DE69837151T2

DE69837151T2 - Verfahren zur erkennung von transplantabstossungen

Info

Publication number: DE69837151T2
Application number: DE69837151T
Authority: DE
Inventors: B. Terry B. Brookline STROM; B. Lauro Brookline VASCONCELLOS; B. Manikkam New York SUTHANTHIRAN
Original assignee: Cornell Research Foundation Inc; Beth Israel Deaconess Medical Center Inc; Beth Israel Hospital Association
Current assignee: Cornell Research Foundation Inc; Beth Israel Deaconess Medical Center Inc
Priority date: 1997-09-24
Filing date: 1998-09-22
Publication date: 2008-01-03
Anticipated expiration: 2018-09-23
Also published as: EP1015639A1; CA2304159A1; AU9493198A; ES2280103T3; WO1999015700A1; ATE354674T1; DE69837151D1; US6187534B1; CA2304159C; HK1029143A1; JP2001517459A; EP1015639B1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Trotz jüngster Verbesserungen beim Überleben nach einer Nierenallotransplantation gibt es weiterhin den Verlust der Transplantatfunktion auf Grund von akuter oder chronischer Abstoßung und er ist heutzutage der am weitesten verbreitete Grund von Leberversagen im Endstadium. Da das Auftreten von akuten Abstoßungsepisoden der wichtigste prognostische Faktor für die spätere Entwicklung einer chronischen Abstoßung bei Erwachsenen und Kinder ist, treten viele für Strategien ein, um akute Abstoßungsepisoden so früh wie möglich nachzuweisen und zu entfernen.
Vorgehensweise zur Diagnose Nierenallotransplantatabstoßung hängen von dem Nachweis der Fehlfunktion des Transplantats und der Gegenwart eines mononuklearen leukozytären Infiltrats ab. Allerdings ist die Gegenwart eines gemäßigten zellulären Infiltrats oft nicht beweiskräftig und kann in Transplantaten, die nicht abgestoßen werden, nachgewiesen werden.
Verfahren zum Nachweis von Transplantatabstoßung durch Untersuchen der Genexpression in Biopsieproben wurden bereits beschrieben. Zum Beispiel identifizierten Strehlau und Mitarbeiter (Strehlau et al., 1997, Proc Natl Acad Sci USA. 94: 695–700) Marker, nämlich Perforin, Granzym B und Fas-Ligand, deren Expression in Nierentransplantatbiopsien erhöht ist und die daher als diagnostisches Mittel bei Nierentransplantation verwendet werden können.
Allerdings konnte bisher kein zuverlässiges Verfahren zur Diagnose einer Transplantatabstoßung unter Verwendung von flüssigen Proben etabliert werden. Studien zur Beurteilung peripheren Bluts in Empfängern von Allotransplantaten verliefen beim Identifizieren diagnostischer Cytokinprofile nicht erfolgreich und es wurde festgestellt, dass Cytokine im peripheren Blut keine zuverlässigen Indikatoren von immunologischen Ereignissen innerhalb des Transplantats waren (Nast, C., 1995, Pediatr. Nephrol. 9: S56–S60). Andere Wissenschaftler verglichen die Expressionsprofile in Urinsedimenten, Blut und Nierenbiopsien (Jeyarajah et al., 1995, Transplant. Proc. 27, 887–889). Allerdings konnten sie keine Korrelation der Markerexpression in Biopsien, Blut und Urinproben finden.
Es wäre hilfreich, ein zuverlässiges Werkzeug zur Diagnose und Verfolgung von akuten Nierenallotransplantatabstoßung unter Verwendung einer Probe mononukleärer Zellen des peripheren Bluts, Lymphflüssigkeit, Peritonealflüssigkeit oder Pleuralflüssigkeit zu besitzen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zum Beobachten des Status eines transplantierten Organs in einem Empfänger. Genauer betrifft die vorliegende Erfindung das Beurteilen einer Transplantatabstoßung in einem Empfänger umfassend das Bestimmen der Genexpression der Immunaktivierungsmarker Perforin-(P), Granzym B-(GB) und Fas-Ligand-(FasL)-Gene in einer biologischen Post-Transplantations-Probe, die von einem Empfänger erhalten wurde, und das Vergleichen der relativen Expression der Markergene mit dem Grundlinienniveau der Expression der Immunaktivierungsmarker, wobei die Hochregulation der Genexpression (d.h. erhöhte oder verstärkte Genexpression) von zwei der drei Immunaktivierungsmarkergene in der Probe eine Abstoßung anzeigt. Immunakti- vierungsgene werden hierin auch mit zytotoxischen Lymphozyten-(CTL; cytotoxic lymphocyte)-Effektormoleküle bezeichnet. Die hierin beschriebenen Verfahren sind insbesondere zum Nachweisen akuter Transplantatabstoßung verwendbar.
Im typischen Fall ist der Empfänger (d.h. der Empfänger eines Transplantats) ein Säuger, wie zum Beispiel ein Mensch. Das transplantierte Organ kann jedes transplantierbare Organ oder Gewebe einschließen, zum Beispiel Niere, Leber, Herz, Lunge oder Knochenmark.
Die biologische Post-Transplantations-Probe (oder Testprobe) des Empfängers kann eine biologische Probe sein, die Zellen umfasst, die RNA (d.h. Transkripte) enthalten, die die interessierenden Immunaktivierungsmarkergene kodieren. Die Probe ist eine Probe peripheren Bluts, die mononukleäre Zellen enthält, Lymphflüssigkeit, Peritonealflüssigkeit oder Pleuralflüssigkeit.
Die Größe der Expression der Immunaktivierungsmarkergene wird durch Quantifizieren der Immunaktivierungsmarkergentranskripte und durch Vergleichen dieser Menge mit der Menge an Transkripten eines konstitutiv exprimierten Gens bestimmt. Der Begriff „Größe der Expression" bedeutet eine „normalisierte oder standartisierte Menge an Genexpression". Zum Beispiel variiert die Gesamtgenexpression aller Gene in Zeilen (d.h. sie ist nicht konstant). Diese Beobachtung der erhöhten Expression eines Gens, welches durch eine Erhöhung der Gegenwart an mRNA-Transkript bestimmt wird, muss in einen geeigneten Zusammenhang gestellt werden, um genau zu bewerten, ob der Nachweis eines erhöhten Transkripts signifikant ist. Das bedeutet, es muss eine gewisse Art der „Normalisierung" der Genexpression auf genau vergleichbare Niveaus der Genexpression zwischen Proben geben. Dies kann durchgeführt werden, indem das Expressionsniveau des interessierenden Gens (z.B. das Bestimmen der Gen-mRNA oder -cDNA, die von der Gen-mRNA transkribiert wird) und das Expressionsniveau eines universellen oder konstitutiv exprimierten Gens (z.B. ein Gen, das in allen Geweben vorhanden ist und ein konstantes Expressionsniveau besitzt) bestimmt werden und die relativen Expressionsniveaus des Zielgens (interessierendes Gen) und des konstitutiv exprimierten Gens verglichen werden. In einer Ausführungsform ist das konstitutiv exprimierte Gen die Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase(GAPDH). Andere konstitutiv exprimierte Gene, wie zum Beispiel Actin, sind dem Fachmann auch bekannt und können zur Verwendung in den hierin beschriebenen Verfahren geeignet sein. In den hierin beschriebenen Verfahren wurde die Quantifizierung von Gentranskripten unter Verwendung kompetitiver Revers-Transkription-Polymerasekettenreaktion(RT-PCR) durchgeführt und die Größe der Genexpression wurde durch Berechnen des Verhältnisses der Menge der Genexpression jeden Immunaktivierungsmarkergens und der Menge der Genexpression des konstitutiv exprimierten Gens bestimmt. Das heißt die Größe der Zielgenexpression wird als pg Zielgen-cDNA pro pg konstitutiv exprimierter Gen-cDNA berechnet.
In einer Ausführungsform wird das Unterscheidungsniveau für verstärkte Genexpression (z.B. die Größe des Grundniveaus der Genexpression) des Immunaktivierungsmarkergens auf den Mittelwert ± 95% Vertrauensintervall einer Gruppe von Werten gesetzt, die in Transplantaten beobachtet wird, die nicht abgestoßen werden, (z.B. Kontrollwerte). Verstärkte Genexpression wird bestimmt als über einem Mittelwert ± 95% Vertrauensintervall dieser Werte.
In einer anderen Ausführungsform können aufeinanderfolgende Proben von dem Empfänger erhalten werden und die Quantifizierung der Immunaktivierungsgenmarker wird wie hierin beschrieben bestimmt und der Verlauf der Abstoßung kann über eine Zeitdauer verfolgt werden. In diesem Fall ist zum Beispiel die Grundniveaugröße der Genexpression der Immunaktivierungsmarkergene die Größe der Genexpression in einer Post-Transplantations-Probe, die sehr kurz nach der Transplantation entnommen wird. Zum Beispiel kann eine an anfägliche Probe oder Proben innerhalb der Nichtabstoßungsdauer genommen wer den, zum Beispiel innerhalb einer Woche nach der Transplantation und die Größe der Genexpression der Markergene in diesen Proben kann mit der Größe der Expression der Gene in Proben verglichen werden, die nach einer Woche entnommen werden. In einer Ausführungsform werden die Proben an den Tagen 0, 3, 5, 7 und 10 entnommen.
In einer anderen Ausführungsform umfasst die Post-Transplantations-Testprobe eine Blutprobe, die von dem Empfänger erhalten wird, die mononukleäre Zellen des peripheren Bluts (PBMCs; peripheral blond mononuclear cells) enthält, die hinsichtlich der Immunaktivierungsgenmarker beurteilt wird. Zusätzlich wird die PBMC-Probe im Wesentlichen gleichzeitig oder aufeinanderfolgend auf die Gegenwart oder auf die Abwesenheit eines oder mehrerer Gene beurteilt, die charakteristisch für (z.B. ein Marker für) ein infektiöses Mittel (z.B. ein Virus) sind. In dieser Ausführungsform zeigt die verstärkte Genexpression zwei der drei Immunaktivierungsmarkergene P, GB und FasL bei gleichzeitiger Abwesenheit des Markers für das infektiöse Mittel eine Transplantatabstoßung an. Zum Beispiel würden die Gene, die charakteristisch für das infektiöse Mittel Cytomegalovirus(CMV) sind, beurteilt werden, um die Transplantatabstoßung eines Nierenallotransplantats zu beurteilen. Wichtigerweise wirkt diese Ausführungsform als ein Screeeningtest unter Verwendung leicht erhältlicher PBMCs, um differentiell zwischen akuter Abstoßung des Transplantats und Infektion zu unterscheiden. In diesem Fall wird ein weiteres Testen wie zum Beispiel eine Transplantat-Biopsieprobe nur durchgeführt werden, wenn der anfängliche „Screening"-Test unter Verwendung von PBMCs für Abstoßung positiv ist. Folglich werden Transplantatempfänger invasiven Biopsievorgehensweisen nicht unterzogen, wenn es nicht gerechtfertigt ist (d.h. erforderlich, um eine Abstoßung zu begründen).
In einer Ausführungsform wird die biologische Probe zur Beurteilung durch Isolieren von RNA aus der Probe unter Verwendung hierin beschriebener Verfahren und Herleitung (Erhalten) komplementärer DNA (cDNA) aus der isolierten RNA durch Techniken reverser Transkription hergestellt. Allerdings können andere Verfahren zum Erhalt von RNA verwendet werden und diese Verfahren sind dem Fachmann bekannt.
Kommerziell erhältliche Kits zur Verwendung in diesen Verfahren sind dem Fachmann auch bekannt. Zum Beispiel werden in einer hierin beschriebenen Ausführungsform PBMCs aus Gesamtblut isoliert und RNA unter Verwendung einer kommerziell erhältlichen QIAGEN^TM-Technik extrahiert. Zum Beispiel stellt QIAGEN eine Anzahl von kommerziell erhältlichen Kits zur RNA-Isolierung her, einschließlich dem „RNEASY^® Total RNA-System" (welches die Bindung der Gesamt-RNA an eine Membran auf Sillica- Gelbasis und Zentrifugieren der RNA einbezieht); OLIGOTEX^TM mRNA-Kits (die kugelförmige Latexpartikel verwenden); und QIAGEN Gesamt-RNA-Kit für in-vitro-Transkripte und RNA-Aufreinigung. Die QIAGEN-Grundtechnik bezieht vier Schritte ein, wie nachfolgend in Beispiel 2 ausgeführt. Die QIAGEN-Technik kann modifiziert werden, um die RNA-Isolierung durch dem Fachmann gut bekannte Verfahren zu steigern.
Die komplementäre DNA wurde mit einem Gen-spezifischen Kompetitor co-amplifiziert und die Quantifizierung umfasst das Erzeugen einer Standardkurve von Reihenverdünnungen des Gen-spezifischen Kompetitors mit einer konstanten Menge revers transkribierter komplementärer Kontroll-DNA, wodurch die Quantifizierung des Transkripts des interessierenden Gens ermöglicht wird. Wie hierin beschrieben wird der Gen-spezifische Kompetitor aus Phytohämagglutinin-stimulierten Glasten oder Nephrektomie-Gewebe gebildet.
Beispielsweise kann die cDNA von Perforin mit einem Oligonukleotidprimerpaar amplifiziert werden, die die Nukleotide der SEQ ID NRN: 17 und 18 von Tabelle 1 umfassen. In ähnlicher Weise kann das Transkript der Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase mit Oligonukleotidprimern amplifiziert werden, die die Nukleotidsequenz der SEQ ID NRN 1 und 2 umfassen. Obwohl diese Primer hierin spezifisch beschrieben sind, können andere geeignete Primer unter Verwendung von dem Fachmann gut bekannten Techniken entwickelt werden. Siehe zum Beispiel Current Protocols in Molecular Biology, Band 2, Ausubel et al., Hrsg., John Wiley & Sons, Inc. (1997) auf Seiten 15.0.1-1-15.8.8.
Die hierin beschriebenen Verfahren sind verwendbar, um die Wirksamkeit einer Therapie gegen Transplantatabstoßung zu bewerten. Solche Verfahren beziehen das Vergleichen der Menge der Transkripte der Markergene vor Verabreichung mit der Menge der Transkripte der gleichen Gene nach Verabreichung ein, wobei eine Menge der Transkripte der Gene nach Verabreichung, die niedriger ist als die Größe der Transkripte der gleichen Gene vor Verabreichung, die Wirksamkeit einer Therapie gegen Abstoßung anzeigt. Jeder beliebige Kandidat für die Vorbeugung und/oder Behandlung von Transplantatabstoßung (wie zum Beispiel Wirkstoffe, Antikörper oder andere Formen von Unterdrückung oder Vorbeugung) können durch Vergleich der Größe der Markerexpression vor und nach dem Aussetzen gegenüber dem Kandidaten gescreent werden. Zusätzlich kann wertvolle Information auf diese Weise gesammelt werden, um bei der Bestimmung des zukünftigen klinischem Managements des Empfängers, auf dessen biologischen Material die Bewertung durchgeführt wird, helfen. Die Bewertung kann unter Verwendung einer biologischen Probe (wie zum Beispiel einer Biopsie oder PBMCs) von dem Empfänger unter Verwendung der hier in beschriebenen Verfahren zur Beurteilung der Größe der Genexpression der Markergene durchgeführt werden. Die Analyse kann darüber hinaus den Nachweis eines infektiösen Mittels umfassen.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung von Kits zur Beurteilung einer Transplantatsabstoßung. Zum Beispiel können die Kits auch solche Komponenten als Mittel zur Hilfe bei der RNA-Isolierung, der cDNA-Herleitung, RT-PCR, Quantifizierung der Genexpression und dem Nachweis eines infektiösen Mittels einbeziehen. In einer Ausführungsform umfasst ein Kit zum Nachweisen der Gegenwart von Transplantatabstoßung in einer Blutprobe Mittel zum Bestimmen der Größe der Expression von Perforin, Granzym B, Fas-Ligand und GAPDH in der Probe und Mittel zum Bestimmen der Gegenwart von Transkripten eines infektiösen Mittels in der Probe. Zum Beispiel kann der Kit Oligonukleotidprimer umfassen, die die SEQ ID NRN: 1, 2, 17, 18, 19, 20, 21 und 22 umfassen. Der Kit kann auch andere Primer enthalten, die unter Verwendung dem Fachmann gut bekannter Verfahren entwickelt werden können.
Folglich sind als ein Ergebnis der hierin beschriebenen Arbeit Verfahren nun erhältlich, um Immunaktivierungsgenexpression in mononuklearen Zellen des peripheren Bluts genau zu quantifizieren und die Größe der Expression dieser Gene mit der Abstoßung von Allotransplantaten zu korrelieren. Genauer diagnostiziert die Beurteilung der drei Immunaktivierungsgene Perforin, Granzym B und Fas-Ligand und die Bestimmung einer verstärkten Genexpression von zwei dieser drei Gene genau eine akute Allotransplantatabstoßung. Überraschenderweise weist die Beurteilung der Expression dieser Markergene in PBMCs zusammen mit der Beurteilung der Expression eines Gens eines infektiösen Mittels auch genau Allotransplantatabstoßung nach.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist ein Bild, das die Größe und Sequenz der Oligonukleotidprimer und kompetitiven Templates (CTs; competitive templates), die zur Quantifizierung von 15 Genen verwendet wurden, zeigt. Deletionen und Insertionen sind durch schwarze bzw. weiße Stücke der Balken angezeigt.
2A–F sind Graphen, die die quantitative Analyse von IL-2-, IL-7-, IL-15-, Perforin-(P), Granzym B-(GB) und Fas-Ligand-(FasL)-Genexpression in 38 Transplantatkernbiopsien darstellen, die entnommen wurden, um in der Differentialdiagriose von Transplantatfehlfunktion behilflich zu sein. Die Biopsien wurden auch aus zwei Donornieren vor der Reperfusion erhalten. Die Linien zeigen aufeinanderfolgende Biopsien an, die im Verlauf der Abstoßung vor und nach Behandlung entnommen wurden (ACR, akute zelluläre Abstoßung; acute cellular rejection; NR, nicht abstoßende Nieren mit akuter tubulärer Nekrose oder Cyclosporin-Zytotoxizität; nonrejecting kidneys with acute tubular necrosis or cyclosporine cytotoxicity; CR, chronische Abstoßung; chronic rejection; INF REC, Infektionskomplikationen und Wiederauftreten der Primärerkrankung; infectious complications and recurrence of primary disease; und VASC, vaskuläre Komplikationen; vascular complications).
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Eine Nierentransplantation ist die Behandlung der Wahl für Patienten, die mit einer Nierenerkrankung im Endstadium geplagt sind, die eine der zehn häufigsten Todesursachen in den Vereinigten Staaten sind. Allerdings versagen 20 bis 25% der ersten und 30 bis 35% der zweiten Nierenallotransplantate aus Leichen innerhalb eines Jahres nach der Transplantation trotz der jüngsten Fortschritte bei der Organkonservierung, dem Histokompatibilitätstesten und den immunsuppressiven Strategien.
Wie hierin verwendet bezieht sich der Begriff „Transplantation" auf den Prozess der Entnahme einer Zelle, eines Gewebes oder Organs, genannt ein „Transplantat" (engl.: „transplant" oder „graft") aus einem Individuum und das Platzieren dieses oder dieser in ein (üblicherweise) anderes Individuum. Das Individuum, das das Transplantat bereitstellt, wird mit „Spender" und das Individuum, das das Transplantat erhält, wird mit „Empfänger" (engt.: "host" oder „recipient") bezeichnet. Ein Organ oder Transplantat, das zwischen zwei genetisch verschiedenen Individuen derselben Spezies transplantiert wird, wird mit „Allotransplantat" bezeichnet. Ein Transplantat, das zwischen Individuen verschiedener Spezies transplantiert wird, wird mit „Xenotransplantat" bezeichnet.
AKUTE ALLOTRANSPLANTATABSTOSSUNG
Der häufigste einzelne Grund für frühes Transplantatversagen, insbesondere innerhalb eines Monats nach Transplantation, ist eine immunologische Abstoßung des Allotransplantats. Der ungünstige Einfluss der Abstoßung wird durch die Tatsache verstärkt, dass: (a) die Verwendung von hoch dosierten Therapien gegen Transplantatabstoßung, die die Erhaltung der Immunsuppression überlagern, primär für die Erkrankung und Sterblichkeit, die mit der Transplantation verbunden sind, verantwortlich ist, (b) die Immunisierung gegen „allgemeine" HLA-Spezifitäten, die aus einem abgestoßenen Transplantat resultieren, es für diese Patientenpopulation schwierig macht, erneut transplantiert zu werden und (c) die Rückkehr von immunisierten Empfängern mit einem fehlgeschlagenen Transplantat zu dem Pool der Patienten, die auf eine Transplantation warten, die beständigen Probleme des Organmangels verstärkt.
Wie hierin verwendet ist „Transplantatabstoßung" definiert als funktionelle und strukturelle Verschlechterung des Organs aufgrund einer aktiven Immunantwort, die von dem Empfänger gezeigt wird, und unabhängig von nichtimmunologischen Ursachen der Organfehlfunktion. Die Diagnose einer Nierenallotransplantatabstoßung wird üblicherweise durch die Entwicklung der Transplantatfehlfunktion (z.B. einer Erhöhung der Konzentration an Serumcreatinin) und eines morphologischen Beweises der Transplantatschädigungen in Gebieten des Transplantats, in denen sich auch eine Infiltration mononukleärer Zellen manifestiert, durchgeführt. Zwei Vorbehalte gelten jedoch für die Verwendung von abnormer Nierenfunktion als ein Indikator des Abstoßungsprozesses: Erstens ist eine Verschlechterung der Nierenfunktion nicht immer als ein klinischer Anhaltspunkt für die Diagnose einer Abstoßung verfügbar, da viele Nierentransplantate aus Leichen an einer akuten (reversiblen) Nierenfehlfunktion in der unmittelbaren Post-Transplantations-Phase aufgrund von Verletzung durch die Entnahme und ex-vivo-Konservierungsvorgehensweise leiden. Zweitens kann sich eine Transplantatfehlfunktion aufgrund einer nichtimmunologischen Ursache, wie z.B. der immunsuppressiven Therapie selbst, entwickeln, selbst wenn eine sofortige Nierenfunktion vorhanden ist.
Zum Beispiel ist eine Cyclosporin-(CsA)-Nephrotoxizität eine Komplikation, die nicht einfach nur auf Grundlage der Plasma/Blut-Konzentrationen von CsA identifiziert werden kann, eine übliche Komplikation. Die klinische Wichtigkeit der Unterscheidung zwischen einer Abstoßung und einer CsA-Nephrotoxizität kann nicht überbetont werden, da die therapeutischen Strategien diametral entgegengesetzt sind: eine Erhöhung der Immunsuppressiva für die Abstoßung und eine Reduktion der CsA-Dosis für Nephrotoxizität.
Die Unterscheidung der Diagnose von Abstoßung von anderen Ätiologien für die Transplantatfehlfunktion und die Einführung einer wirksamen Therapie wird weiter verkompliziert, weil: (a) die perkutane Kernnadelbiopsie von Nierentransplantaten, den besten gegenwärtig verfügbaren Werkzeugen zur Diagnose einer Abstoßung, für gewöhnlich nach der „Tat" durchgeführt wird, d.h. Transplantatfehlfunktion und Transplantatschaden (in einigen Fällen irreversibel) sind bereits vorhanden, (b) die morphologische Analyse des Transplantats moderate Hinweise im Hinblick auf das Potential zur Umkehr von einer gegebenen Abstoßungsepisode und minimale Hinweise im Hinblick auf die Wahrscheinlichkeit eines Rezidivs („Rückschlag") bereitstellt, und (c) die mechanistische Grundlage für das Abstoßungsphänom, einer Vorraussetzung für die Entwicklung therapeutischer Strategien, durch die gegenwärtigen diagnostischen Anzeichen, einschließlich morphologischer Merkmale der Abstoßung, kaum definiert ist.
Die Antigen-getriggerte T-Zellen-Aktivierung und die anschließende Infiltration von aktivierten CD4+- und CD8+-T-Zellklonen, Makrophagen und natürlichen Killer-(NK) -Zellen in das Transplantat sind Schlüsselereignisse der akuten Allotransplantatabstoßung. Obwohl eine T-Zell-reiche interstitiale Nephritis ein Kennzeichen akuter Allotransplantatabstoßung ist, zeigen klinische Abstoßungsepisoden, die auf eine Behandlung antworten, oft nur ein moderates zelluläres Infiltrat und ähnliche Infiltrate werden in Überwachungsbiopsien beobachtet, die von gut funktionierenden Nierenallotransplantaten erhalten werden (Rush et al., Transplantation 57: 208–211 (1994)); (Rush et al., Transplantation 59: 511–514 (1994)).
Die vorliegende Erfindung betrifft die Entdeckung, dass die klinische Abstoßung mit der Expression eines spezifischen Untersatzes von T-Zell-abhängigen Immunaktivierungsgenen verbunden ist, die als ein diagnostischer Indikator von Abstoßung dienen. Die Muster der mRNA-Erzeugung innerhalb des Transplantats während einer zytopathischen Allotransplantatantwort sind substantiell verschieden von jenen, die in anderen Fällen der Transplantatfehlfunktion beobachtet werden und könnten rechtzeitige und spezifische Informationen über Immunereignisse, die für die Transplantatabstoßung maßgeblich sind, bereitstellen.
Genauer stellt, wie hierin beschrieben, die kombinierte Analyse von drei Immunaktivierungs- oder Genmarkern, Perforin(P), Granzym B(GB) und Fas-Ligand(FasL), ein zuverlässiges Werkzeug für die Beurteilung (z.B. Nachweis oder Diagnose und Verfolgung) einer akuten zellulären Nierenallotransplantatabstoßung bereit. Die Bestimmung von erhöhten Gentranskripten von beliebigen zwei dieser drei Gene zeigt eine Transplantatabstoßung an. Zum Beispiel ist eine nachweisbare Erhöhung der Genexpression von Perforin und Granzym B bei keiner nachweisbaren Erhöhung der Fas-Ligand-Genexpression Indikativ für Transplantatabstoßung.
Perforine und Granzym B sind Proteine, die in den Granula der zytotoxischen T-Lymphozyten(CTLs) vorhanden sind. Perforine sind porenbildende Moleküle, die polymerisieren und die Zellmembran perforieren können. Granzyme sind eine Familie von Serinproteasen, die mit Perforinen in den zytoplasmatischen CTL-Granula colokalisieren. Der Eintritt von Granzym B in die Zielzelle über von Perforin gebildete Kanäle resultiert in der Apoptose der Zielzelle. Perforin-unabhängige Wege der zellvermittelten Zytolyse, wie z.B. die Interaktion zwischen Fas-(APO1)-Antigen und Fas-Ligand(FasL) wurden mit den Ca²⁺-unabhängigen Systemen in Verbindung gebracht, in welchen das Perforinmonomer nicht zur Polymerisation in der Lage ist, aber zellvermittelte Zytolyse noch auftritt. Pavlakis, M. Transplant. Proc. 28(4): 2019–2021 (1996).
FasL/Fas-Rezeptor-vermittelte CTL-Schädigung initiiert den Zielzelltod über einen Ca²⁺-unabhängigen apoptotischen Weg. Die FasL-Expression innerhalb des Transplantats, die während muriner Allotransplantatabstoßung des Herzens bemerkt wird, Larsen et al., Transplantation 60: 221–224 (1995), wurde bei einer klinischen Transplantation zuvor nicht untersucht.
Diese Immunaktivierungsgenmarker können aus einer biologischen Probe des Empfängers erhalten werden. Die Probe kann eine Blutprobe sein, die mononukleare Zellen des peripheren Bluts (PBMCs; peripheral blond mononuclear cells) enthält.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „Biopsie" auf eine Probe, die durch Entfernen von Gewebe aus lebenden Patienten für die diagnostische Untersuchung erhalten wurde. Der Begriff schließt ein: Aspirationsbiopsien; Bürstenabstriche; Chorionzottenbiopsien; endoskopische Biopsien; Exzisionsbiopsien; Nadelbiopsien (Proben erhalten durch Entfernen durch Absaugen durch eine geeignete Nadel oder einen geeigneten Trokar, der die Haut oder die äußere Oberfläche eines Organs durchdringt und in das darunterliegende Gewebe, das untersucht werden soll, eindringt); offene Biopsien, Stanzbiopsien (Trephine); Schabbiopsien; Schwammbiopsien; Keilbiopsien; eine Aspirationsbiopsie mit feiner Nadel; eine Minicor-Nadelbiopsie und eine konventionelle perkutane Kern-Nadel-Biopsie.
Wie hierin beschrieben, resultiert die kombinierte Analyse dreier Immunaktivierungsgene, FasL, P und GB, in einem statistisch signifikanten Nachweis einer Transplantatabstoßung im Vergleich zu einer Analyse eines jeden einzelnen Gentranskripts. Eine verstärkte Genexpression von mindestens zwei der drei CTL-Gene wird nur in Proben aus Nieren nachgewiesen, die einer akuten zellulären Abstoßung unterliegen, wohingegen eine niedrige Expression dieser Gene auf Biopsien mit anderen Gründen für die Transplantatfehlfunktion beschränkt war. Erhöhte IL-15-, FasL- und P-, nicht jedoch IL-7-, IL-10- oder GB-Transkripte wurden gelegentlich in den wenigen chronischen Abstoßungsproben, die verarbeitet wurden, gefunden. Dieser Befund lässt vermuten, dass es eine Verbindung zwischen der Kausalität von akuter und chronischer Abstoßung gibt.
Es ist wichtig festzustellen, dass die bloße Existenz von mononukleärem Leukozyteninfiltrat, dem Kennzeichen für die histopathologische Diagnose der Abstoßung, nicht notwendigerweise für ein Transplantat von Nachteil sein muss. Aufeinanderfolgende Biopsien, die von gut funktionierenden Nierenallotransplantaten nach drei und sechs Monaten erhalten wurden, zeigten häufig mononukleäre Leukozyteninfiltrate (Rush et al., Transplantation 57: 208–211 (1994)); (Rush et al., Transplantation 59: 511–514 (1994)) ohne erhöhte Expression der Cytokine, P oder GB (Lipman et al., J. Am. Soc. Nephrol. 6: 1060 (1995)). Nichtsdestotrotz entwickelten einige dieser Transplantate anschließend eine chronische Abstoßung (Rush et al., Transplantation 59: 511–514 (1994)). In einem experimentellen System verhinderte eine wirksame Cyclosporinkur die Infiltration des Transplantats nicht, aber eine solche Behandlung verminderte die Häufigkeit von CD8+-Zellen, die P und G exprimieren (Mueller et al., Transplantation 55: 139–145 (1993)). Im Einklang mit der Feststellung, dass viele Transplantat-infiltrierende T-Zellen nicht zeltzerstörend sind, zeigen nur wenige T-Zellen in histologischen Schnitten von abstoßenden menschlichen Nierenallotransplantaten eine P-mRNA-Expression (Matsuno et al., Transplant. Proc. 24: 1306–1307 (1992); Grimm, P. C. et al., Transplantation 59: 579–584 (1995)). Die Anzahl der Grenzfälle, die durch die hierin beschriebenen Verfahren untersucht wurden, unterstützen das Konzept, dass ein Fall einer leichten Abstoßung mit zellulärem Infiltrat durch Immunaktivierungsgenexpressionsanalyse identifiziert werden kann.
Wie in dem Vergleichsbeispiel 1 beschrieben, identifizierte die gleichzeitige Analyse der Genexpression von CTL-Effektormolekülen innerhalb des Transplantats eine akute Abstoßung (AR; akute rejection) in Nierenallotransplantaten mit außerordentlicher Empfindlichkeit und Spezifität und kann als ein zuverlässiges diagnostisches Werkzeug in die klinische Behandlung von Patienten mit Nierentransplantat eingeführt werden.
Die hierin beschriebenen Verfahren verwenden kompetitive Reverse-Transkription-(RT) -PCR, um die diagnostische Genauigkeit einer mehrfachen Immunaktivierungsgenanalyse als ein Mittel zur Diagnose von Nierenallotransplantatabstoßung zu beurteilen. Die Größe der Genexpression von 15 Immunaktivierungsgenen innerhalb des Transplantats wurde durch kompetitive RT-PCR in 60 Nierenallotransplantat-Kernbiopsien quantifiziert, die zur Beobachtung oder zur Diagnose der Ätiologie von Transplantatfehlfunktion erhalten wurden. Die Sequenzen der Oligonukleotidprimer und die kompetitiven Templates, die verwendet wurden, sind in 1 und Tabelle 1 gezeigt. Die Ergebnisse wurden mit der klinisch-pathologischen Analyse, die auf der histologischen Diagnose (Banff-Kriterien) fußte, und der Antwort auf Behandlung gegen Abstoßung verglichen.
Während einer akuten Nierenallotransplantatabstoßung war die Expression der Gene von Interleukin (IL)-7 (P < 0,001), IL-10 (P < 0,0001), IL-15 (P < 0,0001), Fas-Ligand (P < 0,0001), Perforin (P < 0,0001) und Granzym B (P < 0,0015), jedoch nicht von IL-2, Interferon-γ oder IL-4 innerhalb des Transplantats signifikant verstärkt. Amplifizierte RAN-TES- und IL-8-Gentranskripte waren empfindliche, aber nichtspezifische Marker der Abstoßung. Eine gleichzeitige RT-PCR-Beurteilung von Perforin, Granzym B und Fas-Ligand identifizierte eine akute Abstoßung, einschließlich Fällen mit leichter Infiltration, mit außerordentlicher Empfindlichkeit (100%) und Spezifität (100%). Eine wirksame Therapie gegen Abstoßung resultierte in einer schnellen Herabregulation der Genexpression. Verstärkte Genexpression von Chemokinen (IL-8, RANTES), T-Zell-Wachstumsfaktoren, die nicht von T-Zellen stammen (IL-7, IL-15) und CTL-selektiven Effektormolekülen wurde während der Abstoßung beobachtet.
Folglich stellt die quantitative RT-PCR-Analyse von IL-10- und IL-15-Transkripten (Makrophagen) und der CTL-selektiven Gene P, GB und FasL innerhalb des Transplantats ein zuverlässiges und hochempfindliches Werkzeug für die Diagnose von akuter Nierenallotransplantatabstoßung bereit. RANTES- und IL-8-Transkripte erwiesen sich als empfindliche, aber nichtspezifische Indikatoren der Abstoßung. IL-7- und IL-17-Transkripte wurden nur bei Abstoßung beobachtet, aber falsch negative Ergebnisse waren alltäglich. Die IL-2- und IL-4-Genexpression wurde in Abstoßungsproben nicht nachgewiesen, wohingegen die Expression von IFN-γ-, TGF-β1- und CTLA4-Genen nicht selektiv für eine Abstoßung war.
Darüber hinaus legen die hierin beschriebenen Daten nahe, dass eine gedampfte IL-7-, IL-10-, IL-15- und CTL-Genexpression als ein Indikator für eine wirksame Therapie gegen Abstoßung dienen kann (2). Diese Wirkung könnte durch Genregulation oder Zelleliminierung auftreten.
IL-2 und IL-4 wurden während der Abstoßungsepisoden nicht nachgewiesen. Eine laufende Überwachungsbiopsiestudie könnte bestimmen, ob (i) die IL-2-Genexpression einer klinisch evidenten Abstoßung, wie in vorklinischen Modellen festgestellt, vorangeht (O'Connel et al., J. Immunol. 150: 1093–1104 (1993)) und (ii) die IL-4-Genexpression in über lange Zeit stabilen Allotransplantaten nachweisbar ist. Die IL-4-Genexpression geht häufig mit einer erfolgreichen Langzeitverpflanzung in vorklinischen Versuchen einher (Strom et al., Curr. Opin. Immunol. 8: 688–693 (1996)).
Wie ebenfalls hierin beschrieben, wiesen Verfahren unter Verwendung von RT-PCR mit zur Genexpression von Perforin(P), Granzym B(GB) und Fas-Ligand(FasL) aus mononukleären Zellen des peripheren Bluts oder PBMCs isolierter RNA ebenfalls genau eine akute Abstoßung nach. Die Ergebnisse, die in Beispiel 2 beschrieben sind, begründeten, dass die Expression dieser Transkripte in PBMCs und Kernbiopsiegeweben korrelierte, und diese Expression korrelierte auch mit der histologischen Diagnose. Genauer kann die Transplantatabstoßung in PBMCs durch Beurteilung der Größe der Expression der Immunaktivierungsmarker P, GB und FasL und zusätzlich durch Nachweisen der Gegenwart oder Abwesenheit eines infektiösen Mittels getestet werden.
Wie hierin verwendet bezieht sich ein „infektiöses Mittel" auf jedes beliebige Mittel, das eine Rolle bei der Infektion in einem Transplantationspatienten spielt. Infektiöse Mittel schließen ein Bakterien wie z.B. Escherichia coli, Klebsiella, Enterobacteriaceae, Pseudomonas und Enterococcus; Pilze wie z.B. Candida albicans, Histoplasma capsulatum und Cryptococcus; Viren wie z.B. Hepatitis-B- und -C-Viren, menschliches Immunschwächevirus und Viren der Herpesgruppe, wie Herpes Simplex Virus Typ 1, Herpes Simplex Virus Typ 2, Varicella-Zoster-Virus(VZV), Cytomegalovirus(CMV), Epstein-Barr-Virus(EBV), menschliches Herpes-Virus 6, menschliches Herpes-Virus 7, Kaposi-Sarcom-assoziiertes Virus (menschliches Herpes-Virus 8) und Papovaviren; und Parasiten, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, Plasmodium falciparum, Toxoplasma gondii, Strongyloides stercoralis und Trypanosoma cruzi.
In einer Ausführungsform ist das analysierte infektiöse Mittel Cytomegalovirus(CMV). CMV ist eine übliche und gefährliche Infektion bei Transplantatempfängern. Im Allgemeinen tritt sie am Ende des ersten Post-Transplantationsmonats oder danach auf. 50% aller Nierentransplantatempfänger, die 1 bis 4 Monate nach der Transplantation mit Fieber vorstellig werden, haben Hinweise auf eine CMV-Erkrankung. Harrison's Principles of Internat Medicine, 14. Aufl, Fauci, A.S. et al., McGraw-Hill (1988). CMV selbst bedingt in mehr als zwei Dritteln der Fälle das Fieber und ist somit der während dieser Dauer der vorherrschende Erreger. Die CMV-Infektion kann auch als Arthralgien oder Myalgien vorhanden sein. Diese Infektion kann auch in einer primären Krankheit resultieren (in den Fällen eines seronegativen Empfängers, der eine Niere von einem seropositiven Spender empfängt) oder kann entweder als eine Reaktivierungskrankheit oder Superinfektion während dieses Intervalls vorhanden sein. CMV verursacht ebenfalls eine Glomerulopathie und ist mit einem erhöhten Auftreten anderer opportunistischer Infektionen (z.B. Pilzinfektionen) verbunden. Aufgrund der Häufigkeit und Schwere der CMV-Krankheit wurden beträchtliche Anstrengungen unternommen, um zu versuchen, sie bei Nierentransplantatempfängern zu verhindern oder behandeln. Eine CMV-Retinitis kann auch als eine späte Infektion auftreten (mehr als sechs Monate nach der Transplantation). Darüber hinaus ist eine aktive CMV-Infektion manchmal mit Transplantatabstoßungsepisoden verbunden und wird damit verwechselt.
Wie in Beispiel 2 beschrieben, wurden falsch positive PBMC-Ergebnisse, die eine akute Transplantatabstoßung anzeigen, aus zwei Patienten mit CMV-Infektion erhalten. Daher kann ein zusätzliches Nachweisen der Gegenwart oder Abwesenheit einer oder mehrerer Gene, die charakteristisch für CMV sind, wirksam zwischen akuter Abstoßung und CMV-Infektion unterscheiden. Zum Beispiel kann zusätzlich zu dem Bestimmen der cDNA, die für Perforin, Granzym B und Fas-Ligand kodiert, das Bestimmen der Gegenwart oder Abwesenheit von cDNA, die für ein für CMV (oder ein anderes infektiöses Mittel) charakteristisches Gen kodiert, gleichzeitig oder anschließend durch RT-PCR bestimmt werden. Die genetischen Eigenschaften von Cytomegalovirus wurden sehr ausführlich charakterisiert und sind dem Fachmann gut bekannt (siehe z.B. Virology, 2. Aufl., Fields, B.N.E., Rauen Press, Ltd., N.Y. (1990)), auf Seiten 1595–2010). Die Primersequenzen für CMV sind bekannt und für den Fachmann verfügbar. Siehe Meyer König, U. et al., J. Infectious Diseases, Bd. 171: 705–709 (1995); Wright, P.A. und D. Wynford-Thomas, J. Pathol., Bd. 162: 99 (1990); Cassol, S.A. et al., J. Clin. Invest., Bd. 83: 1109–1115 (1989). Zum Beispiel können die Primersequenzen TCC ACG CTG TTT TGA CCT CCA TAG (CMV-Sense) (SEQ ID NR: 31) und GAC ATC TTT CTC GGG GTT CTC GTT (CMV-Antisense) (SEQ ID NR: 32) verwendet werden. Kompetitive Templates können so entwickelt werden, dass sie Transkripte von CMV und anderen infektiösen Mitteln unter Verwendung der hierin für die Immunaktivierungsmarkergene beschriebenen Verfahren quantifizieren. Siehe Clinical Laboratory Medicine, McClatchey, K.D., Hrsg., William & Wilkins, Baltimore, MD (1994) auf 165–174.
Andere Transplantate, einschließlich Lunge, Herz, Leber und Knochenmark, können in ähnlicher Weise getestet werden. Zum Beispiel kann der Nachweis von Hepatitisvirustranskripten wirksam zwischen einer Lebertransplantatabstoßung und einer Hepatitisinfektion unterscheiden. Der Fachmann kann Primer zum Nachweis von Hepatitis-Virus, die in dieser Ausführungsform verwendet werden, entwickeln. Siehe Virology, supra, auf Seiten 1981–2236.
Als ein Ergebnis der hierin beschriebenen Daten sind nun Verfahren zur schnellen und zuverlässigen Diagnose von akuter Abstoßung sogar in Fällen mit nur geringen zellulären Infiltraten erhältlich. Hierin wird zum ersten Mal die Analyse von Immunaktivierungsgentranskripten, die von PBMCs erhalten werden, bei gleichzeitiger Analyse von CMV-Transkripten zum genauen Nachweis einer Transplantatabstoßung beschrieben. Unter Verwendung der hierin beschriebenen Verfahren können zusätzlich Frühwarnmarker identifiziert werden, um die Empfindlichkeit und Spezifität der RT-PCR zur Entdeckung spezifischer Muster der Genaktivierung bei vaskulären, chronischen und Behandlungsresistenten Abstoßungen durch Verfeinerung der diagnostischen Kriterien aufgeklärt werden.
Die vorliegende Erfindung wird nun durch die folgenden Beispiele veranschaulicht werden, von denen nicht beabsichtigt ist, dass sie in irgendeiner Weise beschränkend sind.
Vergleichsbeispiel 1: ANALYSE VON BIOPSIEPROBEN
BIOPSIEN
Sechzig Nierentransplantatbiopsien wurden auf Genexpression von Chemokinen (IL-8, RANTES (regulated upon activation, normal T-cell expressed and secreted), T-Zell-Wachstumsfaktoren und anderen Cytokinen (IL-2, IL-4, IL-7, IL-10, IL-15 und IL-17), immunregulatorische Zelloberflächenproteine (CTLA4), zytotoxische Effektormoleküle (P, GB, FasL), IFN-γ, „Transforming Growth Factor"-(TGF)-β1, und das housekeeping-Protein Glycerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase(GAPDH) untersucht. Achtunddreißig Biopsien wurden von 34 Patienten (25 Erwachsene und 9 Kinder) zur Aufklärung der Ursache für die Transplantatfehlfunktion, 20 für eine frühe Post-Transplantationsüberwachung und 2 von Nieren verwandter Lebendspender vor der Reperfusion erhalten. Kleine Teile der Biopsiekerne (1/10–1/2) wurden sofort in flüssigem Stickstoff am Krankenbett schockgefroren und bei 70°C gelagert. Die Mehrzahl der Gewebe wurde für die histo pathologische Analyse verwendet. Biopsien, die zur Beurteilung der Ursache der Transplantatfehlfunktion erhalten wurden, wurden nach den Banff-Kriterien (Solez et al., Kidney Int. 44: 411–422 (1993)) als Abstoßung (vor der Behandlung n = 12, nach der Behandlung n = 3), keine Abstoßung (akute tubuläre Nekrose, Cyclosporinnephrotoxizität n = 12), chronische Abstoßung (n = 3), Wiederauftreten der Primärerkrankung (n = 4) und andere Komplikationen (n = 4) klassifiziert. In 4 der 12 Abstoßungsproben und 4 der 12 Proben mit akuter tubulärer Nekrose wurde ein geringes zelluläres Infiltrat beobachtet (Grenzfälle) und die Diagnose der Abstoßung wurde durch eine günstige klinische Antwort auf Corticosteroide oder OKT3-Behandlung bestätigt.
RNA-ISOLIERUNG
Die Vorgehensweisen zur Isolation von Gewebe-RNA und reverser Transkription in cDNA wurden wie ausführlich beschrieben durchgeführt (Lipman et al., J. Immunol. 152: 5120–5127 (1994)). Kurz zusammengefasst wurde die Gesamt-RNA durch Gewebehomogenisierung in Guanidinisothiocyanat/2-Mercaptoethanol und Ultrazentrifugation in CsCl isoliert. Ein Mikrogramm RNA wurde revers durch Moloney-Mause-Leukämievirus-Transkriptase transkribiert und auf ein Endvolumen von 40 μl verdünnt.
QUANTIFIZIERUNG DER GENEXPRESSION DURCH KOMPETITIVE-TEMPLATERT-PCR

Die Expression spezifischer Gentranskripte, die in Biopsiegewebe identifiziert wurden, wurde durch kompetitive RT-PCR, wie in Lipman, M., et al., J. Immunol, 152: 5120–5127 (1994) beschrieben, quantifiziert. Kompetitive RT-PCR ist auch in Bunn et al. ( US-Patent Nr. 5,213,961 ) beschrieben. Die aus den Biopsieproben hergeleitete cDNA wurde mit einer bekannten Menge eines mutierten Zielgen-cDNA-Fragments – dem genspezifischen Kompetitor – co-amplifiziert. Die Sense- und Antisense-Oligonukleotide amplifizierten sowohl Kompetitor als auch revers transkribierte cDNA-Sequenzen proportional zu ihren relativen anfänglichen Mengen in der PCR. (Die Sequenzen sind in 1 und Tabelle 1 als SEQ ID NRN: 1–30 aufgeführt). Tabelle 1: Sequenzen der Oligonukleotidprimer und kompetitiven Templates (CTs; competitive templates), die zur Quantifizierung der 15 beurteilten Gene verwendet wurden.

GEN	Richtung	Sequenz 5' nach 3'	SEQ. ID. NR.	Gen Zugang
GAPDH	Sense Antisense	GGTGAAGGTCGTCAACG CAAAGTTGTCATGGATGACC	SEQ. ID. NR:1 SEQ. ID. NR:2	J04030
IL-2	Sense Antisense	CGTCTGGAGGAGTGCTAA ATGGTTGCTGTCTCATCAGC	SEQ. ID. NR:3 SEQ. ID. NR:4	K02056
IL-4	Sense Antisense	TTCTACAGCCACCATGAGAG CAGCTCGAACACTTTGAATAT	SEQ. ID. NR:5 SEQ. ID. NR:6	M23442
IL-7	Sense Antisense	TTTAGTATATCTTTGGACTTCCTC GTGTTCTTTAGTGCCCATCAA	SEQ. ID. NR:7 SEQ. ID. NR:8	J04156
IL-8	Sense Antisense	TCTCTTGGCAGCCTTCCT AATTCTCAGCCTCTTCAAAAACTT	SEQ. ID. NR:9 SEQ. ID. NR:10	M63932
IL-10	Sense Antisense	GCCGTGGAGCAGGTGAAG AAGCCCCGAGACAAGATA	SEQ. ID. NR:11 SEQ. ID. NR:12	X78437
1L-15	Sense Antisense	CCGTGGCTTTGAGTAATGAG CAGATTCTGTTACATTCCC	SEQ. ID. NR:13 SEQ. ID. NR:14	X91233
IL-17	Sense Antisense	GGAGGCCATAGTGAAGG GGGTCGGCTCTCCATAG	SEQ. ID. NR:15 SEQ. ID. NR:16	U32659
Perforin	Sense Antisense	CGGCTACACTCACAGG CTGCCGTGGATGCCCTATG	SEQ. ID. NR:17 SEQ. ID. NR:18	M31951
Granzym B	Sense Antisense	GGGGAAGCTCCATAAATGTCACCT TACACACAAGAGGGCCTCCAGAGT	SEQ. ID. NR:19 SEQ. ID. NR:20	M28879
Fas-L	Sense Antisense	GCCTGTGTCTCCTTGTGA GCCACCCTTCTTATACTT	SEQ. ID. NR:21 SEQ. ID. NR:22	U11821
TGF-β1	Sense Antisense	CTGCGGATCTCTGTGTCATT CTCAGAGTGTTGCTATGGTG	SEQ. ID. NR:23 SEQ. ID. NR:24	X14935-91
IFN-γ	Sense Antisense	CCAGAGCATCCAAAAGTGTG CTAGTTGGCCCCTGAGATAAAG	SEQ. ID. NR:25 SEQ. ID. NR:26	A02137
CTLA4	Sense Antisense	GCAATGCACGTGGCCCAGCC TTTCACATTCTGGCTCTGTTGG	SEQ. ID. NR:27 SEQ. ID. NR:22	M288379
RANTE _S	Sense Antisense	CGGCACGCCTCGCTGTCATC TGTACTCCCGACCCATTT	SEQ. ID. NR:29 SEQ. ID. NR: 30	M21121

Die PCR-Produkte wurden durch Agarosegelelektrophorese aufgetrennt, mit Ethidiumbromid gefärbt, in UV-Licht mit einem Positiv/Negativ-Polaroidfilm Typ 55 photographiert und durch Laserdensiometrie gescannt (LKB Ultrascan). Das Verhältnis der Dichten (kompetitives Template (CT)/revers transkribierte cDNA) spiegelt die anfänglichen Mengen von zugegebener cDNA wider (pg kompetitiven Template pro pg revers transkribierter cDNA). Standardkurven wurden durch Reihenverdünnungen der genspezifischen Kompetitoren mit einer konstanten Menge einer revers transkribierten Kontroll-cDNA erzeugt, wodurch die Quantifizierung des Wildtyp-Gentranskripts ermöglicht wurde.
Kontaminierende genomische DNA wurde leicht durch Größenunterschiede identifiziert, da alle Oligonukleotidsonden auf getrennte Exons des interessierenden Gens zielten. Die Bedingungen, die für alle kompetitiven PCRs verwendet wurden, waren identisch: 94°C für 30 sec., 55°C für 20 sec., 70°C für 20 sec., 10 min Verlängerung bei 72°C nach 35 Zyklen (Perkin Elmer Cetus 480). Kompetitoren aus Phytohämagglutinin-stimulierten Glasten oder Nephrektomiegewebe wurden durch vier verschiedene Techniken erzeugt (1): (i) Ausschneiden eines 50- bis 100-bp großen Fragments im Zentrum der Zielgen-cDNA durch Verwenden geeigneter Restriktionsenzyme (GAPDH, IFN-γ, IL-10, IL-15, IL-17, P und GB); (ii) Amplifikation der äußeren Teile der cDNA durch zwei getrennte PCRs und Ligation dieser Fragmente (CTLA4, IL-7, FasL); (iii) Insertion eines kurzen DNA-Fragments in die Zielsequenz (IL-2, IL-4, TGF-1 oder Primerdeletion (IL-4)); und (iv) einschnittige Erzeugung einer verkürzten DNA-Sequenz durch Verwenden eines spezifisch entwickelten Doppel-Sense-Primers. Die Kompetitoren wurden in einen TA-Vektor (Invitrogen, San Diego) kloniert, in DH5a-Zellen (Promega) transfiziert, gereinigt und mittels UV-Spektrometrie quantifiziert.
Die Amplifikation des universell exprimierten GAPDH-Gens diente dazu, eine erfolgreiche RNA-Isolierung und reverse Transkription zu bestätigen. Die Größe der Zielgen-Expression wurde als pg Zielgen-cDNA pro pg GAPDH-cDNA berechnet.
Die statistische Analyse wurde unter Verwendung eines Newman-Keuls-Tests für normal verteilte Daten oder eines Kruskal-Wallis-Tests durchgeführt.
ERGEBNISSE

Die geringe Menge Gewebe, die für diese Studie zur Verfügung stand (1/10 bis 1/2 eines Biopsiekerns) erwies sich als ausreichend für eine genaue Analyse der Genexpression. Die RNA-Erträge waren im Bereich von 1 bis 20 μg, abhängig von der Größe des Biopsiefragments, was 40–800 PCRs pro Probe erlaubt. Die quantitative Analyse der Genexpression war notwendig, da geringe Niveaus an Transkripten in vielen Biopsien nachweisbar waren, wohingegen verstärkte Expression ausgewählter Gene nur während der Abstoßung auftrat (2A–F, Tabelle 2). Tabelle 2: Quantitative Analyse der Genexpression im Transplantat für 15 Immunaktivierungsgene

Gen	Abstoßung	Keine Abstoßung	p*	Empfindlichkeit	Spezifität
IL-2	0,0	0,0	NS	8	NA
IL-4	0,0	0,0	NS	0	0
TGF-β1	112 ± 87	98 ± 78	NS	45	55
CTLA-4	577 ± 396	228 ± 214	< 0,057	60	70
RANTES	284 ± 147	132 ± 104	< 0,064	91	71
IFN-γ	214 ± 194	151 ± 130	0,007	75	67
IL-17	24 ± 12	0,0	< 0,001	83	75
IL-7	38 ± 40	0,0	< 0,001	83	100
IL-8	112 ± 82	67 ±	< 0,0005	100	67
IL-10	451 ± 340	24 ± 30	< 0,0005	83	89
IL-15	236 ± 162	85 ± 37	< 0,0005	83	92
GB	174 ± 94	46 ± 51	< 0,0015	91	86
P	1705 ± 1021	338 ± 410	< 0,0001	83	92
FasL	779 ± 360	120 ± 101	< 0,0001	83	92

Die Werte sind als Mittelwert ± SD pg der Zielgen-cDNA pro pg GAPDH-cDNA angegeben. Die Intensität der Expression der einzelnen CTL-Gene innerhalb des Transplantats wurde mit histologischen (Banff-) Kriterien zur Etablierung der Diagnose der Transplantatabstoßung durch eine Analyse von 40 Transplantatbiopsien und in Grenzfällen durch klinische Antwort auf Behandlung gegen Transplantatabstoßung verglichen. NA, nicht anwendbar.

* Die statistische Analyse wurde mit einem Newman-Keuls-Test für normal verteilte Daten und einem Kruskal-Wallis-Test für andere durchgeführt. NS, nicht signifikant.

Eine verstärkte Genexpression während akuter Abstoßung wurde für IL-7, IL-8, RANTES, IL-10, IL-15, IL-17, CTLA4 und alle drei CTL-Effektormoleküle, z.B. GB, P und FasL nachgewiesen (2A–F). Die GB- und IL-10-Expression (P < 0,0015 und P < 0,0005) erwiesen sich als signifikante und spezifische Marker für akute, aber nicht chronische Abstoßung, wohingegen die IL-15- (P < 0,0015), FasL- und P- (P < 0,0001 und P < 0,0001) -Transkription während der akuten Allotransplantatabstoßung und in einigen der analysierten Proben mit chronischer Abstoßung erhöht war. Die Größe der Expression der einzelnen CTL-spezifischen Gene war nicht miteinander verbunden und es wurde kein Hinweis gefunden, dass die Granula-abhängigen (GB, P) oder Rezeptor-vermittelten (FasL) Wege alternativ aktiviert würden. IL-7- und IL-17-Transkripte wurden ausschließlich, aber nicht verlässlich in Abstoßungsproben beobachtet, wohingegen eine Erhöhung der IL-8- und RANTES-mRNA sowohl bei Abstoßung als auch Transplantatfehlfunktion, die mit anderen Ursachen verbunden war, gefunden wurde. Das höchste Niveau einer beliebigen Zielgenexpression war 4,4-fach höher als die Menge an GAPDH-Expression in dieser Probe (FasL in einer akuten Abstoßungsepisode). Die IL-2- und IL-4-Genexpression begleitete Abstoßungsepisoden nicht.

Die Genauigkeit dieses molekularen Ansatzes auf Grundlage von PCR zur Verifizierung einer Abstoßung kann erheblich durch eine gleichzeitige Analyse der CTL-Genexpression verbessert werden (Tabelle 3). Wenn ein Unterscheidungsniveau für verstärkte Genexpression auf den Mittelwert ± 95% Vertrauensintervall der Werte, die in Nichtabstoßungs-Nieren (Maximum 0,07 pg/pg GAPDH für B, 0,4 pg/pg GAPDH für FasL und 0,8 pg/pg GAPDH für P) beobachtet werden, gesetzt wird, identifiziert die kombinierte Analyse aller drei CTL-Effektormoleküle eine akute zelluläre Abstoßung, einschließlich Grenzfälle mit einer Empfindlichkeit von 100% und einer Spezifität von 100% in unseren Datenreihen (P < 0,0001). Tabelle 3: Kombinierte Analyse der CTL-Genexpression

Gen	Abstoßung	Keine _Abstoßung	p*	Empfindlichkeit %	Spezifität %
P + GB, eines oder beide hochreguliert	11/12	5/28	0,00015*	91	82
FasL + GB, eines oder	12/12	4/28	< 0,0001	100	85
beide hochreguliert
FasL + GB + P, beliebige zwei hochreguliert	12/12	0/28	< 0,0001*	100	100

Die Expression eines einzelnen Gens wurde für Werte über dem Mittelwert ± 95% Vertrauensintervall von Nichtabstoßungs-Nieren (Maximum 0,07 pg/pg GAPDH für GB und 0,4 pg/pg GAPDH für FasL und 0,8 pg/pg GAPDH für P) als positiv betrachtet.

* Statistische Analyse wurde mit einem χ²-Test durchgeführt.

Die Größe der Genexpression, die für diese mit einer Abstoßung verbundenen Gene, d.h. GB, P und FasL, indikativ war, sank offensichtlich nach Beginn einer wirksamen Therapie gegen Abstoßung (OKT3 oder Steroid-Pulse) wie in einigen Reihenbiopsieproben, die analysiert wurden, beispielhaft dargestellt wurde (2).
Post-Transplantations-Überwachungsbiopsien zeigten ähnliche Niveaus an IL-7-, IL-10-, IL-17- und GB-Transkripten im Vergleich zu Nichtabstoßungs-Nieren, wohingegen frühe (Tag 4 und 11) Post-Transplantations-Proben ergaben, dass die IL-15-, CTLA4-, P- und FasL-mRNA-Spiegel 2- bis 5-fach höher waren und eine Tendenz zum Absinken innerhalb der ersten Woche zeigten. Bei einer begrenzten Probennahme besaß die frühe Post-Transplantationsgenexpression keine Vorhersagekraft für die spätere Entwicklung von Abstoßungsepisoden.
Beispiel 2: ANALYSE VON PBMCS
In einer Studie von 16 Nierenallotransplantatempfängern wurden PBMCs aus Gesamtblut isoliert und die RNA durch ein modifiziertes QIAGENTM-Verfahren extrahiert (QIAGEN „Rneasy Blood Mini Kits", Kat.-Nr. 74303, 74304 oder 74305). Die QIAGEN-Technik bezieht vier Schritte ein: 1) eine Probe wird mit einem geeigneten Puffer zur Isolierung von RNA in einer Probe aus den übrigen Komponenten gemischt, z.B. wird ein Teil Gesamtblut mit fünf Teilen Lysepuffer gemischt, in dem die Blutzellen lysiert werden und die RNA freigesetzt wird; 2) die RNA in der Probe wird spezifisch an Partikel oder eine Membran gebunden; 3) die Partikel oder Membran werden gewaschen, um Nicht-RNA-Komponenten zu entfernen; 4) die isolierte RNA wird von den Partikeln/der Membran eluiert.
Um die Wirksamkeit der RNA-Isolierung aus PBMCs zu erhöhen, wurde der zweite Schritt des QIAGEN-Protokolls wie in Beispiel 3 beschrieben modifiziert.
Die Genexpression wurde durch Reverse-Transkriptions-gestätzte halbquantitative PCR in PBMCs und in schockgefrorenen Transplantatkernbiopsien analysiert und wurde mit den histopathologischen Ergebnissen (AR = 12 und keine Abstoßung NR = 4) verglichen. Die koordinierte Genexpression in PBMCs und den AR-Transplantaten wurde in 11/12 (92%) für P, 10/12 (83%) für GB und 9/12 (75%) für FasL festgestellt. Die Biopsiepathologie konnte aufgrund der Hochregulation von mindestens 2 der 3 Gene in PBMCs in allen Fällen genau vorhergesagt werden. In den NR-Proben wurde eine falsch positive Genexpression in PBMCs in 2/4 (50%) für P, 2/4 (50%) für GB und 1/4 (25%) mr FasL bemerkt, wenn sie mit der Genexpression im Transplantat verglichen wurde. Die falsch positiven PBMC-Ergebnisse wurden aus zwei Patienten mit CMV-Infektion erhalten. Die Biopsiehistopathologie in den NR-Proben wurde genau durch Nichtexpression von 2 der 3 Gene in PBMCs in den zwei Patienten ohne CMV-Infektion vorhergesagt. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Beurteilung der CTL-Genexpression in PBMCs bei Beurteilung von Markern von CMV verwendet werden kann, um die Notwendigkeit für eine Allotransplantatbiopsie abzuschätzen und eine akute Transplantatabstoßung zu beurteilen.
BEISPIEL 3: VERFAHREN ZUR BEARBEITUNG VON BLUT FÜR DIE PCR-ANALYSE
SAMMLUNG DES BLUTES
Zubehör:

2-ml-EDTA-Vakuumröhrchen (violetter Deckel): Kat. #369651 Vacutainer; Flasche mit Eis.

Vorgehensweise:

Beschriftung der EDTA-Röhrchen mit der Patienten-ID, Datum und Zeit.
Abnahme von 2 ml Blut in EDTA-Röhrchen und sorgfältiges Mischen durch Umdrehen; Transport auf Eis zum Labor zur Verarbeitung.

ISOLIERUNG WEIßER BLUTZELLEN
Zubehör:

3-cm³-Spritzen
sterile konische 15-ml-Röhrchen (Falcon) – Sterile Polypropylenröhrchen (20–200–1000 μl)
RPMI-Medium 1640: Kat. #11875-085 Gibco BRL
EL-Puffer: Kat. #79217 Qiagen
Flaschen mit flüssigem Stickstoff: Kat. #2123 Lab-Line.
Ethanol (96–100%) – 70% Ethanol in Wasser
14,5 M β-Mercaptoethanol (β-ME)
Laborzentrifuge mit einem Rotor für 15-ml-Röhrchen – 4C Mikrozentrifuge mit Rotor für 2-ml-Röhrchen

Geräte:

Laborzentrifuge mit Rotor für 15-ml-Röhrchen bei 4°C.

Vorgehensweise:

1. Verwendung einer 3-cm³-Spritze zum Übertragen von 1 – 1,5 ml Blut in 15-cm³-Röhrchen.
2. Vermischen der Probe mit 7,5 EL-Puffer (1 ml/5 ml EL-Puffer).
3. Inkubieren für 10–15 Minuten auf Eis. Mischen durch zweimaliges kurzes Vortexen während der Inkubation. Wenn die trübe Suspension nicht durchsichtig wird, Verlängerung der Inkubation auf Eis auf 20 Minuten.
4. Zentrifugation mit 400 × g für 10 Minuten bei 4°C, Überprüfen auf ein Pellet und Verwerfen des gesamten Überstands. Falls das Pellet rot ist, zusätzliche Inkubation für 10–15 Minuten auf Eis nach Zugabe von EL-Puffer bei Schritt 5.
5. Zugabe von 2 ml EL-Puffer zu dem Zellpellet. Resuspendieren der Zellen unter Verwendung einer Pipette, um sorgfältig rote Zellen zu entfernen. Zugabe von ausreichend RPMI-Kulturmedium, um ein 10-cm³-Röhrchen zu füllen, Platzieren auf Eis.
6. Erneutes Zentrifugieren wie in Schritt 4., Verwerfen des Überstands und Sicherstellen, dass das Pellet vollständig frei von Blut ist. Falls nicht, Wiederholung von Schritt 5.
7. Platzieren der Röhrchen mit dem Pellet in einen Behälter mit flüssigem Stickstoff zum Schockgefrieren. Lagerung bei –70°C.
8. Zugabe von 600 μl Puffer RLT (Zugabe von 2 ME), um weiße Zellen zu pelletieren. Vortexen oder Pipettieren zum Mischen. Es sollte kein weißes Zellpellet nach diesem Schritt sichtbar sein.
9. Überführung der Lyselösung auf eine Qiasheddersäule und Zentrifugieren für 2 Minuten bei 14–18.000 UpM.
10. Verwerfen der Säule und Zugabe der gleichen Menge 70%-igen Ethanols zu der Lyselösung und Mischen durch Pipettieren.
11. Auftragen von 500 μl auf eine RNeasy-Säule und Zentrifugieren mit 10.000 UpM für 15 Sekunden, Durchfluss verwerfen und Wiederholung mit restlicher Flüssigkeit.
12. Verwerfen des Durchflusses und Pipettieren von 700 μl Waschpuffer RW1 in Zentrifugationssäulen, Zentrifugation für 15 Sekunden bei 10.000 UpM und Verwerfen des Durchflusses.
13. Platzieren der Zentrifugationssäule in neue 2-ml-Sammelröhrchen, Pipettieren von 500 μl Waschpuffer RPE in die Säulen und wie oben Zentrifugieren. Verwerfen des Durchflusses.
14. Pipettieren von 500 ml Waschpuffer RPE in die Säule und Zentrifugieren für 2 Minuten bei höchster Geschwindigkeit zum Trocknen der Säulen; Verwerfen des Durchflusses.
15. Überführung der Zentrifugationssäule in 1,7-ml-Eppendorfgefäß und Eluieren der RNA mit 30 μl DEPC-behandeltem oder reinem Wasser. Zentrifugieren für 1 Minute bei 10.000 UpM. Wiederholen dieses Schrittes mit 30 μl Wasser für weiteres Eluieren in das gleiche Sammelröhrchen.
16. Messen der RNA durch UV-Spektrometrie und Lagerung bei –70°C. Falls wenig oder keine RNA eluiert wird, erneutes Zufügen von 30 μl DEPC-Wasser zu der Zentrifugationssäule bei Raumtemperatur für 10 Minuten, dann Wiederholen von Schritt 15.

ÄQUIVALENTE
Der Fachmann wird viele Äquivalente zu den spezifischen Ausführungsformen der hierin genau beschriebenen Erfindung erkennen oder unter Verwendung von nicht mehr als Routineexperimenten in der Lage sein, diese festzustellen. Es ist beabsichtigt, dass solche Äquivalente von dem Schutzumfang der folgenden Ansprüche umfasst sind.

Claims

Verfahren zur Beurteilung einer Transplantatabstoßung in einem Empfänger, wobei das Verfahren das Beurteilen der Expression von mindestens zwei Genen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Perforin, Granzym B und Fas-Ligand, in einer Post-Transplantations-Testprobe, die von dem Empfänger erhalten wurde, umfassend eine Probe mononukleärer Zellen des peripheren Bluts, Lymphflüssigkeit, Peritonealflüssigkeit oder Pleuralflüssigkeit, umfasst, wobei die Hochregulation der mindestens zwei Gene eine Transplantatabstoßung in dem Empfänger anzeigt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Transplantat ein Organ oder Gewebe umfasst.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Organ eine Niere, eine Leber, ein Herz oder eine Lunge ist.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Gewebe Knochenmark umfasst.
Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Transplantat ein Xenotransplantat ist.
Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Transplantat ein Allotransplantat ist.
Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 6, wobei eines der mindestens zwei Gene Perforin ist.
Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 6, wobei eines der mindestens zwei Gene Granzym B ist.
Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 8, wobei das Beurteilen der Expression der mindestens zwei Gene das Bestimmen der Menge eines jeden Transkripts der mindestens zwei Gene in der Post-Transplantations-Testprobe und das Vergleichen der jeweiligen Menge mit der Größe des Grundniveaus der Genexpression eines jeden der zwei entsprechenden Gene umfasst.
Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 8, wobei das Beurteilen der Expression der mindestens zwei Gene das Bestimmen der Menge des jeweiligen Transkripts der mindestens zwei Gene und das Vergleichen der jeweiligen Menge mit der Menge des Transkripts eines konstitutiv exprimierten Gens umfasst.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei das konstitutiv exprimierte Gen Glycerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase (GAPDH) ist.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei das konstitutiv exprimierte Gen Actin ist.
Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 12, wobei die Transplantatabstoßung eine akute Transplantatabstoßung ist.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Transplantatabstoßung eine akute Nierentransplantatabstoßung ist.
Verfahren nach Anspruch 14, zusätzlich umfassend das Beurteilen der Expression eines Interleukin-7(IL-7), eines Interleukin-10(IL-10) und eines Interleukin-15(IL-15), wobei die Hochregulation der IL-7-, IL-10- und IL-15-Gene eine Transplantatabstoßung in dem Empfänger anzeigt.
Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 15, zusätzlich umfassend das Beurteilen der Expression eines Gens eines infektiösen Mittels in der Flüssigkeit der Post-Transplantations-Testprobe, wobei die Abwesenheit der Expression eines Gens eines infektiösen Mittels in Gegenwart einer Hochregulation der mindestens zwei Gene, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Perforin, Granzym B und Fas-Ligand, eine Transplantatabstoßung in dem Empfänger anzeigt.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei das infektiöse Mittel ein Virus.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei das Virus ein Cytomegalovius ist.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei das Virus ein Papovavirus ist.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei das Virus ein Hepatitisvirus ist.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei das infektiöse Mittel ein Bakterium ist.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei das Bakterium Escherichia coli ist.
Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 22, wobei das Beurteilen der Expression der mindestens zwei Gene das Durchführen einer kompetitiven Reverse-Transkription-Polymerasekettenreaktion umfasst.
Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 23, wobei die Flüssigkeit der Post-Transplantations-Testprobe innerhalb von 7 Tagen nach der Transplantation von dem Empfänger erhalten wird.
Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 24, wobei der Empfänger ein humaner Empfänger ist.
Verwendung eines Kits in einem wie in einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 25 beanspruchten Verfahren, wobei der Kit geeignete Primer zur Beurteilung der Expression von Perforin, Granzym B, Fas-Ligand und GAPDH in einer biologischen Probe umfasst.
Verwendung eines Kits in einem wie in einem beliebigen der Ansprüche 16 bis 25 beanspruchten Verfahren, wobei der Kit geeignete Primer zur Beurteilung der Expression von Perforin, Granzym B, Fas-Ligand und GAPDH und ein Reagens zum Nachweisen der Gegenwart eines infektiösen Mittels in einer biologischen Probe umfasst.
Verwendung nach Anspruch 26 oder 27, wobei die Primer Nukleinsäuremoleküle mit den Sequenzen von SEQ ID NO:1 und SEQ ID NO:2; SEQ ID NO:17 und SEQ ID NO:18; SEQ ID NO:19 und SEQ ID NO:20; und SEQ ID NO:21 und SEQ ID NO:22 umfassen.