DE69807712T2

DE69807712T2 - Zusammensetzung zur mundhygiene, die eine bakterielle pullulanase und dextranase enthält

Info

Publication number: DE69807712T2
Application number: DE69807712T
Authority: DE
Inventors: Dorrit Aaslyng; Holk Nielsen; Rie Tsuchiya
Original assignee: Novozymes AS
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 1997-06-17
Filing date: 1998-06-08
Publication date: 2003-05-15
Anticipated expiration: 2018-06-09
Also published as: ATE223223T1; DE69807712D1; CN1264305A; CN1129436C; ES2183368T3; JP2002515911A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine Zusammensetzung enthaltend eine Bacillus Pullulanase in Kombination mit einer Dextranase.
Die Erfindung bezieht sich auch auf die Verwendung einer Pullulanase stammend von Bacillus in Kombination mit einer Dextranase in Mundpflegezusammensetzungen und -produkten und weiterhin auf die Bacillus Pullulanase zur Verwendung als Medikament zum Entfernen von Zahnbelag und/oder zur Verhinderung der Bildung von Zahnbelag.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Die Bildung von Zahnbelag führt zur Karies von Zähnen, Entzündung der Gingiva, Parodontitis und schließlich Zahnverlust. Zahnbelag ist eine Mischung von Bakterien, Epithelzellen, Leukozyten, Makrophagen und anderem oralen Exsudat. Die genannten Bakterien stellen hochgradig verzweigte Polysaccharide her, die zusammen mit Mikroorganismen aus der Mundhöhle eine adhäsive Matrix für die fortgesetzte Ausdehnung des Belags bilden.
Wenn Zahnbelag sich weiter ansammelt, entstehen steinharte, weiße oder gelbliche Ablagerungen. Diese Ablagerungen werden kalzifizierter Zahnbelag, Konkrement oder Zahnstein genannt und werden im Speichel aus Zahnbelag und Mineralien, wie insbesondere Kalzium, gebildet.

Orale Polysaccharide

Orale Polysaccharide werden aus in den Mund eingeführter Saccharose gebildet, d. h. als Essens- oder Getränkebestandteil, durch die Wirkung von karieserzeugenden Mikroorganismen, wie Streptococcus mutans oder Streptococcus sanguis, die in der Mundhöhle wachsen. Die genannten oralen Polysaccharide umfassen wasserlösliches Dextran, das einen großen Anteil an α-1,6-glucosidischen Bindungen hat, und eine Hauptkomponente an wasserunlöslichen, extrazellulären Polysacchariden genannt "Mutan", das ein Rückgrat mit α-1,3-glycosidischen Bindungen und Verzweigungen mit α-1,6-glycosidischen Bindungen, umfasst.
Mutan bindet an Hydroxyapatit (das die harte, äußere, poröse Schicht des Zahns darstellt) und an Akzeptorproteine an der Zelloberfläche der karieserregenden Bakterien, die an der Zahnoberfläche haften.

Pullulanase

Pullulanasen sind α-Dextrin-endo-1,6-α-glucosidasen (oder Pullulan 6-glucanohydrolase), die 1,6-α-D-glucosidische Bindungen in Pullulan, Amylopektin und Glycogen hydrolysieren. Mehrere Mikroorganismen sind als in der Lage, Pullulanase herzustellen, bekannt, einschließlich Bakterien der Gattung Aerobacter (Bender et al., (1959), Biochim. Biophys. Acta 36, p. 309), der Gattung Bacillus (EP 639,909 von Novo Nordisk A/S und EP 605,040 von Solvay SA), der Gattung Fervidobacterium (WO 92/16617 von Novo Nordisk A/S), der Gattung Pyrococcus (WO 92/02614 von Novo Nordisk A/S). Im Handel erhältliche Pullulanaseprodukte schließen Promozyme® von Novo Nordisk, das ein hitzestabiles Entzweigungsenzym, erhalten von einem Stamm von Bacillus acidopullulyticus, das für den Verzuckerungsschritt bei der Dextrose- und Maltoseherstellung verwendet wird, mit ein. Eine andere handelsübliche Pullulanase ist Optimax® (Solvay SA), erhältlich von Bacillus deramificans.

Dextranase

Dextranasen sind α-1,6-Glucanasen (auch als 1,6-α-D-Glucan-6-Glucanohydrolasen bekannt) die die α-1,6-glycosidischen Bindungen in Dextran abbauen. Mehrere Mikroorganismen sind in der Lage, Dextranasen herzustellen, unter ihnen Pilze der Gattungen Penecillium, Paecilomyces, Aspergillus, Fusarium, Spicaria, Verticillium, Helminthosporium und Chaetomium; Bakterien der Gattungen Lactobacillus, Streptococcus, Cellvibrio, Cytophaga, Brevibacterium, Pseudomonas, Corynebacterium, Arthrobacter und Flavobacterium und Hefen wie Lipomyces starkeyi.
Im Handel erhältliche Produkte schließen Dextranase 50 L von Novo Nordisk A/S, hergestellt durch Fermentation von Stämmen von Penecillium lilacium, mit ein. Dextranase 50 L wird in der Zuckerindustrie verwendet, um Dextran in rohem Zuckersaft oder Sirup aufzuspalten.
Um die Bildung von Zahnkaries, Zahnbelag und Zahnstein zu verhindern, wurde vorgeschlagen, eine Pullulanase und/oder eine Dextranase und/oder andere Enzyme zu Mundpflegezusammensetzungen und -produkten zuzugeben.
DE 1,965,043 (Aspro-Nicholas Ltd.) beschreibt eine Mundpflegezusammensetzung umfassend eine Dextranase und eine Pullulanase.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Es ist der Gegenstand der vorliegenden Erfindung verbesserte Mundpflegeprodukte zur Verfügung zu stellen, die sicher (d. h. ohne das Gewebe und die Struktur der Mundhöhle zu verletzen) und wirksam die Bildung von Zahnbelag verhindern und/oder bereits abgelagerten Zahnbelag entfernen.
Die Erfinder haben herausgefunden, dass Zusammensetzungen und Produkte umfassend eine Pullulanase, die von einem Stamm der bakteriellen Gattung Bacillus stammt, in Verbindung mit einer Dextranase einen synergistischen Effekt auf die Mutanhydrolyse und auf die Entfernung von Zahnbelag und die Verhinderung der Zahnbelagsbildung hat.
Als erstes bezieht sich die Erfindung auf eine Zusammensetzung enthaltend eine Bacillus Pullulanase und eine Dextranase.
Als zweites bezieht sich die Erfindung auf ein Mundpflegeprodukt enthaltend eine Mundpflegezusammensetzung der Erfindung.
Es ist auch der Gegenstand der Erfindung die Verwendung von Bacillus Pullulanasen zur in vitro Hydrolyse von Mutan enthaltendem Material zur Verfügung zu stellen.
Als letztes bezieht sich die Erfindung auf eine Bacillus Pullulanase zur Verwendung als Medikament und die Verwendung einer Bacillus Pullulanase zur Herstellung eines Medikaments zur Verhinderung der Bildung von Zahnbelag und/oder zur Entfernung von bereits gebildetem Zahnbelag.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNG

Fig. 1 vergleicht die Mutan-hydrolysierende Wirkung von zwei Bacillus Pullulanasen und einer Enterobacter aerogenes Pullulanase alleine, und in Verbindung mit einer Paecilomyces lilacinum Dextranase.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Es ist der Gegenstand der vorliegenden Erfindung, verbesserte Mundpflegeprodukte zur Verfügung zu stellen.
"Verbesserte" Mundpflegeprodukte bedeuten Produkte, die sicher sind (d. h. nicht das Gewebe und die Struktur der Mundhöhle verletzen) und die die Bildung von Zahnbelag wirksamer verhindern und/oder bereits abgelagerten Zahnbelag entfernen. Wie weiter oben erwähnt, sind Mundpflegezusammensetzungen umfassend eine Pullulanase und eine Dextranase bekannt.
Die Erfinder haben überraschenderweise herausgefunden, dass Pullulanasen, die von der Bakteriengattung Bacillus stammen, in Kombination mit einer Dextranase verwendet werden können, um verbesserte Mundpflegeprodukte zur Verfügung zu stellen. Derartige Mundpflegeprodukte entfernen Zahnbelag wirksamer als andere entsprechende Produkte, die andere bakterielle Pullulanasen in Verbindung mit einer Dextranase umfassen.
Im Zusammenhang mit der Entfernung von Zahnbelag wird ein synergistischer Effekt zwischen einer Bacillus Pullulanase und einer Dextranase erhalten. Wenn man eine standardmäßige bakterielle Pullulanase, wie die Enterobacter aerogenes Pullulanase, und eine Dextranase und/oder eine Mutanase kombiniert, trägt die Pullulanase nicht zur Zahnbelag-entfernenden Wirkung bei.
Darum haben Zusammensetzungen und Produkte umfassend die Kombination einer Bacillus Pullulanase und einer Dextranase eine Anzahl von Vorteilen im Vergleich mit entsprechenden Zusammensetzungen.
Die Menge an Enzymen, die zum Erhalt der gewünschten Wirkung benötigt ist, kann verringert werden und/oder es wird weniger Zeit zum Erhalt der gewünschten Wirkung benötigt.
Die verringerte Menge an benötigten Enzymen ist von wirtschaftlichem Interesse für Hersteller von Mundpflegeprodukten, da gemäß der Erfindung die Kosten der Produktion eines solchen Produkts verringert werden können. Des Weiteren wird, falls die ursprüngliche Menge an Enzymen dem Produkt zugesetzt ist, ein verbessertes Produkt erhalten, da die gewünschte Wirkung oft in einem kürzeren Zeitraum erhalten werden wird.
Auch der Verwender eines Mundpflegeprodukts der Erfindung (das detaillierter weiter unten beschrieben wird), das aus einer Mundpflegezusammensetzung der Erfindung hergestellt wurde, wird von der vorliegenden Erfindung profitieren, da die direkten und indirekten Nachteile (z. B. jeweils gelbe Beläge auf den Zähnen und Verhinderung von Zahnlöchern und Zahnfleischentzündungen) sicher und wirksamer verhindert werden können als mit entsprechenden Produkten des Standes der Technik, umfassend eine Pullulanase und eine Dextranase.
Es ist zu verstehen, dass die genannten Mundpflegeprodukte direkt oder indirekt gleichzeitig auch andere Mundpflegefunktionen haben können, z. B. Verhinderung von Zahnlöchern oder Gingivitis.

Zusammensetzungen

Als erstes bezieht sich die Erfindung auf eine Zusammensetzung umfassend eine Bacillus Pullulanase (d. h. eine Pullulanase stammend von einem Bakterium der Gattung Bacillus) und eine Dextranase. Eine Mundpflegezusammensetzung der Erfindung umfasst weiterhin Bestandteile, die in Mundpflegezusammensetzungen verwendet werden. Solche Bestandteile sind dem Fachmann wohlbekannt.
Speziell in Betracht gezogene Bacillus Pullulanasen schließen Pullulanasen mit ein, die von einem Stamm von Bacillus acidopullulyticus oder einem Stamm von Bacillus deramificans stammen. Allerdings können auch andere Bacillus Pullulanasen verwendet werden.
Bacillus Pullulanasen können vorteilhaft in Verbindung mit einer Dextranase stammend von Paecilomyces sp., insbesondere Paecilomyces lilacinus oder Penicillium sp., wie Penicillium lilacinus oder Penicillium minioluteum, oder einer anderen der Dextranasen, auf die im Abschnitt "Hintergrund der Erfindung" Bezug genommen wird, verwendet werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind die Enzyme (d. h. besonders die Pullulanase und die Dextranase) rekombinante Enzyme.
Die Enzyme der Erfindung sollten im wesentlichen bei den Temperaturen und pHs, die im Mund von Menschen oder Tieren vorherrschen, d. h. zwischen 20ºC und 40ºC, insbesondere bei um etwa 37ºC, und bei pHs im Bereich von 5-9, insbesondere von pH 6-8,5, oder sollten im wesentlichen bei Temperaturen und pHs, die im Mund vorherrschen, wenn die speziell in Frage kommenden Mundpflegeprodukte verwendet werden, aktiv sein.
Im Zusammenhang mit der Erfindung bedeutet "im Wesentlichen aktiv", dass die relative enzymatische Aktivität des Enzyms/der Enzyme oberhalb 50%, insbesondere oberhalb 60%, ganz besonders oberhalb 70%, wie 90%, bei dem pH ist, der im Mund vorherrscht, wenn die Mundpflegezusammensetzung verwendet wird, im Vergleich zur relativen Aktivität am pH-Optimum.
Die Mundpflegezusammensetzung der Erfindung kann weiterhin ein oder mehrere Enzyme ausgewählt aus der Gruppe aus Mutanasen, Oxidasen, wie Glucoseoxidase, L-Aminosäureoxidase, Peroxidasen, wie z. B. die Coprinus sp. Peroxidasen beschrieben in WO 95/10602 (von Novo Nordisk A/S) oder Lactoperoxidase, Haloperoxidasen, Laccasen, Proteasen, wie Papain, saure Proteasen (z. B. die sauren Proteasen beschrieben in WO 95/02044 (Novo Nordisk A/S)), Endoglucosidasen, Lipasen, Amylasen, einschließlich Amyloglucosidasen, wie AMG (von Novo Nordisk A/S), anti-mikrobielle Enzyme, und Mischungen aus diesen umfassen.
Eine Mundpflegezusammensetzung der Erfindung kann geeigneterweise eine Menge an Bacillus Pullulanase in einer Menge enthalten, die äquivalent zu einer Enzymaktivität, berechnet als Enzymaktivitätseinheiten im letztendlichen Mundpflegeprodukt, im Bereich von 0,001 PUN bis 1000 PUN/ml, bevorzugt von 0,01 PUN/ml bis 500 PUN/ml, besonders von 0,1 PUN/ml bis 100 PUN/ml, ist.
Eine Dextranase kann wahlweise, gemäß der Erfindung, in der Mundpflegezusammensetzung in einer Menge eingeschlossen sein, die äquivalent zu einer Enzymaktivität, berechnet als Enzymaktivitätseinheiten im letztendlichen Mundpflegeprodukt, im Bereich von 0,001 KDU bis 1000 KDU/ml, bevorzugt von 0,01 KDU/ml bis 500 KDU/ml, besonders von 0,1 KDU/ml bis 100 KDU/ml, ist.
Eine Mundpflegezusammensetzung der Erfindung kann weiterhin geeigneterweise eine Menge an Mutanase, wie Trichoderma harzianum Mutanase, umfassen, die äquivalent zu einer Enzymaktivität, berechnet als Enzymaktivitätseinheiten im letztendlichen Mundpflegeprodukt, im Bereich von 0,001 MU bis 1000 MU/ml, bevorzugt von 0,01 MU/ml bis 500 MU/ml, wie von 0,1 MU/ml bis 100 MU/ml, besonders 0,05 MU/ml bis 100 MU/ml, ist.

Mundpflegeprodukte

Die Erfindung bezieht sich auch auf Mundpflegeprodukte umfassend eine Mundpflegezusammensetzung der Erfindung. Das Mundpflegeprodukt kann jede geeignete physikalische Form haben (d. h. Puder, Paste, Gel, Flüssigkeit, Salbe, Tablette etc.).
Ein "Mundpflegeprodukt" kann man als Produkt definieren, das zum Beibehalten oder zur Verbesserung der Mundhygiene im Mund von Menschen und Tieren verwendet werden kann, indem es die Bildung von Zahnbelag verhindert, Zahnbelag entfernt, Zahnkrankheiten verhindert und/oder behandelt etc.
Zumindest im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung umfassen Mundpflegeprodukte auch Produkte zur Reinigung von Gebissen, künstlichen Zähnen und Ähnlichem.
Beispiele für solche Mundpflegeprodukte schließen Zahnpasta, Zahncreme, Gel oder Zahnpuder, Zahnmittel (Odontic), Mundwässer, Formulierungen zum Spülen vor oder nach dem Putzen, Kaugummi, Pastillen und Süßigkeiten mit ein.
Zahnpasten und Zahngele schließen typischerweise schleifendes Poliermaterial, Schaumbildner, Aromastoffe, Befeuchtungsmittel, Bindemittel, Verdickungsmittel, Süßstoffe, Weiß/Bleich/Fleckentfernungsmittel, Wasser und wahlweise Enzyme mit ein.
Mundwässer, einschließlich zahnbelagentfernende Flüssigkeiten, umfassen typischerweise eine Wasser/Alkohollösung, Aroma, Befeuchtungsmittel, Süßstoff, Schaumbildner, Farbstoff und wahlweise Enzyme.

Schleifmittel

Schleifendes Poliermaterial könnte man auch in das Zahnpflegemittel der Erfindung aufnehmen. Gemäß der Erfindung schließt das schleifende Poliermittel Aluminiumoxid und Hydrate davon, wie α-Aluminiumoxidtrihydrat, Magnesiumtrisilikat, Magnesiumcarbonat, Kaolin, Aluminiumsilikate, wie kalziniertes Aluminiumsilikat und Aluminiumsilikat, Kalziumcarbonat, Zirkonsilikat, und auch gepulverte Kunststoffe, wie Polyvinylchlorid, Polyamide, Polymethylmethacrylat, Polystyrol, Phenol-Formaldehydharze, Melamin-Formaldehydharze, Harnstoff- Formaldehydharze, Epoxyharze, gepulvertes Polyethylen, Trockengele (Xerogels) aus Kieselerde, Hydrogele (hydrogels) and Luftgele (aerogels) und Ähnliche mit ein. Kalziumpyrophosphat, wasserunlösliche Alkalimethaphosphate, Dikalziumphosphat und/oder sein Dihydrat, Dikalziumorthophosphat, Trikalziumphosphat, teilchenförmiges Hydroxyapatit und Ähnliche sind auch als Schleifmittel geeignet. Es ist auch möglich, Mischungen aus diesen Substanzen einzusetzen.
Abhängig vom Mundpflegeprodukt kann das Schleifmittel in einer Menge von 0 bis 70 Gewichtsprozent, bevorzugt von 1 bis 70%, vorliegen. Für Zahnpasten liegt typischerweise der Inhalt an Schleifmaterial im Bereich von 10 bis 70 Gewichtsprozent des letztendlichen Zahnpastaprodukts.
Befeuchtungsmittel werden eingesetzt, um Wasserverlust von z. B. Zahnpasten zu verhindern. Geeignete Befeuchtungsmittel für die Verwendung in Mundpflegeprodukten gemäß der Erfindung schließen die folgenden Verbindungen und Mischungen davon mit ein: Glycerin, Polyol, Sorbit, Polyethylenglycol (PEG), Propylenglycol, 1,3-Propandiol, 1,4-Butandiol, hydrogenierte und teilweise hydrolysierte Polysaccharide und Ähnliche. Befeuchtungsmittel liegen im allgemeinen von 0 bis 80%, bevorzugt von 5 bis 70 Gewichtsprozent, in der Zahnpasta vor.
Kieselerde, Stärke, Gummi-Traganth (tragacanth gum), Gummi-Xanthan (xanthan gum), Extrakte aus irischem Moos, Alginate, Pektin, Zellulosederivate, wie Hydroxyethylzellulose, Natriumcarboxymethylzellulose und Hydroxypropylzellulose, Poylacrylsäure und deren Salze, Polyvinylpyrrolidon, können als Beispiele für geeignete Verdickungsmittel und Bindemittel genannt werden, was hilft, das Zahnpflegeprodukt zu stabilisieren. Verdickungsmittel können in Zahnpasta, Cremes und Gelen in einer Menge von 0,1 bis 20 Gewichtsprozent, und Bindemittel in einer Menge von 0,01 bis 10 Gewichtsprozent des letztendlichen Produkts vorliegen.

Schaumbildner

Als Schaumbildner können Seife, anionische, kationische, nicht-ionische, amphoterische und/oder zwitterionische Tenside verwendet werden. Diese können mit Mengen von zwischen 0% bis 15%, bevorzugt von 0,1 bis 13%, mehr bevorzugt von 0,25 bis 10 Gewichtsprozent des letztendlichen Produkts vorliegen.

Tenside

Tenside sind nur in dem Maße geeignet, so dass sie keine inaktivierende Wirkung auf die vorliegende Protease ausüben. Tenside schließen Fettalkoholsulfate, Salze von sulfonierten Monoglyceriden oder Fettsäuren mit 10 bis 20 Kohlenstoffatomen, Fettsäure/Eiweißkondensationsprodukte, Salze von Fettsäureamiden und Taurine und/oder Salze von Fettsäureestern der Isethionsäure mit ein.

Süßstoffe

Geeignete Süßstoffe schließen Saccharin mit ein.

Aromastoffe

Aromen, wie Grüne Minze, liegen gewöhnlich in geringen Mengen, wie von 0,01% bis ungefähr 5 Gewichtsprozent vor, insbesondere von 0,1% bis 5%.

Weißmacher/Bleichmittel

Weißmacher/Bleichmittel schließen H&sub2;O&sub2; mit ein und können in Mengen von weniger als 5% zugesetzt werden, bevorzugt von 0,25 bis 4%, berechnet auf Grundlage des Gewichts des letztendlichen Produkts.
Weißmacher/Bleichmittel können ein Enzym, wie eine Oxidoreduktase, sein. Beispiele für geeignete Zahnbleichenzyme sind beschrieben in WO 97/06775 (Novo Nordisk).

Wasser

Wasser ist gewöhnlich in einer Menge zugesetzt, so dass z. B. Zahnpasta eine fließfähige Form erhält.

Andere Mittel

Des Weiteren können auch wasserlösliche, antibakterielle Mittel, wie Chlorhexidindigluconat, Hexetidin, Alexidin, quaternäre antibakterielle Ammoniumverbindungen und wasserlösliche Quellen für bestimmte Metallionen, wie Zink, Kupfer, Silber und Zinn (z. B. Zink-, Kupfer- und Zinnchlorid, und Silbernitrat) eingeschlossen sein.
Erfindungsgemäß ist auch die Zugabe von Verbindungen, die als Fluoridquelle, als Farbstoffe, als Konservierungsmittel, als Vitamine, als pH-einstellende Mittel, als Anti-Kariesmittel, als Desensibilisierungsmittel etc. verwendet werden könne, vorgesehen.

Enzyme

Enzyme sind andere essentielle Bestandteile, die in Mundpflegeprodukten und in Mundpflegeprodukten der Erfindung verwendet werden. Enzyme sind biologische Katalysatoren von chemischen Reaktionen in lebenden Systemen. Enzyme binden an die Substrate, auf die sie wirken, und bilden einen intermediären Enzym- Substrat-Komplex. Dieser Komplex wird dann zum Reaktionsprodukt und einem freigesetzten Enzym umgewandelt, welches seine spezifische enzymatische Funktion fortsetzt.
Enzyme bieten mehrere Vorzüge wenn sie für die Säuberung der Mundhöhle eingesetzt werden. Proteasen bauen Speichelproteine ab, die an die Zahnoberfläche adsorbieren und das Häutchen (Pellicle) bilden, die erste Schicht des sich bildenden Belags. Proteasen gemeinsam mit Lipasen zerstören Bakterien, indem sie Proteine und Lipide lysieren, die die strukturellen Komponenten von bakteriellen Zellwänden und Membranen bilden.
Dextranase baut die von Bakterien hergestellte organische Skelettstruktur, die die Matrix für bakterielle Adhäsion bildet, ab. Proteasen und Amylasen verhindern nicht nur die Zahnbelagbildung, sondern auch die Bildung von Zahnstein, indem sie den Kohlehydrat-Protein-Komplex, der Kalzium bindet, abbauen und die Mineralisierung verhindern.

Zahnpasta

Eine aus einer Mundpflegezusammensetzung der Erfindung hergestellte Zahnpaste (in Gewichtsprozent der letztendlichen Zahnpastazusammensetzung) kann typischerweise die folgenden Inhaltsstoffe umfassen:
Schleifmittel 10 bis 70%
Befeuchtungsmittel 0 bis 80%
Verdickungsmittel 0,1 bis 20%
Bindemittel 0,01 bis 10%
Süßstoff 0,1 bis 5%
Schaumbildner 0 bis 15%
Weißmacher 0 bis 5%
Enzyme 0,0001 bis 20%
In einer speziellen Ausführungsform der Erfindung ist das Mundpflegeprodukt eine Zahnpasta umfassend
a) 10 bis 70% Schleifmittel
b) 0 bis 80% Befeuchtungsmittel
c) 0,1 bis 20% Verdickungsmittel
d) 0,01 bis 10% Bindemittel
e) 0,1 bis 5% Süßstoff
f) 0 bis 15% Schaumbildner
g) 0 bis 5% Weißmacher
i) 0,0001 bis 20% Enzyme
Die unter i) genannten Enzyme schließen Pullulanasen, Dextranase und andere weiter oben beschriebene Enzyme, die bekannt dafür sind, dass sie in Zahnpasta und Ähnlichem verwendet werden, mit ein.

Mundwasser

Ein aus einer Mundpflegezusammensetzung der Erfindung hergestelltes Mundwasser kann typischerweise die folgenden Inhaltsstoffe umfassen (in Gewichtsprozent der letztendlichen Mundwasserzusammensetzung):
0-20% Befeuchtungsmittel
0-2% Tensid
0-5% Enzyme
0-20% Ethanol
0-2% Andere Bestandteile (z. B. Aroma, Süßstoff, aktive Bestandteile wie Fluoride)
0-70% Wasser
Die Mundwasserzusammensetzung kann mit einem geeigneten Puffer, z. B. Natriumcitrat oder -phosphat im pH-Bereich 6-7,5, gepuffert werden.
Das Mundwasser kann in unverdünnter Form sein, (d. h. muss vor der Verwendung verdünnt werden).

Verfahren der Herstellung

Die Mundpflegezusammensetzung und Produkte der vorliegenden Erfindung können hergestellt werden unter Verwendung von Verfahren, die auf dem Gebiet der Mundprodukte verbreitet sind.

Verwendung

Gemäß der vorliegenden Erfindung werden Bacillus Pullulanasen zur Hydrolyse von Mutan verwendet und des Weiteren zur Verwendung als Medikament zur Verhinderung von Zahnbelag und/oder zur Entfernung. Bevorzugt werden die Bacillus Pullulanasen in Verbindung mit einer Dextranase, manchmal auch mit einer Mutanase, verwendet.
Es ist im Bereich der Erfindung, die Bacillus Pullulanase in Nahrungsmitteln, Futter und/oder Haustierfutterprodukten, bevorzugt in Kombination mit einer Dextranase, und des Weiteren manchmal mit einer Mutanase, zu verwenden.

Verfahren zur Herstellung

MATERIAL UND METHODEN

Material

Pullulanasen:

Promozyme®: Pullulanase (erhältlich von Novo Nordisk) stammend von Bacillus acidopullulyticus (beschrieben in EP 63,909).
Optimax®: Pullulanase (wie beschrieben in EP 605,040 (Solvay SA) stammend von Bacillus deramificans.
Enterobacter aerogenes Pullulanase (bezogen von Amano, JP)

Andere Enzyme:

Dextranase von Paecilomyces lilacinum (erhältlich von Novo Nordisk).
Mutanase von Trichoderma harzianum CBS 243.71 (erhältlich von Novo Nordisk).

Mikroorganismen:

Streptococcus mutans Stamm CBS 350.71 (oder OMZ 176)
Actinomyces viscosus DSM 43329
Fusobacterium nucleatum subsp. polymorphum DSM 20482

Lösungen:

Britton-Robinson Puffer
Erythrosin B (Sigma)

Geräte:

Schüttler (Eppendorf Thermomixer, Typ 5436)
Chromometer CR-200 (Minolta)

Herstellung von Hydroxyapatitscheiben

Hydroxyapatitscheiben werden hergestellt, indem man 250 mg Hydroxyapatit in einer Scheibenform bei ungefähr 5900 kg (13,000 lbs) Druck 5 Minuten lang komprimiert. Die Scheiben werden dann 4 Stunden lang bei 600ºC gesintert und schließlich mit sterilem, deionisiertem Wasser hydratisiert.

Sterilisation von Hydroxyapatitscheiben

HA-Scheiben werden bei 180ºC 2 Stunden lang sterilisiert, mit dem sterilisierten, deionisierten Wasser hydratisiert und in einen Deckel eines Nung-Röhrchens gelegt (10 ml Volumen).

Herstellung von Mutan

Mutan wird hergestellt, indem man Streptococcus Mutans CBS 350.71 bei pH 6,5, 37ºC (konstant gehalten), und mit einer Belüftungsrate von 25 umin (rpm) in einem Medium, umfassend die folgenden Komponenten, wachsen lässt:
NZ-Case 6,5 g/Liter
Hefeextrakt 6 g/Liter
(NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; 20 g/Liter
K&sub2;PO&sub4; 3 g/Liter
Glukose 50 g/Liter
Pluronic PE6100 0,1%
Nach 35 Stunden wird Saccharose bis zu einer Endkonzentration von 60 g/Liter zugegeben, um Glucosyltransferase zu induzieren. Die gesamte Fermentationszeit beträgt 75 Stunden. Der Überstand der Fermentation wird zentrifugiert und filtriert (steril). Dann wird dem Überstand Saccharose zu einer Endkonzentration von 5% zugegeben (pH ist auf pH 7,0 mit Essigsäure eingestellt) und die Lösung wird über Nacht bei 37ºC gerührt. Die Lösung wird filtriert und das unlösliche Mutan auf Propex geerntet und ausgiebig mit deionisiertem Wasser, enthaltend 1% Natriumbenzoat, pH 5 (eingestellt mit Essigsäure), gewaschen. Schließlich wird das unlösliche Mutan lyophilisiert und gemahlen.

Methoden

Aktivitätsbestimmung: Eine Pullulanaseeinheit nach Novo (Pullulanase Unit Novo) (PUN) ist definiert als die Menge an Enzym, die Pullulan hydrolysiert und dabei reduzierendes Kohlenhydrat mit einer Reduktionskraft äquivalent zu einem mikromol Glucose pro Minute unter den folgenden Standardbedingungen freisetzt:
Substrat: 0,2% Pullulan
Temperatur: 40ºC
pH: 5,0
Reaktionsdauer: 30 Minuten
Eine detaillierte Beschreibung des Analyseverfahrens (AF 190) ist auf Anfrage erhältlich.

Bestimmung der Dextranaseaktivität (KDU)

Eine Kilo-Novo-Dextranaseeinheit (1 KDU) ist die Menge an Enzym, die Dextran unter Bildung von reduzierendem Zucker äquivalent zu einem g Maltose pro Stunde, nach dem Verfahren von Novo Nordisk zur Bestimmung von Dextranase, basierend auf den folgenden Standardbedingungen, abbaut:
Substrat: Dextran 500 (Pharmacia)
Reaktionsdauer: 20 Minuten
Temperatur: 40ºC
pH: 5,4
Eine detaillierte Beschreibung des analytischen Verfahrens von Novo Nordisk (AF 120) ist auf Anfrage erhältlich.

Bewertung der Belag-entfernenden Wirkung

Das zur Bewertung der Belag-entfernenden Wirkung verwendete Verfahren basiert auf dem von Kao in JP 2250816 beschriebenen Verfahren. Gemäß dem vorliegenden Verfahren werden die Hydroxyapatitscheiben mit einem Biofilm umfassend 3 Stämme von oralen Mikroorganismen (Streptococcus mutans, Actinomyces viscosus und Fusobacterium nucleatum) beschichtet.
Um die belagentfernende Wirkung zu testen, wird 0,1% Erythrosin B in PBS verwendet um Belag, der auf den Hydroxyapatitscheiben vorliegt, rot zu färben. Die Intensität der roten Farbe (d. h. a*) wird an einem Chromometer CR-200 gemessen. Der maximale Wert für a* ist 60. Werte darunter zeigen eine weniger intensive rote Farbe an (d. h. weniger Belag vorhanden). Falls der Wert für a* als 0 bestimmt wird, ist keine rote Farbe vorhanden (d. h. kein Belag).

BEISPIELE

Beispiel 1

Mutanhydrolyse

Die Hydrolyse von Mutan durch zwei Bacillus Pullulanasen und eine standardmäßige Bakterien Pullulanase, stammend von Enterobacter aerogenes, wurde allein und in Kombination mit Paecilomyces lilacinum Dextranase getestet.
Eine Mutansuspension, zubereitet wie im Abschnitt "Material und Methoden" beschrieben, wurde in deionisiertem Wasser mit einem Ultraschall- Beschallungsgerät (Ultrasonicater) dispergiert und ergab eine 2,5% (w/v) Substratsuspension.
Die folgenden Enzymlösungen, aufgelöst in 10 mM BR-Puffer, wurden hergestellt.
Optimax® (Bacillus Pullulanase): 0,5 und 10 PUN/ml
Promozyme® (Bacillus Pullulanase): 0,5 und 10 PUN/ml
Enterobacter aerogenes Pullulanase: 0,5 und 10 PUN/ml
Die obige Enzymlösung wurde auch mit 8,5 DU/ml Paecilomyces lilacinum Dextranase kombiniert.
Des Weiteren wurden auch 10 mM Britton-Robinson Pufferlösungen (pH 5,5) hergestellt.
250 ul von jeder der oben genannten Enzymlösungen und 250 ul Pufferlösung (pH 5,5) wurden in einem Mikrozentrifugenröhrchen gemischt. Sofort danach wurden 750 ul Mutansuspension zugesetzt, bei 37ºC in einem Schüttler bei Höchstgeschwindigkeit inkubiert.
Nach exakt 15 Minuten wurden 250 ul einer 0,5 N HCl zugegeben um die enzymatische Reaktion zu beenden. Eine Kontrolle wurde hergestellt, indem man 0,5 N HCl vor Zugabe einer Substratsuspension zusetzte. Jede der Reaktionsmischungen wurde einer Zentrifugation unterworfen. Die löslich gemachten Kohlenhydrate im erhaltenen Überstand wurden als Glucose gemäß dem Verfahren der Anthronreaktion bestimmt (J. H. Roe, (1955), J. Biol. Chem. 212, p. 335).
Das Ergebnis ist in Fig. 1 dargestellt. Aus Fig. 1 kann man sehen, dass die zwei Bacillus Pullulanasen, Promozym® bzw. Optimax®, in Kombination mit der Paecilomyces Dextranase einen synergistischen Effekt bei der Hydrolyse von Mutan zeigen, während das die standardmäßige Enterobacter Pullulanase in Kombination mit derselben Dextranase nicht tut.

Claims

1. Zusammensetzung enthaltend eine Bacillus Pullulanase und eine Dextranase.

2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, weiter enthaltend Inhaltsstoffe, die in Mundpflegezusammensetzungen verwendet werden.

3. Zusammensetzung nach Ansprüchen 1 oder 2, wobei die Pullulanase von einem Stamm von Bacillus acidopullulyticus oder Bacillus deramificans stammt.

4. Zusammensetzung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Dextranase von einem Stamm von Paecilomyces sp., insbesondere Paecilomyces lilacium stammt.

5. Zusammensetzung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Enzyme im wesentlichen aktiv bei Temperaturen zwischen 20ºC und 40ºC sind, insbesondere bei um etwa 37ºC.

6. Zusammensetzung nach Anspruch 5, wobei die relative enzymatische Aktivität des Enzyms oberhalb 50%, insbesondere oberhalb 60%, ganz besonders oberhalb 70%, wie 90%, bei dem pH ist, der im Mund vorherrscht, wenn die Zusammensetzung verwendet wird, im Vergleich zur relativen Aktivität am pH Optimum.

7. Zusammensetzung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6, weiter umfassend ein oder mehrere Enzyme ausgewählt aus der Gruppe aus Mutanasen, Oxidasen, Peroxidasen, Haloperoxidasen, Laccasen, Proteasen, Endoglucosidasen, Lipasen, Amylasen, Anti-mikrobielle Enzyme und Mischungen aus diesen.

8. Mundpflegeprodukt enthaltend eine Zusammensetzung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 7.

9. Mundpflegeprodukt nach Anspruch 8, das ein Zahnpflegemittel ist, wie eine Zahnpasta, ein Zahnpuder oder ein Mundwasser.

10. Mundpflegeprodukt nach Anspruch 8 oder 9, weiter enthaltend eine Dextranase, wie eine Dextranase stammend von Paecilomyces sp., insbesondere P. lilacinum.

11. Verwendung einer Bacillus Pullulanase zur in vitro Hydrolyse von Mutan enthaltendem Material.

12. Verwendung nach Anspruch 11, wobei die Bacillus Pullulanase in Kombination mit einer Dextranase und/oder einer Mutanase verwendet wird.

13. Eine Bacillus Pullulanase zur Verwendung als Medikament.

14. Bacillus Pullulanase nach Anspruch 13 zur Verhinderung der Bildung von Zahnbelag und/oder zum Entfernen von bereits gebildetem Zahnbelag.

15. Bacillus Pullulanase nach Ansprüchen 13 bis 14, wobei die Bacillus Pullulanase in Kombination mit einer Dextranase und/oder einer Mutanase verwendet wird.

16. Verwendung einer Bacillus Pullulanase zur Herstellung eines Medikaments zur Verhinderung der Bildung von Zahnbelag und/oder zur Entfernung von bereits gebildetem Zahnbelag.