfte
von α-Actinin
(R3/R4/EF-Seite), nicht aber die NH2-terminale Hälfte (ABD/R1/R2)
oder GST allein (8D–C). Basierend auf den Ergebnissen
der Zwei-Hybrid- und Affinitäts-Niederschlagsverfahren
liegen die Reste, die für
Bindung von α-Actinin
wichtig sind, innerhalb der ersten 215 NH2-terminalen Reste von
Myotilin, und die Myotilin-Bindungsstelle in α-Actinin liegt offensichtlich
innerhalb der Spectrin-ähnlichen Wiederholungssequenzen
3 und 4.
-
Wirkung von transfiziertem
Myotilin auf Actin-Cytoskelett und Zellwachstum
-
Die
zelluläre
Lage und Funktion von Myotilin wurde darüber hinaus analysiert, indem
mit einem HA-Epitop gekennzeichnetes Myotilin in voller Länge und
eine COOH-terminale
Myotilin-Konstruktion (Myotilin215–498)
vorübergehend
in COS-1-Zellen, die kein endogenes Protein exprimieren, transfiziert
wurden. Durch in vitro-Translation wurde bestätigt, dass die Konstruktion
des Myotilin215–498 ein Polypeptid in
der richtigen Größe ergab
(5A). DNA von β-Galactosidase
wurde als eine Transfektionskontrolle verwendet. Nach 72 Stunden
wurden die Zellen fixiert und auf Myotilin oder β-Galactosidase und Actin doppelt
angefärbt. Myotilin215–498 zeigte
zum Teil ein diffuses cytoplasmatisches Färbungsmuster, aber auch submembranöse Akkumulation,
deren Lage mit kortikalem Actin zusammenfiel, das durch Anfärbung mit
Phalloidin sichtbar gemacht worden war (9B, E).
Im Kontrast dazu lag Myotilin in voller Länge innerhalb des Filament-Netzwerkes
des Zellkörpers,
und Anfärbung
mit Phalloidin ergab eine mit F-Actin streng übereinstimmende Lage in diesen
Filamenten. Bemerkenswert ist, dass wir die Bildung von dicken,
F-Actin enthaltenden Bündeln
in COS-1-Zellen beobachten konnten (9A, D),
deren Actin enthaltendes Skelett unter diesen Kulturbedingungen
kaum organisiert ist. β-Galactosidase wies
eine diffuse cytoplasmatische Verteilung auf und lag nicht mit F-Actin zusammen (9C,
F).
-
Die
durch Myotilin induzierten Actin enthaltenden Strukturen wurden
darüber
hinaus durch Konfokalmikroskopie charakterisiert (10).
Typischerweise kamen die Actin-Bündel
im Zellkörper
vor, obgleich sie in einigen Zellen subkortikal in der Zellperipherie
gefunden wurden (10, mittlere Reihe). Teilung
der Zellen zeigten, dass die F-Actin und Myotilin enthaltenden Strukturen
oft zufällig
in unterschiedlichen Schichten im Cytoplasma angeordnet waren. Dies
wird in der unteren Reihe von 10 sichtbar
gemacht, in welcher Abbildungen der linken Seite und aus der Mitte
Zusammensetzungen der F-Actin- und Myotilin-Anfärbung aus zwei unterschiedlichen
Schichten der selben Zellen sind, und die Abbildung auf der rechten
Seite ist eine Überlagerung
der Myotilin-Markierung in der gesamten Zelle. Wichtig ist, dass
die Strukturen auf der ventralen Oberfläche der transfizierten Zellen
nicht vorkamen, was anzeigt, dass es keine Stress-Fasern sind. Die
Wirkung von Myotilin auf die Actin-Organisation erinnert nicht an
Veränderungen,
die durch Überexpression
der zuvor charakterisierten Actin organisierenden Proteine induziert
wurden und legt einen einzigartigen Aktionsmechanismus nahe.
-
Wirkung von
Myotilin auf Zell-Actin und Zellwachstum von Hefe
-
Die
biologischen Funktionen von Myotilin wurden auch untersucht, indem
Myotilin in Saccharomyces cerevisiae exprimiert wurde. Die Induktion
der Myotilin-Expression führte
zur Reorganisation von Actin in dicke Filamente, die in Kontrollzellen
nicht entdeckt wurden. (11A und
C). Die Myotilin exprimierenden Zellen wuchsen in Reihen, und die
Filamente setzten sich von einer Zelle zur nächsten fort (11A). Diese Ergebnisse zeigen an, dass die Actin
organisierende Eigenschaft von Myotilin in unterschiedlichen Organismen
erhalten bleibt. Expression von Myotilin oder seines COOH-terminalen
Abschnittes führte
zur Hemmung des Zellwachstums, wohingegen Expression von NH2-terminalen Konstruktionen (1–150 und
1–250)
oder von einer kürzeren
COOH-terminalen Konstruktion (270–472) keine vergleichbare Wirkung
hatte (11E). Diese Wachstum hemmende
Funktion ging mit morphogenen Änderungen
der Hefezellen einher. Wenn Myotilin gleichzeitig mit zwei unterschiedlichen
Expressionsvektoren exprimiert wurde, war die das Wachstum hemmende
Wirkung stärker
als die Wirkung, die durch einen einzelnen Vektor erzeugt wurde,
was darauf hinweist, dass die Wirkung vom Spiegel der Proteinexpression
abhängig
ist (11F). In diesem Experiment beeinflusste
die Expression eines irrelevanten, Actin des Cytoskeletts bindenden
Proteins, Ezrin, das Zellwachstum nicht, was wiederum die Spezifität der Wirkung
von Myotilin demonstriert.
-
Experimentelles
-
Abkürzungen
-
-
- ABD
- Actin bindende Domäne
- CH
- Calponin-Homologie
- EST
- exprimierte sequenzmarkierte
Stelle
- F-Actin
- filamentöses Actin
- fn
- Fibronectin
- Ig
- Immunglobulin
- LGMD
- Gliedergürtelmuskeldystrophie
- MBP
- Myosin bindendes Protein
- MLCK
- Kinase der leichten
Kette von Myosin
- R
- Wiederholungssequenz
-
Materialien und Verfahren
-
cDNA-Clonierung
von Myotilin und Sequenzanalyse
-
Eine
partielle cDNA wurde verwendet, um die cDNA von Myotilin in voller
Länge aus
einer Skelettmuskel-Bibliothek zu durchmustern (Stratagene, La Jolla,
CA). Positive Clone wurden mit einem ABI 310 Genetic Analyzer (Perkin-Elmer,
Foster City, CA) sequenziert. Die Durchsuchung in Proteindatenbanken
wurde mit dem BLAST-Programm
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov) durchgeführt. Alignments der Sequenzen
zwischen Ig-Domänen
von Myotilin und anderen Proteinen des Cytoskeletts wurden mit der
MegAlign-Software (DNASTAR) durchgeführt. Die Domänen-Vorhersagen
wurden vom Pfam-Server (http://genome.wustl.edu/Pfam/) erhalten.
Proteinmotiv-Vorhersagen
wurden mit dem Protein Familiy-Alignment Pfam2.1 (http://pfam.wustl.edu/)
und mit dem Programm Motif (http://www.motif.genome.ad.jp) durchgeführt.
-
Genomische
Struktur des Myotilin-Gens
-
Die
Organisation des myotilin-Gens wurde durch Vergleichen der cDNA
von Myotilin mit der genomischen Sequenz des Pac-Clons 9c13 auf
Chromosom 5 (Genbank-Zugangsnummer
AC006084) bestimmt. Ein kommerzieller P1-Clon (GenomeSystems Inc.,
St. Louis, Ml., durch PCR mit Myotilin-Primern ausgesucht) wurde
zur Amplifizierung und Sequenzierung von Exon-Intron-Grenzen verwendet.
-
Chromosomale
Lage von myotilin
-
Die
chromosomale Lage des myotilin-Gens wurde durch Radiationhybridkartierung
unter Verwendung des Genebridge II Panel bestimmt. PCR-Untersuchungen
wurden als Duplikate durchgeführt,
und der resultierende Datenvektor wurde unter Verwendung des Whitehead
Genome Center-Servers (http:/www.genome.wi.mit.edu) analysiert.
-
Herstellung
des Myotilin-Antikörpers
-
Ein
polyclonaler Antikörper
wurde in Kaninchen unter Verwendung eines synthetischen, verzweigten Myotilin-Peptids
mit Lysin-Kern aus 17 Aminosäuren
(in 1 mit einer durchbrochenen Linie
markiert) als ein Antigen erzeugt. Nach fünf Immunisierungen wurde den
Kaninchen Blut abgenommen. Der spezifische Antikörper wurde in einer Affinitätssäule unter
Verwendung eines entsprechenden Einzelketten-Peptids, das an CNBr-aktivierte
Sepharose 4B (Parmacia, Uppsala, Schweden) als ein Ligand gekoppelt
war, gereinigt. Die Spezifität
des Kaninchen-Antikörpers wurde
durch Reaktivität
mit geeigneten GST-Fusionsprotein-Konstruktionen in Western-Blot-Analysen
(Daten nicht dargestellt) und durch kreuzblockierende Experimente
bestätigt, in
denen fünffach
molarer Überschuss
des spezifischen Peptids, aber kein irrelevantes Myotilin-Peptid
(Reste 199–217)
die Reaktivität
absorbierten.
-
Studien an
mRNA und Protein
-
Eine
Northern-Blot-Analyse wurde mit einem Filter mit RNA aus zahlreichen
Geweben (Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA) unter Verwendung
eines mit 32P markierten 320 bp großen cDNA-Fragments von Myotilin,
welches die Aminosäuren
369–471
codiert, als einer Sonde durchgeführt. In vitro-Translationen wurden
mit einem gekoppelten Retikulocyten-Lysat-Kit (Promega, Madison,
WI) unter Verwendung von mit 35S markiertem
Methionin zum Nachweis durchgeführt.
Die Matrizen bestanden aus Myotilin in voller Länge und einer Konstruktion,
die die Aminosäuren
215–498
(Myotilin215–498)
im Bluescript-Plasmidvektor (Stratagene) enthielten. Für die Western-Blot-Analyse
wurden frische Gewebe in reduzierender Laemmli-Pufferlösung homogenisiert.
Gleiche Mengen an Protein, wie durch Anfärben mit Coomassie-Blau bestimmt
wurde, wurden mit 8% SDS-PAGE getrennt und auf Nitrocellulose-Filter
(Schleicher & Schuell
GmbH, Dassel, Deutschland) übertragen.
Die Filter wurden mit dem Myotilin-Antikörper oder mit einem Präimmun-Serum zur Kontrolle
abgesucht, es folgten Zugabe von Peroxidase-gebundenem anti-Kaninchen-IgG
der Ziege (Dako A/S, Kopenhagen, Dänemark) und ECL-Nachweis (Pierce,
Rockford, IL).
-
Lage von Myotilin
in Myofibrillen
-
Myofibrinbündel vom
Rind und vom Menschen wurden, wie beschrieben [27], isoliert, auf
Objektträgern
cytozentrifugiert, in –20°C kaltem
Methanol fixiert, und man ließ sie
mit mAk gegen Actin (AC 40, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO),
Titin (T11, Sigma), α-Actinin
(67CB11) [28] und einen Kontroll-mAb X63 (ATCC, Maryland, USA) oder
mit einem affinitätsgereinigten
anti-Myotilin-Antikörper
oder dem entsprechenden Präimmun-IgG
reagieren. Sekundäre
Antikörper
waren FITC-gebundenes
anti-Maus-IgG der Ziege (Cappel Research Products, Durham, NC) und
TRITC-gebundenes anti-Kaninchen F(ab)2-Fragment der Ziege (Jackson ImmunoResearch
Laboratories, Inc., West Grove, PA). Das Anfärben von Myofibrillen des Rindes
und des Menschen ergab identische Ergebnisse.
-
Immunhistochemie
-
Tiefgefrorene
2-μm-Schnitte
des menschlichen Skelettmuskels wurden auf Objektträgern aus
Glas, die mit Poly-L-Lysin überzogen
waren, immobilisiert, mit kaltem Aceton fixiert und sofort luftgetrocknet.
Für die immunhistochemische Anfärbung ließ man die
Schnitte mit einer 1:100-Verdünnung
von affinitätsgereingtem Myotilin-Ak
oder präimmun-IgG
vom Kaninchen in ähnlicher
Konzentration reagieren. Der Antikörper wurde mit Elite-Vectastain-ABC-Kit
(Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) nach den Angaben des
Herstellers nachgewiesen. Die Objektträger wurden kurz mit Hämatoxylin-Eosin
gegengefärbt.
-
Zwei-Hybrid-Analyse
der Hefe und in vitro-Bindungsuntersuchung
-
Myotilin
in voller Länge,
Myotilin215–498 und
Spectrin-ähnliche
Wiederholungssequenzen R1–R4
(Reste 267–749)
von α-Actinin
aus der glatten Muskulatur des Huhns (freundlicherweise von Dr.
D. Critchley, University of Leicester, GB, zur Verfügung gestellt)
wurden für
die Zwei-Hybrid-Analyse in EG202- und
JG4-5-Plasmide subcloniert [29]. Die COOH-terminale Konstruktion
von Myotilin wurde aus einer Teil-cDNA-Sequenz, die aus einer Durchmusterung
einer Skelettmuskel-Bibliothek erhalten wurde, subcloniert. Die
Authentizität
der Konstruktionen wurde durch Sequenzierung bestätigt. Der
Genotyp des Stammes BOY1 von S. cerevisiae, freundlicherweise von
P. Ljungdahl, Ludwig-Institut für
Krebsforschung, Stockholm, Schweden, zur Verfügung gestellt, ist MAT αhis3 trp1
Ieu2::6LexAop-LEU2 URA3::8LexAop-Gal1-LacZ. Der BOY1-Paarungstyp
a wurde unter Verwendung des Plasmids YCpHO CUT4 hergestellt [30].
Hefestämme
wurden bei 30°C
in reichem Kulturmedium oder in synthetischem Minimal-Kulturmedium
mit geeigneten Aminosäurezusätzen gezüchtet. Köder- und
Beute-Konstruktionen wurden in BOY1-Hefe sowohl des α- als auch
des α-Paarungstyps
unter Verwendung des TRAFO-Protokolls (www.manitoba.ca/faculties/medicine/humangenetics/gietz/trafo.html.)
transformiert und auf Selektionsplatten aufgebracht. Die Clone wurden
bis zur späten
logarithmischen Phase in selektivem Kulturmedium gezüchtet. Zur
Analyse der Expression von Fusionsproteinen wurden die Hefezellen aus
1 ml einer Über-Nacht-Kultur
in reduzierender Laemmli-Probenpufferlösung lysiert, die Proben wurden aufgekocht
und durch SDS-PAGE- und Immunblot-Verfahren analysiert. Köder und
Beute wurden auf Selektionsplatten gezüchtet, Replikaansätze wurden
zusammen auf Platten mit reichem Kulturmedium zur Paarung über Nacht
aufgebracht, und Replikaansätze
wurden auf Doppel- (Tryptophan
und Histidin) oder Dreifach-(Tryptophan, Histidin und Leucin)Selektionsplatten
mit oder ohne 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid (X-Gal) (Boehringer)
zur Selektion von Wechselwirkungen aufgebracht.
-
Für die in
vitro-Bindungsuntersuchung wurden die GST-α-Actinin-Fusionsproteine ABD/R1/R2, R3/R4/EF
[25] oder GST allein in E. coli hergestellt und mit Glutathion-Agarose-Perlen (Pharmacia)
gereinigt. Man ließ 2 μg der Fusionsproteine
auf Glutathion-Perlen mit 20 μl
in vitro translatiertem, mit 35S markiertem Myotilin
in 10 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,5, 5 mM EDTA, 130 mM KCl, 0,05% Tween
20 reagieren. Nach Waschungen mit der selben Pufferlösung wurde
das gebundene Material durch Aufkochen in Laemmli-Pufferlösung eluiert,
dem SDS-PAGE-Verfahren unterworfen und durch Autoradiographie nachgewiesen.
-
Lage von Myotilin in transfizierten
COS-1-Zellen
-
In
den Transfektionsstudien wurden Myotilin in voller Länge und
die Myotilin215–498-Konstruktion in einem mit HA markierten
pAHP-Plasmid (ein Derivat von pcDNA3, Invitrogen, San Diego, CA)
und ein SV-β-Galactosidase-Kontrollvector
(Clontech) verwendet. COS-1-Zellen, die auf 6 cm-Gewebekulturschalen
ausgebracht worden waren, wurden mit 5 μg geeigneter Plasmid-cDNA unter
Verwendung von Superfect (Qiagen GmbH, Hilden, Deutschland) transfiziert
und auf Deckgläschen
aus Glas gezüchtet.
Nach 72 Stunden wurden die Zellen in 3,5% Paraformaldehyd bei +4°C über 10 min
fixiert und in 0,1% Triton X-100 permeabilisiert. Transfiziertes
Protein ließ man
mit anti-HA-mAk (12CA5, Boehringer GmbH, Mannheim, Deutschland)
oder anti-β-Galactosidase-mAk
(Boehringer), gefolgt von FITC-gebundenem anti-Maus-IgG der Ziege immunreagieren.
F-Actin wurde gleichzeitig durch mit Rhodamin markiertes Phalloidin
(Molecular Probes, Eugene, OR) sichtbar gemacht. Die Proben wurden
mit einem Zeiss-Axiophot II-Epifluoreszenzmikroskop (Carl Zeiss,
Oberkochen, Deutschland) oder alternativ mit einem konfokalen 410
Invert Laser Scan-Mikroskop (Carl Zeiss) betrachtet.
-
Wirkung von
Myotilin auf Actin und Zellwachstum von Hefe
-
Die
Wirkung von Myotilin auf Actin-Cytoskelett und Wachstumsrate von
Hefe wurde wie folgt untersucht. Zur Anfärbung von Actin wurden Zellen,
die Myotilin exprimierten, oder Zellen, die mit einem leeren Vektor
transfiziert worden waren, in 4% Paraformaldehyd fixiert. F-Actin
wurde durch mit Rhodamin markiertes Phalloidin (Molecular Probes,
Eugene, OR) und die Zellwand mit Calcofluor (1 mg/ml) (Sigma) sichtbar
gemacht. Nach Waschungen wurden die Zellen in DABCO-Fixierlösung resuspendiert.
Zur Analyse der Wirkung von Myotilin auf das Zellwachstum wurden
haploide Zellen, die mit Myotilin im JG4-5-Vektor transfiziert worden waren,
in Glucose gezüchtet,
gewaschen, und eine gleiche Anzahl an Zellen mit unterschiedlichen
Myotilin-Konstruktionen wurde in ein Galactose enthaltendes Wachstumskulturmedium
zur Induktion der Expression von Protein zugegeben. Diploide Zellen,
die zwei unterschiedliche Proteine der Vektoren JG4-5 und EG202 exprimierten,
wurden von Beginn des Experimentes an in Galactose gezüchtet. An
angegebenen Zeitpunkten wurde ein geringer Anteil von Zellen mit
Ultraschall bestrahlt, und die OD600 wurde
unter Verwendung eines Spektrophotometers gemessen.
-
Literatur
-
- 1. Fürst,
D.O. und Gautel, M. (1995) The anatomy of a molecular giant: How
the sarcomere cytoskeleton is assembled from immunoglobulin superfamily
molecules. J. Mol. Cardiol. 27: 951–959.
- 2. Keller, T.C. 3. (1995) Structure and function of titin and
nebulin. Curr. Opin. Cell Biol. 7: 32–38.
- 3. Blanchard, A., Ohanian, V. und Critchley, D. (1989) The structure
and function of α-actinin.
J. Muscle Res. Cell Motil. 10: 280–289.
- 4. Labeit, S. und Kolmerer, B. (1995) Titins: giant proteins
in charge of muscle ultrastructure and elasticity. Science 270:
293–296.
- 5. Fowler, V.M. (1996) Regulation of actin filament length in
erythrocytes and striated muscle. Curr. Opin. Cell Biol. 8: 86–96.
- 6. Gautel, M., Goulding, D., Bullard, B., Weber, K. und Fürst, O.
(1996) The central Z-disk
region of titin is assembled from a novel repeat in variable copy
numbers. J. Cell Sci. 109: 2747–2754.
- 7. Maruyama, K. (1997) Connectin/titin, giant elastic protein
of muscle. Faseb J. 12:341–345.
- 8. Young, P., Ferguson, C., Banuelos, S. und Gautel, M. (1998)
Molecular structure of the sarcomeric Z-disk: two types of titin
interaction lead to an asymmetrical sorting of α-actinin. EMBO J. 17: 1614–1624
- 9. Brown, R.H. Jr. (1996) Dystrophin-associated proteins and
the muscular dystrophies: A glossary. Brain Pathol. 6: 19–24.
- 10. Ozawa, E., Noguchi, S., Miruno, Y., Hagiwara, Y. und Yoshida,
M. (1998) From dystrophinopathy to sarcoglycanopathy: evolution
of a concept of muscular dystrophy. Muscle Nerve 21: 421–438
- 11. Olson, T.M., Michels, V.V., Thibodeau, S.N., Tai, Y-S. und
Keating, M.T. (1998) Actin mutations in dilated cardiomyopathy,
a heritable form of heart failure. Science 280: 750–752.
- 12. Towbin, J.A. (1998) The role of cytoskeletal proteins in
cardiomyopathies. Curr. Opin. Cell Biol. 10: 131–139.
- 13. Laing, N.G., Wilton, S.D., Akkari, P.A., Dorosz, S., Boundy,
K., Kneebone, C., Blumbergs, P., White, S., Watkins, H., Love, D.R.
und Haan, E. (1995) A mutation in the a-tropomyosin gene TPM3 associated
with autosomal dominant nemaline myopathy. Nat. Genet. 9: 75–79
- 14. Pelin, K., Ridanpää, M., Donner,
K.. Wilton. S.. Krishnarajah, J., Laing, N.G., Kolmerer, B., Labeit,
S., de la Chapelle, A. und Wallgren-Petterson, C. (1997) Refined
localization of the genes for nebulin and tirin on chromosome 2q
allows the assignment of nebulin as a candidate gene for autosomal
recessive nemaline myopathy. Eur. J. Hum. Genet. 65: 620–626
- 15. Haravuori, H., Mäkelä-Bengs,
P., Udd, B., Partanen, J., Pulkkinen, L., Somer, H. und Peltonen,
L. (1998) Assignment of the tibial muscular dystrophy locus to chromosome
2q31. Am. J. Hum. Genet. 62: 620–626
- 16. Bartoloni, L., Horrigan, S.K., Viles, K.D., Gilchrist, J.M.,
Stajich, J.M., Vance, J.M., Yamaoka, L.H., Pericak-Vance, M., Westbrook,
C.A. und Speer, M.C. (1998) Use of CEPH meiotic breakpoint panel
to refine the locus of limb-girdle muscular dystrophy type 1A (LGMD1A)
to a 2-Mb interval on 5q31. Genomics 54: 250–255.
- 17. Feit, H., Silbergleit, A., Schneider, L.B., Gutierrez, J.A.,
Fitoussi, R.-P., Reyes, C., Rouleau, G.A., Brais, B., Jackson, C.E.,
Beckmann, J.S. und Seboun, E. (1998) Vocal cord and pharyngeal weakness
with autosomal dominant distal myopathy: clinical description and
gene localization to 5q31. Am. J. Hum. Genet. 63: 1732–1742.
- 18. Janmey, P.A. und Chaponnier, C. (1995) Medical aspects of
the actin cytoskeleton. Curr. Opin. Cell Biol. 7: 111–117.
- 19. Assoian, R.K. und Zhu, X. (1997) Cell anchorage and the
cytoskeleton as partners in growth factor dependent cell cycle progression.
Curr. Opin. Cell Biol. 9: 86–92.
- 20. Jordan, M.A. und Wilson, L. (1998). Microtubules and actin
filaments: dynamic targets for cancer chemotherapy. Curr. Opin.
Cell Biol. 10: 123–130.
- 21. Sasse, F., Kunze, B., Gronewold, M. und Reichenbach, H.
(1998). The chondramides: Cytostaric agents from myxobacteria acting
on the actin cytoskeleton. J. Natl. Cancer Inst. 90: 1559–1563.
- 22. Martin, R.M., Gasser, R.B., Jones, M.K. und Lightowlers,
M.W. (1995) Identification and characterization of myophilin, a
muscle-specific antigen of Echinococcus granulosus. Molecular & Biochemical Parasitology.
70: 139–48
- 23. Williams, A.F. und Barclay, A.N. (1988) The immunoglobulin
superfamily-domains for cell surface recozinition. Annu. Rev. Immunol.
6: 381–405.
- 24. Laitinen, T., Kauppi, P., Ignatius, J., Ruotsalainen, T.,
Daly, M.J., Kääriäinen, H.,
Kruglyak, L., Laitinen, H., de la Chapelle, A., Lander, E.S., Laitinen,
L.A. und Kere, J. (1997) Genetic control of serum IgE levels and
asthma: linkage and linkage disequilibrium studies in an isolated
population. Hum. Mol. Genet. 6: 2069–2076.
- 25. Kahana, E. und Gratzer, W.B. (1991) Properties of the spectrin-like
structural element of smooth-muscle α-actinin. Cell Motil. Cytoskel.
20: 242–248.
- 26. Flood, G., Kahana, E., Gilmore, A.P., Rowe, A.J., Gratzer,
W.B. und Critchley, D.R. (1995) Association of structural repeats
in the α-actinin
rod domain. Alignment of inter-subunit interactions. J. Mol. Biol.
252: 227–234.
- 27. Knight, P.J., und Trinick, J.A. (1982) Preparation of myofibrils.
Methods Enzymol. 85 Pt B: 9–12.
- 28. Närvänen, O.,
Närvänen, A.,
Wasenius, V-M., Partanen, P. und Virtanen, I. (1987) A monoclonal
antibody against a synthetic peptide reveals common structures among
spectrins and α-actinin.
FEBS Lett. 224: 156-160.
- 29. Guyris, J.E., Golemis, E., Chertkov, H. und Brent, R. (1993)
Cdi 1, a human G1 and S phase protein phosphatase that associates
with Cdk2. Cell 75: 791–803.
- 30. Raghuraman, M., Brewer, B. und Fangman, W. (1994) Activation
of a yeast replication origin near a double-stranded DNA break.
Genes & Development
8: 554–562.
- 31. Bubb et al.: "Jasplakinolide,
a cytotoxic natural product, induces actin polymerization and completely
inhibits the binding of phalloidin to F-actin", The Journal of Biological Chemistry
269 (21), S. 14869–14871.
-
-
-
-
-