DE69626516T2

DE69626516T2 - Azadirachtin Formulierungen und deren Herstellung aus Samenkernen des Neembaumes

Info

Publication number: DE69626516T2
Application number: DE69626516T
Authority: DE
Inventors: Dattatreya Manohar Akkewar; Madugula Marthandamurthi; Mohammed Abdul Muneem; Jayanti Venkata Suryanarayana Murthy; Tiruchirapally Natesan Parthasarathy; Vedala Srinivasa Singari Ramgopal; Attaluri Narasimha Rao; Akella Venkata Bhavani Sankaram; Voruganti Srihari; Mukkamala Subramanyam
Original assignee: Council of Scientific and Industrial Research CSIR
Current assignee: Council of Scientific and Industrial Research CSIR
Priority date: 1996-10-02
Filing date: 1996-10-02
Publication date: 2003-11-20
Anticipated expiration: 2016-10-03
Also published as: EP0834254A1; DE69626516D1; EP0834254B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren für die Herstellung eines Azadirachtin-Präparats in Form eines trockenen festen Pulvers mit einer Reinheit bis zu 88%, betrifft ein emulgierbares Konzentrat, das bis zu 30 Gew.-% Azadirachtin aufweist, und betrifft ein Verfahren zum Herstellen eines solchen trockenen festen Azadirachtin-Präparats und emulgierbaren Konzentrats direkt aus Neemsamen/-Kernen. Das trockene Azadirachtin-Pulver, das nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellt wird, eignet sich für Formulierungen aus Neemsamen/-Kernen (Azadirachta indica, A. Juss) für die Schadinsektenbekämpfung zur Anwendung in der Landwirtschaft, Veterinärmedizin und dem Gesundheitswesen. Das nach den erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte Konzentrat ist auch direkt als Mittel zur Schadinsektenbekämpfung verwendbar.
Azadirachtin hat eine Struktur, die in Fig. 1 der Zeichnung dargestellt ist, die der vorliegenden Patentbeschreibung beigefügt ist. Azadirachtin ist später als "Azadirachtin A" bezeichnet worden, da eine Reihe von Verbindungen mit "Azadirachtine (B-I)" und "Azadirachtin K" bezeichnet worden ist, die von verschiedenen Gruppen isoliert wurden (Rembold, H., in Economic and Medicinal Plant Research; Herausg., Govindachari, T. R., Sandhya, G. und Ganeshraj, S. P., Indian Journal of Chemistry, 31A, 295, 1990; Wagner, H. und Norman, R., Academic Press, New York, 3, 7, 1990; Govindachari, T. R., Sandhya, G., Ganeshraj, S. P., Journal ofNatural Products, 55, 596, 1992).
Es gibt zahlreiche hoch toxische, organische, synthetische Insektizide mit breitem Wirkungsspektrum, die gegenwärtig zur Bekämpfung von Schadinsekten bei Lebensmitteln und kommerziell wichtigen Erntegütern angewendet werden. Abgesehen davon, dass sie wirksam die Zielschädlinge bekämpfen, zerstören sie auch die natürlichen Feinde der Schädlinge und andere Nutzinsekten. Aufgrund einer unangemessenen Anwendung entwickeln Insekten außerdem eine Widerstandsfähigkeit gegen einige von ihnen. In Folge einer schlechten biologischen Abbaubarkeit gibt es außerdem Fälle von toxischen Einflüssen der Rückstände einiger der synthetischen Insektizide für die Konsumenten des Produkts. Es besteht daher ein Bedarf nach ökologisch kompatiblen Insektiziden, die über eine Wirksamkeit bei geringen Konzentrationen verfügen und über eine selektive Toxizität gegenüber Insekten, Schädlingen, eine geringe Toxizität gegenüber Pflanzen und Säugetieren und Mensch bei angestrebter Stabilität und wirtschaftlicher Durchführbarkeit.
Neem-Bäume sind in Indien und in einigen Regionen Asiens, Afrikas und Australiens weit verbreitet. Neem-Blätter, Neem-Samen, Neem-Öl und Neem-Trester werden traditionell in Indien seit langer Zeit zur Schadinsektenbekämpfung verwendet. Von diesen, hat der Neem-Samen, der eine sich jährlich erneuernde natürliche Quelle darstellt, die stärksten Eigenschaften zur Schadinsektenbekämpfung.
Es gibt zahlreiche Beispiele, die über die Eigenschaften als Insekten-Fraßabschreckungsmittel und Insekten-Wachstumshemmer von Azadirachtin bei einer Vielzahl von Schadinsekten berichten (beispielsweise Butterworth, J. H. und Morgan, E. D., J. Chem. Soc. Chem. Communs. 23, 1968; Leuschner, K., Naturwissenschaften, S9, 217, 1972; Ruscoe, C. N. E., Nature, Lond., 236, 466, 1972; Schmutterer, H. und Rembold, H., Z., Angew. Ent. 2, 179-188, 1980; Warthen, J. D. Jr., ARMNE-4 USDA, SEA, Agricultural Reviews AND Manuals, 1979; Kubo, I. und Klocke, J. A., Agricultural and Biological Chemistry, 46, 1951, 1982; Champagne, D. E. Koul, O., Isman, M. B., Scudder, G. E. und Towers, G. H. N., Phytochemistry, 31, 377, 1992).
Von Azadirachtin ist auch berichtet worden, dass es keine mutagene Wirkung hat (Jacobson, M., Proceedings of the First International Neem Conference, Rottach Egern, 33, 1980; In Natural pesticides from the neem tree, Azadirachta indica (("In natürlichen Pestiziden von dem Neem-Baum, Azadirachta indica")), A. Juss, Schmutterer, H., Ascher, K. R. S., Herausg., German Agency for Technical Cooperation, Eschborn, Deutschland, 1981) und es hat den Anschein, dass es über keinerlei offenkundige Toxizität bei Säugern und Mensch verfügt (Nakanishi, K., Recent Advances in Phytochemistry, 5, 283, 1975; Morgan, E. D., Proceeding of the First International Neem Conference, Rottach-Egern, 43, 1980; In Natural pesticides from neem tree, Azadirachta indica A. Juss, Schmutterer, H., Ascher, K. R. S., Rembold, H., Herausg., German Agency for Technical Cooperation, Eschborn, Deutschland, 1981).
Als Ergebnis der vorgenannten Untersuchungen ist Azadirachtin als ein umweltfreundliches Schadinsektenbekämpfungsmittel zum Pflanzenschutz betrachtet worden. Zu einer kommerziellen Anwendung ist es deshalb nicht gekommen, weil seine Isolation in reiner Form aus dem Neem- Samen/Kern-Extrakt kostspielig ist und es für eine wirtschaftliche chemische Synthese ein sehr kompliziertes Molekül ist. Von Azadirachtin ist außerdem festgestellt worden, dass es sich in Folge von. Umgebungsfaktoren, wie beispielsweise UV-Strahlung in Sonnenlicht, Wärme, Luft, Feuchtigkeit, Säuregehalt und Enzyme, die in Blattoberflächen vorhanden sind rasch abbaut (Sundaram, K. M. S. und Curry, J., Journal of Pesticide Science, 41, 129, 1994).
Die Eigenschaften des Insekten-Fraßabschreckungsmittels und Insekten-Wachstumshemmers sind an Lösemittelextrakten von Neem-Samen oder -Kernen im Bezug auf verschiedene Schadinsekten im Labor und für den Schutz einer Reihe von Ernteerträgen gegen deren Schadinsekten unter Außenbedingungen von zahlreichen Gruppen untersucht worden, da sie im Vergleich zu reinem Azadirachtin relativ kostengünstig und stabiler sind, was zu vielversprechenden Ergebnissen führt (siehe beispielsweise Schmutterer, H., Ascher, K. R. S., Rembold, H., Herausg., Natural pesticides form the neem tree, Azadirachta indica A. Juss, German Agency for Technical Cooperation, Eschborn, Deutschland, 1981, S. 197, Proceedings of the 1st International Neem Conference, Rottach-Egern, 1980; Schmutterer, H., Ascher, K. R. S., Herausg., Natural Pesticides from the neem tree, Azadirachta indica A. Juss and ohter tropical plants, S. 583, German Agency for Technical Cooperation, Eschborn, Deutschland, 1984; Proceedings of the 2nd International Neem Conference, Rauischholzhausen, 1983; Schmutterer, H., Ascher, K. R. S., Herausg., Natural pesticides from neem tree, Azadirachta indica A. Juss and other tropical plants, Germany agency for Technical Cooperation, Eschborn, Deutschland, S. 703, 1987; Proceedings of Third International Neem Conference, Nairobi, 1986).Allerdings sind Lösemittelextrakte von Neem-Samen oder -Kernen sehr komplizierte Mischungen mehrerer Verbindungen, die im Bezug auf Azadirachtin für die reproduzierbare biologische Wirksamkeit und das Verhalten gegen Schadinsekten unter Außenbedingungen eine Normung erfordern. Für die Extraktion von Azadirachtin aus Neem-Samen/-Kernen sind nach dem Stand der Technik eine Reihe von Lösemitteln und unterschiedlichen Temperaturen erforscht worden. Einige dieser Verfahren sind zur Information nachfolgend erwähnt.
Im Stand der Technik haben Butterworth und Morgan (Butterworth, J. H. und Morgan, E. D., J. Insect Physiol., 17, 969, 1971) Azadirachtin aus Neem-Samen (2 kg) hergestellt, umfassend: (1) Extraktion mit Ethanol (170 g); (2) Aufteilung des Konzentrats von Ethanol-Extrakt zwischen Methanol und Leichtbenzin; (3) Chromatographie (Floridableicherde) des aufgetrennten Produkts (70 g) aus der Methanolphase, das zu Azadirachtin-enthaltenden Fraktionen führt (2 g); (4) präparative Schichtchromatographie (PLC) von Azadirachtin-enthaltenden Fraktionen aus Schritt 3, die zu Azadirachtin führt (1,5 g). Das aus Schritt in diesem Prozess erhaltene Produkt (76 g) ließe sich auf wirtschaftliche Weise erhalten, es wäre jedoch aufgrund des Vorhandenseins von wasserlöslichen Verbindungen viskos und ölig, weshalb es sich für die Herstellung einwandfreier Formulierungen nicht eignet, indem eine Weiterverarbeitung durch weniger kostenaufwendige Methoden für die Herstellung eines an Azadirachtin angereicherten trockenen Pulvers erforderlich macht.
Nach dem Stand der Technik haben Uebel, Warthen, Jr. und Jacobson (Uebel, E. C., Warthen, Jr. J. D. und Jacobson, M., J. Liq. Chromatogr., 2, 878, 1979) Azadirachtin (2 kg-Chargen, 90% Reinheit, 8,7 g) aus Neem-Samen/-Kernen (48,2 kg) isoliert, umfassend die folgenden Schritte: (1) Mahlen der Neem- Samen/-Kerne (2 kg-Chargen) in Hexan in einem Waring-Mischer, Filtration des Homogenats, um einen Rückstand (Trester) zu liefern; (2) Soxhlet-Extraktion des pulvrigen Tresters (1,1 kg-Chargen) mit Aceton (24 Stunden); (3) Waschen des Aceton-Extraktes mit (a) Hexan, (b) Wasser und (c) Hexan; (4) Behandlung des gewaschenen Aceton-Extraktes mit 70/30, 75/25, Methanol/Wasser; (5) Behandlung von 70/30, 75/25 Methanol/wasserlöslichen Teilen mit 75/25Diethylether/Aceton, um 75/25 Diethylether/Aceton-lösliche Azadirachtin-enthaltende Fraktionen zu ergeben (102,8 g); (7) Chromatographie (phasengebunden C-18, Hiflorisil) von Diethylether/Aceton-Fraktionen, die zu Azadirachtin führen (8,7g, 90% Reinheit). Das Produkt, das nach der Behandlung von Aceton-Extrakt mit 70/30, 75/25 Methanol/H&sub2;O in Schritt S mit diesem Verfahren erhalten wird, erfordert eine Modifikation, indem Diethylether als ein leicht entflammbares Lösemittel vermieden wird, bei Schwierigkeiten der Lösemittel-Rückgewinnung und der wiederholten Anwendung in großtechnischen Verfahren. Darüber hinaus erfordern die Prozesseinzelheiten eine stärkere Vereinfachung in den Schritten (1), (2) und (3) bei großtechnischen Verfahren, wie beispielsweise Vorextraktion von Neem-Samen/-Kernen mit Hexan vor der Extraktion mit Aceton, die ebenfalls vermieden werden sollte, da Azadirachtin am Siedepunkt des Acetons (57ºC) im Vergleich zur Umgebungstemperatur unstabil ist. Aceton ist ein niedrig siedendes Lösemittel und ist außerdem in wirtschaftlicher Hinsicht kein hervorragendes Lösemittel für die Wiedergewinnung und den wiederholten Gebrauch in großtechnischen Verfahren. Diese Methode ist daher zur Erzeugung von angereicherten trockenen Azadirachtin-Pulvern nicht besonders geeignet, da es für großtechnische Herstellungen zu viele Verfahrensschritte gibt, gefährlich ist, unwirtschaftlich und unbequem.
Nach dem Stand der Technik haben Feurhake (Feuerhake, K. J., Proceedings of Second International Neem Conference, Rauischholozhausen, 103, 1983; in Natural Pesticides from the neem tree and other Tropical plants, Schmutterer, H. und Ascher, K. R. S., Herausg., German Agency for Technical Corporation, Eschborn, Deutschland, 1984) die Eignung der technischen Lösemittel untersucht: (a) mit Methyl-tert-butylether (MTB); (b) Methylisobutylketon (MIBK); (c) Methylethylketon (MEK); (d) Wasser; (e) Methanol; (f) azeotrope Mischung von Methanol und MTB (AZT); (g) Aceton und (h) Butanol, wobei von ihnen AZT für die Herstellung von Azadirachtin-angereicherten Extrakten empfohlen wird und sie festgestellt haben, dass Wasser kein einfaches Lösemittel zum Extrahieren von Azadirachtin ist, das auf seine geringe Löslichkeit in Wasser zurückzuführen ist. Die Verwendung von Neem-Öl und p- Aminobenzoesäure zum Schutz von Azadirachtin ist ebenfalls eine bereits bekannte Ausführungsform. Einige Beispiele anderer kommerzieller Formulierungen auf der Basis von Neem-Samen/-Kernen/Öl sind Azatin, Neemguard, bei dem es sich um eine Neem-Öl-Formulierung handelt, Neemgold mit einem Gehalt von 300 ppm Azadirachtin sowie Neemazal F.
Die Prozedur besteht aus den folgenden Schritten: (1) es wurden zuerst gemahlene Neem-Samen/- Kerne in einen Soxhlet-Apparat mit Petrolether zur Entfernung fetthaltiger Substanzen extrahiert; (2) die Extraktion wurde mit Lösemitteln ausgeführt, wie beispielsweise MIBK und MTB oder Aceton oder MeOH oder AZT oder MEK oder Butanol, und zwar für 10 Stunden; (3) der Rückstand aus dem AZT-Extrakt nach der Entfernung des Lösemittels wurde mit Methanol behandelt; (4) der Methanol-lösliche Teil von Schritt 3 wurde einer Flüssig-Flüssig-Extraktion mit Methanol (50%) und Leichtbenzin unterworfen und lieferte eine Ausbeute von 1 bis 1,5% an AZT-VR-NR, von der man meinte, dass sie an Azadirachtin angereichert ist.
Es wird angestrebt, eine Vorextraktion von Neem-Samen/-Kernen mit Petrolether zu vermeiden und eine Extraktion in einem Soxhlet-Apparat mit polaren Lösemitteln bei hoher Temperatur zu vermeiden, da Azadirachtin bei diesen Temperaturen nicht besonders stabil ist. In diesem Verfahren wurde der physikalische Zustand und die Stabilität von AZT-VR-NR nicht definiert. Dieses wäre der Ausgangspunkt für die Herstellung eines trockenen, an Azadirachtin angereicherten Feststoffes, der für Formulierungen geeignet ist.
Die US-P-4 556 562 (Larson, R. O., 1985) betrifft die Extraktion von Neem-Samen/-Kernen als Pulver mit Ethanol bei 60º bis 90ºC, um einen Ethanol-Extrakt zu ergeben, der 5.000 bis 10.000 ppm Azadirachtin enthält und mit nichtionischem Emulgiermittel behandelt und auf 2.000 bis 4.000ppm Azadirachtin im pH-Bereich von 3,5 bis 6 und p-Aminobenzoesäure und Neem-Öl als Stabilisiermitteln verdünnt wurde. Die Extraktion von Neem-Samen mit Ethanol ist bereits von Butterworth und Morgan für die Isolation von Azadirachtin ausgeführt worden (Butterworth, J. H. und Morgan, E. D., J. Insect Physiol., 17, 969, 1971). Sankaram und Mitarbeiter haben eine an Azadirachtin angereicherte Fraktion aus dem Ethanol-Extrakt von entfettetem Neem-Samen (Soxhlet-Apparat) erhalten, diesen angereichert in Aceton, mit Emulgiermittel Teepol behandelt und auf 0,1% mit Wasser verdünnt, und die resultierende Formulierung schützt ihre Sorghum- und Perlhirse-Ernten gegen Schadinsekten (Sharma, H. C., Leuschner, K., Sankaram, A. V. B., Gungsekhar, D., Marthandamurthi, M., Bhaskariah, K., Subrahmanyam, M. und Sulthana, N., Proc. 2te Internationale Neem-Konferenz, Rauischholzhausen, 291, 1983; in Natural Pesticides from the neem tree, Herausg., Schmutterer, H., Ascher, K. R. S., German Agency for Technical Cooperation, Eschborn, Deutschland, 1984).
Yamasaki, Klocke, Stone und Darlington (Yamasaki, R. B., Klocke, J. A., Stone, G. A. und Darlington, M. V., J. Chromatogr. 18, 467, 1986) haben Azadirachtin aus Neem-Samen (1 kg) isoliert, um Azadirachtin zu erhalten (56 mg, 99% Reinheit), umfassend die folgenden Schritte: (1) die Neem-Samen wurden in Hexan (2 Liter) suspendiert, gelegentlich bei Umgebungstemperatur für mehrere Stunden gerührt und den Hexan-Extrakt dekantiert und den Prozess drei weitere Male wiederholt; (2) der entfettete Trester von Schritt 1 wurde sechs Mal mit Methanol (2 Liter) nacheinander in der gleichen Weise wie mit n-Hexan extrahiert; (3) das Filtrat der Methanol-Extrakte wurde vereinigt und unter Vakuum eingeengt, um einen orangefarbenen Ter (78 g) zu ergeben; (4) der orangefarbene Ter von Schritt (4) wurde erneut in Methanol (2 Liter) aufgelöst und mit destilliertem Wasser (2 Liter) unter Rühren verdünnt; (5) die wässrige Methanolmischung von Schritt (4) wurde drei Mal mit gleichen Portionen n-Hexan extrahiert, gefolgt von drei gleichen Mengen Dichlormethan; (6) der vereinigte Dichlormethan-Extrakt wurde einer Flash- Chromatographie unterworfen (Silicagel, Eluierungsmittel, Diethylether/Methanol), um amorphes Azadirachtin als einen orangefarbenen Feststoff zu ergeben (7,3%, 7,4 g). Allerdings ist seine Stabilität und Eignung für Pestizid-Anwendungen nicht erforscht worden; Azadirachtin (7,3%) ist mit Hilfe der Flash- Chromatographie weiter an Azadirachtin angereichert worden (26% Ausbeute; 1,26 g) (ODS-Säule, mobile Phase, Methanol/H&sub2;O, 3/2). Der physikalische Zustand und die Stabilität von Azadirachtin (26%) sind ebenfalls nicht erforscht worden; (8) Azadirachtin (26%) aus Schritt (7) wurde einer präparativen HPLC unterworfen, um Azadirachtin (70%) zu ergeben (Silicagel, Isopropanol/n-Hexan L/3, Ausbeute: 0,280 g); (9) Azadirachtin (70%) wurde einer Phenyl-präparativen HPLC unterzogen, um Azadirachtin (99%, mobile Phase, Acetonitril/H&sub2;O, 3/7, Ausbeute: 56 mg) zu ergeben. Obgleich diese Prozedur zur Herstellung von Azadirachtin (5 bis 30%) angewendet werden kann, das für Pestizid-Anwendungen geeignet ist, umfasst sie (1) das zeitweilige Rühren von gemahlenen Neem-Samen in Hexan für mehrere Stunden und dreimalige Wiederholung mit Hexan, sechsmalige Wiederholung mit Methanol, jedes Mal dekantieren, und dieses nacheinander, wobei die Prozedur nicht einfach ist und für großtechnische Verfahren nicht wirtschaftlich und eine drastische Überarbeitung erfordert; (2) Entfetten des Neem-Samens in Schritt (2) mit Hexan muss nach Möglichkeit eliminiert werden, da es die Extraktionsdauer und die Kosten der Erzeugung von Azadirachtin herabsetzen kann.
In diesem Verfahren ist das Azadirachtin (7,3%) als orangefarbener Feststoff (Ausbeute 0,74%), das mit Hilfe der Flash-Chromatographie (Silicagel) von Dichlormethan-Extrakt in Schritt 4 erhalten wurde, ein Vertreter für neuartige Formulierungen; allerdings ist die Flash-Chromatographie eine aufwendige Prozedur und die Ausbeute ist gering. Es ist anzustreben, die Reinigung des Dichlormethan-Extrakts, der nach Schritt S unter Vermeidung der Chromatographie erhalten wird, zu optimieren, was zu einem trockenen festen Pulver mit überlegener Ausbeute führt, das an Azadirachtin angereichert ist. Es ist ebenfalls anzustreben, ein niedrig siedendes, umweltunverträgliches Lösemittel wie Dichlormethan zu vermeiden. Die Lösemittel-Rückgewinnung ist für großtechnische Verfahren gering. Im Wesentlichen ist diese Prozedur für eine wirtschaftliche Herstellung von festem Azadirachtin-Pulver, das für Pestizid- Formulierungen geeignet ist, nicht geeignet.
Schroeder und Nakanishi (Schroeder, D. R. und Nakanishi, K., J. Nat. Prod., 50, 242, 1987) haben die Isolation von Azadirachtin aus Neem-Samen/-Kernen beschrieben, umfassend die folgenden Schritte: (1) Neem-Samen/-Kerne (2,0 kg) wurden mit Hexan, (2 Liter) in einem kommerziellen Waring-Mischer (10 Minuten) zu einem feinen Pulver gemahlen und für 1 Stunde absetzen gelassen, wiederum bewegt und unter Vakuum filtriert, um einen Neem-Samen/-Kern-Extraktrückstand zu ergeben; (2) die in Schritt (1) beschriebene Prozedur wurde vier Mal nacheinander wiederholt und führte zu entfetteten Neem-Samen/- Kernen-Filterkuchen, der mit 95% Ethanol (2 Liter) fünf Mal mit Hilfe der in Schritt (1) beschriebenen Prozedur durch Perkolation im Inneren des Mischers für 8 bis 12 Stunden extrahiert wurde; (3) die vereinigten Ethanol-Extrakte ergaben nach Einengung unter Vakuum einen dunklen viskosen Rückstand (185 g); (4) der Rückstand des Ethanol-Extraktes aus Schritt (3) wurde zwischen Hexan und Methanol/H&sub2;O, 95/5 aufgetrennt; (5) die 95/5 Methanol/Wasser-Phase (138 g) wurde mit Wasser und Ethylacetat nacheinander aufgetrennt; (6) die Ethylacetat-Phase (59 g) wurde einer Silicagel-Filtration mit Ethylacetat unterzogen und lieferte ein Produkt (52 g), das an Azadirachtin angereichert war; (7) das Produkt aus Schritt (6) (52 g) wurde einer Vakuum-Flüssigchromatographie (EtOAc/Hexan, 3/l) mit einer Ausbeute von Azadirachtin-Fraktionen (13 g) unterworfen; (8) Kristallisation von Azadirachtin-Fraktionen aus Tetrachlorkohlenstoffergaben rohes Azadirachtin (8,5 g); (9) die Flash-Chromatographie des Produktes aus Schritt (8) (CHCl&sub3;/CH&sub3;CN, 3/1) ergab Azadirachtin (5g). Die Extraktion durch Mahlen von Neem-Samen/- Kernen mit Hexan und Ethanol in einem Waring-Mischer entsprechend der Beschreibung in dieser Prozedur ist für die großtechnische Herstellung von Azadirachtin gefährlich, unwirtschaftlich und unbequem und erfordert Modifikationen. In dieser Prozedur ist der Rückstand des Ethylacetat-Extraktes in Schritt (6) (52 g) der Ausgangspunkt für die Herstellung von trockenem an Azadirachtin angereichertem Feststoff für neuartige Formulierungen ohne Verlust in der Ausbeute und bevorzugt durch wirtschaftliche Methoden der Lösemittel-Fraktionierung. Das Entfetten mit Hexan vor der Extraktion mit 95% Ethanol kann vermieden werden. Die Schritte der Silicagel-Filtration unter Vakuum-Flüssigchromatographie, um an Azadirachtin angereicherte Fraktionen zu erhalten, sind schwer in der großtechnischen Herstellung von reinem Azadirachtin zu optimieren, das für neuartige Pestizid-Formulierungen erforderlich ist, und bedürfen der Modifikation. Die Prozedur ist für großtechnische Verfahren nicht geeignet.
Die EP-A-0 311 284, A2 (1988) berichtet über ein Verfahren für die Herstellung von Azadirachtin (25% Ausbeute; 0,25%) als ein hellgelber Rückstand für die Herstellung von hydriertem Azadirachtin als ein Insektizid. Diese Prozedur hat zu zeitaufwendige und unwirtschaftliche Verfahrensschritte und die Ausbeute des gewünschten Produkts ist gering. Sie muss vereinfacht und optimiert werden, um sie zu einem Herstellungsverfahren für an Azadirachtin angereicherten trockenen Feststoff, der für neuartige Formulierungen geeignet zu machen.
Govindachari, Sandhya und Ganeshraj (Govindachari, T. R., Sandhya, G., und Ganeshraj, S. P., Chromatographia, 31, 303, 1991) haben Azadirachtin A hergestellt, umfassend die folgenden Schritte: (1) Entfetten von pulverförmigen Neem-Samen/-Kernen (1 kg) mit Hexan (3 Liter); (2) Extraktion von entfetteten pulverförmigen Neem-Kernen durch Refluxieren mit 95% Ethanol (a), (1 1.) und (b) (0,5 1.); (3) Auftrennung des Ethanolkonzentrats (95 g), erhalten nach Entfernung des Lösemittels aus dem vereinigten Ethanol-Extrakt, aufgelöst in 90% Methanol mit Petrolether (100 ml), drei Mal; (4) Behandlung des Rückstands nach der Entfernung von Lösemittel aus dem Methanol-Extrakt von Schritt (3) mit Ethylacetat; (5) Waschen des Ethylacetat-Extrakts mit Wasser zur Entfernung von Proteinen und Kohlenhydraten; (6) Entfernen von Lösemittel aus dem Ethylacetat-Extrakt, um Azadirachtin (25%, 24,5 g) zu ergeben; (7) präparative HPLC von Azadirachtin (25%, 4 g) auf einer RP 18-Säule, um Azadirachtin A+D (340 mg) zu ergeben; (8) präparative HPLC von Azadirachtin A+D, um Azadirachtin A (160 mg) zu ergeben.
In dieser Prozedur wurde der physikalische Zustand des 25% Azadirachtin-enthaltenden Produktes nicht definiert. Darüber hinaus wurde der Entfettungsschritt eliminiert. Die Methode der Extraktion erfordert eine Modifikation zur Herstellung von trockenem Azadirachtin-Pulver, das für neuartige Formulierungen geeignet ist, da von Azadirachtin bekannt ist, dass es bei hohen Temperaturen unstabil ist, die Extraktion bei der Temperatur des Refluxierens von Ethanol muss vermieden werden.
Das Refluxieren von pulverförmigen Neem-Kernen mit 95% Ethanol ist bei großtechnischen Extraktionen ökonomisch nicht einfach.
Kleeberg berichtet über die Herstellung eines an Azadirachtin angereicherten stabilen Pulvers aus Neem-Samen (Kleeberg, n H., Ger. Offen. DE4, 109, 473, 1992, Chemical Abstracts, 118, 18002, s, 1993) umfassend: (1) Extraktion von Neem-Samen mit Wasser; (2) Extraktion des wässrigen Extraktes mit Ethylacetat; (3) Behandlung des Ethylacetat-Konzentrats mit Petrolether, was zu einem angereicherten Azadirachtin-Pulver führt. Dieser Prozess ist zum Herstellen von an Azadirachtin angereichertem Pulver wirtschaftlich nicht geeignet, was auf die Tatsache zurückzuführen ist, dass Wasser kein geeignetes Lösemittel für die Extraktion von Azadirachtin aus Neem-Samen in wirtschaftlicher Hinsicht ist, da die Löslichkeit von Azadirachtin in Wasser im Vergleich zu Lösemitteln, wie beispielsweise Methanol und Ethanol, sehr schlecht ist mit denen Azadirachtin aus Neem-Samen/-Kernen effektiv extrahiert wird. Die Ausbeute des Azadirachtin-Pulvers wird bei dieser Prozedur gering sein.
In der Mehrzahl der vorgenannten Verfahren kommt eine Anfangsextraktion von Samen oder Kernen jeweils mit Petrolether/Hexan/Heptan zum Einsatz. Danach folgt eine Extraktion mit polaren Lösemitteln, wie beispielsweise Aceton oder Methanol oder Ethanol bei Umgebungstemperatur oder bei der Temperatur des Refluxierens des Lösemittels oder in einem Soxhlet-Extraktionsapparat. Darüber hinaus zielen diese Methoden auf die Extraktion von kostspieligem reinen Azadirachtin, das für die Bestimmung seiner Struktur benötigt wird, der Chemie, der biologischen Wirksamkeit und analytischer Untersuchungen bei denen komplizierte und aufwendige präparative Schichtchromatographien (PLC) zur Anwendung kommen, Säulenchromatographie und Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC), unabhängig von der Anwendbarkeit der Zwischenstufen der Extrakte im Bezug auf ihren Azadirachtingehalt, physikalischem Zustand, Eignung zur Lagerung, Stabilität und zur Herstellung ihrer Formulierungen für die praktische Schadinsektenbekämpfung. Tatsächlich sind bei den vorgenannten Verfahren Neem-Samen- und -Kern- Extrakte mit einem verhältnismäßig hohen Gehalt an Azadirachtin erhalten worden, wobei jedoch ihr physikalischer Zustand, ihre Eignung zur Lagerung, Stabilität, Formulierung und wirtschaftliche Herstellung nicht erforscht worden ist, und diese für die wirtschaftliche Herstellung im technischen Maßstab nicht gut geeignet sind. Hinsichtlich der Lagerung, Stabilität und Formulierung ist es wünschenswert über ein rieselfähiges Pulver mit einem Gehalt von 5 bis 30% Azadirachtin zu verfügen sowie über die Herstellung von Formulierungen, wie beispielsweise emulgierbare Konzentrate (EC), benetzbare dispergierbare Pulver (WDP), Stäube, Granalien, Aerosole, Formulierungen mit kontrollierter Freisetzung, usw., wobei die Extrakte vorzugsweise frei sein sollten sogar von Spuren von wasserlöslichen Verbindungen, wie beispielsweise anorganischen Salzen, Kohlehydraten, Proteinen und färbenden Substanzen, da diese zu Problemen führen würden, wie beispielsweise bei der Schaffung eines geeigneten Lösemittels zur Auflösung des wirksamen Bestandteils für die Herstellung eines emulgierbaren Konzentrats und im Bezug auf die Stabilität bei praktischen Anwendungen.
In diesem Zusammenhang sind die Konzentrate von rohen Extrakten mit polaren Lösemitteln aus Neem-Samen oder -Kernen, die nach der Entfernung der Lösemittel mit Hilfe des vorgenannten Prozesses erhalten werden, in der Regel ölig und gummiartig, was auf das Vorhandensein von Fettbestandteilen und wasserlöslichen Verbindungen zurückzuführen ist, wie beispielsweise Tannine, organische Carbonsäuren, Kohlehydrate, Proteine, organische und anorganische Salze, Pigmente usw. wobei diese nicht das Vermögen besitzen, die Eigenschaften zu bewahren. Diese Konzentrationen stellen auch Probleme hinsichtlich der Löslichkeit bei der Herstellung von Formulierungen emulgierbarer Konzentrate (EC) dar sowie beim Zusammenbacken in der Herstellung von Formulierungen aus benetzbaren dispergierbaren Pulvern (WDP), Stäuben und Granulat-Formulierungen.
Trotz der vorgenannten Vorteile besteht ein Bedarf nach einer Prozedur für die leichte Herstellung eines Neem-Samen/-Kern-Extraktes in trockener Pulverform in einem großtechnischen Maßstab mit 5 bis 30% Azadirachtin, Stabilität, guter Löslichkeit in organischen Lösemitteln, Eignung für EC- Formulierungen und Kompatibilität mit Trägermaterialien für die Erzeugung von WDP-Formulierungen, die für die Schadinsektenbekämpfung verwendbar sind.
Acetonlösungen von Azadirachtin liefern, wenn sie für sieben Tage bzw. sechzehn Tage an Sonnenlicht exponiert werden > 50% bzw. eine vollständige Reduktion der Wirksamkeit als Insekten- Fraßabschreckungsmittel gegen den Herbst-Heerwurm (Spodoptera frugiperda) im ersten Zwischenhäutungszustand, woran die Zerstörung des Azadirachtins beteiligt ist (Stokes, J. B., Redfern, R. E., J. Env. Sci. Health, Part A, 1982, A, (17), 57-65; Chemical Abstracts, 96: 137955). Der Photoabbau von Azadirachtin in Sonnenlicht wurde zu < 25% für zwei Wochen von Neem-, Angelika-, Rhizinus- und Kalmusölen aufgehalten.
Die Extraktion von Neem-Samen mit Ethanol, die Isolation von Azadirachtin aus dem Ethanol- Extrakt und die Eigenschaften als Insekten-Fraßabschreckungsmittel von Azadirachtin für die Wüstenheuschrecke sind bereits sehr viel früher von Butterworth und Morgan in 1971 (Butterworth, J. H. und Morgan, E. D., J. Insect Physiol., 17, 969, 1971) veröffentlicht worden.
Neem-Extrakte, die an aktiven Verbindungen angereichert sind, wie beispielsweise Azadirachtin, Salannin, Desacetylnimbin und Nimbin sind ebenfalls unter Verwendung von oberflächenaktiven Mitteln und speziellen Lösemitteln von Formulierungen angesetzt worden und es ist in Feld- und Laborversuchen festgestellt worden, dass diese wirksame Mittel als Insektizide sind (Feuerhake, K., und Schmutterer, H., Z. Pflanzen Krank Pflanzen Schutz, 1985, 92(6) 643-9, Chemical Abstracts, 104, 163705 h, 1986).
Es wurde eine Mischung von Citronellöl, Neem-Samen-Extrakt mit einem Gehalt von 5% Azadirachtin, Triclosan, DEET, di-pr-Isocinchomerat, Spuren von Lemongrasöl und Ethanol für 14 Tage bei 54ºC erhitzt, woraus ein Insektenabwehrmittel resultierte. Während des Erhitzens verschwand das Azadirachtin und es wurden neue Verbindungen gebildet (Henry, G. V., PCT Int. Appl. 91/5, 970, 6. Mai, 1991, S. 13, Chemical Abstracts, 118; S. 75393 h).
Der Azadirachtin-Gehalt einer Destillatlösung von aromatischem Petroleum mit einem Gehalt von 3,2% Azadirachtin und 10% 1,2-Epoxyoctan wurde auf 2,8% bei Lagerung über 28 Tage reduziert (Butler, B. J., Ellenberger, W. P., Omilinsky, B. A. PLT, Int. Appl. Nr. 9402, 019 (Cl. AO IN43/08) 3. Februar, 1994, US appl. 920800, 28. Juli, 1992, S. 32; Chemical Abstracts, 120, S. 263865q).
Von Azadirachtin ist außerdem festgestellt worden, dass es sich durch Umgebungsfaktoren, wie beispielsweise UV-Strahlung im Sonnenlicht, Wärme, Luft, Feuchtigkeit, Säuregehalt und Enzyme, die auf Blattoberflächen vorhanden sind, schnell zersetzt (Sundaram, K. M. S. und Curry, J., Pesticide Science, 1944, 41, 129). Von diesen Ergebnissen ist ersichtlich, dass ein Bedarf für stabilisierte Formulierungen von Neem-Samen/-Kern-Öl-Extrakten mit Azadirachtin-Gehalt für den Schutz von Erntegut besteht, für den Schutz von gelagertem Getreide und für das Gesundheitswesen.
Wir haben im Verlaufe unserer ausgedehnten Untersuchungen auf diesem Gebiet festgestellt, dass die größere Menge von Azadirachtin direkt aus pulverförmigen Neem-Samen und -Kernen mit polaren Lösemitteln extrahiert werden kann, wie beispielsweise Methanol oder wässriges Methanol oder Ethanol (rektifizierter Spiritus) oder wässriges Ethanol bei Umgebungstemperatur, wobei die Fettöle in dem Samen/Kern-Rückstand überwiegend zurückgehalten werden, so dass der Extraktion von pulverförmigen Neem-Samen/-Kernen mit Hexan/Petrolether (Sp 60º bis 80ºC) zur Entfernung von Fettölen vermieden wird. Der thermische Abbau von Azadirachtin bei der Extraktion wird auf ein Minimum herabgesetzt, wenn die Extraktion bei Umgebungstemperatur ausgeführt wird.
Wir haben festgestellt, dass es möglich ist, trockene Neem-Samen/-Kerne mühelos zu einem geeigneten Pulver im Partikelgrößenbereich BSS-7 (0,2 mm) bis BSS-72 (2,4 mm) für die Lösemittelextraktion von pulverförmigen Neem-Samen/-Kernen im großtechnischen Maßstab zu zerkleinern.
Für die Extraktion von Azadirachtin aus pulverförmigen Neem-Samen/-Kernen in einer Säule durch kontinuierliche Perkolation wird in der vorliegenden Erfindung damit direkt Methanol oder wässriges Methanol oder Ethanol oder wässriges Ethanol eingesetzt. In der vorliegenden Erfindung wird eine kontinuierliche Lösemittelperkolation bei Umgebungstemperatur eingesetzt, um die Zersetzung von Azadirachtin bei höherer Temperatur zu vermeiden und weil es bei modularen Verfahren bequemer ist.
In einer der Ausführungsformen betrifft die vorliegende Erfindung die Herstellung eines Extrakts von Neem-Samen/-Kernen mit einem Gehalt bis zu 88% Azadirachtin als trockenes Pulver direkt aus Neem-Samen/-Kernen, umfassend eine kontinuierliche Chargenextraktion mit der Verwendung von Methanol oder wässrigem Methanol oder Ethanol oder wässrigem Ethanol; Aufkonzentrieren dieser Extrakte, Lösemittelfraktion der Konzentrate, fraktionierte Ausfällung bei Umgebungstemperatur, und Säulenchromatographie sowie HPLC.
In einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die Herstellung einer emulgierbaren Konzentrat-Formulierung von trockenem Pulver, das an Azadirachtin bis zu 30% angereichert ist, für die Anwendung bei der Schadinsektenbekämpfung.
Dementsprechend gewährt die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die Herstellung von Azadirachtin in Form eines trockenen festen Pulvers mit einer Reinheit von 10% bis 19% aus Neem- Samen/-Kernen, welches Verfahren umfasst:
(a) Vermahlen der Neem-Samen/-Kerne zu einem Pulver; (b) das Pulver einer kontinuierlichen Extraktion unterziehen, indem eine Charge unter Verwendung von Methanol, wässrigem Methanol, Ethanol (rektifizierter Spiritus) oder wässrigen Ethanol bei Umgebungstemperatur perkoliert wird; (c) Einengen des Extraktes und Rühren des Konzentrats mit Petrolether (Sp. 60º bis 80ºC) oder Hexan und Phasentrennung mit Hilfe konventioneller Methoden; (d) Rühren der dichteren Phase, die die größere Menge an Azadirachtin enthält, mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösemittel und Wasser nach Erfordernis in Abhängigkeit von dem für die Extraktion verwendeten Lösemittel und Phasentrennung mit Hilfe konventioneller Methoden; (e) Einengen der organischen Phase und allmähliches Zusetzen des Konzentrats zu Petrolether (Sp. 60º bis 80ºC) oder Hexan unter Rühren bei Umgebungstemperatur; (f) Filtern und Trocknen unter Vakuum bei einer Temperatur im Bereich von 25º bis 65ºC, um einen Neem- Samen/-Kern-Extrakt als ein Pulver zu erhalten, das Azadirachtin mit einer Reinheit von 10 bis 19% aufweist.
Die vorliegende Erfindung gewährt ferner ein Verfahren, bei welchem dem vorgenannten Verfahren der Verfahrensschritt (g) des erneuten Auflösens des in Schritt (f) erhaltenen Produkts in einem organischen Lösemittel und Zusetzen der Lösung zu Petrolether (Sp 60º bis 80ºC) oder Hexan, und zwar unter Rühren, was ein weißes Pulver, ergibt, das nach Filtration und Trocknen unter Vakuum bei 65ºC Azadirachtin mit einer Reinheit von 15 bis 26% als ein weißes Pulver liefert.
Die vorliegende Erfindung gewährt ferner ein Verfahren, bei welchem dem vorgenannten Verfahren der Verfahrensschritt (h) des Auflösens des Azadirachtins von Schritt (f) in einem organischen Lösemittel folgt, und dieses einer Säulenchromatographie (Silicagel) durch schrittweise Eluierung unter Verwendung unterschiedlicher Zusammensetzungen von Hexan oder Petrolether (Sp 60º bis 80ºC) und Ethylacetat unterziehen, um festes Azadirachtin-Pulver mit bis zu 49%iger Reinheit zu erhalten. Diesem kann der Schritt (i) des abschließenden Auflösens des in Schritt (h) erhaltenen Azadirachtins in Methanol, Ethanol oder Acetonitril folgen, und dieses einer HPLC (C18-Säule) unterziehen, um Azadirachtin mit einer Reinheit bis zu 88% in Form eines festen Pulvers zu erzeugen.
Die vorliegende Erfindung gewährt ferner ein Verfahren für die Herstellung eines emulgierbaren Konzentrats, das bis zu 30% an Azadirachtin angereichert ist, welches Verfahren umfasst: Rühren des Azadirachtin-Pulvers zusammen mit einem organischen Lösemittel oder Mischungen von organischen Lösemitteln, Emulgiermittel oder einer Emulgiermittel-Kombination mit oder ohne Synergist und mit oder ohne UV-Stabilisiermittel. Die zur Auflösung des Pulvers verwendeten Lösemittel können ausgewählt sein aus: Aromax (Petroleumdestillat mit einem Gehalt an aromatischen Verbindungen), 2-Butanon, Cyclohexanon, Dimethylformamid, Dimethylphthalat, Dioctylphthalat, Isobutanol, Isobutylmethylketon, Isopropanol, Solvent C-IX (Petroleumdestillat mit einem Gehalt an höheren aliphatischen Alkanen/Isoalkanen im Bereich von C&sub5;, C&sub7;, C&sub8;, C&sub9; bis C&sub7;&sub4;) sowie Xylol einzeln oder in Form geeigneter Mischungen. Das Emulgiermittel, das verwendet wird, kann ausgewählt werden aus kommerziell verfügbaren ionischen oder nichtionischen Emulgiermitteln, wie beispielsweise: Cresolox 3409, Emulsol MAL, Emulsol 172 RH, Igesol (CABS), Ethylenoxid-Kondensat, 10 Mol Triton X100 und Tween 80. Der Synergist, der verwendet wird, ist Piperonylbutoxid. 2-Hydroxy-4-octyloxybenzophenon wird als UV- Stabilisiermittel wahlweise verwendet, bis eine braune homogene, stabile Flüssigkeit erhalten wird. Das resultierende Konzentrat kann als eine Sprühflüssigkeit für die Schadinsektenbekämpfung nach Verdünnung mit Wasser verwendet werden.
Die Verfahren der vorliegenden Erfindung umfassen die folgenden Schritte:
a. Es werden gut getrocknete Neem-Samen/-Kerne zu einem Pulver geeigneter Größe unter Verwendung einer Mühle zerkleinert.
b. Das aus Schritt (a) erhaltene Samen/Kern-Pulver wird in eine geeignete Säule gepackt und einer kontinuierlichen Perkolation mit Methanol oder Ethanol (rektifizierter Spiritus) oder Methanol oder Ethanol mit einem Gehalt von 20% Wasser bei Umgebungstemperatur unterworfen, wobei Methanol das am meisten bevorzugte Lösemittel ist.
c. Der Extrakt in Schritt (d) wird bei Atmosphärendruck oder unter Vakuum eingeengt, wobei Vakuum die bevorzugte Bedingung ist.
d. Das Konzentrat aus Schritt (c) wird mit einem organischen Lösemittel gerührt, wie beispielsweise Petrolether oder Hexan, und die zwei Phasen zu einer dichteren und einer leichteren Phase separiert.
e. Die in Schritt (d) erhaltene dichtere Phase, die Azadirachtin enthält, wird mit Wasser und mit Wasser mischbaren organischen Lösemitteln gerührt, wie beispielsweise Benzol, 2-Butanon, Chloroform, Dichlormethan, Dichlorethan, Diisopropylether, Ethylacetat, Methyl-tert-butylether und Toluol, und die Phasen separiert. Das bevorzugte, mit Wasser nicht mischbare organische Lösemittel ist Ethylacetat.
Sofern bei der Extraktion von pulverförmigen Neem-Samen/-Kernen Methanol oder Ethanol mit einem Gehalt von 20% Wasser verwendet werden, ist die Verwendung von Wasser zusammen mit den im Wasser nicht mischbaren Lösemittel in diesem Schritt nicht erforderlich.
f. Die organische Phase in Schritt (e) wird bei Atmosphärendruck oder unter Vakuum eingeengt, wobei Vakuum die bevorzugte Bedingung ist.
g. Das in Schritt (f) erhaltene Konzentrat wird allmählich Petrolether (Sp 60º bis 80ºC) oder Hexan unter Rühren oder bei Rückflusstemperatur zugesetzt und filtriert, um einen bräunlichen-gelben Feststoff zu ergeben, der unter Vakuum bei 65ºC getrocknet wird und 10 bis 19% Azadirachtin enthält und zum Schutz verschiedener Ernteerträge zubereitet werden kann, wie beispielsweise Baumwolle, Reis, Erdnüsse, Auberginen, Kohl, Rhizinussamen, Zitrusarten, Kaffee, Kartoffel, Hülsenfrüchte, Sorghum, Zuckerrohr, Tabak, usw., und die gelagerten Getreidesorten gegen ihre Schadinsekten geschützt werden.
h. Das Produkt von Schritt (g) wird in Dichlormethan oder Ethylacetat aufgelöst und die Lösung allmählich zu Petrolether (Sp 60º bis 80ºC) oder Hexan unter Rühren gegeben und der resultierende Feststoff filtriert und bei 65ºC im Vakuum getrocknet. Das resultierende weiße Pulver enthält 15 bis 26% Azadirachtin. Das resultierende Produkt ist für Formulierungen zur Schadinsektenbekämpfung verwendbar. Die am meisten bevorzugten Lösemittel, die in diesem Schritt verwendet werden, sind Ethylacetat und Petrolether (Sp 60º bis 80ºC).
i. Das Produkt von Schritt (g) wird in Dichlormethan/Ethylacetat aufgelöst und einer offenen Säulenchromatographie (Silicagel) unter Verwendung von Mischungen von Hexan oder Petrolether (Sp 60º bis 80ºC) und Ethylacetat als Eluierungsmittel schrittweise unterworfen, was nach Entfernung des Lösemittels unter Vakuum zu einem weißen Feststoff mit bis zu 49% Azadirachtin führt.
j. Das Produkt von Schritt (i) wird in Methanol aufgelöst, durch eine kurze C18- Führungssäule filtriert und das Filtrat verdünnt und einer semipräparativen HPLC (C18-Säule) unterworfen, was einen weißen Feststoff mit einem Gehalt bis zu 88% Azadirachtin liefert.
Die Erfindung betrifft ebenfalls ein Verfahren für die Herstellung eines emulgierbaren Konzentrats, das bis zu 30 Gew.-% Azadirachtin aufweist, und zwar aus Neem-Samen/-Kernen, welches Verfahren das Rühren des Azadirachtin-Pulvers mit einer Reinheit bis zu 88% mit Lösemitteln oder Mischungen davon umfasst, mit Emulgiermitteln oder Emulgiermittel-Kombinationen mit oder ohne Synergist sowie mit oder ohne UV-Stabilisiermittel, wodurch ein klares emulgierbares Konzentrat erhalten wird. Die in dem vorgenannten Verfahren verwendeten organischen Lösemittel sind: Aromax, 2-Butanon, Cyclohexanon, Dimethylformamid, Dimethylphthalat, Dioctylphthalat, Isobutanol, Isobutylmethylketon, Isopropanol, Solvent C-IX und Xylol, einzeln oder als geeignete Kombinationen. Die verwendeten Emulgiermittel sind solche, die kommerziell als ionische und nichtionische Emulgiermittel verfügbar sind, wie beispielsweise Cresolox 3409, Emulsol MAL, Emulsol 172 RH, Igesol, Calciumalkylbenzolsulfonat (CABS), Ethylenoxid-Kondensate (10 Mol), Triton · 100 und Tween 80. Das Piperinylbutoxid wird als Synergist und 2-Hydroxy-4-octyloxybenzophenon als UV-Stabilisiermittel verwendet.
Die vorliegende Erfindung gewährt daher ein wirtschaftliches und einfaches Verfahren für die Herstellung von Neem-Samen/-Kerne-Extrakt mit einem Gehalt bis zu 88% Azadirachtin aus Neem- Samen/-Kernen direkt durch kontinuierliche Lösemittelperkolation bei Umgebungstemperatur, mit Hilfe der Lösemittelextraktion, des Aufkonzentrierens, der Lösemittelauftrennung, der fraktionierten Ausfällung, und zwar als ein trockenes Pulver, das zur Formulierung für emulgierbare Konzentrate geeignet ist, geeignet für benetzbare dispergierbare Pulver, Stäube usw., und zwar für die praktische Schadinsektenbekämpfung. Die vorliegende Erfindung gewährt ebenfalls ein Verfahren zur Anreicherung von Azadirachtin-Pulver (10 bis 26%) durch schrittweise Säulenchromatographie (Silicagel) zu Pulver mit Azadirachtin bis zu 49%, das weiter zu einem Azadirachtin-Pulver (88%) durch HPLC (C18-Säule) für spezielle Anwendungen angereichert wird.
Wir haben festgestellt, dass es nicht notwendig ist, pulverisierte Neem-Samen oder -Kerne zuerst mit Petrolether oder Hexan zu extrahieren, gefolgt von einer Extraktion mit Methanol oder wässrigem Methanol oder Ethanol oder wässrigem Ethanol für die Extraktion von Azadirachtin, da die Fettöle von diesen Lösemitteln bei Umgebungstemperatur im Wesentlichen nicht aus pulverförmigen Neem-Samen und -Kernen extrahiert werden und sie faktisch überwiegend mit dem restlichen Samen- oder Kern-Pulver zurückgehalten werden und die die Isolation von Azadirachtin in den nachfolgenden Stufen nicht stören.
Auf dem Stand der Technik liefert der konzentrierte Extrakt mit polaren Lösemitteln einen ölähnlichen oder gummiartigen Feststoff oder eine viskose Masse selbst nach vergleichbaren Reinigungsschritten mit geringerem Gehalt an Azadirachtin. Mit dem vorliegenden Verfahren kann ein bis zu 88% Azadirachtin enthaltender Extrakt in Form von Pulver erhalten werden, der sich leicht zur Herstellung von Formulierungen für die Schadinsektenbekämpfung verwenden lässt.
Die Extraktion von Azadirachtin mit Hilfe einer kontinuierlichen Lösemittelperkolation direkt mit einem polaren Lösemittel in einer mit in geeigneter Weise zerkleinerten Neem-Samen/-Kernen gepackten Säule bei Umgebungstemperatur mit Hilfe des vorliegenden wirtschaftlichen und einfachen sowie großtechnisch aufrüstbaren Verfahrens ist eine Verbesserung gegenüber den Verfahren nach dem Stand der Technik, bei denen gefährliche, unwirtschaftliche und nicht einfach großtechnisch aufrüstbare und sich wiederholende Verfahrensschritte eingesetzt werden, wie beispielsweise die Zerkleinerung und Extraktion von Neem-Samen/-Kernen, die in flüchtigen und gefährlichen organischen Lösemitteln suspendiert sind und bei denen kommerzielle Mischer und Rührer eingesetzt werden. Die kontinuierliche Lösemittelperkolation von zerkleinerten Neem-Samen/-Kernen direkt mit einem polaren Lösemittel, die wirtschaftlich unter Vermeidung eines Entfettens in dem vorliegenden wirtschaftlichen und großtechnisch einfach aufzurüstenden Verfahren bei Umgebungstemperatur ausgeführt wird und der überwiegende Teil der Fettbestandteile, die die Extraktion und Anreicherung von Azadirachtin mit dem Rest des Neem- Samen-/-Kern-Pulvers stören, zurückgehalten wird, stellt eine Verbesserung gegenüber dem Verfahren nach dem Stand der Technik dar, bei denen obligatorisch eine vermeidbare Lösemittelextraktion von Neem- Samen/-Kernen mit Petrolether/Hexan für Entfettung bei der Extraktion mit polaren Lösemitteln für die Isolation von Azadirachtin verwendet wurde.
Die Extraktion von Azadirachtin bei Umgebungstemperatur hält in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung den Abbau von Azadirachtin aufgrund seiner bekannten thermischen Instabilität auf und stellt eine Verbesserung gegenüber Extraktionen dar, die bei höherer Temperatur oder in einem Soxhlet-Extraktionsapparat bei einem Siedepunkt der in dem Verfahren bekannter Ausführung verwendeten Lösemitteln ausgeführt wird. Damit vermeidet die Herstellung von Azadirachtin-Pulver aus rohem Extrakt mit polarem Lösemittel von Neem-Samen/-Kernen, die Azadirachtin enthalten, in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung kostspielige und unnötig sich wiederholende Verfahrensschritte für die Herstellung ähnlicher Extrakte bekannter Ausführungen. Die Herstellung von Azadriachtin-Pulver (15 bis 26%), das für Formulierungen geeignet ist, durch allmählichen Zusatz von Konzentrat von Ethylacetat-Extrakt zu Petrolether (Sp 60º bis 80ºC)/Hexan unter Rühren, gefolgt von einer Filtration und einem Trocknen des ausgefällten Azadirachtin-Pulvers in zwei aufeinanderfolgenden Verfahrensschritten mit Hilfe des vorliegenden wirtschaftlichen und großtechnisch leicht aufrüstbaren Prozesses ist eine Verbesserung gegenüber den Verfahren nach dem Stand der Technik, bei denen kostspielige, zeitaufwendige und in gewissem Maß vermeidbare Lösemittelextraktion und Trennoperationen, chromatographische Methoden und gefährliche Lösemittel, wie beispielsweise Diethylether für die Herstellung ähnlicher Produkte, eingesetzt werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist eine Verbesserung gegenüber einer in der Patentschrift Ger. Offen. Der, 109, 473 (1992) beschriebene Prozedur für die Herstellung von stabilem Azadirachtinangereicherten Insektenpulver aus Neem-Samen (Kleeberg, H., Chemical Abstracts, 118; 18, 0002, s) umfasst: (1) Extraktion von Neem-Samen mit Wasser; (2) Extraktion von wässrigem Extrakt mit Ethylacetat; (3) Ausfällung von Azadirachtin-Pulver aus dem Ethylacetat-Konzentrat durch Zusatz von Petrolether, da die Ausbeuten des Endproduktes angesichts der schlechten Löslichkeit von Azadirachtin in Wasser erwartungsgemäß gering sind.
Die Anreicherung von Azadirachtin-Pulver (10 bis 26%) zu Azadirachtin-Pulver bis zu 49% mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens, das die schrittweise Eluierung mit unterschiedlichen Zusammensetzungen von Petrolether und Ethylacetat mit Hilfe der Säulenchromatographie umfasst, ist eine Verbesserung gegenüber dem Stand der Technik, bei dem gefährliche Lösemittel eingesetzt werden, wie beispielsweise Diethylether, oder der wiederholte Einsatz aufwendiger chromatographischer Methoden.
Die Anreicherung von Azadirachtin-Pulver (49%) bis zu 88% Azadirachtin nach dem erfindungsgemäßen Verfahren mit Hilfe eines einzigen, leicht wiederholbaren HPLC-Schrittes (C18-Säule) (in Folge der Entfernung von unerwünschten polaren Bestandteilen, die die Säule in den ersten Schritten beeinträchtigen) ist eine Verbesserung gegenüber dem Stand der Technik, bei der eine mühselige PLC einbezogen ist, die großtechnisch nicht aufrüstbar ist, zeitaufwendige Lösemittel-Trennoperationen und gefährliche Lösemittel, wie beispielsweise Diethylether, sowie eine Reihe aufwendiger chromatographischer Versuche.
Dementsprechend wird nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung Azadirachtin mit unterschiedlichen Reinheiten in einer trockenen Pulverform, die für Schädlingsbekämpfungs- Formulierungen geeignet ist, erhalten. Ferner wird das so erhaltene trockene Pulver mit organischen Lösemitteln oder ihren Derivaten, Emulgiermitteln oder deren Kombinationen, UV-Stabilisiermitteln und (wahlweise) Synergist gerührt.
Die Erfindung wird unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele beschrieben, die zur Veranschaulichung der Erfindung ausgeführt werden und daher nicht zur Beschränkung des Geltungsbereichs der Erfindung auszulegen sind.

BEISPIEL 1

Es wurden gut gereinigte trockene Neem-Samen in einer mehrstufigen Mühle zu einem groben Pulver mit einer Partikelgröße im Bereich von BSS-7 (0,2 mm) bis BSS-72 (2,4 mm) pulverisiert. Das resultierende Neem-Samen-Pulver (200 g) wurde in eine Glassäule gepackt und kontinuierlich durch Perkolation von Methanol bei Umgebungstemperatur extrahiert. Der Methanol-Extrakt (1.000 ml) wurde bei Atmosphärendruck eingeengt. Das Konzentrat (40 ml) wurde mit einem gleichen Volumen Petrolether (Sp 60º bis 80ºC) in einem Rührkessel gerührt und absetzen gelassen. Die zwei Phasen wurden in einem Phasenseparator getrennt. Die dichtere Phase wurde mit Ethylacetat (40 ml) und Wasser (20 ml) in einem Rührkessel gerührt und absetzen gelassen, während die leichtere Ethylacetat-Phase abgetrennt wurde. Die dichtere Phase wurde wiederum mit Ethylacetat (20 ml) gerührt und in der gleichen Weise verarbeitet, um die leichtere Phase zu ergeben. Beide leichtere Phasen wurden vereint und bei Atmosphärendruck eingeengt. Das so erhaltene Konzentrat wurde allmählich zu Petrolether (Sp 60º bis 80ºC) (40 ml) unter Rühren bei Raumtemperatur oder unter refluxierenden Bedingungen zugesetzt und der Feststoff unter Absaugen filtriert und im Vakuum (65ºC) getrocknet, was zu einem bräunlich-gelben Feststoff (3,65 g) führte, der anhand der HPLC-Analyse 10,84% Azadirachtin enthielt.
Das Produkt, das 10,84% Azadirachtin (8 g) enthielt, wurde in Ethylacetat aufgelöst und die Lösung auf eine mit Silicagel (240 g, weniger als 0,08 mm) gepackte Säule gegeben, die Aufschlämmung wurde mit einer Zusammensetzung von Petrolether (Sp 60º bis 80ºC)/Ethylacetat (9/1) angesetzt. Die Säule wurde schrittweise mit unterschiedlichen Zusammensetzungen von Petrolether (Sp 60º bis 80ºC)/Ethylacetat beginnend bei 9/1, 8/2, 7/3, 6/4, 5/5, 4/6, 3/7, 2/8, 1/9 und Ethylacetat schrittweise eluiert und die Fraktionen, die jeweils 600 ml enthielten, aufgefangen. Fraktion 8, die mit einer Petrolether/Ethylacetat-Zusammensetzung (2/8) eluiert wurde, lieferte einen weißen Rückstand (1,5 g) nach Entfernung des Lösemittels unter Vakuum und enthielt 30,42% Azadirachtin anhand der HPLC.
Der Feststoff, der 30,42% Azadirachtin (500 mg) enthielt, wurde in Methanol (5 ml) aufgelöst und durch eine kurze Säule (Adsorbsil, LC, C18, 100/200 Mesh) filtriert und das Filtrat auf 10 ml aufgefüllt. Dieses wurde mit Hilfe der semipräparativen HPLC verarbeitet (Mikrobondapak, C18-Säule (ID) · 150 mm unter Verwendung als mobile Phase: MeOH/H&sub2;O, 6/4, OD-Bereich-2 AUF: Detektor: UV 217 nm; Durchflussrate 4 ml/min. Probenvolumen 30ul; Dämpfung -1). Das Eluat mit einem Peak der Retentionszeit von 22,6 min wurde unter Vakuum eingeengt und der Rückstand weiter verarbeitet und ergab einen weißen Feststoff, der unter Vakuum bei 65ºC getrocknet wurde und dessen Azadirachtin-Gehalt 88% betrug.
Das Produkt (1 g), das 10,84% Azadirachtin enthielt, wurde zu einem Produkt mit einem Gehalt von 17% Azadirachtin durch Auflösen in Ethylacetat und Zusetzen der Lösung allmählich zu Petrolether (Sp 60º bis 80ºC) unter Rühren angereichert und der resultierende Feststoff filtriert und bei 65ºC getrocknet.

BEISPIEL 2

Es wurden gut gereinigte trockene Neem-Samen in einer mehrstufigen Mühle zu einem groben Pulver mit einer Partikelgröße im Bereich von BSS-7 (0,2 mm) bis BSS-72 (2,4 mm) pulverisiert. Das resultierende Neem-Samen-Pulver (200 g) wurde in eine Glassäule gepackt und kontinuierlich durch Perkolation von Ethanol (rektifizierter Spiritus) bei Umgebungstemperatur extrahiert. Der Ethanol-Extrakt (1.000 ml) wurde bei Atmosphärendruck eingeengt. Das Konzentrat (40 ml) wurde mit einem gleichen Volumen von Petrolether (Sp 60º bis 80ºC) in einem Rührkessel gerührt und absetzen gelassen. Die zwei Phasen wurden in einem Phasenseparator getrennt. Die dichtere Phase wurde mit Ethylacetat (40 ml) und Wasser (20 ml) in einem Rührkessel gerührt und absetzen gelassen, wobei die leichtere Ethylacetat-Phase abgetrennt wurde. Die dichtere Phase wurde wiederum mit Ethylacetat (20 ml) gerührt und in der gleichen Weise verarbeitet, um die leichtere Phase zu ergeben. Beide leichtere Phasen wurden vereint und bei Atmosphärendruck eingeengt. Das so erhaltene Konzentrat wurde allmählich zu Petrolether (Sp 60º bis 80ºC) unter Rühren bei Raumtemperatur zugesetzt und der Feststoff unter Absaugen filtriert und im Vakuum (65ºC) getrocknet, und führte zu einem bräunlich-gelben Feststoff (3,00 g) mit einem Gehalt von 9,15% Azadirachtin anhand der HPLC-Analyse.
Das Produkt, das 9,15% Azadirachtin enthielt, wurde in Ethylacetat aufgelöst und die Lösung auf eine mit Silicagel (240 g, weniger als 0,08 mm) gepackte Säule gegeben, wobei die Aufschlämmung mit einer Zusammensetzung von Petrolether (Sp 60º bis 80ºC)/Ethylacetat (9/1) angesetzt wurde. Die Säule wurde nacheinander mit unterschiedlichen Zusammensetzungen von Petrolether (Sp 60º bis 80ºC)/Ethylacetat beginnend bei 9/1, 8/2, 7/3, 6/4, 5/5, 4/6, 3/7, 2/8, 1/9 schrittweise eluiert und die Fraktionen, die jeweils 600 ml enthielten, aufgefangen. Fraktion 8 wurde mit Petrolether (Sp 60º bis 80ºC)/Ethylacetat-Zusammensetzung (2/8) eluiert und lieferte einen weißen Rückstand (1,5 g) nach Entfernung des Lösemittels unter Vakuum und enthielt anhand der HPLC-Analyse 39,7% Azadirachtin.
Der Feststoff, der 39,7% Azadirachtin (500 mg) enthielt, wurde in Methanol (5 ml) aufgelöst und durch eine kurze Säule (Adsorbsil, LC, C18, 100/200 Mesh) filtriert und das Filtrat auf 10 ml aufgefüllt. Dieses wurde mit Hilfe der semipräparativen HPLC (Mikrobondapak, C18-Säule, 19 mm Innendurchmesser · 150 mm unter Verwendung einer mobilen Phase: MeOH/H&sub2;O, 6/4 OD-Bereich-2 AUF verarbeitet; Detektor: UV 217 nm; Durchflussrate 4 ml/min. Probenvolumen 30ul; Dämpfung -1). Das Eluat mit einem Peak der Retentionszeit von 22,6 min wurde unter Vakuum eingeengt und der Rückstand weiter verarbeitet und ergab einen weißen Feststoff, der unter Vakuum bei 65ºC getrocknet wurde und dessen Azadirachtin- Gehalt 88% betrug.
Das Produkt (1 g), das 9,15% Azadirachtin enthielt, wurde zu einem Produkt mit einem Gehalt von 11,8% Azadirachtin angereichert, indem es in Ethylacetat aufgelöst und die Lösung allmählich zu Petrolether (Sp 60º bis 80ºC) unter Rühren gegeben wurde und der resultierende Feststoff filtriert und bei 65ºC getrocknet wurde.

BEISPIEL 3

Es wurden gut gereinigte trockene Neem-Samen in einer mehrstufigen Mühle zu einem groben Pulver mit einer Partikelgröße im Bereich von BSS-7 (0,2 mm) bis BSS-72 (2,4 mm) pulverisiert. Das resultierende Neem-Samen-Pulver (200 g) wurde in eine Glassäule gepackt und kontinuierlich durch Perkolation von Methanol-Extrakt (1.000 ml) extrahiert und bei Atmosphärendruck eingeengt. Das Konzentrat (40 ml) wurde mit einem gleichen Volumen von Petrolether (Sp 60º bis 80ºC) in einem Rührkessel gerührt und stehen gelassen, um sich abzusetzen. Die zwei Phasen wurden in einem Phasenseparator getrennt. Die dichtere Phase wurde mit Ethylacetat (40 ml) in einem Rührkessel gerührt und stehen gelassen, um sich abzusetzen, und die leichtere Ethylacetat-Phase wurde abgetrennt. Die dichtere Phase wurde nochmals mit Ethylacetat (20 ml) gerührt und in der gleichen Weise verarbeitet, um die leichtere Phase zu ergeben. Beide leichtere Phasen wurden vereinigt und bei Atmosphärendruck eingeengt. Das so erhaltene Konzentrat wurde allmählich zu Petrolether (Sp 60º bis 80ºC) unter Rühren bei Raumtemperatur gegeben und der Feststoff unter Absaugen filtriert und im Vakuum (65ºC) getrocknet, was zu einem bräunlich-gelben Feststoff (3,9 g) mit einem Gehalt von 11,9% Azadirachtin anhand der HPLC- Analyse.
Das Produkt, das 11,9% Azadirachtin enthielt, wurde in Ethylacetat aufgelöst und die Lösung auf eine mit Silicagel (240 g, weniger als 0,08 mm) gepackte Säule gegeben, und die Aufschlämmung mit einer Zusammensetzung von Petrolether (Sp 60º bis 80ºC)/Ethylacetat (9/1) angesetzt. Die Säule wurde nacheinander mit verschiedenen Zusammensetzungen von Petrolether (Sp 60º bis 80ºC)/Ethylacetat beginnend bei 9/1, 8/2, 7/3, 6/4, 5/5, 4/6, 3/7, 2/8, 1/9 schrittweise eluiert und die jeweiligen Fraktionen, die jeweils 600 ml enthielten, aufgefangen. Die Fraktion 8 wurde mit Petrolether (Sp 60º bis 80ºC)/Ethylacetat- Zusammensetzung (2/8), eluiert und lieferte einen weißen Rückstand (1,5 g) nach Entfernung des Lösemittels unter Vakuum und enthielt anhand der HPLC-Analyse 31,19% Azadirachtin.
Der Feststoff, der 31,19% Azadirachtin (500 mg) enthielt, wurde in Methanol (5 ml) aufgelöst und durch eine kurze Säule (Adsorbsil, LC, C18, 100/200 Mesh) filtriert und das Filtrat auf 10 ml aufgefüllt. Dieses wurde mit Hilfe der semipräparativen HPLC verarbeitet (Mikrobondapak, C18-Säule, 19 mm (Innendurchmesser) · 150 mm, unter Verwendung einer mobilen Phase: MeOH/H&sub2;O, 6/4 OD-Bereich-2 AUF: Detektor-UV 217 nm; Durchflussrate 4 ml/min; Probenvolumen 30ul; Dämpfung -1). Das Eluat des Peaks mit der Retentionszeit von 22,6 min wurde unter Vakuum eingeengt und der Rückstand verarbeitet und führte zu einem weißen Feststoff, der unter Vakuum bei 65ºC getrocknet wurde und dessen Azadirachtin-Gehalt 88% hatte. Das Produkt (1 g), das 11,9% Azadirachtin enthielt, wurde zu einem Produkt angereichert, das 15,72% Azadirachtin enthielt, indem es in Ethylacetat aufgelöst wurde und die Lösung allmählich zu Petrolether (Sp 60º bis 80ºC) unter Rühren zugesetzt wurde und der resultierende Feststoff filtriert und bei 65ºC getrocknet wurde.

BEISPIEL 4

Es wurden gut gereinigte trockene Neem-Samen/-Kerne in einer mehrstufigen Mühle zu einem groben Pulver mit einer Partikelgröße im Bereich von BSS-7 (0,2 mm) bis BSS-72 (2,4 mm) pulverisiert. Das resultierende Neem-Samen- und -Kern-Pulver (200 g) wurde in eine Glassäule gepackt und kontinuierlich durch Perkolation von Methanol bei Umgebungstemperatur extrahiert. Der Methanol-Extrakt (1.000 ml) wurde mit Atmosphärendruck eingeengt. Das Konzentrat (40 ml) wurde mit einem gleichen Volumen von Petrolether (Sp 60º bis 80ºC) in einem Rührkessel gerührt und stehen gelassen, um sich abzusetzen. Die zwei Phasen wurden in einem Phasenseparator getrennt. Die dichtere Phase wurde mit Ethylacetat (40 ml) und Wasser (20 ml) in einem Rührkessel gerührt und stehen gelassen, um sich abzusetzen, und die leichtere Ethylacetat-Phase wurde abgetrennt. Die dichtere Phase wurde wiederum mit Ethylacetat (20 ml) gerührt und in der gleichen Weise verarbeitet, um die leichtere Phase zu ergeben. Beide leichtere Phasen wurden vereinigt und bei Atmosphärendruck eingeengt: Das so erhaltene Konzentrat wurde allmählich zu Petrolether (Sp 60º bis 80ºC) unter Rühren bei Raumtemperatur gegeben und der Feststoff unter Absaugen filtriert und im Vakuum (65ºC) getrocknet, was zu einem bräunlich-gelben Feststoff (4,0 g) mit einem Gehalt von 16,16% Azadirachtin anhand der HPLC-Analyse. Das Produkt, das 16,16% Azadirachtin (8 g) enthielt, wurde in Ethylacetat aufgelöst und die Lösung auf eine mit Silicagel (200 g, Acme weniger als 0,08 mm) gepackte Säule gegeben und die Aufschlämmung mit einer Zusammensetzung von Petrolether (Sp 60º bis 80ºC)/Ethylacetat (9/1) angesetzt. Die Säule wurde nacheinander mit verschiedenen Zusammensetzungen von Petrolether (Sp 60º bis 80ºC)/Ethylacetat beginnend bei 9/1, 8/2, 7/3, 6/4, 5/5, 4/6, 3/7, 2/8, 1/9 schrittweise eluiert und die jeweiligen Fraktionen, die jeweils 600 ml enthielten, aufgefangen. Die Fraktion 8 wurde mit Petrolether (Sp 60º bis 80ºC)/Ethylacetat- Zusammensetzung (2/8), eluiert und lieferte einen weißen Rückstand (1,5 g) nach Entfernung des Lösemittels unter Vakuum und enthielt anhand der HPLC-Analyse 49,24% Azadirachtin.
Der Feststoff, der 49,24% Azadirachtin (500 mg) enthielt, wurde in Methanol (5 ml) aufgelöst und durch eine kurze Säule (Adsorbsil, LC, C18, 100/200 Mesh) filtriert und das Filtrat auf 10 ml aufgefüllt. Dieses wurde mit Hilfe der semipräparativen HPLC verarbeitet (Mikrobondapak, C18-Säule, 19 mm (Innendurchmesser) · 150 mm, unter Verwendung einer mobilen Phase: MeOH/H&sub2;O, 6/4 OD-Bereich-2 AUF: Detektor-UV 217 nm; Durchflussrate 4 ml/min; Probenvolumen 30ul; Dämpfung -1). Das Eluat des Peaks mit der Retentionszeit von 22,6 min wurde unter Vakuum eingeengt und der Rückstand verarbeitet und führte zu einem weißen Feststoff, der unter Vakuum bei 65ºC getrocknet wurde und dessen Azadirachtin-Gehalt 88% hatte.
Das Produkt (1 g), das 16, 16% Azadirachtin enthielt, wurde zu einem Produkt angereichert, das 22,89% Azadirachtin enthielt, indem es in Ethylacetat aufgelöst wurde und die Lösung allmählich zu Petrolether (Sp 60º bis 80ºC) unter Rühren zugesetzt wurde und der resultierende Feststoff filtriert und bei 65ºC getrocknet wurde.

BEISPIEL 5

Es wurden gut gereinigte trockene Neem-Samen/-Kerne in einer mehrstufigen Mühle zu einem groben Pulver mit einer Partikelgröße im Bereich von BSS-7 (0,2 mm) bis BSS-72 (2,4 mm) pulverisiert. Das resultierende Neem-Samen- und -Kern-Pulver (200 g) wurde in eine Glassäule gepackt und durch Perkolation von 20% Wasser enthaltendem Methanol bei Umgebungstemperatur kontinuierlich extrahiert. Der wässrige Methanol-Extrakt (1.000 ml) wurde mit Atmosphärendruck eingeengt. Das Konzentrat (40 ml) wurde mit einem gleichen Volumen von Petrolether (Sp 60º bis 80ºC) in einem Rührkessel gerührt und stehen gelassen, um sich abzusetzen. Die zwei Phasen wurden in einem Phasenseparator getrennt. Die dichtere Phase wurde mit Ethylacetat (40 ml) in einem Rührkessel gerührt und stehen gelassen, um sich abzusetzen, und die leichtere Ethylacetat-Phase wurde abgetrennt. Die dichtere Phase wurde wiederum mit Ethylacetat (20 ml) gerührt und in der gleichen Weise verarbeitet, um die leichtere Phase zu ergeben. Beide leichtere Phasen wurden vereinigt und bei Atmosphärendruck eingeengt. Das so erhaltene Konzentrat wurde allmählich zu Petrolether (Sp 60º bis 80ºC) unter Rühren bei Raumtemperatur gegeben und der Feststoff unter Absaugen filtriert und im Vakuum (65ºC) getrocknet, was zu einem bräunlich-gelben Feststoff (3,75 g) mit einem Gehalt von 19,93% Azadirachtin anhand der HPLC-Analyse. Das Produkt, das 19,93% Azadirachtin (8 g) enthielt, wurde in Ethylacetat aufgelöst und die Lösung auf eine mit Silicagel (200 g, weniger als 0,08 mm) gepackte Säule gegeben und die Aufschlämmung mit einer Zusammensetzung von Petrolether (Sp 60º bis 80ºC)/Ethylacetat (9/1) angesetzt. Die Säule wurde nacheinander mit verschiedenen Zusammensetzungen von Petrolether (Sp 60º bis 80ºC)/Ethylacetat beginnend bei 9/1, 8/2, 7/3, 6/4, 5/5, 4/6, 3/7, 2/8, 1/9 schrittweise eluiert und die jeweiligen Fraktionen, die jeweils 600 ml enthielten, aufgefangen. Die Fraktion 8 wurde mit Petrolether (Sp 60º bis 80ºC)/Ethylacetat- Zusammensetzung (2/8), eluiert und lieferte einen weißen Rückstand (1,5 g) nach Entfernung des Lösemittels unter Vakuum und enthielt anhand der HPLC-Analyse 45% Azadirachtin.
Der Feststoff, der 45% Azadirachtin (500 mg) enthielt, wurde in Methanol (5 ml) aufgelöst und durch eine kurze Säule (Adsorbsil, LC, C18, 100/200 Mesh) filtriert und das Filtrat auf 10 ml aufgefüllt. Dieses wurde mit Hilfe der semipräparativen HPLC verarbeitet (Mikrobondapak, C18-Säule, 19 mm (Innendurchmesser) · 150 mm, unter Verwendung einer mobilen Phase: MeOH/H&sub2;O, 6/4 Proben-Bereich-2 AUF; Detektor-UV 217 nm; Durchflussrate 4 ml/min; Probenvolumen 30 ul; Dämpfung-1). Das Eluat des Peaks mit der Retentionszeit von 22,6 min wurde unter Vakuum eingeengt und der Rückstand verarbeitet und führte zu einem weißen Feststoff, der unter Vakuum bei 65ºC getrocknet wurde und dessen Azadirachtin-Gehalt 88% hatte.
Das Produkt (1 g), das 19,93% Azadirachtin enthielt, wurde zu einem Produkt angereichert, das 26,86% Azadirachtin enthielt, indem es in Ethylacetat aufgelöst wurde und die Lösung allmählich zu Petrolether (Sp 60º bis 80ºC) unter Rühren zugesetzt wurde und der resultierende Feststoff filtriert und bei 65ºC getrocknet wurde.

BEISPIEL 6

Es wurden gut gereinigte trockene Neem-Samen/-Kerne in einer mehrstufigen Mühle zu einem groben Pulver mit einer Partikelgröße im Bereich von BSS-7 (0,2 mm) bis BSS-72 (2,4 mm) pulverisiert. Das resultierende Neem-Samen-Pulver (200 g) wurde in eine Glassäule gepackt und durch kontinuierliche Perkolation von Ethanol bei Umgebungstemperatur extrahiert. Der Ethanol-Extrakt (1.000 ml) wurde mit Atmosphärendruck eingeengt. Das Konzentrat (40 ml) wurde mit einem gleichen Volumen von Petrolether (Sp 60º bis 80ºC) in einem Rührkessel gerührt und stehen gelassen, um sich abzusetzen. Die zwei Phasen wurden in einem Phasenseparator getrennt. Die dichtere Phase wurde mit Ethylacetat (40 ml) und Wasser (20 ml) in einem Rührkessel gerührt, stehen gelassen, um sich abzusetzen, und die leichtere Ethylacetat- Phase wurde abgetrennt. Die dichtere Phase wurde wiederum mit Ethylacetat (20 ml) gerührt und in der gleichen Weise verarbeitet, um die leichtere Phase zu ergeben. Beide leichtere Phasen wurden vereinigt und bei Atmosphärendruck eingeengt. Das so erhaltene Konzentrat wurde allmählich zu Petrolether (Sp 60º bis 80ºC) (40 ml) unter Rühren bei Raumtemperatur gegeben und der Feststoff unter Absaugen filtriert und im Vakuum (65ºC) getrocknet, was zu einem bräunlich-gelben Feststoff (2,8 g) mit einem Gehalt von 16,06% Azadirachtin anhand der HPLC-Analyse.
Das Produkt, das 16,06% Azadirachtin (8 g) enthielt, wurde in Ethylacetat aufgelöst und die Lösung auf eine mit Silicagel (240 g, weniger als 0,08 mm) gepackte Säule gegeben und die Aufschlämmung mit einer Zusammensetzung von Petrolether (Sp 60º bis 80ºC)/Ethylacetat (9/1) angesetzt. Die Säule wurde nacheinander mit verschiedenen Zusammensetzungen von Petrolether (Sp 60º bis 80ºC)/Ethylacetat beginnend bei 9/1, 8/2, 7/3, 6/4, 5/5, 4/6, 3/7, 2/8, 1/9 und Ethylacetat schrittweise eluiert und die jeweiligen Fraktionen, die jeweils 600 ml enthielten, aufgefangen. Die Fraktion 8 wurde mit Petrolether (Sp 60º bis 80ºC)/Ethylacetat-Zusammensetzung (2/8), eluiert und lieferte einen weißen Rückstand (1,5 g) nach Entfernung des Lösemittels unter Vakuum und enthielt anhand der HPLC-Analyse 45,5% Azadirachtin.
Der Feststoff, der 45,5% Azadirachtin (500 mg) enthielt, wurde in Methanol (5 ml) aufgelöst und durch eine kurze Säule (Adsorbsil, LC, C18, 100/200 Mesh) filtriert und das Filtrat auf 10 ml aufgefüllt. Dieses wurde mit Hilfe der semipräparativen HPLC verarbeitet (Mikrobondapak, C18-Säule, 19 mm (Innendurchmesser) · 150 mm, unter Verwendung einer mobilen Phase: MeOH/H&sub2;O, 6/4 Proben-Bereich-2 AUF; Detektor-UV 217 nm; Durchflussrate 4 ml/min. Probenvolumen 30 ul; Dämpfung-1). Das Eluat des Peaks mit der Retentionszeit von 22,6 min wurde unter Vakuum eingeengt und der Rückstand verarbeitet und führte zu einem weißen Feststoff, der unter Vakuum bei 65ºC getrocknet wurde und dessen Azadirachtin-Gehalt 88% hatte.
Das Produkt (1 g), das 16,06% Azadirachtin enthielt, wurde zu einem Produkt angereichert, das 20,44% Azadirachtin enthielt, indem es in Ethylacetat aufgelöst wurde und die Lösung allmählich zu Petrolether (Sp 60º bis 80ºC) unter Rühren zugesetzt wurde und der resultierende Feststoff filtriert und bei 65ºC getrocknet wurde.

BEISPIEL 7

Es wurde trockenes Neem-Samen-Extraktpulver (20 mg), das nach einem der vorgenannten Beispiel erhalten wurde, langsam zu einer gut gerührten Lösung von Lösemittel C-IX (51 g), Cyclohexanon (14 g), Triton X 100 (4,12 g), Tween 80 (2,94 g), Igesol, CABS (2,94 g) und Piperonylbutoxid (5 g) gegeben, die in einem Becherglas aufgenommen und für 1 Stunde gerührt wurden, bis eine klare braune Lösung erhalten wurde.

BEISPIEL 8

Es wurde Neem-Samen-Extraktpulver (1 kg), das nach einem der Beispiele 1 bis 6 erhalten wurde, langsam zu einer gut gerührten homogenen Lösung von Lösemittel C-IX (2,35 kg), Cyclohexanon (1 kg), Triton X 100 (206,0 g), Tween 80 (147g), Igesol, CABS (147g) und Piperonylbutoxid (500 g) und 2- Hydroxy-4-octyloxybenzophenon (25 g) gegeben und in einem Becherglas aufgenommen und für 8 Stunden kontinuierlich gerührt, bis eine klare braune Lösung erhalten wurde.

BEISPIEL 9

Es wurde trockenes Neem-Samen-Extraktpulver (20 g), das nach einem der Beispiele 1 bis 6 erhalten wurde, Xylol (51 g), 2-Butanon (14 g), Triton · 100 (4,12 g), Tween 80 (2,94 g) und Igesol CABS (2,94 g), Piperonylbutoxid (5 g) in einem Becherglas aufgenommen und für 1 Stunde gerührt, bis eine klare braune Lösung erhalten wurde.

BEISPIEL 10

Es wurde trockenes Neem-Samen-Extraktpulver (20 g), das nach einem der Beispiele 1 bis 6 erhalten wurde, Dimethylphthalat (35 g) und Cyclohexanon (30 g), Emulsol MAL (10 g) und Piperonylbutoxid (5 g) in einem Becherglas aufgenommen und so lange gerührt, bis eine klare braune Lösung erhalten wurde.

BEISPIEL 11

Es wurde trockenes Neem-Samen-Extraktpulver (20 g), das nach einem der Beispiele 1 bis 6 erhalten wurde, Cyclohexanon (70 g) und Emulgiermittel Creslox 3409 (10 g) in einem Becherglas aufgenommen und so lange gerührt, bis eine klare braune Lösung erhalten wurde.

BEISPIEL 12

Es wurde Neem-Samen-Extraktpulver (20 g), das nach einem der Beispiele 1 bis 6 erhalten wurde, Cyclohexanon (60 g), Dioctylphthalat (8 g), Emulsol 172 RH (10 g), Triton · 100 (2 g) in einem Becherglas aufgenommen und so lange gerührt, bis eine klare braune Lösung erhalten wurde.

BEISPIEL 13

Es wurde Neem-Samen-Extraktpulver (20 g), das nach einem der Beispiele 1 bis 6 erhalten wurde, Isobutylmethylketon (56 g), Dimethylformamid (14 g), Cresolox 3409 (10 g) in einem Becherglas aufgenommen und so lange gerührt, bis eine klare braune Lösung erhalten wurde.

BEISPIEL 14

Es wurde trockenes Neem-Samen-Extraktpulver (20 g), das nach einem der Beispiele 1 bis 6 erhalten wurde, Isopropanol (70 g), Igesol CABS (1,43 g) und Ethylenoxid-Kondensat, 10 Mol (8,57 g) in einem Becherglas aufgenommen und so lange gerührt, bis eine braune homogene Lösung erhalten wurde.

BEISPIEL 15

Es wurde trockenes Neem-Samen-Extraktpulver (20 g), das nach einem der Beispiele 1 bis 6 erhalten wurde, Aromax (60 g), Cyclohexanon (10 g) und Emulsol 172 RH (10 g) in einem Becherglas aufgenommen und für 1 Stunde gerührt, bis eine klare braune Lösung erhalten wurde.

Claims

1. Verfahren zum Herstellen von Azadirachtin in Form eines trockenen festen Pulvers mit einer Reinheit von 10 bis 19% aus Neem-Samen/-Kernen, welches Verfahren umfasst:

(a) Vermahlen der Neem-Samen/-Kerne zu einem Pulver; (b) das Pulver einer kontinuierlichen Extraktion unterziehen, indem eine Charge unter Verwendung von Methanol, wässrigem Methanol, Ethanol (rektifizierter Spiritus) oder wässrigen Ethanol bei Umgebungstemperatur perkoliert wird; (c) Einengen des Extraktes und Rühren des Konzentrats mit Petrolether (Sp. 60º bis 80ºC) oder Hexan und Phasentrennung mit Hilfe konventioneller Methoden; (d) Rühren der dichteren Phase, die die größere Menge an Azadirachtin enthält, mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösemittel und Wasser nach Erfordernis in Abhängigkeit von dem für die Extraktion verwendeten Lösemittel und Phasentrennung mit Hilfe konventioneller Methoden; (e) Einengen der organischen Phase und allmähliches Zusetzen des Konzentrats zu Petrolether (Sp. 60º bis 80ºC) oder Hexan unter Rühren bei Umgebungstemperatur; (f) Filtern und Trocknen unter Vakuum bei einer Temperatur im Bereich von 25º bis 65ºC, um einen Neem-Samen/-Kern-Extrakt als ein Pulver zu erhalten, das Azadirachtin mit einer Reinheit von 10 bis 19% aufweist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei welchem das Vermahlen der Neem-Samen/-Kerne ausgeführt wird in einer Mühle, um eine Partikelgröße im Bereich von BSS-7 (0,2 mm) bis BSS-72 (2,4 mm) zu erhalten.

3. Verfahren nach Anspruch 1, bei welchem das für die Extraktion des vermahlenen Neem-Samens/- Kerne in Schritt (b) verwendete Lösemittel Methanol ist.

4. Verfahren nach Anspruch 1, bei welchem der in Schritt (c) erhaltene Extrakt unter Vakuum eingeengt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1, bei welchem das in Schritt (d) verwendete Lösemittel für die Abtrennung von Azadirachtin ausgewählt wird aus Benzol, 2-Butanon, Chloroform, Dichlormethan, Dichlorethan, Diisopropylether, Ethylacetat, Methyl-tert-butylether und Toluol.

6. Verfahren nach Anspruch 5, bei welchem das Lösemittel Ethylacetat ist.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dem der Schritt (g) des Auflösens des in Schritt (f) erhaltenen Produktes in einem organischen Lösemittel folgt und Zusetzen der Lösung zu Petrolether (Sp. 60º bis 80ºC) oder Hexan unter Rühren, was ein weißes Pulver ergibt, das nach Filtration und Trocknen unter Vakuum bei 65ºC Azadirachtin mit einer Reinheit von 15 bis 26% als ein weißes Pulver liefert.

8. Verfahren nach Anspruch 7, bei welchem das für die erneute Auflösung von Azadirachtin in Schritt (g) verwendete Lösemittel ausgewählt wird aus Ethylacetat und Dichlormethan und das für die Herstellung von Azadirachtin-Pulver verwendete Lösemittel ausgewählt wird aus Petrolether (Sp. 60º bis 80ºC) und Hexan.

9. Verfahren nach Anspruch 8, bei welchem die zwei Lösemittel Ethylacetat und Petrolether sind.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dem der Schritt (h) des Auflösens des Azadirachtin aus Schritt (f) in einem organischen Lösemittel folgt und dieses einer Säulenchromatographie (Silicagel) unterziehen, indem unter Verwendung verschiedener Zusammensetzungen von Hexan oder Petrolether (Sp. 60º bis 80ºC) und Ethylacetat schrittweise eluiert wird, um festes Azadirachtin-Pulver mit einer Reinheit bis zu 49% zu ergeben.

11. Verfahren nach Anspruch 10, bei welchem die eingesetzte stationäre Phase C18-gebundenes Silicagel ist.

12. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, dem der Schritt (i) des abschließenden Auflösens des in Schritt (h) erhaltenen Azadirachtin in Methanol, Ethanol oder Acetonitril folgt und dieses einer HPLC (C18-Säule) unterwerfen, um Azadirachtin mit einer Reinheit bis zu 88% in einer festen Pulverform zu erzeugen.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, bei welchem das in den Schritten (f), (g), (h) und (i) erhaltene Azadirachtin-Pulver in einem Vakuum zwischen 25º und 65ºC zur Entfernung der anhaftenden Lösemittel getrocknet wird.

14. Verfahren für die Herstellung eines emulgierbaren Konzentrats, aufweisend bis zu 30 Gew.-% Azadirachtin aus Neem-Samen/-Kernen, welches Verfahren. umfasst: Rühren des nach einem der Ansprüche 1 bis 18 erhaltenden Azadirachtin-Pulvers mit Lösemitteln oder Mischungen davon, Emulgiermitteln oder Emulgiermittel-Kombinationen mit oder ohne Synergist und mit oder ohne UV- Stabilisiermitteln und dadurch das klare emulgierbare Konzentrat erhalten.

15. Verfahren nach Anspruch 14, bei welchem die verwendeten organischen Lösemittel Aromax, 2- Butanon, Cyclohexanon, Dimethylformamid, Dimethylphthalat, Dioctylphthalat, Isobutanol, Isobutylmethylketon, Isopropanol, Lösemittel C-IX (bei dem es sich um ein Petroleum-Destillat handelt, das höhere aliphatische Alkane, Isoalkane im Bereich von C&sub5;, C&sub7;, C&sub8;, C&sub9; bis C&sub7;&sub4; enthält) und Xylol einzeln oder als geeignete Kombinationen sind.

16. Verfahren nach Anspruch 14 oder 15, bei welchem die Emulgiermittel oder Emulgiermittel- Kombinationen ausgewählt werden aus den kommerziell verfügbaren nichtionischen und ionischen Emulgiermitteln Cresolox 3409, Emulsol MAL, Emulsol 172 RH, Igesol, Calciumalkylbenzolsulfonat (CABS), Ethylenoxid-Kondensate (10 Mole), Triton · 100 und Tween 80.

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 16, bei welchem Piperonylbutoxid als ein Synergist verwendet wird.

18. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 17, bei welchem das verwendete UV-Stabilisiermittel 2-Hydroxy-4-octyloxybenzophenon ist.