DE69933033T2

DE69933033T2 - Myotilin, ein actin-organisierendes protein

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Publication number: DE69933033T2
Application number: DE69933033T
Authority: DE
Inventors: Olli Carpen; Paula Salmikangas; Mikaela GRÖNHOLM; Leena Heiska; Olli-Matti MYKKÄNEN
Original assignee: Licentia Oy
Current assignee: Licentia Oy
Priority date: 1998-07-17
Filing date: 1999-07-14
Publication date: 2007-04-05
Anticipated expiration: 2019-07-15
Also published as: WO2000004145A3; CA2333469C; EP1098971A2; ATE338119T1; AU756370B2; US6458929B1; AU5043599A; EP1098971B1; DE69933033D1; CA2333469A1; WO2000004145A2

Description

Bereich der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Protein des Cytoskeletts, Myotilin, das Ig-ähnliche Domänen homolog zu dem riesigen sarkomeren Strukturprotein Titin enthält. Myotilin wird in Skelett- und Herzmuskeln exprimiert, es liegt zusammen mit α-Actinin innerhalb der sarkomeren I-Banden und tritt direkt mit α-Actinin in Wechselwirkung. Expression von Myotilin in Nicht-Muskelzellen von Säugern und in Hefe bewirkt Reorganisation von Actin in dicke F-Actin-Bündel und verhindert das Wachstum von Hefezellen.
Hintergrund der Erfindung
Unter den zahlreichen Zelltypen in höheren Organismen haben sich die gestreiften Muskelzellen differenziert, um die Aufgabe der Krafterzeugung und -übertragung durchzuführen. Um diese hoch spezialisierte Funktion zu erfüllen, exprimieren die Muskelzellen viele Genprodukte oder mRNA-Spleißvarianten, die in anderen Körperzellen nicht gefunden werden. Viele der für Muskeln spezifischen Gene codieren Cytoskelett-Proteine, durch welche eine hoch organisierte sarkomere Architektur geschaffen wird [1, 2]. Die Hauptbestandteile von dicken und dünnen Filamenten, Actin und Myosin, sind an eine Reihe von Molekülen gebunden, die den Aufbau, strukturelle Integrität und Funktion des gestreiften Muskels regulieren. Zum Beispiel dient das riesige Protein Titin, das sich von der M-Linie des dicken Filaments bis zur Z-Linie des dünnen Filaments erstreckt, als eine Feder und ein Regler des Sarkomers, und α-Actinin, ein Actin bindendes Protein, bewirkt eine Quervernetzung dünner Filamente in antiparallele Bündel in den Z-Streifen [2–8]. Die Kraft, die von Cytoskelett-Bestandteilen der kontrahierenden Untereinheiten erzeugt wird, wird durch die Plasmamembran (Sarkolemma) auf die extrazelluläre Matrix über einen verbindenden, aus zahlreichen Untereinheiten bestehenden Dystrophin-Glycoproteinkomplex übertragen [9, 10].
Die Wichtigkeit der einzelnen Bestandteile der sarkomeren und Sarkolemma-Strukturen wird durch neue Befunde hervorgehoben, welche zeigen, dass Mutationen in mehreren verschiedenen Strukturproteinen zu muskulären Erkrankungen wie etwa Muskeldystropien und Kardiomyopathien [9–12] führen. Viele der identifizierten Gene für Muskelerkrankungen codieren Proteine des mit Dystrophin verbundenen Sarkolemma-Komplexes, doch in neuerer Zeit gibt es Hinweise, dass auch andere Molekültypen, einschließlich Regulatoren der sarkomeren Architektur, Anteil an der Pathogenese bestimmter Krankheitsformen haben. Es wurde gezeigt, dass eine Mutation in dem Gen für α-Tropomyosin, TPM3, eine autosomale dominante Nemalinmyopathie (NEM1) verursacht [13]. Das nebulin-Gen ist ein Kandidat für eine andere Nemalinmyopathie (NEM2) [14], und das titin-Gen ist ein Kandidat für autosomale dominante Dystrophie der Tibiamuskulatur [15].
Trotz der Fortschritte der letzten Zeit gibt es mehrere klinisch unterscheidbare Formen muskulärer Dystrophie mit nicht definierten Krankheitsgenen. Zwei Formen der muskulären Dystrophie, eine dominante Form der Gliedergürtelmuskeldystrophie (LGMD1A) und eine dominante Form distaler Myopathie mit Stimmband- und Kehlkopfschwäche (VCPMD) sind auf einer überlappenden Stelle in 5q31 kartiert worden [16, 17].
Zahlreiche Studien haben gezeigt, dass das Actin-Cytoskelett in transformierten Zellen wesentlich verändert ist [Überblick in 18, 19 und 20]. In Zellen unterliegen Actin-Moleküle dynamischer Reorganisation, d.h. Polymerbildung aus Actin-Monomeren und Zerstörung oder Veränderung von bestehenden Polymeren. Diese Vorgänge werden durch eine Reihe von Actin bindenden Proteinen mit unterschiedlichen Aktivitäten kontrolliert. Die komplexe, dynamische Regulierung von Filamenten des Cytoskeletts ist von der Expression und Aktivität verschiedener Bestandteile innerhalb der Zellen abhängig. Interessanterweise kommt in den meisten Zelltypen eine große Actin-Fraktion als Monomere vor, während in Muskelzellen mehr als 99% des Actins in Filamenten vorliegt. Dies legt nahe, dass Muskelzellen Protein(e) exprimieren, von denen einige unbekannt sein mögen, deren Funktion darin besteht, das Gleichgewicht der Actin-Moleküle in einem polymerisierten Status zu halten. Unter Beachtung der wichtigen Rolle des Actin-Cytoskeletts für Funktionen, die mit abnormem Zellwachstum und den Veränderungen bei der Actin-Organisation in transformierten Zellen zusammenhängen, stellen Faktoren, die die Actin-Organisation regulieren, attraktive Ziele für eine Krebs-Chemotherapie dar. Eine solche Idee ist kürzlich durch experimentelle Daten unterstützt worden, welche darauf hinwiesen, dass zwei neue, Actin stabilisierende Bestandteile, Jasplakinolid und Chondramide, das Wachstum transformierter Zellen hemmen [20, 21, 31].
Zusammenfassung der Erfindung
Wir beschreiben hier die cDNA-Sequenz und Struktur des myotilin-Gens, das einen neuen Bestandteil des Cytoskeletts der gestreiften und der Herzmuskulatur codiert. Das Myotilin-Protein umfasst zwei Ig-ähnliche Domänen des C2-Typs mit beachtlicher Homologie zu bestimmten Ig-Domänen von Titin. Myotilin kommt sowohl im Sarkomer, wo es innerhalb der I-Banden liegt und an ein α-Actinin gebunden ist, als auch entlang der Sarkolemma-Membran vor. Das myotilin-Gen liegt in Chromosom 5q31 innerhalb einer 2 Mb-Region, welche das Gen für die LGMD1A-Erkrankung umfasst [16], und ist damit ein Kandidat für LGMD1A. Transfizierung von Myotilin in Säugerzellen und Hefezellen induziert die Bildung von dicken Actinbündeln und reduziert das Wachstum von Hefezellen, wodurch angezeigt wird, dass Myotilin eine Rolle bei der Organisation des Actin enthaltenden Cytoskeletts spielt.
Die Bezeichnung „Myotilin" stammt von myofibrillärem Protein mit Titin-änlichen (engl.: Titin-like) Ig-Domänen. Es sollte beachtet werden, dass die Bezeichnung „Myofilin", welche früher verwendet wurde, aufgrund der Tatsache geändert wurde, dass ein Muskel-spezifisches Gen von Echinococcus granulosus zuvor „Myophilin" genannt worden war [22]. Obwohl die Begriffe unterschiedlich buchstabiert werden, verursacht eine ähnliche Aussprache die Möglichkeit zur Verwirrung, und deshalb wurde die Bezeichnung „Myofilin" in „Myotilin" geändert.
Expression von Myotilin in Säugerzellen und Hefe bewirkt Reorganisation von Actin in dicke Filamente. Die Expression von Myotilin oder seinem C-terminalen Fragment (Aminosäuren 215–498) verändert die Morphologie von Hefe und reduziert die Wachstumsrate. Die Actin organisierenden und Wachstum hemmenden Eigenschaften legen nahe, dass Myotilin oder seine Fragmente für die Entwicklung von Substanzen verwendet werden können, welche Zellwachstum unter verschiedenen pathologischen Bedingungen kontrollieren können, einschließlich der Behandlung von Krebserkrankungen oder mikrobiellen Infektionen.
Beschreibung der Abbildungen
1A. Abgeleitete Aminosäuresequenz von Myotilin.
Das abgeleitete, aus 498 Resten bestehende Myotilin-Polypeptid wird dargestellt. Diese Sequenz ist ebenso im angehängten Sequenzprotokoll als SEQ ID NO:2 angegeben. Die Ig-ähnliche Domänen enthaltenden Regionen sind umrandet. Die gestrichelte Linie kennzeichnet das aus 17 Resten bestehende Peptid, das für die Herstellung von Kaninchen-Antiserum verwendet wurde. Die Nucleotidsequenz der cDNA für Myotilin ist in der Gene Bank-Datenbank hinterlegt worden (Zugangnummer AF144477). Die Nucleotidsequenz wird als SEQ ID NO:1 angegeben.
1B. Schematische Struktur von Myotilin.
Das schematische Diagramm der Proteinstruktur zeigt die Serin-reiche Region (grauer Kasten), die einen hydrophoben Abschnitt enthält (schwarzer Kasten), und die beiden Ig-Domänen (Schleifen). Die annähernden Positionen verschiedener Regionen werden nachstehend angegeben.
1C. Vergleich der Myotilin-Sequenz mit Titin.
Zwei gepaarte Ig-Domänen und flankierende Regionen von Myotilin und Titin des Menschen (Ig-Domänen 7 und 8) wurden unter Verwendung des Clustal-W-Verfahrens gegeneinander ausgerichtet. Reste, die zu den Ig-ähnlichen Domänen gehören, sind umrandet. Schwarze Kästen kennzeichnen konservierte Reste, und graue Kästen kennzeichnen konservative Substitutionen. Die Gene Bank-Zugangsnummer für Titin ist I38344.
2. Organisation des myotilin-Gens
Exons (vertikale schwarze Kästen), mit römischen Ziffern nummeriert, und Introns werden im gleichen Maßstab dargestellt. Die Position des Startsignals für die Translation in Exon II und das Translations-Stopp-Codon in Exon X sind gekennzeichnet. Die Größen der Introns sind in kB angegeben.
3. Integrierte Karte von Chromosom 5 in der Region des Myotilin-Gens.
Abstände zwischen den Markierungen beruhen auf kombinierten Informationen aus genetischer und physikalischer Kartierung (http://www.genome.wi.mit.edu/). Das Myotilin-Gen liegt auf Chromosom 5q31, 141 cM vom Anfang der Chromosom 5-Kopplungsgruppe [24], und wird innerhalb der 2 Mb großen kritischen Region für Gliedergürtelmuskeldystophie (LGMD1A) kartiert, wodurch es durch seine Position ein Gen-Kandidat für die Krankheit ist. IL9 ist das Gen für Interleukin-9. Die Ausrichtung des Chromosoms ist angegeben (Zentromer auf der linken Seite).
4. Northern-Blot-Analyse von Myotilin.
Auf einen kommerziellen Filter mit RNA aus zahlreichen Geweben wurde ein mit ³²P markiertes, 320 Bp großes Fragment der cDNA von Myotilin als Sonde gegeben. Der Filter wurde über 20 h exponiert. Die Sonde hybridisierte stark mit Skelettmuskel-RNA und schwach mit Herzmuskel-RNA, während die anderen angegebenen Gewebe negativ waren. Die rechte Linie zeigt eine Exposition von Skelettmuskel-RNA über 6 h, um zwei unterschiedliche Transkriptionsgrößen darzustellen (2,2 und 2,5 Kb).
5A. In vitro-Translation von Myotilin.
Die cDNA von Myotilin wurde unter Verwendung eines gekoppelten Retikulocyten-Lyase-Kits in vitro translatiert. Eine Proteinbande mit 57 kDa, die das Protein in voller Größe darstellt, wird nachgewiesen. Die kleinere Bande mit 45 kDa aus der Translation der cDNA mit vollständiger Länge geht offensichtlich auf einen falschen Translations-Startpunkt in der Sequenz zurück. Myotilin_215-498 ist eine Deletionskonstruktion, die in Zwei-Hybrid-Experimenten verwendet worden ist. MG = Molekulargewichtsmarkierungen.
5B. Western-Blot-Analyse von Myotilin.
Lysate der angegebenen Gewebe wurden für Immunblots mit affinitätsgereinigtem Myotilin-Antikörper verwendet. Der Western-Blot des Skelettmuskels vom Menschen ergab eine kräftige Bande mit 57 kDa und eine schwächere Bande mit 110 kDa (Pfeile), die Nicht-Muskelgewebe hingegen zeigten keine Reaktivität. Präabsorption des Myotilin-Antikörpers mit fünffach molarem Überschuss an antigenem Peptid führt zum Verlust der Immunreaktivität des Skelettmuskel-Lysats (rechte Linie).
6. Immunlokalisierung von Myotilin in gereinigten Myofibrillen.
Myofibrillen-Bündel vom Rind wurden isoliert, wie im Abschnitt Materialen und Verfahren beschrieben, und mit Antikörpern gegen Myotilin, α-Actinin, Actin, Titin und präimmunem IgG vom Kaninchen angefärbt. Alle analysierten Proteine liegen auf I-Banden in Sarkomeren, aber die Anfärbmuster unterscheiden sich. Myotilin und α-Actinin färben die Mitte der I-Banden, während die Actin-Färbung mehr diffus ist. Titin wird als Doppel-Farbbande der Verbindungen von A- und I-Banden nachgewiesen. Das Phasenkontrastbild zeigt die sarkomere Struktur, wobei die hellen Banden dünne Filamente (I-Banden) und die dunklen Banden dicke Filamente (A-Banden) sind. Balken = 5 μm.
7A bis 7D. Immunhistochemische Anfärbung von Myotilin in tiefgefrorenen Schnitten von Skelettmuskeln des Menschen.
Tiefgefrorene Schnitte des Skelettmuskels wurden durch Immunperoxidase-Technik unter Verwendung eines affinitätsgereinigten Myotilin-Antikörpers (A–C) oder eines Kontroll-Antiserums (D) analysiert. Myotilin-Anfärbung wird in den I-Banden von Sarkomeren (A) und in Querschnitten wie auch entlang des Sarkolemmas von Muskelfasern (B) nachgewiesen. Positive Reaktivität wird auch in den muskulären Nerven nachgewiesen (C). (D) Eine Kontroll-Anfärbung mit Präimmun-Serum.
8A bis 8E. Homotypische Wechselwirkung von Myotilin und Verbindung mit α-Actinin.

(A) Struktur der Domänen von α-Actinin und Myotilin und der Konstruktionen, die in Hefe Zwei-Hybrid- und in vitro-Bindungsuntersuchungen verwendet wurden. ABD = Actin-Bindungsdomäne, R = Spectrin-ähnliche Wiederholungssequenz, EF = EF-seitige-Region. Der graue Kasten innerhalb des Myotilins kennzeichnet die Serinreiche Region, und die Schleifen kennzeichnen Ig-ähnliche Domänen.
(B) Eine Fotomikrografie der Zwei-Hybrid-Wechselwirkungen bei Hefe. Auf der linken Seite liegen die exprimierten Köder-Fusionsproteine und oben liegen die Beute-Fusionsproteine. EG202 = leerer Köder-Vektor und JG4-5 = Beute-Vektor. Die Farbreaktion ist ein Indikator für eine Wechselwirkung.
(C) Quantifizierung der Werte für β-Galactosid. Die Köder- und Beute-Fusionsproteine sind wie in B. Die Werte für β-Galaktosidase sind in folgende Kategorien unterteilt: – = < 20; + = 21–150; ++ = 151–300; +++ = 301–450.
(D) Affinitätsniederschlag-Analyse der Wechselwirkung Myotilin – α-Actinin. Die NH₂-terminalen und COOH-terminalen Abschnitte von α-Actinin wurden als GST-Fusionsproteine exprimiert, gereinigt und an Glutathion-Agaroseperlen gebunden. Man ließ Myotilin, das mit ³²S markiert und in vitro translatiert worden war, an GST-α-Actinin-Fusionsprotein enthaltende Perlen binden. Das gebundene Material wurde in dem SDS-PAGE-Verfahren getrennt und eine Autoradiographie wurde durchgeführt. Myotilin bindet die R3/R4/EF-Konstruktion, die ABD/R1/R2 und die GST-Kontrolle sind dagegen nicht bindend.
(E) In der Bindungsuntersuchung verwendete, mit Coomassie gefärbte SDS-PAGE, die die Konstruktionen zeigt.

9A bis 9F. Wirkung von Myotilin bei der Organisation von Actin enthaltendem Cytoskelett in COS-Zellen.
Auf der linken Seite COS-Zellen, die vorübergehend mit cDNA von Myotilin transfiziert worden sind (mt 1–498); in der Mitte Zellen, die mit einer COOH- terminalen Konstruktion, Myotilin_215–498 (mt 215–498), transfiziert worden sind; auf der rechten Seite eine cDNA für β-Galactosidase (β-Gal) als Transfektionskontrolle. (A–B) zeigen Anfärbung von Myotilin, (C) zeigt Anfärbung von β-Galactosidase. (D–F) ist eine doppelte Anfärbung der selben Zellen für F-Actin. Man beachte die dicken, F-Actin und Myotilin enthaltenden Bündel in (A) und (D). Myotilin_215–498 tritt mit F-Actin zusammen auf, aber die Organisation von Actin unterscheidet sich nicht von der in den Kontrollzellen. Die β-Galactosidase-Kontrolle zeigt keine spezifische Lage. Balken = 20 μm.
10. Konfokalanalyse von COS-Zellen, die Myotilin exprimieren.
COS-Zellen, die mit cDNA von Myotilin transfiziert worden waren, wurden fixiert, auf F-Actin (ph) und Myotilin (my) doppelt angefärbt und mit einem Konfokalmikroskop analysiert. Die Abbildungen oben rechts und in der Mitte rechts sind Zusammensetzungen aus den entsprechenden Phalloidin- (rot) und Myotilin- (grün) Anfärbungen. Gebiete mit überlappender Verteilung erscheinen gelb. Man beachte die dicken, cytoplasmatischen, F-Actin und Myotilin enthaltenden Strukturen in der oberen Reihe und die submembranösen Rindenstrukturen in der mittleren Reihe. In der unteren Reihe werden zusammengesetzte Abbildungen von Phalloidin- (rot) und Myotilin- (grün) Anfärbungen von einer transfizierten Zelle gezeigt, die, 2 μm (links) und 6 μm (Mitte) über dem Nährsubstrat dargestellt, eine zufällige Anordnung der F-Actin und Myotilin enthaltenden Strukturen aufweisen. Rechts unten wird eine Überlagerung von Myotilin-Anfärbung in Sektionen mit 1 μm Abstand durch die gesamte Zelle dargestellt. Die Farbcodierung zeigt den Abstand vom Substrat (μm) an. Man beachte die fehlende Anfärbung an der ventralen Oberfläche der Zelle. Balken = 10 μm.
11A bis 11F. Die Wirkung von Myotilin auf Cytoskelett und Wachstum von Hefezellen.
Hefezellen, die Myotilin exprimieren (A und B), und Kontrollzellen (C und D) wurden mit Rhodamin-Phalloidin angefärbt, um F-Actin sichtbar zu machen (A und C), oder mit Calcofluor, um Kohlenhydrate der Zellwand anzufärben (B und D). Man beachte, dass die Myotilin exprimierenden Zellen länger sind, in Reihen wachsen und mit dicken Actin-Bündeln verbunden sind, was ein fehlerhaftes Zelltrennungsereignis nahelegt. E. Wachstumsrate von Zellen, die verschiedene Myotilin-Fragmente exprimieren. Die Ziffern kennzeichnen Aminosäuren des Myotilin, die in die Konstruktionen eingeschlossen sind. Myotilin in voller Länge und Myotilin_215–498 reduzieren das Zellwachstum. JG4-5 = ein leerer Vektor. F. Wachstumsrate von Zellen, die Myotilin und/oder Kontrollproteine in zwei verschiedenen Expressionsvektoren exprimieren. Die stärkste, das Wachstum hemmende Wirkung wird in beiden Vektoren durch Expression von Myotilin oder seines COOH-terminalen Fragmentes verursacht. Die Wachstumsrate von Zellen, die Ezrin, ein Actin organisierendes Kontrollprotein, exprimieren, unterscheidet sich nicht vom Wachstum der Zellen, die mit leeren Vektoren transfiziert worden sind. α-Actinin = Spectrin-ähnliche Wiederholungssequenzen von α-Actinin aus dem Muskelmagen des Huhns, EG202 und JG4-5 = leere Vektoren.
Genaue Beschreibung der Erfindung
Charakterisierung der myotilin-cDNA
Eine teilweise cDNA, der Myotilin codiert, wurde zuerst entdeckt, beruhend auf einer Zwei-Hybrid-Durchmusterung von Hefe auf neue Bestandteile des Cytoskeletts. Mit der Verwendung dieser Sequenz als Sonde clonierten wir eine 2244 Bp große cDNA aus einer Skelettmuskel-Bibliothek des Menschen. Die cDNA enthält einen 1494 bp großen offenen Leserahmen (Nucleotide 281 bis 1774), der ein Polypeptid mit 498 Aminosäuren codiert (SEQ ID NO:2), welches wir Myotilin genannt haben (1A). Das Methionin-Startcodon weist eine teilweise Übereinstimmung mit der Kozak-Konsensussequenz auf. Die NH₂-terminale Sequenz ist besonders reich an Serin-Resten, die oft paarweise angeordnet sind, und enthält einen aus 23 Aminosäuren bestehenden hydrophoben Abschnitt (Reste 57–79). Nach Datenbankrecherchen ist die NH₂-terminate Sequenz einzigartig und enthält keine bekannten Strukturdomänen.
Vom COOH-Terminus des Proteins wurde vorhergesagt, dass es zwei Ig-ähnliche Domänen mit konservativen Schlüssel-Resten bildet (1B) [23]. Kürzlich ist gezeigt worden, dass mehrere Cytoskelettproteine, die an der Organisation des Muskelsarkomers beteiligt sind, solche strukturellen Einheiten enthalten. Durch Vergleich der Sequenzen ist die höchste Homologie zwischen Myotilin und der Region von Titin aus der gestreiften Muskulatur des Menschen nachgewiesen worden, welches die mit der Z-Scheibe verbundenen Ig-Domänen 7 und 8 enthält (1C) Reste 1406–1621 von Titin) [4]. Die Sequenzen innerhalb der verglichenen Regionen sind zu 31% identisch und zu 53% konserviert ohne irgendwelche zwischengeschobenen Lücken. Ein Ähnlichkeitsvergleich unter Verwendung des Clustal-Verfahrens zeigt 38,3% Ähnlichkeit zwischen dieser Region von Myotilin und Titin. Die Ähnlichkeit der Sequenzen zwischen Myotilin und Titin ist auf die Ig-Domänen von Myotilin begrenzt. Andere charakteristische strukturelle Eigenschaften von Titin, die Domänen des fn(III)-Typs, die spezifischen Sequenzen der Z-Scheibe, I-Bande und M-Bande oder das sich wiederholende KSP-Phosphorylierungsmotiv [4] kommen in Myotilin nicht vor. Die Seugenzvorhersage für Myotilin ergibt mehrere andere mögliche Stellen für die Phosphorylierung, drei davon liegen in der Serinreichen Region.
Organisation des myotilin-Gens
Die Organisation des Myotilin-Gens wurde durch Vergleichen der cDNA von Myotilin mit der genomischen Sequenz des Pac-Clons 9c13 von Chromosom 5 (Genbank-Zugangsnummer AC006084) bestimmt. Alle Spleiß-Verbindungssequenzen befinden sich in Übereinstimmung mit dem GT-AG-Konsensussequenz (Tabelle 1). Die Exon/Intron-Grenzen wurden darüber hinaus durch Amplifizierung jedes einzelnen Exons eines kommerziellen P1-Clons mit für Introns spezifischen Primern bestätigt (nicht dargestellt). Das Gen ist aus zehn Exons zusammengesetzt, und das Initiationssignal für die Translation liegt in Exon II (2). Daher wird das kleine erste Exon mit 69 bp nicht translatiert. Die Größe des gesamten Gens liegt unter 20.000 bp ohne die Promotor-Region. Die Sequenzen, die die Ig-Domänen codieren, liegen in den Exons VI und VII (erste Ig-Domäne) und in Exons VIII und IX (zweite Ig-Domäne).
Chromosomale Lage von myotilin
Die chromosomale Lage des myotilin-Gens wurde durch Radiationhybridkartierung bestimmt. Das myotilin-Gen wurde auf Chromosom 5q31 zwischen den Markern AFM350yb1 und D5S500 kartiert (3). Das Gen, das eine autosomale, dominant vererbte Gliedergürtelmuskeldystrophie (LGMD) 1A verursacht, ist auf Chromosom 5q31 zwischen den Markern D5S479 und D5S594 kartiert worden [16]. Das myotilin-Gen befindet sich innerhalb dieses angegebenen Bereichs. Werden all diese Daten zusammengenommen, ist myotilin ein Gen-Kandidat für LGMD1A.
Expressionsmuster von myotilin
Durch eine Northern-Blot-Analyse entdeckten wir zwei verschiedene Transkripte (2,2 und 2,5 kB), die im Skelettmuskel stark und im Herzen schwach exprimiert werden (4). Die beiden Transkripte werden im Herzen nur nach einer verlängerten Exposition festgestellt (nicht dargestellt). Glatte Muskulatur und zahlreiche nicht-muskuläre Gewebe, einschließlich Gehirn, Plazenta, Lunge, Leber, Niere und Bauchspeicheldrüse, enthielten keine nachweisbare mRNA. In vitro-Translation der cDNA in voller Länge ergab ein 57 kDa großes Polypeptid, was sich mit der Masse von Myotilin, die aus der cDNA-Sequenz abgeschätzt wurde, in Übereinstimmung befindet (5A).
Wir erstellten einen Antikörper gegen Myotilin, indem wir Kaninchen mit einem synthetischen, verzweigten Peptid aus 17 Aminosäuren, welches die Reste 352–368 umfasste (vgl. 1A), immunisierten. In der Western-Blot-Analyse zeigte dieser Antikörper eine Proteinbande bei 57 kDa und eine schwächere Bande nahe 110 kDa bei Skelettmuskulatur, nicht aber bei glatter Muskulatur oder nicht-muskulären Geweben (5B). Die Reaktivität konnte blockiert werden, indem der Antikörper mit fünffach molarem Überschuss an entsprechendem Peptid inkubiert wurde (5B). Sowohl die mRNA als auch die Daten aus dem Immunblot weisen daher darauf hin, dass Myotilin ein muskuläres Protein mit einem klar begrenzten Expressionsmuster ist. Die Identität der Bande mit 110 kDa ist unklar. Da sie in einer Region von zweifacher Größe eines Myotilin-Monomers wandert und da Myotilin in der Lage ist, intermolekulare Wechselwirkungen auszubilden (vgl. nachstehend), repräsentiert die Bande möglicherweise ein Myotilin-Dimer. Bei Behandlung von Geweben mit 1% Triton X-100 oder mit 1 M KCl wurde Myotilin in der unlöslichen Fraktion zurückgehalten, was eine Verbindung mit dem Zytoskelett nahelegt (Daten nicht dargestellt).
Subzelluläre Lage von Myotilin im Skelettmuskel
Um die subzelluläre Lage von Myotilin zu charakterisieren, isolierten wir Bündel von Myofibrillen der gestreiften Muskulatur und färbten sie unter Verwendung von affinitätsgereinigtem Peptid-Antiserum an. Das Immunfärbungsmuster wurde mit mehreren charakterisierten Bestandteilen des Sarkomers verglichen (6). Myotilin-Anfärbung wurde in den I-Banden nachgewiesen. Das Färbungsmuster erinnerte an α-Actinin, von dem bekannt ist, dass es in den Z-Streifen der I-Banden vorkommt. Actin, der Hauptbestandteil der dünnen Filamente, ergab ein diffuseres Färbungsmuster entlang der gesamten I-Banden. Ein Titin-mAk, der ein Epitop auf Verbindungen von dünnen und dicken Filamenten erkennt, ergab ein Färbungsmuster einer Doppelbande auf jedem Sarkomer. Die Daten der Immunlokalisierung zeigen, dass Myotilin ein integraler Bestandteil der Sarkomere im gestreiften Muskel ist.
Um die Lage von Myotilin im gestreiften Muskel darüber hinaus zu untersuchen, führten wir immunhistochemische Analysen an tiefgefrorenen Gewebeschnitten mit dem Myotilin-Antikörper durch. In senkrechten Schnitten, bei denen die Organisation von Sarkomeren sichtbar war, konnten wir eine periodische, kreuzgestreifte Anfärbung von Myotilin nachweisen (7A), die mit dem Muster in isolierten Myofibrillen übereinstimmte. Besonders in Querschnitten (7B) lag die Anfärbung von Myotilin an der Plasmamembran, was anzeigt, dass Myotilin auch am Sarkolemma vorkommt. Zusätzlich zu diesen Befunden färbte der Myotilin-Antikörper intramuskuläre Nervenfasern an (7C). Das Präimmun-Serum ergab keine Reaktivität (7D).
Myotilin bildet intermolekulare Wechselwirkungen aus und bindet in vitro α-Actinin direkt
Wir verwendeten das Zwei-Hybrid-Verfahren bei Hefe, um Protein-Wechselwirkungen von Myotilin zu untersuchen. Unter den untersuchten Partnern wurden die stärksten Wechselwirkungen zwischen Myotilin und α-Actinin (einer Konstruktion, die Spectrin-ähnliche Wiederholungssequenzen R1-R4 enthält) und zwischen Myotilin-Molekülen beobachtet (8A–C). Es ist bekannt, dass α-Actinin über Spectrin-ähnliche Wiederholungssequenzen Dimere bildet [25, 26], und dies konnte auch in unserer Zwei-Hybrid-Analyse bestätigt werden (8B). Jedoch zeigte die Quantifizierung der Werte für β-Galactosidase, dass die Intensität der Reaktion schwächer als die Wechselwirkung zwischen α-Actinin und Myotilin und zwischen zwei Myotilin-Molekülen war (8C). Eine NH₂ terminate Deletionskonstruktion, die die Ig-Domänen, Myotilin_215–498, enthielt, band Myotilin in voller Länge, α-Actinin (R1–R4) wurde jedoch nicht gebunden. Wir waren nicht in der Lage, Myotilin_215–498 als einen Köder zu exprimieren, um zu testen, ob die intermolekulare Wechselwirkung von Myotilin durch die die COOH-terminale Ig-Domäne enthaltende Region oder durch NH₂-terminale Bindung an den COOH-terminalen Abschnitt vermittelt wird. Die Wechselwirkung zwischen Myotilin und α-Actinin wurde darüber hinaus durch einen Affinitäts-Niederschlagstest untersucht, indem in vitro translatierte, mit ³²S markierte Myotilin- und GST-α-Actinin-Konstruktionen, gebunden an Glutathion-Agarose, verwendet wurden. Myotilin band die COOH-terminale Hälfte von α-Actinin (R3/R4/EF-Seite), nicht aber die NH₂-terminale Hälfte (ABD/R1/R2) oder GST allein (8D–C). Basierend auf den Ergebnissen der Zwei-Hybrid- und Affinitäts-Niederschlagsverfahren liegen die Reste, die für Bindung von α-Actinin wichtig sind, innerhalb der ersten 215 NH₂-terminalen Reste von Myotilin, und die Myotilin-Bindungsstelle in α-Actinin liegt offensichtlich innerhalb der Spectrin-ähnlichen Wiederholungssequenzen 3 und 4.
Wirkung von transfiziertem Myotilin auf Actin-Cytoskelett und Zellwachstum
Die zelluläre Lage und Funktion von Myotilin wurde darüber hinaus analysiert, indem mit einem HA-Epitop gekennzeichnetes Myotilin in voller Länge und eine COOH-terminale Myotilin-Konstruktion (Myotilin_215–498) vorübergehend in COS-1-Zellen, die kein endogenes Protein exprimieren, transfiziert wurden. Durch in vitro-Translation wurde bestätigt, dass die Konstruktion des Myotilin_215–498 ein Polypeptid in der richtigen Größe ergab (5A). DNA von β-Galactosidase wurde als eine Transfektionskontrolle verwendet. Nach 72 Stunden wurden die Zellen fixiert und auf Myotilin oder β-Galactosidase und Actin doppelt angefärbt. Myotilin_215–498 zeigte zum Teil ein diffuses cytoplasmatisches Färbungsmuster, aber auch submembranöse Akkumulation, deren Lage mit kortikalem Actin zusammenfiel, das durch Anfärbung mit Phalloidin sichtbar gemacht worden war (9B, E). Im Kontrast dazu lag Myotilin in voller Länge innerhalb des Filament-Netzwerkes des Zellkörpers, und Anfärbung mit Phalloidin ergab eine mit F-Actin streng übereinstimmende Lage in diesen Filamenten. Bemerkenswert ist, dass wir die Bildung von dicken, F-Actin enthaltenden Bündeln in COS-1-Zellen beobachten konnten (9A, D), deren Actin enthaltendes Skelett unter diesen Kulturbedingungen kaum organisiert ist. β-Galactosidase wies eine diffuse cytoplasmatische Verteilung auf und lag nicht mit F-Actin zusammen (9C, F).
Die durch Myotilin induzierten Actin enthaltenden Strukturen wurden darüber hinaus durch Konfokalmikroskopie charakterisiert (10). Typischerweise kamen die Actin-Bündel im Zellkörper vor, obgleich sie in einigen Zellen subkortikal in der Zellperipherie gefunden wurden (10, mittlere Reihe). Teilung der Zellen zeigten, dass die F-Actin und Myotilin enthaltenden Strukturen oft zufällig in unterschiedlichen Schichten im Cytoplasma angeordnet waren. Dies wird in der unteren Reihe von 10 sichtbar gemacht, in welcher Abbildungen der linken Seite und aus der Mitte Zusammensetzungen der F-Actin- und Myotilin-Anfärbung aus zwei unterschiedlichen Schichten der selben Zellen sind, und die Abbildung auf der rechten Seite ist eine Überlagerung der Myotilin-Markierung in der gesamten Zelle. Wichtig ist, dass die Strukturen auf der ventralen Oberfläche der transfizierten Zellen nicht vorkamen, was anzeigt, dass es keine Stress-Fasern sind. Die Wirkung von Myotilin auf die Actin-Organisation erinnert nicht an Veränderungen, die durch Überexpression der zuvor charakterisierten Actin organisierenden Proteine induziert wurden und legt einen einzigartigen Aktionsmechanismus nahe.
Wirkung von Myotilin auf Zell-Actin und Zellwachstum von Hefe
Die biologischen Funktionen von Myotilin wurden auch untersucht, indem Myotilin in Saccharomyces cerevisiae exprimiert wurde. Die Induktion der Myotilin-Expression führte zur Reorganisation von Actin in dicke Filamente, die in Kontrollzellen nicht entdeckt wurden. (11A und C). Die Myotilin exprimierenden Zellen wuchsen in Reihen, und die Filamente setzten sich von einer Zelle zur nächsten fort (11A). Diese Ergebnisse zeigen an, dass die Actin organisierende Eigenschaft von Myotilin in unterschiedlichen Organismen erhalten bleibt. Expression von Myotilin oder seines COOH-terminalen Abschnittes führte zur Hemmung des Zellwachstums, wohingegen Expression von NH₂-terminalen Konstruktionen (1–150 und 1–250) oder von einer kürzeren COOH-terminalen Konstruktion (270–472) keine vergleichbare Wirkung hatte (11E). Diese Wachstum hemmende Funktion ging mit morphogenen Änderungen der Hefezellen einher. Wenn Myotilin gleichzeitig mit zwei unterschiedlichen Expressionsvektoren exprimiert wurde, war die das Wachstum hemmende Wirkung stärker als die Wirkung, die durch einen einzelnen Vektor erzeugt wurde, was darauf hinweist, dass die Wirkung vom Spiegel der Proteinexpression abhängig ist (11F). In diesem Experiment beeinflusste die Expression eines irrelevanten, Actin des Cytoskeletts bindenden Proteins, Ezrin, das Zellwachstum nicht, was wiederum die Spezifität der Wirkung von Myotilin demonstriert.
Experimentelles
Abkürzungen

ABD

Actin bindende Domäne

CH

Calponin-Homologie

EST

exprimierte sequenzmarkierte Stelle

F-Actin

filamentöses Actin

fn

Fibronectin

Ig

Immunglobulin

LGMD

Gliedergürtelmuskeldystrophie

MBP

Myosin bindendes Protein

MLCK

Kinase der leichten Kette von Myosin

R

Wiederholungssequenz

Materialien und Verfahren
cDNA-Clonierung von Myotilin und Sequenzanalyse
Eine partielle cDNA wurde verwendet, um die cDNA von Myotilin in voller Länge aus einer Skelettmuskel-Bibliothek zu durchmustern (Stratagene, La Jolla, CA). Positive Clone wurden mit einem ABI 310 Genetic Analyzer (Perkin-Elmer, Foster City, CA) sequenziert. Die Durchsuchung in Proteindatenbanken wurde mit dem BLAST-Programm (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) durchgeführt. Alignments der Sequenzen zwischen Ig-Domänen von Myotilin und anderen Proteinen des Cytoskeletts wurden mit der MegAlign-Software (DNASTAR) durchgeführt. Die Domänen-Vorhersagen wurden vom Pfam-Server (http://genome.wustl.edu/Pfam/) erhalten. Proteinmotiv-Vorhersagen wurden mit dem Protein Familiy-Alignment Pfam2.1 (http://pfam.wustl.edu/) und mit dem Programm Motif (http://www.motif.genome.ad.jp) durchgeführt.
Genomische Struktur des Myotilin-Gens
Die Organisation des myotilin-Gens wurde durch Vergleichen der cDNA von Myotilin mit der genomischen Sequenz des Pac-Clons 9c13 auf Chromosom 5 (Genbank-Zugangsnummer AC006084) bestimmt. Ein kommerzieller P1-Clon (GenomeSystems Inc., St. Louis, Ml., durch PCR mit Myotilin-Primern ausgesucht) wurde zur Amplifizierung und Sequenzierung von Exon-Intron-Grenzen verwendet.
Chromosomale Lage von myotilin
Die chromosomale Lage des myotilin-Gens wurde durch Radiationhybridkartierung unter Verwendung des Genebridge II Panel bestimmt. PCR-Untersuchungen wurden als Duplikate durchgeführt, und der resultierende Datenvektor wurde unter Verwendung des Whitehead Genome Center-Servers (http:/www.genome.wi.mit.edu) analysiert.
Herstellung des Myotilin-Antikörpers
Ein polyclonaler Antikörper wurde in Kaninchen unter Verwendung eines synthetischen, verzweigten Myotilin-Peptids mit Lysin-Kern aus 17 Aminosäuren (in 1 mit einer durchbrochenen Linie markiert) als ein Antigen erzeugt. Nach fünf Immunisierungen wurde den Kaninchen Blut abgenommen. Der spezifische Antikörper wurde in einer Affinitätssäule unter Verwendung eines entsprechenden Einzelketten-Peptids, das an CNBr-aktivierte Sepharose 4B (Parmacia, Uppsala, Schweden) als ein Ligand gekoppelt war, gereinigt. Die Spezifität des Kaninchen-Antikörpers wurde durch Reaktivität mit geeigneten GST-Fusionsprotein-Konstruktionen in Western-Blot-Analysen (Daten nicht dargestellt) und durch kreuzblockierende Experimente bestätigt, in denen fünffach molarer Überschuss des spezifischen Peptids, aber kein irrelevantes Myotilin-Peptid (Reste 199–217) die Reaktivität absorbierten.
Studien an mRNA und Protein
Eine Northern-Blot-Analyse wurde mit einem Filter mit RNA aus zahlreichen Geweben (Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA) unter Verwendung eines mit 32P markierten 320 bp großen cDNA-Fragments von Myotilin, welches die Aminosäuren 369–471 codiert, als einer Sonde durchgeführt. In vitro-Translationen wurden mit einem gekoppelten Retikulocyten-Lysat-Kit (Promega, Madison, WI) unter Verwendung von mit ³⁵S markiertem Methionin zum Nachweis durchgeführt. Die Matrizen bestanden aus Myotilin in voller Länge und einer Konstruktion, die die Aminosäuren 215–498 (Myotilin_215–498) im Bluescript-Plasmidvektor (Stratagene) enthielten. Für die Western-Blot-Analyse wurden frische Gewebe in reduzierender Laemmli-Pufferlösung homogenisiert. Gleiche Mengen an Protein, wie durch Anfärben mit Coomassie-Blau bestimmt wurde, wurden mit 8% SDS-PAGE getrennt und auf Nitrocellulose-Filter (Schleicher & Schuell GmbH, Dassel, Deutschland) übertragen. Die Filter wurden mit dem Myotilin-Antikörper oder mit einem Präimmun-Serum zur Kontrolle abgesucht, es folgten Zugabe von Peroxidase-gebundenem anti-Kaninchen-IgG der Ziege (Dako A/S, Kopenhagen, Dänemark) und ECL-Nachweis (Pierce, Rockford, IL).
Lage von Myotilin in Myofibrillen
Myofibrinbündel vom Rind und vom Menschen wurden, wie beschrieben [27], isoliert, auf Objektträgern cytozentrifugiert, in –20°C kaltem Methanol fixiert, und man ließ sie mit mAk gegen Actin (AC 40, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), Titin (T11, Sigma), α-Actinin (67CB11) [28] und einen Kontroll-mAb X63 (ATCC, Maryland, USA) oder mit einem affinitätsgereinigten anti-Myotilin-Antikörper oder dem entsprechenden Präimmun-IgG reagieren. Sekundäre Antikörper waren FITC-gebundenes anti-Maus-IgG der Ziege (Cappel Research Products, Durham, NC) und TRITC-gebundenes anti-Kaninchen F(ab)2-Fragment der Ziege (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA). Das Anfärben von Myofibrillen des Rindes und des Menschen ergab identische Ergebnisse.
Immunhistochemie
Tiefgefrorene 2-μm-Schnitte des menschlichen Skelettmuskels wurden auf Objektträgern aus Glas, die mit Poly-L-Lysin überzogen waren, immobilisiert, mit kaltem Aceton fixiert und sofort luftgetrocknet. Für die immunhistochemische Anfärbung ließ man die Schnitte mit einer 1:100-Verdünnung von affinitätsgereingtem Myotilin-Ak oder präimmun-IgG vom Kaninchen in ähnlicher Konzentration reagieren. Der Antikörper wurde mit Elite-Vectastain-ABC-Kit (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) nach den Angaben des Herstellers nachgewiesen. Die Objektträger wurden kurz mit Hämatoxylin-Eosin gegengefärbt.
Zwei-Hybrid-Analyse der Hefe und in vitro-Bindungsuntersuchung
Myotilin in voller Länge, Myotilin_215–498 und Spectrin-ähnliche Wiederholungssequenzen R1–R4 (Reste 267–749) von α-Actinin aus der glatten Muskulatur des Huhns (freundlicherweise von Dr. D. Critchley, University of Leicester, GB, zur Verfügung gestellt) wurden für die Zwei-Hybrid-Analyse in EG202- und JG4-5-Plasmide subcloniert [29]. Die COOH-terminale Konstruktion von Myotilin wurde aus einer Teil-cDNA-Sequenz, die aus einer Durchmusterung einer Skelettmuskel-Bibliothek erhalten wurde, subcloniert. Die Authentizität der Konstruktionen wurde durch Sequenzierung bestätigt. Der Genotyp des Stammes BOY1 von S. cerevisiae, freundlicherweise von P. Ljungdahl, Ludwig-Institut für Krebsforschung, Stockholm, Schweden, zur Verfügung gestellt, ist MAT αhis3 trp1 Ieu2::6LexAop-LEU2 URA3::8LexAop-Gal1-LacZ. Der BOY1-Paarungstyp a wurde unter Verwendung des Plasmids YCpHO CUT4 hergestellt [30]. Hefestämme wurden bei 30°C in reichem Kulturmedium oder in synthetischem Minimal-Kulturmedium mit geeigneten Aminosäurezusätzen gezüchtet. Köder- und Beute-Konstruktionen wurden in BOY1-Hefe sowohl des α- als auch des α-Paarungstyps unter Verwendung des TRAFO-Protokolls (www.manitoba.ca/faculties/medicine/humangenetics/gietz/trafo.html.) transformiert und auf Selektionsplatten aufgebracht. Die Clone wurden bis zur späten logarithmischen Phase in selektivem Kulturmedium gezüchtet. Zur Analyse der Expression von Fusionsproteinen wurden die Hefezellen aus 1 ml einer Über-Nacht-Kultur in reduzierender Laemmli-Probenpufferlösung lysiert, die Proben wurden aufgekocht und durch SDS-PAGE- und Immunblot-Verfahren analysiert. Köder und Beute wurden auf Selektionsplatten gezüchtet, Replikaansätze wurden zusammen auf Platten mit reichem Kulturmedium zur Paarung über Nacht aufgebracht, und Replikaansätze wurden auf Doppel- (Tryptophan und Histidin) oder Dreifach-(Tryptophan, Histidin und Leucin)Selektionsplatten mit oder ohne 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid (X-Gal) (Boehringer) zur Selektion von Wechselwirkungen aufgebracht.
Für die in vitro-Bindungsuntersuchung wurden die GST-α-Actinin-Fusionsproteine ABD/R1/R2, R3/R4/EF [25] oder GST allein in E. coli hergestellt und mit Glutathion-Agarose-Perlen (Pharmacia) gereinigt. Man ließ 2 μg der Fusionsproteine auf Glutathion-Perlen mit 20 μl in vitro translatiertem, mit ³⁵S markiertem Myotilin in 10 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,5, 5 mM EDTA, 130 mM KCl, 0,05% Tween 20 reagieren. Nach Waschungen mit der selben Pufferlösung wurde das gebundene Material durch Aufkochen in Laemmli-Pufferlösung eluiert, dem SDS-PAGE-Verfahren unterworfen und durch Autoradiographie nachgewiesen.
Lage von Myotilin in transfizierten COS-1-Zellen
In den Transfektionsstudien wurden Myotilin in voller Länge und die Myotilin_215–498-Konstruktion in einem mit HA markierten pAHP-Plasmid (ein Derivat von pcDNA3, Invitrogen, San Diego, CA) und ein SV-β-Galactosidase-Kontrollvector (Clontech) verwendet. COS-1-Zellen, die auf 6 cm-Gewebekulturschalen ausgebracht worden waren, wurden mit 5 μg geeigneter Plasmid-cDNA unter Verwendung von Superfect (Qiagen GmbH, Hilden, Deutschland) transfiziert und auf Deckgläschen aus Glas gezüchtet. Nach 72 Stunden wurden die Zellen in 3,5% Paraformaldehyd bei +4°C über 10 min fixiert und in 0,1% Triton X-100 permeabilisiert. Transfiziertes Protein ließ man mit anti-HA-mAk (12CA5, Boehringer GmbH, Mannheim, Deutschland) oder anti-β-Galactosidase-mAk (Boehringer), gefolgt von FITC-gebundenem anti-Maus-IgG der Ziege immunreagieren. F-Actin wurde gleichzeitig durch mit Rhodamin markiertes Phalloidin (Molecular Probes, Eugene, OR) sichtbar gemacht. Die Proben wurden mit einem Zeiss-Axiophot II-Epifluoreszenzmikroskop (Carl Zeiss, Oberkochen, Deutschland) oder alternativ mit einem konfokalen 410 Invert Laser Scan-Mikroskop (Carl Zeiss) betrachtet.
Wirkung von Myotilin auf Actin und Zellwachstum von Hefe
Die Wirkung von Myotilin auf Actin-Cytoskelett und Wachstumsrate von Hefe wurde wie folgt untersucht. Zur Anfärbung von Actin wurden Zellen, die Myotilin exprimierten, oder Zellen, die mit einem leeren Vektor transfiziert worden waren, in 4% Paraformaldehyd fixiert. F-Actin wurde durch mit Rhodamin markiertes Phalloidin (Molecular Probes, Eugene, OR) und die Zellwand mit Calcofluor (1 mg/ml) (Sigma) sichtbar gemacht. Nach Waschungen wurden die Zellen in DABCO-Fixierlösung resuspendiert. Zur Analyse der Wirkung von Myotilin auf das Zellwachstum wurden haploide Zellen, die mit Myotilin im JG4-5-Vektor transfiziert worden waren, in Glucose gezüchtet, gewaschen, und eine gleiche Anzahl an Zellen mit unterschiedlichen Myotilin-Konstruktionen wurde in ein Galactose enthaltendes Wachstumskulturmedium zur Induktion der Expression von Protein zugegeben. Diploide Zellen, die zwei unterschiedliche Proteine der Vektoren JG4-5 und EG202 exprimierten, wurden von Beginn des Experimentes an in Galactose gezüchtet. An angegebenen Zeitpunkten wurde ein geringer Anteil von Zellen mit Ultraschall bestrahlt, und die OD₆₀₀ wurde unter Verwendung eines Spektrophotometers gemessen.
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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isoliertes und gereinigtes Myotilinprotein, das die in SEQ ID NO:2 gezeigte Aminosäuresequenz umfasst, oder ein Fragment davon, das die Actinorganisierende Aktivität des Myotilinproteins hat.
Isolierte DNA-Sequenz, die das Myotilinprotein codiert, das die in SEQ ID NO:2 gezeigte Aminosäuresequenz umfasst.
Antikörper, der spezifisch mit dem Myotilinprotein oder einem Fragment davon nach Anspruch 1 reagiert.
Verwendung eines immunhistochemischen Färbemusters des Myotilinproteins oder eines Fragments davon nach Anspruch 1 zur Diagnose von Muskeldystrophien oder Cardiomyopathien, wobei ein mikroskopischer Schnitt von einer durch Muskelbiopsie von einem Patienten erhaltenen Probe immunohistochemisch für das Myotilinprotein angefärbt wird und dann verglichen wird mit dem immunhistochemischen Färbemuster des Myotilinproteins oder eines Fragments davon nach Anspruch 1.
Isolierte DNA-Sequenz nach Anspruch 2 zur Verwendung beim Nachweis von Mutationen im Myotilingen.
Verwendung des Myotilinproteins oder eines Fragments davon nach Anspruch 1 zur Herstellung von Verbindungen, die das Actin-Zytoskelett regulieren.
Verwendung des Myotilinproteins oder eines Fragments davon nach Anspruch 1 für die Herstellung von Verbindungen, die das Zellwachstum regulieren.
Verwendung des Myotilinproteins oder eines Fragments davon nach Anspruch 1 für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Krebs.
Verwendung des Myotilinproteins oder eines Fragments davon nach Anspruch 1 für die Herstellung eines antimikrobiellen Arzneimittels.
Arzneimittel zur Verwendung in der Hemmung von Krebszellenwachstum, umfassend das isolierte und gereinigte Myotilinprotein oder ein Fragment davon nach Anspruch 1.
Arzneimittel zur Verwendung in der Regulation des Actin-Zytoskeletts, umfassend das isolierte und gereinigte Myotilinprotein oder ein Fragment davon nach Anspruch 1.