DE69932804T2 - Protein, welches durch einen cystinknoten charakterisiert ist und verfahren zu dessen herstellung - Google Patents

Protein, welches durch einen cystinknoten charakterisiert ist und verfahren zu dessen herstellung Download PDF

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Description

  • In multizellulären Tieren werden das Wachstum, die Differenzierung und die Migration von Zellen von Polypeptid-Wachstumsfaktoren und Hormonen gesteuert. Diese Wachstumsfaktoren spielen sowohl bei der normalen Entwicklung als auch bei der Pathogenese eine Rolle, einschließlich der Entwicklung von festen Tumoren.
  • Polypeptid-Wachstumsfaktoren und Hormone beeinflussen zelluläre Ereignisse durch die Bindung an Rezeptoren an der Zelloberfläche. Die Bindung initiiert eine Kette von Signalereignissen innerhalb der Zelle, was letztendlich zu phenotypischen Veränderungen führt, so wie Zellteilung und Produktion von zusätzlichen Hormonen.
  • Eine Familie von Hormonen ist die Glykoprotein-Hormonfamilie, welche das luteinisierende Hormon, das Follikel stimulierende Hormon, das die Schilddrüse stimulierende Hormon sowie Choriongonadotropin einschließt. Die ersten drei werden in der vorderen Hypophyse synthetisiert, während Choriongonadotropin in der Plazenta synthetisiert wird, wobei die Synthese 10 bis 12 Wochen nach der Empfängnis ein Maximum erreicht und danach bis zum Ende der Schwangerschaft immer geringer wird.
  • Die vier Glykoproteinhormone sind strukturell und funktionell miteinander verwandt. Alle vier werden glykosyliert und bestehen aus zwei nicht kovalent assoziierten Untereinheiten, welche als α- und β-Untereinheiten bezeichnet werden. Alle vier Hormone haben eine einzelne α-Untereinheit gemeinsam, während die β-Untereinheiten einzigartig sind und biologische Spezifität verleihen. Die verschiedenen β-Untereinheiten weisen eine ähnliche Größe sowie ein signifikantes Maß an paarweiser Homologie auf; die β-Untereinheiten von humanem Choriongonadotropin (HCG) und humanem luteinisierenden Hormon sind zu 82% identisch und die anderen Paare von β-Untereinheiten sind zu etwa 30 bis 40% identisch: Von den vier β-Untereinheiten werden zwölf Cysteinreste konserviert. Die gemeinsame α-Untereinheit weist eine detektierbare Homologie zu den β-Untereinheiten auf und schließt sechs der zwölf konservierten Cysteinreste ein. Siehe Fiddes und Goodman, Nature 281:351–356, 1979; Fiddes und Goodman, Nature 286:684–687, 1980; Talmadge et al., Nature 307:37–40, 1984; sowie Pierce und Parsons, Ann. Rev. Biochem. 50:465–495, 1981. Die Polypeptide bilden charakteristische Strukturen höherer Ordnung mit einer Bow-Tie-ähnlichen Konfiguration um einen Cystinknoten, welcher durch Disulfidbindung zwischen den drei Paaren von Cysteinresten gebildet wird. Die Dimerisierung erfolgt durch hydrophobe Interaktionen zwischen Loops der beiden Monomere. Siehe Daopin et al., Science 257:369, 1992; Lapthorn et al., Nature 369:455, 1994.
  • Das Cystinknotenmotiv und die Bow-Tie-ähnliche Faltung sind ebenfalls charakteristisch für die Wachstumsfaktoren, welche den Wachstumsfaktor Beta (TGF-β), den Nervenwachstumsfaktor (NGF) sowie den Wachstumsfaktor PDGF (platelet derived growth factor) transformieren. Bei allen diesen Proteinen handelt es sich um Dimere in ihrer aktiven Formen, deren Monomeruntereinheiten zwischen 100 und 130 Aminosäurereste enthalten. Wenngleich ihre Aminosäuresequenzen ziemlich voneinander abweichen, enthalten alle diese Proteine, ebenso wie die Glykoproteinhormone, die sechs konservierte Cysteinreste des Cystinknotens.
  • Die Glykoproteinhormone wirken in einer stadiums- und gewebespezifischen Weise. LH, FSH und TSH werden in der Hypophyse produziert. Luteinisierendes Hormon stimuliert die Produktion von Steroid in den Testikeln und den Ovarien, was wiederum die Spermatogenese und die Ovulation stimuliert. FSH reguliert auch die Gametogenese sowie die Synthese von Steroidhormon in den Gonaden. TSH reguliert eine Reihe von Prozessen in der Schilddrüse und kontrolliert dadurch die Synthese und Sekretion von Schilddrüsenhormonen. HCG, welches in der Plazenta produziert wird, stimuliert die Ovarien, Steroide zu produzieren, welche zur Aufrechterhaltung der Schwangerschaft erforderlich sind. Zur Übersicht siehe Pierce und Parsons, Ann. Rev. Biochem. 50:465–495, 1981.
  • Von einem Mitglied dieser Familie, welches vor noch kürzerer Zeit entdeckt wurde und als Norrin oder NDP (Norrie Disease Protein) bezeichnet wird, wird angenommen, dass es die Differenzierung und Proliferation von neuralen Zellen reguliert (Berger et al., Nature Genetics 1:199–203, 1992). NDP wird in der Retina, in der Chorioidea sowie im fetalen und adulten Gehirn exprimiert. Ein Mangel an NDP wird mit dem Norrie-Syndrom assoziiert: eine mit dem X-Chromosom in Verbindung gebrachten Störung, welche durch Blindheit, Taubheit und mentale Störungen charakterisiert ist. Eine Reihe von Varianten des Proteins, einschließlich Deletionen und Punktmutationen, wurden in an dem Norrie-Syndrom leidenden Patienten identifiziert. Siehe z. B. Berger et al., ebenda.; Fuchs et al., Hum. Mol. Genet. 3:655–656, 1994; und Meindl et al., Nature Genetics 2:139–143, 1992.
  • Eine weitere Gruppe verwandter Proteine sind die Wachstums- und Differenzierungsfaktoren (growth and differentiation factors, GDFs). Ein Mitglied dieser Gruppe, bekannt als GDF-8 oder Myostatin, scheint die Muskelmasse negativ zu regulieren (McPherron und Lee, Nature 387:83–90, 1997; McPherron und Lee, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:12457–12461, 1997; und Grobet et al., Nat. Genet. 17:17–71, 1997). Viele GDFs weisen eine Sequenzhomologie von 20 bis 40% zueinander und zu TGF-β 1, 2 und 3 auf. Die Entdeckung der GDFs unterstützt die postulierte Existenz von "Chalonen", löslichen Faktoren, von welchen angenommen wird, dass sie die Größe und Regeneration von Organen steuern (Bullough, Cancer Res. 25:1683–1727, 1965; Bullough, Biol. Res. 37:307–342, 1992).
  • Aufgrund ihrer Rolle bei der Steuerung von zellulären Prozessen sind die Hormone sowohl geeignete Kandidaten als auch geeignete Targets für die therapeutische Intervention. Beispiele für solche therapeutisch verwendeten Proteine schließen Insulin zur Behandlung von Diabetes sowie Erythropoietin zur Behandlung von Anämie ein. Gonadotropin wird verwendet, um die Ovulation zu induzieren (z. B. Fleming, Am. J. Obstet. Gynecol. 159:376–381, 1988), die Absenkung kryptorchider Testikel in das Skrotum zu induzieren (Lala et al., J. Urol. 157:1898–1901, 1997) sowie die intratestikulare Testosteronproduktion bei Männern, welche sich einer Varikozelektomie unterzogen haben, zu stimulieren (Yamamoto et al., Arch. Androl. 35:49–55, 1995). Klinische Studien zeigten, dass hCG Antitumoraktivität gegen das Kaposi-Sarkom aufweisen kann (Gill et al., J. Natl. Cancer Inst. 89:1797–1802, 1997). Assays für die Präsenz von Choriongonadotropin werden zur Feststellung einer Schwangerschaft verwendet. Vakzinen gegen hCG zeigten in frühen Tests vielversprechende Resultate zur Verhinderung einer Schwangerschaft und zur Inhibition des Wachstums von hormonabhängigen Krebsarten (Talwar, Immunol. Cell Biol. 75:184–189, 1997).
  • Angesichts der erwiesenen klinischen Nützlichkeit von Hormonen besteht im Stand der Technik ein Bedarf an solchen Molekülen zur Verwendung als therapeutische Agenzien, diagnostische Agenzien sowie als Hilfsmittel und Reagenzien in der Forschung.
  • Die vorliegende Erfindung stellt solche Polypeptide für diese und weitere Verwendungen bereit, welche für den Fachmann anhand der hierin offenbarten Erkenntnisse offensichtlich sein sollten.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • In einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein isoliertes Polypeptid bereitgestellt, welches hinsichtlich der Aminosäuresequenz zu mindestens 80% identisch zu den Resten 1 bis einschließlich 106 aus SEQ ID NR: 2 ist. Das Polypeptid umfasst Cysteinreste an den Positionen, welche den Resten 8, 34, 38, 66, 96 und 98 aus SEQ ID NR: 2 entsprechen, einen Glycinrest an einer Position, welcher dem Rest 36 aus SEQ ID NR: 2 entspricht, sowie beta-Stränge, welche den Resten 9 bis 17, 29 bis 34, 38 bis 43, 59 bis 64, 67 bis 71 und 90 bis 95 aus SEQ ID NR: 2 entsprechen. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst das isolierte Polypeptid des weiteren Cysteinreste an den Positionen, welche den Resten 25, 65, 80 und 101 aus SEQ ID NR: 2 entsprechen. In einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei den Aminosäureresten innerhalb des Polypeptids an Positionen, welche den Resten 8, 11, 12, 14, 29, 30, 32, 34, 43, 44, 60, 63, 64, 65, 71, 74, 80, 90, 91, 93 und 94 aus SEQ ID NR: 2 entsprechen, jeweils um Cys, His, Pro, Asn, His, Val, Gln, Cys, Phe, Pro, Thr, Ser, Gln, Cys, Leu, Val, Cys, Ile, Phe, Ala und Arg; ein Aminosäurerest, welcher dem Rest 75 aus SEQ ID NR: 2 entspricht, ist Lys oder Arg. In anderen Ausführungsformen umfasst das isolierte Polypeptid die Reste 1 bis einschließlich 106 aus SEQ ID NR: 2 oder die Reste 1 bis einschließlich 106 aus SEQ ID NR: 29. In weiteren Ausführungsformen ist das isolierte Polypeptid kovalent mit einem Affinitäts-Tag oder einer konstanten Immunglobulinregion verknüpft.
  • In einem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein isoliertes Protein bereitgestellt, welches einen ersten Polypeptidkomplex zu einem zweiten Polypeptid umfasst, wobei besagtes Protein die Zellproliferation, die Zelldifferenzierung oder den Zellmetabolismus moduliert. Das erste Polypeptid ist hinsichtlich der Aminosäuresequenz zu mindestens 80% identisch zu den Resten 1 bis einschließlich 106 aus SEQ ID NR: 2 und umfasst Cysteinreste an Positionen, welche den Resten 8, 34, 38, 66, 96 und 98 aus SEQ ID NR: 2 entsprechen, einen Glycinrest an einer Position, welche dem Rest 36 aus SEQ ID NR: 2 entspricht, sowie beta-Stränge, welche den Resten 9 bis 17, 29 bis 34, 38 bis 43, 59 bis 64, 67 bis 71 und 90 bis 95 aus SEQ ID NR: 2 entsprechen. In einer Ausführungsform umfasst das erste Polypeptid des weiteren Cysteinreste an den Positionen, welche den Resten 25, 65, 80 und 101 aus SEQ ID NR: 2 entsprechen. In einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei den Aminosäureresten des ersten Polypeptids, welche den Resten 8, 11, 12, 14, 29, 30, 32, 34, 43, 44, 60, 63, 64, 65, 71, 74, 80, 90, 91, 93 und 94 aus SEQ ID NR: 2 entsprechen, jeweils um Cys, His, Pro, Asn, His, Val, Gln, Cys, Phe, Pro, Thr, Ser, Gln, Cys, Leu, Val, Cys, Ile, Phe, Ala und Arg; ein Aminosäurerest, welcher dem Rest 75 aus SEQ ID NR: 2 entspricht, ist Lys oder Arg. In einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei dem Protein um ein Heterodimer. In einer verwandten Ausführungsform handelt es sich bei dem zweiten Polypeptid um eine gemeinsame alpha-Untereinheit eines Glykoproteinhormons. In weiteren Ausführungsformen umfasst das erste Polypeptid die Reste 1 bis einschließlich 106 aus SEQ ID NR: 2 oder die Reste 1 bis einschließlich 106 aus SEQ ID NR: 29. In weiteren Ausführungsformen handelt es sich bei dem Protein um ein Homodimer, so wie ein Homodimer von Polypeptiden, umfassend die Reste 1 bis einschließlich 106 aus SEQ ID NR: 2 oder um ein Homodimer aus Polypeptiden, umfassend die Reste 1 bis einschließlich 106 aus SEQ ID NR: 29.
  • In einem dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein isoliertes Polynukleotid bereitgestellt, welches ein Polypeptid kodiert, welches hinsichtlich der Aminosäuresequenz zu mindestens 90% identisch zu den Resten 1 bis einschließlich 106 aus SEQ ID NR: 2 ist, wobei das Polypeptid Cysteinreste an Positionen, welche den Resten 8, 34, 38, 66, 96 und 98 aus SEQ ID NR: 2 entsprechen, einen Glycinrest an einer Position, welche dem Rest 36 aus SEQ ID NR: 2 entspricht, und beta-Strängen, welche den Resten 9–17, 29–34, 38–43, 59–64, 67–71 und 90 bis 95 aus SEQ ID NR: 2 entsprechen, umfasst. In einer Ausführungsform umfasst das Polypeptid des weiteren Cysteinreste an Positionen, welche den Resten 25, 65, 80 und 101 aus SEQ ID NR: 2 entsprechen. In einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei Aminosäureresten des Polypeptids, welche den Resten 8, 11, 12, 14, 29, 30, 32, 34, 43, 44, 60, 63, 64, 65, 71, 74, 80, 90, 91, 93 und 94 aus SEQ ID NR: 2 entsprechen, jeweils um Cys, His, Pro, Asn, His, Val, Gln, Cys, Phe, Pro, Thr, Ser, Gln, Cys, Leu, Val, Cys, Ile, Phe, Ala und Arg; ein Aminosäurerest, welcher dem Rest 75 aus SEQ ID NR: 2 entspricht, ist Lys oder Arg. In bestimmten zusätzlichen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfasst das Polypeptid die Reste 1 bis einschließlich 106 aus SEQ ID NR: 2 oder die Reste 1 bis einschließlich 106 aus SEQ ID NR: 29. In einer weiteren Ausführungsform kodiert das Polynukleotid des weiteren ein sekretorisches Peptid, welches mit dem Polypeptid operativ verknüpft ist. In zusätzlichen Ausführungsformen kodiert das Polynukleotid die Reste –23 bis einschließlich 106 aus SEQ ID NR: 2 oder die Reste –23 bis einschließlich 106 aus SEQ ID NR: 29. In weiteren Ausführungsformen umfasst das Polynukleotid eine Sequenz von Nukleotiden, wie in SEQ ID NR: 4 oder SEQ ID NR: 30 gezeigt, von Nukleotid 70 bis einschließlich Nukleotid 387. In weiteren Ausführungsformen umfasst das Polynukleotid eine Sequenz von Nukleotiden, wie in SEQ ID NR: 1 gezeigt, von Nukleotid 125 bis einschließlich Nukleotid 442. In einer zusätzlichen Ausführungsform weist das Polynukleotid eine Länge von 318 bis 1.000 Nukleotiden auf. Bei dem Polynukleotid kann es sich um DNA oder um RNA handeln.
  • In einem vierten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Expressionsvektor bereitgestellt, welcher die folgenden operativ miteinander verknüpften Elemente umfasst: (a) einen Transkriptionspromotor; (b) ein DNA-Segment, welches ein wie zuvor offenbartes Polypeptid kodiert; und (c) einen Transkriptionsterminator. In einer Ausführungsform kodiert das DNA-Segment des weiteren ein sekretorisches Peptid, welches operativ mit dem Polypeptid verknüpft ist. In weiteren Ausführungsformen kodiert das DNA-Segment die Reste –23 bis einschließlich 106 aus SEQ ID NR: 2 oder die Reste –23 bis einschließlich 106 aus SEQ ID NR: 29.
  • In einem fünften Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine kultivierte Zelle bereitgestellt, in welche ein wie zuvor offenbarter Expressionsvektor eingeführt wurde, wobei die Zelle das von dem DNA-Segment kodierte Polypeptid exprimiert. Die Zelle kann im Rahmen eines Verfahrens zur Herstellung eines Polypeptids verwendet werden, wobei das Verfahren das Kultivieren der Zelle, wodurch die Zelle das von dem DNA-Segment kodierte Polypeptid exprimiert, sowie die Gewinnung des exprimierten Polypeptids umfasst.
  • In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Antikörper bereitgestellt, welcher spezifisch an ein Epitop eines wie zuvor offenbarten Polypeptids bindet.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls ein Verfahren zur Detektion einer genetischen Abnormität in einem Patienten bereit, umfassend die folgenden Schritte: Inkubation der genetischen Probe mit einem Polynukleotid, welches wenigstens 14 aufeinanderfolgende Nukleotide aus SEQ ID NR: 1 umfasst, oder dem Komplement von SEQ ID NR: 1 unter Bedingungen, unter welchen das Polynukleotid an eine komplementäre Polynukleotidsequenz hybridisiert, um ein erstes Reaktionsprodukt zu erzeugen; Vergleich des ersten Reaktionsprodukts mit einem Kontrollreaktionsprodukt, wobei ein Unterschied zwischen dem ersten Reaktionsprodukt und dem Kontrollreaktionsprodukt eine genetische Abnormität in dem Patienten anzeigt.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls eine Oligonukleotidsonde oder einen Oligonukleotidprimer bereit, umfassend 14 aufeinanderfolgende Nukleotide eines Polynukleotids aus SEQ ID NR: 4 oder eine zu SEQ ID NR: 4 komplementäre Sequenz. In einer Ausführungsform umfasst die Sonde oder der Primer 14 aufeinanderfolgende Nukleotide eines Polynukleotids aus SEQ ID NR: 1 oder eine zu SEQ ID NR: 1 komplementäre Sequenz.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, welche ein wie zuvor offenbartes Polypeptid in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst.
  • Diese und weitere Aspekte der vorliegenden Erfindung werden unter Bezugnahme auf die folgende detaillierte Beschreibung der vorliegenden Erfindung und die angehängten Zeichnungen offensichtlich werden.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNG
  • Die Figur stellt ein Hydrophilieprofil gemäß Hopp/Woods der in SEQ ID NR: 2 gezeigten Aminosäuresequenz dar. Das Profil basiert auf einem verschiebbaren Fenster von sechs Resten. Verborgene G-, S- und T-Reste sowie exponierte H-, Y- und W-Reste wurden ignoriert. Diese Reste sind in der Figur durch die kleinen Buchstaben angezeigt.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Vor der detaillierten Darlegung der vorliegenden Erfindung kann es sich für das Verständnis derselben als hilfreich erweisen, die folgenden Begriffe zu definieren:
    Der Begriff "Affinitäts-Tag" wird hierin verwendet, um ein Polypeptidsegment zu bezeichnen, welches an einem zweiten Polypeptid befestigt sein kann, um für die Aufreinigung des zweiten Polypeptids zu sorgen oder Stellen zur Befestigung des zweiten Polypeptids an ein Substrat bereitzustellen. Im Prinzip kann jedes beliebige Peptid oder Protein, für welches ein Antikörper oder ein anderes spezifisches Bindungsagens verfügbar ist, als ein Affinitäts-Tag verwendet werden. Affinitäts-Tags schließen ein: Protein A (Nilsson et al., EMBO J. 4:1075, 1985; Nilsson et al., Methods Enrymol. 198:3, 1991), Glutathion S-Transferase (Smith und Johnson, Gene 67:31, 1988), Glu-Glu-Affinitäts-Tag (Grussenmeyer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:7952–7954, 1985), Substanz P, FlagTM-Peptid (Hopp et al., Biotechnology 6:1204–1210, 1988), Maltose bindendes Protein (Kellerman und Ferenci, Methods Enzymol. 90:459–463, 1982; Guan et al., Gene 67:21–30, 1987), Streptavidin bindendes Peptid, Thioredoxin, Ubiquitin, Zellulose bindendes Protein, T7-Polymerase, die konstante Domäne von Immunglobulin oder andere antigene Epitop- oder Bindungsdomänen. Siehe allgemein Ford et al., Protein Expression and Purification 2:95–107, 1991. DNAs, welche Affinitäts-Tags und andere Reagenzien kodieren, sind von kommerziellen Lieferanten zu beziehen (z. B. Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA; Eastman Kodak, New Haven, CT, USA; New England Biolabs, Beverly, MA, USA).
  • Der Begriff "allele Variante" wird hierin verwendet, um jede beliebige von zwei oder mehreren alternativen Formen eines Gens zu bezeichnen, welche den gleichen Chromosomenlokus besetzen. Allele Variation entsteht natürlicherweise durch Mutation und kann in phänotypischem Polymorphismus innerhalb von Populationen resultieren. Genmutationen können "silent" sein (keine Veränderung in dem kodierten Polypeptid) oder sie können Polypeptide mit veränderten Aminosäuresequenzen kodieren. Der Begriff der allelen Variante wird hierin ebenfalls dazu verwendet, ein von einer allelen Variante eines Gens kodiertes Protein zu bezeichnen.
  • Die Begriffe "aminoterminal" und "carboxylterminal" werden hierin verwendet, um die Positionen innerhalb von Polypeptiden zu bezeichnen. Wo es der Kontext zulässt, werden diese Begriffe in Bezug auf eine bestimmte Sequenz oder einen bestimmten Abschnitt eines Polypeptids verwendet, um die Proximität oder die relative Position zu bezeichnen. Beispielsweise ist eine bestimmte innerhalb eines Polypeptids carboxylterminal zu einer Referenzsequenz positionierte Sequenz proximal zu dem Carboxylterminus der Referenzsequenz gelegen, befindet sich jedoch nicht notwendigerweise am Carboxylterminus des kompletten Polypeptids.
  • Eine "beta-Strang-artige Region" ist eine Region eines Proteins, welche durch bestimmte Kombinationen der zweiflächigen Winkel Phi (ϕ) und Psi (Ψ) des Polypeptidrückgrats charakterisiert ist. Regionen, in denen φ weniger als –60° und Ψ mehr als 90° betragen, sind beta-Strang-artig. Der Fachmann wird erkennen, dass die Begrenzungen eines β-Strangs etwas unpräzise sind und sich in Abhängigkeit von den zu ihrer Definition verwendeten Kriterien verändern können. Siehe z. B. Richardson und Richardson in Fasman, ed., Prediction of Protein Structure and the Principles of Protein Conformation, Plenum Press, New York, USA, 1989; und Lesk, Protein Architecture: A Practical Approach, Oxford University Press, New York, USA, 1991.
  • Ein "Komplement" eines Polynukleotidmoleküls ist ein Polynukleotidmolekül mit einer komplementären Basensequenz und reverser Orientierung im Vergleich zu einer Referenzsequenz. So ist z. B. die Sequenz 5' ATGCACGGG 3' komplementär zu 5' CCCGTGCAT 3'.
  • Eine Vielzahl von Polypeptidketten sind "miteinander komplexiert", wenn sie, kovalent (z. B. durch Disulfidbindung) oder nicht kovalent (z. B. durch Wasserstoffbrückenbindung, hydrophobe Interaktionen oder Salzbrückeninteraktionen), assoziiert sind, um ein Protein mit einer charakteristischen biologischen Aktivität zu bilden.
  • "Entsprechend", sofern in Bezug auf eine Nukleotid- oder Aminosäuresequenz verwendet, zeigt die Position in einer zweiten Sequenz an, welche sich nach der Referenzposition ausrichtet, wenn zwei Sequenzen optimal ausgerichtet sind.
  • Der Begriff "degenerierte Nukleotidsequenz" bezeichnet eine Sequenz von Nukleotiden, welche eines oder mehrere degenerierte Codons einschließt (im Vergleich zu einem Referenzpolynukleotidmolekül, welches ein Polypeptid kodiert). Degenerierte Codons enthalten verschiedene Tripletts von Nukleotiden, kodieren jedoch den gleichen Aminosäurerest (d.h. GAU- und GAC-Tripletts kodieren jeweils Asp).
  • Der Begriff "Expressionsvektor" wird verwendet, um ein lineares oder ringförmiges DNA-Molekül zu bezeichnen, welches ein Segment umfasst, welches ein relevantes Polypeptid kodiert, welches mit zusätzlichen Segmenten, welche für seine Transkription sorgen, operativ verknüpft ist. Solche zusätzlichen Segmente schließen Promotor- und Terminatorsequenzen ein und können ebenfalls einen oder mehrere Replikationsorigins, einen oder mehrere selektierbare Marker, einen Enhancer, ein Polyadenylierungssignal und dergleichen enthalten. Expressionsvektoren sind im allgemeinen abgeleiten von Plasmid- oder viraler DNA oder sie können Elemente von beiden enthalten.
  • Der Begriff "isoliert", sofern er auf ein Polynukleotid angewandt wird, bedeutet, dass das Polynukleotid aus seinem natürlichen genetischen Milieu entfernt wurde und daher frei von weiteren fremden oder unerwünschten Kodierungssequenzen ist und dass es in einer Form vorliegt, welche geeignet für die Verwendung innerhalb gentechnisch veränderter Systeme zur Proteinproduktion ist. Solche isolierten Moleküle sind diejenigen, welche von ihrer natürlichen Umgebung getrennt wurden und schließen cDNA und genomische Klone ein. Isolierte DNA-Moleküle der vorliegenden Erfindung sind frei von. anderen Genen, mit denen sie im Normalfall assoziiert werden, können jedoch natürlich vorkommende 5'- und 3'-untranslatierte Regionen so wie Promotoren und Terminatoren einschließen. Die Identifizierung von assoziierten Regionen wird für den Fachmann offensichtlich sein (siehe z. B. Dynan und Tijan, Nature 316:774–78, 1985).
  • Ein "isoliertes" Polypeptid oder Protein ist ein Polypeptid oder Protein, welches in einem sich von seiner nativen Umgebung unterscheidenden Zustand zu finden ist, so wie getrennt von Blut und tierischem Gewebe. In einer bevorzugten Form ist das isolierte Polypeptid oder Protein im wesentlichen frei von anderen Polypeptiden oder Proteinen, insbesondere von anderen Polypeptiden oder Proteinen tierischen Ursprungs. Es wird bevorzugt, die Polypeptide oder Proteine in einer in höchstem Maße aufgereinigten Form bereitzustellen, d.h. eine Reinheit größer als 95%, mehr bevorzugt größer als 99%. Wenn in diesem Zusammenhang verwendet, schließt der Begriff "isoliert" die Präsenz des gleichen Polypeptids oder Proteins in alternativen physikalischen Formen, so wie als Dimere oder alternativ in glykosylierten oder derivatisierten Formen, nicht aus.
  • "Operativ verknüpft", sofern es sich auf DNA-Segmente bezieht, bedeutet, dass die Segmente so angeordnet sind, dass sie in konzertierter Weise ihrem beabsichtigten Zweck dienen, z. B. beginnt die Transkription in dem Promotor und setzt sich durch das Kodierungssegment zum Terminator fort.
  • Der Begriff "Ortholog" bezeichnet ein Polypeptid oder Protein, welches aus einer Spezies erhalten wird, welche das funktionelle Gegenstück eines Polypeptids oder Proteins einer anderen Spezies darstellt. Sequenzunterschiede unter Orthologen sind das Ergebnis der Artenbildung.
  • Ein "Polynukleotid" ist ein einzel- oder doppelsträngiges Polymer aus vom 5'- bis zum 3'-Ende gelesenen Desoxyribonukleotid- oder Ribonukleotidbasen. Polynukleotide schließen RNA und DNA ein und können aus natürlichen Quellen isoliert, in vitro synthetisiert oder aus einer Kombination von natürlichen und synthetischen Molekülen hergestellt werden. Die Größen der Polynukleotide wird in Form von Basenpaaren (abgekürzt "bp"), Nukleotiden ("nt") oder Kilobasen ("kb") ausgedrückt. Wo es der Kontext gestattet, können die beiden letzteren Begriffe Polynukleotide beschreiben, welche einzelsträngig oder doppelsträngig sind. Wird der Begriff auf doppelsträngige Moleküle angewandt, so wird er dazu verwendet, die gesamte Länge zu bezeichnen und wird als gleichbedeutend mit dem Begriff "Basenpaare" verstanden. Der Fachmann wird erkennen, dass die beiden Stränge eines doppelsträngigen Polynukleotids sich hinsichtlich der Länge geringfügig unterscheiden können und dass dessen Enden als Folge der enzymatischen Spaltung gegeneinander versetzt sein können; folglich können nicht alle Nukleotide innerhalb eines doppelsträngigen Polynukleotidmoleküls miteinander gepaart werden. Solche ungepaarten Enden werden im allgemeinen eine Länge von 20 nt nicht überschreiten.
  • Ein "Polypeptid" ist ein Polymer aus durch Peptidbindungen verbundenen Aminosäureresten, entweder natürlich oder synthetisch produziert. Polypeptide aus weniger als etwa 10 Aminosäureresten werden herkömmlicherweise als "Peptide" bezeichnet.
  • Der Begriff "Promotor" wird hierin aufgrund seiner in der Fachwelt anerkannten Bedeutung verwendet, um einen Abschnitt eines Gens, welches DNA-Sequenzen enthält, welche für die Bindung von RNA-Polymerase und die Initiation der Transkription sorgen, zu bezeichnen.
  • Promotorsequenzen sind herkömmlicherweise, aber nicht immer, in den 5'-nicht kodierenden Regionen von Genen zu finden.
  • Ein "Protein" ist ein Makromolekül, welches eine oder mehrere Polypeptidketten umfasst. Ein Protein kann ebenfalls nicht peptidische Komponenten umfassen, so wie Kohlenhydratgruppen. Kohlenhydrate und andere nicht peptidische Substituenten können durch die Zelle, in welcher das Protein produziert wird, zu einem Protein hinzugefügt werden und werden je nach dem Zelltyp unterschiedlich sein. Proteine werden hierin in Hinsicht auf ihre Aminosäurerückgratstrukturen definiert; Substituenten so wie Kohlenhydratgruppen werden im allgemeinen nicht spezifiziert, können jedoch trotzdem anwesend sein.
  • Eine "sekretorische Signalsequenz" ist eine DNA-Sequenz, welche ein Polypeptid (ein "sekretorisches Peptid") kodiert, welches, als eine Komponente eines größeren Polypeptids, das größere Polypeptid durch einen sekretorischen Weg einer Zelle steuert, in welcher es synthetisiert wird. Das größere Polypeptid wird herkömmlicherweise gespalten, um das sekretorische Peptid während des Transits durch den sekretorischen Weg zu entfernen.
  • Mittels unpräziser analytischer Verfahren (z. B. der Gelelektrophorese) bestimmte Molekulargewichte und Längen von Polymeren werden als Näherungswerte verstanden. Wird ein solcher Wert als "etwa x" oder "annähernd x" ausgedrückt, so wird der genannte Wert von x als ± 10% genau verstanden.
  • Alle hierin zitierten Referenzen werden in ihrer Gesamtheit durch Bezugnahme Gegenstand der vorliegenden Anmeldung.
  • Die vorliegende Erfindung basiert zum Teil auf der Entdeckung eines neuartigen DNA-Moleküls, welches ein Polypeptid mit einem sekretorischen Peptid und einer Anordnung von Cysteinresten und beta-Strang-artigen Regionen kodiert, welches charakteristisch für die Gonadotropinfamilie von Glykoproteinhormonen ist. Das DNA-Molekül wurde ursprünglich in einer Bibliothek von cDNAs identifiziert, welche von Inselzellen aus dem Pankreas abgeleitet waren. Eine Northern Blot-Analyse der Gewebeverteilung der mRNA, welche diese neuartigen DNA entsprach, zeigte, dass die Expression im Pankreas am höchsten war, mit niedrigeren Expressionsniveaus in der Hypophyse, den Testikeln und dem Auge. Das Polypeptid wurde "zsig5l" genannt.
  • Die Analyse der zsig51-Sequenz zeigt an, dass das Polypeptid Homomultimere oder Heteromultimere bilden kann, welche die Proliferation, die Differenzierung oder den Metabolismus von Zellen modulieren könnten. Mitglieder dieser Familie von Proteinen regulieren die Entwicklung und Regeneration eines Organs, das Organwachstum nach der Entwicklungsphase sowie die Erhaltung des Organs.
  • SEQ ID NR: 2 ist die Sequenz eines repräsentativen Polypeptids der vorliegenden Erfindung. Eine Analyse der Aminosäuresequenz zeigt an, dass die Reste –23 bis einschließlich –1 ein sekretorisches Peptid bilden, wobei das reife Polypeptid bei dem Rest 1 (Gln) beginnt und sich durch Rest 106 (Tyr) hindurch fortsetzt. SEQ ID NR: 2 weist eine signifikante Homologie zu den Gonadotropin- und Norrie-Syndrom-Unterfamilien der C-terminalen Cystinknotenproteine auf. Eine Sequenzausrichtung zeigt die Konservierung von Cys-Resten an den Positionen 8, 25, 34, 38, 65, 66, 80, 96, 98 und 101, wobei die Cys-Reste an den Positionen 8, 34, 38, 66, 96 und 98 den höchsten Grad der Konservierung innerhalb der Familie aufweisen. Eine weitere Analyse legt die Paarung (Ausbildung von Disulfidbindungen) der Cys-Reste 8 und 66, 34 und 96 sowie 38 und 98 zur Bildung des Cystinknotens nahe. Die Cys-Reste an den Positionen 25, 65, 80 und 101 können intra- oder intermolekulare Disulfidbindungen bilden. Der Gly-Rest an Position 36 ist ebenfalls in höchstem Maße konserviert. Diese Anordnung von nicht konservierte Resten kann durch die Formel Cys-Xaa25-33-Cys-Xaa-Gly-Xaa-Cys-Xaa15-33-Cys-Xaa20-33-Cys-Xaa-Cys (SEQ ID NR: 3) dargestellt werden, wobei jedes Xaa eine Aminosäure darstellt und die Subskripte die Anzahl der Reste bezeichnen. Konsens-Kohlenhydrat-Additionsstellen befinden sich an den Resten 14 bis 17 und 58 bis 61.
  • Die Struktur höherer Ordnung von zsig51-Polypeptiden kann mittels Computeranalyse unter Verwendung von erhältlicher Software vorausgesagt werden (z. B. der Insight II Viewer sowie Homology Modeling Tools; Molecular Simulations, Inc., San Diego, CA, USA). Die Analyse der SEQ ID NR: 2 sagt voraus, dass die Sekundärstruktur von dem Cystinknoten dominiert wird, welcher variable beta-Strang-artige Regionen und Loops zu einer Bow-Tie-ähnlichen Struktur zusammenbindet. Die ungefähren Begrenzungen der beta-Strang-artigen Regionen sind: Strang 1, Reste 9 bis 17; Strang 2, Reste 29 bis 34; Strang 3, Reste 38 bis 43; Strang 4, Reste 59 bis 64; Strang 5, Reste 67 bis 71; Strang 6, Reste 90 bis 95. Die Bow-Tie-Struktur wird gebildet als: Aminoterminus zu Cystinknoten → beta-Strang 1 → variable Loop 1 → beta-Strang 2 → Cystinknoten → beta-Strang 3 → variable Loop 2 → beta-Strang 4 → Cystinknoten → beta-Strang 5 → variable Loop 3 → beta-Strang 6 Cystinknoten. Die variable Loop 1 ist mittels einer Disulfidbindung mit der variablen Loop 2 verbunden und bildet so die eine Seite der Bow-Tie, wobei die variable Loop 3 die andere Seite bildet.
  • Die strukturelle Analyse und die Homologe zeigen an, dass zsig51-Polypeptide mit einem zweiten Polypeptid komplexieren, um multimere Proteine zu bilden. Diese Proteine schließen Homodimere und Heterodimere ein. Im letzteren Fall kann das zweite Polypeptid eine gekürzte oder anderweitige Variante des zsig51-Polypeptids oder ein anderes Polypeptid sein, so wie eine Glykoproteinhormonuntereinheit, ein TGF-β-Polypeptid, ein GDF-Polypeptid oder ein BMP (Bone Morphogenic Protein)-Polypeptid. Unter den dimeren Proteinen der vorliegenden Erfindung finden sich Dimere, welche durch nicht kovalente Assoziation (z. B. hydrophobe Interaktionen) mit einer zweiten Untereinheit gebildet werden, entweder einem zweiten zsig51-Polypeptid oder einer zweiten Untereinheit, so wie einer gemeinsamen α-Untereinheit. Innerhalb dieser Dimere interagieren die Loops 1 und 3 des Monomers 1 mit der Loop 2 des Monomers 2 sowie die Loop 2 des Monomers 1 mit den Loops 1 und 3 des Monomers 2. Darüber hinaus kann die Dimerisierung über intermolekulare Bildung von Disulfidbindungen erfolgen. Die Ausrichtung mit TGF- zeigt an, dass Cys-65 an einer intermolekularen Disulfidbindung beteiligt sein kann.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls isolierte Polypeptide bereit, welche im wesentliche homolog zu den Polypeptiden aus SEQ ID NR: 2 sind, sowie deren Orthologe. Solche Polypeptide werden vorzugsweise zu wenigstens 95% oder mehr zu den Resten 1 bis 106 aus SEQ ID NR: 2 oder deren Orthologen identisch sein. Die prozentuale Sequenzidentität wird mittels gebräuchlicher Verfahren bestimmt. Siehe z. B. Altschul et al., Bull. Math. Bio. 48:603–616, 1986, sowie Henikoff und Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. LISA 89:10915–10919, 1992. Kurz gesagt werden zwei Aminosäuresequenzen ausgerichtet, um die Ausrichtungsergebnisse zu optimieren, unter Verwendung einer Gap-Opening-Penalty von 10, einer Gap-Extension-Penalty von 1 sowie der "BLOSUM62"-Scoring-Matrix gemäß Henikoff und Henikoff (ebenda), wie in Tabelle 1 gezeigt (Aminosäuren werden durch die standardgemäßen aus einem Buchstaben bestehenden Codes angezeigt). Die prozentuale Identität wird dann berechnet als:
  • Figure 00150001
  • Figure 00160001
  • Der Grad der Identität zwischen Aminosäuresequenzen kann unter Verwendung des "FASTA"-Ähnlichkeits-Suchalgorithmus gemäß Pearson und Lipman (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988) sowie Pearson (Meth. Enzymol. 183:63, 1990) bestimmt werden. Kurz gesagt charakterisiert FASTA zunächst die Sequenzähnlichkeit, indem es die Regionen identifiziert, welche die gesuchte Sequenz (z. B. SEQ ID NR: 2) und eine Testsequenz gemeinsam aufweisen und welche entweder die höchste Dichte an Übereinstimmungen (wenn die Variable ktup = 1) oder an Paaren von Übereinstimmungen (wenn ktup = 2) aufweisen, ohne dass dabei die konservativen Aminosäuresubstitutionen, -insertionen oder -deletionen berücksichtigt werden. Die zehn Regionen mit der höchsten Dichte an Übereinstimmungen werden dann neu bewertet, indem die Ähnlichkeit aller gepaarten Aminosäuren unter Verwendung einer Aminosäuresubstitutionsmatrix verglichen wird und die Enden dieser Regionen so "getrimmt" werden, dass sie nur die Reste einschließen, welche zu dem höchsten Ergebnis beitragen. Falls es mehrere Regionen gibt, deren Ergebnis über dem "Cutoff"-Wert (berechnet mittels einer vorbestimmten Formel basierend auf der Länge der Sequenz und dem ktup-Wert) liegt, so werden die getrimmten Anfangsregionen untersucht, um zu bestimmen, ob die Regionen so miteinander verbunden werden können, dass sie eine ungefähre Ausrichtung mit Lücken ergeben. Schließlich werden die Regionen der beiden Aminosäuresequenzen, welche die höchsten Ergebnisse aufweisen, unter Verwendung einer Modifikation des Algorithmus gemäß Needleman-Wunsch-Sellers ausgerichtet (Needleman und Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 444, 1970; Sellers, SIAM J. Appl. Math. 26:787, 1974), welcher die Aminosäureinsertionen und -deletionen in Betracht zieht. Illustrative Parameter für die FASTA-Analyse sind: ktup = 1, Gap-Opening-Penalty = 10, Gap-Extension-Penalty = 1 und Substitutionsmatrix = BLOSUM62. Diese Parameter können in ein FASTA-Programm eingebracht werden, indem man die Datei der Scoring-Matrix ("SMATRIX") modifiziert, wie in Appendix 2 von Pearson, 1990 (ebenda), erläutert wird.
  • FASTA kann auch dazu verwendet werden, die Sequenzidentität von Nukleinsäuremolekülen unter Verwendung eines wie zuvor offenbarten Verhältnisses zu bestimmen. Für Vergleiche der Nukleotidsequenzen kann der ktup-Wert zwischen eins und sechs liegen, vorzugsweise zwischen vier und sechs.
  • Die vorliegende Erfindung schließt Polypeptide ein, welche eine oder mehrere konservative Aminosäureveränderungen im Vergleich zu der Aminosäuresequenz aus SEQ ID NR: 2 aufweisen. Die BLOSUM62-Matrix (Tabelle 1) ist eine Aminosäuresubstitutionsmatrix, welche von etwa 2.000 lokalen multiplen Ausrichtungen von Proteinsequenzsegmenten abgeleitet ist und die in höchstem Maße konservierten Regionen von mehr als 500 Gruppen von verwandten Proteinen repräsentiert (Henikoff und Henikoff, ebenda). Folglich können die BLOSUM62-Substitutionsfrequenzen dazu verwendet werden, die konservativen Aminosäuresubstitutionen zu identifizieren, welche in die Aminosäuresequenzen der vorliegenden Erfindung eingeführt werden können. Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff "konservative Aminosäuresubstitution" auf eine Substitution, welche durch einen BLOSUM62-Wert höher als –1 repräsentiert wird. Beispielsweise ist eine Aminosäuresubstitution dann konservativ, wenn die Substitution durch einen BLOSUM62-Wert von 0, 1, 2 oder 3 gekennzeichnet ist. Bevorzugte konservative Aminosäuresubstitutionen sind durch einen BLOSUM62-Wert von wenigstens einer 1 (z. B. 1, 2 oder 3) gekennzeichnet, während mehr bevorzugte konservative Aminosäuresubstitutionen durch einen BLOSUM62-Wert von wenigstens 2 (z. B. 2 oder 3) gekennzeichnet sind.
  • Im wesentlichen homologe Proteine und Polypeptide sind dadurch gekennzeichnet, dass sie eine oder mehrere Aminosäuresubstitutionen, -deletionen oder -additionen aufweisen. Diese Veränderungen sind vorzugsweise ihrem Wesen nach geringfügig, d.h. es handelt sich um konservative Aminosäuresubstitutionen und andere Veränderungen, welche die Faltung oder die Aktivität des Proteins oder Polypeptids nicht signifikant beeinträchtigen und amino- oder carboxylterminale Extensionen einschließen, so wie einen aminoterminalen Methioninrest, ein kleines Linkerpeptid von bis zu etwa 20 bis 25 Resten oder eine Extension, welche die Aufreinigung (ein Affinitäts-Tag), wie zuvor offenbart, ermöglicht. Proteine, welche solche Extensionen aufweisen, werden vorzugsweise eine Region umfassen, welche zu wenigstens 95% zu den Resten 1 bis einschließlich 106 aus SEQ ID NR: 2 oder einem Ortholog davon identisch sind.
  • Die vorliegende Erfindung stellt des weiteren eine Vielzahl von weiteren Polypeptidfusionen und verwandten multimeren Proteinen bereit, welche eine oder mehrere Polypeptidfusionen umfassen. So kann z. B. ein zsig51-Polypeptid als eine Fusion an ein dimerisierendes Protein präpariert werden, wie offenbart in den U.S. Patenten Nrs. 5,155,027 und 5,567,584. In dieser Hinsicht bevorzugte dimerisierende Proteine schließen Domänen der konstanten Region von Immunglobulin ein. Immunglobulin-zsig51-Polypeptidfusionen können in gentechnisch veränderten Zellen exprimiert werden, um eine Vielzahl von multimeren zsig51-Analoga zu produzieren. Es können Hilfsdomänen an zsig51-Polypeptide fusioniert werden, um sie auf spezifische Zellen, Gewebe oder Makromoleküle (z. B. Kollagen) zu zielen. Beispielsweise kann ein zsig51-Polypeptid oder -Protein auf einen vorbestimmten Zelltyp zielgerichtet werden, indem man ein zsig51-Polypeptid an einen Liganden fusioniert, welcher spezifisch an einen Rezeptor auf der Oberfläche der Targetzelle bindet. Auf diese Weise können Polypeptide und Proteine zu therapeutischen oder diagnostischen Zwecken zielgerichtet werden. Ein zsig51-Polypeptid kann an zwei oder mehrere Reste fusioniert werden, so wie einen Affinitäts-Tag zur Aufreinigung und eine Targetdomäne. Polypeptidfusionen können ebenfalls eine oder mehrere Spaltungsstellen aufweisen, insbesondere zwischen Domänen. Siehe Tuan et al., Connective Tissue Research 34:1–9, 1996.
  • Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung können ebenfalls nicht natürlich vorkommende Aminosäurereste umfassen. Nicht natürlich vorkommende Aminosäure schließen, ohne Einschränkung, ein: Trans-3-Methylprolin, 2,4-Methanprolin, Cis-4-Hydroxyprolin, Trans-4-Hydroxyprolin, N-Methylglycin, Allothreonin, Methylthreonin, Hydroxyethylcystein, Hydroxyethylhomocystein, Nitroglutamin, Homoglutamin, Pipecolinsäure, Tert-leucin, Norvalin, 2-Azaphenylalanin, 3-Azaphenylalanin, 4-Azaphenylalanin sowie Fluorphenylalanin. Im Stand der Technik sind verschiedene Verfahren zum Einbau von nicht natürlich vorkommenden Aminosäureresten in Proteine bekannt. Beispielsweise kann ein in-vitro-System verwendet werden, wobei Nonsense-Mutationen unter Verwendung von chemisch aminoacylierten Suppressor-tRNAs, einem E. coli-S30-Extrakt sowie im Handel erhältlichen Enzymen und anderen Reagenzien unterdrückt werden. Siehe z. B. Robertson et al., J. Am. Chem. Soc. 113:2722, 1991; Ellman et al., Methods Enzymol. 202:301, 1991; Chung et al., Science 259:806–809, 1993; und Chung et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10145–10149, 1993). In einem zweiten Verfahren erfolgt die Translation in Xenopus Oozyten durch Mikroinjektion von mutierter mRNA und chemisch aminoacylierten Suppressor-tRNAs (Turcatti et al., J. Biol. Chem. 271:19991–19998, 1996). Im Rahmen eines dritten Verfahrens werden E. coli-Zellen in der Abwesenheit einer zu ersetzenden natürlichen Aminosäure (z. B. Phenylalanin) und in der Anwesenheit der erwünschten nicht natürlich vorkommenden Aminosäure(n) (z. B. 2-Azaphenylalanin, 3-Azaphenylalanin, 4-Azaphenylalanin oder 4-Fluorphenylalanin) kultiviert. Siehe Koide et al., Biochem. 33:7470–7476, 1994. Natürlich vorkommende Aminosäurereste können durch chemische Modifikation in vitro in nicht natürlich vorkommende Spezies umgewandelt werden. Die chemische Modifikation kann mit stellengerichteter Mutagenese kombiniert werden, um den Bereich der Substitutionen zu erweitern (Wynn und Richards, Protein Sci. 2:395–403, 1993).
  • Veränderungen in der Aminosäuresequenz werden in zsig51-Polypeptiden so vorgenommen, dass sie die Zerstörung von Strukturen höherer Ordnung minimieren, welche von essentieller Bedeutung für die biologische Aktivität sind. Veränderung in Aminosäureresten werden so vorgenommen werden, dass sie den Cystinknoten und die "Bow-Tie"-förmige Anordnung von Loops nicht zerstören, welche charakteristisch für die Proteinfamilie sind. Die Auswirkungen von Veränderungen in der Aminosäuresequenz können mittels Modellierung am Computer, wie zuvor offenbart, vorausgesagt oder mittels Analyse der Kristallstruktur bestimmt werden (siehe z. B. Lapthorn et al., ebenda). Ein Hydrophobieprofil von SEQ ID NR: 2 ist in der angehängten Figur gezeigt. Der Fachmann wird erkennen, dass diese Hydrophobie in Betracht gezogen wird, wenn Veränderungen in der Aminosäuresequenz eines zsig51-Polypeptids konstruiert werden, so dass das gesamte Profil nicht zerstört wird. Die Ausrichtung von zsig51 mit anderen Mitgliedern der Familie stellt ebenfalls eine Anleitung zur Auswahl von Aminosäuresubstitutionen bereit, insbesondere wenn Informationen über die Auswirkungen der Aminosäuresubstitutionen in anderen Mitgliedern der Familie verfügbar sind. Beispielsweise legt die Ausrichtung nahe, dass der Rest 95 (Ala) durch Ser ersetzt werden kann. Diese Variante der Sequenz ist in SEQ ID NR: 29 gezeigt. Die Ausrichtung mit NDP, unter Berücksichtigung der angezeigten gesundheitsschädlichen Mutationen, zeigt an, dass die Reste 8, 11, 12, 14, 29, 30, 32, 34, 43, 44, 60, 63, 64, 65, 71, 74, 75, 80, 90, 91, 93 und 94 sich als relativ intolerant gegenüber der Substitution oder Deletion erweisen können. Der Rest 75 (Lys in SEQ ID NR: 2) kann konservativ durch Arg ersetzt werden. Die Region von zsig51, welche sich vom vorletzten Cys-Rest bis hin zum Carboxylterminus erstreckt (Reste 98 bis 106 aus SEQ ID NR: 2) kann von Bedeutung für die Rezeptorspezifität sein.
  • Essentielle Aminosäuren in den Polypeptiden der vorliegenden Erfindung können gemäß im Stand der Technik bekannten Verfahren identifiziert werden, so wie die stellengerichtete Mutagenese oder die Alanin-Scanning-Mutagenese (Cunningham und Wells, Science 244:1081–1085, 1989; Bass et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4498–4502, 1991). Multiple Aminosäuresubstitutionen können durchgeführt und getestet werden unter Verwendung von bekannten Verfahren der Mutagenese und des Screening, so wie offenbart von Reidhaar-Olson und Sauer (Science 241:53–57, 1988) oder Bowie und Sauer (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2152–2156, 1989). Andere Verfahren, welche angewandt werden können, schließen das Phagendisplay (z. B. Lowman et al., Biochem. 30:10832–10837, 1991; Ladner et al., U.S. Patent Nr. 5,223,409; Huse, WIPO-Veröffentlichung WO 92/06204) und die regionsgerichtete Mutagenese (Derbyshire et al., Gene 46:145, 1986; Ner et al., DNA 7:127, 1988) ein.
  • Varianten der offenbarten zsig51-DNA- und -Polypeptid-Sequenzen können mittels DNA-Shuffling erzeugt werden, wie von Stemmer, Nature 370:389–391, 1994 und Stemmer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747–10751, 1994, offenbart wurde. Kurz gesagt, Varianten von Genen werden erzeugt mittels homologer Rekombination in vitro durch zufällige Fragmentierung eines Elterngens gefolgt von der Wiederzusammensetzung unter Verwendung von PCR, was zu zufällig eingeführten Punktmutationen führt.
  • Die wie zuvor offenbarten Mutageneseverfahren können mit Screeningverfahren mit hohem Volumen oder mit hohem Durchsatz kombiniert werden, um die biologische Aktivität von Varianten der zsig51-Polypeptide zu detektieren, insbesondere die biologische Aktivität bei der Modulation der Zellproliferation oder der Zelldifferenzierung. Beispielsweise können Mitogenese-Assays, welche die Aufnahme von Farbstoffen oder die Aufnahme von 3H-Thymidin messen, in großen Anzahlen von Proben durchgeführt werden, ebenso wie auf Zellen basierende Assays, welche die Expression eines Reportergens (z. B. eines Luziferase-Gens) detektieren. Diese und weitere Assays werden im Nachfolgenden detaillierter offenbart. Mutagenisierte DNA-Moleküle, welche aktive zsig51-Polypeptide kodieren, können aus den Wirtszellen gewonnen und unter Verwendung von moderner Ausstattung schnell sequenziert werden. Diese Verfahren gestatten die schnelle Bestimmung der Bedeutung von einzelnen Aminosäureresten in einem relevanten Polypeptid und sie können auf Polypeptide mit unbekannter Struktur angewandt werden.
  • Unter Verwendung der zuvor besprochenen Verfahren kann der durchschnittliche Fachmann eine Vielzahl von Polypeptiden, welche im wesentliche homolog zu den Resten 1 bis einschließlich 106 aus SEQ ID NR: 2 oder allelen Varianten oder Orthologen davon sind, identifizieren und/oder herstellen und dabei die biologischen Eigenschaften des Wildtypproteins beibehalten. Solche Polypeptide können ebenfalls zusätzliche Polypeptidsegmente einschließen, wie zuvor im allgemeinen offenbart.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls Polynukleotidmoleküle einschließlich DNA- und RNA-Molekülen bereit, welche die zuvor offenbarten zsig51-Polypeptide kodieren. Der Fachmann wird ohne weiteres erkennen, dass hinsichtlich der Degeneration des genetischen Codes eine beträchtliche Sequenzabweichung unter diesen Polynukleotidmolekülen möglich ist. SEQ ID NR: 4 ist eine degenerierte DNA-Sequenz, welche alle DNAs umfasst, welche das zsig51-Polypeptid aus SEQ ID NR: 2 kodieren. Der Fachmann wird erkennen, dass die degenerierte Sequenz aus SEQ ID NR: 4 durch Substitution von U für T ebenfalls alle RNA-Sequenzen bereitstellt, welche SEQ ID NR: 2 kodieren. Folglich werden Polynukleotide, welche zsig51-Polypeptid kodieren und die Nukleotide 70 bis 387 aus SEQ ID NR: 4 und deren RNA-Äquivalente umfassen, von der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen. Eine degenerierte Sequenz, welche SEQ ID NR: 29 kodiert, ist in SEQ ID NR: 30 gezeigt. Tabelle 2 bedient sich der in SEQ ID NR: 4 und SEQ ID NR: 30 verwendeten aus einem Buchstaben bestehenden Codes, um degenerierte Nukleotidpositionen zu bezeichnen. "Resolutionen" sind die mit einem Code-Buchstaben bezeichneten Nukleotide. "Komplement" benennt den Code für das komplementäre Nukleotid (s). So bezeichnet z. B. der Code Y entweder C oder T und sein Komplement R bezeichnet A oder G, wobei A komplementär zu T und G komplementär zu C ist.
  • Figure 00220001
  • Die in SEQ ID NR: 4 und SEQ ID NR: 30 verwendeten degenerierten Codons, welche alle für eine gegebene Aminosäure möglichen Codons umfassen, sind in der nachfolgenden Tabelle 3 dargelegt.
  • Figure 00230001
  • Der durchschnittliche Fachmann wird erkennen, dass bei der Bestimmung eines degenerierten Codons eine gewisse Mehrdeutigkeit eingeführt wird, repräsentativ für alle möglichen Codons, welche die jeweilige Aminosäure kodieren. So kann z. B. das degenerierte Codon für Serin (WSN) unter gewissen Umständen Arginin (AGR) kodieren und das degenerierte Codon für Arginin (MGN) kann unter gewissen Umständen Serin (AGY) kodieren. Eine ähnliche Beziehung existiert zwischen Codons, welche Phenylalanin und Leucin kodieren. Folglich können manche Polynukleotide, welche von den degenerierte Sequenzen umfasst werden, Varianten von Aminosäuresequenzen kodieren, der durchschnittliche Fachmann kann solche Varianten von Sequenzen jedoch ohne weiteres durch Bezugnahme auf die Aminosäuresequenz aus SEQ ID NR: 2 oder SEQ ID NR: 29 identifizieren. Varianten von Sequenzen können, wie hierin beschrieben, einfach hinsichtlich ihrer Funktionalität getestet werden.
  • Für jedes beliebige zsig51-Polypeptid, einschließlich der Varianten und Fusionsproteine, kann der Fachmann jedoch ohne weiteres unter Verwendung der in den Tabellen 2 und 3 zuvor dargelegten Informationen eine vollständig degenerierte Polynukleotidsequenz erzeugen, welche diese Variante kodiert. Darüber hinaus kann der Fachmann standardgemäße Software verwenden, um Varianten von zsig51 zu entwerfen, welche auf den hierin beschriebenen Nukleotid- und Aminosäuresequenzen basieren. Die vorliegende Erfindung stellt folglich ein computerlesbares Medium bereit, welches mit einer Datenstruktur kodiert ist, welche wenigstens eine der folgenden Sequenzen liefert: SEQ ID NR: 1, SEQ ID NR: 2, SEQ ID NR: 3, SEQ ID NR: 4, SEQ ID NR: 29, SEQ ID NR: 30, SEQ ID NR: 31, SEQ ID NR: 32, SEQ ID NR: 38 und SEQ ID NR: 39. Geeignete Formen von computerlesbaren Medien schließen magnetische und optisch lesbare Medien ein. Beispiele für magnetische Medien schließen ein: eine Festplatte, einen RAM (random access memory)-Chip, eine Diskette, Digital Linear Tape (DLT), ein Disk-Cache sowie eine ZIP-Disk. Optisch lesbare Medien sind z. B. Compact-Disks (z. B. CD-read only memory (ROM), CD-rewritable (RW) und CD-recordable) sowie Digital Versatile Video Disks (DVD) (z. B. DVD-ROM, DVD-RAM und DVD+RW).
  • In bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden die isolierten Polynukleotide an Regionen aus SEQ ID NR: 1, welche eine ähnliche Größe aufweisen, oder an eine dazu komplementäre Sequenz unter stringenten Bedingungen hybridisieren. Im allgemeinen werden stringente Bedingungen so ausgewählt, dass sie etwa 5°C unter dem thermischen Schmelzpunkt (Tm) für die spezifische Sequenz bei einer definierten Ionenstärke und definiertem pH-Wert liegen. Der Tm ist die Temperatur (bei definierter Ionenstärke und definiertem pH), bei welcher 50% der Targetsequenz an eine perfekt gepaarte Sonde hybridisieren. Typische stringente Bedingungen sind solche, bei denen die Salzkonzentration bei bis zu etwa 0,03 M bei pH 7 liegt und die Temperatur mindestens etwa 60°C beträgt.
  • Wie zuvor bemerkt, schließen die isolierten Polynukleotide der vorliegenden Erfindung DNA und RNA ein. Verfahren zur Präparation von DNA und RNA sind im Stand der Technik bekannt. Komplementäre DNA (cDNA)-Klone werden aus RNA hergestellt, welche aus einem Gewebe oder einer Zelle isoliert wird, welche/s große Mengen an zsig51-RNA produziert. Solche Gewebe und Zellen werden mittels Northern Blotting identifiziert (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:5201, 1980), und schließen den Pankreas, die Hypophyse, die Testikel und das Auge ein. Gesamt-RNA kann unter Verwendung von Guanin-HCl-Extraktion gefolgt von Isolierung mittels Zentrifugierung in einem CsCl-Gradienten präpariert werden (Chirgwin et al., Biochemistry 18:52–94, 1979). Poly (A)+-RNA wird aus Gesamt-RNA unter Verwendung des Verfahrens gemäß Aviv und Leder (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:1408–1412, 1972) präpariert. Komplementäre DNA (cDNA) wird aus Poly (A)+-RNA unter Verwendung bekannter Verfahren präpariert. Alternativ dazu kann genomische DNA isoliert werden. Für manche Anwendungen (z. B. Expression in transgenen Tieren) kann es bevorzugt sein, einen genomischen Klon zu verwenden oder einen cDNA-Klon so zu modifizieren, dass er wenigsten ein genomisches Intron enthält. Verfahren zur Identifizierung und Isolierung von cDNA und genomischen Klonen sind wohl bekannt und liegen im Rahmen der Fertigkeit des durchschnittlichen Fachmanns und schließen die Verwendung der hierin offenbarten Sequenz, oder Teilen davon, zur Sondierung oder zum Priming einer Bibliothek ein. Polynukleotide, welche zsig51-Polypeptide kodieren werden z. B. mittels Hybridisierung oder Polymerase-Kettenreaktion ("PCR", Mullis, U.S. Patent Nr. 4,683,202) identifiziert und isoliert. Expressionsbibliotheken können mit Antikörpern gegen zsig51, mit Rezeptorfragmenten oder mit anderen spezifischen Bindungspartnern sondiert werden.
  • Der Fachmann wird erkennen, dass die in SEQ ID NRS: 1 und 2 offenbarten Sequenzen ein einzelnes Allel von humanem zsig51 repräsentieren. Allele Varianten dieser Sequenzen können mittels Sondierung von cDNA oder genomischen Bibliotheken aus verschiedenen Individuen gemäß Standardverfahren kloniert werden.
  • Die vorliegende Erfindung stellt des weiteren Counterpart-Polynukleotide und -Polypeptide aus anderen Spezies (Orthologe) bereit. Von besonderem Interesse sind zsig51-Polynukleotide und -Polypeptide aus anderen Säugerspezies, einschließlich muriner, Ratte-, porkiner, oviner, boviner, caniner, feliner, equiner und anderer Primatenproteine. Orthologe der humanen Polynukleotide können unter Verwendung von durch die vorliegende Erfindung bereitgestellten Informationen und Zusammensetzungen in Kombination mit gebräuchlichen Klonierungstechniken kloniert werden. So kann z. B. eine cDNA unter Verwendung vom mRNA, welche aus einem Gewebe oder einem Zelltyp erhalten wird, welches/r das Protein exprimiert, kloniert werden. Geeignete Quellen von mRNA können mittels Sondierung von Northern Blots mit Sonden, welche aus den hierin offenbarten Sequenzen konstruiert sind, identifiziert werden. Dann wird eine Bibliothek aus mRNA aus einem positiven Gewebe oder einer positiven Zelllinie präpariert. Eine DNA, welche zsig51 kodiert, kann dann mittels einer Vielzahl von Verfahren isoliert werden, so wie mittels Sondierung mit einer humanen Gesamt- oder partiellen cDNA mit einem oder mehreren Sätzen von degenerierten Sonden basierend auf den offenbarten Sequenzen. Eine cDNA kann ebenfalls mittels PCR unter Verwendung von Primern, welche aus den hierin offenbarten Sequenzen konstruiert wurden, kloniert werden. In einem zusätzlichen Verfahren kann die cDNA-Bibliothek dazu verwendet werden, Wirtszellen zu transformieren oder zu transfizieren und die Expression der relevanten cDNA kann mit einem Antikörper gegen zsig51-Polypeptid detektiert werden Ähnliche Techniken können ebenfalls bei der Isolierung von genomischen Klonen angewandt werden.
  • Konservierte Regionen von zsig51, welche durch Ausrichtung mit Sequenzen von anderen Mitgliedern der Familie (einschließend NDP, beta- und alpha-Untereinheiten von humanem Gonadotropin, TGF-β1, Myostatin und Leutropin) identifiziert wurden, können dazu verwendet werden, die verwandten Polynukleotide und Proteine zu identifizieren. So können z. B. die Reverse-Transkriptions-Polymerasekettenreaktion (RT-PCR) und andere im Stand der Technik bekannte Verfahren angewandt werden, um die Sequenzen zu amplifizieren, welche die konservierten Motive kodieren, welche in zsig51 aus RNA vorhanden sind, welche aus einer Vielzahl von Gewebequellen erhalten wird. Insbesondere die in hohem Maße degenerierten Primer, wie nachfolgend in Tabelle 4 gezeigt, sind nützlich zu diesem Zweck.
  • Primer, welche von den Sequenz-kodierenden Resten 33 bis 38 (SEQ ID NRS: 5,6 und 7) und 94 bis 99 aus SEQ ID NR: 2 abgeleitet sind, sind bevorzugt für das breite Screening von Familien, während Primer, welche von den Sequenz-kodierenden Resten 96 bis 101, 33 bis 38 (SEQ ID NRS: 14, 15 und 16), 63 bis 68 und 11 bis 16 abgeleitet sind, bevorzugt für die Verwendung bei der Identifikation von enger miteinander verwandten Homologen sind. Tabelle 4
    zsig51 Reste 33–38
    Degeneriert: CN TGY GTN GGN CAY TGY (SEQ ID NR: 5)
    Konsens: NN TGY DNN GGN BVN TGY (SEQ ID NR: 6)
    Komplement: NN ACR HNN CCN VBN ACR (SEQ ID NR: 7)
    zsig51 Reste 94–99
    Degeneriert: MGN GCN TGY CAR TGY GA (SEQ ID NR: 8)
    Konsens: NNN NVN TGY VRN TGY DV (SEQ ID NR: 9)
    Komplement: NNN NBN ACR BYN ACR HB (SEQ ID NR: 10)
    zsig51 Reste 96–101
    Degeneriert: TGY CAR TGY GAY ATG TG (SEQ ID NO: 11)
    Konsens: TGY CAN TGY GAN RWR TG (SEQ ID NO: 12)
    Komplement: ACR GTN ACR CTN YWY AC (SEQ ID NR: 13)
    zsig51 Reste 33–38
    Degeneriert: CN TGY GTN GGN CAY TGY (SEQ ID NR: 14)
    Konsens: SN TGY GWN GGN CAY TGY (SEQ ID NR: 15)
    Komplement: SN ACR CWN CCN GTR ACR (SEQ ID NR: 16)
    zsig51 Reste 63–68
    Degeneriert: WSN CAR TGY TGY ACN AT (SEQ ID NR: 17)
    Konsens: WSN CAN TGY TGY MSN MY (SEQ ID NR: 18)
    Komplement: WSN GTN ACR ACR KSN KR (SEQ ID NR: 19)
    zsig51 Reste 11–16
    Degeneriert: CAY CCN TTYAAY GTN AC (SEQ ID NR: 20)
    Konsens: MRN CMN YWY WAY GTN RM (SEQ ID NR: 21)
    Komplement: KYN GKN RWR WTR CAN YK (SEQ ID NR: 22)
  • Die hierin offenbarten zsig51-Polynukleotidsequenzen können ebenfalls als Sonden oder Primer verwendet werden, um 5'-nicht kodierende Regionen eines zsig51-Gens zu klonieren. Angesichts der gewebespezifischen Expression, welche mittels Northern Blotting für zsig51 beobachtet wurde, wird erwartet, dass diese Genregion für pankreas-, testikel-, augen- und hypophysenspezifische Expression sorgt. Die Promotorelemente aus einem zsig51-Gen könnten folglich dazu verwendet werden, die gewebespezifische Expression von heterologen Genen z. B. in transgenen Tieren oder in mit Gentherapie behandelten Patienten zu steuern. Die Klonierung von 5'-flankierenden Sequenzen ermöglicht ebenfalls die Produktion von zsig51-Proteinen mittels "Genaktivierung", wie in dem U.S. Patent Nr. 5,641,670 offenbart ist. Kurz gesagt wird die Expression eines endogenen zsig51-Gens in einer Zelle dadurch verändert, dass ein DNA-Konstrukt, welches wenigstens eine Targetingsequenz, eine regulatorische Sequenz, ein Exon und eine nicht gepaarte Splice-Donor-Stelle umfasst, in den zsgi51-Lokus eingeführt wird. Bei der Targetingsequenz handelt es sich um eine zsig51-5'-nicht kodierende Sequenz, welche die homologe Rekombination des Konstrukts mit dem endogenen zsig51-Lokus gestattet, wodurch die Sequenzen innerhalb des Konstrukts operativ mit der endogenen zsig51-Kodierungssequenz verknüpft werden. Auf diese Weise kann ein endogener zsig51-Promotor durch andere regulatorische Sequenzen ersetzt oder ergänzt werden, um eine verstärkte, gewebespezifische oder anderweitig regulierte Expression bereitzustellen.
  • Die Polynukleotide der vorliegenden Erfindung können ebenfalls mittels automatisierter Synthese präpariert werden. Die Synthese von Polynukleotiden liegt im Rahmen der Fertigkeit des durchschnittlichen Fachmanns und geeignete Ausstattung sowie geeignete Reagenzien können von kommerziellen Lieferanten bezogen werden. Siehe allgemein Glick und Pasternak, Molecular Biotechnology: Principles & Applications of Recombinant DNA, ASM Press, Washington, D.C., USA, 1994; Itakura et al., Ann. Rev. Biochem. 53:323–56, 1984; und Climie et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:633–7, 1990.
  • Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung, einschließlich Polypeptide in voller Länge, biologisch aktiver Fragmente und Fusionspolypeptide, können in gentechnisch veränderten Wirtszellen gemäß gebräuchlicher Verfahren hergestellt werden. Geeignete Wirtszellen sind die Zelltypen, welche mit exogener DNA transformiert oder transfiziert und in Kultur gezüchtet werden können und schließen Bakterien, Pilzzellen und kultivierte höhere eukaryote Zellen ein. Eukaryote Zellen, insbesondere kultivierte Zellen aus multizellulären Organismen, sind bevorzugt. Techniken zur Manipulation von klonierten DNA-Molekülen und zur Einführung exogener DNA in eine Vielzahl von Wirtszellen werden offenbart in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA, 1989, und Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, Green and Wiley and Sons, NY, USA, 1993.
  • Im allgemeinen ist eine DNA-Sequenz, welche ein zsig51-Polypeptid kodiert, operativ mit anderen genetischen Elementen innerhalb eines Expressionsvektors verknüpft, welche für ihre Expression erforderlich sind, was normalerweise einen Transkriptionspromotor und -terminator einschließt. Der Vektor wird ebenfalls herkömmlicherweise einen oder mehrere selektierbare Marker und einen oder mehrere Replikationsorigins enthalten, wenngleich der Fachmann erkennen wird, dass in bestimmten Systemen selektierbare Marker auf separaten Vektoren bereitgestellt werden können und die Replikation der exogenen DNA durch die Integration in das Genom der Wirtszelle erfolgen kann. Die Auswahl von Promotoren, Terminatoren, selektierbaren Markern, Vektoren und anderen Elementen ist eine Frage des routinemäßigen Designs im Rahmen der Fertigkeit des durchschnittlichen Fachmanns. Viele solcher Elemente werden in der Literatur beschrieben und können über kommerzielle Lieferanten bezogen werden.
  • Um ein zsig51-Polypeptid in den sekretorischen Weg einer Wirtszelle zu steuern, wird in dem Expressionsvektor eine sekretorische Signalsequenz (auch bekannt als eine Führungssequenz, eine Prepro-Sequenz oder eine Pre-Sequenz) bereitgestellt. Die sekretorische Signalsequenz kann die von zsig51 sein oder sie kann von einem anderen sekretierten Protein (z. B. t-PA; siehe U.S. Patent Nr. 5,641,655) abgeleitet oder de novo synthetisiert werden. Die sekretorische Signalsequenz ist operativ mit der zsig51-DNA-Sequenz verknüpft, d.h. die beiden Sequenzen sind in dem korrekten Leserahmen miteinander verbunden und so positioniert, dass sie das soeben synthetisierte Polypeptid in den sekretorischen Weg der Wirtszelle steuern. Sekretorische Signalsequenzen sind üblicherweise 5' zu der DNA-Sequenz positioniert, welche das relevante Polypeptid kodiert, wenngleich bestimmte Signalsequenzen an anderen Stellen in der relevanten DNA-Sequenz positioniert sein können (siehe z. B. Welch et al., U.S. Patent Nr. 5,037,743; Holland et al., U.S. Patent Nr. 5,143,830).
  • Es wird erwartet, dass die Expression von zsig51-Polypeptiden über den sekretorischen Weg einer Wirtszelle zu der Produktion von multimeren Proteinen führt. Wie zuvor bereits bemerkt, schließen solche Multimere sowohl Homomultimere als auch Heteromultimere ein, wobei die letzteren Proteine einschließen, welche nur zsig51-Polypeptide umfassen, sowie Proteine, welche zsig51- und heterologe Polypeptide einschließen. So kann z. B. ein Heteromultimer, welches ein zsig51-Polypeptid und eine gemeinsame alpha-Untereinheit umfasst, mittels Co-Expression der beiden Polypeptide in einer Wirtszelle produziert werden. Eine cDNA-Sequenz, welche eine gemeinsame alpha-Untereinheit kodiert, wird von Fiddes und Goodman, Nature 281:351–356, 1979, offenbart. Eine cDNA, welche die beta-Untereinheit von humanem Choriongonadotropin kodiert, wird von Fiddes und Goodman, Nature 286:684–687, 1980, offenbart. Berger et al., Nature Genetics 1:199–203, 1992, offenbaren cDNA-Klone, welche NDP kodieren. Eine TGF-β-cDNA wird von Derynck et al., Nature 316:701–705, 1985, offenbart. Resultiert eine Mischung von Proteinen aus der Expression, so werden einzelne Spezies mittels konventioneller Verfahren isoliert. Monomere, Dimere und Multimere höherer Ordnung werden z. B. mittels Größenausschluss-Chromatographie getrennt. Heteromultimere können von Homomultimeren getrennt werden mittels Immunaffinitäts-Chromatographie unter Verwendung von Antikörpern, welche spezifisch für einzelne Dimere sind, oder mittels sequentieller Immunaffinitätsschritte unter Verwendung von Antikörpern, welche spezifisch für einzelne Polypeptidkomponenten sind. Siehe allgemein U.S. Patent Nr. 5,094,941. Multimere können ebenfalls in vitro nach der Inkubation von Polypeptidkomponenten unter geeigneten Bedingungen zusammengesetzt werden. Die Gewinnung und Assemblierung von Proteinen, welche in bakteriellen Zellen exprimiert werden, ist nachfolgend offenbart.
  • Kultivierte Säugerzellen sind geeignete Wirte zur Verwendung im Rahmen der vorliegenden Erfindung. Verfahren zur Einführung von exogener DNA in Säugerwirtszellen schließen ein: die durch Kalziumphosphat vermittelte Transfektion (Wigler et al., Cell 14:725, 1978; Corsaro und Pearson, Somatic Cell Genetics 7:603, 1981; Graham und Van der Eb, Virology 52:456, 1973), die Elektroporation (Neumann et al., EMBO J. 1:841–845, 1982), die durch DEAE-Dextran vermittelte Transfektion (Ausubel et al., ebenda) sowie die durch Liposome vermittelte Transfektion (Hawley-Nelson et al., Focus 15:73, 1993; Ciccarone et al., Focus 15:80, 1993). Die Herstellung von rekombinanten Polypeptiden in kultivierten Säugerzellen wird z. B. offenbart von Levinson et al., U.S. Patent Nr. 4,713,339; Hagen et al., U.S. Patent Nr. 4,784,950; Palmiter et al., U.S. Patent Nr. 4,579,821; und Ringold, U.S. Patent Nr. 4,656,134. Geeignete kultivierte Säugerzellen schließen die folgenden Zelllinien ein: COS-1 (ATCC Nr. CRL 1650), COS-7 (ATCC Nr. CRL 1651), BHK (ATCC Nr. CRL 1632), BHK 570 (ATCC Nr. CRL 10314), 293 (ATCC Nr. CRL 1573; Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59–72, 1977) sowie Zelllinien aus Ovarien vom chinesischen Hamster (z. B. CHO-K1; ATCC Nr. CCL 61). Zusätzliche geeignete Zelllinien sind im Stand der Technik bekannt und können von öffentlichen Hinterlegungsstellen bezogen werden, so wie der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA. Im allgemeinen werden starke Transkriptionspromotoren bevorzugt, so wie Promotoren aus SV-40 oder Zytomegalievirus. Siehe z. B. U.S. Patent Nr. 4,956,288. Andere geeignete Promotoren schließen diejenigen aus Metallothionein-Genen (U.S. Patente Nrs. 4,579,821 und 4,601,978) sowie den Adenovirus-Major-Late-Promotor ein. In einer alternativen Ausführungsform können Adenovirusvektoren verwendet werden. Siehe z. B. Garnier et al., Cytotechnol. 15:145–55, 1994.
  • Die Wirkstoffauswahl wird im allgemeinen dazu verwendet, kultivierte Säugerzellen auszuwählen, in welche fremde DNA eingeführt wurde. Solche Zellen werden im allgemeinen als "Transfektanten" bezeichnet. Zellen, welche in der Anwesenheit eines selektiven Agens kultiviert wurden und dazu in der Lage sind, das relevante Gen an ihre Nachkommen weiterzugeben, werden als "stabile Transfektanten" bezeichnet. Ein beispielhafter selektierbarer Marker ist ein Gen, welches die Resistenz gegen das Antibiotikum Neomycin kodiert. Die Selektionierung wird in der Anwesenheit eines Wirkstoffs des Neomycin-Typs, so wie G418 oder dergleichen, durchgeführt. Selektionierungssysteme können ebenfalls dazu verwendet werden, das Expressionsniveau des relevanten Gens zu erhöhen; ein Prozess, der als "Amplifikation" bezeichnet wird. Die Amplifikation wird durchgeführt, indem man Transfektanten in der Anwesenheit eines niedrigen Spiegels des selektiven Agens kultiviert und anschließend die Menge an selektivem Agens steigert, um Zellen auszuwählen, welche große Mengen der Produkte der eingeführten Gene produzieren. Ein beispielhafter amplifizierbarer selektierbarer Marker ist die Dihydrofolatreduktase, welche Resistenz gegen Methotrexat verleiht. Andere Wirkstoffresistenzgene (z. B. Resistenz gegen Hygromycin, multiple Wirkstoffresistenz, Puromycin-Acetyltransferase) können ebenfalls verwendet werden.
  • Es können ebenfalls weitere höhere Zellen als Wirte verwendet werden, einschließlich Insektenzellen, Pflanzenzellen und Vogelzellen. Die Verwendung von Agrobacterium rhizogenes als ein Vektor zur Expression von Genen in Pflanzenzellen wurde von Sinkar et al., J. Biosci. (Bangalore) 11:47–58, 1987, besprochen. Die Transformation von Insektenzellen und die Herstellung von fremden Polypeptiden in denselben wird von Guarino et al., U.S. Patent Nr. 5,162,222 und WIPO-Veröffentlichung WO 94/06463 offenbart.
  • Insektenzellen können mit rekombinantem Baculovirus infiziert werden, welcher üblicherweise aus dem nuklearen Autographa californica-Polyhedrosevirus (AcNPV) abgeleitet ist. Siehe King und Possee, The Baculovirus Expression System: A Laboratory Guide, London, Chapman & Hall; O'Reilly et al., Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, New York, Oxford University Press., 1994; und Richardson, Ed., Baculovirus Expression Protocols. Methods in Molecular Biology, Humana Press, Totowa, NJ, USA, 1995. Rekombinantes Baculovirus kann ebenfalls mittels der Verwendung eines Transposon-basierten Systems hergestellt werden, welches von Luckow et al. (J. Virol. 67:4566–4579, 1993) beschrieben wird. Dieses System, welches sich Transfervektoren zunutze macht, ist in Form eines Kits (Bac-to-BacTM Kit; Life Technologies, Rockville, MD, USA) im Handel erhältlich. Der Transfervektor (z. B. pFastBac1TM; Life Technologies) enthält ein Tn7-Transposon, um die DNA, welche das relevante Protein kodiert, in das Genom eines Baculovirus, welches in Form eines großen Plasmids, bezeichnet als "Bacmid", in E. coli aufrecht erhalten wird, zu verschieben. Siehe Hill-Perkins und Possee, J. Gen. Virol. 71:971–976, 1990; Bonning et al., J. Gen. Virol. 75:1551–1556, 1994; sowie Chazenbalk und Rapoport, J. Biol. Chem. 270:1543–1549, 1995. Transfervektoren können zusätzlich eine inframe-Fusion mit DNA, welche eine Polypeptidextension oder ein Affinitäts-Tag, wie zuvor offenbart, kodiert, einschließen. Unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Methoden wird ein Transfervektor, welcher eine zsig51 kodierende Sequenz enthält, in E. coli-Wirtszellen transformiert und die Zellen werden für Bacmide gescreent, welche ein unterbrochenes lacZ-Gen enthalten, welches auf das rekombinante Baculovirus hinweist. Die das Genom des rekombinanten Baculovirus enthaltende Bacmid-DNA wird unter Verwendung gebräuchlicher Methoden isoliert und dazu verwendet, Zellen aus Spodoptera frugiperda, so wie Sf9-Zellen, zu transfizieren. Daraufhin wird rekombinantes zsig51-Protein exprimierendes Virus produziert. Vorräte an rekombinantem Virus werden mittels im Stand der Technik üblicherweise angewandter Verfahren hergestellt.
  • Zur Proteinherstellung wird das rekombinante Virus dazu verwendet, Wirtszellen zu infizieren, typischerweise eine Zelllinie, welche aus dem Heerwurm Spodoptera frugiperda (z. B. Sf9- oder Sf21-Zellen) oder aus Trichoplusia ni (z. B. High FiveTM-Zellen; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) abgeleitet sind. Siehe allgemein Glick und Pasternak, Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA, ASM Press, Washington, D.C., 1994. Siehe auch U.S. Patent Nr. 5,300,435. Es werden serumfreie Medien verwendet, um die Zellen wachsen zu lassen und zu erhalten. Geeignete Formulierungen von Medien sind im Stand der Technik bekannt und können von kommerziellen Lieferanten bezogen werden. Man lässt die Zellen von einer Inokulationsdichte von 2 – 5 × 105 Zellen zu einer Dichte von 1 – 2 × 106 Zellen wachsen und fügt dann bei einer "MOI" (Multiplicity of Infection) von 0,1 bis 10, noch typischer etwa 3, einen Vorrat an rekombinantem Virus hinzu. Die angewandten Methoden sind im allgemeinen in erhältlichen Laborhandbüchern beschrieben (z. B. King und Possee, ebenda; O'Reilly et al., ebenda; Richardson, ebenda). Pilzzellen, einschließlich Hefezellen, können im Rahmen der vorliegenden Erfindung ebenfalls verwendet werden. Hefespezies von in dieser Hinsicht besonderem Interesse schließen Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris sowie Pichia methanolica ein. Verfahren zur Transformation von Zellen aus S. cerevisiae mit exogener DNA sowie die Herstellung rekombinanter Polypeptide daraus werden z. B. offenbart von Kawasaki, U.S. Patent Nr. 4,599,311; Kawasaki et al., U.S. Patent Nr. 4,931,373; Brake, U.S. Patent Nr. 4,870,008; Welch et al., U.S. Patent Nr. 5,037,743; sowie Murray et al., U.S. Patent Nr. 4,845,075. Transformationssysteme für andere Hefen, einschließlich Hansenula polymorpha, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragilis, Ustilago maydis, Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia guillermondii sowie Candida maltosa, sind im Stand der Technik bekannt. Siehe z. B. Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. 132:3459–3465, 1986, und Cregg, U.S. Patent Nr. 4,882,279. Die Verwendung von Pichia methanolica als Wirt für die Herstellung rekombinanter Proteine wird offenbart in den U.S. Patenten Nr. 5,716,808 und Nr. 5,736,383, sowie den WIPO-Veröffentlichungen WO 97/17450 und WO 97/17451. Es können Aspergillus-Zellen gemäß der Verfahren von McKnight et al., U.S. Patent Nr. 4,935,349, verwendet werden. Verfahren zur Transformation von Acremonium chrysogenum werden offenbart von Sumino et al., U.S. Patent Nr. 5,162,228. Verfahren zur Transformation von Neurospora werden von Lambowitz, U.S. Patent Nr. 4,486,533, offenbart.
  • Prokaryote Wirtszellen, einschließlich Stränge aus den Bakterien E. coli, Bacillus und anderen Gattungen, sind ebenfalls im Rahmen der vorliegenden Erfindung nützliche Wirtszellen. Methoden zur Transformation dieser Wirte und zur Expression von darin klonierten fremden DNA-Sequenzen sind im Stand der Technik wohl bekannt (siehe z. B. Sambrook et al., ebenda).
  • Transformierte oder transfizierte Wirtszellen werden gemäß konventioneller Methoden in einem Kulturmedium kultiviert, welches Nährstoffe und andere für das Wachstum der ausgewählten Wirtszellen erforderliche Bestandteile enthält. Eine Vielzahl geeigneter Medien, einschließlich definierter Medien und komplexer Medien, sind im Stand der Technik bekannt und schließen im allgemeinen eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, essentielle Aminosäuren sowie Vitamine und Mineralstoffe ein. Die Medien können je nach Notwendigkeit ebenfalls solche Komponenten wie Wachstumsfaktoren oder Serum enthalten. Das Wachstumsmedium wird mittels der Wirkstoffauswahl oder des Mangels an einem essentiellen Nährstoff, welcher durch den auf dem Expressionsvektor transportieren oder in die Wirtszelle transfizierten selektierbaren Marker ergänzt wird, im allgemeinen Zellen auswählen, welche die exogen hinzugefügte DNA enthalten.
  • Nicht kovalente Komplexe, welche ein zsig51-Polypeptid umfassen, können durch die Inkubation eines zsig51-Polypeptids und eines zweiten Polypeptids (z. B. eine gemeinsame alpha-Untereinheit) bei beinahe physiologischem pH hergestellt werden. In einer typischen Reaktion werden Polypeptide bei einer Konzentration von etwa 0,1 bis 0,5 μg/μl bei einem pH von etwa 7,4 in einem schwachen Puffer (z. B. 0,01 M Phosphat- oder Acetatpuffer) inkubiert; Natriumchlorid kann in einer Konzentration von etwa 0,1 M eingeschlossen sein. Bei 37°C ist die Reaktion nach 4 bis 24 Stunden im wesentlichen abgeschlossen. Siehe z. B. Weintraub et al., Endocrinology 101:225–235, 1997.
  • Es wird bevorzugt, die Polypeptide und Proteine der vorliegenden Erfindung bis zu einer Reinheit von ≥ 80%, mehr bevorzugt von ≥ 90%, noch mehr bevorzugt von ≥ 95% aufzureinigen und es wird ein pharmazeutisch reiner Zustand besonders bevorzugt, welcher hinsichtlich kontaminierender Makromoleküle, insbesondere anderer Proteine und Nukleinsäuren, über einer Reinheit von 99,9% liegt und frei von infektiösen und pyrogenen Wirkstoffen ist. Vorzugsweise ist ein aufgereinigtes Polypeptid oder Protein im wesentlichen frei von anderen Polypeptiden oder Proteinen, insbesondere von solch tierischem Ursprung.
  • Exprimierte rekombinante zsig51-Polypeptide (einschließend chimäre Polypeptide und Polypeptid-Dimere) werden gemäß konventioneller Verfahren zur Aufreinigung von Proteinen aufgereinigt, typischerweise mittels einer Kombination chromatographischer Techniken. Siehe allgemein Affinity Chromatography: Principles & Methods, Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Schweden, 1988; und Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York, USA, 1994. Proteine, welche ein Polyhistidin-Affinitäts-Tag (typischerweise etwa 6 Histidinreste) umfassen, werden mittels Affinitätschromatographie auf einem Nickel-Chelat-Harz aufgereinigt. Siehe z. B. Houchuli et al., Biol. Technol. 6:1321–1325, 1988. Proteine, welche ein Glu-glu-Tag umfassen, können mittels Immunaffinitätschromatographie aufgereinigt werden, im wesentlichen wie von Grussenmeyer et al., ebenda, offenbart.
  • Zsig51-Polypeptide oder Fragmente davon können ebenfalls mittels chemischer Synthese gemäß im Stand der Technik bekannter Verfahren hergestellt werden, einschließend Festphasensynthese, partielle Festphasenverfahren, Fragmentkondensation oder klassische Lösungssynthese. Siehe z. B. Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149, 1963; Stewart et al., Solid Phase Peptide Synthesis (2. Auflage), Pierce Chemical Co., Rockford, IL, USA, 1984; Bayer und Rapp, Chem. Pept. Prot. 3:3, 1986; sowie Atherton et al., Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford, 1989.
  • Unter Verwendung im Stand der Technik bekannter Verfahren können zsig51-Proteine als Monomere oder Multimere; glykosyliert oder nicht glykosyliert; pegyliert oder nicht pegyliert hergestellt werden und können einen initiierenden Methionin-Aminosäurerest einschließen oder auch nicht.
  • Die Aktivität von zsig51-Polypeptiden und -proteinen kann in vitro unter Verwendung von kultivierten Zellen oder in vivo durch die Verabreichung von Molekülen der beanspruchten Erfindung an ein geeignetes Tiermodell gemessen werden. So kann z. B. die mitogene Aktivität unter Verwendung bekannter Assays gemessen werden, einschließend 3H-Thymidin-Inkorporationsassays (wie offenbart von Raines und Ross, Methods Enzymol. 109:749–773, 1985), Farbstoff-Inkorporationsassays (wie z. B. offenbart von Mosman, J. Immunol. Meth. 65:55–63, 1983 und Raz et al., Acta Trop. 68:139–147, 1997) oder andere Zellzählungen. Ein bevorzugtes Mitogenese-Assay misst die Integration des Farbstoffs AlamarBlue (Raz et al., ebenda) in Zellen des Pankreas oder der Hypophyse. Siehe auch Gospodarowicz et al., J. Cell. Biol. 70:395–405, 1976; Ewton und Florin, Endocrinol. 106:577–583, 1980; und Gospodarowicz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:7311–7315, 1989. Die Differenzierung kann unter Verwendung von geeigneten Vorläuferzellen, welche ein differenzierungsspezifisches Reporterelement enthalten, untersucht werden. So können z. B. Vorläuferzellen aus dem Pankreas dazu verwendet werden, die Fähigkeit eines zsig51-Proteins zu messen, die Differenzierung in einen bestimmten Zelltypus des Pankreas (z. B. Inselzellen) zu stimulieren. Ein für Inselzellen spezifischer Promotor, so wie ein Insulin-Genpromotor, kann mit einem Reportergen, so wie einem Luciferase-Gen, verknüpft werden, wodurch in den differenzierten Inselzellen Luciferase exprimiert wird, nicht jedoch in den Vorläuferzellen. Vorläuferzellen, welche das Reporterelement enthalten, können z. B. aus für das Reporterelement transgen gemachten Mäusen erhalten werden. Eine ähnliche Strategie kann angewandt werden, um den Effekt von zsig51-Protein auf Vorläuferzellen des Hypothalamus und andere Typen von Zellen zu untersuchen.
  • Zsig51-Polypeptide und -proteine können in vivo unter Verwendung eines viralen Zuführungssystems untersucht werden. Für diesen Zweck beispielhafte Viren schließen ein: Adenovirus, Herpesvirus, Vacciniavirus und adeno-assoziiertes Virus (AAV). Das Adenovirus, ein doppelsträngiges DNA-Virus, ist der derzeit am ausführlichsten studierte Gentransfervektor für die Zuführung einer heterologen Nukleinsäure (besprochen von Becker et al., Meth. Cell Biol. 43:161–89, 1994; sowie Douglas und Curiel, Science & Medicine 4:44–53, 1997). Das System des Adenovirus bietet etliche Vorteile: Adenovirus ist dazu in der Lage, (i) relativ große DNA-Inserte zu beherbergen; (ii) zu hohen Titern herangezüchtet zu werden; (iii) ein breites Spektrum von Säugerzelltypen zu infizieren; und (iv) mit einer großen Anzahl von verfügbaren Vektoren, welche unterschiedliche Promotoren enthalten, verwendet zu werden. Adenoviren können ebenfalls durch intravenöse Injektion verabreicht werden, da sie im Blutkreislauf stabil sind.
  • Durch die Deletion von Abschnitten aus dem Genom des Adenovirus können größere Inserte (bis zu 7 kb) von heterologer DNA aufgenommen werden. Diese Inserte können mittels direkter Ligation oder homologer Rekombination mit einem co-transfizierten Plasmid in die virale DNA integriert werden. In einem beispielhaften System wird das essentielle E1-Gen aus dem viralen Vektor deletiert und das Virus repliziert sich so lange nicht, bis das E1-Gen von der Wirtszelle (z. B. der humanen 293-Zelllinie) bereitgestellt wird. Wird das Adenovirus an intakte Tiere verabreicht, so zielt es in erster Linie auf die Leber ab. Weist das adenovirale Zuführungssystem eine Deletion des E1-Gens auf, so kann sich das Virus nicht in den Wirtszellen replizieren. Das Gewebe des Wirts (z. B. die Leber) wird jedoch das heterologe Protein exprimieren und prozessieren (und, sofern eine Signalsequenz vorhanden ist, sekretieren). Sekretierte Proteine werden in der gefäßreichen Leber in den Kreislauf eintreten und es können die Auswirkungen auf das infizierte Tier bestimmt werden.
  • Mäuse, welche gentechnisch so verändert wurden, dass sie das zsig51-Gen exprimieren, und die als "transgene Mäuse" bezeichnet werden, sowie Mäuse, denen die Funktion des zsig51-Gens gänzlich fehlt, und die als "Knockout-Mäuse" bezeichnet werden, können ebenfalls erzeugt werden (Snouwaert et al., Science 257:1083, 1992; Lowell et al., Nature 366:740–742, 1993; Capecchi, Science 244:1288–1292, 1989; Palmiter et al. Annu. Rev. Genet. 20:465–499, 1986). So können z. B. transgene Mäuse, welche zsig51 entweder ubiquitär oder unter einem gewebespezifischen oder gewebebegrenzten Promotor überexprimieren, dazu verwendet werden zu bestimmen, ob die Überexpression einen Phänotypen hervorruft. So kann z. B. die Überexpression eines Wildtyp-zsig51-Polypeptids, -Polypeptidfragments oder einer Mutante davon normale zelluläre Vorgänge verändern, was in einem Phänotypen resultiert, welcher ein Gewebe, in dem die Expression von zsig51 funktionell relevant ist, identifiziert und ein therapeutisches Target für zsig51, seine Agonisten oder seine Antagonisten bedeuten kann.
  • Darüber hinaus kann eine solche Überexpression in einem Phänotypen resultieren, welcher eine Ähnlichkeit zu humanen Krankheiten zeigt. In ähnlicher Weise können Knockout-zsig51-Mäuse dazu verwendet werden, zu bestimmen, ob zsig51 in vivo absolut erforderlich ist. Der Phänotyp der Knockout-Mäuse kann vorhersagen, welche Auswirkungen ein zsig51-Antagonist wie die hierin beschriebenen in vivo haben wird. Die murine zsig51-cDNA kann dazu verwendet werden, murine genomische DNA zu isolieren, welche im Anschluss daran verwendet wird, um Knockout-Mäuse zu erzeugen. Diese Mäuse können dazu verwendet werden, das zsig51-Gen und das dadurch kodierte Protein in einem in-vivo-System zu untersuchen, und sie können als in-vivo-Modelle für entsprechende humane Krankheiten verwendet werden. Die transgene Expression von zsig51-Antisense-Polynukleotiden oder gegen zsig51 gerichteten Ribozymen kann ebenfalls dazu verwendet werden, die Auswirkungen einer fehlenden zsig51-Expression zu bestimmen.
  • Proteine der vorliegenden Erfindung sind nützlich für die Modulation der Proliferation, der Differenzierung oder des Metabolismus responsiver Zelltypen sowohl in vitro als auch in vivo. Responsive Zelltypen schließen sowohl primäre Zellen als auch kultivierte Zelllinien ein. Von besonderem Interesse in dieser Hinsicht sind Pankreas-, Testikel-, Augen- und Hypophysenzellen. So werden z. B. Proteine der vorliegenden Erfindung in einer Konzentration von etwa 10 pg/ml bis etwa 100 ng/ml zu Zellkulturmedien hinzugefügt. Der Fachmann wird erkennen, dass zsig51-Proteine in vorteilhafter Weise mit anderen Wachstumsfaktoren in Kulturmedien kombiniert werden können.
  • Die Polypeptide und Proteine der vorliegenden Erfindung können dazu verwendet werden, die an der Wachstumsregulierung im Pankreas und in der Hypophyse beteiligten Rezeptoren zu identifizieren und zu isolieren. So können z. B. zsig51-Proteine und -Polypeptide auf einer Säule immobilisiert und Membranpräparate über die Säule laufen gelassen werden (wie allgemein offenbart in Immobilized Affinity Ligand Techniques, Hermanson et al., eds., Academic Press, San Diego, CA, USA, 1992, Seiten 195–202). Die Proteine und Polypeptide können ebenfalls radiomarkiert (Methods Enzymol., Bd. 182, "Guide to Protein Purification", M. Deutscher, ed., Academic Press, San Diego, 1990, 721–737) oder mittels Photoaffinität (Brunner et al., Ann. Rev. Biochem. 62:483–514, 1993 und Fedan et al., Biochem. Pharmacol. 33:1167–1180, 1984) markiert und dazu verwendet werden, spezifische Zelloberflächenproteine mit einem Tag zu versehen. In ähnlicher Weise können radiomarkierte zsig51-Proteine und -Polypeptide dazu verwendet werden, den verwandten Rezeptor in mit einer cDNA-Expressionsbibliothek transfizierten Bindungsassays zu klonieren.
  • Die Polypeptide, Nukleinsäuren und/oder Antikörper der vorliegenden Erfindung können bei der Diagnose oder der Behandlung von Störungen verwendet werden, welche mit dem Pankreas, der Hypophyse, den Testikeln oder dem Auge assoziiert werden, insbesondere Störungen, welche durch Zellverlust oder abnorme Zellproliferation (einschließlich Krebs) gekennzeichnet sind. Insbesondere können den Pankreas oder die Hypophyse betreffende Krebsarten sowie Diabetes auf eine solche Diagnose, Behandlung oder Vorbeugung ansprechen.
  • Monomere zsig51-Polypeptide können bei der Behandlung von Krankheiten nützlich sein, welche durch die Überexpression eines Glykoproteinhormons gekennzeichnet sind. Zsig51-Polypeptide könnten dazu verwendet werden, die gemeinsame alpha-Untereinheit zu titrieren und dadurch als ein Antagonist der Hormonaktivität zu wirken.
  • Weist ein Säuger eine Insuffizienz von zsig51-Polypeptid auf (z. B. aufgrund eines mutierten oder fehlenden zsig51-Gens), so kann das zsig51-Gen in die Zellen des Säugers eingebracht werden. In einer Ausführungsform wird ein Gen, welches ein zsig51-Polypeptid kodiert, in vivo in einen viralen Vektor eingebracht. Solche Vektoren schließen ein: ein abgeschwächtes oder defektes DNA-Virus, so wie, aber nicht beschränkt auf, das Herpes-Simplex-Virus (HSV), das Papillomavirus, das Epstein-Barr-Virus (EBV), das Adenovirus, das adenoassoziierte Virus (AAV) und dergleichen. Defekte Viren, welchen virale Gene vollständig oder beinahe vollständig fehlen, werden bevorzugt. Ein defektes Virus ist nach dem Einbringen in eine Zelle nicht mehr infektiös. Die Verwendung defekter viraler Vektoren gestattet die Verabreichung an Zellen in einem spezifischen lokalisierten Bereich ohne das Problem, dass der Vektor andere Zellen infizieren kann. Beispiele für spezielle Vektoren schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf einen defekten Herpes-Simplex-Virus 1 (HSV1)-Vektor (Kaplitt et al., Molec. Cell. Neurosci. 2:320–30, 1991); einen abgeschwächten Adenovirusvektor, so wie der von Stratford-Perricaudet et al. (J. Clin. Invest. 90:626–30, 1992) beschriebene Vektor, sowie einen defekten adeno-assoziierten Virusvektor (Samulski et al., J. Virol. 61:3096–101, 1987; Samulski et al., J. Virol. 63:3822–28, 1989).
  • In einer anderen Ausführungsform kann das zsig51-Gen in einen retroviralen Vektor eingebracht werden, wie z. B. beschrieben in Anderson et al., U.S. Patent Nr. 5,399,346; Mann et al., Cell 33:153, 1983; Temin et al., U.S. Patent Nr. 4,650,764; Temin et al., U.S. Patent Nr. 4,980,289; Markowitz et al., J. Virol. 62:1120, 1988; Temin et al., U.S. Patent Nr. 5,124,263; Internationale Patentveröffentlichung Nr. WO 95/07358, veröffentlicht am 16. März 1995 von Dougherty et al.; sowie Kuo et al., Blood 82:845–852, 1993. Alternativ dazu kann der Vektor mittels Lipofektion in vivo unter Verwendung von Liposomen eingeführt werden. Es können synthetische kationische Lipide dazu verwendet werden, Liposome für die in-vivo-Transfektion eines einen Marker kodierenden Gens herzustellen (Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413–17, 1987; Mackey et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8027–31, 1988). Die Anwendung der Lipofektion, um exogene Gene in vivo in spezifische Organe einzubringen, weist gewisse praktische Vorteile auf, einschließlich der Möglichkeit, die Transfektion auf bestimmte Zellen zu richten. Die Ausrichtung der Transfektion auf bestimmte Zelltypen ist insbesondere vorteilhaft in einem Gewebe mit zellulärer Heterogenität, so wie in Pankreas, Leber, Niere oder Gehirn. Lipide können zum Zweck des Targeting chemisch an andere Moleküle gekoppelt werden. Zielgerichtete Peptide (z. B. Hormone oder Neurotransmitter), Proteine, so wie Antikörper, oder nicht peptidische Moleküle können chemisch an Liposome gekoppelt werden.
  • In einer anderen Ausführungsform werden Targetzellen aus dem Körper entfernt, heterologe DNA wird in Form eines nackten DNA-Plasmids eingebracht und die Zellen werden wieder in den Körper re-implantiert. Nackte DNA-Vektoren zur Gentherapie können mittels im Stand der Technik bekannter Verfahren in die gewünschten Wirtszellen eingebracht werden, z. B. mittels Transfektion, Elektroporation, Mikroinjektion, Transduktion, Zellfusion, DEAE-Dextran, Kalziumphosphatpräzipitation, Verwendung einer Genkanone oder Verwendung eines DNA-Vektortransporters. Siehe z. B. Wu et al., J. Biol. Chem. 267:963–67, 1992; Wu et al., J. Biol. Chem. 263:14621–24, 1988.
  • Die vorliegende Erfindung stellt des weiteren Antisense-Polynukleotide bereit, welche zu einem Segment der in SEQ ID NR: 1 dargestellten Polynukleotide komplementär sind. Solche synthetischen Antisense-Oligonukleotide werden dazu konstruiert, um an zsig51-Polypeptids kodierende mRNA zu binden und die Translation einer solchen mRNA zu inhibieren. Solche Antisense-Oligonukleotide werden dazu verwendet, die Expression von zsig51-Polypeptide kodierenden Genen in einer Zellkultur oder in einem Subjekt zu inhibieren. Antisense-Ansätze können z. B. bei der Behandlung von folgenden Beschwerden angewandt werden: Krebs, Hyperplasien des Pankreas oder der Hypophyse, Hypersekretion von Hypophysenhormon, Prolaktinhypersekretion, Hypersekretion von Wachstumshormon (Akromegalie) und Hypersekretion von ACTH (Cushing-Syndrom).
  • Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls Reagenzien zur Verwendung in diagnostischen Anwendungen bereit. Das humane zsig51-Gen wurde auf dem Chromosomenband 11q13 lokalisiert. Verschiedene weitere Gene von Interesse wurden in dieser Region des Chromosoms 11 lokalisiert, einschließlich des Tumorsuppressorgens MEN1 (Multiple Endokrine Neoplasie Typ 1, ein autosomales dominantes familiäres Krebssyndrom, welches durch Tumoren in enteropankreatischen endokrinen Geweben, in der vorderen Hypophyse und den Epithelkörperchen sowie durch Geschwüre im Verdauungstrakt gekennzeichnet ist), welches bereits positionell kloniert wurde (Chandrasekharappa et al., Science 276:404–407, 1997), und eines zweiten bisher noch nicht klonierten Gens, welches ebenfalls mit MEN1-ähnlichen Symptomen assoziiert wird (Chakrabarti et al., Genes Chromosomes Cancer 22:130–137, 1998). Zsig51 kommt als dieses bisher nicht identifizierte Krankheitsgen in Frage, ebenso wie als IDDM4, ein insulinabhängiger Suszeptibilitätslokus für Diabetes mellitus auf 11q13, sowie als Bardet-Bied1-Syndrom Typ 1. Folglich kann das zsig51-Gen, eine zsig51-DNA oder -RNA umfassende Sonde oder eine Untersequenz davon verwendet werden, um zu bestimmen, ob das zsig51-Gen auf dem Chromosom 11 vorhanden ist oder ob eine Mutation erfolgt ist. Detektierbare chromosomale Abweichungen am zsig51-Genlokus schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf: Aneuploidie, Veränderungen der Anzahl von Genkopien, Insertionen, Deletionen sowie Veränderungen und Neuordnung der Restriktionsstellen. Diese Abweichungen können innerhalb der Kodierungssequenz, innerhalb von Introns oder innerhalb von flankierenden Regionen auftreten, einschließlich stromaufwärts gelegener Promotor- und regulatorischer Regionen, und sie können sich in Form von physikalischen Veränderungen innerhalb einer Kodierungssequenz oder in Form von Veränderungen des Genexpressionsniveaus manifestieren. Analytische Sonden werden im allgemeinen eine Länge von wenigstens 20 Nukleotiden aufweisen, wenngleich die Verwendung etwas kürzerer Sonden (14 bis 17 Nukleotide) möglich ist. PCR-Primer weisen eine Länge von wenigstens 5 Nukleotiden auf, bevorzugt 15 oder mehr nt, mehr bevorzugt 20 bis 30 nt. Kurze Polynukleotide können verwendet werden, wenn ein kleiner Bereich des Gens zielgerichtet für die Analyse ist. Zur Gesamtanalyse von Genen kann eine Polynukleotidsonde eines oder mehrere vollständige/s Exon/s umfassen. Sonden werden im allgemeinen ein an einen signalerzeugenden Rest gekoppeltes Polynukleotid umfassen, so wie ein Radionukleotid. Im allgemeinen umfassen diese diagnostischen Verfahren die folgenden Schritte: (a) Erhalten einer genetischen Probe von einem Patienten; (b) Inkubation der genetischen Probe mit einer Polynukleotidsonde oder einem Polynukleotidprimer, wie zuvor offenbart, unter Bedingungen, unter welchen das Polynukleotid an eine komplementäre Polynukleotidsequenz hybridisieren wird, um ein erstes Reaktionsprodukt zu produzieren; und (c) der Vergleich des ersten Reaktionsprodukts und des Kontrollreaktionsprodukts zeigt eine genetische Abnormität in dem Patienten an. Genetische Proben zur Verwendung im Rahmen der vorliegenden Erfindung schließen genomische DNA, cDNA und RNA ein. Bei der Polynukleotidsonde oder dem Polynukleotidprimer kann es sich um RNA oder um DNA handeln und sie/er wird einen Abschnitt von SEQ ID NR: 1, dem Komplement von SEQ ID NR: 1 oder einem RNA-Äquivalent davon umfassen. In dieser Hinsicht geeignete Assayverfahren schließen die dem Fachmann bekannten molekulargenetischen Techniken ein, so wie die RFLP (restriction fragment length polymorphism)-Analyse, die STR (short tandem repeat)-Analyse unter Verwendung von PCR-Techniken, die Ligationskettenreaktion (Barany, PCR Methods and Applications 1:5–16, 1991), Ribonuklease-Protektionsassays und weitere im Stand der Technik bekannte genetische Kopplungsanalysetechniken (Sambrook et al., ebenda; Ausubel et. al., ebenda; A. J. Marian, Chest 108:255–65, 1995). Ribonuklease-Protektionsassays (siehe z. B. Ausubel et al., ebenda, Kap. 4) umfassen die Hybridisierung einer RNA-Sonde an eine vom Patienten stammende RNA-Probe, woraufhin das Reaktionsprodukt (RNA-RNA-Hybrid) einer RNase ausgesetzt wird. Hybridisierte Regionen der RNA werden vor dem Verdau geschützt. In PCR-Assays wird eine vom Patienten stammende genetische Probe mit einem Paar von Oligonukleotidprimern inkubiert und die Region zwischen den Primern wird amplifiziert und gewonnen. Veränderungen hinsichtlich der Größe, der Menge oder der Sequenz des gewonnenen Produkts zeigen Mutationen in dem Patienten an. Eine weitere auf PCR basierende Technik, welche angewandt werden kann, ist die SSCP (single strand conformational polymorphism)-Analyse (Hayashi, PCR Methods and Applications 1:34–38, 1991).
  • Assays für zsig51-Protein in Serum können dazu verwendet werden, metabolische Abnormitäten zu detektieren, so wie Diabetes, Abnormitäten der Hypophyse und des Fortpflanzungsapparats, letzteres einschließlich Unfruchtbarkeit. Der Fachmann wird erkennen, dass Bedingungen, welche in Beziehung zu einer Unter- oder Überexpression von zsig51 stehen, zugänglich für die Behandlung mittels therapeutischer Manipulation der zsig51-Proteinniveaus sein können.
  • Rezeptorbindende zsig51-Polypeptide können ebenfalls in weiteren im Stand der Technik bekannten Assaysystemen verwendet werden. Solche Systeme schließen ein: die Scatchard-Analyse zur Bestimmung der Bindungsaffinität (siehe Scatchard, Ann. NYAcad. Sci. 51:660–72, 1949) sowie kalorimetrische Assays (Cunningham et al., Science 253:545–48, 1991; Cunningham et al., Science 245:821–25, 1991).
  • Zsig51 kann ebenfalls dazu verwendet werden, Inhibitoren seiner Aktivität zu identifizieren. Zu den zuvor offenbarten Assays werden Testverbindungen hinzugegeben, um Verbindungen zu identifizieren, welche die Aktivität von zsig51 inhibieren. Zusätzlich zu den zuvor offenbarten Assays können Proben hinsichtlich der Inhibition der Aktivität von zsig51 in einer Vielzahl von Assays getestet werden, welche dazu konstruiert sind, die Rezeptorbindung oder die Stimulation/Inhibition von zsig51-abhängigen zellulären Antworten zu messen. So können z. B. zsig51-responsive Zelllinien mit einem Reportergenkonstrukt transfiziert werden, welches responsiv gegenüber einem zsig51-stimulierten zellulären Weg ist. Reportergenkonstrukte dieses Typs sind im Stand der Technik bekannt und werden im allgemeinen ein zsig51-aktiviertes Serum-Response-Element (SRE) umfassen, welches operativ mit einem Gen verknüpft ist, welches ein prüfbares Protein kodiert, so wie Luciferase. In Frage kommende Verbindungen, Lösungen, Mixturen oder Extrakte werden hinsichtlich ihrer Fähigkeit getestet, die Aktivität von zsig51 auf den Targetzellen zu inhibieren, wie durch einen Rückgang der zsig51-Stimulation der Reportergenexpression belegt wird. Assays dieses Typs werden Verbindungen detektieren, welche die zsig51-Bindung an Zelloberflächenrezeptoren direkt blockieren, ebenso wie Verbindungen, welche nach der Rezeptor/Ligand-Bindung Prozesse in dem zellulären Weg blockieren. Alternativ dazu können Verbindungen oder andere Proben hinsichtlich der direkten Blockierung der zsig51-Bindung an den Rezeptor getestet werden unter Verwendung von zsig51, welches mit einer detektierbaren Markierung (z. B. 125I, Biotin, Meerrettichperoxidase, FITC und dergleichen) als Tag versehen ist. In Assays dieses Typs zeigt die Fähigkeit einer Testprobe, die Bindung von markiertem zsig51 an den Rezeptor zu inhibieren, die inhibitorische Aktivität an, welche mittels sekundärer Assays bestätigt werden kann. Bei den Bindungsassays verwendeten Rezeptoren kann es sich um zelluläre Rezeptoren oder um isolierte, immobilisierte Rezeptoren handeln.
  • Die vorliegende Erfindung stellt des weiteren Polypeptide bereit, welche einen ein Epitop enthaltenden Abschnitt eines Proteins wie in SEQ ID NR: 2, SEQ ID NR: 32 oder SEQ ID NR: 39 gezeigt umfassen. Ein "Epitop" ist eine Region eines Proteins, an welche ein Antikörper binden kann. Siehe z. B. Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998–4002, 1984. Epitope können in linearer oder konformationsbedingter Form vorliegen, wobei sich die letztere Form aus nicht zusammenhängenden Regionen des Proteins zusammensetzt, die erst bei der Faltung des Proteins ein Epitop bilden. Lineare Epitope weisen im allgemeinen eine Länge von wenigstens 6 Aminosäureresten auf. Relativ kurze synthetische Peptide, welche einen Teil einer Proteinsequenz nachahmen, sind üblicherweise dazu in der Lage, die Produktion eines mit dem teilweise nachgeahmten Protein reagierenden Antiserums hervorzurufen. Siehe Sutcliffe et al., Science 219:660–666, 1983. Antikörper, welche kurze lineare Epitope erkennen, sind besonders nützlich in analytischen und diagnostischen Anwendungen, welche denaturiertes Protein einsetzen, so wie Western Blotting (Tobin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:4350–4356, 1979). Antikörper gegen kurze Peptide können ebenfalls Proteine in nativer Konformation erkennen und werden folglich nützlich sein für die Überwachung der Proteinexpression und -isolierung sowie für die Detektion von zsig51-Proteinen in Lösung, so wie mittels ELISA oder in Immunpräzipitationsstudien.
  • Antigene, ein Epitop enthaltende Polypeptide der vorliegenden Erfindung sind nützlich zum Züchten von Antikörpern, einschließlich monoklonaler Antikörper, welche spezifisch an ein zsig51-Protein binden. Antigene, ein Epitop enthaltende Polypeptide enthalten eine Sequenz von wenigstens sechs, bevorzugt wenigstens neun, mehr bevorzugt zwischen 15 und 30 aufeinanderfolgenden Aminosäureresten eines zsig51-Proteins (z. B. SEQ ID NR: 2). Polypeptide, welche einen größeren Abschnitt eines zsig51-Proteins umfassen, d.h. von 30 bis 50 Resten bis hin zur vollständigen Sequenz, sind eingeschlossen. Es wird bevorzugt, dass die Aminosäuresequenz des das Epitop enthaltenden Polypeptids so ausgewählt ist, dass eine substantielle Löslichkeit in wässrigen Lösungsmitteln gewährleistet ist, d.h. die Sequenz beinhaltet relativ hydrophile Reste und hydrophobe Reste werden im wesentlichen vermieden.
  • Wie hierin verwendet, beinhaltet der Begriff "Antikörper" polyklonale Antikörper, monoklonale Antikörper, antigenbindende Fragmente davon, so wie F(ab')2- und Fab-Fragmente, einzelkettige Antikörper und dergleichen, einschließlich genetisch veränderter Antikörper. Nicht humane Antikörper können humanisiert werden, indem man ausschließlich nicht humane CDRs auf humane Grundstrukturen und konstante Regionen aufpfropft oder indem man die gesamten nicht humanen variablen Domänen integriert (und gegebenenfalls mit einer der humanen ähnlichen Oberfläche umhüllt, indem man exponierte Reste ersetzt, wobei das Ergebnis ein "furnierter" Antikörper ist). In einigen Fällen können humanisierte Antikörper nicht humane Reste innerhalb der Domänen der Grundstruktur der humanen variablen Region beibehalten, um die passenden Bindungseigenschaften zu verstärken. Durch die Humanisierung von Antikörpern kann die biologische Halbwertszeit erhöht werden und das Potential ungünstiger Immunreaktionen bei der Verabreichung an den Menschen wird verringert. Der Fachmann kann Antikörper mit spezifischen und unterschiedlichen konstanten Domänen (d.h. unterschiedlichen Ig-Unterklassen) erzeugen, um diverse mit bestimmten konstanten Domänen von Antikörpern assoziierte Immunfunktionen zu begünstigen oder zu inhibieren.
  • Alternative Techniken zur Erzeugung oder Selektionierung von hierin nützlichen Antikörpern schließen ein: das Aussetzen in vitro von Lymphozyten gegenüber zsig51-Polypeptid sowie die Auswahl von Antikörper-Display-Bibliotheken in Phagenvektoren oder ähnlichen Vektoren (z. B. mittels der Verwendung von immobilisiertem oder markiertem zsig51-Polypeptid). Humane Antikörper können in transgenen, nicht humanen Tieren hergestellt werden, welche derart verändert wurden, dass sie humane Immunglobulingene, wie in der WIPO-Veröffentlichung WO 98/24893 offenbart, enthalten. Es wird bevorzugt, dass die endogenen Immunglobulingene in diesen Tieren inaktiviert oder eliminiert werden, so wie bei der homologen Rekombination.
  • Antikörper werden als spezifisch bindend definiert, wenn sie mit einer Affinität, welche wenigstens 10-fach größer ist als die Bindungsaffinität an Kontroll(nicht zsig51)-Polypeptid, an ein zsig51-Polypeptid binden. Es wird bevorzugt, dass die Antikörper eine Bindungsaffinität (Ka) von 106 M–1 oder höher, vorzugsweise von 107 M–1 oder höher, mehr bevorzugt von 108 M–1 oder höher und am meisten bevorzugt von 109 M–1 oder höher aufweisen. Die Affinität eines monoklonalen Antikörpers kann vom durchschnittlichen Fachmann ohne weiteres bestimmt werden (siehe z. B. Scatchard, Ann. NY Acad. Sci. 51:660–672, 1949).
  • Verfahren zur Herstellung von polyklonalen und monoklonalen Antikörpern sind im Stand der Technik wohl bekannt (siehe z. B. Hurrell, J. G. R., Ed., Monoclonal Hybridoma Antibodies : Techniques and Applcations, CRC Press, Inc., Boca Raton, FL, USA, 1982). Wie für den durchschnittlichen Fachmann offensichtlich ist, können polyklonale Antikörper aus einer Vielzahl warmblütiger Tiere, so wie aus Pferden, Kühen, Ziegen, Schafen, Hunden, Hühnern, Kaninchen, Mäusen und Ratten, erzeugt werden. Die Immunogenität eines zsig51-Polypeptids kann durch die Verwendung eines Adjuvans, so wie Alaun (Aluminiumhydroxid) oder komplettes oder inkomplettes Freundsches Adjuvans, erhöht werden. Für die Immunisierung nützliche Polypeptide schließen auch Fusionspolypeptide ein, so wie Fusionen eines zsig51-Polypeptids oder eines Abschnitts davon mit einem Immunglobulinpolypeptid oder mit Maltosebindungsprotein. Bei dem Polypeptid-Immunogen kann es sich um ein Molekül vollständiger Länge oder um einen Abschnitt davon handeln. Ist der Polypeptidabschnitt "haptenartig", so kann ein solcher Abschnitt zur Immunisierung vorteilhafterweise mit einem Makromolekülträger (so wie Napfschnecken-Hämocyanin (KLH), Kälberserumalbumin (BSA) oder Tetanustoxoid) verbunden oder an ihn gekoppelt werden.
  • Es kann eine Vielzahl von dem Fachmann bekannten Assays dazu verwendet werden, die Antikörper zu detektieren, welche spezifisch an zsig51-Polypeptide binden. Beispielhafte Assays werden detailliert beschrieben in: Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow und Lane (Eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988. Repräsentative Beispiele solcher Assays schließen ein: parallele Immunelektrophorese, Radioimmunassays, Radioimmunpräzipitationen, ELISAs (enzyme-linked immunosorbent assays), Dot-Blot-Assays, Western Blot Assays, Inhibitions- oder Kompetitionsassays sowie Sandwichassays.
  • Antikörper gegen zsig51 können z. B. dazu verwendet werden, zsig51-Polypeptide mittels Affinitätsaufreinigung zu isolieren; für diagnostische Assays zur Bestimmung der zirkulierenden oder lokalisierten Levels von zsig51-Polypeptiden; für Screening-Expressionsbibliotheken; für die Herstellung anti-idiotypischer Antikörper; und als neutralisierende Antikörper oder als Antagonisten, um die Aktivität von zsig51 in vitro und in vivo zu blockieren.
  • Hierin offenbarte Antikörper und Polypeptide können ebenfalls direkt oder indirekt an Wirkstoffe, Toxine, Radionukleotide und dergleichen konjugiert werden und diese Konjugate können für diagnostische oder therapeutische Anwendungen in vivo verwendet werden. So können z. B. Polypeptide oder Antikörper der vorliegenden Erfindung dazu verwendet werden, Gewebe oder Organe zu identifizieren oder zu behandeln, welche ein entsprechendes antikomplementäres Molekül (z. B. einen Rezeptor bzw. ein Antigen) exprimieren. Genauer gesagt können zsig51-Polypeptide oder anti-zsig51-Antikörper oder bioaktive Fragmente oder Abschnitte davon an detektierbare oder zytotoxische Moleküle gekoppelt und einem Säuger zugeführt werden, welcher Zellen, Gewebe oder Organe aufweist, die das antikomplementäre Molekül exprimieren. Geeignete detektierbare Moleküle können direkt oder indirekt an dem Polypeptid oder Antikörper befestigt werden und schließen ein: Radionukleotide, Enzyme, Substrate, Co-Faktoren, Inhibitoren, fluoreszierende Marker, chemilumineszente Marker, magnetische Partikeln und dergleichen. Zytotoxische Moleküle können direkt oder indirekt an dem Polypeptid oder Antikörper befestigt werden und schließen ein: bakterielle oder pflanzliche Toxine (z. B. Diphtherietoxin, Pseudomonas Exotoxin, Rizin, Saporin, Abrin und dergleichen) ebenso wie therapeutische Radionukleotide, so wie Jod-131, Rhenium-188 oder Yttrium-90 (z. B. entweder direkt an dem Polypeptid oder Antikörper befestigt oder indirekt mittels eines chelatbildenden Restes befestigt). Polypeptide oder Antikörper können ebenfalls an zytotoxische Wirkstoffe konjugiert werden, so wie Adriamycin. Zur indirekten Befestigung eines detektierbaren oder zytotoxischen Moleküls kann das detektierbare oder zytotoxische Molekül mit einem Mitglied eines komplementär/antikomplementären Paares konjugiert werden, wobei das andere Mitglied an den Polypeptid- oder Antikörperabschnitt gebunden ist. Ein beispielhaftes komplementäres/antikomplementäres Paar für diese Zwecke ist Biotin/Streptavidin.
  • In einer weiteren Ausführungsform können Polypeptid/Toxin-Fusionsproteine oder Antikörper/Toxin- oder Fragment/Toxin-Fusionsproteine zur zielgerichteten Inhibition oder Ablation von Zellen oder Geweben verwendet werden (z. B. zur Behandlung von Krebszellen oder -geweben). Zielgerichtete Zellen (d.h. Zellen, welche den zsig51-Rezeptor aufweisen) binden das zsig51-Toxinkonjugat, welches dann internalisiert wird, wobei die Zelle getötet wird. Die Auswirkungen der rezeptorspezifischen Zelltötung (Targetablation) offenbaren sich durch Veränderungen in der gesamten Physiologie des Tieres oder durch histologische Untersuchung. Folglich kann die vom Liganden abhängige rezeptorgerichtete Zytotoxizität dazu verwendet werden, das Verständnis der physiologischen Bedeutung eines Proteinliganden zu verbessern. Ein bevorzugtes unter derartigen Toxinen ist Saporin. Säugerzellen besitzen keinen Rezeptor für Saporin, welches nicht toxisch ist, sofern es extrazellulär bleibt. Alternativ dazu, falls das Polypeptid multiple funktionelle Domänen aufweist (d.h. eine Aktivierungsdomäne oder eine Ligandenbindungsdomäne sowie eine Targetingdomäne), kann ein lediglich die Targetingdomäne einschließendes Fusionsprotein dazu geeignet sein, ein detektierbares Molekül, ein zytotoxisches Molekül oder ein zu einem relevanten Zell- oder Gewebetyp komplementäres Molekül zu steuern. In Fällen, in denen das Fusionsprotein mit nur der Domäne ein komplementäres Molekül einschließt, kann das antikomplementäre Molekül an ein detektierbares oder zytotoxisches Molekül konjugiert werden. Solche domänenkomplementäre Molekül-Fusionsproteine repräsentieren folglich ein generisches Targetingvehikel zur zell- oder gewebespezifischen Zuführung von generischen antikomplementär-detektierbaren/zytotoxischen Molekülkonjugaten.
  • In einer weiteren Ausführungsform können Polypeptid/Zytokin-Fusionsproteine oder Antikörper/Zytokin-Fusionsproteine dazu verwendet werden, die Zytotoxizität in vitro (z. B. die durch monoklonale Antikörper gegen Tumortargets vermittelte Zytotoxizität) sowie die Tötung von Targetgeweben in vivo (z. B. Blut- und Knochenmarkkrebsarten) zu verstärken. Siehe allgemein Hornick et al., Blood 89:4437–4447, 1997). Im allgemeinen sind Zytokine toxisch, wenn sie systemisch verabreicht werden. Die beschriebenen Fusionsproteine ermögliche das Targeting eines Zytokins an eine gewünschte Wirkungsstelle, wodurch eine erhöhte lokale Zytokinkonzentration bereitgestellt wird. Geeignete zsig51-Polypeptide oder anti-zsig51-Antikörper zielen auf eine unerwünschte Zelle oder ein unerwünschtes Gewebe (z. B. einen Tumor) und das fusionierte Zytokin vermittelt durch Effektorzellen eine verbesserte Lysis von Targetzellen. Zu diesem Zweck geeignete Zytokine schließen z. B. Interleukin-2 und den Granulozyten-Makrophagen-Kolonie stimulierenden Faktor (GM-CSF) ein.
  • Die hierin beschriebenen bioaktiven Polypeptid- und Antikörperkonjugate können intravenös, intraarteriell oder intraductal zugeführt werden oder sie können lokal an der beabsichtigten Wirkungsstelle eingeführt werden.
  • Inhibitoren der Aktivität von zsig51 (zsig51-Antagonisten) schließen anti-zsig51-Antikörper und lösliche zsig51-Rezeptoren ebenso wie andere peptidische und nicht peptidische Agenzien (einschließlich Ribozyme) ein. Solche Antagonisten können dazu verwendet werden, die Wirkung von zsig51 in vitro und in vivo zu blockieren. Von besonderem Interesse ist die Verwendung von Antagonisten der zsig51-Aktivität in der Krebstherapie. Da die Verfahren zur Früherkennung besser werden, wird es nunmehr möglich, früher in die Tumorentwicklung einzugreifen, wodurch ermöglicht wird, Inhibitoren der Angiogenese zu verwenden, um die angiogene Veränderung zu blockieren, welche der Weiterentwicklung zu invasivem Krebs vorausgeht. Inhibitoren der zsig51-Aktivität können in Kombination mit anderen krebstherapeutischen Wirkstoffen verwendet werden.
  • Für die pharmazeutische Verwendung werden die Proteine der vorliegenden Erfindung zur parenteralen, insbesondere zur intravenösen oder subkutanen Zuführung gemäß konventioneller Verfahren formuliert. Bei der intravenösen Verabreichung wird es sich um Bolusinjektion oder -infusion über einen typischen Zeitraum zwischen einer und einigen Stunden handeln. Im allgemeinen werden pharmazeutische Formulierungen ein zsig51-Protein in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger, so wie Kochsalzlösung, gepufferte Kochsalzlösung, 5% Dextrose in Wasser oder dergleichen, einschließen. Formulierungen können des weiteren eines/n oder mehrere Exzipienten, Konservierungsmittel, Lösungsmittel, Pufferagens/-agenzien, Albumin/e einschließen, um einen Proteinverlust auf Gefäßoberflächen zu vermeiden, z. B. in Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, USA, 19. Aufl., 1995. Therapeutische Dosierungen werden im allgemeinen im Bereich von 0,1 bis 100 μg/Körpergewicht des Patienten pro Tag, bevorzugt 0,5 bis 20 μg/kg pro Tag, wobei die exakte Dosis vom behandelnden Arzt gemäß anerkannter Standards erfolgt und die Natur und Ernsthaftigkeit der zu behandelnden Beschwerden sowie charakteristische Merkmale des Patienten in Betracht zu ziehen sind. Dosierungen von zsig51-Protein werden im allgemeinen in einem täglichen bis wöchentlichen Rhythmus verabreicht werden, wobei die einzelnen Dosen im Bereich von 0,1 bis 10 mg/Patient liegen. Die Festlegung der Dosierung liegt im Rahmen der Fähigkeiten des durchschnittlichen Fachmanns. Die Proteine können zur akuten Behandlung über eine Woche oder weniger, oftmals über einen Zeitraum von ein bis drei Tagen oder in der chronischen Behandlung über einige Monate oder Jahre hinweg verabreicht werden. Im allgemeinen ist eine therapeutisch wirksame Menge an zsig51 eine Menge, welche ausreicht, eine klinisch signifikante Veränderung der anvisierten Beschwerden hervorzurufen.
  • Die Erfindung wird weiterhin durch die folgenden nicht-beschränkenden Beispiele illustriert.
  • Beispiel 1: Herstellung einer Pankreas-Inselzell-cDNA-Bibliothek
  • Aus Pankreas-Inselzellen extrahierte RNA wurde in der folgenden Art und Weise revers transkribiert. Die Erststrang-cDNA-Reaktion enthielt 10 μl humane Pankreas-Inselzell-Poly d(T) selektierte Poly-(A)+ mRNA (Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA) in einer Konzentration von 1,0 mg/ml, und 2 μl 20 pMol/μl Erststrangprimer ZC6171 (SEQ ID NR: 23), enthaltend eine Xho I-Restriktionsschnittstelle. Das Gemisch wurde für 2,5 min auf 70°C erhitzt und durch Abkühlen auf Eis gekühlt. Erststrang-cDNA-Synthese wurde initiiert durch die Zugabe von 8 μl des Erststrangpuffers (5 × SUPERSCRIPTTM Puffer; Life Technologies, Gaithersburg, MD), 4 μl 100 mM Dithiothreitol, und 3 μl einer Desoxynukleotid-Trisphosphat (dNTP)-Lösung, enthaltend jeweils 10 mM dTTP, dATP, dGTP sowie 5-Methyl-dCTP (Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, NJ) zu dem RNA-Primer-Gemisch. Das Reaktionsgemisch wurde für 2 min bei 40°C inkubiert, gefolgt von der Zugabe von 10 μl von 200 E/μl RNase H– reverse Transkriptase (SUPERSCRIPT II®; Life Technologies). Die Effizienz der Erststrangsynthese wurde in einer parallelen Reaktion durch die Zugabe von 10 μCi 32P-α-dCTP, um die Reaktion für die Analyse zu markieren, zu einem 5 μl Aliquot von einem der Reaktionsgemische analysiert. Die Reaktionen wurden inkubiert bei 40°C für 5 min, 45°C für 50 min, anschließend inkubiert bei 50°C für 10 min. Nicht-inkorporiertes 32P-α-dCTP in der markierten Reaktion wurde durch Chromatographie über eine 400er Porengröße-Gelfiltrationssäule (Clontech Laboratories, Inc.) entfernt. Die nicht-inkorporierten Nukleotide und Primer in den unmarkierten Erststrangreaktionen wurden durch Chromatographie über eine 400er Porengröße-Gelfiltrationssäule entfernt. Die Länge der markierten Erststrang-cDNA wurde durch Agarosegelelektrophorese bestimmt.
  • Die Zweitstrang-Reaktion enthielt 102 μl der unmarkierten Erststrang-cDNA, 30 μl 5 × Polymerase I-Puffer (125 mM Tris-HCl, pH 7,5, 500 mM KCl, 25 mM MgCl2, 50 mM (NH4)2 SO4)), 2,0 μl 100 mM Dithiothreitol, 3,0 μl einer Lösung, enthaltend 10 mM von jedem Desoxynukleotid-Triphosphat, 7 μl 5 mM β-NAD, 2,0 μl 10 E/μl E. coli DNA-Ligase (New England Biolabs), 5 μl 10 E/μl E. coli DNA-Polymerase I (New England Biolabs, Beverly, MA), sowie 1,5 μl von 2 E/μl RNase H (Life Technologies). Ein 10 μl Aliquot von einer der Zweitstrangsynthese-Reaktionen wurde durch die Zugabe von 10 μCi 32P-α-dCTP markiert, um die Effizienz der Zweitstrangsynthese zu kontrollieren. Die Reaktionen wurden für zwei Stunden bei 16°C inkubiert, gefolgt durch die Zugabe von 1 μl einer 10 mM dNTP-Lösung und 6,0 μl T4 DNA-Polymerase (10 E/μl, Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) und für weitere 10 Minuten bei 16°C inkubiert. Nicht-inkorporiertes 32P-α-dCTP im Reaktionsgemisch wurde durch Chromatographie über eine 400er Porengröße-Gelfiltrationssäule vor Analyse durch Agarosegelelektrophorese entfernt. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von 10,0 μl 0,5 M EDTA terminiert und mit Phenol/Chloroform und Chloroform, gefolgt von Ethanolpräzipitation in der Anwesenheit von 3,0 M Natriumazetat und 2 μl Pellet Paint carrier (Novagen, Madison, WI) extrahiert. Die Ausbeute an cDNA wurde geschätzt auf etwa 2 μg, ausgehend von einem mRNA-Template von 10 μg.
  • Eco RI-Adapter wurden an die 5'-Enden der vorstehend beschriebenen cDNA ligiert, um die Klonierung in einen Expressionsvektor zu ermöglichen. Ein 12,5 μl cDNA-Aliquot (~2,0 μg) und 3 μl von 69 pMol/μl Eco RI-Adapter (Pharmacia LKB Biotechnology Inc., Piscataway, NJ) wurden mit 2,5 μl 10 × Ligasepuffer (660 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM MgCl2), 2,5 μl 10 mM ATP, 3,5 μl 0,1 M DTT sowie 1 μl 15 E/μl T4 DNA-Ligase (Promega Corp., Madison, WI) gemischt. Die Reaktion wurde inkubiert 1 Stunde bei 5°C, 2 Stunden bei 7,5°C, 2 Stunden bei 10°C, 2 Stunden bei 12,5°C und 16 Stunden bei 10°C. Die Reaktion wurde terminiert durch die Zugabe von 65 μl H2O und 10 μl 10 × H Puffer (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) und bei 70°C für 20 Minuten inkubiert.
  • Um die direktionale Klonierung der cDNA in einen Expressionsvektor zu erleichtern, wurde die cDNA mit Xho I verdaut, woraus eine cDNA mit einem 5' Eco RI kohäsiven Ende sowie einem 3' Xho I kohäsiven Ende resultierte. Die Xho I-Restriktionsschnittstelle am 3'-Ende der cDNA war vorher eingeführt worden. Der Restriktionsenzymverdau wurde in einem Reaktionsgemisch durch die Zugabe von 1,0 μl 40 E/μl Xho I (Boehringer Mannheim) durchgeführt. Der Verdau wurde bei 37°C für 45 min durchgeführt. Die Reaktion wurde terminiert durch die Inkubation bei 70°C für 20 min und Chromatographie über eine 400er Porengröße-Gelfiltrationssäule.
  • Die cDNA wurde Ethanol-präzipitiert, gewaschen mit 70%igem Ethanol, luftgetrocknet und resuspendiert in 10,0 μl Wasser, 2 μl 10 × Kinasepuffer (660 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM MgCl2), 0,5 μl 0,1 M DTT, 2 μl 10 mM ATP, 2 μl 74 Polynukleotidkinase (10 E/μl, Life Technologies). Nach 30-minütiger Inkubation bei 37°C wurde die cDNA in der Anwesenheit von 2,5 M Ammoniumazetat Ethanol-präzipitiert und auf einem 0,8%igen "low-melt" Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt. Die kontaminierenden Adapter sowie cDNA unter 0,6 kb Länge wurden aus dem Gel ausgeschnitten. Die Elektroden wurden umgekehrt und die cDNA elektrophoretisch aufgetrennt, bis sie sich in der Nähe des Spurbeginns konzentrierte. Der die konzentrierte cDNA enthaltende Bereich des Gels wurde ausgeschnitten und in ein Mikrozentrifugenröhrchen platziert, und das ungefähre Volumen des Gelstücks bestimmt. Ein Wasseraliquot, welches ungefähr dem dreifachen Volumen des Gelstücks (300 μl) entsprach, und 35 μl 10 × β-Agarose I-Puffer (New England Biolabs) wurden dem Röhrchen zugegeben, und die Agarose wurde durch 15-minütiges Erhitzen auf 65°C geschmolzen. Nach Einstellen der Probe auf 45°C wurden 3 μl 1 E/μl β-Agarase I (New England Biolabs, Beverly, MA) zugegeben, und das Gemisch wurde zum Verdauen der Agarose für 60 Minuten bei 45°C inkubiert. Nach der Inkubation wurden der Probe 40 μl 3 M Natriumazetat zugesetzt, und das Gemisch wurde für 15 Minuten auf Eis inkubiert. Die Probe wurde für 15 Minuten bei Raumtemperatur bei 14,000 × g zentrifugiert, um die unverdaute Agarose zu entfernen. Die cDNA wurde Ethanol-präzipitiert, in 70%igem Ethanol gewaschen, luftgetrocknet und in 40 μl Wasser resuspendiert.
  • Nach der Wiedergewinnung aus dem "low-melt" Agarosegel wurde die cDNA in die Eco RI und Xho I Stellen eines Phagmid-Vektors (pBluescript II SK+; Stratagene, La Jolla, CA) kloniert und in DH10B-Zellen elektroporiert.
  • Bakterielle Kolonien, die ESTs von bekannten Genen enthielten, wurden identifiziert und aus Sequenzanalysen durch wiederholte Zyklen von Sondenhybridisierung an "hi-density" Kolonie-Filter-Arrays (Genome Systems, St. Louis, MI) entfernt. cDNAs bekannter Gene wurden in Gruppen zu 50–100 Inserts gepoolt und mit 32P-α-dCTP unter Verwendung eines MEGAPRIME labeling Kits (Amersham, Arlington Heights, IL) markiert. Kolonien, die nicht an das Sondengemisch hybridisierten, wurden zum Sequenzieren ausgewählt. Das Sequenzieren wurde unter Verwendung automatisierter Vorrichtungen durchgeführt. Die resultierenden Daten wurden analysiert, was zur Identifizierung eines neuen, als SISF1000391 bezeichneten, ESTs führte. Die Sequenz dieses EST ist in SEQ ID NR: 24 dargestellt. Das Plasmid, welches dieses Insert enthielt, wurde als pSLSIG51-1 bezeichnet. Das Insert wurde sequenziert, wobei herausgefunden wurde, dass es die in SEQ ID NR: 1 dargestellte Sequenz enthält.
  • Anschließend an die Klonierung von pSLSIG51-1 wurde ein Zsig51-Klon in einer Hypophysen-cDNA-Bibliothek identifiziert.
  • Beispiel 2: Gewebeverteilung von Zsig51
  • Blots von humaner RNA (Human Multiple Tissue Northern Blots I, II, und III; und Human RNA Master Blot; Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA) wurden sondiert, um die Gewebeverteilung von Zsig51 zu bestimmen. Eine cDNA-Sonde wurde unter Verwendung von 20 pMol von jedem der Oligonukleotid-Primer ZC16,013 (SEQ ID NR: 25) und ZC16,014 (SEQ ID NR: 26) und 5 μl einer Pankreas-cDNA-Bibliothek (präpariert aus Pankreas-RNA unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Kits (MarathonTM cDNA amplification kit von Clontech Laboratories, Inc.) und 1:100 verdünnt) generiert. Die Sonde wurde durch PCR generiert, wobei das Reaktionsgemisch bei 94°C für eine Minute inkubiert wurde, gefolgt von 30 Zyklen bei 94°C, 20 Sekunden; 64°C, 30 Sekunden; 72°C, 30 Sekunden; anschließend erfolgte eine finale "Extension" für 7 Minuten bei 72°C. Die Reaktionsprodukte wurden auf einem 1,25%igem Trisborat/EDTA-Gel elektrophoretisch aufgetrennt und die 180 bp-Produkte wurden aus dem Gel ausgeschnitten. Die DNA wurde unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Kits (QIAquickTM Gel Extraction Kit; Qiagen, Inc., Santa Clarita, CA) aus dem Gelstück extrahiert. Dieses PCR-Produkt wurde sequenziert und es wurde gefunden, dass es ein Teil der Zsig51-Sequenz ist. 98,7 ng des extrahierten Fragments wurden mit 32P (MultiprimeTM DNA Labeling System; Amersham Corporation, Arlington Heights, IL) markiert. Nicht-inkorporierte Radioaktivität wurde durch Säulenchromatographie unter Verwendung einer kommerziell erhältlichen Drucksäule (NucTrap® Säule; Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA; siehe US-Patent Nr. 5,336,412) entfernt. Die Blots wurden für drei Stunden bei 65°C in einer Hybridisierungslösung (ExpressHybTM Hybridisation Solution; Clonetech Laboratories, Inc.), die 1 mg gekochte Lachssperma-DNA enthielt, prähybridisiert. 10,2 × 106 cpm der Sonde und 1 mg Lachssperma-DNA wurden für 5 Minuten gekocht, eisgekühlt, mit 10 ml der ExpressHybTM-Lösung gemischt und den Blots zugesetzt. Die Blots wurden in der Lösung über Nacht bei 65°C inkubiert. Initiale Waschungen wurden für 40 Minuten in 2 × SSC, 0,1% SDS bei Raumtemperatur durchgeführt, gefolgt von einer 40-minütigen Waschung bei 50°C in 0,1 × SSC, 0,1% SDS mit einmaligem Wechsel der Waschlösung. Die gewaschenen Blots wurden bei –80°C über Nacht einem Film exponiert, anschließend wieder mit 0,1 × SSC, 0,1% SDS bei 65°C für 40 Minuten gewaschen, um den Hintergrund zu entfernen und über Nacht bei –80°C exponiert. Hohe Expression wurde in Pankreas festgestellt, mit niedrigerer Expression in Hypophyse. Die Transkriptgröße betrug ungefähr 1kb.
  • Zusätzliche Northern Blot Experimente wurden im Wesentlichen wie vorstehend offenbart unter Verwendung einer längeren humanen Zsig51 Sonde durchgeführt. In Pankreas und Hypophyse wurde ähnliche Expression festgestellt, und ein in geringem Überschuss vorhandenes Transkript von ungefähr 4 kb wurde in humanen Testis gezeigt.
  • Beispiel 3: Chromosomale Kartierung
  • Humanes Zsig51 wurde unter Verwendung des kommerziell erhältlichen GenBridge 4 Radiation Hybrid Panel (Research Genetics, Inc., Huntsville, AL) auf Chromosom 11 kartiert. Das GeneBridge 4 Radiation Hybrid Panel enthält PCR-fähige DNAs von jedem der 93 Strahlungshybridklone, zzgl. zwei Kontroll-DNAs (den HFL-Donor und den A23-Empfänger). Ein öffentlich zugänglicher www-Server (http://www-genome.wi.mit.edu/cgibin/contig/rhmapper.pl) erlaubte die Kartierung im Verhältnis zur "Whitehead Institute/MIT Center for Genome Research's radiation hybrid map" des humanen Genoms (the "WICGR" radiation hybrid map), welche mit dem GeneBridge 4 Radiation Hybrid Panel konstruiert wurde.
  • Für die Kartierung ("Mapping") von Zsig51, wurden 20 μl Reaktionsgemische in eine PCR-fähige 96-Well Mikrotiterplatte (Stratagene, La Jolla, CA) vorgelegt und in einem Thermocycler (RoboCycler® Gradient 96; Stratagene) verwendet. Jedes der 95 PCR-Reaktionsgemische enthielt 2 μl Puffer (10 × KlenTaq PCR-Reaktionspuffer; Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA), 1,6 μl dNTP Mix (jeweils 2,5 mM, Perkin-Elmer, Foster City, CA), 1 μl Sense Primer ZC16,761 (SEQ ID NR: 27), 1 μl Antisense-Primer ZC16,760 (SEQ ID NR: 28), 2 μl eines Dichte-erhöhenden Agens und ein "Tracking Dye" (RediLoad, Research Genetics, Inc., Huntsville, AL), 0,4 μl eines kommerziell erhältlichen DNA Polymerase-/Antikörpermixes (50 × AdvantageTM KlenTaq Polymerase Mix; Clontech Laboratories, Inc.), 25 ng DNA von einem einzelnen Hybrid-Klon oder von der Kontrolle sowie ddH2O in einem Gesamtvolumen von 20 μl. Die Gemische wurden mit gleicher Menge Mineralöl überschichtet und versiegelt. Die PCR-Cycler-Bedingungen waren wie folgt: eine initiale 5-minütige Denaturierung bei 95°C; 35 Zyklen einer 1-minütigen Denaturierung bei 95°C, 1 Minute "Annealing" bei 66°C und 1,5 Minuten Extension bei 72°C; gefolgt von einer finalen Extension für 7 Minuten bei 72°C. Die Reaktionsprodukte wurden durch Elektrophorese auf einem 2%igen Agarosegel (Life Technologies, Gaithersburg, MD) aufgetrennt.
  • Die Ergebnisse zeigten, dass Zsig51 6,40 cR_3000 vom "Framework" Marker WI-1409 auf der Chomosom 11 "WICGR radiation hybrid map" kartiert. Proximale und distale Framework Marker waren WI-1409 bzw. D11S913. Die Verwendung umgebender Marker positionierte Zsig51 im 11q13.1 Bereich auf der integrierten LDB Chromosom 11 Karte (The Genetic Location Database, University of Southhampton, WWW-Server: http://cedar.genetics.soton.ac.uk/public_html/.
  • Beispiel 4: Maus Zsig51
  • Eine Maus Zsig51 DNA Sequenz wurde in einer "expressed sequence tag" Datenbank (Marra et al., The WashU-HHMI Mouse EST Project, 1996) identifiziert. Ein dem EST entsprechender Klon wurde als eine E. coli Transformante erhalten. Die Transformante wurde auf einer 175 μg/ml Ampizilin und 25 μg/ml Methizilin enthaltenden LB-Platte aufgestrichen und über Nacht bei 37°C inkubiert. Das cDNA-Insert wurde sequenziert und es wurde gefunden, dass es einen für 128 Aminosäuren kodierenden offenen Leserahmen enthält, einschließlich eines putativen 20 Aminosäure-sekretorischen Peptids. Die DNA und Aminosäuresequenzen sind in SEQ ID NR: 31 bzw. NR: 32 dargestellt.
  • Beispiel 5: Chromosomale Kartierung des Maus Zsig51 Gens
  • Das Zsig51 Gen wurde in Maus unter Verwendung des kommerziell erhältlichen "Mouse T31 whole genome radiation hybrid (WGRH) Panels" (Research Genetics, Inc., Huntsville, AL) und "Map Manager QT linkage analysis" Programm kartiert. Das "T31 WGRH Panel" enthält PCR-fähige DNAs von jedem der 100 Strahlungshybridklone, zzgl. zwei Kontroll-DNAs (der 129AS-Donor und der A23-Empfänger). Für die Kartierung wurden wie im Wesentlichen in Beispiel 3 offenbart, 20 μl Reaktionen unter Verwendung des Sense-Primers ZC18,588 (SEQ ID NR: 40), 5' CCG TTT CTC CCG CTA CTA 3', und des Antisense-Primers ZC18,589 (SEQ ID NR: 41), 5' GGG CCA ACC TCA TCT TCA 3' durchgeführt. Die PCR-Cycler-Bedingungen waren wie folgt: eine initiale 5-minütige Denaturierung bei 94°C; 35 Zyklen von 1 Minute Denaturierung bei 94°C, 1 Minute Annealing bei 66°C, 90 Sekunden Extension bei 72°C, gefolgt von einer finalen Extension von 7 Minuten bei 72°C. Die Reaktionsprodukte wurden durch Elektrophorese auf einem 2%igen Agarosegel (Life Technologies, Gaithersburg, MD) aufgetrennt.
  • Bei P = 0,0001 band Maus Zsig51 an den Marker D19Mit68 mit einem LOD Score von 8.2. D19Mit68 wurde bei 6,0 cM auf dem Mauschromosom 19 kartiert. Dies ist ein bekannter Bereich der Syntenie- oder Bindungskonservierung mit dem Bereich des humanen Chromosoms 11, wo die humane Form von Zsig51 kartiert wurde.
  • Beispiel 6: Ratten Zsig51 cDNA
  • Aus Ratten-Pankreas-Inselzellen extrahierte RNA wurde revers transkribiert. Die Erststrang-cDNA-Reaktion enthielt 16 μl der Ratten-Pankreas-Inselzell-Poly d(T) selektierten Poly(A)+ mRNA in einer Konzentration von 0,4 μg/ml, und 2 μl 20 pMol/μl des eine Xho I Restriktionsschnittstellen enthaltenden Erststrangprimers (ZC6172; SEQ ID NR: 33). Das Gemisch wurde für 3 Minuten auf 70°C erhitzt und durch Abkühlen auf Eis gekühlt. Die Erststrang-cDNA-Synthese wurde initiiert durch die Zugabe von 8 μl Erststrangpuffer (5 × SUPERSCRIPTTM Puffer; Life Technologies, Gaithersburg, MD), 4 μl 100 mM Dithiothreitol, und 2 μl einer Deoxynukleotidtriphosphat (dNTP)-Lösung, enthaltend jeweils 10 mM dTTP, dATP, dGTP und 5-Methyl-dCTP (Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, NJ) zum RNA-Primergemisch. Das Reaktionsgemisch wurde für 2 Minuten bei 45°C inkubiert, gefolgt von der Zugabe von 10 μl 200 E/μl RNase H– reverse Transkriptase (SUPERSCRIPT II®; Life Technologies). Die Effizienz der Erststrangsynthese wurde in einer parallelen Reaktion durch die Zugabe von 10 μCi 32P-α-dCTP zu einem 5 μl Aliquot von einem der Reaktionsgemische analysiert, um die Reaktion für die Analyse zu markieren. Die Reaktionsgemische wurden für 50 Minuten bei 45°C inkubiert, anschließend für 10 Minuten bei 50°C. Nicht-inkorporiertes 32P-α-dCTP in den markierten Reaktionen wurde durch Chromatographie über eine 400er Porengröße Gelfiltrationssäule (Clontech Laboratories, Inc.) entfernt. Die nicht-inkorporierten Nukleotide und Primer in den unmarkierten Erststrangreaktionen wurden durch Chromatographie über eine 400er Porengröße Gelfiltrationssäule entfernt. Die Länge der markierten Erststrang-cDNA wurde durch Agarose-Gelelektrophorese bestimmt.
  • Die Zweitstrang-Reaktion enthielt 100 μl der nicht-markierten Erststrang-cDNA, 30 μl 5 × Polymerase I Puffer (125 mM Tris-HCl, pH 7,5, 500 mM KCl, 25 mM MgCl2, 50 mM (NH4)2SO4)), 2,0 μl 100 mM Dithiothreitol, 3,0 μl einer Lösung enthaltend 10 mM von jedem Deosxynukleotidtriphosphat, 7 μl 5 mM β-NAD, 2,0 μl 10 E/μl E. coli DNA Ligase (New England Biolabs), 6 μl 10 E/μl E. coli DNA Polymerase I (New England Biolabs, Beverly, MA), sowie 1,5 μl 2 E/μl RNase H (Life Technologies). Ein 10 μl Aliquot von jeder der Zweitstrang-Synthese-Reaktionen wurde durch die Zugabe von 10 μCi 32P-α-dCTP markiert, um die Effizienz der Zweitstrang-Synthese zu kontrollieren. Die Reaktionen wurden bei 16°C für 2 Stunden inkubiert, gefolgt von der Zugabe von 1 μl einer 10 mM dNTP-Lösung sowie 6,0 μl T4-DNA-Polymerase (10 E/μl, Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) und für weitere 10 Minuten bei 16°C inkubiert. Nicht-inkorporiertes 32P-α-dCTP im Reaktionsgemisch wurde vor Analyse durch Agarosegelektrophorese durch Chromatographie über eine 400er Porengrößegelfiltrationssäule entfernt. Die Reaktion wurde terminiert durch die Zugabe von 5 μl 0,5 M EDTA und Extraktion erfolgte mit Phenol/Chloroform und Chloroform gefolgt von Ethanolpräzipitation in der Anwesenheit von 3,0 M Na-Acetat und 2 μl eines Farbstoffmarkierten Trägers (Pellet PaintTM Co-Prezipitant; Novagen, Madison, WI). Die cDNA-Ausbeute wurde, ausgehend von einem mRNA Template von 10 μg, auf ungefähr 2 μg geschätzt.
  • Eco RI Adapter wurden an die 5' Enden der vorstehend beschriebenen cDNA ligiert, um das Klonieren in einen Expressionsvektor zu ermöglichen. Ein 10 μl Aliquot cDNA (~1,0 μg) und 4 μl des 69 pMol/μl Eco RI Adapters (Pharmacia LKB Biotechnology Inc., Piscataway, NJ) wurden mit 2,5 μl 10 × Ligasepuffer (660 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mM MgCl2), 2,5 μl 10 mM ATP, 3,5 μl 0,1 M DTT und 1 μl 15 E/μl T4 DNA Ligase (Promega Corp., Madison, WI) gemischt. Die Reaktion wurde 1 Stunde bei 5°C, 2 Stunden bei 7,5°C, 2 Stunden bei 10°C, 2 Stunden bei 12,5°C und 16 Stunden bei 10°C inkubiert. Die Reaktion wurde terminiert durch die Zugabe von 65 μl H2O und 10 μl 10 × H-Puffer (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) und für 20 Minuten bei 70°C inkubiert.
  • Um das direktionale Klonieren der cDNA in einen Expressionsvektor zu erleichtern, wurde die cDNA mit Xho I verdaut, woraus eine cDNA mit einem 5' Eco RI kohäsiven Ende und einem 3' Xho I kohäsiven Ende resultierte. Die Xho I Restriktionsschnittstelle am 3'-Ende der cDNA ist vorher eingeführt worden. Der Restriktionsenzymverdau wurde in einem Reaktionsgemisch durch die Zugabe von 1,0 μl 40 E/μl Xho I (Boehringer Mannheim) durchgeführt. Der Verdau wurde bei 37°C für 45 Minuten durchgeführt. Die Reaktion wurde terminiert durch die Inkubation bei 70°C für 20 Minuten und Chromatographie über eine 400er Porengröße Gelfiltrationssäule.
  • Die cDNA wurde Ethanol-präzipitiert, gewaschen mit 70% Ethanol, luftgetrocknet und resuspendiert in 13 μl Wasser, 2 μl 10 × Kinasepuffer (660 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM MgCl2); 0,5 μl 0,1 M DTT, 2,5 μl 10 mM ATP, 2 μl T4 Polynukleotidkinase (10 E/μl, Life Technologies). Nach Inkubation bei 37°C für 30 Minuten wurde die cDNA Ethanol präzipitiert in der Anwesenheit von 2,5 M Ammoniumacetat und auf einem 0,8%igem "low-melt" Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt. Die kontaminierenden Adapter sowie c-DNA in einer Länge von weniger als 0,6 kb wurden aus dem Gel entfernt. Die Elektroden wurden umgekehrt und die cDNA wurde elekrophoretisch aufgetrennt, bis sie sich in der Nähe des Spurbeginns konzentrierte. Der Bereich des Gels, der die konzentrierte cDNA enthielt, wurde ausgeschnitten und in ein Mikrozentrifugenröhrchen platziert und das angefähre Volumen des Gelstücks bestimmt. Ein Wasseraliquot mit ungefähr 3fachem Volumen des Gelstücks (300 μl) sowie 35 μl 10 × β-Agarase I Puffer (New England Biolabs) wurden zum Röhrchen gegeben und die Agarose wurde durch Erhitzen auf 65°C für 15 Minuten geschmolzen. Nach Einstellen der Probe auf 45°C, wurden 3 μl von 1 E/μl β-Agarase I (New England Biolabs, Beverly, MA) zugegeben und das Gemisch wurde für 60 Minuten bei 45°C inkubiert, um die Agarose zu verdauen. Nach der Inkubation wurden der Probe 40 μl 3 M Na-Acetat zugesetzt und das Gemisch wurde für 15 Minuten auf Eis inkubiert. Die Probe wurde bei 14.000 × g für 15 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert, um die unverdaute Agarose zu entfernen. Die cDNA wurde Ethanol präzipitiert, in 70%igem Ethanol gewaschen, luftgetrocknet und in 40 μl Wasser resuspendiert.
  • Nach der Wiedergewinnung aus dem "low melt" Agarosegel, wurde die cDNA in die Eco RI und Xho I Stellen des Phagmidvektors (pBluescript® II SK(+); Stratagene, La Jolla, CA) kloniert und in DH10B-Zellen elektroporiert.
  • 1,5 Millionen pfu aus der Ratten-Pankreas-cDNA-Bibliothek wurden auf 150 mm NZY-Platten mit einer Dichte von 40.000 pfu/Platte auf elektroporationskompetente E. coli Zellen (XL1-Blue MRF' Stang; Stratagene) ausplattiert. Nach Über-Nacht-Inkubation bei 37°C wurden unter Verwendung von Nylonmembranen (Hybond-NTM; Amersham Corporation, Arlington Heights, IL) gemäß Herstellerangabe Filterabdrücke gemacht. Die Filter wurden durch Denaturierung in einer Lösung, enthaltend 1,5 M NaCl und 0,5 M NaOH für 7 Minuten bei Raumtemperatur bearbeitet. Die Filter wurden in 0,5 M Tris:HCl, pH 7,2 für 7 Minuten neutralisiert. Die Phagen-DNA wurde mit 1200 μJoule UV-Energie in einem UV-Crosslinker (Stratagene) auf den Filtern fixiert. Die Filter wurden anschließend mit 0,25 × SSC bei 70°C gewaschen, um überschüssiges Zelldebris zu entfernen.
  • Unter Verwendung der Oligonukleotidprimer ZC16763 (SEQ ID NR:34) und ZC16753 (SEQ ID NR: 35) sowie des Plasmids pSLSIG51-1 als Template wurde durch PCR eine Sonde erzeugt. Ein μl einer 1:100 Verdünnung der zum Sequenzieren von pSLSIG51-1 verwendeten Plasmidpräparation wurde mit einem μl 10 pmol/μl ZC16763, 1 μl 20 pmol/μl ZC16753 sowie 45 μl eines Gemisches aus Taq-DNA-Polymerase, Salzen, Magnesium, und Desoxynukleotidtriphosphaten (PCR Supermix; Life Technologies, Gaithersburg, MD) vereint. Die Amplifikation wurde bei 94°C für 30 Sekunden durchgeführt, gefolgt von 35 Zyklen mit 20 Sekunden bei 94°C, 20 Sekunden bei 55°C, und 1 Minute bei 68°C; gefolgt von einer finalen 5-minütigen Inkubation bei 68°C. Die Sonde wurde durch Gelelektrophorese gereinigt.
  • Die Filter wurden 6 mal für 30 Minuten in heißem 0,25 × SSC, 0,25% SDS vorgewaschen, über Nacht bei 60°C in der gleichen Lösung, enthaltend eine 1:200 Verdünnung denaturierter Heringssperma DNA, prähybridisiert, anschließend über das Wochenende bei 60°C in Hybridisierungslösung (enthaltend, pro Liter: 250 ml 20 × SSC (0,45 μl filtriert), 50 ml 100 × Denhardt's (5 Prime-3 Prime, Boulder, CO), 2 ml 0,5 M EDTA, 20 ml 10% SDS (Research Genetics, Huntsville, AL) und Wasser (Baxter, McGaw Park, IL) enthaltend 20 μl/ml gescherte DNA (Research Genetics), denaturiert bei 98°C für 10 Minuten und ~7,5 μl Sonde, denaturiert bei 98°C für 4 Minuten, an die Sonde hybridisiert. Positive wurden nochmals ausplattiert und Filter-präpariert. Diese zweiten Filter wurden 5-mal für 30 Minuten mit heißem 0,25 × SSC, 0,25% SDS vorgewaschen und über Nacht bei 60°C in 0,25 × SSC, 0,25% SDS, enthaltend eine 1:50-Verdünnung denaturierter Heringssperma-DNA, prähybridisiert. Die Filter wurden anschließend mit der Sonde in Hybridisierungslösung, enthaltend 20 μl/ml denaturierte, gescherte DNA (wie oben) sowie etwa 6 μl/ml denaturierte Sonde, über Nacht bei 60°C mit der Sonde hybridisiert. Positive des zweiten Screenings wurden ausplattiert und tertiäre Filter präpariert. Die tertiären Filter wurden mit der gleichen Sonde, wie für die zweiten Filter verwendet, sondiert, unter Verwendung von 4,4 μl/ml denaturierter Sonde + 20 μl/ml denaturierter, gescherter DNA. Viele der tertiären Filter zeigten schwarze Punkte ("spots") auf dem Film. Acht Pfropfen wurden aus den tertiären Platten ausgeschnitten. Für jeden der acht Pfropfenproben wurden 150 μl elektroporationskompetente E. coli Zellen (XL1-Blue MRF'-Stamm; Stratagene, La Jolla, CA) mit 75 μl Phage plus 1 μl Interferenz-resistentem Helferphagen (ExAssistTM; Stratagene) infiziert. Die Zellen wurden bei 37°C für 15 Minuten inkubiert, anschließend wurden 3 ml LB zugegeben, gefolgt von einer Inkubation für weitere 3 Stunden mit Schütteln. Ein 1-ml-Aliquot wurde entnommen und für 15 Minuten auf 70°C erhitzt, anschließend für 15 Minuten bei 4000 rpm zentrifugiert. Der Überstand wurde in ein neues Röhrchen überführt und über Nacht bei 4°C gelagert. Am nächsten Tag wurden E. coli Zellen (XLOLR-Stamm; Stratagene, La Jolla, CA) bis zu einer O.D. von 1,0 kultiviert, anschließend wurden 200 μl XLOLR-Zellen und 15 μl Phagenserum vereint und für 15 Minuten bei 37°C inkubiert. 300 μl LB wurdn zugegeben und das Gemisch wurde für 45 Minuten bei 37°C inkubiert. Von jeder Probe wurden mit LB Verdünnungen (1:10, 1:100 und 1:1000) hergestellt. Von jeder Verdünnung wurden 50 μl plattiert.
  • Von sieben der Pfropfen wurden Kulturen präpariert und die Insertgröße wurde durch PCR unter Verwendung des Phagen als Template sowie 1 μl von jedem der Primer ZC5995 (SEQ ID NR: 36) und ZC5996 (SEQ ID NR: 37) bestimmt. PCR-Supermix (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD) (45 μl/Reaktion) wurde verwendet. Die Reaktion wurde in einem Thermocycler (Progene Techne) bei 94°C, 1 Minute; 30 Zyklen von 95°C, 20 Sekunden; 64°C, 20 Sekunden; 68°C, 3 Minuten; gefolgt von einer Inkubation bei 68°C, 10 Minuten und einer Haltezeit bei 10°C durchgeführt.
  • Vier der Proben hatten Inserts, die etwa 1300 bp lang zu sein schienen. Einer der Klone wurde sequenziert und als das Rattenortholog von humanem Zsig51 identifiziert. Die Sequenz ist in SEQ ID NR: 38 sowie NR: 39 dargestellt.
  • Beispiel 7: Zsig51 Adenovirus-Vektorkonstruktion
  • Die für Protein kodierenden Bereiche von humanem und Maus-Zsig51 wurden von durch PCR unter Verwendung von Primern amplifiziert, welche FseI- und AscI-Restriktionsschnittstellen an die 5'- bzw. 3'-Enden fügten. Die PCR-Primer ZC17438 (SEQ ID NR: 42) und ZC17439 (SEQ ID NR: 43) wurden mit dem die "full-length" Human-Zsig51-cDNA enthaltenden Template-Plasmid verwendet. PCR-Primer ZC17950 (SEQ ID NR: 44) und ZC17951 (SEQ ID NR:45) wurden mit dem die "full-length" Maus-Zsig51-cDNA enhaltenden Template-Plasmid in einer PCR-Reaktion wie folgt verwendet: 95°C für 5 Minuten; 15 Zyklen bei 95°C für 1 Min., 58°C für 1 Min., sowie 72°C für 1,5 Min.; 72°C für 7 Min.; gefolgt von einer Haltezeit bei 4°C. Die PCR-Reaktionsprodukte wurden auf ein 1,2%iges ("low melt") Agarose (SeaPlaque GTG; FMC, Rockland, ME) Gel in TAE-Puffer geladen. Die Zsig51-PCR-Produkte wurden aus dem Gel ausgeschnitten und unter Verwendung einer eine Silikagel-Membran enthaltenden Spinsäule (QIAquickTM Gel Extraction Kit; Qiagen, Inc., Valencia, CA) gereinigt. Die PCR-Produkte wurden anschließend mit FseI und AscI verdaut, Phenol/Chloroform-extrahiert, EtOH-präzipitiert und rehydriert in 20 μl TE (Tris/EDTA, pH 8). Die 390 bp (human) und 387 bp (Maus) Zsig51-Fragmente wurden anschließend in die FseI-AscI-Stellen des Vektors pMT12-8 (Beispiel 10, unten) ligiert und in DH10B kompetente Zellen durch Elektroporation transformiert. Klone, die Zsig51-Inserts enthielten, wurden durch Plasmid-DNA Miniprep, gefolgt von Verdau mit FseI und AscI identifiziert. Ein positiver Klon wurde sequenziert, um sicher zu gehen, dass das Konstrukt keine Deletionen oder andere Anomalien enthielt. DNA wurde unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Kits (erhalten von Qiagen, Inc.) präpariert.
  • Die Zsig51-cDNA wurde unter Verwendung der Enzyme FseI und AscI aus dem pTG12-8-Vektor freigesetzt. Die cDNA wurde auf einem 1%igen "low melt" Agarosegel isoliert und aus dem Gel ausgeschnitten, und die Gelstücke wurden bei 70°C geschmolzen, zweimal mit einem gleichen Volumen Tris-gepuffertem Phenol extrahiert und EtOH-präzipitiert. Die DNA wurde in 10 μl H2O resuspendiert. Die cDNA wurde in den pACCMV-Shuttlevektor (Microbix Biosystems, Inc., Ontario, Kanada) ligiert, in welchem die Polylinker insoweit modifiziert waren, als dass sie FseI- und AscI-Stellen enthielten, und in E. coli-Wirtszellen (Electromax DH10BTM-Zellen; erhalten von Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD) durch Elektroporation transformiert. Die Klone, die Zsig51-Inserts enthielten, wurden durch Plasmid-DNA-Miniprep, gefolgt von Verdau mit FseI und AscI, identifiziert. Für die Transfektion wurde eine DNA-Präparation in großem Maßstab durchgeführt.
  • Die Zsig51-enthaltenden Shuttlevektoren wurden co-transfiziert mit E1-deletiertem, Adenovirus-Vektor pJM17 (Microbix Biosystems, Inc.) in 293A-Zellen (Quantum Biotechnologies, Inc. Montreal, QC, Kanada), welche das Adenovirus-E1-Gen exprimieren. Die DNA wurde mit sterilem HBS (150 mM NaCl, 20 mM HEPES) auf ein Gesamtvolumen von 50 μl verdünnt. In einem gesonderten Röhrchen wurden 20 μl DOTAP (Boehringer Mannheim, 1 mg/ml) mit HBS auf ein Gesamtvolumen von 100 μl verdünnt. Die DNA wurde zu dem DOTAP gegeben, durch Auf- und Ab-Pipettieren vorsichtig gemischt und für 15 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen. Das Medium wurde von den 293A-Zellen entfernt und mit 5 ml serumfreiem MEMalpha, enthaltend 1 mM Natriumpyruvat, 0,1 mM MEM nicht-essentielle Aminosäuren und 25 mM HEPES-Puffer (alles von Life Technologies, Inc.) gewaschen. 5 ml des serumfreien MEM wurde zu den 293A-Zellen zugegeben und bei 37°C gehalten. Das DNA/Lipidgemisch wurde tropfenweise zu der T25-Flasche mit 293A-Zellen gegeben, vorsichtig gemischt und bei 37°C für 4 Stunden inkubiert. Nach 4 Stunden wurde das das DNA/Lipidgemisch enthaltende Medium abgesaugt und mit 5 ml vollständigem MEM-Medium, enthaltend 5% fötales Kälberserum ersetzt. Virusvermehrung ist konditional und wurde nur durch Wachstum des E1-deletierten Virus in einer das E1-Gen exprimierenden Zelllinie erreicht.
  • Die Zellen wurden für 2–4 Wochen gehalten, bis das Rekombinationsereignis eintrat. (Rekombinantes Virus wird durch homologe Rekombination der überlappenden Fragmente des viralen Genoms im pJM17-Vektor und dem Shuttle-Vektor erzeugt.) Zu der Zeit wurden die 293-Wirtszellen durch das Virus lysiert, und Plaques toter Zellen gebildet. Innerhalb von 3–5 Tagen war die gesamte Zellschicht vollständig lysiert. Das die viralen Lysate enthaltende Medium wurde gesammelt und jede verbleibende intakte Zelle wurde durch Wiederholen von Gefrier-/Tauzyklen lysiert und Zelldebris durch Zentrifugation pelletiert.
  • Die viralen Lysate wurden anschließend gemäß dem Verfahren von Becker et al., Meth., Cell Biol. 43:161–189, 1994, Plaque-gereinigt. In Kürze: Serielle Verdünnungen wurden hergestellt in DMEM, enthaltend 10% fötales Kälberserum und 100 E/ml Penicillin/Streptomycin, auf einer Schicht mit 293 Zellen ausplattiert, und bei 37°C für eine Stunde inkubiert. Eine geschmolzene 1,3%ige Agarose-/Wasserlösung wurde mit 2 × DMEM (enthaltend 4% FBS, 200 E/ml Penicillin/Streptomycin, 0,5 μg/ml Fungizon und 30 mg/ml Phenolrot) gemischt, und 6 ml des Gemisches wurden den Virus-infizierten 293-Zellen zugesetzt, gefolgt von einer Inkubation bei 37°C, bis sich Plaques bildeten, 7–10 Tage. Einzelne Plaques wurden isoliert und die Anwesenheit des Zsig51-Inserts wurde durch PCR verifiziert. Die Primer waren ZC12700 (SEQ ID NR: 48) und ZC12742 (SEQ ID NR: 49). Amplifikation wurde durchgeführt über 30 Zyklen bei 94°C, 0,5 Minuten, 55°C, 0,5 Minuten und 72°C, 0,5 Minuten; gefolgt von einer 10-minütigen Extension bei 72°C. Jeweils ein Plaque für Human- und Maus-Zsig51, welcher ein PCR-Produkt der erwarteten Größe aufwies, wurde verwendet, um eine erste Amplifikation durchzuführen.
  • Zehn 10cm-Platten mit nahezu konfluenten (80–90%) 293A-Zellen wurden 20 Stunden zuvor vorbereitet. Ungefähr 5% der Viruslysate eines Plaques wurden zu jeder der 10cm-Platten gegeben und für 48 bis 72 Stunden unter Beobachtung des CPE (Cytopathischer Effekt) unter dem Weißlichtmikroskop kontrolliert. Sobald alle der 293A-Zellen CPE zeigten, wurde dieses 1°-Stocklysat gesammelt und 3 Gefrier-/Tauzyklen durchgeführt.
  • Für die sekundäre (2°) Amplifikation von Zsig51 rAdV wurden 20 15cm-Gewebekulturplatten von 293A-Zellen vorbereitet, so dass die Zellen 80–90% konfluent waren. Alles außer 20 ml der 5%-MEM-Medien wurde entfernt und jede Platte wurde mit 300–500 ml des 1°-amplifizierten rAdv-Lysats inokuliert. Nach 48 Stunden wurden die 293A-Zellen durch die Virusproduktion lysiert und die Lysate wurden in 250 ml-Polypropylen-Zentrifugenflaschen gesammelt.
  • Um das rekombinante Virus zu reinigen, wurde den Flaschen mit unbehandeltem Lysat NP-40-Detergens in einer Endkonzentration von 0,5% zugesetzt, um alle Zellen zu lysieren. Die Flaschen wurden für 10 Min. auf einer Rotationsplattform platziert und so schnell wie möglich geschüttelt, allerdings ohne dass die Flaschen herunterfielen. Das Debris wurde durch 15minütiges Zentrifugieren bei 20000 × G pelletiert. Der Überstand wurde in 250 ml- Polykarbonat-Zentrifugenflaschen überführt, und 0,5 Volumen einer 20% PEG8000/2,5 M NaCl-Lösung wurden zugegeben. Die Flaschen wurden über Nacht auf Eis geschüttelt. Die Flaschen wurden für 15 Minuten bei 20000 × G zentrifugiert und der Überstand in eine Bleichlösung verworfen. Unter Verwendung eines sterilen Zellschabers wurden die Präzipitate aus 2 Flaschen in 2,5 ml PBS resuspendiert. Die resultierende Viruslösung wurde in 2 ml-Mikrozentrifugenröhrchen platziert und für 10 Minuten bei 14000 × G zentrifugiert, um jedes zusätzliche Zelldebris zu entfernen. Der Überstand aus den 2 ml-Mikrozentrifugenröhrchen wurde in ein 15 ml-Polypropylen-Schnappdeckelröhrchen überführt und mit Cäsiumchlorid (CsCl) auf eine Dichte von 1,34 g/ml eingestellt. Das Volumen der Viruslösung wurde geschätzt und 0,55 g/ml CsCl wurden zugegeben. Das Cäsiumchlorid (CsCl) wurde gelöst, und 1 ml dieser Lösung wog 1,34 g. Die Lösung wurde in dickwandige 3,2 ml-Polykarbonat-Zentrifugenröhrchen (Beckman) überführt und bei (348,000 × G) für 3–4 Stunden bei 25°C zentrifugiert. Das Virus formte ein weißes Band. Unter Verwendung von weitgebohrten Pipettenspitzen wurde das Virusband gesammelt.
  • Das Virus aus dem Gradienten enthielt eine große Menge CsCl, welches entfernt wurde, bevor es auf Zellen verwendet werden konnte. Um die Viruspräparation zu entsalzen, wurden Pharmacia PD-10-Säulen, vorgepackt mit Sephadex G-25M (Pharmacia), verwendet. Die Säule wurde mit 20 ml PBS äquilibriert. Das Virus wurde geladen und es wurde ihm erlaubt, in die Säule zu laufen. 5 ml PBS wurden der Säule zugesetzt und Fraktionen von 8–10 Tropfen wurden gesammelt. Die optischen Dichten der 1:50-Verdünnungen jeder Fraktion wurden bei 260 nm in einem Spektrophotometer bestimmt. Ein deutlicher Absorptionspeak trat zwischen den Fraktionen 7–12 auf. Diese Fraktionen wurden gepoolt und die optische Dichte (OD) einer 1:50-Verdünnung wurde bestimmt. Die OD wurde unter Verwendung der Formel (OD bei 260 nm)(50)(1,1 × 1012) = Virione/ml auf die Viruskonzentration umgerechnet. Die Human-Zsig51 rAdV-Konzentration betrug 6,1 × 1012 Virione/ml. Die Maus-Zsig51-Viruskonzentration betrug 9,2 × 1012.
  • Um das Virus zu lagern, wurde dem gereinigten Virus Glyzerin in einer Endkonzentration von 15% zugesetzt, vorsichtig, aber effektiv gemischt und in Aliquots bei –80°C gelagert.
  • Um die Infektionsität des rekombinanten Virus zu messen, wurde ein von der Quantum Biotechnologies, Inc. (Montreal, Qc., Kanada) entwickeltes Protokoll befolgt. In Kürze: Zwei 96-Well-Gewebekulturplatten wurden mit 1 × 104 293A-Zellen pro Well in MEM, enthaltend 2% fötales Kälberserum, für jedes zu testende rekombinante Virus gesät. Nach 24 Stunden wurden 10fache Verdünnungen von jedem Virus von 1 × 10–2 auf 1 × 10–14 in MEM, enthaltend 2% fötales Kälberserum, hergestellt. Jedem der 20 Wells wurden 100 μl jeder Verdünnung zugesetzt. Nach 5 Tagen bei 37°C wurden die Zellen als entweder positiv oder negativ für CPE ausgelesen, und ein Wert für "Plaque Forming Units/ml" (PFU) wurde berechnet.
  • TCID50-Formulierung wurde gemäß Quantum Biotechnologies, Inc., oben, verwendet. Der Titer (T) wurde bestimmt von einer Platte, wo das verwendete Virus von 10–2 bis 10–14 verdünnt war, und 5 Tage nach der Infektion ausgelesen. Für jede Verdünnung wurde ein Verhältnis (R) von CPE-positiven Wells pro Gesamtzahl an Wells bestimmt.
  • Beispiel 8: Adenovirale Verabreichung von Zsig51 an normale Mäuse
  • Humane und Maus-Zsig51 s wurden unter Verwendung eines Adenovirusvektors, enthaltend den kodierenden Bereich des humanen Gens (Zsig51h; SEQ ID NR: 1) oder sein Maus-Ortholog (Zsig51m, SEQ ID NR: 31), an Mäuse verabreicht. Die Adenovirusvektoren wurden gemäß dem in Tabelle 5 dargestellten Versuchsschemata intravenös in C57B1/6-Mäuse injiziert. Blut wurde entnommen und an Tag 12 und anschließend wieder an Tag 21 für jedes Experiment analysiert. Alle Mäuse erhielten 3 Tage vor der Präparation Bromdesoxyuridin (BrdU) mit ihrem Trinkwasser. Die Mäuse wurden am Tag 21 präpariert. Die ermittelten Parameter schlossen Gewichtsänderungen, vollständige Blutbilder, Serumanalysen, Histologie, Organgewichte sowie die anhand BrdU-Inkorporierung gemessene Zellproliferation ein. Tabelle 5
    Gruppe 1 Zsig51 rAdV
    1 × 1011 Partikel/Dosis
    10 Weibchen/10 Männchen
    Gruppe 2 Null-AdV-Kontrolle
    1 × 1011 Partikel/Dosis
    10 Weibchen/10 Männchen
    Gruppe 3 keine Behandlung
    5 Weibchen/5 Männchen
  • In den Zsig51h-Versuchsgruppen waren die Glukosespiegel der Weibchen gegenüber den Null-Virus-Kontrollgruppen höher. In Zsig51m-Versuchsgruppen waren sowohl die Glukosespiegel der Männchen als auch die der Weibchen niedriger als die in den Null-Virus-Kontrollgruppen. Die gesenkte Glukose wurde in Zsig51m-Mäusen sowohl im Fastenzustand als auch in einem gut gefütterten Zustand beobachtet.
  • Die Lebergewichte waren bei Männchen und Weibchen in Zsig51m-Versuchsgruppen höher als in den Null-Virus-Kontrollgruppen
  • Beispiel 9: In situ-Hybridisierung
  • Frisches Gewebe wurde in 4% Paraformaldehyd bei 4°C über Nacht fixiert. Gewebe wurde in Paraffin unter Verwendung eines Standardprotokolls mit Ausnahme, dass Histoclear (National Diagnostics, Atlanta, GA) durch Xylen ersetzt wurde, eingebettete. 5–10-Mikron-Schnitte wurden auf Objektträger (SuperfrostTM Plus; VWR Scientific, West Chester, PA) geschichtet und die Objektträger wurden bei 37°C für 4 Stunden gebacken und anschließend bei 4°C gelagert. Alternativ wurden fixierte und geschnittene Gewebe aus kommerziellen Quellen bezogen. Die Objektträger wurden in Histoclear entwachst und durch eine Ethanolreihe rehydriert. Sie wurden anschließend luftgetrocknet und bei –20°C gelagert.
  • Für die in situ-Hybridisierung wurden die Objektträger auf Raumtemperatur erwärmt, jeder 3mal für 5 Minuten in Phosphat-gepufferter Saline, enthaltend 0,1% Polyoxyethylensorbitanmonolaurat (Tween 20) (PBT), gewaschen und anschließend in PBT mit Proteinase K in einer Konzentration von 2–100 μg/ml bei 37°C inkubiert. Die Objektträger wurden zweimal für 5 Minuten in PBT gespült, nochmals mit 4%igem Paraformaldehyd für 20 Minuten bei Raumtemperatur fixiert und zweimal für 5 Minuten in PBT gespült. Die Schnitte wurden durch Eintauchen der Objektträger in ein Gemisch aus 197 ml deionisiertem Wasser, 2,6 ml Triethanolamin und 350 μl Salzsäure azetyliert. 500 μl saures Anhydrid wurde unter Rühren Tropfen für Tropfen zugesetzt und die Inkubation der Objektträger in diesem Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 10 Minuten fortgesetzt. Die Objektträger wurden zweimal für 5 Minuten in PBT gewaschen, anschließend durch eine Methanolreihe dehydriert und luftgetrocknet.
  • Die Schnitte wurden hybridisiert mit einer in vitro transkribierten, Digoxigenin-markierten RNA-Antisense-Zsig51-Sonde, die den vollständigen Protein-kodierenden Bereich des Gens repräsentiert. Humane Gewebe wurden mit einem Antisense gegen das humane Gen (SEQ ID NR: 2, ausschließlich human kodierender Bereich) und Mausgewebe wurden mit einem Antisense gegen das Maus-Ortholog (SEQ ID NR: 32, ausschließlich Maus-kodierender Bereich) sondiert. Die Sonden wurden in einer Konzentration von 200 ng des 1 μg/ml in 50% Formamid, 10% Dextransulfat, 5 × SSC, 5 × Denhardt's Lösung, 250 μg/ml Hefe-tRNA, 500 μg/ml Lachssperma-DNA und 50 μg/ml Heparin verwendet. Die Hybridisierung wurde über Nacht bei 60–72°C durchgeführt. Die Objektträger wurden gewaschen, unter Verwendung von auf 60–72°C vorgeheizten Lösungen, in 50% Formamid, 2 × SSC, einmal für 15 Minuten, anschließend in einer frischen Waschlösung für 30 Minuten; und abschließend in 25% Formamid, 1 × SSC, 0,5 × PBS für 30 Minuten. Die Objektträger wurden anschließend zweimal in PBT bei Raumtemperatur für 5 Minuten gespült.
  • Die Schnitte wurden bei Raumtemperatur für 1 Stunde geblockt in 5% fettfreier Trockenmilch, 4 × SSC und 0,1% Tween 20 (Blocking-Lösung) mit einem Zusatz von 5% normalem Kaninchen- oder Ziegenserum. Die Objektträger wurden anschließend bei Raumtemperatur dreimal für 5 Minuten in PBT gespült. Schaf-Anti-Digoxigenin-Antikörper (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) wurde 1:1000 in der Blocking-Lösung verdünnt, zu den Objektträgern gegeben und für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Jeder der Objektträger wurde viermal für 15 Minuten in Blocking-Lösung gewaschen. Biotinylierter Kaninchen-Anti-Schaf-Antikörper (Vector Laboratories, Burlingane, CA) wurde 1:200 in Blocking-Lösung mit einem Zusatz von 7,5% normalem Mausserum verdünnt und, bevor sie zu den Objektträgern gegeben wurde, für weitere 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert wurden. Jeder der Objektträger wurde anschließend zweimal für 5 Minuten in Blocking-Lösung gewaschen. Avidin und biotinylierte Peroxidase (Vectastain® ABC-AP-Kit; Vector Laboratories) wurden gemäß den Angaben des Herstellers vorbereitet, bevor sie zu den Objektträgern gegeben wurden, welche anschließend für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert wurden. Jeder der Objektträger wurde zweimal für 5 Minuten in Blocking-Lösung gewaschen und anschließend in 0,1 M Tris, pH 9,5, 0,1 M Natriumchlorid, 50 mM Magnesiumchlorid (AP-Puffer) äquilibriert. Die Objektträger wurden in AP-Puffer mit 4,5 μl/ml 4-Nitro-Blautetrazoliumchlorid und 3,5 μl/ml 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat entwickelt, bis sich im Lichtmikroskop eine Färbung abzeichnete.
  • Alternativ wurde die in situ-Hybridisierung im Wesentlichen wie vorstehend durchgeführt, allerdings unter Verwendung einer Biotin-markierten Antisense-RNA-Sonde und eines kommerziell erhältlichen Detektionskits (Renaissance® TSATM Indirect Signal Amplification System; NEN Life Science Products, Boston, MA), nach Anweisung des Herstellers.
  • In humanem Testisgewebe wurde eine starke Färbung in unreifen Spermavorläufern gesehen. Die Testisproben waren von einem 46 Jahre alten Mann, der an einer Hirnblutung gestorben war, sowie von einem 58 Jahre alten Mann mit chronisch-obstruktiver Lungenkrankheit, der an akuter Atemnot starb.
  • In Testisgewebe von Maus war eine stark positive Färbung in Spermatogonien zu sehen.
  • Beispiel 10: Erzeugung von Zsig51-transgenen Mäusen
  • Oligonukleotide wurden entworfen, um ein PCR-Fragment zu erzeugen, das eine Konsensus-Kozak-Sequenz und den exakten Zsig51-kodierenden Bereich enthielt. Diese Oligonukleotide wurden mit einer FseI-Schnittstelle am 5'-Ende und einer AscI-Schnittstelle am 3'-Ende entworfen, um das Klonieren in pMT12-8, einen transgenen Expressionsvektor, der den Maus-MT-1-Promoter und ein 5'-Ratten-Insulin II-Intron "upstream" von der FseI-Schnittstelle aufwies, zu erleichtern.
  • Die PCR-Reaktionen wurden unter Verwendung eines Oligonukleotid-Primers durchgeführt, der entworfen wurde, um ein PCR-Fragment zu erzeugen, das eine Konsensus-Kozak-Sequenz und den exakten Zsig51-kodierenden Bereich mit einer FseI-Schnittstelle am 5'-Ende und einer AscI-Schnittstelle am 3'-Ende enthielt. Die Reaktionsgemische enthielten 20 ng humanes Zsig51-Template und Oligonukleotide ZC17438 (SEQ ID NR: 42) und ZC17439 (SEQ ID NR:43) oder Maus-Zsig51-Template und Oligonukleotide ZC17950 (SEQ ID NR: 44) und ZC17951 (SEQ ID NR: 45). Die PCR-Bedingungen waren wie folgt: 95°C für 5 Minuten; 15 Zyklen von 95°C für 60 Sekunden, 62°C für 60 Sekunden und 72°C für 90 Sekunden, und 72°C für 7 Minuten. Die PCR-Produkte wurden durch Agarosegel-Elektrophorese aufgetrennt und unter Verwendung einer eine Silikagelmembran (QIAquickTM Gel Extraction Kit; Qiagen, Inc. Valencia, CA) enthaltende Spin-Säule gereinigt. Die isolierten DNA-Fragmente wurden mit FseI und AscI (Boehringer Mannheim) verdaut, Ethanol-präzipitiert und in pMT12-8 ligiert, der zuvor mit FseI und AscI verdaut wurde. Das pMT12-8-Plasmid, entworfen zur Expression eines Gens von Interesse in transgenen Mäusen, enthielt eine Expressionskassette, die von 10 kb MT-1 5'-DNA und 7 kb von MT-1 3'-DNA flankiert wurde. Die Expressionskassette umfasst den Maus-MT-1-Promoter, ein Ratteninsulin-II-Intron, einen Polylinker für die Insertion des gewünschten Klons und die Poly-A-Sequenz des humanen Wachstumshormons.
  • Etwa ein Mikroliter von jedem der Ligationsgemische wurden in E. coli Wirtszellen (Elektromax DH10BTM Zellen; erhalten von Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD) nach Anweisung des Herstellers elektroporiert und auf LB-Platten ausplattiert, die 100 μg/ml Ampicillin enthielten, und über Nacht inkubiert. Kolonien wurden gepickt und in LB-Medium, das 100 μg/ml Ampicillin enthielt, angezogen. Aus den gepickten Klonen wurde Miniprep DNA präpariert und gescreent auf das zsig51 human oder Maus-Insert durch Restriktionsverdau mit EcoRI und anschließender Agarosegelelektrophorese. Aus den korrekten pMT-zsig51 Konstrukten wurden Maxipreps präpariert. Ein SalI-Fragment, das mit 5' und 3' flankierenden Sequenzen den MT-1 Promoter, das Ratteninsulin II Intron, zsig51 human oder Maus-cDNA, und die Poly-A-Sequenz des humanen Wachstumshormons enthielt, wurde präpariert und für die Mikroinjektion in fertile Maus-Oozyten verwendet um transgene "Founder"-Tiere zu erzeugen. Die Original-Oozyten und das Sperma, das verwendet wurde, um sie zu fertilisieren, stammt von F1-Hybriden von C3H und C57B1/6 Mäusen. In nachfolgenden Generationen wurden die Mäuse in jeder Generation mit C57B1/6 Mäusen gepaart. Die humanen Tansgene wurden als MTzsig51h bezeichnet, während die Maustransgene als MTzsig51m bezeichnet wurden.
  • Fünf männliche und fünf weibliche transgene Mäuse, die MTzsig51 h trugen, wurden identifiziert. Das Expressionslevel der Transgene in der Leber jeder Maus wurde durch realtime RT-PCR auf einem ABI Prism 7700 Sequence Detector (Perkin Elmer) quantifiziert.
  • Diese Analyse zeigte, dass keiner der Männchen ein messbares Level an Expression aufwies. Expressionslevel der Weibchen war wie folgt: 2 sehr hohe Expressoren (mehr als 10.000 mRNA-Moleküle/Leberzelle); 1 hoher Expressor (mehr 2.000 mRNA-Moleküle/Leberzelle); 1 mittlerer Expressor (ungefähr 600 mRNA-Moleküle/Leberzelle); und 1 niedriger Expressor (ungefähr 300 mRNA-Moleküle/Leberzelle).
  • Zwei männliche und zehn weibliche transgene Mäuse, das MTzsig51m trugen, wurden identifiziert. Der Expressionslevel der Transgene in der Leber jeder Maus wurde wie oben quantifiziert. Keines der Männchen hatte ein messbares Level an Expression. Expressionsprofile der Weibchen waren wie folgt: 5 sehr hohe Expressoren (mehr als 10.000 mRNA-Moleküle/Leberzelle); 1 hoher Expressor (mehr als 2.000 mRNA-Moleküle/Leberzelle); 1 mittlerer Expressor (ungefähr 1.100 mRNA-Moleküle/Leberzelle); 1 niedriger Expressor (ungefähr 300 mRNA-Moleküle/Leberzelle); und einer unter dem messbaren Level an Expression.
  • Die gemessenen Parameter umfassten Gewichtsänderung, Fertilität, vollständige Blutbilder, Serumanalysen, Histologie, Organgewichte und Zellproliferation, gemessen durch Inkorporierung von Bromodedoxyuridin (BrdU). Alle Mäuse enthielten BrdU in ihrem Trinkwasser, drei Tage bevor sie getötet wurden.
  • Für die MTzsig51h-Transgenetik wurden männliche Tiere in einem ungefähren Alter von 2 Monaten getötet; weibliche Tiere wurden mit einem ungefähren Alter von 5 Monaten getötet, die Gewebe wurden für histologische Analysen gesammelt. Gewebeproben wurden in 10% gepuffertem Formalin fixiert, in Paraffin eingebettet, bei 3 Mikrons geschnitten, und mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt. Die Objektträger wurden untersucht und von einem behördlich zertifizierten Veterinärpathologen bewertet. Für weibliche Mäuse wurde gezeigt, dass sie in Herz, Lunge, Skelettmuskel und der Wachstumsplatte des Femurs verstreut kleine mineralisierte Bereiche aufwiesen.
  • In der zweiten Generation der Nachkommen, die aus Paarungen der C57B1/6-Mäuse stammten, ergab die höchste Expressionslinie von MTzsig51h in Mäusen transgene Weibchen, die bei der Entwöhnung schweren Haarverlust zeigten.
  • MTzsig51M-Tiere wurden mit einem ungefähren Alter von 6 Monaten getötet. Die Gewebe wurden für histologische Analysen gesammelt, fixiert, untersucht und wie vorstehend bewertet. Die am stärksten exprimierende weibliche MTzsig51m-Maus war unfruchtbar.
  • Beispiel 11: Baculovirus-Expression
  • C-Terminal Glu-Glu markiertes humanes zsig51 wird unter Verwendung eines Baculovirus-Vektors in Sf9-Zellen exprimiert. Das markierte Protein umfasst das in (SEQ ID NR: 46) dargestellte Peptid-Tag. Die zsig51cee-Sequenz (als EcoRI-BamHI-Fragment) ist in einen modifizierten pFastBacTM Expressionsvektor (Life Technologies) inseriert worden, der einen spätaktivierenden Basic Protein Promoter enthält. Etwa 90 Nanogramm des zsig51cee Inserts und etwa 150 Nanogramm des verdauten Vektors wurden über Nacht ligiert. Das Ligationsgemisch ist 3fach in TE (10 mM Tris-HCl, pH 7,5 und 1 mM EDTA) verdünnt, und 4 fmol des verdünnten Ligationsgemisches werden in kompetente E. coli Zellen (Library Efficiency DH5αTM kompetente Zellen; Life Technologies, Gaithersburg, MD) nach Anweisung des Herstellers durch Hitzeschock für 45 Sekunden in einem 42°C Wasserbad transformiert.
  • Die ligierte DNA wurde in 450 μl SOC-Medium (2% Bacto Tryptone, 0,5% Bacto Hefeextrakt, 10 ml 1M NaCl, 1,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4 und 20 mM Glukose) verdünnt und auf LB-Platten, die 100 μg/ml Ampicillin enthielten, aufplattiert. Klone wurden durch Restriktionverdau analysiert und 1 μl eines positiven Klons wurde in 20 μl E. coli Zellen (Max Efficiency DH10BacTM kompetente Zellen; Life Technologies) nach Anweisung des Herstellers durch Hitzeschock für 45 Sekunden in einem 42°C Wasserbad transformiert. Die ligierte DNA wurde in 980 μl SOC-Medium verdünnt und auf Luria-Agar Platten ausplattiert, die 50 μg/ml Kanamycin, 7 μg/ml Gentamycin, 10 μg/ml Tetrazyklin, IPTG sowie Bluo Gal enthielten. Die Zellen wurden für 48 Stunden bei 37°C inkubiert. Eine Farbselektion wurde verwendet, um diejenigen Zellen zu identifizieren, die Virus aufwiesen, das in das Plasmid inkorporiert hatte (bezeichnet als ein "Bacmid"). Eben jene Kolonien, die von weißer Farbe waren, wurden für Analysen gepickt. Bacmid-DNA von positiven Kolonien wurde unter Verwendung kommerziell erhältlicher Reagenzien und Ausrüstung (QIAprep® 8 Miniprep Kit und QIAvac vacuum manifold; Qiagen, Inc., Valencia, CA) nach Anweisung des Herstellers isoliert. Klone wurden durch Amplifizieren der DNA via PCR unter Verwendung von Primern für den Basic Protein Promoter und für den SV40 Terminus auf das korrekte Insert gescreent. Jene, die das korrekte Insert enthielten, wurden verwendet, um Spodoptera frugiperda (Sf9)-Zellen zu transfizieren.
  • Sf9-Zellen wurden zu 5 × 106 Zellen pro 35 mm Platte ausgesät und für 1 Stunde bei 27°C das Anheften erlaubt. Fünf Mikroliter Bacmid DNA wurde mit 100 μl serumfreien Medium (Sf-900 II SFM; Life Technologies) verdünnt. Sechs μl einer 1:1,5 (M/M) Liposomformulierung des kationischen Lipids N, N',N'',N'''-Tetramethyl-N,N',N'',N'''-Tetrapalmitylspermin und Dioleloylphosphatidylethanolamin in membrangefiltertem Wasser (CellFECTINTM Reagenz; Life Technologies) werden mit 100 μl Sf-900 II SFM verdünnt. Die Bacmid-DNA und Lipidlösungen wurden vorsichtig gemischt und 30–45 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Das Medium wurde von einer Zellkulturplatte abgesaugt, die Zellen wurden 1 mal mit 2 ml frischem Medium gewaschen. 800 μl Sf-900 II SFM wurde dem Lipid-DNA-Gemisch zugesetzt. Das Waschmedium wurde abgesaugt und das DNA-Lipid-Gemisch zu den Zellen gegeben. Die Zellen wurden bei 27°C für 4 bis 5 Stunden inkubiert. Das DNA-Lipid-Gemisch wurde abgesaugt und 2 ml Penicillin/Streptomycin enthaltendes Sf-900 II Medium wurde zu jeder Platte gegeben. Die Platten wurden bei 27°C, 90% Humidität, für 96 inkubiert und anschließend der Virus geerntet.
  • Sf9-Zellen wurden in 50 ml Sf-900 II SFM in einer 200 ml Schüttelflasche auf eine ungefähre Dichte von 0,41–0,52 × 106 Zellen/ml kultiviert. Sie wurden anschließend mit 100 μl des vorgenannten Virusstocks transfiziert und bei 27°C für 2–3 Tage inkubiert und anschließend der Virus geerntet. Der Titer für AcCSCF1 beträgt 1,7 × 107 pfu/ml und für AcCSNF1 beträgt er 2,6 × 107. Zur maßstäblichen Vergrößerung wurden 1,5 × 106 SF9 Zellen/ml zu fünf Litern SF900-Gemisch II SFM gegeben und für 91 Stunden kultiviert. Die Zellen wurden anschließend mit dem geernteten Virus (MOI 0,2) transfiziert und wie oben für 71 Stunden inkubiert.
  • Beispiel 12: Proteinreinigung und -analyse
  • Glu-Glu markiertes zsig51 Protein (zsig51cee) wurde in Baculovirus infizierten Zellen wie im Wesentlichen vorstehend beschrieben produziert und das Protein wurde aus dem Zell-konditionierten Medium durch Affinitätschromatographie gereinigt. Ein 100 ml Behälter Volumen-immobilisiertes Protein G (Protein G-Sepharose®; Pharmacia Biotech) wurde 3 mal mit 100 ml 0,02% Natriumacid enthaltendes PBS unter Verwendung einer 500 ml Nalgene 0,45 Mikron Filtereinheit gewaschen. Das Gel wurde mit 6,0 Volumen 200 mM Triethanolamin, pH 8,2 (TEA; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) gewaschen und ein gleiches Volumen einer Anti-Glu-Glu-Antikörperlösung, die 900 mg Antikörper enthielt, wurde zugesetzt. Nach einer Über-Nacht-Inkubation bei 4°C wurde nicht gebundener Antikörper durch Waschen des Harzes mit 5 Volumen 200 mM TEA wie vorstehend beschrieben entfernt. Das Harz wurde in zwei Volumen TEA resuspendiert, in einen geeigneten Behälter überführt und Dimethylpimilimidat-2HCl (Pierce, Rockford, IL), gelöst in TEA, wurde in einer Endkonzentration von 36 mg/ml des Gels zugegeben. Das Gel wurde bei Raumtemperatur für 45 Minuten gerüttelt, und die Flüssigkeit wurde unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Filtereinheit entfernt. Nicht-spezifische Stellen auf dem Gel wurden anschließend geblockt durch Inkubieren für 10 Minuten bei Raumtemperatur mit 5 Volumen 20 mM Ethanolamin in 200 mM TEA. Das Gel wurde mit 5 Volumen PBS, enthaltend 0,02% Natriumazid gewaschen und in dieser Lösung bei 4°C gelagert.
  • Sofern nicht anderweitig vermerkt, wurden alle Reinigungsschritte bei 4°C ausgeführt. Ein Gemisch an Protease-Inhibitoren wurde zu einer 2 Liter Probe des konditionierten Mediums von Baculovirus infizierten Sf9 Zellen in Endkonzentrationen von 2,5 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), 0,001 mM Leupeptin (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN), 0,001 mM Pepstatin (Boehringer Mannheim) und 0,4 mM 4-(2-Aminoethyl)-Benzensulfonylfluoridhydrochlorid (Pefabloc®; Boehringer Mannheim). Die Probe wurde bei 10.000 rpm für 30 Minuten bei 4°C in einem Beckman JLA-10,5 Rotor (Beckman Instruments) in einer Beckman Avanti J251 Zentrifuge (Beckman Instruments) zentrifugiert, um das Zelldepris zu entfernen. Zu der Überstandsfraktion wurde eine 50,0 ml Probe Anti-EE Sepharose zugegeben, die wie vorstehend beschrieben präpariert wurde, und das Gemisch wurde vorsichtig auf einem Wheaton (Millville, NJ) Rollkulturapparat für 18,0 Stunden bei 4°C geschüttelt.
  • Das Gemisch wurde in eine 5,0 × 20,0 cm Säule (Econo-Column®; Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) geschüttet und das Gel wurde mit 30 Säulen-Volumen-Phosphat-gepufferter Saline (PBS) gewaschen. Die nicht zurückgehaltene Durchflussfraktion wurde verworfen. Weil die Absorbierung des Abflusses bei 280 mM weniger als 0,05 betrug, wurde der Durchfluss der Säule auf 0 herabgesetzt und das Anti-EE Sepharosegel wurde mit 2,0 Säulen-Volumen PBS gewaschen, das 0,2 mg/ml EE-Peptid enthielt, das die Sequenz Glu-Tyr-Met- Pro-Val-Asp (SEQ ID NR: 47) (AnaSpec, San Jose, CA) aufwies. Nach einer Stunde bei 4°C wurde der Fluss fortgesetzt und das eluierte Protein gesammelt. Diese Fraktion wurde als Peptidelution bezeichnet. Das Anti-EE Sepharosegel wurde mit 2,0 Säulenvolumen 0,1 M Glycin, pH 2,5 gewaschen und die Glycin-Waschung wurde gesondert gesammelt. Der pH der Glycin-eluierten Fraktion wurde auf 7,0 durch die Zugabe eines kleinen Volumens 10 × PBS eingestellt und bei 4°C gelagert. Die Peptidelution wurde unter Verwendung eines 5.000 Molekulargewichts Cutoff Membran Konzentrators (Millipore, Bedford, MA) nach Anweisung des Herstellers auf 5,0 ml konzentriert. Die konzentrierte Peptidelution wurde durch Chromatographie auf einer 1,5 × 50 cm Sephadex® G-50 Pharmacia Biotech) Säule, äquilibriert in PBS, bei einer Flussrate von 1,0 ml/min unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen HPLC-Systems (BioCadTM/Sprint HPLC System; PerSeptive BioSystems, Framingham, MA) von freiem Peptid getrennt. Zwei-ml Fraktionen wurden gesammelt und die Absorbtion bei 280 nM wurde kontrolliert. Der erste Peak an Material, das bei 280 nM absobierte und nahe des Leervolumens der Säule eluierte, wurde gesammelt. Dieses Material repräsentiert gereinigtes zsig51cee. Das Material wurde aliquotiert und bei –80°C gelagert.
  • Das N-terminale Peptid des rekombinanten zsig51cee wurde durch Massenspektrometrie identifiziert. Zwei Formen wurden gefunden. Die erste wies eine Masse von 2000.8 auf, welche ein N-terminales Peptid mit einer Pyro-Glutaminsäure anstelle eines Glutamins (Rest 1 von SEQ ID NR: 2) anzeigte. Die zweite Form wies eine Masse von 3038 auf, entsprechend dem ersten Peptid mit Glykosilierung, bestehend aus 2HexNAc, 3Hex, und 1Deoxyhex.
  • Beispiel 13: Expression von zsig51 in Säugerzellen
  • Ein Säugetier-Expressionsvektor wurde konstruiert mit dem Dihydrofolate Reduktasegen unter Kontrolle des SV40-early-Promotors und SV40 Polyadenylierungsstelle und einer Klonierungsstelle um das Gen von Interesse unter Kontrolle des Maus MT-1 Promotors und der hGH Polyadenylierungsstelle zu inserieren. Der Expressionsvektor wurde mit pZP-9 bezeichnet und bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD am 20. Februar 1998 unter der Accession Nummer 98668 hinterlegt. Um die Reinigung des Proteins von Interesse zu erleichtern, wurde der pZP-9 Vektor durch Addition der tPA Leader Sequenz (U.S. Patent 5,641,655, hiermit durch Bezugnahme eingeschlossen) und einem Glu-Glu-Tag (SEQ ID NR: 46) zwischen dem MT-1 Promoter und dem hGH-Terminator modifiziert. Die Expression resultierte in einem N-terminal markierten, den tPA Leader umfassenden Fusionsprotein. Der N-terminal markierte Vektor wurde mit pZP9NEE bezeichnet.
  • BHK570-Zellen (ATCC CRL 10314) wurden auf 10 cm Gewebekulturplatten ausplattiert und über Nacht auf ungefähr 50 bis 70% Konfluenz kultiviert. Sofern nicht anderweitig spezifiziert, wurden die Zellen unter Verwendung standarisierter Steriltechniken behandelt, bei 37°C, 5% CO2 in mit Wassertank versehenen Inkubatoren (Modell 3110; Forma Scientific, Marietta, OH) mit den folgenden Medien kultiviert: DMEM (High Glucose, #11965-092; Life Technologies, Gaithersburg, MD), 5% fötales Kälberserum (Hyclone, Logan, UT), 1% L-Glutamin (JRH Biosciences, Lexena, KS), 1% Natriumpyruvat (Life Technologies). Die Zellen wurden transfiziert mit dem Plasmid pZP9/zsig51NEE, unter Verwendung einer 3:1 (Gewicht/Gewicht) Liposomformulierung des polykationischen Lipids 2,3-Dioleyloxy-N-[2(Spermincarboxamido)-Etyhl]-N,N-Dimethyl-1-Propaniminium-Trifluorazetat und dem neutralen Lipid Dioleoyl-Phosphatidyl-Ethanolamin in Membran-gefiltertem Wasser (LipofectamineTM Reagent; Life Technologies) in einer serumfreien (SF) Mediumformulierung (DMEM, 10 mg/ml Transferrin, 5 mg/ml Insulin, 1 mg/ml Fetuin, 1% L-Glutamin (JRH #59202-77P), 1% Natriumpyruvat. 16 μg des Plasmids wurden in einem 15 ml Röhrchen mit 640 μl SF Medium verdünnt und in einem separaten Röhrchen wurden 35 μl LipofectaminTM mit 605 μl SF Medium gemischt. Das LipofectaminTM wurde zu dem DNA-Gemisch gegeben und für ungefähr 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. 5 ml SF Medium wurden dem DNA:LipofectaminTM-Gemisch zugesetzt. Die Zellen wurden einmal mit 5 ml SF Medium gespült, abgesaugt und das DNA:LipofectaminTM-Gemisch wurde zugesetzt. Die Zellen wurden bei 37°C für 5 Stunden inkubiert, anschließend wurden 6,4 ml von 10% FKS-DMEM Medium zu der Platte gegeben. Die Platte wurde bei 37°C über Nacht inkubiert und das DNA:LipofectaminTM-Gemisch wurde am nächsten Tag durch frisches Medium ersetzt. Nach Tag 2 nach der Transfektion wurden die Zellen gesplittet in Transfektionsmedium (Standardmedium plus 1 μM Methotrexat) in 150 mm Platten zu 1:50, 1:100, und 1:200. Die Platten wurden an Tag 5 nach Transfektion mit frischem Selektionsmedium wieder gefüttert. Sobald resistente Kolonien einen Durchmesser von 3–4 mm erreichten, wurde eine Platte, die 70 bis 150 Kolonien enthielt, für Immunoassays ausgewählt.
  • Die Zellplatten wurden mit 10 ml SF Medium gespült, anschließend wurden 5 ml SF Medium zugesetzt, gefolgt von einem Nylongaze, anschließend ein gekerberter Nitrozellulosefilter, beide zuvor in SF Medium getränkt. Auf der Platte wurden übereinstimmende Anordnungsmarkierungen gemacht und sie wurde für ungefähr 5 Stunden bei 37°C inkubiert. Der Filter und die Gaze wurden entfernt und die Zellen wurden mit Standardmedium plus einem Pencillin-Streptomycin-Neomycin Antibiotikamix (Lifetechnologies) wieder gefüttert und bei 37°C inkubiert. Der Filter wurde inkubiert mit Anti-Glu-Glu-Antikörper, konjugiert mit Meerrettich-Peroxidase, in einer 1:5000 Verdünnung in einem 2,5% fettfreiem Trockenmilch Western A-Puffer für 1 Stunde bei Raumtemperatur auf einem rotierenden Schüttler. Der Filter wurde dreimal für 15 Minuten bei Raumtemperatur in PBS plus 0,01% Tween 20 gewaschen. Der Filter wurde mit kommerziell erhältlichen Reagenzien (ECLTM Western Blotting Detektionsreagenz; Amersham Life Science Inc., Arlington Heights, IL) nach Anweisung des Herstellers entwickelt und für ungefähr 5 Minuten einem Film exponiert (HyperfilmTM ECL, Amersham). Die Anordnungsmarkierungen auf dem Filter wurden auf den Film übertragen.
  • Der Film wurde für die Auswahl der Kolonien mit optimalem Signal an den Markierungen auf der Zellkulturplatte ausgerichtet. Die Kolonien wurden eingekreist und das Medium wurde von der Platte entfernt. Sterile 3 mm Cloning Discs (PGM Scientific Corporation #62-6151-12), getränkt in Trypsin, wurden auf die Kolonien platziert, und anschließend zu 200 μl Selektionsmedium in eine 96-Well Platte transferiert. Eine Reihe von sieben, zweifach seriellen Verdünnungen wurde mit den von der Disk wiedergewonnen Zellen durchgeführt. Die Zellen wurden für eine Woche bei 37°C kultiviert, anschließend durch Selektieren des Wells mit der niedrigsten Verdünnung an Zellen bei Konfluenz für jeden Klon zur Trypsinierung expandiert und in eine Selektionsmedium enthaltende 12-Well Platte transferiert.
  • Die Klone wurden direkt aus der 12-Well Platte in zwei T75 Flaschen für jeden Klon expandiert. Eine Flasche wurde in Selektionsmedium bei 37°C gehalten. Die andere Flasche wurde für Western Blot Analysen der Klone verwendet. Die Flasche wurde zunächst auf Konfluenz kultiviert, anschließend das Medium gegen SF ausgetauscht, für Tage bei 37°C inkubiert, geerntet und bei 0,22 μm filtriert. Die Flasche wurde nach der Ernte verworfen.
  • Das konditionierte Medium wurde durch Ultrazentrifugation 10-fach konzentriert und durch Western Blot analysiert. Drei Klone, die die höchsten Levels an Protein produzierten, wurden ausgewählt und Proben wurden eingefroren. Die Klone wurden gepoolt und in eine Kultur für großen Maßstab transferiert.
  • Beispiel 14: Expressionsanalyse durch quantitative RT-PCR
  • Das Expressionslevel von zsig51 mRNA in einer Reihe von humanen und Mausgeweben wurde durch real time PCR (RT-PCR) auf einem ABI Prism 7700 Sequence Detector (Perkin-Elmer, Norwalk, CT) nach Anweisung des Herstellers quantifiziert. Gesamt RNA wurde aus frischen Mausgeweben unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Kits (RNeasy® kit; Qiagen) präpariert. Humane Gesamt-RNA Proben wurden aus einer Reihe kommerzieller Quellen (Invitrogen, Clontech) erworben.
  • Für die Expression von zsig51 mRNA in der Bauchspeicheldrüse von Diabetes-NOD Mäusen wurde gezeigt, dass sie signifikant höher ist als in der Bauchspeicheldrüse von nicht-Diabetes -NOD Mäusen. Für die Expression von zsig51 in der Bauchspeicheldrüse von hungernden Mäusen wurde gezeigt, dass sie niedriger als in Bauchspeicheldrüse von gut gefütterten Mäusen war. Für die Expression von zsig51 im Mausauge wurde gezeigt, dass sie ungefähr 50-fach höher ist, als die Expression in normaler Bauchspeicheldrüse.
  • SEQUENZPROTOKOLL
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  • Figure 00970001

Claims (19)

  1. Isoliertes Polypeptid umfassend mindestens 15 konsekutive Aminosäurereste von SEQ ID NO: 2.
  2. Isoliertes Polypeptid, das in der Aminosäuresequenz zu mindestens 80% und gegebenenfalls zu mindestens 95 % identisch zu den Resten 1 bis 106 von SEQ ID NO: 2 ist, das Polypeptid umfassend Cysteinreste an den Positionen entsprechend den Resten 8, 34, 38, 66, 96 und 98 von SEQ ID NO: 2; einen Glycinrest an einer Position entsprechend dem Rest 36 von SEQ ID NO: 2; und Beta-Strang-ähnliche Regionen entsprechend den Resten 9–17, 29–34, 38–43, 59–64, 67–71 und 90–95 von SEQ ID NO: 2, gegebenenfalls weiterhin umfassend Cysteinreste an Positionen entsprechend den Resten 25, 65, 80 und 101 von SEQ ID NO: 2.
  3. Isoliertes Polypeptid, wie in Anspruch 2 beansprucht, wobei Aminosäurereste entsprechend den Resten 8, 11, 12, 14, 29, 30, 32, 34, 43, 44, 60, 63, 64, 65, 71, 74, 80, 90, 91, 93 und 94 von SEQ ID NO: 2 Cys, His, Pro, Asn, His, Val, Gln, Cys, Phe, Pro, Thr, Ser, Gln, Cys, Leu, Val, Cys, Ile, Phe, Ala bzw. Arg sind; und ein Aminosäurerest entsprechend dem Rest 75 von SEQ ID NO: 2 Lys oder Arg ist.
  4. Isoliertes Polypeptid, wie in einem der Ansprüche 1 bis 3 beansprucht, umfassend Rest 1 bis Rest 106 von SEQ ID NO: 2 oder Rest 1 bis Rest 106 von SEQ ID NO: 29.
  5. Isoliertes Polypeptid, wie in einem der Ansprüche 1 bis 4 beansprucht, kovalent gebunden an einen Affinitäts-Tag oder an eine konstante Region eines Immunglobulins.
  6. Isoliertes Protein, umfassend ein erstes Polypeptid, wie in einem der Ansprüche 1 bis 5 beansprucht, komplexiert mit einem zweiten Polypeptid, wobei das Protein Zellproliferation, Differenzierung oder Metabolismus moduliert, wobei das Protein gegebenenfalls ein Heterodimer ist, wobei das zweite Polypeptid gegebenenfalls eine gemeine Alpha-Untereinheit eines Glykoproteinhormons ist.
  7. Isoliertes Protein, wie in Anspruch 6 beansprucht, wobei das erste Polypeptid Rest 1 bis Rest 106 von SEQ ID NO: 2 oder Rest 1 bis Rest 106 von SEQ ID NO: 29 umfasst.
  8. Isoliertes Protein, wie in Anspruch 6 beansprucht, wobei das Protein ein Homodimer ist, wobei jedes der ersten und zweiten Polypeptide gegebenenfalls Rest 1 bis Rest 106 von SEQ ID NO: 2 oder Rest 1 bis Rest 106 von SEQ ID NO: 29 umfasst.
  9. Isolierte cDNA oder Poly(A)+RNA-Polynukleotid, kodierend für ein Polypeptid, wie in einem der Ansprüche 2 bis 4 beansprucht, gegebenenfalls umfassend eine Sequenz von Nukleotiden wie gezeigt in SEQ ID NO: 4 von Nukleotid 70 bis Nukleotid 387 oder in SEQ ID NO: 30 von Nukleotid 70 bis Nukleotid 387 oder in SEQ ID NO: 1 von Nukleotid 125 bis Nukleotid 442.
  10. Isoliertes Polynukleotid, wie in Anspruch 9 beansprucht, wobei das Polynukleotid eine Länge von 318 bis 1000 Nukleotiden aufweist.
  11. Isoliertes Polynukleotid, wie in Anspruch 9 oder 10 beansprucht, wobei dieses Polynukleotid cDNA ist.
  12. Expressionsvektor, umfassend die folgenden operativ verknüpften Elemente: einen Transkriptionspromoter; ein DNA-Segment, kodierend für ein Polypeptid, wie in einem der Ansprüche 1 bis 5 beansprucht, und gegebenenfalls weiterhin kodierend für ein sekretorisches Peptid, das operativ mit dem Polypeptid verknüpft ist; und einen Transkriptionsterminator.
  13. Expressionsvektor, wie in Anspruch 12 beansprucht, wobei das DNA-Segment für Rest –23 bis Rest 106 von SEQ ID NO: 2 oder für Rest –23 bis Rest 106 von SEQ ID NO: 29 kodiert.
  14. Kultivierte Zelle, in die ein Expressionsvektor, wie in Anspruch 12 oder 13 beansprucht, eingeführt wurde, wobei die Zelle das von dem DNA-Segment kodierte Polypeptid exprimiert.
  15. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein Polypeptid, wie in einem der Ansprüche 1 bis 5 beansprucht, oder ein isoliertes Protein, wie in einem der Ansprüche 6 bis 8 beansprucht, in Kombination mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger.
  16. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, umfassend: Kultivieren einer Zelle, in die ein Expressionsvektor, wie in Anspruch 12 oder 13 beansprucht, eingeführt wurde, wobei die Zelle das von dem DNA-Segment kodierte Polypeptid exprimiert; und Wiedergewinnen des exprimierten Polypeptids.
  17. Antikörper, der spezifisch an ein Epitop eines Polypeptids, wie in einem der Ansprüche 1 bis 5 beansprucht, bindet.
  18. Verfahren zum Nachweisen einer genetischen Abnormalität in einem Patienten, umfassend: Inkubieren einer genetischen Probe von einem Patienten mit einem Polynukleotid, umfassend mindestens 14 zusammenhängende Nukleotide von SEQ ID NO: 1 oder dem Gegenstück zu SEQ ID NO: 1, unter Bedingungen, wobei das Polynukleotid mit der komplementären Polynukleotidsequenz hybridisieren wird, um ein erstes Reaktionsprodukt zu erzeugen; Vergleichen des ersten Reaktionsprodukts mit einem Kontrollreaktionsprodukt, wobei ein Unterschied zwischen dem ersten Reaktionsprodukt und dem Kontrollreaktionsprodukt indikativ ist für eine genetische Abnormalität in dem Patienten.
  19. Isoliertes Polypeptid, wie in einem der Ansprüche 1 bis 5 beansprucht, isoliertes Protein, wie in einem der Ansprüche 6 bis 8 beansprucht, oder isoliertes Polynukleotid, wie in einem der Ansprüche 9 bis 11 beansprucht, zur therapeutischen Verwendung.
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