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Ausgangspunkt
der Erfindung
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Die rekonstruktive bzw. plastische
Chirurgie wurde viele Jahre lang zur Behandlung kongenitaler Gewebsdefekte
und zur Reparatur bzw. Heilung geschädigter Organe und Gewebe angewendet.
Ein ideales Material zur Gewebsrekonstruktion sollte biokompatibel
sein, sollte dazu in der Lage sein, sich in natives Gewebe ohne
Induktion nachteiliger Gewebsreaktionen einzufügen und sollte adäquate anatomische
und funktionelle Eigenschaften aufweisen (beispielsweise Größe, Festigkeit,
Beständigkeit
und dergleichen). Obwohl eine große Anzahl von Biomaterialien
einschließlich
synthetischer und natürlich gewonnener
Polymere zur Gewebskonstruktion oder Vergrößerung verwendet wurde (siehe
beispielsweise "Textbook of Tissue Engineering", Hsg. Lanza, R., Longer,
R. und Chick, W.: ACM Press, Colorado (1996) und die darin genannten
Referenzen), hat sich jedoch kein Material als zur Verwendung in
jeder Anwendung zufriedenstellend erwiesen.
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Beispielsweise waren auf dem Gebiet
der Blasenrekonstruktion synthetische Biomaterialien, wie beispielsweise
Polyvinyl- und Gelatine-Schwämme,
Folytetrafluorethylen(Teflon)-Filz und Silikongummi-Pflaster vergleichsweise
wenig erfolgreich, was im Allgemeinen auf Fremdkörperreaktionen zurückzuführen ist
(siehe beispielsweise Kudish, H. G., J. Urol., 78: 232 (1957); Ashkar,
L. und Heller, E., J. Urol. 98: 91 (1967); Kelami, A. et al., J.
Urol. 104: 693 (1970)). Polymer-Materialien wurden als "Gerüste" zum
Aussäen
von bzw. Beimpfen mit Zellen verwendet. Die besäten Gerüste können implantiert werden, um
eine Matrix für
das Wachstum von neuem Gewebe bereitzustellen (siehe beispielsweise
Atala, A. et al., J. Urol. 148 (2 Pt. 2): 658–62 (1992); Atala, A. et al.,
J. Urol. 150 (2 Pt. 2): 608–12
(1993)). Natürlich abgeleitete
Materialien wie beispielsweise lyophilisierte Dura, deepithelisierte
Darmsegmente und Dünndarmsubmukosa
(Small Intestinal Submukosa = SIS) wurden als Blasenersatz vorgeschlagen
(als allgemeinen Überblick
siehe Mooney, D. et al. "Tissue Engineering: Urogenital System"
in "Textbook of Tissue Engineering", Hsg. Lama, R., Langer, R. und Chick,
W., ACM Press, Colorado (1996)).
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Es wurde berichtet, dass Blasen,
die mit Data, Peritoneum, Plazenta und Faszie vergrößert wurden,
sich über
die Zeit hinweg kontrahieren (Kelami, A. et al., J. Urol. 105: 518
(1971)). Deepithelisierte Darmsegmente zeigten eine adäquate urotheliale Umhüllung zur
Verwendung in der Blasen-Rekonstruktion, jedoch verblieben Schwierigkeiten
entweder mit dem Schleimhaut-Wachstum, mit der Segment-Fibrose oder
mit beidem. Es wurde gezeigt, dass die Deepithelisierung der Darmsegmente
zu einem erneuten Schleimhautwachstum führen kann, wohingegen die Entfernung
der Schleimhaut bzw. Mukosa und der Submukosa zu einem Rückzug des Darmsegmentes
führen
kann (siehe beispielsweise Atala, A., J. Urol. 156: 338 (1996)).
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Xenogene Schweine-SIS wurde kürzlich mit positiven
Ergebnissen verwendet (beispielsweise Kropp, B. P. et al., Urology
46: 396 (1995)). Diese biodegradierbare kollagenreiche xenogene
Membran wurde kürzlich
als ein potentielles Material für
Gefäßtransplantate
untersucht (siehe beispielsweise Hiles et al., J. Biomed. Materials
Research 27: 139 (1993)). Jedoch mag die SIS durch die maximale
Größe beschränkt sein,
die das Transplantat abdecken kann, die unter Umständen für einen
Blasenersatz nicht ausreichend sein kann.
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Es wurde von weiteren Problemen bei
der Verwendung bestimmter gastrointestinaler Segmente zur Blasenchirurgie
berichtet, einschließlich
einer Infektion, Perforation, Steinbildung, metabolischer bzw. Stoffwechsel-Störungen und
Fällen
von Tumorentwicklung. Formalin-konservierte Schnitte der Blase wurden
zur Blasenrekonstruktion verwendet (siehe beispielsweise Tsuji et
al., J. Urol. 98: 91 (1967)). Jedoch hat die Verwendung des Formalinkonservierten
Materials im Allgemeinen keine effektive Langzeitbehandlung zur
Folge.
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Polymere und natürlich-abgeleitete "Gerüste" wurden
ebenfalls zur Unterstützung
des erneuten Wachstums von Knochen in Knochendefekten verwendet
(siehe beispielsweise US-Patent
Nr. 5 112 354 und 4 127 128; als allgemeinen Überblick siehe Yaszemski, M.
J.; et al., Biomaterials 17 (2): 175–85 (1996) und die darin genannten
Entgegenhaltungen). Vom Knochen abgeleitete Kollagen-Implantate
wurden zur Knochenheilung verwendet. Jedoch stellen diese Materialien
nicht immer die erforderliche Festigkeit, Biegsamkeit und Nicht-Immunogenität bereit, die
für eine
Langzeitheilung von Knochen erforderlich sind.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung betrifft
Materialien zur Reparatur oder Vergrößerung bzw. Verstärkung von
Geweben. Die Erfindung betrifft insbesondere Verfahren zur Gewebsrekonstruktion
oder Reparatur unter Verwendung von Blasen-Submukosa, betrifft Verfahren
zur Herstellung von Blasen-Submukosa-Segmenten, die zur Verwendung
in der Gewebsrekonstruktion oder -reparatur bzw. -heilung geeignet sind,
und betrifft Materialien zur Verwendung in der Gewebsrekonstruktion
oder -reparatur.
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Gemäß einem Grundgedanken stellt
die Erfindung eine Zusammensetzung zur Verwendung in einem Verfahren
zur chirurgischen Vergrößerung eines
Gewebes eines Patienten bereit. Das Verfahren schließt den Schritt
ein, das Gewebe des Patienten mit isolierter Blasen-Submukosa zu vergrößern. In bevorzugten
Ausführungsformen
umfasst die isolierte Blasen-Submukosa
isolierte Blasen-Submukosa, die mit Zellen beimpft bzw. besät ist. Die
Zellen können
Zellen eines Typs sein, der in dem Gewebe des Patienten zu finden
ist. Das Gewebe des Patienten kann Blasen-Gewebe sein. Die isolierte
Blasen-Submukosa kann xenogen sein oder kann vorzugsweise allogene
Blasen-Submukosa sein. Die isolierte Blasen-Submukosa kann weiterhin
einen Wachstumsfaktor zur Förderung
des Wachstums des Gewebes einschließen. Das Subjekt bzw. der Patient
kann ein Säugetier,
einschließlich
eines Menschen, sein.
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Bei einer weiteren Ausführungsform
stellt die Erfindung eine Zusammensetzung zur Verwendung in einem
Verfahren zur Reparatur eines geschädigten Gewebes bereit, wobei
das Verfahren ein In-Berührung-Bringen
des beschädigten
Gewebes mit isolierter Blasen-Submukosa,
die mit Zellen beimpft ist, unter derartigen Bedingungen umfasst,
dass das Wachstum des Gewebes eintritt, so dass das geschädigte Gewebe
geheilt wird. Das geschädigte
Gewebe kann Blasen-Gewebe sein.
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Bei einem weiteren Grundgedanken
stellt die Erfindung ein Material zur Gewebsrekonstruktion oder
-verstärkung
bereit. Das Material umfasst isolierte Blasen-Submukosa, die mit Zellen beimpft ist. Die
isolierte Blasen-Submukosa kann erste und zweite Oberflächen aufweisen
und kann mit einem ersten Zelltyp auf der ersten Oberfläche und
mit einem zweiten Zelltyp auf der zweiten Oberfläche beimpft sein. Der erste
Zelltyp kann aus Urothelzellen bestehen und der zweite Zelltyp kann
aus Muskelzellen bestehen.
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Bei einem weiteren Grundgedanken
stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung isolierter Blasen-Submukosa
bereit, die mit Zellen beimpft ist. Das Verfahren schließt die Schritte
ein, die isolierte Blasen-Submukosa mit Zellen zu beimpfen.
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Kurze Beschreibung
der Figuren
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1 ist
eine schematische Darstellung, die die Gewinnung von Blasen-Submukosa
und Zellen und die Blasenvergrößerung mit
der Blasen-Submukosa zeigt, die mit Zellen beimpft ist.
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2 ist
ein Diagramm, das die Ergebnisse der Blasenvergrößerung unter Verwendung isolierter Blasen-Submukosa
darstellt, die wahlweise beimpfte Zellen einschließen.
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Ausführliche
Beschreibung der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung stellt
Verfahren und Materialien zur Gewebsrekonstruktion und -reparatur
bereit. Im Allgemeinen beansprucht die Erfindung die Verwendung
isolierter Blasen-Submukosa zur Gewebsreparatur und -vergrößerung.
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Biodegradierbare bzw. biologisch
abbaubare Polymere wurden als Zellabgabe-Träger zur Blasenreparatur verwendet,
wobei die rekonstituierten Muskelzellen auf einer Seite des Polymers
geschichtet und Urothelzellen auf der gegenüberliegenden Seite geschichtet
wurden. Das in vitro-Zell-Polymerkonstrukt wurde dann als Gewebsersatz
in Blasen, Harnleitern und Harnröhren
von Tieren verwendet (siehe beispielsweise Atala, A. et al., J.
Urol. 148 (2 Pt. 2): 658–62
(1992); Atala, A. et al., J. Urol. 150 (2 Pt. 2): 608–12 (1993);
Yoo, J. J. et al., J. Urol., Pt. 2, 153: 375A (1995)). Obwohl die
Polymere für
bestimmte Zwecke geeignet waren, weist isolierte Blasen-Submukosa
spezifische Eigenschaften auf, wie beispielsweise Elastizität, die zur
Verwendung in der Gewebsreparatur, Rekonstruktion und Verstärkung erwünscht sind.
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Das Blasengewebe in vivo enthält drei Hauptschichten:
die submukosale Schicht, die Muskelschicht und die urotheliale Schicht.
Wie hierin verwendet, betrifft der Begriff "isolierte Blasen-Submukosa"
Blasen-Submukosa, die im Wesentlichen frei von natürlich vorkommenden
Urothel- und Muskelschichten der Blase sind. In bevorzugten Ausführungsformen
ist die isolierte Blasen-Submukosa im Wesentlichen frei von natürlich vorkommenden
anhaftenden Muskel- und Urothelzellen (d. h. die isolierte Blasen-Submukosa
ist vorzugsweise im Wesentlichen frei von Muskel- und Urothelzellen,
die Teil des natürlich
vorkommenden Blasengewebes sind, von dem die isolierte Blasen-Submukosa
gewonnen wurde, und welche Zellen nicht aus der Submukosa entfernt
wurden, beispielsweise durch Mikrosektion). In bestimmten Ausführungsformen
ist die isolierte Blasen-Submukosa im Wesentlichen zellfrei. Isolierte Blasen-Submukosa
ist eine Kollagen-reiche Schicht, die im Wesentlichen nicht immunogen,
azellulär
und bioresorbierbar ist.
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"Isolierte Blasen-Submukosa, beimpft
mit Zellen" betrifft isolierte Blasen-Submukosa, von der im Wesentlichen
alle natürlich
vorkommenden anhaftenden Zellen entfernt wurden (wie hierin beschrieben)
und der exogene Zellen zugesetzt wurden. Der Begriff "exogene" Zellen,
wie hierin verwendet, betrifft Zellen, die in vitro isolierter Blasen-Submukosa zugesetzt
wurden. Somit schließen
beispielsweise exogene Zellen Zellen ein, die aus einer Zellkultur oder
aus getrennten Gewebs-Proben gewonnen wurden. Exogene Zellen können aus
einer Probe von Ganzblasen-Gewebe gewonnen werden, von dem die isolierte
Blasen-Submukosa gewonnen wird; jedoch müssen solche Zellen zuerst von
der Submukosa abgetrennt werden, bevor die isolierte Submukosa mit
den Zellen beimpft wird. Beispielsweise, wie im Beispiel unten beschrieben,
kann eine Mikrosektion von Ganzblasen-Gewebe die Submukosa-Schicht von
der Urothel-Schicht und der Muskelschicht abtrennen. Zellen, die
aus dem Muskel- oder Urothelgewebe gewonnen wurden, können dann
in vitro kultiviert werden und die kultivierten Zellen können auf isolierte
Submukosa geimpft werden. Exogene Zellen schließen ebenfalls Zellen ein, die
aus anderen Organen oder Geweben als der Blase gewonnen wurden,
wie beispielsweise Endothel-Zellen (beispielsweise von Gefäßgewebe),
Osteoblasten von Knochen und dergleichen.
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Die isolierte Blasen-Submukosa kann
beispielsweise gemäß der hierin
beschriebenen Verfahren gewonnen werden. Beispielsweise können aus einem
Subjekt mikrosezierte Blasenschnitte gewonnen werden, um die Muskel-
und Urothel-Schichten von der Submukosa zu entfernen (beispielsweise
wie im Beispiel unten beschrieben), so dass isolierte Blasen-Submukosa erzeugt
wird, die, in speziellen Ausführungsformen,
zur Entfernung von Fremdmaterialien, Blut und dergleichen, beispielsweise
mit Phosphat-gepufferter Salzlösung (Phosphate
Buffered Saline = PBS), gewaschen werden kann. In bestimmten Ausführungsformen
kann die isolierte Blasen-Submukosa (die beispielsweise durch Mikrosezieren
hergestellt wurde) weiter behandelt werden, um sicherzustellen,
dass die isolierte Blasen-Submukosa-Zubereitung azellulär ist. Beispielsweise
können
Schnitte von mikrosezierten Blasen-Submukosa in destilliertem Wasser
angeordnet werden, um alle verbleibenden Zellen, die an der kollagenösen Submukosa-Schicht
anhaften, zu lysieren. Weitere Behandlungen, mit beispielsweise
einer Desoxyribonuklease zur Entfernung aller verbleibenden Nukleinsäuren, können angewendet
werden, um weiter sicherzustellen, dass die isolierte Blasen-Submukosa
zellfrei ist (vor einem wahlweise Beimpfen mit exogenen Zellen).
Solche Behandlungen sind für
den Fachmann auf dem Gebiet im Lichte der hierin offenbarten Lehren
Routine (siehe ebenfalls Sutherland, R. S. et al., J. Urol 156:
571 (1996)).
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Zellen zum Beimpfen von isolierter
Blasen-Submukosa können
durch Standardverfahren gewonnen werden und werden im Allgemeinen
so ausgewählt
werden, dass sie mit dem Zielgewebe oder -organ, das repariert oder
verstärkt
werden soll, kompatibel sind. Die beimpften Zellen sind vorzugsweise
von einer Art, die normalerweise im Zielorgan oder -gewebe zu finden
ist. In bevorzugten Ausführungsformen
sind die Zellen Zellen, die von einem Spender-Tier derselben Spezies
wie das Subjekt (wie beispielsweise wie in 1 dargestellt) gewonnen wurden, um immunogene
Reaktionen im Wirt nach der Implantation zu vermeiden oder zu reduzieren.
Solche Zellen werden hierin als "allogene" Zellen bezeichnet. In
bestimmten bevorzugten Ausführungsformen
können
die besäten
Zellen vom Subjekt (autologe Zellen) vor dem chirurgischen Eingriff
gewonnen werden. Zellen (wie beispielsweise autologe Zellen) können in
vivo kultiviert werden, falls dies erwünscht ist, um die Anzahl von
Zellen, die zum Beimpfen auf das isolierte Blasen-Submukosa-"Gerüst" verfügbar sind
zu erhöhen.
Die Verwendung allogener Zellen und besonders bevorzugt von autologen
Zellen ist zur Vermeidung einer Gewebsabstoßung bevorzugt. Wenn jedoch
eine immunologische Reaktion in dem Subjekt nach der Implantation
der isolierten Blasen-Submukosa,
die mit Zellen beimpft ist (die zu einer Transplantat-Abstoßung führen könnten) auftritt,
kann das Subjekt beispielsweise mit immunsuppressiven Mitteln wie
beispielsweise Cyclosporin oder FK506 behandelt werden, um die Wahrscheinlichkeit
einer Abstoßung
des implantierten Materials zu reduzieren. In bestimmten Ausführungsformen
können
chimäre
Zellen oder Zellen aus einem transgenen Tier auf die isolierte Blasen-Submukosa aufgeimpft
werden.
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Das Impfen der Zellen auf die isolierte
Blasen-Submukosa kann beispielsweise wie im Beispiel oder gemäß Standardverfahren
durchgeführt
werden. Beispielsweise wurde vom Beimpfen von Zellen auf Polymersubstrate
zur Verwendung in der Gewebsreparatur berichtet (siehe beispielsweise
Atala, A. et al., J. Urol. 148 (2 Pt. 2): 658–62 (1992); Atala, A. et al.,
J. Urol. 150 (2 Pt. 2): 608–12
(1993)). In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen können mehr
als ein Zelltyp auf isolierte Blasen-Submukosa vor der Implantation
geimpft werden. Zur Veranschaulichung kann, wie im Beispiel unten
beschrieben, vor der Implantation des Implantats isolierte Blasen-Submukosa
auf einer Seite oder Oberfläche
mit Urothel-Zellen beimpft werden und auf einer zweiten Seite oder
Oberfläche
mit Muskelzellen beimpft werden. In bestimmten Ausführungsformen
kann mehr als ein Zelltyp auf eine einzelne Oberfläche der
isolierten Blasen-Submukosa aufgesät werden. Zellen, die in Kultur
gewachsen sind, können
trypsinisiert werden, um die Zellen aufzutrennen, und die aufgetrennten
Zellen können
auf die isolierte Blasen-Submukosa gesät werden. Alternativ können Zellen,
die aus Zellkultur gewonnen wurden, von einer Kulturplatte als eine
Zellschicht abgehoben werden, und die Zellschicht kann direkt auf
die isolierte Blasen-Submukosa
ohne vorherige Auftrennung der Zellen gesät werden. In einer bevorzugten
Ausführungsform
werden zumindest 50 Mio. Zellen/cm2 auf eine
Oberfläche
einer isolierten Blasen-Submukosa gesät. Es ist jedoch klar, dass
die Dichte der Zellen, die auf die Blasen-Submukosa gesät wird, variiert werden kann.
Beispielsweise fördern
größere Zelldichten
eine größere Gewebsbildung
durch die geimpften Zellen, wohingegen geringere Dichten eine relativ
größere Bildung
von Gewebe durch Zellen ermöglichen
kann, die das Transplantat vom Wirt infiltrieren. Die Auswahl von
Zelltypen und die Beimpfung der Zellen auf die isolierte Blasen-Submukosa
ist für einen
Fachmann auf dem Gebiet im Lichte der hierin offenbarten Lehren
Routine.
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Die isolierte Blasen-Submukosa kann
mit Zusätzen
bzw. Additiven oder Arzneistoffen vor der Implantierung behandelt
werden (vor oder nachdem die isolierte Blasen-Submukosa mit Zellen
besät wird,
wenn die optional besäten
Zellen verwendet werden), beispielsweise, um die Bildung von neuem Gewebe
nach der Implantation zu fördern.
Somit können
beispielsweise Wachstumsfaktoren, Zytokine, extrazelluläre Matrixbestandteile
und andere bioaktive Materialien der isolierten Blasen-Submukosa
zugesetzt werden, um die Transplantatheilung und die Bildung von
neuem Gewebe zu fördern.
Solche Additive werden im Allgemeinen gemäß dem zu rekonstruierenden
oder zu verstärkenden
Gewebe oder Organ ausgewählt
werden, um sicherzustellen, dass geeignetes neues Gewebe in dem transplantierten Organ
oder Gewebe gebildet wird (als Beispiel für solche Additive zur Verwendung
zur Förderung
der Knochenheilung siehe beispielsweise Kirker-Head, C. A. Vet.
Surg. 24 (5): 408–19
(1995)). Wenn beispielsweise isolierte Blasen-Submukosa (wahlweise besät mit Endothelzellen)
zur Vergrößerung von
vaskulärem
bzw. Gefäßgewebe
verwendet wird, kann vaskulärer
endothelialer Wachstumsfaktor (VGEF, siehe beispielsweise US-Patent
Nr. 5 654 273) verwendet werden, um die Bildung von neuem Gefäßgewebe
zu fördern.
Wachstumsfaktoren und weitere Additive (beispielsweise epidermaler
Wachstumsfaktor (EGF), Heparin-bindender epidermaler Wachstumsfaktor
(HBGF), Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF),
Zytokine, Gene, Proteine und dergleichen) können in Mengen im Überschuss über die
Mengen solcher Wachstumsfaktoren (falls vorliegend) zugesetzt werden,
die von den Zellen erzeugt werden können, die auf die isolierte
Blasen-Submukosa geimpft werden, wenn zugesetzte Zellen verwendet
werden. Solche Additive werden vorzugsweise in einer Menge bereitgestellt,
die ausreichend ist, um die Bildung von neuem Gewebe einer Art zu
fördern,
die für
das Gewebe oder Organ, das repariert oder verstärkt werden soll, geeignet ist
(beispielsweise indem die Infiltration von Wirtszellen in das Transplantat
verursacht oder beschleunigt wird). Während hierin auf die Vergrößerung einer
Blase gemäß der Erfindung
Bezug genommen wird, ist klar, dass die Verfahren und Materialien
der Erfindung zur Gewebsrekonstruktion oder -vergrößerung einer
Vielzahl von Geweben und Organen in einem Subjekt von Nutzen sind.
Somit können
beispielsweise Organe oder Gewebe wie beispielsweise Blase, Harnleiter,
Harnröhre,
Nierenbecken und dergleichen mit isolierter Blasen-Submukosa, die
mit Zellen besät
ist, vergrößert oder
repariert werden. Die Materialien und Verfahren der Erfindung können weiterhin
auf die Rekonstruktion oder Verstärkung von Gefäßgewebe
(siehe beispielsweise Zdrahala, R. J., J. Biomater. Appl. 10 (4):
309–29 (1996)),
von Darmgewebe, Magen, Knorpel, Knochen (siehe beispielsweise Laurencin,
C. T. et al., J. Biomed. Mater. Res. 30 (2): 133–8 (1996)) und dergleichen,
angewendet werden. Der Begriff "Subjekt" wie hierin verwendet, betrifft
ein Säugetier
wie beispielsweise einen Hund, eine Katze, ein Schwein, ein Pferd,
eine Kuh oder einen Menschen, das einer Rekonstruktion, Reparatur
oder Vergrößerung eines Gewebes
bedarf.
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Isolierte Blasen-Submukosa kann aus
Ganzblasen-Gewebe, wie hierin beschrieben, gewonnen werden. Es wird
angenommen, dass azelluläre
isolierte Blasen-Submukosa im Wesentlichen nicht immunogen ist.
In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen
wird die isolierte Blasen-Submukosa zur Gewebsreparatur oder -verstärkung von
einem Tier derselben Spezies wie das Subjekt gewonnen; solche Gewebe
werden hierin als "allogene" Blasen-Submukosa bezeichnet. Jedoch
können
die im Wesentlichen nicht immunogenen Qualitäten isolierter Blasen-Submukosa
die Verwendung isolierter Blasen-Submukosa ermöglichen, die von einer anderen
Spezies als dem Subjekt gewonnen wurde (hierin als "xenogene" isolierte
Blasen-Submukosa
bezeichnet). Die Verwendung von xenogener isolierter Blasen-Submukosa
ist insbesondere dann von Vorteil, wenn allogen isolierte Blasen-Submukosa
schwer zu gewinnen ist, beispielweise, wenn das Subjekt ein Mensch
ist. Somit kann isolierte Blasen-Submukosa von
Tieren wie beispielsweise Schweinen, von denen adäquate Mengen
einfach erhältlich
sind, zur Verwendung in der Reparatur oder Vergrößerung von Geweben oder Organen
eines Subjektes einer anderen Spezies gewonnen werden. Wie vorher
erwähnt, sind
jedoch allogene Zellen zur Besäung
isolierter Blasen-Submukosa bevorzugt, wenn Zellen gemäß der Erfindung
verwendet werden. Zusätzlich
kann isolierte Blasen-Submukosa aus Kadavern gewonnen werden.
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In einer bevorzugten Ausführungsform
sind die Materialien der Erfindung zur Rekonstruktion oder Vergrößerung von
Blasengewebe von Nutzen. Somit stellt die Erfindung Behandlungen
für solche Zustände bzw.
Leiden wie Blasenexstrophie, Blasenvolumeninsuffizienz, Rekonstruktion
der Blase im Anschluss einer teilweise oder vollständige Zystektomie,
Reparatur einer Blase, die durch eine Verletzung geschädigt wurde
oder dergleichen, bereit.
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Es hat sich nunmehr herausgestellt,
dass isolierte Blasen-Submukosa, mit oder ohne zugesetzten Zellen,
die Bildung von neuem Gewebe ermöglichen
kann, das eine grob normale zelluläre Organisation aufweist. Beispielsweise
diente, wie im Beispiel unten beschrieben, isolierte Blasen-Submukosa,
wahlweise mit Urothel- und Muskelzellen besät und in die Blase implantiert,
als ein "Gerüst"
für die Bildung
neuen Blasengewebes innerhalb von ungefähr zwei Monaten. Das neue Gewebe
besteht aus einem Urothel-ausgekleideten Lumen, umgeben von Submukosa-Gewebe
und glatter Muskulatur. Überdies
zeigte das neu geformte Gewebe Anzeichen einer Angiogenese und von
Nervenwachstum. Ohne an eine Theorie gebunden sein zu wollen wird
angenommen, dass die Zellen aus dem Wirtstier auf dem isolierten
Blasen-Submukosa-Transplantat infiltrieren und wachsen können, wodurch
neues Gewebe bereitgestellt wird, das strukturell und funktionell
dem nativen Gewebe, beispielsweise dem Blasengewebe, ähnlich ist.
Die besäten
Zellen können,
falls verwendet, ebenfalls zur Bildung von neuem Gewebe gezüchtet werden.
Isolierte Blasen-Submukosa ohne zugesetzte Zellen kann in einigen
Fällen
durch das Wirtstier nach der Implantation resorbiert werden. Es wird
angenommen, dass isolierte Blasen-Submukosa, die mit Zellen besät ist, im
Allgemeinen nicht nach Implantation resorbiert wird. Jedoch kann
in einigen Fällen
die isolierte Blasen-Submukosa
resorbiert werden, wenn neues Gewebe gebildet wird.
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Die Implantierung isolierter Blasen-Submukosa,
wahlweise mit Zellen besät,
in ein Organ oder Gewebe, das vergrößert werden soll, kann gemäß der hierin
beschriebenen Verfahren oder gemäß in der
Technik anerkannter Verfahren durchgeführt werden. Beispielsweise
kann die isolierte Blasen-Submukosa einem Organ oder Gewebe des
Subjektes durch Vernähen
des Transplantatmaterials mit dem Zielorgan transplantiert werden,
beispielsweise wie es im Beispiel 1 unten beschrieben ist. Andere
Verfahren zur Anlagerung bzw. Befestigung eines Transplantats an
ein Organ oder Gewebe des Subjekts (beispielsweise durch Verwendung
chirurgischer Heftklammern) können
ebenfalls angewendet werden. Solche chirurgische Verfahren können durch
einen Fachmann auf dem Gebiet gemäß bekannter Verfahren durchgeführt werden.
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Es hat sich herausgestellt, dass
die Materialien der Erfindung in der Blasen-Vergrößerung von Nutzen
sind, wie es hierin beschrieben ist. In einer bevorzugten Ausführungsform
wird eine isolierte Blasen-Submukosa, die mit Zellen beimpft ist,
zur Vergrößerung der
Blase verwendet, um eine vergrößerte Blase
mit einem Volumen (Kapazität)
von zumindest ungefähr
20% mehr als der Vor-Vergrößerungskapazität, besonders
bevorzugt zumindest ungefähr
40% mehr, 60% mehr, 80%, 100%, 200 oder 300% mehr Blasen-Kapazität bereitzustellen.
In anderen Ausführungsformen
wird die isolierte Blasen-Submukosa ohne Zellen zur Vergrößerung der
Blase verwendet, um eine vergrößerte Blase
mit einem Volumen (Kapazität)
von zumindest ungefähr
20% mehr als der Vor-Vergrößerungskapazität, besonders
bevorzugt, zumindest ungefähr
30% mehr, 40% mehr, 50%, 70%, 100% oder 200% mehr Blasen-Kapazität bereitzustellen.
Es hat sich herausgestellt, eine gewisse Kontraktion der Blase nach
dem Transplantieren einer isolierten Blasen-Submukosa ohne Zellen
an die Blase auftreten kann. Ohne an eine Theorie gebunden sein
zu wollen wird angenommen, dass eine solche Kontraktion auf die
Selbst-Anhaftung des transplantierten Materials zurückzuführen sein
kann. Es wird im Allgemeinen angenommen, dass Transplantate der
isolierten Blasen-Submukosa, die mit Zellen besät sind, sich über die
Zeit hinweg nach der Implantation möglicherweise signifikant kontrahieren können, was
auf die Hemmung der Selbst-Anhaftung und eine Kontraktion durch
die beimpften Zellen des transplantierten Materials zurückzuführen ist.
Falls erwünscht,
kann die Transplantationsstelle (oder die isolierte Blasen-Submukosa,
die mit Zellen besät
ist) mit Materialien zum Verhindern einer Selbst-Anhaftung des Transplantatmaterials
behandelt werden, wodurch eine Kontraktion der transplantierten
Blase verhindert wird und wodurch eine erhöhte Blasenkapazität im Subjekt
bereitgestellt, wird. Geeignete Materialien zur Vorbeugung chirurgischer
Anhaftungen sind bekannt und sind im Handel erhältlich.
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Beispiel
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Die isolierte Blasen-Submukosa, wahlweise beimpft
mit Zellen, wurde wie allgemein in 1 dargestellt,
hergestellt. 10 Beagle-Hunde wurden mit Natriumpentobarbital (25
mg/kg i.v.) anästhetisiert, im
Anschluss an eine Vorbehandlung mit Acepromazin (0,2 mg/kg i.m.).
Die Beagles wurden einer Zystektomie unterworfen, die ungefähr 50% der
Blase entfernte. Bei fünf
Hunden wurde das Blasengewebe mikroseziert und die Schleimhaut-
und Muskelschichten wurden getrennt. Die Blasenurothel- und -muskelzellen
wurden unter Verwendung von früher beschriebenen
Techniken kultiviert (siehe beispielsweise Cilento, B. G. et al.,
J. Urol. 152: 665 (1994); Tobin, M. S. et al., Surgical Forum 45:
786 (1994); Freeman, M. R. et al., J. Urol. 153: 4 (Erg.) (1995)). Kurz
gesagt, wurden Urothelzellen seziert und in Serum und freiem Keratinozyten-Wachstumsmedium angeordnet
(Karotinocyte SFM, Gibco, Grand Island, NY), das 5 ng/ml epidermalen
Wachstumsfaktor und 50 μg/ml
Hypophysenextrakt enthielt. Die Muskelzellen wurden durch die Gewebsexplantat-Technik
unter Verwendung von Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) (HyClone
Laboratories, Inc., Logan, Utah), ergänzt mit 10% fötalem Kalbsserum,
verarbeitet. Die Zellen wurden in einer angefeuchteten Atmosphärenkammer
inkubiert, die 5% CO2 enthielt und bei 37°C gehalten.
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Hunde-Blasengewebe wurde aseptisch
von getöteten
Tieren gewonnen. Das Blasengewebe wurde wiederholt mit Phosphat-gepufferter
Salzlösung (PBS)
gespült.
Die Submukosa wurde mikroseziert und aus den Muskel- und Serosaschichten
isoliert. Die isolierte Submukosa wurde sorgfältig gewaschen und in PBS angeordnet,
das 10% Cefazolin enthielt. Die Submukosa wurde dann bei 4°C für 6–12 Monate gehalten.
Alle Segmente der allogenen Blasen-Submukosa, mit einer Abmessung
von 4 × 5
cm Größe, wurden
für 24
Stunden UV-Licht-exponiert,
um die Segmente zu sterilisieren. Fünf Segmente wurden mit den
in vitro expandierten Muskelzellen auf einer Seite und mit Urothelzellen
auf der gegenüberliegenden
Seite beimpft. Diese Zell-Submukosa-Gerüste wurden für 7 Tage
vor der Implantation in Kultur belassen. Die verbleibenden fünf Blasen-Submukosa-Segmente
wurden nicht mit Zellen beimpft.
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Eine präoperative fluoroskopische Zystographie
und urodynamische Studien wurden bei allen Tieren durchgeführt. Unter
Vollnarkose wurden 10 Beagles Kreuzzystostomien an der Blasenkuppel
unterworfen. Die Vergrößerungs-Zystoplastie
wurde mit der allogenen Blasen-Submukosa
durchgeführt,
die bei fünf
Tieren mit Urothel- und Muskelzellen besät wurde, und mit allogenen
isolierten Blasen-Submukosa ohne zugesetzte Zellen bei den verbleibenden fünf Tieren.
Eine einzige Schicht aus kontinuierlich ineinandergreifenden Nähten mit
4-0 Vicryl wurde zur Anastomose verwendet. Nicht-absorbierbare 5-0-Nylon-Nähte wurden
bei den vier chirurgischen Eingriffen als Marker verwendet. Die
vergrößerten Blasen wurden
mit Omentum abgedeckt. Zystostomie-Katheter wurden zur Urinabscheidung
für 10–14 Tage verwendet.
Urodynamische Studien und fluoroskopische Zystographie wurden bei
allen Hunden zum Zeitpunkt 1, 2 und 3 Monate nach dem operativen Eingriff
durchgeführt.
Die vergrößerten Blasen
wurden 2 und 3 Monate nach der Vergrößerung wiedergewonnen und grob
und histologisch mit Hämatoxylin-
und Eosin-Färbungen
untersucht.
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Ergebnisse Während der Zeitdauer der Studie
zeigte keiner der Hunde eine nachteilige Wirkung. Alle Tiere überlebten
bis zum Zeitpunkt der Tötung ohne
irgendwelche bemerkenswerten Komplikationen, wie beispielsweise
Harntrakt-Infektion oder Caliculi-Bildung. Eine fluoroskopische
Zystographie aller vergrößerten Blasen
zeigte eine normale Blasenkonfiguration ohne Leckage zum Zeitpunkt
1, 2 oder 3 Monate nach dem Verfahren.
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Die Ergebnisse sind in 2 graphisch dargestellt
(ABS: Allogene Blasen-Submukosa; ABS + Zellen: Allogene Blasen-Submukosa,
besät mit
Urothel- und Muskelzellen). Blasen, vergrößert mit der allogenen Submukosa,
besät mit
Zellen, die eine durchschnittliche Zunahme der Kapazität von 99% zeigten.
Blasen, die mit der zellfrei isolierten Blasen-Submukosa vergrößert wurden, zeigten eine durchschnittliche
Zunahme der Kapazität
von 30%. Alle Tiere zeigten eine normale Blasen-Compliance, wie
es durch urodynamische Studien bewiesen wurde.
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Bei der Entnahme zeigten die vergrößerten Blasen
eine grobe Normalität
ohne irgendeinen Hinweis auf Divertikel-Bildung im Bereich des Transplantats.
Die Dicke des transplantierten Segmentes war derjenigen des nativen
Blasengewebes ähnlich.
Es gab keinen Hinweis auf eine Anhaftung oder Fibrose. Histologisch
enthielten alle entnommenen Blasen eine normale Zellorganisation,
die aus Urothel-ausgekleidetem Lumen, umgeben von submukosalem Gewebe
und glatter Muskulatur bestanden. Eine angiogene Reaktion war in
allen Proben ersichtlich.
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Die Ergebnisse zeigen, dass die Blasen-Submukosa,
die mit Urothel- und Muskelzellen besät war, neues Blasengewebe bilden
kann, das histologisch und funktionell von der nativen Blase nicht
unterscheidbar ist. Dieses Ergebnis kann auf eine mögliche Aufrechterhaltung
des Baurahmens der Blase durch die extrazelluläre Matrix zurückzuführen sein,
die durch die besäten
Zellen regeneriert wurde. Die Urothel- und Muskelzellen, die auf
der allogenen Submukosa aufgesät
wurden, scheinen die Resorption des Transplantates zu verhindern.
Diese Technologie ist dazu in der Lage, neues Blasengewebe zu bilden,
das anatomisch und funktionell demjenigen normaler Blasen ähnlich ist.