DE69606882T2

DE69606882T2 - USE OF NADPH OXIDASE INHIBITORS FOR PRODUCING A MEDICINAL PRODUCT FOR PREVENTING ARTERIOSCLEROSIS

Info

Publication number: DE69606882T2
Application number: DE69606882T
Authority: DE
Inventors: James A. Holland; David K. Johnson
Original assignee: Research Foundation of State University of New York
Current assignee: Research Foundation of State University of New York
Priority date: 1995-11-27
Filing date: 1996-11-27
Publication date: 2000-08-17
Anticipated expiration: 2016-11-28
Also published as: EP0861070A2; US5902831A; WO1997019679A2; ES2144792T3; GR3033067T3; AU1085997A; CA2238098A1; EP0914821A2; US5763496A; EP0861070B1; DE69606882D1; JPH11507946A; WO1997019679A3; ATE189957T1; JP2003176224A; EP0914821A3; CA2238098C

Abstract

A diagnostic method for predicting risk of a human patient to atherosclerotic-related diseases, involving measurement of NADPH oxidase activity.

Description

Description Background of the invention

Die Atherosklerose mit den Folgeerscheinungen Herzanfall, Schlag und peripheren Gefäßerkrankungen stellt in den Vereinigten Staaten mit über 800000 Todesfällen pro Jahr die Haupttodesursache dar. Mit Ausnahme von Unfällen, Selbstmorden und Morden sind Atherosklerose-Krankheiten für nahezu 50% aller Todesfälle verantwortlich.Atherosclerosis, with its consequences of heart attacks, strokes and peripheral vascular diseases, is the leading cause of death in the United States, with over 800,000 deaths per year. Excluding accidents, suicides and murders, atherosclerosis diseases are responsible for almost 50% of all deaths.

Epidemiologische Studien zeigen, daß die Betroffenen einen erhöhten "Low Density Lipoprotein" (LDL)-Spiegel im Blut aufweisen. LDL befördert Cholesterin von der Leber zu den Körpergeweben. Ein erhöhter Cholesterinspiegel (Hypercholesterinämie) geht gewöhnlich mit einem Anstieg des LDL-Spiegels einher. Hohe Cholesterinspiegel im Blut, insbesondere von LDL-Cholesterin, erhöhen das Risiko für koronare Herzerkrankungen (KHE), während eine Senkung des Gesamtcholesterin- und LDL-Cholesterinspiegels das KHE-Risko herabsetzt.Epidemiological studies show that those affected have an increased level of low-density lipoprotein (LDL) in their blood. LDL transports cholesterol from the liver to the body's tissues. An increased cholesterol level (hypercholesterolemia) is usually accompanied by an increase in LDL levels. High cholesterol levels in the blood, especially LDL cholesterol, increase the risk of coronary heart disease (CHD), while lowering total cholesterol and LDL cholesterol levels reduces the risk of CHD.

Viele pharmazeutische Mittel sind zur Behandlung und Vorbeugung von Atherosklerose und deren Komplikationen entwickelt worden, indem anomal hohe Blut-LDL-Spiegel bekämpft oder die Cholesterin-Spiegel gesenkt wurden. Unter den am meisten bekannten Mitteln dieser Art sind Nicotinsäure, Clofibrat, das Natriumsalz von Dextrothyroxin, Neomycin, β-Sitosterin, Probucol, Cholestyramin und HMG-CoA-Reductase-Inhibitoren, wie Lovastatin und Simvastatin. Die Zweckdienlichkeit dieser Mittel ist jedoch wegen des häufigen Auftretens akuter Nebenwirkungen begrenzt. Solche Nebenwirkungen können eine intensive Rötung der Haut, Juckreiz, Magen-Darm-Reizung, Leberschädlichkeit, Herzrhythmusstörungen, Übelkeit, Gewichtsverlust, Haarausfall, Impotenz, Bauchschmerzen, Durchfall, Eosinophilie, Hautausschlag, Schmerzen im Bewegungsapparat, verschwommenes Sehen, leichte Anämie, verminderter Leukocytengehalt, gesteigertes Auftreten von Gallensteinen, Verstopfung und Impaktion sein. Darüber hinaus besteht nur ein teilweiser Zusammenhang zwischen einer Senkung des Serumcholesterins und einem Rückgang der Atherosklerose. Nicht alle an Atherosklerose erkrankten Patienten weisen einen hohen Cholesterinspiegel auf und nicht alle Patienten mit hohem Cholesterinspiegel sind an Atherosklerose erkrankt.Many pharmaceutical agents have been developed to treat and prevent atherosclerosis and its complications by combating abnormally high blood LDL levels or lowering cholesterol levels. Among the most well-known agents of this type are nicotinic acid, clofibrate, sodium salt of dextrothyroxine, neomycin, β-sitosterol, probucol, cholestyramine and HMG-CoA reductase inhibitors such as lovastatin and simvastatin. However, the usefulness of these agents is limited due to the frequent occurrence of acute side effects. Such side effects may include intense redness of the skin, itching, gastrointestinal irritation, liver damage, cardiac arrhythmia, nausea, weight loss, hair loss, impotence, abdominal pain, diarrhea, eosinophilia, rash, musculoskeletal pain, blurred vision. vision, mild anemia, decreased white blood cell count, increased incidence of gallstones, constipation and impaction. In addition, there is only a partial association between lowering serum cholesterol and a reduction in atherosclerosis. Not all patients with atherosclerosis have high cholesterol and not all patients with high cholesterol have atherosclerosis.

Die Pathobiologie der Atherosklerose weist darauf hin, daß hauptsächlich das Gefäßendothelium darin verwicket ist. Eine Störung des Endotheliums ohne das offensichtliche Absterben oder den Verlust von Endothelzellen mit einer anschließenden Veränderung der Durchlässigkeit des Endothels für verschiedene Blutstoffe stellt ein wichtiges Kennzeichen bei der Entwicklung von atherosklerotioschen Wunden dar. Im Blut enthaltene Stoffe dringen dann durch dieses Endothelgewebe und häufen sich in der Intima der Arterienwand an. Selbst ein nur mäßiger Anstieg in der Durchlässigkeit des Endotheliums (Hyperpermeabilität) ist begleitet von einem signifikanten Anstieg im Vorkommen atherosklerotischer Ereignisse.The pathobiology of atherosclerosis indicates that the vascular endothelium is primarily involved. Disruption of the endothelium without obvious death or loss of endothelial cells, with a subsequent change in the permeability of the endothelium to various blood substances, is an important hallmark in the development of atherosclerotic lesions. Substances contained in the blood then penetrate through this endothelial tissue and accumulate in the intima of the artery wall. Even a modest increase in the permeability of the endothelium (hyperpermeability) is accompanied by a significant increase in the occurrence of atherosclerotic events.

Ein Mechanismus, nach welchem Gefäß-Hyperpermeabilität in Gegenwart eines intakten Endothels in Erscheinung treten kann, ist eine gesteigerte Endothel-Endozytose infolge einer Störung des Endotheliums. Das Endothelium kann durch verschiedene Bedingungen gestört werden, einschließlich einem hohen Gehalt an "Low Density Liopoprotein" (LDL) im Blut und von Scherkräften, wie sie bei Bluthochdruck auftreten. Auch Diabetes mellitus und Rauchen können eine Störung des Endotheliums hervorrufen. Ich führte Untersuchungen durch, in denen Endothelzellen (EC) des Menschen über längere Zeiträume hohen LDL- Konzentrationen (bis zu 330 mg/dl Cholesterin) ausgesetzt wurden. Wie beispielsweise durch die Stabilität der Zellzählung gezeigt wurde, wiesen die Ergebnisse darauf hin, daß bei Menschen ein Absterben und ein Verlust an ECs während des Fortschreitens der endothelialen Plaquebildung durch LDL nicht auftrat.One mechanism by which vascular hyperpermeability may occur in the presence of intact endothelium is increased endothelial endocytosis due to endothelial disruption. Endothelium can be disrupted by a variety of conditions, including high levels of low-density lipoprotein (LDL) in the blood and shear forces such as those associated with hypertension. Diabetes mellitus and smoking can also cause endothelial disruption. I performed studies in which human endothelial cells (EC) were exposed to high LDL concentrations (up to 330 mg/dL cholesterol) for prolonged periods. The results indicated that in humans, as demonstrated by, for example, the stability of cell counts, EC death and loss did not occur during the progression of endothelial plaque formation by LDL.

Anfangs tritt eine Störung des Endotheliums auf, was dazu führt, daß eine Endocytose und LDL-Änhäufung im unter dem Endothel liegenden Raum auftritt. Somit wird eine erhöhte EC-Endocytose induziert, wenn die ECs hohen LDL-Spiegeln ausgesetzt werden. Die Untersuchungen zeigen, daß es für eine übertriebene Endocytose nötig ist, die ECs LDL in Konzentrationsbereichen auszusetzten, von denen man aus epidemiologischen Untersuchungen her glaubt, daß sie atherogen sind (z. B. Endothelzellen > 140 mg/dl LDL- Cholesterin ausgesetzt). Eine weiter Haupterkenntnis ist, daß, wenn sich erst einmal eine erhöhte Endocytose eingestellt hat, sie dies auch bleibt. Solch eine andauernde Veränderung im funktionellen Zustand von ECs stimmt mit dem Konzept einer Endothelstörung oder Gefäß-Hyperpermeabilität überein.Initially, there is a disruption of the endothelium, which leads to endocytosis and LDL accumulation in the subendothelial space. Thus, increased EC endocytosis is induced when ECs are exposed to high levels of LDL. The studies show that exaggerated endocytosis requires ECs to absorb LDL in concentration ranges believed by epidemiological studies to be atherogenic (e.g., exposing endothelial cells to > 140 mg/dL LDL cholesterol). Another key finding is that once increased endocytosis is established, it remains so. Such a sustained change in the functional state of ECs is consistent with the concept of endothelial dysfunction or vascular hyperpermeability.

Die Endocytose stellt ein fundamentales, offensichtlich ubiquitäres Zellgeschehen dar. Während der Endocytose wird ein Segment der Plasmamembran nach innen gestülpt und bildet ein Vesikel, das ins Cytoplasma wandert. Dieses Vesikel kann sich am Materialtransport durch die Zelle über Transcytose beteiligen. Der einer Endocytose zugrundeliegende Regulationsmechanismus wird noch nicht vollständig verstanden, aber viele Untersuchungen weisen darauf hin, daß reaktive Sauerstoffspezies, wie z. B. H&sub2;O&sub2; und O&sub2;&supmin;, die erhöhte EC-Endocytose regulieren. Als Nebenprodukte des normalen Zell-Metabolismus werden von den Zellen reaktive Sauerstoffspezies (ROS) erzeugt. Gestörte Endothelzellen erhöhen die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies über die Aktivierung der Nicotinamidadenindinucleotidphosphat (NADPH)-Oxidase.Endocytosis is a fundamental, apparently ubiquitous cellular event. During endocytosis, a segment of the plasma membrane is inverted and forms a vesicle that migrates into the cytoplasm. This vesicle can participate in the transport of material through the cell via transcytosis. The regulatory mechanism underlying endocytosis is not yet fully understood, but many studies indicate that reactive oxygen species, such as H₂O₂ and O₂⊃min;, regulate increased EC endocytosis. Reactive oxygen species (ROS) are generated by cells as byproducts of normal cellular metabolism. Disturbed endothelial cells increase the production of reactive oxygen species via the activation of nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) oxidase.

NADPH-Oxidase ist ein Enzym, das in Leukocyten gut charakterisiert worden ist, jedoch ist zuvor noch keine leukocytenartige NADPH-Oxidase in Endothelzellen identifitiert worden. Ich habe nachgewiesen, daß es in Endothelzellen vorkommt. Eine Aktivierung der NADPH- Oxidase hat eine Übertragung von Elektronen von NADPH auf Sauerstoff zur Folge, wodurch eine reaktive Sauerstoffspezies (ROS), wie z. B. O&sub2;&supmin; und H&sub2;O&sub2;, erzeugt wird. Die aktive Form der Oxidase ist ein Komplex, der sich aus membrangebundenen Proteinen zusammensetzt, unter denen sich Cytochrom b&sub5;&sub5;&sub8; (zusammengesetzt aus gp 91[phox] und p 22[phox]) und Komponenten des Cytosols befinden, von denen drei charakterisiert worden sind, nämlich p 47[phox], p 67[phox] und ein GTP-bindendes Protein mit niedrigem Molekulargewicht. Cytochrom b558 besteht aus einem Polypeptid von 22 kD, welches fest an ein glykosyliertes Polypeptid von 91 kD gebunden ist. Das glykosylierte Polypeptid von 91 kD ist ein integrales Membranprotein, das als Anker für das Polypeptid von 22 kD dient.NADPH oxidase is an enzyme that has been well characterized in leukocytes, but no leukocyte-like NADPH oxidase has been previously identified in endothelial cells. I have demonstrated that it exists in endothelial cells. Activation of NADPH oxidase results in the transfer of electrons from NADPH to oxygen, generating reactive oxygen species (ROS), such as O₂⁻ and H₂O₂. The active form of the oxidase is a complex composed of membrane-bound proteins, among which is cytochrome b₅₅₈ (composed of gp 91[phox] and p 22[phox]) and components of the cytosol, three of which have been characterized, namely p 47[phox], p 67[phox] and a low molecular weight GTP-binding protein. Cytochrome b558 consists of a 22 kD polypeptide tightly bound to a glycosylated polypeptide of 91 kD. The glycosylated polypeptide of 91 kD is an integral membrane protein that serves as an anchor for the 22 kD polypeptide.

Es ist bekannt, daß erbliche Anomalien des NADPH-Oxidase-Enzym-Komplexes zu progressiver septischer Granulomatose (Chronic Granulomatous Disease; CGD) führen, einer angeborenen Krankheit, bei welcher Leukocyten nicht befähigt sind, reaktive Sauerstoffspezies als Reaktion auf Mikroorganismen zu bilden. Mit Studien an CGD-Kranken mit ungenügender oder fehlender NADPH-Oxidase-Aktivität konnte gezeigt werden, daß es genetische Varianten für die NADPH-Oxidase gibt. Allerdings hat es noch keine Untersuchungungen zum Nachweis genetischer Varianten für NADPH-Oxidase gegeben, bei welchen übermäßige Mengen an reaktiven Sauerstoffspezies gebildet werden. Falls es solche Varianten gibt und sie in unserer Bevölkerung vorkommen, dann können Leute, die diese genetischen Varianten geerbt haben, in größerer Gefahr für einen Herzanfall, einen Schlag oder eine periphere Gefäßerkrankung sschweben.It is known that hereditary abnormalities of the NADPH oxidase enzyme complex lead to progressive septic granulomatosis (chronic granulomatous disease; CGD), a congenital disease in which leukocytes are unable to produce reactive oxygen species in response to microorganisms. Studies of CGD patients with insufficient or lacking NADPH oxidase activity have shown that there are genetic variants for NADPH oxidase. However, there have been no studies to identify genetic variants for NADPH oxidase that produce excessive amounts of reactive oxygen species. If such variants exist and are present in our population, then people who have inherited these genetic variants may be at greater risk for heart attack, stroke, or peripheral vascular disease.

Das membrangebundene Enzym NADPH-Oxidase liegt in ruhenden Zellen in inaktiver Form vor. Nach Störung einer Zelle ordnet sich der Enzymkomplex um und wird in den aktiven Zustand überführt, was die verstärkte Bildung reaktiver Sauerstoffspezies bewirkt (oxydative Explosion). Untersuchungen zur Beschreibung des Aktivierungsmechanismus für die NADPH-Oxidase zeigen, daß ungesättigte Fettsäuren, am wirksamsten die Arachidonsäure, direkt die NADPH-Oxidase aktivieren. Um festzustellen, ob Arachidonsäure die in Endothelzellen gefundene NADPH-Oxidase aktiviert, wurden Untersuchungen durchgeführt, in welchen Zellen direkt steigenden Konzentrationen von Arachidonsäure ausgesetzt und dann die Produktion reaktiver Sauerstoffspezies ermittelt wurden. Für diese Untersuchungen wurden ECs mit 1 bis 25 uM Arachidonsäure inkubiert und die H&sub2;O&sub2;-Produktion gemessen. Es konnte gezeigt werden, daß Arachidonsäure sowohl in ECs eine H&sub2;O&sub2;-Bildung induziert als auch eine höhere Endocytoserate in ECs hervorruft.The membrane-bound enzyme NADPH oxidase is present in an inactive form in resting cells. After a cell is disturbed, the enzyme complex rearranges itself and is converted into the active state, which causes the increased formation of reactive oxygen species (oxidative explosion). Studies to describe the activation mechanism for NADPH oxidase show that unsaturated fatty acids, most effectively arachidonic acid, directly activate NADPH oxidase. To determine whether arachidonic acid activates the NADPH oxidase found in endothelial cells, studies were carried out in which cells were directly exposed to increasing concentrations of arachidonic acid and the production of reactive oxygen species was then determined. For these studies, ECs were incubated with 1 to 25 μM arachidonic acid and H₂O₂ production was measured. It has been shown that arachidonic acid induces H₂O₂ formation in ECs as well as increasing the rate of endocytosis in ECs.

Eine Erklärung für den Zusammenhang von hohem LDL-Wert und Atherosklerose auf der Grundlage der obigen Information ist, daß unter der Einwirkung von hohen LDL-Werten die Aktivierung von Phospholipase A&sub2; gefördert wird. Bei einem intrazellulären Schwellenwert wird die NADPH-Oxidase von der freien Arachidonsäure im Cytosol vom inaktiven in den aktiven Zustand überführt.One explanation for the association between high LDL and atherosclerosis based on the above information is that under the influence of high LDL levels, the activation of phospholipase A2 is promoted. At an intracellular threshold, NADPH oxidase is converted from the inactive to the active state by free arachidonic acid in the cytosol.

Die Ergebnisse aus meinen Untersuchungen zeigen, daß reaktive Sauerstoffspezies eine erhöhte Endocytoserate bewirken, ein charakteristisches merkmal für Atherosklerose, und daß die NADPH-Oxidase die zelluläre Hauptquelle ist. Obwohl behauptet wird, daß NADPH- Oxidase-Inhibitoren bei der Behandlung von Entzündungen wirksam sind, wurden sie bisher noch nicht für eine Behandlung von Krankheiten, wie z. B. Atherosklerose, vorgeschlagen, deren Anfangsstadium durch eine erhöhte Endocytoserate und übermäßige Gefäßdurchlässigkeit gekennzeichnet ist. Beispielsweise wird in der europäischen Patentanmeldung 551 662 die Verwendung von NADPH-Oxidase-Inhibitoren zur Kontrolle von akuten und chronischen Entzündungen der Atemwege, Gelenke und Blutgefäße offenbart. Solche Entzündungen der Gefäße beinhalten solche Arteriosklerosearten, welche von einer Entzündung herrühren, die europäische Anmeldung nimmt jedoch keinen Betug auf Atherosklerose, weil Atherosklerose durch eine Stoffwechselbefindlichkeit und nicht von einer Entzündung ausgelöst wird.The results of my studies show that reactive oxygen species cause an increased rate of endocytosis, a characteristic feature of atherosclerosis, and that NADPH oxidase is the main cellular source. Although NADPH oxidase inhibitors are claimed to be effective in treating inflammation, they have not been have not yet been proposed for the treatment of diseases such as atherosclerosis, the initial stage of which is characterized by an increased rate of endocytosis and excessive vascular permeability. For example, European patent application 551 662 discloses the use of NADPH oxidase inhibitors to control acute and chronic inflammation of the airways, joints and blood vessels. Such inflammation of the vessels includes those types of arteriosclerosis which result from inflammation, but the European application does not refer to atherosclerosis because atherosclerosis is caused by a metabolic condition and not by inflammation.

Die Verwendung von 4-Hydroxy-3-methoxyacetophenon (Trivialname: Apocynin) als NADPH-Oxidase-Inhibitor ist bekannt und wurde zur Behandlung entzündlicher Erkrankungen vorgeschlagen. Apocynin ist ein natürlich vorkommendes Phenol, das aus der Wurzel von Picrorhiza kurroa isoliert wird, einer Pflanze, welche im Himalaya-Gebirge wächst. Extrakte aus Picrorhiza kurroa sind in der traditionellen Medizin in Südostasien zur Behandlung von mit einer Entzündung einhergehenden Krankheiten sowie zur Behandlung einer Vielzahl von Beschwerden, wie Leber- und Lungenerkrankungen, Fieber, Hautverletzungen, Wurminfektionen, rheumatischen Beschwerden, Harnwegserkrankungen, Herzinsuffizienz sowie Schlangen- und Skorpionbissen eingesetzt worden. In einer Schrift jüngeren Datums [Engels und Mitarb., FEBS Lett., 305, 154-56 (1992) wird vorgeschlagen, daß Apocynin auch zur Vorbeugung gegen Thrombose eingesetzt werden kann. Weder für Apocynin noch für einen anderen NADPH-Oxidase-Inhibitor wurde jedoch gezeigt, daß sie gegen Artherosklerose oder übermäßige Gefäßdurchlässigkeit, die auf erhöhte EC-Endocytose und hohe LDL-Konzentrationen zurückzuführen sind, vorbeugend wirksam sind.The use of 4-hydroxy-3-methoxyacetophenone (common name: apocynin) as a NADPH oxidase inhibitor is well known and has been proposed for the treatment of inflammatory diseases. Apocynin is a naturally occurring phenol isolated from the root of Picrorhiza kurroa, a plant that grows in the Himalayan mountains. Extracts from Picrorhiza kurroa have been used in traditional medicine in Southeast Asia to treat diseases associated with inflammation, as well as to treat a variety of ailments, such as liver and lung diseases, fever, skin lesions, worm infections, rheumatic complaints, urinary tract diseases, heart failure, and snake and scorpion bites. A more recent paper [Engels et al., FEBS Lett., 305, 154-56 (1992)] suggests that apocynin may also be used to prevent thrombosis. However, neither apocynin nor any other NADPH oxidase inhibitor has been shown to be effective in preventing atherosclerosis or excessive vascular permeability resulting from increased EC endocytosis and high LDL concentrations.

Ein Verfahren, das gegen Atherosklerose und die damit einhergehenden Krankheiten vorbeugt und diese behandelt, auf welches die meisten Patienten ansprechen und das keine die Patienten abschreckende Nebenwirkungen aufweist, würde einen wesentlichen Fortschritt bei der Überwindung einer Haupttodesursache in diesem Lande darstellen. Ein Verfahren, in dem ein leicht zu bekommendes bereits am Menschen eingesetztes Medikament verwendet wird, würde zusätzliche bedeutende Vorteile bei der Vorbeugung und Behandlung der Atherosklerose und damit verwandter Erkrankungen darstellen. Darüber hinaus ist ein diagnostisches Verfahren zur Vorhersage einer potentiellen Artherosklerosegefahr für Patienten höchst wünschenswert.A method to prevent and treat atherosclerosis and related diseases, to which most patients respond and which does not have side effects that deter patients, would represent a significant advance in overcoming a major cause of death in this country. A method using a readily available drug already used in humans would provide additional significant benefits in the prevention and treatment of atherosclerosis and related diseases. In addition, a A diagnostic procedure to predict a potential risk of atherosclerosis for patients is highly desirable.

Summary of the invention

Die vorliegende Erfindung betrifft die überraschende Entdeckung der wirksamen Verwendung eines NADPH-Oxidase-Inhibitors für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung und Vorbeugung von Artherosklerose bei Säugern.The present invention relates to the surprising discovery of the effective use of a NADPH oxidase inhibitor for the manufacture of a medicament for the treatment and prevention of atherosclerosis in mammals.

Die vorliegende Erfindung betrifft den Gegenstand der Ansprüche.The present invention relates to the subject matter of the claims.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der NADPH-Oxidase-Inhibitor eine Verbindung der Formel In a preferred embodiment of the invention, the NADPH oxidase inhibitor is a compound of the formula

in welcher R¹, R² und R³ unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe H, Alkyl, Cycloalkyl, Heterocycloalkyl, Alkenyl, Alkinyl, Aryl, Heteroaryl, Arylalkyl, Heteroarylalkyl sowie substituiertes Alkyl, Cycloalkyl, Heterocycloalkyl, Alkenyl und Alkinyl.in which R¹, R² and R³ are independently selected from the group H, alkyl, cycloalkyl, heterocycloalkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, heteroaryl, arylalkyl, heteroarylalkyl and substituted alkyl, cycloalkyl, heterocycloalkyl, alkenyl and alkynyl.

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung hat der NADPH-Oxidase- Inhibitor die Formel In another preferred embodiment of the invention, the NADPH oxidase inhibitor has the formula

oder ein Tautomer davon, in welcher R¹, R² und R³ unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe H, Alkyl, Cycloalkyl, Heterocycloalkyl, Alkenyl, Alkinyl, Aryl, Heteroaryl, Arylalkyl, Heteroarylalkyl sowie substituiertes Alkyl, Cycloalkyl, Heterocycloalkyl, Alkenyl und Alkinyl.or a tautomer thereof, in which R¹, R² and R³ are independently selected from the group H, alkyl, cycloalkyl, heterocycloalkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, heteroaryl, Arylalkyl, heteroarylalkyl and substituted alkyl, cycloalkyl, heterocycloalkyl, alkenyl and alkynyl.

In einer bevorzugteren Ausführungsform der Erfindung weist der NADPH-Oxidase-Inhibitor die Formel I, II oder III auf, worin R¹ und R² jeweils für Methyl stehen und R³ durch H repräsentiert wird.In a more preferred embodiment of the invention, the NADPH oxidase inhibitor has the formula I, II or III, wherein R¹ and R² are each methyl and R³ is represented by H .

Verbindungen der Formel I sind weitestgehend käuflich zu erwerben. Solche Verbindungen, die nicht käuflich sind, lassen sich auf herkömmliche Art und Weise mittels Friedels-Crafts- Acylierung eines geeigneten Phenols oder geschützten Phenols, mittels Lithiumaryl-Addition eines geschützten Phenols an die geeignete Carboxylsäure oder mittels Cadmiumaryl- Addition an ein Säurechlorid und nachfolgender Abspaltung der Schutzgruppen sowie mittels jeden bekannten Verfahrens zur Herstellung von Ketonen herstellen.Compounds of formula I are largely commercially available. Those compounds that are not commercially available can be prepared in a conventional manner by Friedel-Crafts acylation of a suitable phenol or protected phenol, by lithium aryl addition of a protected phenol to the appropriate carboxylic acid or by cadmium aryl addition to an acid chloride followed by removal of the protecting groups, and by any known process for preparing ketones.

Andere Verbindungen der Formel II lassen sich analog mittels oxydativer Dimerisierung des geeigneten Phenols herstellen. Alle diese Verbindungen werden leicht und reversibel mittels Oxidation unter Verwendung herkömmlicher Oxidationsmittel, wie z. B. Wasserstoffperoxid, zum entsprechenden Chinon oxidiert.Other compounds of formula II can be prepared analogously by oxidative dimerization of the appropriate phenol. All of these compounds are easily and reversibly oxidized to the corresponding quinone by oxidation using conventional oxidizing agents, such as hydrogen peroxide.

Von übermäßiger Gefäßdurchlässigkeit herrührende Leiden umfassen Atherosklerose und der Atherosklerose verwandete Erkrankungen, einschließlich Herzanfall, Schlag und periphere Gefäßerkrankungen. Verbindungen der Formel I, II oder III sind besonders gut zur Behandlung und Vorbeugung von Atherosklerose geeignet. Unter den Begriffen "Vorbeugung" und "Behandlung" soll nicht verstanden werden, daß die Krankheit oder das Leiden völlig verschwunden sind, sondern lediglich, daß eher eine bestimmte Besserung eintritt, d. h. daß der normale Krankheitsverlauf ganz wesentlich zurückgedrängt wird, so daß sich eine Verbesserung im Vergleich mit der sonst zu erwartenden Symptomatik klinisch erfassen läßt.Conditions resulting from excessive vascular permeability include atherosclerosis and diseases related to atherosclerosis, including heart attack, stroke and peripheral vascular disease. Compounds of formula I, II or III are particularly useful in the treatment and prevention of atherosclerosis. The terms "prevention" and "treatment" are not intended to mean that the disease or condition has completely disappeared, but merely that a certain improvement occurs, i.e. that the normal course of the disease is substantially reduced so that an improvement can be clinically detected compared with the symptoms that would otherwise be expected.

In einer anderen Ausführungsart betrifft die Erfindung ein Verfahren, um bei Patienten die Gefahr für eine Krankheit, z. B. für Atherosklerose, vorherzusagen, die von übermäßiger Durchlässigkeit des Endothels herrührt. Das Verfahren umfaßt die Identifizierung eines Patienten mit erhöhter NADPH-Oxidase-Aktivität. Unter erhöhter NADPH-Oxidas-Aktivität im Sinne der vorliegenden Erfindung wird eine Aktivität definiert, die über 10% des in Paarvergleichen gefundenen Bereichs liegt. Eine solche Identifizierung erfolgt vorzugsweise durch Bestimmung der NADPH-Oxidase-Aktivität in weißen Blutzellen (polymorphkernige Leukocyten) des Patienten. Die NADPH-Oxidase-Aktivität in polymorphkernigen Leukocyten (PMKL) läßt sich mittels Durchflußzytometrie mit Hilfe von 2,7- Dichlorfluoresceindiacetat als Indikator bestimmen. Nach der Identifizierung eines solchen Patienten kann die Verabreichung eines NADPH-Oxidase-Inhibitors, wie z. B. Apocynin, zur Vorbeugung und Behandlung von Atherosklerose und verwandter Erkrankungen angezeigt sein.In another embodiment, the invention relates to a method for predicting in patients the risk of a disease, e.g. atherosclerosis, resulting from excessive permeability of the endothelium. The method comprises identifying a patient with increased NADPH oxidase activity. Increased NADPH oxidase activity For the purposes of the present invention, an activity is defined which is above 10% of the range found in paired comparisons. Such identification is preferably carried out by determining the NADPH oxidase activity in white blood cells (polymorphonuclear leukocytes) of the patient. The NADPH oxidase activity in polymorphonuclear leukocytes (PMKL) can be determined by flow cytometry using 2,7-dichlorofluorescein diacetate as an indicator. After identifying such a patient, the administration of an NADPH oxidase inhibitor, such as apocynin, may be indicated for the prevention and treatment of atherosclerosis and related diseases.

In jeder Ausführungsform der Erfindung soll ein NADPH-Oxidase-Inhibitor Verbindungen enthalten, welche selbst NADPH-Oxidase-Inhibitoren sind sowie Verbindungen, die hierzu im Stoffwechsel Vorläufersubstanzen (d. h. Prodrugs) darstellen. Das Wirkprinzip besteht in der Hemmung der NADPH-Oxidase infolge der Verwendung der jeweiligen Verbindung.In each embodiment of the invention, a NADPH oxidase inhibitor should contain compounds which are themselves NADPH oxidase inhibitors as well as compounds which are metabolic precursors (i.e. prodrugs). The active principle consists in the inhibition of NADPH oxidase as a result of the use of the respective compound.

Definitions

Die folgenden Begriffe haben durchwegs die angezeigte Bedeutung:The following terms have the meaning indicated throughout:

Unter "Alkyl" sollen lineare, verzweigte oder cyclische Kohlenwasserstoffreste oder Kombinationen davon verstanden werden. "Niederalkyl" bedeutet Alkyl-Gruppen mit 1 bis 8 C-Atomen. Beispiele für Niederalkyl-Gruppen sind die Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Isopropyl-, Butyl-, s- und t-Butyl-, Pentyl-, Hexyl-, Octyl-, Cyclopropylethyl-, Bornyl-Gruppe. Bevorzugte Alkyl-Gruppen sind solche mit C&sub2;&sub0; oder darunter."Alkyl" is understood to mean linear, branched or cyclic hydrocarbon radicals or combinations thereof. "Lower alkyl" means alkyl groups with 1 to 8 C atoms. Examples of lower alkyl groups are the methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, s- and t-butyl, pentyl, hexyl, octyl, cyclopropylethyl and bornyl groups. Preferred alkyl groups are those with C₂₀ or below.

"Cycloalkyl" ist ein Unterbegriff von Alkyl und umfaßt cyclische Kohlenwasserstoff-Gruppen von 3 bis 8 Kohlenstoffatomen. Beispiele für niedrige Cycloalkyl-Gruppen sind c-Propyl, c- Butyl-, c-Pentyl, Norbornyl."Cycloalkyl" is a sub-term of alkyl and includes cyclic hydrocarbon groups of 3 to 8 carbon atoms. Examples of lower cycloalkyl groups are c-propyl, c-butyl, c-pentyl, norbornyl.

"Heterocycloalkyl" bedeutet eine Cycloalkyl-Gruppe, in welcher eine bis zwei Methylen (CH&sub2;)-Gruppen durch ein Heteroatom, wie z. B. NR (mit R = H oder Alkyl), S oder dergl. ersetzt ist. Beispiele für eine Heterocycloalkyl-Gruppe sind Tetrahydrofuranyl, Piperidin, Dioxanyl."Heterocycloalkyl" means a cycloalkyl group in which one to two methylene (CH₂) groups are replaced by a heteroatom such as NR (where R = H or alkyl), S or the like. Examples of a heterocycloalkyl group are tetrahydrofuranyl, piperidine, dioxanyl.

"Alkenyl" umfaßt ungesättigte C&sub2;&submin;&sub8;-Kohlenwasserstoffe von linearer, verzweigter oder cyclischer (C&sub5;&submin;&sub6;) Konfiguration sowie Kombinationen davon. Beispiele für Alkenyl-Gruppen sind die Vinyl-, Allyl-, Isopropenyl-, Pentenyl-, Hexenyl-, c-Hexenyl-, 1-Propenyl-, 2- Butenyl- 2-Methyl-2-butenyl-Gruppe."Alkenyl" includes unsaturated C2-8 hydrocarbons of linear, branched or cyclic (C5-6) configuration and combinations thereof. Examples of alkenyl groups are vinyl, allyl, isopropenyl, pentenyl, hexenyl, c-hexenyl, 1-propenyl, 2-butenyl, 2-methyl-2-butenyl.

"Alkinyl" umfaßt C&sub2;&submin;&sub8;-Kohlenwasserstoffe von linearer oder verzweigter Konfiguration sowie Kombinationen davon mit mindestens einer Kohlenstoff-Kohlenstoff-Dreifachbindung. Beispiele für Alkinyl-Gruppen sind Ethin, Propin, Butin, Pentin, 3-Methyl-1-butin, 3,3- Dimethyl-1-butin."Alkynyl" includes C2-8 hydrocarbons of linear or branched configuration and combinations thereof having at least one carbon-carbon triple bond. Examples of alkynyl groups are ethyne, propyne, butyne, pentyne, 3-methyl-1-butyne, 3,3- dimethyl-1-butyne.

"Aryl" und "Heteroaryl" umfassen einen 5- bis 6-gliedrigen aromatischen oder heteroaromatischen Ring mit 0 bis 3 Heteroatomen, ausgewählt aus der Gruppe O, N und S; ein bicyclisches 9- oder 10-gliedriges aromatisches oder heteroaromatisches Ringsystem mit 0 bis 3 Heteroatomen, ausgewählt aus der Gruppe O, N und S; oder ein tricyclisches 13- oder 14-gliedriges aromatisches oder heteroaromatisches Ringsystem mit 0 bis 3 Heteroatomen, ausgewählt aus der Gruppe O, N und S; wobei jeder dieser Ringe wahlweise mit 1-3 Niederalkyl, substituiertem Alkyl, substituiertem Alkinyl, =O, -NO&sub2;, Halogen, Hydroxy, Alkoxy, -OCH(COOH)&sub2;, Cyano, -NR&sup4;R&sup4; (worin R&sup4; unabhängig voneinander H, Niederalkyl oder Cycloalkyl sind, und -R&sup4;R&sup4; zur Ausbildung eines cyclischen Ringes mit N miteinander verbunden sein können), Acylamino, Phenyl, Benzyl, Phenoxy, Benzyloxy, Heteroaryl oder Heteroaryloxy substituiert sein kann; wobei jede dieser Phenyl-, Benzyl-, Phenoxy-, Benzyloxy-, Heteroaryl- und Heteroaryloxy-Gruppen wahlweise mit 1-3 Substituenten, ausgewählt aus der Gruppe Niederalkyl, Alkenyl, Alkinyl, Halogen, Hydroxy, Alkoxy, Cyano, Phenyl, Benzyl, Benzyloxy, Carboxamido, Heteroaryl, Hetroaryloxy, -NO&sub2; und -NR&sup4;R&sup4; substituiert sein kann. Die aromatischen 6- bis 14-gliedrigen carbocyclischen Ringe umfassen beispielsweise Imidazol, Pyridin, Indol, Thiophen, Benzopyranon, Thiazol, Furan, Benzimidazol, Chinolin, Isochinolin, Cinoxalin, Pyrimidin, Pyrazin, Tetrazol und Pyrazol."Aryl" and "heteroaryl" include a 5- to 6-membered aromatic or heteroaromatic ring having 0 to 3 heteroatoms selected from the group O, N and S; a bicyclic 9- or 10-membered aromatic or heteroaromatic ring system having 0 to 3 heteroatoms selected from the group O, N and S; or a tricyclic 13- or 14-membered aromatic or heteroaromatic ring system having 0 to 3 heteroatoms selected from the group O, N and S; each of these rings optionally being substituted with 1-3 lower alkyl, substituted alkyl, substituted alkynyl, =O, -NO₂, halogen, hydroxy, alkoxy, -OCH(COOH)₂, cyano, -NR⁴R⁴ (wherein R⁴ are independently H, lower alkyl or cycloalkyl, and -R⁴R⁴ may be joined together to form a cyclic ring with N), acylamino, phenyl, benzyl, phenoxy, benzyloxy, heteroaryl or heteroaryloxy; each of these phenyl, benzyl, phenoxy, benzyloxy, heteroaryl and heteroaryloxy groups may optionally be substituted with 1-3 substituents selected from the group consisting of lower alkyl, alkenyl, alkynyl, halogen, hydroxy, alkoxy, cyano, phenyl, benzyl, benzyloxy, carboxamido, heteroaryl, heteroaryloxy, -NO₂ and -NR⁴R⁴. The aromatic 6- to 14-membered carbocyclic rings include, for example, imidazole, pyridine, indole, thiophene, benzopyranone, thiazole, furan, benzimidazole, quinoline, isoquinoline, cinoxaline, pyrimidine, pyrazine, tetrazole and pyrazole.

"Alkoxy" betrifft Gruppen von 1 bis 8 Kohlenstoffatomen von gerader, verzweigter oder cyclischer Konfiguration sowie Kombinationen davon. Beispiele hierfür sind Methoxy, Ethoxy, Propoxy, Isopropoxy, Cyclopropyloxy, Cyclohexyloxy."Alkoxy" refers to groups of 1 to 8 carbon atoms of straight, branched or cyclic configuration and combinations thereof. Examples are methoxy, ethoxy, propoxy, isopropoxy, cyclopropyloxy, cyclohexyloxy.

"Acylamino" betrifft Gruppen von 1 bis 8 Kohlenstoffatomen von gerader, verzweigter oder cyclischer Konfiguration sowie Kombinationen davon. Beispiele hierfür sind Acetylamino, Butylamino, Cyclohexylamino."Acylamino" refers to groups of 1 to 8 carbon atoms of straight, branched or cyclic configuration and combinations thereof. Examples are acetylamino, butylamino, cyclohexylamino.

"Halogen" steht für F, Cl, Br oder J."Halogen" stands for F, Cl, Br or J.

"Arylalkyl" steht für einen Aryl-Ring mit angeheftetem Alkyl-Rest. Beispiele hierfür sind Benzyl, Phenethyl."Arylalkyl" stands for an aryl ring with an attached alkyl radical. Examples of this are benzyl, phenethyl.

"Heteroarylalkyl" steht für einen Heteroaryl-Ring mit angeheftetem Alkyl-Rest. Beispiele hierfür sind Pyridinylmethyl, Pyrimidinylethyl."Heteroarylalkyl" stands for a heteroaryl ring with an attached alkyl radical. Examples of this are pyridinylmethyl, pyrimidinylethyl.

"Substituierter" Alkyl, Cycloalkyl, Heterocycloalkyl, Alkenyl oder Alkinyl betrifft einen Alkyl-, Cycloalkyl-, Heterocycloalkyl-, Alkenyl- oder Alkinyl-Rest, in welchem bis zu 3 H- Atome eines jeden C-Atoms durch Halogen, Hydroxy, Niederalkoxy, Carboxy, Carboalkoxy, Carboxamido, Cyano, Carbonyl, -NO&sub2;, -NR&sup5;R&sup5; (in welchem R&sup5; für H, Alkyl oder Arylalkyl steht), Alkylthio, Sulfoxid, Sulfon, Acylamino, Amidino, Phenyl, Benzyl, Heteroacyl, Phenoxy, Benzyloxy, Heteroaryloxy und substituiertes Phenyl, Benzyl, Heteroaryl, Phenoxy, Benzyloxy oder Heteroaryloxy ersetzt sind."Substituted" alkyl, cycloalkyl, heterocycloalkyl, alkenyl or alkynyl refers to an alkyl, cycloalkyl, heterocycloalkyl, alkenyl or alkynyl radical in which up to 3 H atoms of each C atom are replaced by halogen, hydroxy, lower alkoxy, carboxy, carboalkoxy, carboxamido, cyano, carbonyl, -NO₂, -NR⁵R⁵ (in which R⁵ is H, alkyl or arylalkyl), alkylthio, sulfoxide, sulfone, acylamino, amidino, phenyl, benzyl, heteroacyl, phenoxy, benzyloxy, heteroaryloxy and substituted phenyl, benzyl, heteroaryl, phenoxy, benzyloxy or heteroaryloxy.

Short description of the drawings

Diese und andere Gegenstände, Merkmale und Vorteile der Erfindung lassen sich aus der folgenden genauen Beschreibung im Kontext mit den anliegenden Zeichnungen entnehmen.These and other objects, features and advantages of the invention will become apparent from the following detailed description taken in conjunction with the accompanying drawings.

Fig. 1 ist eine graphische Darstellung der optischen Dichte aus der Fluoreszenzspektroskopie, bestimmt als "ILIGV" pro Zelle für vier Testgruppen von Endothelzellen; gezeigt wird die Wirkung von Apocynin auf die bei hoher Konzentration von LDL erfolgende Induktion der Peroxidproduktion von Endothelzellen;Fig. 1 is a graphical representation of the optical density from fluorescence spectroscopy determined as "ILIGV" per cell for four test groups of endothelial cells, showing the effect of apocynin on the induction of peroxide production by endothelial cells at high concentrations of LDL;

Fig. 2 ist eine graphische Darstellung der Fluoreszenz pro 10&sup5; Zellen für 4 Testgruppen von Endothelzellen; gezeigt wird die Wirkung von Apocynin auf die bei hoher Konzentration von LDL erfolgende Induktion der Endocytose bei Endothelzellen;Figure 2 is a graph of fluorescence per 105 cells for 4 test groups of endothelial cells showing the effect of apocynin on the induction of endocytosis in endothelial cells at high concentrations of LDL;

Fig. 3 ist eine graphische Darstellung der optischen Dichte aus der Fluoreszenzspektroskopie, bestimmt als "ILIGV" pro Zelle für vier Testgruppen von Endothelzellen; gezeigt wird die Wirkung von Apocynin auf die durch Arachidonsäure erfolgende Induktion der Peroxidproduktion von Endothelzellen;Figure 3 is a graph of optical density from fluorescence spectroscopy determined as "ILIGV" per cell for four test groups of endothelial cells showing the effect of apocynin on arachidonic acid-induced induction of peroxide production by endothelial cells;

Fig. 4 ist die gedruckte Reproduktion einer Mikrophotographie eines Ausschnitts der Bauchschlagader eines mit einer Diät von hohem Cholesteringehalt gefütterten Kaninchens;Fig. 4 is a printed reproduction of a photomicrograph of a section of the abdominal aorta of a rabbit fed a high cholesterol diet;

Fig. 5 ist die gedruckte Reproduktion einer Mikrophotographie eines Ausschnitts der Bauchschlagader eines mit einer Diät von hohem Cholesteringehalt gefütterten Kaninchens, dem erfindungsgmäß Apocynin verabreicht wurde;Figure 5 is a printed reproduction of a photomicrograph of a section of the abdominal aorta of a rabbit fed a high cholesterol diet and administered apocynin according to the invention;

Fig. 6 ist ein Balkendiagramm und zeigt den prozentualen Zuwachs der H&sub2;O&sub2;- Produktion (d. h. die Erhöhung der Oxidase-Aktivität) für jeweils 22 Patienten mit Atherosklerose gegenüber einem Paarvergleich.Figure 6 is a bar graph showing the percentage increase in H2O2 production (i.e., increase in oxidase activity) for each of 22 patients with atherosclerosis versus a paired comparison.

Fig. 7 ist die gedruckte Reproduktion eines Western-Blots der Cytosol- und Membranfraktionen aus Endothelkontrollzellen, Endothelzellen, die PMA ausgesetzt wurden und Endothelzellen, die PMA ausgesetzt und mit 100 ug/ml Apocynin behandelt wurden; zu erkennen ist das Fehlen von p47[phox] in der Membranfraktion; undFigure 7 is a printed reproduction of a Western blot of the cytosol and membrane fractions from control endothelial cells, endothelial cells exposed to PMA, and endothelial cells exposed to PMA and treated with 100 ug/ml apocynin, showing the absence of p47[phox] in the membrane fraction; and

Fig. 8 ist eine graphische Darstellung, in welcher in Gegenwart und Abwesenheit von Apocynin und gereinigtem Apocynin-Dimer die Erzeugung von O&sub2;&supmin; durch Schallwellenbehandlung von Endothelzellen aus ganzen Zellen als Reaktion auf Arichidonsäure gezeigt wird.Fig. 8 is a graphical representation in which in the presence and absence of Apocynin and purified apocynin dimer demonstrate the generation of O₂⁻ by acoustic wave treatment of whole cell endothelial cells in response to arichidonic acid.

Während man glaubt, daß viele der bekannten NADPH-Oxidase-Inhibitoren über eine Wechselwirkung mit dem vereinigten aktiven Komplex wirken, soll der hier verwendete Begriff NADPH-Oxidase-Inhibitor nicht auf einen bestimmten Mechanismus festgelegt werden. Jede Substanz, welche die von NADPH-Oxidase katalysierte Bildung von reaktiven Sauerstoffapezies zu hemmen vermag, fällt unter den Begriff "NADPH-Oxidase-Inhibitor".While many of the known NADPH oxidase inhibitors are believed to act via interaction with the combined active complex, the term NADPH oxidase inhibitor as used here is not intended to be tied to a specific mechanism. Any substance that can inhibit the formation of reactive oxygen species catalyzed by NADPH oxidase falls under the term "NADPH oxidase inhibitor".

In vitro experiments with apocynin

Die Experimente wurden in vitro unter Verwendung von Kultursystemen aus Endothelzellgewebe mit hoher LDL-Konzentration durchgführt. Endothelzellen wurden aus menschlichen Nabelschnurvenen isoliert und unter Zusatz von LDL -Medium in Reagenzgläser gegeben. Die Verbindungen und Chemikalien für die Gewebskulturen sind zu kaufen und wurden von Sigma, Worthington, and Gibco erworben. LDL wurde aus menschlichem Blutplasma isoliert. Apocynin kann von Carl Roth GmbH (Deutschland) bezogen werden.Experiments were performed in vitro using endothelial tissue culture systems with high LDL concentration. Endothelial cells were isolated from human umbilical veins and placed in test tubes with the addition of LDL medium. Compounds and chemicals for tissue culture are commercially available and were purchased from Sigma, Worthington, and Gibco. LDL was isolated from human blood plasma. Apocynin can be purchased from Carl Roth GmbH (Germany).

Es wurden Untersuchungungen unter Verwendung von Apocynin durchgeführt, um die NADPH-Oxidase-Aktivierung zu hemmen und damit eine erhöhte Endocytose zu verhindern. Apocynin tritt mit einem funktionellen NADPH-Oxidase-Enzymkomplex insgesamt in Wechselwirkung. Für die Untersuchungen mit Apocynin wurden ECs mit 240 mg/dl LDL- Cholesterin in Gegenwart und Abwesenheit von 100 ug/ml Apocynin inkubiert. Wie in den Fig. 1 und 2 wiedergegeben, hemmt Apocynin wirksam (1) die Induktion der H&sub2;O&sub2;&supmin; Produktion sowie (2) mit hohen LDL-Konzentrationen einhergehende Änderungen der Endocytose.Studies were conducted using apocynin to inhibit NADPH oxidase activation and thereby prevent increased endocytosis. Apocynin interacts with a functional overall NADPH oxidase enzyme complex. For the apocynin studies, ECs were incubated with 240 mg/dL LDL cholesterol in the presence and absence of 100 μg/mL apocynin. As shown in Figures 1 and 2, apocynin effectively inhibits (1) the induction of H2O2- production and (2) changes in endocytosis associated with high LDL concentrations.

Wie oben beschrieben, wird die NADPH-Oxidase in ECs direkt von Arachidonsäure aktiviert, indem es die H&sub2;O&sub2;-Erzeugung in ECs induziert; werden ECs der Arachidonsäure ausgesetzt, wird dadurch eine Erhöhung der Endocytoserate bei ECs noch beschleunigt.As described above, NADPH oxidase in ECs is directly activated by arachidonic acid, by inducing H2O2 production in ECs; exposure of ECs to arachidonic acid further accelerates an increase in the endocytosis rate in ECs.

Eine weitere Unterstützung dafür, daß die von Arachidonsäure induzierte oxidative Explosion sich aus Aktivierung der NADPH-Oxidase ergibt, erschließt sich aus den Ergebnissen der folgenden Untersuchung, in welcher Apocynin zur Blockierung der NADPH-Oxidase- Aktivierung eingesetzt wurde. ECs wurden mit 10 uM Arachidonsäure in Gegenwart und Abwesenheit von 100 ug/ml Apocynin inkubiert. Fig. 3 zeigt, daß Apocynin die von Arachidonsäure induzierte H&sub2;O&sub2;-Bildung in ECs deutlich reduziert.Further support that the oxidative burst induced by arachidonic acid results from activation of NADPH oxidase comes from the results of the following study in which apocynin was used to block NADPH oxidase activation. ECs were incubated with 10 µM arachidonic acid in the presence and absence of 100 µg/ml apocynin. Figure 3 shows that apocynin significantly reduces arachidonic acid-induced H₂O₂ formation in ECs.

Es konnte gezeigt werden, daß es eine Lag-Zeit von ca. zwei Minuten gibt, bevor Apocynin zur Hemmung der NADPH-Oxidase-Aktivität zu wirken beginnt. Diese Verzögerung kommt von der Zeit, die erforderlich ist, daß Apocynin in einer chemischen Reaktion unter Mitwirkung des ROS und Peroxidase zu einem aktiven Produkt verstoffwechselt wird. Im Anschluß an diese Verzögerung ist die ROS-Produktion in der Zelle nahezu vollständig gehemmt.It has been shown that there is a lag time of approximately two minutes before apocynin begins to act to inhibit NADPH oxidase activity. This delay is due to the time required for apocynin to be metabolized into an active product in a chemical reaction involving ROS and peroxidase. Following this delay, ROS production in the cell is almost completely inhibited.

Als aktives Stoffwechselprodukt des Apocynins wurde ein Dimer mit chinonähnlicher Struktur identifiziert, das aus der Oxidation des Stoffwechsels stammt. Es wurden Untersuchungen durchgeführt, um die von der Beschallung von ECs hervorgerufene ROS- Produktion in Reaktion auf Arachidonsäure in Gegenwart und Abwesenheit des gereinigten Apocynin-Dimers zu erforschen. Wie in Fig. 8 wiedergegeben, gab es keine Lag-Zeit für die nahezu vollständige Hemmung der ROS-Bildung in Gegenwart des gereinigten Apocynin- Dimers. Dimerisierung von Apocynin A dimer with a quinone-like structure derived from metabolic oxidation was identified as the active metabolite of apocynin. Studies were conducted to investigate the ROS production induced by sonication of ECs in response to arachidonic acid in the presence and absence of the purified apocynin dimer. As shown in Fig. 8, there was no lag time for the almost complete inhibition of ROS formation in the presence of the purified apocynin dimer. Dimerization of apocynin

Synthesis and isolation of the apocynin dimer I. Synthesis

Eine wässrige Lösung von 0,02 mg/ml Apocynin wird zubereitet, indem 10 mg Apocynin in 500 ml destilliertem Wasser aufgelöst werden. Die Endmolarität der Lösung ist 1,2 10&supmin;&sup4; M. Eine 3% (m/m) H&sub2;O&sub2;-Lösung wird zubereitet, indem 1 ml 30% H&sub2;O&sub2; (m/m, 9,8 M) mit destilliertem Wasser auf 10 ml verdünnt werden. Die Endmolarität der Lösung ist 0,98 M. Eine Lösung von 0,1 mg/ml Meerrettichperoxidase (MRP) wird zubereitet, indem 5 mg feste MRP in 50 ml destilliertem Wasser gelöst werden.An aqueous solution of 0.02 mg/ml apocynin is prepared by dissolving 10 mg apocynin in 500 ml distilled water. The final molarity of the solution is 1.2 10-4 M. A 3% (m/m) H₂O₂ solution is prepared by diluting 1 ml of 30% H₂O₂ (m/m, 9.8 M) to 10 ml with distilled water. The final molarity of the solution is 0.98 M. A solution of 0.1 mg/ml horseradish peroxidase (MRP) is prepared by dissolving 5 mg of solid MRP in 50 ml distilled water.

100 ml der Apocynin-Lösung von 0,02 mg/ml wird mit 100 ul (abgemessen mit einer Mikropipette) der MRP-Lösung von 0,1 mg/ml in einem reinen, trockenen Erlenmeyerkolben vereinigt. Mit Hilfe eines Magnetfischrührers wird die Lösung leicht gerührt. Durch Zugabe von 24 ul (abgemessen mit einer Mikropipette) der 3% H&sub2;O&sub2;-Lösung wird die Reaktion gestartet. Nach 10 Sekunden wird die Reaktionsmischung durch Zugabe von 1,5 ml 0,1 M Na&sub2;S&sub2;O&sub3; desaktiviert. Die Lösung wird sodann 2 Minuten lang heftig gerührt und am Ende dann das pH der Lösung durch Zugabe von 5 Tropfen 3 M H&sub2;SO&sub4; auf 3 bis 4 gesenkt.100 ml of the apocynin solution 0.02 mg/ml is combined with 100 μl (measured with a micropipette) of the MRP solution 0.1 mg/ml in a clean, dry Erlenmeyer flask. The solution is gently stirred using a magnetic stirrer. The reaction is started by adding 24 μl (measured with a micropipette) of the 3% H₂O₂ solution. After 10 seconds, the reaction mixture is deactivated by adding 1.5 ml of 0.1 M Na₂S₂O₃. The solution is then vigorously stirred for 2 minutes and at the end the pH of the solution is lowered to 3 to 4 by adding 5 drops of 3 M H₂SO₄.

Die desaktivierte Reaktionsmischung wird dann in zwei Anteile von 50 ml aufgeteilt. Jeder Anteil wird zweimal mit Diethylether (2 · 15 ml) extrahiert und die Ertherphasen vereinigt. Die vereinigten Etherextrakte werden 10 Minuten über einer Mindestmenge von wasserfreiem MgSO&sub4; getrocknet und dann gefiltert. Der Ether wird im Rotationsverdampfer abgezogen und das erhaltene Produkt, vor allem eine Mischung aus Apocynin und Apocynin-Dimer, in CDCl&sub3; für eine Analyse mittels ¹H-NMR-Spektroskopie aufgenommen.The deactivated reaction mixture is then divided into two 50 mL portions. Each portion is extracted twice with diethyl ether (2 x 15 mL) and the ether phases are combined. The combined ether extracts are dried over a minimum amount of anhydrous MgSO4 for 10 minutes and then filtered. The ether is removed in a rotary evaporator and the product obtained, mainly a mixture of apocynin and apocynin dimer, is taken up in CDCl3 for analysis by 1H NMR spectroscopy.

II. Isolation

Nach Analyse mittels ¹H-NMR wird das CDCl&sub3; im Rotationsverdampfer abgezogen und die Rohproduktmischung in einem minimalen Volumen Methanol für die HPLC (< 1 ml) gelöst. Bei Vorkommen suspendierter Teilchen wird, vor dem Auftragen auf die HPLC-Säule, ein Spritzenfilter mit Nylonmembran zum Filtern der Lösung verwendet. Zu Isolierung des Dimeren wird im präparativen Betrieb eine mit einem UV-Detektor ausgestattete Reversedphase-HPLC-Säule (C 18) eingesetzt. Die mobile Phase ist ein Methanol : Acetat (50 : 50)- Puffer (pH=4) und zum Nachweis wird eine Wellenlänge von 260 nm benutzt.After analysis by ¹H-NMR, the CDCl₃ is removed in a rotary evaporator and the crude product mixture is dissolved in a minimum volume of methanol for HPLC (< 1 ml). If suspended particles are present, a Syringe filters with nylon membrane are used to filter the solution. To isolate the dimer, a reversed phase HPLC column (C 18) equipped with a UV detector is used in preparative operation. The mobile phase is a methanol:acetate (50:50) buffer (pH=4) and a wavelength of 260 nm is used for detection.

Methanol wird aus der das Dimer enthaltenden gesammelten Präparatelösung (10 bis 20 ml) im Rotationsverdampfer abgezogen (ca. 1 Stunde).Methanol is removed from the collected preparation solution containing the dimer (10 to 20 ml) in a rotary evaporator (approx. 1 hour).

Eine Filterkartusche für Festphasenextraktion (Alltech C 18 500mg - 3 ml) wird vorbereitet, indem 10 ml Methanol für HPLC gefolgt von 10 ml destilliertem Wasser durch den Filter gezogen werden. Sodann gibt man die gestrippte Präparatelösung über den Filter gefolgt von 4 ml destilliertem Waschwasser. Den Filter läßt man ca. 10 Minuten trocknen, dann werden gleiche Anteile von Methanol für HPLC über die Säule gegeben und gesammelt (5 · 5 ml). Das Methanol wird im Rotationsverdampfer abgezogen und das isolierte Dimer in 3 ml CDCl&sub3; aufgenommen. Das Dimer wird sodann mittels ¹H-NMR-Spektroskopie analysiert. Redoxreaktion für das Dimere des Apocynins A filter cartridge for solid phase extraction (Alltech C 18 500mg - 3 ml) is prepared by passing 10 ml of HPLC methanol followed by 10 ml of distilled water through the filter. The stripped preparation solution is then passed over the filter followed by 4 ml of distilled wash water. The filter is allowed to dry for about 10 minutes, then equal portions of HPLC methanol are passed over the column and collected (5 x 5 ml). The methanol is removed in a rotary evaporator and the isolated dimer is taken up in 3 ml of CDCl₃. The dimer is then analyzed by ¹H-NMR spectroscopy. Redox reaction for the dimer of apocynin

Obwohl der Anmelder nicht darauf festgelegt zu werden wünscht, scheint das Apocynin doch ein Stoffwechselvorläufer für die Spezies zu sein, welche die NADPH-Oxidase aktiv hemmt.Although the applicant does not wish to be bound, apocynin appears to be a metabolic precursor for the species that actively inhibits NADPH oxidase.

Um weiter Einsicht in den Mechanismus der NADPH-Oxidase-Aktivierung zu erhalten, wurden zusätzliche Untersuchungen angestellt. Das Zellenzym Phospholipase A&sub2; (PLA&sub2;) hydrolysiert Phospholipide der Membran, wodurch in der Zelle Arachidonsäure freigesetzt wird. Eine Hemmung von PLA&sub2; durch deren Antagonisten p-Bromphenacylbromid (BPB) unterdrückt die Erhöhung an frei im Cytosol vorkommender Arachidonsäure und begrenzt diesen Second-messenger für die Aktivierung der NADPH-Oxidase. Somit führt eine Hemming der PLA&sub2; zur Blockierung der NADPH-Oxidase-Aktivierung in LDL-ECs. In diesen Untersuchungen wurden ECs 240 mg/dl LDL-Cholesterin mit und ohne 10 uM BPB ausgesetzt. BPB verminderte deutlich die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies in LDL-ECs.To gain further insight into the mechanism of NADPH oxidase activation, additional investigations were carried out. The cell enzyme phospholipase A₂ (PLA₂) hydrolyses membrane phospholipids, thereby releasing arachidonic acid in the cell. Inhibition of PLA₂ by its antagonist p-bromophenacyl bromide (BPB) suppresses the increase in free arachidonic acid in the cytosol and limits this second messenger for the activation of NADPH oxidase. Thus, Inhibition of PLA2 to block NADPH oxidase activation in LDL-ECs. In these studies, ECs were exposed to 240 mg/dl LDL cholesterol with and without 10 μM BPB. BPB significantly reduced the formation of reactive oxygen species in LDL-ECs.

PLA&sub2; ist ein Ca²&spplus;-abhängiges Enzym. Ca²&spplus; wird auch in intakten Zellen für eine Aktivierung der NADPH-Oxidase benötigt. Die PLA&sub2;-vermittelte Freisetzung von Arachidonsäure verläuft parallel zur Ca²&spplus;-Konzentration außerhalb der Zelle. Es wurden Untersuchungen angestellt, um zu ermitteln, ob LDL-ECs einen erhöhten Ca²&spplus;-Zustrom aufweisen. In diesen Untersuchungen wurden ECs mit steigenden LDL-Konzentrationen (30 bis 240 mg/dl Cholesterin) inkubiert und der Ca²&spplus;-Zustrom in die Zelle, wie in J. Clin. Invest., 82, 2045- 2055(1988) beschrieben mit einem &sup4;&sup5;Ca²&spplus;-Uptake Assay gemessen. Es wurde gefunden, daß LDL-ECs eine dosisabhängige Erhöhung des Ca²&spplus;-Zustroms in die Zelle bewirken. Werden ECs H&sub2;O&sub2; ausgesetzt, kann LDL den Ca²+-Zustrom induzieren, wodurch die Zelle für Ca²&spplus; durchlässig gemacht wird und einen Anstieg der Ca²&spplus;-Konzentration innerhalb der Zelle zur Folge hat.PLA₂ is a Ca2+-dependent enzyme. Ca2+ is also required in intact cells for activation of NADPH oxidase. PLA₂-mediated release of arachidonic acid parallels the Ca2+ concentration outside the cell. Studies were conducted to determine whether LDL-ECs exhibit increased Ca2+ influx. In these studies, ECs were incubated with increasing LDL concentrations (30 to 240 mg/dl cholesterol) and Ca2+ influx into the cell was measured using a 45 Ca2+ uptake assay as described in J. Clin. Invest., 82, 2045-2055(1988). LDL-ECs have been found to cause a dose-dependent increase in Ca2+ influx into the cell. When ECs are exposed to H2O2, LDL can induce Ca2+ influx, thereby making the cell permeable to Ca2+ and resulting in an increase in Ca2+ concentration within the cell.

Die obigen in vitro-Untersuchungen zeigten, daß atherogene LDL-Spiegel eine erhöhte Endocytose an ECs induzieren und daß, vorzugsweise von NADPH-Oxidase produzierte, reaktive Sauerstoffspezies eine erhöhte Endocytose an ECs auslösen. Ohne sich auf eine besondere Theorie festlegen zu lassen, kann man auf Grundlage der obigen in vitro- Untersuchungen die Hypothese aufstellen, daß von aktivierter NADPH-Oxidase in ECs gebildete reaktive Sauerstoffspezies durch erhöhte Endocytose in ECs eine von einem erhöhten Cholesteringehalt induzierte übermäßige Gefäßdurchlässigkeit regulieren.The above in vitro studies showed that atherogenic LDL levels induce increased endocytosis of ECs and that reactive oxygen species produced preferentially by NADPH oxidase trigger increased endocytosis of ECs. Without being bound to a particular theory, one can hypothesize on the basis of the above in vitro studies that reactive oxygen species produced by activated NADPH oxidase in ECs regulate excessive vascular permeability induced by increased cholesterol content through increased endocytosis in ECs.

Unter Einfluß hoher Konzentrationen an LDL wird anfangs die Phospholipase A&sub2;-Aktivität aktiviert, was aus Phosphpolipiden Arachidonsäure freisetzt. Freie Arachidonsäure im Cytoplasma wandelt bei einem Schwellenwert eine inaktive genetische Variante der NADPH- Oxidase in die aktive Form um. Diese genetische NADPH-Oxidase-Variante erzeugt höhere Mangen an reaktiven Sauerstoffspezies, welche die Zellmembran stören und für eine erhöhte PLA&sub2;-Aktivierung sorgen. Die PLA&sub2;-Aktivierung wird weiter durch den von reaktiven Sauerstoffspezies vermittelten Ca²&spplus;-Zustrom in die Zelle erhöht. Die aus Membranphospholipiden freigesetzte Arachidonsäure steigert deutlich die Rekrutierung und das Zusammentreten des NADPH-Oxidase-Enzymkomplexes. Die mehrfachen, membrangebundenen, zusammengetretenen Enzymkomplexe erzeugen außerordentlich große Mengen der reaktiven Sauerstoffspezies O²&supmin; und H&sub2;O&sub2;. Diese reaktiven Sauerstoffspezies erhöhen die Membranfluidität und erniedrigen die Aktivierungsenergie für Endocytose. Die Kombination dieser von LDL induzierten Zellereignisse haben eine gesteigerte Endocytose bei ECs, eine übermäßige Gefäßdurchlässigkeit und über Transcytose einen erhöhten Transport durch die Zelle zur Folge.Under the influence of high concentrations of LDL, phospholipase A₂ activity is initially activated, releasing arachidonic acid from phospholipids. Free arachidonic acid in the cytoplasm converts an inactive genetic variant of NADPH oxidase into the active form at a threshold level. This genetic NADPH oxidase variant generates higher levels of reactive oxygen species, which disrupt the cell membrane and cause increased PLA₂ activation. PLA₂ activation is further increased by the influx of Ca2+ into the cell mediated by reactive oxygen species. Arachidonic acid released from membrane phospholipids significantly increases the recruitment and assembly of the NADPH oxidase enzyme complex. The multiple, Membrane-bound, assembled enzyme complexes generate extraordinarily large amounts of the reactive oxygen species O2- and H2O2. These reactive oxygen species increase membrane fluidity and lower the activation energy for endocytosis. The combination of these LDL-induced cellular events results in increased endocytosis in ECs, excessive vascular permeability, and increased transport through the cell via transcytosis.

Somit verhindert z. B. die Hemmung der NADPH-Oxidase-Aktivierung mit Apocynin eine gesteigerte Endocytose bei ECs und senkt eine übermäßige Gefäßdurchlässigkeit.Thus, for example, inhibition of NADPH oxidase activation with apocynin prevents increased endocytosis in ECs and reduces excessive vascular permeability.

Ohne uns auf eine bestimmte Theorie festlegen zu wollen, halten wir für möglich, daß eine Hemmung der NADPH-Oxidase durch das Apocynin-Dimere bei der Unterbrechung der Elektronentransportkette beim NADPH-Oxidase-Aktivierungsprozeß mitwirken kann. Die NADPH-Oxidase-Aktivierung erfordert eine Kopplung der Elektronentransportkette zwischen Ubichinon (Coenzym Q) und Cytochrom b. Ein oxidiertes Dimer mit einem niedrigeren Reduktionspotential als Ubichinon würde dann die Elektronentransportkette blockieren.Without wishing to commit ourselves to a particular theory, we consider it possible that inhibition of NADPH oxidase by the apocynin dimer may contribute to the interruption of the electron transport chain in the NADPH oxidase activation process. NADPH oxidase activation requires coupling of the electron transport chain between ubiquinone (coenzyme Q) and cytochrome b. An oxidized dimer with a lower reduction potential than ubiquinone would then block the electron transport chain.

Experiments with apocynin in vivo

Um die vorstehende Hypothese zu prüfen, wurden in vivo-Untersuchungen durchgeführt, welche auf die Wirkung der NADPH-Oxidase-Hemmung auf übermäßige Gefäßdurchlässigkeit abzielten, wobei ein Kaninchen-Modell mit erhöhtem Cholesteringehalt eingesetzt wurde. Weiße, männliche Neu Seeland-Kaninchen wurden auf 1% Cholesterindiät mit (n = 5) und ohne (n = 5) 200 mg/ml Apocynin-Zusatz zum Trinkwasser gesetzt. Einen Monat nach Beginn der Fütterung wurden die Tiere eine Minute vor ihrer Tötung mit Meerrettichperoxidase (MRP) als Durchlässigkeitsindikator infundiert. Die Aorten wurden herausgeschnitten, geöffnet und mit Nadeln an einem Seziertische befestigt. Eine grobe Inaugenscheinnahme zeigte bereits, daß die Aorten von Kaninchen mit der 1% Cholesterindiät ohne Behandlung mit Apocynin typische diffuse, frühe atherosklerotische Wunden aufwiesen. Im Gegensatz dazu wurden in den Aorten der mit Apocynin behandelten Kaninchen mit erhöhtem Cholesteringehalt keine Wunden beobachtet. Daraufhin wurden die Aorten Diaminobenzidin und H&sub2;O&sub2; ausgesetzt, wobei sich ein brauner Reaktionsniederschlag an den Stellen hoher MRP-Konzentrationen bildete. Die Aorten der Kaninchen mit erhöhtem Cholesterinwert ohne Apocynin-Behandlung wiesen deutliche, diffuse Bereiche mit hohen MRP-Konzentrationen auf. Jedoch zeigten Aorten von Apocynin behandelten Kaninchen mit erhöhtem Cholesterinwert übereinstimmend wenige MRP-positive Bereiche, mit einem Muster ähnlich dem von mit Standardfutter gefütterten Kaninchen. Die Gesamtserumcholesterinspiegel von Kaninchen mit erhöhtem Cholesterinwert mit und ohne Apocynin-behandlung waren einander vergleichbar.To test the above hypothesis, in vivo studies were conducted aimed at the effect of NADPH oxidase inhibition on excessive vascular permeability using a cholesterol-elevated rabbit model. Male New Zealand white rabbits were placed on a 1% cholesterol diet with (n = 5) and without (n = 5) 200 mg/ml apocynin added to the drinking water. One month after the start of feeding, the animals were infused with horseradish peroxidase (MRP) as a permeability indicator one minute before sacrifice. The aortas were excised, opened and pinned to a dissecting table. A gross visual inspection already showed that the aortas of rabbits on the 1% cholesterol diet without treatment with apocynin showed typical diffuse, early atherosclerotic wounds. In contrast, no wounds were observed in the aortas of rabbits with elevated cholesterol treated with Apocynin. The aortas were then exposed to diaminobenzidine and H₂O₂, and a brown reaction precipitate formed on the The aortas of high cholesterol rabbits without apocynin treatment showed distinct, diffuse areas of high MRP concentrations. However, aortas of high cholesterol rabbits treated with apocynin consistently showed few MRP-positive areas, with a pattern similar to that of rabbits fed standard diet. Total serum cholesterol levels of high cholesterol rabbits with and without apocynin treatment were comparable.

Es wurde auch eine dreimonatige Untersuchung an weißen, männlichen Neu-Seeland- Kaninchen durchgeführt, an die eine 1% Cholesterindiät mit 30 ug/ml (n = 2), 200 ug/ml (n = 2), 400 ug/ml (n = 2), 800 ug/ml (n = 2) und ohne (n = 2) Apocyninzusatz zum Trinkwasser verfüttert wurden. Nach drei Monaten wurden die Tiere getötet und ihre Aorten wie oben beschrieben untersucht. Eine Inaugenscheinnahme zeigte, daß die Aorten bei Kaninchen mit der 1% Cholesterindiät ohne Behandlung mit Apocynin im Bereich von 60% der Aortenoberfläche mit atherosklerotischen Plaques bedeckt waren. Im Gegensatz dazu wurde eine dosisabhängige Abnahme von Wunden an den Aorten von Kaninchen mit erhöhtem Cholesterinwert mit Apocynin-Behandlung beobachtet. Bei Tieren, die mit einer über 200 g/ml liegenden Dosis Apocynin behandelt wurden, ging die mit Plaques bedeckte Aortenoberfläche auf unter 8% zurück. Die Gesamtserumcholesterinspiegel von Kaninchen mit erhöhtem Cholesterinwert mit und ohne Apocynin-behandlung waren bei ca. 1000 mg/dl miteinander vergleichbar.A three-month study was also conducted on male New Zealand white rabbits fed a 1% cholesterol diet with 30 ug/ml (n = 2), 200 ug/ml (n = 2), 400 ug/ml (n = 2), 800 ug/ml (n = 2) and no (n = 2) apocynin added to the drinking water. After three months, the animals were sacrificed and their aortas examined as described above. Visual inspection showed that the aortas of rabbits on the 1% cholesterol diet without apocynin treatment were covered with atherosclerotic plaques covering 60% of the aortic surface. In contrast, a dose-dependent reduction in wounds was observed on the aortas of rabbits with elevated cholesterol treated with apocynin. In animals treated with a dose of apocynin above 200 g/ml, the aortic surface area covered by plaque decreased to less than 8%. Total serum cholesterol levels in rabbits with elevated cholesterol levels with and without apocynin treatment were comparable at approximately 1000 mg/dl.

Es wurde eine morphologische Untersuchung des Aortenendothels an den Kaninchen aus den obigen ein- und dreimonatigen Untersuchungen durchgeführt. Zufällige Gewebsproben wurden aus den Thorax- und Abdominalaorten von Kaninchen mit erhöhtem Cholesteringehalt und von solchen Kaninchen mit erhöhtem Cholesteringehalt und Apocynin- Behandlung entnommen. Von den Gewebsproben wurden Dünnschnitte angefertigt und für eine mikroskopischen Untersuchung weiterbehandelt. Die Untersuchung von elektronenmikroskopischen und lichtmikroskopischen Aufnahmen von Kaninchen mit erhöhtem Cholesterinspiegel ohne Apocyninbehandlung zeigten häufige und diffuse vaskuläre Veränderungen, wie sie für Atherosklerose charakteristisch sind. Fig. 4 ist eine repräsentative lichtmikroskopische Aufnahme. Im Gegensatz dazu zeigte die Untersuchung an mehreren Gewebsproben von Kaninchen mit erhöhtem Cholesterinspiegel mit Apocyninbehandlung nur wenige Anzeichen für vaskuläre Veränderungen. Fig. 5 ist eine repräsentative lichtmikroskopische Aufnahme hierfür. Auf ähnliche Weise wurde die Wirkung der NADPH-Oxidase-Hemmung auf das Endothel von Koronararterien untersucht. Es wurde gefunden, daß die Koronararterie wie die Abdominalaorta für Atherosklerose charakteristische Veränderungen aufwies und daß diese Veränderungen bei Behandlung mit Apocynin weniger waren.A morphological study of the aortic endothelium was performed on the rabbits from the above one- and three-month studies. Random tissue samples were taken from the thoracic and abdominal aorta of rabbits with elevated cholesterol and of rabbits with elevated cholesterol and apocynin treatment. The tissue samples were thinly sectioned and processed for microscopic examination. Examination of electron microscopic and light microscopic images of rabbits with elevated cholesterol without apocynin treatment showed frequent and diffuse vascular changes characteristic of atherosclerosis. Fig. 4 is a representative light microscopic image. In contrast, examination of several tissue samples from rabbits with elevated cholesterol and Apocynin treatment showed few signs of vascular changes. Fig. 5 is a representative light micrograph of this. Similarly, the effect of NADPH oxidase inhibition on the endothelium of coronary arteries was studied. It was found that the coronary artery, like the abdominal aorta, showed changes characteristic of atherosclerosis and that these changes were less with Apocynin treatment.

Als experimenteller Beweis dafür, daß Apocynin eine übermäßige Gefäßdurchlässigkeit durch Verhinderung der Endocytose bei ECs reduzieren, wurde die Zahl der Endocytosevesikel auf ECs auf der Licht- und Schattenseite von elektronenmikroskopischen Aufnahmen als ungefähres Maß für eine Endocytose-Aktivität ausgezählt. Elektronenmikroskopische Aufnahmen von 50 zufällig ausgewählten Aortenzellen von Kaninchen mit erhöhtem Cholesteringehalt mit und ohne Apocynin-Behandlung wurden mit 35000-facher Vergrößerung aufgenommen. Endocytosevesikel wurden auf den Licht- und Schattenseiten der Zellen ausgezählt. Ausgezählt wurden solche Vesikel, die sich in der Plasmamembran bildeten oder klar erkennbar an der Membran anhafteten. Es wurde eine deutliche Abnahme der Zahl der Endocytosevesikel an Apocynin behandelten Tieren beobachtet, was darauf schließen läßt, daß die Wirkung von Apocynin so ist, daß es eine Zunahme der Endocytose verhütet.As experimental evidence that apocynin reduces excessive vascular permeability by preventing endocytosis in ECs, the number of endocytic vesicles on ECs was counted on the light and shaded sides of electron micrographs as an approximate measure of endocytic activity. Electron micrographs of 50 randomly selected aortic cells from rabbits with elevated cholesterol with and without apocynin treatment were taken at 35,000x magnification. Endocytic vesicles were counted on the light and shaded sides of the cells. Vesicles that formed in the plasma membrane or were clearly attached to the membrane were counted. A significant decrease in the number of endocytic vesicles was observed in apocynin-treated animals, suggesting that the effect of apocynin is to prevent an increase in endocytosis.

Side effects

Mit Apocynin drei Monate lang behandelte Kaninchen zeigten keine offenkundigen Krankheitsanzeichen. Die Gewichtszunahme von drei Monate lang mit Apocynin behandelten Kaninchen war mit derjenigen von nicht mit Apocynin behandelten Tieren vergleichbar.Rabbits treated with Apocynin for three months showed no overt signs of disease. Weight gain in rabbits treated with Apocynin for three months was comparable to that of animals not treated with Apocynin.

Es wäre zu erwarten gewesen, daß Apocynin die Anfälligkeit gegenüber Infektionen erhöhte, da die weißen Blutzellen NADPH-Oxidase zur Erzeugung von ROS verwenden, um damit Bakterien abzutöten. Es wurde jedoch keine Zunahme für die Anfälligkeit gegenüber Infektionen bei den weißen, männlichen Neu Seeland-Kaninchen beobachtet.Apocynin would be expected to increase susceptibility to infection, since white blood cells use NADPH oxidase to generate ROS to kill bacteria. However, no increase in susceptibility to infection was observed in the male New Zealand white rabbits.

Eine weitere theoretische Nebenwirkung von Apocynin könnte sich möglicherweise aus einer Hemmung der Zellproliferation ergeben. Einige Gewebe des Körpers, darunter das Knochenmark und die Gastrointestinalzellen, haben höhere Zellproliferationsraten. Zellwachstumsstudien zeigten die dosisabhängige Wirkung von Apocynin auf die Proliferation von Endothel- und glatten Muskelzellen. Bei 100 ug/ml Apocynin war die Zellproliferationsrate minimal, eine Inaugenscheinnahme der Zellen ergab jedoch für die untersuchten Apocynin-Konzentrationen keinen Hinweis auf eine Beschädigung der Zelle oder gar für deren Tod. Somit ist Apocynin bei Konzentrationen, welche die ROS-Bildung hemmen, höchst wirksam bei der Unterdrückung der Zellproliferation.Another theoretical side effect of apocynin could potentially result from inhibition of cell proliferation. Some tissues of the body, including bone marrow and gastrointestinal cells, have higher rates of cell proliferation. Cell growth studies have shown the dose-dependent effect of apocynin on endothelial and smooth muscle cell proliferation. At 100 ug/ml apocynin, the cell proliferation rate was minimal, but visual inspection of the cells showed no evidence of cell damage or even death at the apocynin concentrations tested. Thus, apocynin is highly effective at suppressing cell proliferation at concentrations that inhibit ROS formation.

Conclusion

Die obigen in vitro- und in vivo-Untersuchungen zeigen, daß sich durch die Verabreichung von NADPH-Oxidase-Inhibitoren, wie z. B. Apocynin, mit einer übermäßigen Durchlässigkeit von Endothelzellen einhergehende Erkrankungen, einschließlich der Atherosklerose und damit verwandter Krankheiten, verhindern und behandeln lassen. Zusätzlich zur Verhinderung von Atherosklerose können NADPH-Oxidase-Inhibitoren, wie z. B. Apocynin, nützlich bei der Verhinderung und Behandlung der folgenden Zustände sein, indem sie die Membrandurchlässigkeit und die damit assoziierte Zellproliferation herabsetzen: Arthritis, Krebs, Sepsis; Gewebeschwellung nach einem Schlag oder Myocard-Infarkt und Verletzung bei Reperfusion; Atemnotsyndrom im Erwachsenenalter (ARDS = Adult Respiratory Distress Syndrome); bösartige Geschwülste; Gewebsveränderungen nach Transplantation; Gefäßentzündungen; Asthma und Diabetes mellitus.The above in vitro and in vivo studies demonstrate that the administration of NADPH oxidase inhibitors such as apocynin can prevent and treat diseases associated with excessive endothelial cell permeability, including atherosclerosis and related diseases. In addition to preventing atherosclerosis, NADPH oxidase inhibitors such as apocynin may be useful in preventing and treating the following conditions by reducing membrane permeability and associated cell proliferation: arthritis, cancer, sepsis; tissue swelling following stroke or myocardial infarction and reperfusion injury; adult respiratory distress syndrome (ARDS); malignant tumors; tissue changes following transplantation; vascular inflammation; asthma and diabetes mellitus.

Die beim Menschen einzusetzende optimale Dosis für den NADPH-Oxidase-Inhibitor, wie z. B. Apocynin, variiert in Abhängigkeit von der Schwere und Art des zu behandelnden Zustands, dem Weg der Verabreichung, dem Alter, Gewicht und Geschlecht des Patienten sowie von jeder anderen medikamentösen Behandlung des jeweiligen Patienten oder dem Vorkommen einer ernsten Komplikation beim zu behandelnden Patienten. Auch die Dosis und die Häufigkeit der Verabreichung ändert sich entsprechend dem individuellen Ansprechen des Patienten. Im allgemeinen liegt der Bereich für die tägliche Gesamtdosis für Apocynin bei den obigen Bedingungen 10 bis 45 mg/kg/Tag; für einen Durchschnittsmenschen liegt die tägliche Gesamtdosis bei ca. 500 bis 3000 mg, vorzugsweise in Teildosen. Bei einer Behandlung des Patienten sollte die Therapie bei niedrigeren Dosen, etwa bei ca. 200 bis 500 mg, beginnen und je nach nach dem globalen Ansprechen des Patienten bis auf 1000 mg gesteigert werden. Es ist weiterhin zu empfehlen, daß Patienten über 65 Jahre und solche mit geschwächter Nieren- oder Leberfunktion zunächst kleinere Dosen einnehmen und daß sie auf Grundlage der individuellen Reaktion(en) und Blutspiegel titriert werden. In einigen Fällen ist es notwendig, Dosierungen außerhalb dieser Bereiche einzusetzen, wie der Faschmann leicht erkennen kann. Desweiteren sei darauf verwiesen, daß der Kliniker oder behandelnde Arzt weiß, wie und wann er die Therapie in Verbindung mit der individuellen Reaktion eines Patienten zu unterbrechen, einzustellen oder zu beenden hat. Die Begriffe "eine therapeutisch wirksame Menge" und "eine zur Verhinderung ausreichende Menge" werden von den oben beschriebenen Mengenangaben für die Bereiche und das Muster für die Verabreichungshäufigkeit umfaßt.The optimal dose of NADPH oxidase inhibitor such as Apocynin to be used in humans will vary depending on the severity and nature of the condition being treated, the route of administration, the age, weight and sex of the patient, and any other drug treatment the patient is receiving or the presence of a serious complication in the patient being treated. The dose and frequency of administration will also vary depending on the individual patient's response. In general, the range for the total daily dose of Apocynin under the above conditions is 10 to 45 mg/kg/day; for an average person, the total daily dose is approximately 500 to 3000 mg, preferably in divided doses. When treating the patient, therapy should begin at lower doses, such as approximately 200 to 500 mg, and increase to 1000 mg depending on the patient's global response. It is also recommended that patients over 65 years of age and those with compromised renal or hepatic function begin with smaller doses and that they be titrated based on individual response(s) and blood levels. In some cases, it is necessary to use doses outside these ranges, as the faschmann will readily recognize. Furthermore, it should be noted that the clinician or treating physician knows how and when to interrupt, discontinue or stop therapy in relation to a patient's individual response. The terms "a therapeutically effective amount" and "a sufficient amount to prevent" are encompassed by the amounts, ranges and pattern of frequency of administration described above.

Jeder Verabreichungsweg läßt sich einsetzen, um den Patienten mit einer wirksamen Dosis Apocynin zu versorgen. Beispielsweise lassen sich eine orale, rectale, parenterale (subkutan, intramuskulär, intravenös), transdermale Verabreichung oder eine Verabreichung als Aerosol oder eine andere Form einsetzen. Die orale Gabe ist bevorzugt.Any route of administration may be used to provide the patient with an effective dose of Apocynin. For example, oral, rectal, parenteral (subcutaneous, intramuscular, intravenous), transdermal, aerosol or other form may be used. Oral administration is preferred.

Studies to predict the risk of atherosclerosis

Falls eine erhöhte Endocytose vor allem eher einen Defekt der Endothelzellen zur Folge hat als einen artherogenen LDL-Typ, dann ließe sich erklären, warum bestimmte Leute mit im allgemeinen mit Atherosklerose einhergehenden Plasma-LDL-Spiegeln keine Atherosklerose oder verwandte Erkrankungen ausbilden. Die EC-Defekt-Hypothese würde auch nahelegen, daß Atherosklerosepatienten ganz allgemein eine gewisse Erhöhung der NADPH-Oxidase- Aktivität aufweisen.If increased endocytosis results primarily in endothelial cell defects rather than an atherogenic type of LDL, this would explain why certain people with plasma LDL levels generally associated with atherosclerosis do not develop atherosclerosis or related diseases. The EC defect hypothesis would also suggest that atherosclerosis patients in general have some elevation of NADPH oxidase activity.

Um die Hypothese zu testen, wurden 92 EC-Experimente mit hohem LDL-Spiegel an isolierten Zellen von 92 getrennten menschlichen Nabelschnüren in vitro durchgeführt. Zusätzlich wurden allgemein an isolierten ECs aus zwei oder mehr menschlichen Quellen wöchentlich aus verschiedenen menschlichen Quellen isolierte LDL-Präparationen eingesetzt, womit sich die Wirkung von LDL analysieren ließ. Endothelzellen aus der gleichen Nabelschnur verfügten über ähnliche Endocytoseaktivität, wenn sie hohen LDL-Spiegeln ausgesetzt wurden. Im Gegensatz dazu reagieren ECs aus unterschiedlichen Nabelschnurquellen unterschiedlich, und zwar von keiner Änderung der Endocytose bis hin zu einem 200 bis 300% Anstieg der Endocytoseaktivität im Vergleich mit Kontrollzellen.To test the hypothesis, 92 high-LDL EC experiments were performed on isolated cells from 92 separate human umbilical cords in vitro. In addition, LDL preparations isolated from different human sources were generally used weekly on isolated ECs from two or more human sources, which allowed the effect of LDL to be analyzed. Endothelial cells from the same cord had similar endocytic activity when exposed to high levels of LDL. In contrast, ECs from different cord sources responded differently, ranging from no change in endocytosis to a 200 to 300% increase in endocytic activity compared to control cells.

Wenn sie einer hohen LDL-Konzentration ausgesetzt wurden, wurde in 52% der untersuchten isolierten ECs ein breites Spektrum an Veränderungen im Hinblick auf den Grad der Reaktion induziert, mit Endocytose-Anstiegen von 5 bis 300%. Diese in vitro-Beobachtung korreliert mit epidemiologischen Untersuchungen, welche zeigen, daß die von der Artheroskleose und verwandeten Krankheiten hervorgerufene Sterblichkeit bei ungefähr 50% der Bevölkerung auftritt.When exposed to high concentrations of LDL, a wide range of changes in the degree of response was induced in 52% of the isolated ECs examined, with increases in endocytosis ranging from 5 to 300%. This in vitro observation correlates with epidemiological studies showing that mortality caused by atherosclerosis and related diseases occurs in approximately 50% of the population.

Falls es im Gegensatz zu der EC-Hypothese einen atherogenen LDL-Typ gibt, wäre zu erwarten, daß isolierte ECs aus einer Vielzahl menschlicher Quellen ähnliche Reaktionen zeigen würden, wenn sie der gleichen LDL-Präparation ausgesetzt wurden. Isolierte ECs wurden als zu keiner Reaktion (0 bis 5% Endocytose-Anstieg) oder zu einer Reaktion befähigt (5 bis 300% Endocytose-Anstieg) eingestuft und analysiert. Die Ergebnisse zeigten, daß nur 53% alle isolierten ECs, wenn sie der gleichen LDL-Präpation ausgesetzt wurden, entweder reagiem oder nicht reagieren. Die Bedeutung dieses Befunds liegt darin, daß er die Wahrscheinlichkeit nahelegt, daß die erhöhte Endocytoserate eher einen EC-Defekt mit sich bringt als einen atherogenen LDL-Typ. Somit scheinen LDL-Spiegel die erhöhte Endocytoserate zu aktivieren.If, contrary to the EC hypothesis, there is an atherogenic type of LDL, it would be expected that isolated ECs from a variety of human sources would show similar responses when exposed to the same LDL preparation. Isolated ECs were classified as unresponsive (0 to 5% increase in endocytosis) or capable of responding (5 to 300% increase in endocytosis) and analyzed. The results showed that only 53% of all isolated ECs were either responsive or nonresponsive when exposed to the same LDL preparation. The significance of this finding is that it suggests the likelihood that the increased endocytosis rate is associated with an EC defect rather than an atherogenic type of LDL. Thus, LDL levels appear to activate the increased endocytosis rate.

Dieser Befund kann erklären, warum bestimmte Leute mit allgemein mit Atherosklerose assoziierten Plasma-LDL-Spiegeln keine Atherosklerose oder verwandte Krankheiten zeigen und führt zu der erfindungsgemäßen Methode zur Vorhersage des Atheroskleroserisikos für eine Person. Durch die Identifizierung eines Patienten mit erhöhter NADPH-Oxidase- Aktivität läßt sich ein erhöhtes Atheroskleroserisiko voraussagen. Bei solcherart identifizierten Patienten kann dann die Verabreichung von Apocynin oder anderer NADPH- Oxidase-Inhibitoren zur Vorbeugung gegen Atherosklerose und verwandte Krankheiten angezeigt sein.This finding may explain why certain people with plasma LDL levels generally associated with atherosclerosis do not exhibit atherosclerosis or related diseases and leads to the method of the invention for predicting the risk of atherosclerosis for an individual. By identifying a patient with increased NADPH oxidase activity, an increased risk of atherosclerosis can be predicted. In patients so identified, administration of apocynin or other NADPH oxidase inhibitors may then be indicated for the prevention of atherosclerosis and related diseases.

Falls in der menschlichen Bevölkerung genetische Varianten von NADPH-Oxidase oder von an dessen Aktivierung beteiligten Enzymen vorkommen und einige dieser Varianten außerordentlich hohe Mengen an reaktiven Sauerstoffspezies bilden, könnte dies mit klinischer Atherosklerose korreliert sein. Untersuchungen am Menschen wurden daher unternommen. In diesen Studien wurde die NADPH-Oxidase-Aktivität von polymorphkernigen (PMK) Leukozyten von Personen mit in der Familie klinisch dokumentierten Fällen von Atherosklerose oder verwandten Krankheiten mit solchen verglichen, wo in der Familie keine derartige Erkrankung auftrat. Freiwillige, deren medizinische und krankheitsbezogene Familiengeschichte genau recherchiert wurde, spendeten Proben venösen Blutes. Die PMK-NADPH-Oxidase-Aktivität wurde mittels Durchflußzytometrie mit einer Fluoreszenz-Sonde unter Verwendung von 2,7- Dichlorfluorescindiacetat als Indikator gemessen. Die NADPH-Oxidase-Aktivität wurde bestimmt, indem die Fluoreszenzmessungen aus dem mit PMK versperrten Fenster herangezogen wurden. Für diese Untersuchungen wurden 22 Personen mit entweder klinisch dokomentierter Atherosklerosegeschichte in der Familie mit 11 Personen (Kontrolle) verglichen, in deren Familie keine Atherosklerose bekannt war.If genetic variants of NADPH oxidase or of enzymes involved in its activation exist in the human population and some of these variants produce exceptionally high amounts of reactive oxygen species, this could be correlated with clinical atherosclerosis. Human studies have therefore been undertaken. In these studies, the NADPH oxidase activity of polymorphonuclear (PMK) leukocytes from individuals with a clinical family history of atherosclerosis or related diseases was compared with those without a family history of such disease. Volunteers whose medical and disease-related family history was carefully researched donated venous blood samples. PMK NADPH oxidase activity was measured by flow cytometry with a fluorescent probe using 2,7-dichlorofluorescin diacetate as an indicator. NADPH oxidase activity was determined using fluorescence measurements from the window blocked with PMK. For these studies, 22 individuals with either a clinically documented family history of atherosclerosis were compared with 11 individuals (controls) who had no known family history of atherosclerosis.

Die in Fig. 6 wiedergegebenen Ergebnisse zeigen, daß die 22 Personen gegnüber den Kontrollpersonen eine beträchtlich erhöhte NADPH-Oxidase-Aktivität aufwiesen. (Signifikanzniveau des Tests: P < 0,07). Die Befunde legen nahe, daß es genetische Varianten der NADPH-Oxidase (oder von bei dessen Aktivierung beteiligten Enzymen) gibt, und daß Personen mit diesen genetischen Varianten einer größer Gefahr für Atherosklerose oder verwandte Krankheiten ausgesetzt sind.The results shown in Figure 6 show that the 22 subjects had significantly increased NADPH oxidase activity compared to the control subjects. (Significance level of the test: P < 0.07). The findings suggest that there are genetic variants of NADPH oxidase (or enzymes involved in its activation) and that individuals with these genetic variants are at greater risk for atherosclerosis or related diseases.

Claims

1. Use of a NADPH oxidase inhibitor for the manufacture of a medicament for use in the therapy of disorders characterized by LDL accumulation in the subendothelial space resulting from endothelial hyperpermeability, wherein the inhibitor:

(a) a compound of the formula:

or

(b) a compound of the formula:

or a tautomer thereof, wherein R¹, R² and R³ are independently selected from the group consisting of H, alkyl, cycloalkyl, heterocycloalkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, heteroaryl, arylalkyl, heteroarylalkyl, and substituted alkyl, cycloalkyl, heterocycloalkyl, alkenyl and alkynyl.

2. Use of an inhibitor of p47[phox] translocation to endothelial cell gp91[phox] and p22[phox] membrane-bound NADPH oxidase components, for the manufacture of a medicament for use in the therapy of disorders characterized by LDL accumulation in the subendothelial space resulting from endothelial hyperpermeability, with the proviso that the use of lovastatin and compactin is excluded.

103. Use according to claim 2, wherein the translocation inhibitor is a compound of the formula:

or

or a tautomer thereof, wherein R¹, R² and R³ are independently selected from the group consisting of H, alkyl, cycloalkyl, heterocycloalkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, heteroaryl, arylalkyl, heteroarylalkyl and substituted alkyl, cycloalkyl, heterocycloalkyl, alkenyl and alkynyl.

4. Use according to claim 1 or 3, wherein R¹ and R² are each methyl and R³ is H.