DE69726144T9

DE69726144T9 - Topische verwendung von tempol zur vorbeugung der lichtalterung

Info

Publication number: DE69726144T9
Application number: DE69726144T
Authority: DE
Inventors: Eric F Bernstein
Original assignee: Bernstein, Eric F.
Current assignee: BERNSTEIN, ERIC F., GLADWYNE, PA., US
Priority date: 1996-05-07
Filing date: 1997-05-06
Publication date: 2004-09-09
Also published as: DE69726144D1; JP2000511516A; WO1997041826A1; EP0906078A4; EP0906078A1; ATE253885T1; AU3060597A; DE69726144T2; AU720476B2; EP0906078B1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Wirkungen von UV-Strahlung stellen ein zunehmendes Problem für die heutige langlebige Bevölkerung dar, wenn die menschliche Haut der Sonne ausgesetzt wird. Der Hauptanteil an Veränderungen, die mit einem älteren Aussehen einhergehen, ist auf chronische Sonnenschäden zurückzuführen. Warnen et al., J. Am. Acad. Dermatol. 1991, 25: 751–760; Frances, C., und Robert L., Int. J. Dermatol. 1984, 23: 166–179. Dramatische Veränderungen der äußeren Dermis, die mit tiefen Falten und Schlaffheit verbunden sind, sind typisch für lichtgealterte Haut. Die hauptsächliche histopathologische Veränderung der lichtgealterten Haut ist die Anhäufung von Substanzen, welche bei histopathologischen Routineuntersuchungen die Färbeeigenschaften von Elastin aufweisen, und somit als Sonnenelastosis bezeichnet werden. Durch immunohistochemische Färbung wurde gezeigt, dass die schlecht ausgebildeten Fasem, die Sonnenelastosis umfassen, aus Elastin (Chen et al., J. Invest. Dermatol., 1986, 87: 334–337; Mera et al., Br. J. Dermatol. 1987, 117: 21–27) Fibrillin (Chen et al., J. Invest. Dermatol. 1986, 87: 334–337; Dahlback et al., J. Invest. Dermatol. 1990, 94: 284–291; Bernstein et al., J. Invest. Dermatol. 1994, 103: 182–186) und Versican, den normalen Bestandteilen von elastischen Fasern (Zimmermann et al., J. Cell. Biol. 1994, 124: 817–825) bestehen. Ein koordinierter Anstieg in den Elastin-, Fibrillin- und Versican-mRNAs wurde in Fibroblasten gezeigt, die aus lichtgeschädigter Haut abstammen, im Vergleich zu Fibroblasten, die aus normaler Haut von den gleichen Personen abstammen. Bernstein et al., J. Invest. Dermatol. 1994, 103: 182–186. Erhöhte Elastin-mRNA-Gehalte in sonnengeschädigter Haut sind zurückzuführen auf eine verstärkte Elastin-Promotoraktivität, wie durch transiente Transfektionen von Fibroblasten mit einem DNA-Konstrukt, das aus menschlichem Elastin-Promotor besteht, der mit einem Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT)-Reportergen verbunden ist, gezeigt wurde. Bernstein et al., J. Invest. Dermatol. 1994, 103: 182–186.
Die Bildung von freien Radikalen, nachdem die Haut UV-Strahlung ausgesetzt wurde, ist aus dem Stand der Technik gut bekannt. Es wurde gezeigt, dass freie Radikalmechanismen verantwortlich sind für die Rötung und das Erythem, das auf UV- Bestrahlung zurückzuführen ist. Eine Anzahl von Antioxidantien wurde als lichtschützende Mittel getestet, wobei jedoch die Ergebnisse dieser Untersuchungen zeigen, dass die Fähigkeit dieser Mittel, schützend zu wirken, variiert.
Miyachi, Y., J. Dermatol. Sci. 1995, 9: 79–86 gibt eine Übersicht über die Lichtalterung ausgehend von einem photooxidativen Standpunkt, und schlägt die Verwendung von Antioxidantien als Regulatoren der Lichtalterung vor. Speziell werden Untersuchungen mit Superoxiddismutase (SOD) beschrieben. Es wird jedoch daraus geschlossen, dass Sonnenschutzmittel einen besseren Schutz vor UV-Strahlung bieten.
Bissett et al., Photodermatol. Photoimmunol. Photomed. 1990, 7: 56–62 zeigten, dass Mäuse, die lokal mit Lösungen von Superoxid-einfangenden Antioxidantien, wie beispielsweise Alpha-Tocopherol, Ascorbinsäure, Propylgallat und Trolox vor der Bestrahlung mit Ultraviolett B (UVB)-Strahlen behandelt werden, erheblich weniger Schädigung zeigen als unbehandelte Mäuse. Zusätzliche Antioxidantien oder freie Radikalfänger, die getestet wurden, einschließlich Glutathion, Beta-Carotin, BHT, Mannit, Divinylglycol, Pantethein, Harnstoff und Histidin lieferten keinen signifikanten Schutz gegen UVB-Strahlen. Weiterhin wurde die Schwere der durch UVA-Bestrahlung induzierten Hautschädigung bei Mäusen durch lokale Anwendung dieser Antioxidantien in diesen Untersuchungen nicht verringert. Somit ist es offensichtlich, dass die gegenwärtig eingeschlagenen Wege, die beschritten werden, um die kumulativen Wirkungen von Lichtalterung zu verhindern, unzulänglich sind.
Historisch gesehen, wurden mehr Untersuchungen auf dem Gebiet der Bestrahlungsonkologie durchgeführt. Es wurde gezeigt, dass Schädigungen durch ionisierende Strahlung und ein Teil der durch UV-Strahlung induzierten Schädigungen auf die Bildung von Sauerstoffradikalspezies zurückzuführen ist. Sulfhydrylverbindungen waren unter den ersten Strahlenschutzmitteln, die identifiziert wurden. Ihr schützender Mechanismus scheint auf ihre Fähigkeit zurückzuführen zu sein, strahlungsinduzierte freie Radikale abzufangen und/oder reduzierende Äquivalente an oxidierte Moleküle abzugeben. Hämopoetische Zytokine wurden auch als Strahlenschutzmittel untersucht. Es wurde angenommen, dass sie durch schnellere Wiederherstellung der hämopoetischen Funktion nach Bestrahlung schützen.
Kürzlich wurde eine neue Klasse von Strahlenschutzmitteln, die Nitroxide, beschrieben. Als Klasse sind die Nitroxide stabile freie Radikalkomponenten, welche mit einer Vielzahl von biologisch relevanten Verbindungen, einschließlich anderen freien Radikalen, reagieren (Nilsson et al., J. Biol. Chem. 1989, 264: 11131–11135). Die Beobachtung, dass einige Nltroxide selbst mit freien Radikalen regieren, speziell mit Oxyradikalen, führte zur Untersuchung dieser Verbindungen als Strahlenschutzmittel (Samuni et al., Free Radical Biol. Med. 1989, 6: 141–148).
Tempol [4-Hydroxy-2,2-6,6-tetramethylpiperidinyloxy, freies Radikal] ist ein Piperidinyl-n-oxyl, wobei das n-Oxid sterisch stabilisiert ist durch symmetrische Paare von benachbarten Methylgruppen. Diese Verbindung ist kommerziell) erhältlich von Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI. Es wird am häufigsten als Spinmarker verwendet, um biologische Moleküle, wie beispielsweise NADP, zu markieren.
Von Tempol wurde gezeigt, dass es als Superoxiddismutase (SOD)-Imitator wirkt, wobei Säugetierzellen vor Superoxid geschützt werden, das aus Hypoxanthin/Xanthinoxidase und aus Wasserstoffperoxid, welches durch Zytotoxizität gebildet wird, erzeugt wird (Mitchell et al., Biochem. 1990, 29: 2802–2807; Samuni et al., J. Biol. Chem. 1988, 263: 17921–17924). Es wurde auch gezeigt, dass Tempol sowohl in vitro als auch in vivo Schutz gegenüber ionisierender Strahlung zeigt (Mitchell et al., Arch. Biochem. Biophys. 1991, 289: 62–70). Kürzlich wurde gezeigt, dass Tempol gegen durch Bestrahlen induzierten Haarausfall schützt, indem die Wiederherstellung des Haarwachstums in einem Bereich, in dem die Haut stark bestrahlt wurde, beschleunigt wird (Goffman et al., Int. J. Rad. Onc. Biol. Phys. 1992, 22: 803–806). Goffman et al. schlagen vor, dass dieser Schutz zurückzuführen ist auf den direkten Schutz der Haarfollikelstammzellen und auf die Entwicklung anderer Nitroxide. Bedeutenderweise zeigt diese Untersuchung auch, dass Tempol nach Verabreichung im Blut nicht nachweisbar ist. Dies ist von Bedeutung, da lokale Strahlenschutzmittel eine gemeinsame Tendenz zu systemischer Absorption haben, was zu einem potentiellen Problem beim Tumorstrahlenschutz führt.
Es wurde nun festgestellt, dass die lokale Anwendung von Tempol Lichtalterung und andere Hautschäden, die aus UV-Strahlung resultieren, verhindert.
Zusammenfassung der Erfindung
In der vorliegenden Erfindung wird eine neue Verwendung für die Verbindung Tempol (4-Hydroxy-TEMPO, freies Radikal; 4-Hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidinyloxy, freies Radikal) zur Verfügung gestellt. Es wurde nun festgestellt, dass Tempol die Lichtalterung verhindert und auch UVB blockiert, wodurch andere Sonnenschädigungen, wie beispielsweise Sonnenbrand oder Hautkrebs, verhindert werden. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass Tempol gegen UVA in vitro schützt. Diese Verbindung besitzt Sonnenblockerfähigkeit. Die Fähigkeit, durch UV-Strahlung induzierte Schäden zu blockieren, wurde gezeigt. Zusammensetzungen zur Verwendung als Sonnenschutzmittel, die Tempol umfassen, werden zur Verfügung gestellt.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung des freien Radikals 4-Hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidinyloxy (TEMPOL) zur Herstellung einer lokalen Zusammensetzung zum Schutz der Haut gegen durch UV-Strahlung induzierte Schäden zur Verfügung gestellt.
Vorzugsweise wird die Zusammensetzung formuliert zur lokalen Anwendung, bevor die Haut der Sonne ausgesetzt wird.
Vorteilhafterweise wird die Zusammensetzung formuliert zur lokalen Auftragung, nachdem die Haut der Sonne ausgesetzt wurde.
In bevorzugten Ausführungsformen umfasst die Zusammensetzung weiterhin einen zweiten Sonnenschutz oder Fänger für freie Radikale.
GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Tiefgehende Veränderungen finden in der äußeren Dermis als Ergebnis der chronischen Sonnenaussetzung statt. Die Hauptveränderung ist die Ablagerung großer Mengen von anormalen elastischen Materialien, was als Sonnenelastosis bezeichnet wird. Es wurde gezeigt, dass die Sonnenelastosis von höheren Werten der Elastin- und Fibrillin-RNAs sowie der Elastin-Promotoraktivität begleitet wird.
Ein transgenes Mausmodell, welches den menschlichen Elastin-Promotor enthält, der an ein Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT)-Reportergen gebunden ist, wurde zum Testen von Verbindungen entwickelt, die die kutane Lichtschädigung inhibieren können. Diese Mäuse exprimieren menschliche Elastin-Promotoraktivität in einer gewebespezifischen und entwicklungsbedingt regulierten Weise. Die Promotoraktivität kann in diesem Modell als Funktion von kleinen Anstiegen bei der UV-Bestrahlung untersucht werden, was die Empfindlickeit des Assays zeigt. Darüber hinaus können quantitative Daten nach nur einer einzigen UV-Bestrahlung erhalten werden. Eine Testverbindung wird auf die Haut einer transgenen Maus aufgetragen, die in der Lage ist, den menschlichen Elastinpromotor zu exprimieren. Die transgene Maus wird dann UV-Strahlen ausgesetzt, und die menschliche Elastin-Promotoraktivität in der Maus wird bestimmt. Die menschliche Elastin-Promotoraktivität wird dann mit der einer transgenen Maus verglichen, die auch der gleichen Dosis an UV-Strahlung ausgesetzt wird, welche aber nicht mit der Testverbindung behandelt wurde, um zu bestimmen, ob die Testverbindung Schutz gegen die UV-Strahlung bietet oder nicht. Da die Elastin-Promotoraktivierung ein primäres Ereignis bei der Hautalterung ist, repräsentieren diese Mäuse ein Mausmodell der menschlichen Lichtalterung.
Unter Verwendung dieser transgenen Mauslinie wurde die Fähigkeit von Tempol bestimmt, die Wirkungen von UV-Strahlen auf menschliche Elastin-Promotoraktivität zu inhibieren. In diesen Untersuchungen erhielten 4–5 Tage alte Mäuse entweder keine Behandlung, 0,4 M Tempol, 245 mJ/cm² UVB oder 245 mJ/cm² UVB und 0,4 M Tempol. Tempol wurde mit Ethanol verdünnt und lokal auf die Rücken dieser Mäuse aufgetragen. Nach der Lichtbehandlung wurden die Rücken der Mäuse zweimal mit 70%-igen Isopropylalkohol-Pads gespült, um überschüssiges Tempol zu entfernen. Die Mäuse wurden getötet, und die Haut zur Bestimmung der CAT-Aktivität 24 Stunden nach der Lichtbehandlung entnommen. Tempol allein produzierte keine signifikanten Änderung, wobei es die CAT-Aktivität um das 1,7- fache (S.A. = 0,48) erhöhte. UVB erhöhte die CAT-Aktivität um das 7,2-fache (Standardabweichung (S.A.) = 0,72) und die Verabreichung von Tempol an mit UVB behandelten Mäusen verringerte die Zunahme um das 3,3-fache (S.A. = 0,68) gegenüber den unbehandelten Kontrollmäusen.
Experimente, die die Fähigkeit von Tempol zeigen, gegen UVB-induzierte Promotoraktivitäten zu schützen, wurden auch in Fibroblastenkulturen durchgeführt, die aus der Haut von transgenen Mäusen gebildet wurden. Die Zellen erhielten entweder kein Tempol oder UVB (Vergleichsproben), 50 mM Tempol allein ohne UVB, 5,5 mJ/cm² UVB allein, Vorbehandlung mit 25 mM Tempol und nachfolgende Einwirkung von 5,5 mJ/cm² UVB, oder Vorbehandlung mit 50 mM Tempol und nachfolgende Einwirkung von 5,5 mJ/cm² UVB. Das Tempol wurde zehn Minuten vor dem UVB-Bestrahlen auf die Kulturplatten gegeben und nach der UVB-Bestrahlung 4 Minuten lang auf den Zellen belassen. Tempol allein veränderte die CAT-Aktivität in diesen Zellen nicht um einen signifikanten Betrag. UVB allein erhöhte die CAT-Aktivität um das 9,5-fache (S.A. = 0,47) gegenüber den unbestrahlten Zellen. Die Verabreichung von 25 mM Tempol an UVB-bestrahlte Zellen verringerte die Erhöhung um das 4,2-fache (S.A. = 0,02) gegenüber den Vergleichsproben, während 50 mM Tempol die Erhöhung weiter um das 2,8-fache (S.A. = 1,4) gegenüber den Vergleichsproben verringerte.
Weitere Experimente wurden mit verschiedenen Mengen an UVB an den Zellen durchgeführt. In diesen Experimenten erhielten die Zellen kein UVB oder Tempol. Die UVB-Vergleichszellen erhielten entweder 0,7, 1,4, 2,7 oder 5,5 mJ/cm² UVB. Die Tempol-Vergleichsproben erhielten 100 mM Tempol und kein UVB. Mit UVB behandelte Zellen wurden vor der UVB-Bestrahlung vorher mit Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) oder 100 mM Tempol 12,5 Minuten lang vorinkubiert. Die Wirkung von UVB und Tempol auf die Zelllebensfähigkeit wurde unter Verwendung eines Tryptan Blue-Ausschluß-Kits bestimmt.
Vor der Anwendung der Kulturen wurde das Gewebekulturmedium abgetrennt, und die Zellen wurden zweimal mit PBS gespült. Die Zellen wurden auf Platten mit 10 cm Durchmesser mit 3 ml 100 mM Tempol oder PBS 12,5 Minuten lang vor der UVB-Bestrahlung inkubiert. Die UVB-Vergleichsproben wurden vor der UVB-Bestrahlung 12,5 Minuten lang in eine gleiche Menge PBS gegeben. Nach der Behandlung wurden die Zellen zweimal mit PBS gereinigt, und das Gewebekulturmedium wurde in allen Platten ersetzt. Die Zellen wurden zur Bestimmung der CAT- Aktivität 24 Stunden nach der Lichtbehandlung gesammelt. Nur Fibroblasten von Mäusen aus dem gleichen Wurf wurden für jedes vorgegebene Experiment verwendet und pro Durchgang zwei- oder dreimal verwendet. Zwei Platten mit Zellen wurden für jeden Datenpunkt verwendet, und die Experimente wurden dreimal wiederholt. Somit wurden für jeden experimentellen Parameter sechs Werte bestimmt. Für die statistische Analyse wurde ein gepaarter t-Test durchgeführt. Die Daten aus diesen Experimenten sind in Tabelle 1 gezeigt.
TABELLE 1 In vitro-Effekt von Tempol auf UVB-induzierte CAT-Aktivität
Wie in den vorherigen Experimenten veränderte Tempol allein die CAT-Aktivität nicht um einen signifikanten Betrag (1,2-faches der unbehandelten Zellen). UVB allein erhöhte die CAT-Aktivität um das 3,2-, 8,1-, 15,7- und 20,0-fache der Vergleichszellen bei UVB-Dosen von 0,7, 1,4, 2,7 bzw. 5,5 mJ/cm² UVB. Die Zugabe von 100 mM Tempol zu UVB-behandelten Zellen verringerte die Höhe auf das 1,9-, 2,1-, 4,8- und 11,6-fache der unbehandelten Vergleichszellen bei UVB-Dosen von 0,7-, 1,4-, 2,7- bzw. 5,5 mJ/cm² UVB. Die Fängerfähigkeit für freie Radikale von Tempol wurde auch in den Zellen gezeigt. Die Zellen erhielten entweder keine Behandlung, 5,5 mJ/cm² UVB, UVB mit 50 mM Tempol, das in einer Quarzschale über den Zellen, die mit Salzlösung bedeckt waren, ausgebreitet war, oder UVB mit 50 mM Tempol, direkt angewendet auf die Zellen mit Salzlösung und in einer Quarzschale über den Zellen ausgebreitet. Das über den Zellen ausgebreitete Tempol wirkt als UV-Blocker. Tempol, das direkt auf den Zellen angewendet wird, wirkt sowohl als UVB-Blocker, als auch als Fänger für freie Radikale. UVB allein führte zu einem 14,2-fachen (S.A. = 1,5) Anstieg der CAT-Aktivität. Das in einer Quarzschale (die somit nur als Schirm wirkte) über den Zellen ausgebreitete Tempol führte zu einem 2,4-fachen Anstieg der CAT-Aktivität im Vergleich zu unbehandelten Vergleichsproben, was fast eine 6-fache Reduzierung gegenüber den Zellen ist, die nur mit UVB behandelt wurden und kein Tempol erhalten hatten, was den signifikanten Schutz vor UVB zeigte. Wenn Tempol in direkten Kontakt mit den Zellen gebracht wurde, wurde die CAT-Aktivität auf das 1,5-fache der der Vergleichsproben reduziert. Demgemäss reduzierten die Fängereigenschaften von Tempol die CAT-Aktivität um weitere 38%. Somit wurde auch gezeigt, dass Tempol zusätzlich zum Schutz gegen Lichtalterung durch Absorption von Licht einen Schutz gegenüber Schädigungen bietet, wenn UV-Strahlung die Haut schon erreicht hat.
Experimente, die die Fähigkeit zeigen, dass Tempol Schutz gegen UV-induzierte Promotoraktivierung bietet, wurden auch in Fibroblastenkulturen durchgeführt, welche aus der Haut von transgenen Mäusen erhalten wurden. Da eine Reaktion auf UVA allein in vitro nicht messbar ist, und die in vivo Reaktion relativ gering ist, wurde 8-Methoxypsoralen (8-MOP) zum System zugegeben, um die Promotorreaktion auf UVA zu verstärken. Die Zugabe von 8-MOP führte zu einem substantiellen Anstieg der CAT-Aktivität nach Verabreichung von UVA, was dieses Modell besonders nützlich macht zur Untersuchung von Mitteln, welche sowohl gegen UVA als auch gegen UVB schützen.
In diesen Experimenten erhielten die Vergleichszellen kein UVA oder 8-MOP. Die UVA-Vergleichsproben erhielten entweder 0,5, 0,75 oder 1,0 J/cm² UVA ohne vorherige Inkubation mit 8-MOP. 8-M0P-Vergleichsproben erhielten 1 μg/ml 8-MOP, aber kein UVA. Die Tempol-Vergleichsproben erhielten 100 mM Tempol und kein UVA oder 8-MOP. PUVA-behandelte Zellen wurden vorher mit 1,0 μg/ml 8-MOP in PBS inkubiert und dann 0,5, 0,75 oder 1,0 J/cm² UVA ausgesetzt. Die mit Tempol behandelten Zellen wurden mit 100 mM Tempol 12,5 Minuten lang vor der UVA-Bestrahlung vorbehandelt. 8-MOP wurde auch zu diesen Zellen gleichzeitig mit dem Tempol zugegeben.
Es wurde festgestellt, dass die Kombination von 1 μg/ml 8-MOP und 0,5, 0,75 oder 1,0 J/cm² UVA in Fibroblastenkulturen zu einem Anstieg der CAT-Aktivität um das 2,7-, 9,0- bzw. 21,4-fache der Vergleichsproben führte. UVA allein und 8-MOP allein waren nicht in der Lage, signifikante CAT-Aktivität hervorzurufen. Die Zugabe von Tempol zu den Kulturen reduzierte den PUVA-induzierten Anstieg der CAT-Aktivität um das 1,5-, 1,2- bzw. 2,0-fache der Vergleichsproben, wobei somit der PUVAinduzierte Anstieg der CAT-Aktivität fast vollständig ausgeschlossen wurde. Das Absorptionsspektrum von Tempol zeigte eine sehr kleine Absorption im UVA-Bereich, wodurch der Schutz durch Tempol gegen PUVA-induzierte Elastin-Geninduktion aufgrund der Fängerfähigkeit des Tempols bei freien Radikalen fast vollständig ist. Darüber hinaus war über den Zellen ausgebreitetes Tempol nicht in der Lage, Schutz gegen PUVA-induzierten Anstieg in der CAT-Aktivität zu leisten, wobei somit weiterhin gezeigt wird, dass der Schutz von Tempol gegen UVAinduzierte Lichtschädigung fast ausschließlich auf seine Fängereigenschaften bei freien Radikalen zurückzuführen ist.
Demgemäss stellt die lokale Anwendung einer Tempol-Zusammensetzung auf der Haut einen Schutz gegen Lichtalterung und andere Sonnenschädigungen, wie beispielsweise Sonnenbrand und Hautkrebs, zur Verfügung. Beispiele für die Tempol-Zusammensetzungen umfassen, sind aber nicht eingeschränkt auf Cremes, Lotionen und Sprays. Verfahren zur Formulierung von Tempol in Cremes, Lotionen und Sprays sowie pharmazeutische Additive für solche Formulierungen sind den Fachleuten auf dem Gebiet gut bekannt. Für die Fachleute auf diesem Gebiet wird es nach dieser Veröffentlichung offensichtlich sein, dass solche Zusammensetzungen weiterhin einen zweiten oder zusätzlichen Sonnenschutz oder einen Fänger für freie Radikale umfassen können, wie beispielsweise Vitamin C und Vitamin E und Analoga davon, aber nicht darauf eingeschränkt sind. In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Tempol-Zusammensetzung vor der Sonnenbestrahlung auf die Haut aufgetragen. Die Verabreichung dieser Zusammensetzungen nach der Bestrahlung kann auch jeden Schaden lindern, den die Haut durch die Bestrahlung erhalten hat. Es wird angenommen, dass die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung besonders nützlich zum Schutz von Personen mit erhöhter Empfindlichkeit gegenüber der Sonne sind, wie beispielsweise, aber nicht eingeschränkt auf, Personen, die einer psoralen Behandlung gegen Krebs, Psoriasis und andere Hauterkrankungen unterzogen werden; Personen, die einer fotodynamischen Therapie für Hautkrebs, Psoriasis und andere Hautkrankheiten unterzogen werden; Personen, die an genetischen Reparaturdefekten leiden, wie beispielsweise Xeroderma pigmentosa, Albinismus oder anderen Erkrankungen, die aus dem verringerten endogenen Melaninpigment resultieren.
Die folgenden, nicht einschränkenden Beispiele werden zur Verfügung gestellt, um die vorliegende Erfindung weiter zu veranschaulichen.
BEISPIELE
Beispiel 1: Transgene Mäuse, die den menschlichen Elastinpromotor exprimieren
Eine homozygote Linie von transgenen Mäusen, die den menschlichen 5,2-KB-Elastinpromotor, der mit einem CAT-Reportergen verbunden ist, exprimieren, wurde verwendet. Hsu-Wong et al., J. Biol. Chem. 1994, 269: 18072–18075. Diese Mäuse exprimierten den menschlichen Elastinpromotor in einer gewebespezifischen und entwicklungsbedingt regulierten Weise. Mäuse, die vier oder fünf Tage alt waren, wurden verwendet, da bei diesem Alter ein sichtbarer Haarwuchs nicht vorhanden ist.
Beispiel 2: Fibroblastenkulturen
Fibroblastenkulturen wurden auf der Haut von transgenen Mäusen gebildet, indem Gewebeproben auf Plastik-Gewebepetrischalen explantiert wurden, und die Zellen in den umgebenden Bereich wandern konnten. Die ersten Kulturen wurden in Dulbecco's modifiziertem Eagle-Medium bei 37°C gehalten, das mit 10% fetalem Kalbsserum, 2 mM L-Glutamin und Antibiotika versetzt war. Die primären Zellkulturen wurden durch Trypsinisation geleitet, und die Subkulturen in den Durchgängen drei oder vier wurden für die UVB-Behandlung verwendet. Nach UV-Bestrahlung wurden die Zellen in dem Gewebekulturmedium 24 Stunden lang inkubiert und dann zur Bestimmung der CAT-Aktivität gesammelt.
Beispiel 3: CAT-Assay
Die Messung der Expression des menschlichen Elastinpromotor/CAT-Reportergenkonstrukts in der Haut von transgenen Mäusen und in Fibroblastenkulturen, die aus diesen Tieren gebildet wurden, wurde die CAT-Aktivität bestimmt. Zur Extraktion des CAT aus der Haut wurden Proben in 0,25 Tris-HCl, pH 7,5, unter Verwendung eines Gewebehomogenisators (Brinkmann Instruments, Inc., Westbury, NY) homogenisiert. Die Homogenate wurden bei 10000 X g 15 Minuten lang bei 4°C zentrifugiert, und die Proteinkonzentration in der überstehenden Flüssigkeit wurde mit einem kommerziellen Proteinassay-Kit (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA) bestimmt. Aliquots der überstehenden Lösung, die 100 μg Protein enthielten, wurden durch Inkubation mit [¹⁴C]-Chloramphenicol nach gut bekannten Methoden für den Assay der CAT-Aktivität verwendet. Die acetylierten und nicht-acetylierten Formen des radioaktiven Chloramphenicols wurden durch Dünnschichtchromatographie getrennt, und die CAT-Aktivität wurde durch Radioaktivität in den acetylierten Formen als Prozentzahl der Gesamtradioaktivität in jeder Probe bestimmt.
Beispiel 4: UVB-Quellen
Bestrahlung mit UVB bei in vitro- und in vivo-Untersuchungen wurde unter Verwendung von sieben dicht nebeneinander angeordneten Westinghouse FS-40-Sonnenlampen durchgeführt, welche eine einheitliche Strahlung in einem Abstand von 38 cm abgaben. Die Energieabgabe bei 38 cm wurde mit einem Solar Light Modell 3D UVA- und UVB-Detektor (Solar Light Company, Philadelphia, PA) gemessen. Die Abgabeleistung von FS-40 Sonnenlampen betrug 23,4 Einheiten/Stunde UVB bei 38 cm, wobei jede Einheit 21 mJ/cm² oder effektiver Erythema-Energie äquivalent ist.
Beispiel 5: UVA-Quellen
Die Bestrahlung mit UVA wurde unter Verwendung von sieben dicht nebeneinander angeordneten Sylvania FR40T12 PUVA-Lampen, gefiltert durch Fensterglas von 2 mm Dicke, durchgeführt, um Wellenlängen unter 320 nm auszuschließen. Die Energieabgabe bei 38 cm aus der Anordnung wurde mit einem Solar Light Modell 3D UVA- und UVB-Detektor (Solar Light Company, Philadelphia, PA) gemessen. Die Abgabeleistung der Lampen, gefiltert durch das Fensterglas, betrug 2,02 mW/cm², wobei kein UVB-Licht nachweisbar war.

Claims

Verwendung des freien Radikals 4-Hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidinyloxy (TEMPOL) bei der Herstellung einer Zusammensetzung zur lokalen Auftragung zum Schutz der Haut gegen Schädigung, die durch UV-Strahlen hervorgerufen wird.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Zusammensetzung zur lokalen Auftragung auf die Haut, bevor diese der Sonne ausgesetzt wird, formuliert ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Zusammensetzung zur lokalen Auftragung auf die Haut, nachdem diese der Sonne ausgesetzt wurde, formuliert ist.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Zusammensetzung weiterhin einen zweiten Sonnenschutz oder einen Fänger für freie Radikale umfasst.