DE69521193T2 - Process for the recovery of cyclosporin A from a tolypocladium species - Google Patents
Process for the recovery of cyclosporin A from a tolypocladium speciesInfo
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Description
Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von Cyclosporin A aus Tolypocladiumspezien NRRL 18950, wie in dieser Schrift beschrieben.This invention relates to a process for the production of cyclosporin A from Tolypocladium species NRRL 18950 as described in this document.
Es ist allgemein bekannt, dass Cyclosporin A eine nützliche Anwendung hat als ein immunsuspressiver Wirkstoff zur Verhinderung von Organabstoßung in der Transplantationschirurgie. In dem bekannten Verfahren wird Cyclosporin als ein Komplex gewonnen durch die Zucht der Art von Tolypocladium Varium Pilz Spezies. Das britische Patent Nr. 2227489 offenbart ein mikrobielles Verfahren für die Produktion eines Cyclosporin-Komplexes oder dessen Komponenten, das heißt, Cyclosporin A, Cyclosporin B und Cyclosporin C. Solch ein bekanntes Verfahren schlägt vor, eine Art von Tolypocladium Varium Pilz Spezies zu züchten, um den Cyclosporin-Komplex auf einem Nährmedium (Nährboden) zu produzieren. Das Nährmedium weist Kohlenstoffquellen auf, organische und inorganische Stickstoffquellen und Steinsalze, wie sie üblicherweise in Fermentationsbrühen eingesetzt werden. Die Fermentation wird wie gewöhnlich unter aeroben Bedingungen bei 25 bis 30ºC durchgeführt. Der produzierte Cyclosporin-Komplex wird, falls gewünscht, isoliert und gereinigt, um einen gereinigten Komplex herzustellen.It is well known that cyclosporin A has a useful application as an immunosuppressive agent for preventing organ rejection in transplantation surgery. In the known process, cyclosporin is obtained as a complex by culturing the type of Tolypocladium varium fungal species. British Patent No. 2227489 discloses a microbial process for the production of a cyclosporin complex or its components, i.e., cyclosporin A, cyclosporin B and cyclosporin C. Such a known process proposes culturing a type of Tolypocladium varium fungal species to produce the cyclosporin complex on a nutrient medium. The nutrient medium comprises carbon sources, organic and inorganic nitrogen sources and rock salts as are commonly used in fermentation broths. The fermentation is carried out as usual under aerobic conditions at 25 to 30°C. The cyclosporine complex produced is, if desired, isolated and purified to produce a purified complex.
Das im Stand der Technik bekannte Verfahren schlägt ein bevorzugtes Fermentationsmedium vor, das Pepton beinhaltet, Ammoniumsulfat und Trypton als Stickstoffquelle. Die bevorzugten Kohlenstoffquellen sind Glukose, Maltose und Sorbit. Die Zucht Tolypocladium Varium sp nov. Cy/93 wird als NCAIM (P) F-001005 gelagert.The prior art method suggests a preferred fermentation medium containing peptone, ammonium sulfate and tryptone as a nitrogen source. The preferred carbon sources are glucose, maltose and sorbitol. The culture Tolypocladium Varium sp nov. Cy/93 is stored as NCAIM (P) F-001005.
WO 94116091 offenbart ein Verfahren zur Herstellung eines Cyclosporins durch Züchtung einer neuen Art von Tolypocladium Sp wie sie unter CBS 630.92 gelagert wird.WO 94116091 discloses a process for producing a cyclosporin by culturing a new species of Tolypocladium Sp as stored under CBS 630.92.
DD 298276 offenbart die Gewinnung von Cyclosporin A durch Züchtung von Tolypocladium inflatum SF 136.DD 298276 discloses the production of cyclosporin A by culturing Tolypocladium inflatum SF 136.
EP 0379708 offenbart die Gewinnung von Cyclosporin durch Züchtung einer neuen Art von Tolypocladium varium wie gelagert unter NCAIM (P) F-00105.EP 0379708 discloses the production of cyclosporin by culturing a new species of Tolypocladium varium as stored under NCAIM (P) F-00105.
EP 0568698 offenbart ein Verfahren zum Produzieren von Cyclosporin A und/oder Cyclosporin C durch Züchten eines Cyclosporin A und/oder C, die Bakterien produzieren, die zu der Art der Nectria gehören.EP 0568698 discloses a process for producing cyclosporin A and/or cyclosporin C by culturing a cyclosporin A and/or C producing bacteria belonging to the genus Nectria.
EP 0507968 offenbart ein Verfahren zum Produzieren von Cyclosporin A durch Kultivieren einer neuen Art des Pilzes Sesquicilliopsis rosariensis G. ARNOLD.EP 0507968 discloses a process for producing cyclosporin A by culturing a new species of the fungus Sesquicilliopsis rosariensis G. ARNOLD.
Die bekannten Verfahren schlagen kein Verfahren vor, um nur Cyclosporin A zu produzieren und dies in einer hohen Reinheit von nicht weniger als 98%.The known processes do not suggest a process to produce only cyclosporin A and this in a high purity of not less than 98%.
Ein Ziel dieser Erfindung ist es, ein verbessertes Verfahren zur Gewinnung von Cyclosporin A vorzuschlagen.An aim of this invention is to propose an improved process for the production of cyclosporin A.
Ein anderes Ziel dieser Erfindung ist es, ein Verfahren für die Gewinnung von Cyclosporin A mit einer hohen Ausbeute vorzuschlagen.Another object of this invention is to propose a process for the production of cyclosporin A with a high yield.
Noch ein weiteres Ziel dieser Erfindung ist es, ein Verfahren vorzuschlagen für die Gewinnung von im Wesentlichen einheitlich reinem Cyclosporin A.Yet another object of this invention is to provide a process for the obtaining of substantially uniformly pure cyclosporin A.
Die vorliegende Erfindung verwendet einen neuen Pilz Tolypocladium Sp. und gelagert unter NRRL Nr. 18950. Die Charakteristiken von anderen Spezies von Tolypocladium bezüglich der Spezies der vorliegenden Erfindung werden in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle - 1 Vergleich von Charakteristiken verschiedener Spezies von Tolypocladium The present invention uses a novel fungus Tolypocladium Sp. and deposited under NRRL No. 18950. The characteristics of other species of Tolypocladium with respect to the species of the present invention are shown in Table 1. Table - 1 Comparison of characteristics of different species of Tolypocladium
Gemäß dieser Erfindung wird ein Verfahren für die Gewinnung von Cyclosporin A vorgesehen aus Tolypocladium sp, wie in der Beschreibung dargestellt, das umfasst: Ein Aussetzen des besagten Tolypocladium sp dem Schritt der Fermentation in einem Nährmedium, um ein fermentiertes Medium zu erhalten, ein Herausziehen der Pilzbiomasse des besagten fermentierten Mediums mit Methanol, um ein Methanolextrakt zu erhalten, ein Entfernen des Methanols von dem besagten Extrakt durch den Schritt des Verdampfens, um einen ersten Rückstand zu erhalten, eine Gewinnung einer wässrigen Lösung von dem besagten ersten Rückstand, eine Gewinnung eines Ethylacetatextraktes von der besagten wässrigen Lösung, eine Entfärbung und Konzentrierung des besagten Extraktes, um einen zweiten Rückstand zu erhalten und dann eine Reinigung des zweiten Rückstandes chromatografisch in zwei Stufen, nämlich in einer ersten Stufe auf einer Kieselgelsäule als feste Phase und einer lösenden Mischung von Hexan, Chloroform und Methanol als mobile Phase und in einer zweiten Stufe auf einer Harzsäule als feste Phase und Methanol als mobile Phase.According to this invention, there is provided a process for the recovery of Cyclosporin A from Tolypocladium sp as set forth in the specification, which comprises: subjecting said Tolypocladium sp to the step of fermentation in a nutrient medium to obtain a fermented medium, extracting the fungal biomass of said fermented medium with methanol to obtain a methanol extract, removing the methanol from said extract by the step of evaporation to obtain a first residue, obtaining an aqueous solution from said first residue, obtaining an ethyl acetate extract from said aqueous solution, decolorizing and concentrating said extract to obtain a second residue and then purifying the second residue chromatographically in two stages, namely in a first stage on a silica gel column as a solid phase and a solvent mixture of hexane, chloroform and methanol as a mobile phase and in a second stage on a resin column as solid phase and methanol as mobile phase.
Die Einzelheiten des Verfahrens werden nachfolgend im Detail beschrieben, wobei zwei Arten von Fermentationstechniken beschrieben werden, nämlich (i) statische und (ii) Festsubstratfermentationen.The details of the process are described in detail below, describing two types of fermentation techniques, namely (i) static and (ii) solid substrate fermentations.
Gemäß dieser Erfindung zerfällt eine kleine Menge von Erde in einer Suspension in sterilisiertem Wasser und wird dann mehrfach mit destiliertem Wasser verdünnt. Ein kleiner Teil der verdünnten Erdsuspension wird über ein Zuchtmedium verteilt.According to this invention, a small amount of soil is dissolved in a suspension in sterilized water and then diluted several times with distilled water. A small portion of the diluted soil suspension is spread over a growing medium.
Das Zuchtmedium wird bei einem pH von beispielsweise 6,5 gehalten und besteht aus Dextrose, Pepton, Agar und Wasser. Eine notwendige Menge eines Wirkstoffes wie etwa Streptomycinsulfat wird dem Zuchtmedium hinzugefügt, um Bakterienwachstum zu verhindern.The culture medium is maintained at a pH of, for example, 6.5 and consists of dextrose, peptone, agar and water. A necessary amount of an active agent such as streptomycin sulfate is added to the culture medium to prevent bacterial growth.
Die oben hergestellte Erdsuspension wird dann auf der oberen festen Fläche des Zuchtmediums verteilt, aufgenommen von einem geeigneten Behälter wie einer Petrischale.The soil suspension prepared above is then spread on the upper solid surface of the growing medium, held by a suitable container such as a Petri dish.
Die Inkubation der Petrischalen wird bei Temperaturen von ca. 22 bis 30ºC ausgeführt. Wesentliches Wachstum von Pilzkolonien wird nach sieben Tagen bemerkt. Wenn das Wachstum einer Pilzkolonie als ausreichend eingeschätzt wird, wird das Wachstum beendet.Incubation of the Petri dishes is carried out at temperatures of approximately 22 to 30ºC. Significant growth of fungal colonies is noticed after seven days. When the growth of a fungal colony is considered sufficient, growth is stopped.
Die individuellen Pilzkolonien werden auf kleine Mengen desselben Zuchtmediums transferiert, das in Teströhrchen gehalten wird, die versiegelt sind und bei 25ºC gelagert werden.The individual fungal colonies are transferred to small amounts of the same growth medium, which is maintained in test tubes that are sealed and stored at 25ºC.
Die Reste der Kolonien werden unter einem Mikroskop untersucht und auf der Gattungsebene identifiziert. Einer von diesen hatte die Charakteristiken des Pilzes Tolypocladium und die Ergebnisse wurden schon in Tabelle 1 dargestellt. Diese Tolypocladiumspezies der vorliegenden Erfindung wurde in einem Nährmedium gezüchtet, das Glukose beinhaltete, Pepton, Caseinsäurenhydrolysat und steriles Wasser, das bei einem pH zwischen 4-6 gehalten wurde, wobei eine Schleife voll von Sporensuspension der Spezies in Schrägagar eingeimpft wurden, die Malzextrakt, Hefeextrakt und Agar mit einem pH von 4-6 beinhalteten, und wobei Schrägagar inkubiert wurde bis die Kultur die Bearbeitungsstufe erreichte.The remains of the colonies are examined under a microscope and identified at the genus level. One of them had the characteristics of the fungus Tolypocladium and the results were already presented in Table 1. This Tolypocladium species of the present invention was grown in a nutrient medium containing glucose, peptone, caseic acid hydrolysate and sterile water maintained at a pH between 4-6, a loop full of spore suspension of the species was inoculated into agar slants containing malt extract, yeast extract and agar with a pH of 4-6 and the agar slants were incubated until the culture reached the processing stage.
Wenn ausreichendes Wachstum erreicht wird, wird die Kultur in Glasampullen übertragen und wird Lyophilisation ausgesetzt.When sufficient growth is achieved, the culture is transferred to glass vials and is subjected to lyophilization.
In dem Beispiel der Gewinnung von Cyclosporin A durch Feststofffermentation, wird der auf obige Art erzeugte Hauptsamen in ein flüssiges Medium eingeimpft. Nach ausreichendem Wachstum wird die Kultur auf Festsubstratfermentations- Schalen übertragen, die sterilisierte Weizenkleie/Reiskleie aufweisen und bei einem pH von 4-6 gehalten sind. Indem eine relative Feuchtigkeit von ca. 85-90% bei einer Temperatur von 25 bis 30ºC aufrechterhalten wird, mit Lüftung, tritt auf dem festen Substrat Wachstum des Pilzes auf. Pilzwachstum wurde zusammen mit dem Nährmedium mit Methanol extrahiert und verdampft, um einen ersten Rückstand zu erhalten, der in sterilem Wasser gelöst wurde, um eine wässrige Lösung zu erhalten. Ein Ethylacetatextrakt der besagten wässrigen Lösung wird entfärbt und konzentriert, um einen zweiten Rückstand zu erhalten. Der zweite Rückstand wird einer zweistufigen Säulenchromatografie auf einer Kieselgelsäule ausgesetzt als der ersten Stufe und einer Harzsäule als der zweiten Stufe, und wobei eine Lösungsmischung aus Hexan, Chloroform und Methanol in dem Verhältnis 10 : 9 : 1 als mobile Phase für die erste Stufe verwandt wurde. Für die zweite Stufe der Chromatografie wurde Methanol als mobile Phase eingesetzt. Cyclosporin A hoher Reinheit wird in dieser Zweistufenchromatografie erreicht.In the example of obtaining cyclosporin A by solid state fermentation, the main seed produced in the above manner is inoculated into a liquid medium. After sufficient growth, the culture is transferred to solid substrate fermentation dishes containing sterilized wheat bran/rice bran and maintained at a pH of 4-6. By maintaining a relative humidity of about 85-90% at a temperature of 25 to 30ºC, with ventilation, growth of the fungus occurs on the solid substrate. Fungal growth was extracted together with the nutrient medium with methanol and evaporated to obtain a first residue, which was dissolved in sterile water to obtain an aqueous solution. An ethyl acetate extract of the said aqueous solution is decolorized and concentrated to obtain a second residue. The second residue is subjected to two-stage column chromatography on a silica gel column. as the first stage and a resin column as the second stage, and a mixed solution of hexane, chloroform and methanol in the ratio 10:9:1 was used as the mobile phase for the first stage. For the second stage of chromatography, methanol was used as the mobile phase. Cyclosporin A of high purity is achieved in this two-stage chromatography.
In dem Beispiel des statischen Fermentationsverfahrens wird der Hauptkeim in ein flüssiges Medium in zwei Stufen eingeimpft, um den Impfstoff der Spezies zu bilden. Das Medium, das Glukose, Pepton, Caseinsäurehydrolysat und steriles Wasser aufweist, und dass 3-4 Tage inkubiert wurde, ist die erste Stufe und 2-3 Tage ist die zweite Stufe bei 25ºC, und das den so erhaltenen Impfstoff zu dem statischen Fermentationsmedium überträgt, das Glukose, Glycerol, Caseinsäurenhydrolysat als Extrakt von Pepton und DL-Alphaaminobuttersäure in sterilem Wasser bei einem pH von 4-6 aufweist und dass die Fermentation 21 Tage ermöglicht. Das besagte Medium weist auf: 2 bis 6% Glucose, 2 bis 5,5% Glycorol, 1,5 bis 5,5% Caseinsäurenhydrolysat, 0,5 bis 4,5% Malzextrakt, 0,25 bis 2,5% Pepton, 0,1 bis 3% DL-Alphaaminobuttersäure und als Rest steriles Wasser.In the example of the static fermentation process, the main germ is inoculated into a liquid medium in two stages to form the vaccine of the species. The medium comprising glucose, peptone, caseic acid hydrolysate and sterile water and that has been incubated for 3-4 days is the first stage and 2-3 days is the second stage at 25ºC, and that transfers the vaccine thus obtained to the static fermentation medium comprising glucose, glycerol, caseic acid hydrolysate as an extract of peptone and DL-alpha-aminobutyric acid in sterile water at a pH of 4-6 and that allows fermentation for 21 days. The medium in question contains: 2 to 6% glucose, 2 to 5.5% glycorol, 1.5 to 5.5% caseic acid hydrolysate, 0.5 to 4.5% malt extract, 0.25 to 2.5% peptone, 0.1 to 3% DL-alpha-aminobutyric acid and the balance sterile water.
Das Medium enthält beispielsweise 4% Glukose, 4% Glycerol, 3% Caseinsäurenhydrolysat, 2% Malzextrakt, 1% Pepton, 0,5% DL-Alphaaminobuttersäure.For example, the medium contains 4% glucose, 4% glycerol, 3% caseinic acid hydrolysate, 2% malt extract, 1% peptone, 0.5% DL-alpha-aminobutyric acid.
Die Ausbeute von Cyclosporin A wird sehr gering, wenn die Inhaltsstoffe jenseits des gegebenen Bereichs inkorporiert werden.The yield of cyclosporin A becomes very low when the ingredients are incorporated beyond the given range.
Die Biomasse des Tolypocladiumpilzes, der in dem besagten statischen Fermentationsmedium gewachsen ist, wird gefiltert und die dadurch rückgewonnene Pilzbiomasse wird in einem organischen Lösungsmittel extrahiert, wie etwa Methanol. Methanol wird aus dem Methanolextrakt verdampft, um einen ersten Rückstand zu erhalten, der Rückstand wird in destilliertem Wasser aufgelöst, um eine wässrige Lösung zu erhalten, die mit Ethylacetat extrahiert wird, um ein Ethylacetatextrakt zu erhalten. Der Extrakt wird mit Natrium gewaschen und verdampft, um einen zweiten Rückstand zu erhalten und auf diesen Rückstand wird, wie oben beschrieben, eine zweistufige Säulenchromatografietrennung angewandt.The biomass of the Tolypocladium fungus grown in said static fermentation medium is filtered and the fungal biomass thus recovered is extracted in an organic solvent such as methanol. Methanol is evaporated from the methanol extract to obtain a first residue, the residue is dissolved in distilled water to obtain an aqueous solution which is extracted with ethyl acetate to obtain an ethyl acetate extract. The extract is washed with sodium and evaporated to obtain a second residue and to this residue a two-step column chromatography separation is applied as described above.
Beide Stufen der Säulenchromatografie sorgten für eine Ausbeute von Cyclosporin A von 98%-iger Reinheit.Both steps of column chromatography resulted in a yield of cyclosporin A of 98% purity.
In dem folgenden Flussdiagramm haben wir ein typisches Verfahren zur Gewinnung von Cyclosporin A erklärt durch Einsetzen der Stufe der statischen Fermentation. Tabelle - 2 Ausbeute von Cyclosporin A bei dem Verfahren der vorliegenden Erfindung mit statischer Fermentation. In the following flow chart, we have explained a typical procedure for obtaining cyclosporin A by employing the static fermentation step. Table - 2 Yield of cyclosporin A in the static fermentation process of the present invention.
Ein Verfahren zur Gewinnung von Cyloporin A durch Festsubstratfermentation (SSF) wie unten beschrieben (Durchschnitt von zehn Arbeitsmengen) Quelle der Isolation verschiedener Spezies von Tolypocladium und deren Cyclosporinausbeute A process for the production of Cyloporin A by solid substrate fermentation (SSF) as described below (average of ten working batches) Source of isolation of different species of Tolypocladium and their cyclosporin yield
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