DE69432796T2 - COMBINATION OF DNA SEQUENCES WHICH ENABLES THE FORMATION OF MODIFIED STARCH IN PLANT CELLS AND PLANTS, METHOD FOR THE PRODUCTION OF THESE PLANTS - Google Patents
COMBINATION OF DNA SEQUENCES WHICH ENABLES THE FORMATION OF MODIFIED STARCH IN PLANT CELLS AND PLANTS, METHOD FOR THE PRODUCTION OF THESE PLANTS Download PDFInfo
- Publication number
- DE69432796T2 DE69432796T2 DE69432796T DE69432796T DE69432796T2 DE 69432796 T2 DE69432796 T2 DE 69432796T2 DE 69432796 T DE69432796 T DE 69432796T DE 69432796 T DE69432796 T DE 69432796T DE 69432796 T2 DE69432796 T2 DE 69432796T2
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- cells
- enzyme
- plasmid
- plants
- promoter
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
- C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
- C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
- C12N15/8245—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified carbohydrate or sugar alcohol metabolism, e.g. starch biosynthesis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
- C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
- C12N9/107—1,4-Alpha-glucan branching enzyme (2.4.1.18)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Kombination von DNA-Sequenzen, die in transgenen Pflanzenzellen und Pflanzen zu einer Modifikation der in den Zellen gebildeten Stärke führt. Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung genetisch veränderter Pflanzen, die bezüglich der physikalischen und chemischen Eigenschaften der gebildeten Stärke im Vergleich zu der natürlich gebildeten Stärke infolge der Expression künstlich eingeführter DNA-Sequenzen verändert sind, die über dieses Verfahren erhältlichen Pflanzenzellen und Pflanzen und die aus diesen Pflanzen erhältliche modifizierte Stärke.The present invention relates to a combination of DNA sequences, those in transgenic plant cells and plants for modification the strength formed in the cells leads. The invention further relates to a method for producing genetically modified Plants related to the physical and chemical properties of the starch formed in comparison to the of course formed strength due to the expression artificial introduced DNA sequences changed are that about this method available Plant cells and plants and those available from these plants modified starch.
Polysaccharide wie Stärke sind die wesentlichen nachwachsenden Rohstoffe aus Pflanzen.Polysaccharides are like starch the essential renewable raw materials from plants.
Ein entscheidender Faktor, der der Verwendung von nachwachsenden Rohstoffen als industrielle Rohstoffe im Wege steht, ist der Mangel an Stoffen, die in Form, Struktur oder sonstigen physikalisch-chemischen Eigenschaften den Erfordernissen der chemischen Industrie genau entsprechen. Zwei spezielle Anforderungen an einen für die technische Verwendung geeigneten Rohstoff sind, dass er in hoher Reinheit vorliegt und chemisch einheitlich aufgebaut ist. Letzteres ist wichtig, um eine homogene Reaktionsführung bei der Verarbeitung zu gewährleisten.A crucial factor that the Use of renewable raw materials as industrial raw materials standing in the way is the lack of substances in shape, structure or other physico-chemical properties the requirements correspond exactly to the chemical industry. Two special requirements to one for The technical use of suitable raw material is that it is in high Purity is present and is chemically uniform. The latter is important to ensure a homogeneous reaction during processing to ensure.
Obwohl die Stärke ein Polymer aus chemisch einheitlichen Grundbausteinen, den Glucosemolekülen, ist, ist sie ein komplexes Gemisch aus sehr unterschiedlichen Molekülformen, die sich hinsichtlich ihres Polymerisationsgrades und des Auftretens von Verzweigungen der Glucoseketten unterscheiden. Der Grad der Verzweigung bestimmt inter alia die physikalisch-chemischen Eigenschaften der betreffenden Stärke und daher auch ihre Eignung für eine große Vielzahl von Anwendungen. Insbesondere unterscheidet man die Amylose-Stärke, ein im Wesentlichen unverzweigtes Polymer aus α-1,4 verknüpften Glucosemolekülen, von der Amylopektin-Stärke, die ihrerseits ein komplexes Gemisch aus unterschiedlich verzweigten Glucoseketten darstellt. Die Verzweigungen kommen durch das Auftreten von zusätzlichen α-1,6 Verknüpfungen zustande.Although the starch is a polymer of chemical uniform building blocks, the glucose molecules, it is a complex one Mixture of very different molecular forms that differ in terms of their degree of polymerization and the appearance of branches of glucose chains. The degree of branching determines inter alia the physico-chemical properties of the concerned Strength and therefore their suitability for a big Variety of applications. In particular, a distinction is made between amylose starch essentially unbranched polymer from α-1,4 linked glucose molecules, from the amylopectin starch that in turn a complex mixture of differently branched Represents glucose chains. The ramifications come from the appearance of additional α-1.6 links conditions.
In typischen Pflanzen für die Stärkeproduktion, wie zum Beispiel Mais oder Kartoffel, kommen die beiden Stärkeformen in einem Verhältnis von etwa 25 Teilen Amylose zu 75 Teilen Amylopektin vor.In typical plants for starch production, such as corn or potato, the two forms of starch come in a relationship from about 25 parts of amylose to 75 parts of amylopectin.
Um das Stärke-Rohmaterial an die unterschiedlichen industriellen Anwendungen anzupassen, d. h. seine physikalisch-chemischen Eigenschaften abzuwandeln, ist es inter alia notwendig, den Verzweigungsgrad der Stärke beeinflussen zu können.To the starch raw material to the different adapt to industrial applications, d. H. its physico-chemical To modify properties, it is necessary inter alia, the degree of branching of strength to be able to influence.
Im Hinblick auf die Eignung eines Grundstoffes wie Stärke für seine Anwendung im industriellen Bereich scheint es daher wünschenswert, Verfahren zur Herstellung amylogener Pflanzen be reitzustellen, die eine Stärke synthetisieren, die im Vergleich zu der natürlich vorkommenden Stärke modifiziert ist.With regard to the suitability of a Basic material such as starch for his Application in the industrial sector therefore seems desirable To provide a process for the production of amylogenic plants, the one Strength synthesize that modified compared to the naturally occurring starch is.
Insbesondere ist es erwünscht, Stärke so zu verändern, dass sie einen modifizierten Verzweigungsgrad aufweist, d. h. eine Verminderung oder Erhöhung des Verzweigungsgrades, wodurch eine einheitlichere Stärke mit höherem oder niedrigerem Amylosegehalt gebildet wird.In particular, it is desirable to add starch in this way change, that it has a modified degree of branching, i.e. H. a Decrease or increase the degree of branching, creating a more uniform strength with higher or lower amylose content is formed.
Ein Beispiel einer anderen, für die technische Verwendung von Stärke nützlichen Eigenschaft ist der Gehalt an Phosphatgruppen. Phosphat-enthaltende Stärke kann in einer großen Anzahl von Gebieten angewendet werden, z. B. bei der Papierherstellung, der Herstellung von Textilien, als Klebstoffe, im Nahrungsmittel- und Medizinbereich. Weiterhin sind phosphathaltige Stärkederivate geeignet, als Emulgatoren verwendet zu werden. Da die in der Mehrzahl von amylogenen Pflanzen natürlich vorkommende Stärke nur einen sehr kleinen Anteil an Phosphatgruppen enthält, wobei eine spezielle Ausnahme die von unterirdischen Organen wie z. B. Wurzeln oder Kartoffelknollen gebildete Stärke ist, wurden Phosphatgruppen bisher mit Hilfe von chemischen Verfahren eingeführt. Um die zusätzlichen Aufwendungen an Kosten und Zeit, die mit solchen Verfahren zur Einführung von Phosphatgruppen in Stärke verbunden sind, zu vermeiden, scheint es wünschenswert, Verfahren bereit zu stellen, die es ermöglichen, Pflanzen so zu modifizieren, dass sie eine veränderte Stärke bilden, die einen erhöhten Gehalt an Phosphatgruppen aufweist.An example of another, for the technical Use of starch useful The property is the content of phosphate groups. Phosphate-containing Strength can in a big Number of areas to be applied, e.g. B. in papermaking, the production of textiles, as adhesives, in the food and medical fields. Starch derivatives containing phosphate are also suitable as emulsifiers to be used. Because the in the majority of amylogenic plants Naturally occurring strength contains only a very small proportion of phosphate groups, whereby a special exception is that of underground organs such. B. Roots or potato tubers formed starch were phosphate groups previously introduced using chemical processes. To the additional Expenses in terms of cost and time involved with such procedures to introduce Starch phosphate groups To avoid connected, it seems desirable to have procedures ready to make it possible to Modify plants so that they form an altered starch that has an increased content has phosphate groups.
Bezüglich des Verzweigungsgrades der Stärke ist es bereits bekannt, dass für bestimmte Pflanzenspezies, beispielsweise den Mais, durch Mutagenese, bei der einzelne Gene der Pflanze inaktiviert werden, Sorten erzeugt werden können, die nur noch Amylopektin enthalten. Für Kartoffel wurde durch chemische Mutagenese bei einer haploiden Linie ebenfalls ein Genotyp erzeugt, der keine Amylose bildet (Hovenkamp-Hermelink et al., 1987, Theor. Appl. Genet. 75: 217–221). Haploide Linien, bzw. die daraus entwickelten homozygoten diploiden oder tetraploiden Linien, sind landwirtschaftlich aber nicht einsetzbar. Für die landwirtschaftlich interessanten heterozygot tetraploiden Linien ist die Mutagenese-Technik nicht anwendbar, da wegen des Vorliegens von vier verschiedenen Erbgutkopien eine Inaktivierung aller Kopien eines Gens technisch nicht möglich ist.Regarding the degree of branching of strength it is already known that for certain plant species, for example maize, by mutagenesis, in which individual genes of the plant are inactivated, varieties are produced can be which only contain amylopectin. For potato has been through chemical Mutagenesis in a haploid line also creates a genotype that does not form amylose (Hovenkamp-Hermelink et al., 1987, Theor. Appl. Genet. 75: 217-221). Haploid lines, or the homozygous diploids developed from them or tetraploid lines, but cannot be used for agriculture. For the agriculturally interesting heterozygous tetraploid lines the mutagenesis technique is not applicable because of the presence inactivation of all copies of four different genetic copies a gene is technically not possible is.
Ferner sind Mais- und Erbsensorten bekannt, die Amylosestärke produzieren können, die Amylosekonzentration in diesen Pflanzen beträgt jedoch nur 60–80%. Weiterhin ist das Mutageneseverfahren, das der Produktion dieser Sorten zugrunde liegt, auf andere Pflanzen wie z. B. die Kartoffel nicht anwendbar.There are also varieties of corn and peas known the amylose strength can produce however, the amylose concentration in these plants is only 60-80%. Farther is the mutagenesis process that underlies the production of these varieties lies on other plants such. B. the potato not applicable.
Visser et al. (19911, Mol. Gen. Genet. 225, 289) haben weiterhin offenbart, dass Kartoffelsorten, die weitgehend reine Amylopektinstärke bilden, mit Hilfe von gentechnischen Verfahren, insbesondere durch antisense-Inhibition des Gens für die Stärkekorngebundene Stärkesynthase, erzeugt werden können.Visser et al. (19911, Mol. Gen. Genet. 225, 289) have further revealed that potato varieties are largely pure amylopectin starch form, with the help of genetic engineering, in particular by antisense inhibition of the gene for the starch-bound starch, can be generated.
In der WO 92/14827 ist ein Verzweigungsenzym der Kartoffel offenbart. Dieses Enzym wird als Q-Enzym (Verzweigungsenzym) von Solanum tuberosum bezeichnet. Weiterhin ist bekannt, dass mit Hilfe von DNA-Sequenzen, die die Information für das in der WO 92/14827 beschriebene Verzweigungsenzym der Kartoffel enthalten, transgene Pflanzen hergestellt werden können, bei denen das Amylose/Amylopektin-Verhältnis der Stärke verändert ist; obwohl die in der WO 92/14827 beschriebenen Pflanzen keine Stärke mit einem hohen Grad an Amylose bilden.In WO 92/14827 there is a branching enzyme the potato reveals. This enzyme is called the Q enzyme (branching enzyme) denoted by Solanum tuberosum. It is also known that with Help of DNA sequences that contain the information for that described in WO 92/14827 Containing the branching enzyme of the potato, transgenic plants are produced can be where the amylose / amylopectin ratio of starch is changed; although the plants described in WO 92/14827 have no starch form a high degree of amylose.
Synthese, Abbau und Modifikation der Stärke involvieren eine große Anzahl an Enzymen, deren Interaktionen bisher nur teilweise erklärt sind.Synthesis, degradation and modification of strength involve a large Number of enzymes whose interactions have only been partially explained so far.
In der Kartoffel erfolgt die Synthese von Stärke hauptsächlich durch die Wirkung der Stärkesynthase, die im Wesentlichen ADP-Glucose als Substrat für eine Übertragung eines Glucoserestes auf das nicht-reduzierende Ende eines Polyglucans nutzt. Welche weiteren Enzyme an der Synthese von verzweigter Stärke beteiligt sind, ist derzeit größtenteils unbekannt.The synthesis takes place in the potato of strength mainly through the action of starch synthase, the essentially ADP glucose as a substrate for a transfer of a glucose residue on the non-reducing end of a polyglucan uses. Which other enzymes are involved in the synthesis of branched starch are, for the most part unknown.
Vdiederum sind an der Modifikation und dem Abbau der Stärke mehrere Enzyme beteiligt:Vdiederum are on the modification and the degradation of strength several enzymes involved:
Die Stärkephosphorylasen, die anorganisches Phosphat als Kosubstrat nutzen, bauen α-1,4 Bindungen bis vier Einheiten vor einer α-1,6 Verzweigung ab und arbeiten vom nicht-reduzierenden Ende her. Die β-Amylase hat als Exoamylase eine hohe Spezifität für α-1,4 Bindungen. Das am geringsten polymerisierte Substrat ist Maltotetraose. Verzweigungsstellen bewirken ein Ende des Kettenabbaus, wobei die letzte α-1,4 Bindung vor der Verzweigungsstelle bestehen bleibt (Whelan, 1961, Nature 190, 954–957). Die verbleibenden Polyglucane können von Transglycosylasen bearbeitet werden, die gleichzeitig hydrolytische und synthetisierende Enzymaktivität besitzen.The starch phosphorylases, the inorganic Using phosphate as a cosubstrate, α-1,4 bonds build up to four units before an α-1.6 Branch off and work from the non-reducing end. The β-amylase as exoamylase has a high specificity for α-1,4 bonds. The least polymerized substrate is maltotetraose. Cause branches one end of chain degradation, with the last α-1,4 bond before the branch point persists (Whelan, 1961, Nature 190, 954-957). The remaining polyglucans can processed by transglycosylases, which are simultaneously hydrolytic and have synthesizing enzyme activity.
An der Modifikation der Stärke arbeiten als Transglycosylasen das Q-Enzym (Verzweigungsenzym) und das T-Enzym. Das Minimalsubstrat für die vom T-Enzym katalysierte Reaktion ist α-1,4 Maltose, die zum Trisaccharid Panose und Glucose umgesetzt wird, wobei eine α-1,6 Bindung entsteht (Whelan, 1961; Abdullah & Whelan, 1960, J. Biochem. 75, 12P). Das Q-Enzym katalysiert die gleiche Transglycosylierung ausschließlich an Glucanen einer Kettenlänge von mindestens 40 Einheiten. Während das Vorkommen mehrerer Q-Enzyme bei anderen Spezies wie Mais (Singh & Preiss, 1985, Plant Physiol. 79: 34–40) bekannt ist, wurde im Fall von Solanum tuberosum nur das in der WO 92/14827 beschriebene Verzweigungsenzym entdeckt.Work on the modification of the strength as transglycosylases, the Q enzyme (branching enzyme) and the T enzyme. The minimum substrate for the reaction catalyzed by the T enzyme is α-1,4 maltose, that to the trisaccharide Panose and glucose is implemented, whereby an α-1.6 bond is formed (Whelan, 1961; Abdullah & Whelan, 1960, J. Biochem. 75, 12P). The Q enzyme catalyzes the same Transglycosylation only on glucans of a chain length of at least 40 units. While the presence of multiple Q enzymes in other species such as maize (Singh & Preiss, 1985, Plant Physiol. 79: 34-40) is known, only that in the case of Solanum tuberosum Branching enzyme described in WO 92/14827 was discovered.
Eine weitere Transglycosylase, das D-Enzym, wurde erstmals 1953 beschrieben (in Nature 172, 158). Peat et al. (1956, J. Chem. Soc., Part XX: 44–55) beschreiben es als eine Transglycosylase, die Maltodextrin-Substrate mit zwei oder mehr Einheiten überträgt und dabei ausschließlich α-1,4 Bindungen erzeugt. Das Substrat muss aus mindestens drei Einheiten aufgebaut sein, bezüglich des Akzeptors besteht eine geringe Spezifität. Takaha et al. (1993, J. Biol. Chem. 268, 1391–1396) beschreiben die Reinigung des D-Enzyms von Kartoffel (EC 2.4.1.25) sowie die Klonierung einer cDNA. Das gereinigte Enzym akzeptiert Glukose als Empfänger der zu übertragenden Kette, jedoch muss der Donor aus mindestens drei Glucoseeinheiten aufgebaut sein. Die Autoren beschreiben nicht, welche Art von Bindung bei der Transglycosylierung entsteht und gehen davon aus, dass das D-Enzym oder Disproportionierungsenzym wahrscheinlich nicht so sehr an der Modifikation als vielmehr am Abbau von Stärke beteiligt ist. Bisher ist noch unbekannt, ob andere Enzyme an der Modifikation der Stärke beteiligt sind. Ebenfalls ist unbekannt, welche Auswirkungen die Modifikation der Aktivitäten des T- oder D-Enzyms auf die Struktur der in den Zellen gebildeten Stärke haben, noch wurden diese Auswirkungen bisher untersucht. Da bisher angenommen wurde, dass das D-Enzym am Abbau der Stärke beteiligt ist, würde von einer Inaktivierung oder Überexpression des für das D-Enzym kodierenden Gens kein Effekt auf die Basisstruktur der gebildeten Stärke erwartet werden.Another transglycosylase, the D-enzyme was first described in 1953 (in Nature 172, 158). Peat et al. (1956, J. Chem. Soc., Part XX: 44-55) describe it as one Transglycosylase, the maltodextrin substrates with two or more Transferring units and doing so only α-1.4 bonds generated. The substrate must consist of at least three units be, regarding the acceptor has a low specificity. Takaha et al. (1993, J. Biol. Chem. 268, 1391-1396) describe the purification of the D-enzyme from potatoes (EC 2.4.1.25) as well as the cloning of a cDNA. The purified enzyme accepted Glucose as a recipient the one to be transferred Chain, however, the donor must consist of at least three glucose units be constructed. The authors do not describe what type of bond arises during transglycosylation and assume that this D-enzyme or disproportionation enzyme probably not so much is involved in the modification rather than in the breakdown of starch. So far still unknown whether other enzymes are involved in the modification of the starch are. The effects of the modification are also unknown of activities of the T or D enzyme on the structure of those formed in the cells Strength these effects have not yet been investigated. Since so far the D enzyme was thought to be involved in starch degradation, would of an inactivation or overexpression of for encoding the D enzyme No effect expected on the basic structure of the starch formed become.
Über die enzymatischen Reaktionen, die an der Einführung von Phosphatgruppen in die Stärke beteiligt sind, ist bisher nichts bekannt. Weder wurden Enzyme identifiziert, die für die Einführung der Phosphatgruppen verantwortlich sind, noch gibt es eine klare Vorstellung, welche Substrate als Phosphatgruppen-Donor fungieren.about the enzymatic reactions involved in the introduction of phosphate groups in the strenght nothing is known so far. Neither enzymes have been identified, the for the introduction of the phosphate groups are responsible, there is still a clear one Idea of which substrates act as phosphate group donors.
Dementsprechend konnte bisher noch niemand amylogene Pflanzen durch gentechnologische Verfahren erfolgreich spezifisch modifizieren, so dass sie eine Stärke produzieren, die in Bezug auf ihre physikalisch-chemischen Eigenschaften, beispielsweise den Stärkegehalt oder den Verzweigungsgrad, derart modifiziert ist, dass sie für die industrielle Verarbeitung besser geeignet ist als Stärke, die natürlich in Pflanzen vorkommt.Accordingly, so far no one amylogenic plants successful through genetic engineering modify specifically so that they produce a strength that is related on their physico-chemical properties, for example the starch content or the degree of branching, is modified so that it is for industrial Processing is more suitable than starch, which of course in Plants occurs.
Weiterhin ist bisher noch nicht bekannt, wie eine amylogene Pflanze durch gentechnologische Verfahren gezielt dahingehend modifiziert werden kann, dass die in dieser Pflanze gebildete Stärke einen höheren Gehalt an Phosphatgruppen aufweist.Furthermore, it is not yet known targeted like an amylogenic plant by genetic engineering can be modified so that in this plant formed strength a higher salary has phosphate groups.
Es wurde nun überraschend gefunden, dass es durch die Einführung einer Kombination von bekannten DNA-Sequenzen, die ein Verzweigungsenzym oder ein Disproportionierungsenzym der Kartoffel in Pflanzenzellen kodieren, ermöglicht wird Pflanzen herzustellen, die eine Stärke synthetisieren, die im Vergleich zu natürlich gebildeter Stärke modifiziert ist, wobei diese modifizierte Stärke sich von der natürlich gebildeten Stärke insbesondere in Bezug auf den Verzweigungsgrad und den Phosphatgehalt unterscheidet.It has now surprisingly been found that it through the introduction a combination of known DNA sequences that a branching enzyme or a potato disproportionation enzyme in plant cells encode, enables will produce plants that synthesize a starch that is used in Compared to natural formed strength is modified, whereby this modified strength differs from the naturally formed Strength especially with regard to the degree of branching and the phosphate content different.
Die vorliegende Erfindung stellt daher eine Zubereitung bereit, enthaltend eine Kombination von DNA-Sequenzen, die aus
- a) der Kodierregion eines Verzweigungsenzyms oder eines Teils davon, und
- b) der Kodierregion eines Disproportionierungsenzyms oder eines Teils davon
- (a) the coding region of a branching enzyme or a part thereof, and
- b) the coding region of a disproportionation enzyme or a part thereof
Insbesondere kann der Verzweigungsgrad der modifizierten Stärke derart verändert werden, dass eine verminderte oder verstärkte Verzweigung auftritt, so dass eine Stärke mit höherem oder niederem Anteil an Amylose synthetisiert wird. Alternativ können die zwei Kodierregionen des Verzweigungsenzyms und des Disproportionierungsenzym jede in antisense Orientierung an einen eigenen Promotor gekoppelt werden und so unabhängig voneinander transkribiert werden, oder sie können an einen gemeinsamen Promotor fusioniert werden.In particular, the degree of branching the modified starch so changed that there is a reduced or increased branching, so a strength with higher or a low proportion of amylose is synthesized. Alternatively, the two coding regions of the branching enzyme and the disproportionation enzyme each coupled to its own promoter in an antisense orientation become and so independent can be transcribed from each other, or they can be linked to a common promoter be merged.
Bisher wurde eine Kombination von DNA-Sequenzen, die ein Verzweigungsenzym kodieren, mit DNA-Sequenzen, die ein Disproportionierungsenzym kodieren, zur genetischen Modifikation von Pflanzenzellen und Pflanzen mit dem Ziel, in den genetisch modifizierten Pflanzen eine Stärke zu bilden, die in ihren physikalisch-chemischen Eigenschaften, insbesondere in Bezug auf den Verzweigungsgrad und den Phosphatgehalt, modifiziert ist, noch nicht beschrieben. Der Effekt, den die Einführung der neuen Kombination von DNA-Sequenzen in ein pflanzliches Genom auf die physikalisch-chemischen Eigenschaften der Stärke, insbesondere den Verzweigungsgrad und den Gehalt an Phosphatgruppen, ausübt, ist überraschend, da es bislang keinen Anhaltspunkt für eine Beteiligung des D-Enzyms an der Stärkesynthese und der Einführung von Verzweigungen, oder an der Einführung von Phosphatgrup pen in der gebildeten Stärke gab. Nach den Befunden von Peat et al. (1956) besitzt das D-Enzym nämlich nicht die Fähigkeit zur Knüpfung von α-1,6 Bindungen.So far, a combination of DNA sequences that encode a branching enzyme, with DNA sequences, encoding a disproportionation enzyme for genetic modification of plant cells and plants with the aim of being genetically modified Plant a starch to form, in particular, in their physico-chemical properties modified in terms of the degree of branching and the phosphate content is not yet described. The effect of the introduction of the new combination of DNA sequences in a plant genome the physicochemical properties of the starch, especially the degree of branching and the content of phosphate groups, is surprising since there is none Clue for involvement of the D-enzyme in starch synthesis and the introduction of Ramifications, or at the introduction of phosphate groups in the strength formed. According to the findings of Peat et al. (1956) the D enzyme does not have the ability for knotting from α-1.6 Bonds.
Die Kombination der DNA-Sequenzen besteht vorzugsweise aus den Kodierregionen der Verzweigungs- und Disproportionierungsenzyme von Solanum tuberosum, wobei die Kodierregion des Verzweigungsenzyms die auf dem rekombinanten Plasmid p35SH-anti-BE (DSM 9366) oder Plasmid p35S-anti-BE (DSM 6144) lokalisierte Sequenz, und die Kodierregion des Disproportionierungsenzyms die auf dem rekombinanten Plasmid p35SH-anti-D (DSM 8479) oder Plasmid p35Santi-D (DSM 9365) lokalisierte Sequenz ist. Es ist möglich, entweder die gesamte Kodierregionen oder Teile dieser Sequenzen zu verwenden, wobei diese Teile lang genug sein müssen, um einen antisense Effekt in den Zellen auszuüben. Es ist möglich, Teile bis zu einer minimalen Länge von 15 bp zu verwenden, vorzugsweise mit einer Länge von 100 bis 500 bp, oder, für eine wirksame antisense Inhibition, insbesondere Sequenzen mit einer Länge über 500 bp. In der Regel werden DNA Moleküle, die kürzer als 5000 bp sind, verwendet, vorzugsweise Sequenzen, die kürzer als 2500 bp sind.The combination of the DNA sequences consists preferably of the coding regions of the branch and Disproportionation enzymes from Solanum tuberosum, the coding region of the branching enzyme on the recombinant plasmid p35SH-anti-BE (DSM 9366) or plasmid p35S-anti-BE (DSM 6144) localized sequence, and the coding region of the disproportionation enzyme which is on the recombinant plasmid p35SH-anti-D (DSM 8479) or plasmid p35Santi-D (DSM 9365) localized sequence. It is possible to either the entire To use coding regions or parts of these sequences, these Parts must be long enough to have an antisense effect in the cells. It is possible to parts to a minimum length of 15 bp to be used, preferably with a length of 100 to 500 bp, or, for one effective antisense inhibition, especially sequences with a Length over 500 bp. Usually DNA molecules shorter than 5000 bp are used preferably sequences that are shorter than 2500 bp.
Die rekombinanten DNA-Sequenzen führen bei gleichzeitiger oder aufeinander folgender Einführung in ein pflanzliches Genom in transgenen Pflanzen zur Bildung von Transkripten, die die Bildung von Enzymen des Stärkemetabolismus dahingehend verändern, dass in den Zellen eine modifizierte Stärke gebildet wird, die im Vergleich mit der natürlich in den Zellen gebildeten Stärke inter alia einen erhöhten Phosphatgehalt und einen veränderten Verzweigungsgrad aufweist, insbesondere einen reduzierten bzw. einen erhöhten Verzweigungsgrad, wodurch die gebildete Stärke einen höheren oder niedrigeren Anteil an Amylose enthält.The recombinant DNA sequences lead to simultaneous or sequential introduction to a plant genome in transgenic plants to form transcripts that promote formation of enzymes of starch metabolism change to that a modified starch is formed in the cells, which in comparison with the course starch formed in the cells inter alia an increased Phosphate content and an altered Has degree of branching, in particular a reduced or one increased Degree of branching, which makes the strength formed a higher or lower proportion contains amylose.
Wenn beispielsweise eine Kombination von DNA-Sequenzen mit der Kodierregion des Verzweigungsenzyms auf Plasmid p35S-anti-BE (DSM 6144) und der Kodierregion des Disproportionierungsenzyms auf Plasmid p35SH-anti-D (DSM 8479), oder eine Kombination von DNA-Sequenzen mit der Kodierregion des Verzweigungsenzyms auf Plasmid p35SH-anti-BE (DMS 9366) und der Kodierregion des Disproportionierungsenzyms auf Plasmid p35S-anti-D (DSM 9365) gleichzeitig oder aufeinander folgend in das pflanzliche Genom transgener Pflanzen eingeführt wird, führt dies zur Synthese von Transkripten, die die Synthese des Verzweigungsenzyms und des Disproportionierungsenzyms in den Zellen hemmen, so dass in den Zellen eine modifizierte Stärke synthetisiert wird, die sich von der natürlich in den Zellen synthetisierten Stärke in Bezug auf ihren Verzweigungsgrad und ihren Phosphatgehalt unterscheidet.For example, if a combination of DNA sequences with the coding region of the branching enzyme Plasmid p35S-anti-BE (DSM 6144) and the coding region of the disproportionation enzyme on plasmid p35SH-anti-D (DSM 8479), or a combination of DNA sequences with the coding region of the branching enzyme on plasmid p35SH-anti-BE (DMS 9366) and the coding region of the disproportionation enzyme Plasmid p35S-anti-D (DSM 9365) simultaneously or in succession is introduced into the plant genome of transgenic plants, does this for the synthesis of transcripts which are the synthesis of the branching enzyme and inhibit the disproportionation enzyme in the cells so that a modified starch is synthesized in the cells different from the of course starch synthesized in the cells in terms of their degree of branching and their phosphate content.
Weiterhin führt eine Kombination von DNA-Sequenzen mit der Kodierregion des Verzweigungsenzyms und der Kodierregion des Disproportionierungsenzyms auf einem Plasmid, nämlich Plasmid p35S-anti-D-anti-BE (DSM 9367) bei Einführung in ein pflanzliches Genom in transgenen Pflanzen zur Bildung von Transkripten, die die Bildung des Verzweigungsenzyms und des Disproportionierungsenzyms in den Zellen hemmen, so dass in den Zellen eine modifizierte Stärke gebildet wird, die sich im Vergleich mit der natürlich in den Zellen gebildeten Stärke in Bezug auf ihren Verzweigungsgrad und ihren Phosphatgehalt unterscheidet.Furthermore, a combination of DNA sequences with the coding region of the branching enzyme and the coding region of the disproportionation enzyme on a plasmid, namely plasmid p35S-anti-D-anti-BE (DSM 9367) when introduced into a plant genome in transgenic plants to form transcripts that promote formation of the branching enzyme and the disproportionation enzyme in the Inhibit cells so that a modified starch is formed in the cells which is compared to that naturally formed in the cells Strength in terms of their degree of branching and their phosphate content.
Die vorliegende Erfindung stellt auch Verfahren für die Herstellung von transgenen Pflanzenzellen und transgenen Pflanzen bereit, die in der Lage sind, eine modifizierte Stärke zu synthetisieren, die sich von der natürlich in den Zellen synthetisierten Stärke insbesondere in Bezug auf ihren Verzweigungsgrad und ihren Phosphatgehalt unterscheidet. Die transgenen Pflanzen können hergestellt werden, indem zuerst eine der DNA Kombinationen gemäß der Erfindung stabil in das Genom einer Pflanzenzelle in tegriert und anschließend ganze Pflanzen aus diesen transformierten Pflanzenzellen regeneriert werden, dadurch gekennzeichnet, dass dieses Verfahren:
- A) ein einstufiges Verfahren ist, dass die folgenden Schritte umfasst:
- a) Herstellung einer Kombination von DNA-Sequenzen aus folgenden Teilsequenzen:
- i) je einem Promotor, der in Pflanzen aktiv ist und die Bildung einer RNA im vorgesehenen Zielgewebe oder den Zielzellen sicherstellt;
- ii) je einer Kodierregion eines Verzweigungsenzyms oder eines Teils davon und eines Disproportionierungsenzyms oder eines Teils davon, derart an den unter i) genannten Promotor fusioniert, dass ein Transkript vom nicht-kodierenden Strang gebildet wird (antisense-Fusion) und
- iii) je einer 3'-nichttranslatierten Sequenz, die in Pflanzenzellen zur Beendigung der Transkription sowie zur Addition von poly-A Resten an das 3'-Ende der RNA führt, derart an die unter ii) genannte Sequenz fusioniert, dass die 3'-nichttranslatierte Sequenz an das 3'-Ende des unter ii) genannten nicht-kodierenden Stranges anschließt;
- b) Transfer und Einbau der Kombinationen von DNA-Sequenzen in ein pflanzliches Genom zur Erzeugung transgener Pflanzenzellen und
- c) Regeneration von intakten, ganzen Pflanzen aus den transformierten Pflanzenzellen, oder
- B) ein einstufiges Verfahren, dass die folgenden Schritte aufweist:
- a) Herstellung einer Kombination von DNA-Sequenzen aus folgenden Teilsequenzen:
- i) einem Promotor, der in Pflanzen aktiv ist und die Bildung einer RNA im vorgesehenen Zielgewebe oder den Zielzellen sicherstellt,
- ii) der Fusion der Kodierregion eines Verzweigungsenzyms oder eines Teils davon und der Kodierregion eines Disproportionierungsenzyms oder eines Teils davon, wobei die beiden Kodierregionen so miteinander fusioniert sind, dass beide Kodierregionen in der selben Richtung (Sense oder Anti-sense) ge- lesen werden, und die an den unter i) genannten Promotor so fusioniert sind, dass sie ein Transkript des nicht-kodierenden Stranges der Fusion (Antisense-Fusion) bilden, und
- iii) eine 3'-nichttranslatierte Sequenz, die in Pflanzenzellen zur Beendigung der Transkription sowie zur Addition von poly-A Resten an das 3'-Ende der RNA führt, derart an die unter ii) genannte Sequenz fusioniert, dass die 3'-nichttranslatierte Sequenz and das 3'-Ende des unter ii) genannten nicht-kodierenden Stranges anschließt,
- b) Transfer und Einbau der Kombinationen von DNA-Sequenzen in ein pflanzliches Genom zur Erzeugung transgener Pflanzenzellen, und
- c) Regeneration von intakten, ganzen Pflanzen aus den transformierten Pflanzenzellen, oder
- C) ein zweistufiges Verfahren, bei dem zunächst eine DNA-Sequenz, bestehend aus den folgenden Teilstücken:
- iv) einem Promotor, der in Pflanzen aktiv ist und die Bildung einer RNA im vorgesehenen Zielgeweben oder den Zielzellen sicherstellt,
- v) einer Kodierregion eines Verzweigungsenzyms oder eines Teils davon, das derart an den unter iv) genannten Promotor fusioniert ist, dass ein Transkript vom nicht-kodierenden Strang gebildet wird (antisense-Fusion), und
- vi) einer 3'-nichttranslatierten Sequenz, die in Pflanzenzellen zur Beendigung der Transkription sowie zur Addition von poly-A Resten an das 3'-Ende der RNA führt, derart an die unter v) genännte Sequenz fusioniert, dass die 3'-nichttranslatierte Sequenz an das 3'-Ende des unter v) genannten nichtkodierenden Stranges anschließt, und die in das Genom einer Pflanzenzelle transferiert und eingebaut wird, und dass aus den auf diesem Weg genetisch modifizierten Pflanzen eine ganze Pflanze regeneriert wird, und anschließend durch wiederholte Transformation in Zellen dieser genetisch modifizierten Pflanze eine andere DNA-Sequenz, die aus den folgenden Teilsequenzen besteht:
- vii) einem Promotor, der in Pflanzen aktiv ist und die Bildung einer RNA im vorgesehenen Zielgewebe oder den Zielzellen sicherstellt,
- viii) einer Kodierregion eines Disproportionierungsenzyms oder eines Teils davon, das derart an den unter vii) genannten Promotor fusioniert ist, dass ein Transkript vom nicht-kodierenden Strang gebildet wird (antisense-Fusion), und
- ix) einer 3'-nichttranslatierten Sequenz, die in Pflanzenzellen zur Beendigung der Transkription sowie zur Addition von poly-A Resten an das 3'-Ende der RNA führt, derart an die unter viii) genannte Sequenz fusioniert, dass die 3'nichttranslatierte Sequenz an das 3'-Ende des unter viii) genannten nichtkodierenden Stranges anschließt, und die in das Genom einer Pflanzenzelle transferiert und eingebaut wird, und dass schließlich aus den auf diesem Weg genetisch modifizierten Pflanzenzellen, die beide Kodierregionen oder Teile davon enthalten, eine ganze Pflanze regeneriert wird, oder
- D) ein wie unter C) beschriebenes zweistufiges Verfahren, wobei die unter v) genannte Kodierregion nicht für ein Verzweigungsenzym, sondern für ein Disproportionierungsenzym kodiert, und die unter viii) genannte Kodierregion nicht für ein Disproportionierungsenzym, sondern für ein Verzweigungsenzym kodiert.
- A) is a one step process that includes the following steps:
- a) Production of a combination of DNA sequences from the following partial sequences:
- i) one promoter each, which is active in plants and ensures the formation of an RNA in the intended target tissue or cells;
- ii) a coding region of a branching enzyme or a part thereof and a disproportionation enzyme or a part thereof, fused to the promoter mentioned under i) such that a transcript is formed from the non-coding strand (antisense fusion) and
- iii) a 3'-untranslated sequence which leads to the termination of transcription and addition of poly-A residues to the 3 'end of the RNA in plant cells, fused to the sequence mentioned under ii) in such a way that the 3'- untranslated sequence at the 3 'end of the non-coding strand mentioned under ii);
- b) transfer and incorporation of the combinations of DNA sequences into a plant genome to generate transgenic plant cells and
- c) regeneration of intact, whole plants from the transformed plant cells, or
- B) a one-step process that comprises the following steps:
- a) Production of a combination of DNA sequences from the following partial sequences:
- i) a promoter that is active in plants and ensures the formation of an RNA in the intended target tissue or cells,
- ii) the fusion of the coding region of a branching enzyme or a part thereof and the coding region of a disproportionation enzyme or a part thereof, the two coding regions being fused to one another in such a way that both coding regions are read in the same direction (sense or anti-sense), and which are fused to the promoter mentioned under i) such that they form a transcript of the non-coding strand of the fusion (antisense fusion), and
- iii) a 3'-untranslated sequence which leads to termination of transcription and addition of poly-A residues to the 3'-end of the RNA in plant cells, fused to the sequence mentioned under ii) in such a way that the 3'-untranslated Sequence connects to the 3 'end of the non-coding strand mentioned under ii),
- b) transfer and incorporation of the combinations of DNA sequences into a plant genome to produce transgenic plant cells, and
- c) regeneration of intact, whole plants from the transformed plant cells, or
- C) a two-stage process, in which first a DNA sequence consisting of the following sections:
- iv) a promoter which is active in plants and ensures the formation of an RNA in the intended target tissue or cells,
- v) a coding region of a branching enzyme or a part thereof which is fused to the promoter mentioned under iv) in such a way that a transcript is formed from the non-coding strand (antisense fusion), and
- vi) a 3'-untranslated sequence which leads to termination of transcription and addition of poly-A residues to the 3'-end of the RNA in plant cells, fused to the sequence mentioned under v) such that the 3'-untranslated Sequence at the 3 'end of the non-coding strand mentioned under v), and which is transferred and incorporated into the genome of a plant cell, and that a whole plant is regenerated from the genetically modified plants in this way, and then by repeated transformation into Cells of this genetically modified plant have a different DNA sequence, which consists of the following partial sequences:
- vii) a promoter that is active in plants and ensures the formation of an RNA in the intended target tissue or cells,
- viii) a coding region of a disproportionation enzyme or a part thereof which is fused to the promoter mentioned under vii) in such a way that a transcript is formed from the non-coding strand (antisense fusion), and
- ix) a 3'-untranslated sequence which leads in plant cells to the end of transcription and to the addition of poly-A residues to the 3 'end of the RNA, fused to the sequence mentioned under viii) in such a way that the 3' untranslated sequence connects to the 3 'end of the non-coding strand mentioned under viii), and which is transferred and incorporated into the genome of a plant cell, and finally, from the plant cells genetically modified in this way, which contain both coding regions or parts thereof, an entire plant is regenerated, or
- D) a two-stage process as described under C), the coding region mentioned under v) not coding for a branching enzyme but for a disproportionation enzyme, and the coding region mentioned under viii) not for a disproportionation enzyme but for a branching enzyme.
Die in der Kombination zur Anwendung kommenden und unter den Verfahrensschritten i), iv) und vii) genannten Promotoren können grundsätzlich alle Promotoren sein, die in Pflanzen aktiv sind. Beispielsweise ist es möglich, den 35S Promotor des Blumenkohl-Mosaik-Virus zu verwenden, der prinzipiell eine konstitutive Expression von nachgeschalteten DNA-Sequenzen in allen Geweben transformierter Pflanzen bewirkt. Präferenziell werden Promotoren eingesetzt, die in den stärkespeichernden Organen der zu transformierenden Pflanzen aktiv sind. Bei Mais sind dies die Maiskörner, während es bei Kartoffel die Knollen sind. Zur Transformation von Kartoffel kann insbesondere, aber nicht ausschließlich, der knollenspezifische B33 Promotor von Solanum tuberosum oder ein anderer Promotor eines Klasse I-Patatingens eingesetzt werden. Die Kodierregionen von Verzweigungsenzym und Disproportionierungsenzym werden derart an den Promotor fusioniert, dass das 3'-Ende der Kodierregion an das 3'-Ende des Promotors angefügt wird. Diese Anordnung bezeichnet man als antisense-Orientierung. Die antisense-Orientierung bewirkt, dass bei der Expression des Transgens der nicht-kodogene Strang zur Synthese eines Transkripts abgelesen wird. Das nicht-kodierende Transkript kann in einer genetisch veränderten Pflanze das endogene, kodierende Transkript neutralisieren, so dass es nicht zur Translation in ein Peptid kommt. Dadurch entfällt die enzymatische Aktivität des Verzweigungs- und des Disproportionierungsenzyms in den genetisch veränderten Pflanzen. Der Erfolg der Translationsinhibition hängt inter alia von der Menge der in der Zelle wirksamen antisense-Transkripte ab. Zur Stabilisierung der Transkripte, die von der eingeführten Kombination von DNA-Sequenzen gebildet werden, wird daher an die Kodierregionen von Verzweigungsenzym und Disproportionierungsenzym ein Terminati ons- und Polyadenylierungssignal angehängt. Dies kann beispielsweise das Terminationssignal des Nopalinsynthase-Gens aus Agrobacterium tumefaciens sein.The combination in use coming and mentioned under process steps i), iv) and vii) Promoters can in principle all promoters that are active in plants. For example it possible the 35S promoter of the cauliflower mosaic virus to use the principle of a constitutive expression of downstream DNA sequences in all tissues of transformed plants. preferentially are promoters used in the starch-storing organs of plants to be transformed are active. These are the case with maize Corn kernels, while it is the tubers of potatoes. For the transformation of potatoes can in particular, but not exclusively, the bulb-specific B33 promoter from Solanum tuberosum or another promoter of one Class I patatens are used. The coding regions of branching enzyme and disproportionation enzyme are fused to the promoter such that the 3 'end of the Coding region at the 3 'end of the promoter added becomes. This arrangement is called the antisense orientation. The antisense orientation causes the expression of the Transgenic the non-codogenic strand for the synthesis of a transcript is read. The non-coding transcript can be in a genetic changed Plant neutralize the endogenous coding transcript so that there is no translation into a peptide. This eliminates the enzymatic activity of the branching and disproportionation enzyme in the genetically changed Plants. The success of translation inhibition depends internally alia from the amount of antisense transcripts effective in the cell from. To stabilize the transcripts introduced by the combination of DNA sequences are therefore formed at the coding regions of branching enzyme and disproportionation enzyme a termination and polyadenylation signal attached. This can be the termination signal of the nopaline synthase gene, for example from Agrobacterium tumefaciens.
Die durch die Fusion von Promotor, Kodierregion des Verzweigungs- bzw. des Disproportionierungsenzyms und Terminationssignals gebildeten Konstrukte werden vorzugsweise mit Hilfe geeigneter Plasmide in Pflanzenzellen eingeführt. Die rekombinanten Plasmide können die Kombination als Fusion beider kodierender DNA-Sequenzen oder Teile dieser Sequenzen, die lang genug sind, um einen antisense-Effekt zu bewirken, enthalten, oder sie können jeweils ein Element der Kombination enthalten. Wenn die rekombinanten Plasmide beide der vorstehend bezeichneten DNA-Sequenzen enthalten, können diese entweder von einem gemeinsamen Promotor (Verfahrensvariante B)) oder jeweils von einem eigenen Promotor (Verfahrensvariante A)) transkribiert werden. Wenn die rekombinanten Plasmide beide Elemente der Kombination enthalten, können transgene Pflanzen, die die erfindungsgemäße Kombination von DNA-Sequenzen enthalten, in einem einstufigen Verfahren hergestellt werden. In dem erfindungsgemäßen einstufigen Verfahren (Verfahrensvariante B)) wird vorzugsweise das Plasmid p35S-anti-D-anti-BE (DSM 9367) verwendet. Wenn die rekombinanten Plasmide jeweils ein Element der Kombination enthalten, können sie nacheinander zur Transformation eingesetzt werden, so dass transgene Pflanzen, die die erfindungsgemäße Kombination von DNA-Sequenzen enthalten, in einem zweistufigen Verfahren hergestellt werden können.By the merger of promoter, Coding region of the branching or disproportionation enzyme and termination signal constructs are preferred introduced into plant cells using suitable plasmids. The recombinant plasmids can the combination as a fusion of both coding DNA sequences or Parts of these sequences that are long enough to have an antisense effect to cause contain, or they can each be an element of Combination included. If the recombinant plasmids are both of the DNA sequences referred to above can contain either from a common promoter (process variant B)) or each from its own promoter (process variant A)) be transcribed. If the recombinant plasmids contain both elements the combination can contain transgenic plants, the inventive combination of DNA sequences included, are produced in a one-step process. In the one-stage according to the invention Process (process variant B)) is preferably the plasmid p35S-anti-D-anti-BE (DSM 9367) used. If the recombinant plasmids are each one Containing element of the combination, they can be successively used for transformation are used, so that transgenic plants, the combination of the invention of DNA sequences contained, produced in a two-stage process can be.
In dem erfindungsgemäßen zweistufigen Verfahren (Verfahrensvarianten C) und D)) werden vorzugsweise die Plasmide p35S-anti-BE (DSM 6144) und p35SH-anti-D (DSM 8479), oder die Plasmide p35Santi-D (DSM 9365) und p35SH-anti-BE (DSM 9366) oder Derivate davon verwendet. Die Plasmide sind ein weiterer Gegenstand der Erfindung.In the two-stage according to the invention Processes (process variants C) and D)) are preferably the Plasmids p35S-anti-BE (DSM 6144) and p35SH-anti-D (DSM 8479), or the plasmids p35Santi-D (DSM 9365) and p35SH-anti-BE (DSM 9366) or derivatives thereof. The plasmids are another subject the invention.
Die Erfindung stellt weiterhin Pflanzenzellen und Pflanzen bereit, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt werden können, in deren Genom eine oder mehrere der erfindungsgemäßen DNA-Kombinationen integriert ist (sind), und die in der Lage sind, eine modifizierte Stärke zu synthetisieren, die sich von der natürlich gebildeten Stärke inter alia in Bezug auf den Verzweigungsgrad und den Phosphatgehalt unterscheidet.The invention also provides plant cells and plants prepared using the method according to the invention can, in their genome one or more of the DNA combinations according to the invention is (are) integrated, and are capable of a modified Strength to synthesize inter themselves from the naturally formed strength alia differs in terms of the degree of branching and the phosphate content.
Prinzipiell können die erfindungsgemäßen Verfahren auf alle Pflanzen angewendet werden. Von besonderem Interesse sind die Pflanzen, die Stärke als Speicherungssubstanz bilden, insbesondere Agrarpflanzen. Die erfindungsgemäßen Verfahren werden vorzugsweise bei Pflanzen angewendet, bei denen ein Verzweigungsenzym und ein Disproportionierungsenzym bei der Modifikation der Stärke beteiligt sind. Dabei handelt es sich vorzugsweise um eine Kartoffelpflanze.In principle, the method according to the invention can be applied to all plants. Are of particular interest the plants, the strength form as storage substance, especially agricultural plants. The method according to the invention are preferably used in plants in which a branching enzyme and a disproportionation enzyme involved in the modification of the starch are. It is preferably a potato plant.
Die Teilsequenzen aus der neuen Kombination von DNA-Sequenzen, die für das Verzweigungsenzym und das Disproportionierungsenzym von Solanum tuberosum kodieren, können durch Klonen in Plasmidvektoren von Bakterien repliziert werden. Beispiele für Vektoren sind pBR322, die der pUC-Serie, der m13mp-Serie usw.. Die DNA-Sequenzen können mit Linkern versehen werden, die eine einfache Reklonierung in andere Plasmide ermöglichen. Zum Einführen in Pflanzen (siehe Beispiel 6) ist es vorzugsweise, aber nicht ausschließlich, möglich, binäre Plasmide zu verwenden, die ein Replikationssignal enthalten, z. B. für Escherichia coli und für Agrobacterium tumefaciens. Wenn die binären Plasmide T-DNA Sequenzen enthalten, ist es besonders einfach, die Kombination von DNA-Sequenzen in das Genom von dicotylen Pflanzen zu transferieren. Es sind jedoch auch andere Verfahren möglich, beispielsweise die Transformation mit Hilfe von ballistischen Verfahren, die für die Transformation von Monocotylen (Potrykus, 1991, Ann.The partial sequences from the new combination of DNA sequences which code for the branching enzyme and the disproportionation enzyme of Solanum tuberosum can be replicated by cloning in plasmid vectors of bacteria. Examples of vectors are pBR322, those of the pUC series, the m13mp series etc. The DNA sequences can be provided with linkers which enable simple recloning into other plasmids. For introduction into plants (see example 6) it is preferably, but not exclusively, possible to use binary plasmids which contain a replication signal, e.g. B. for Escherichia coli and for Agrobacterium tumefaciens. If the binary plasmids contain T-DNA sequences, it is particularly easy to transfer the combination of DNA sequences into the genome of dicotyledonous plants. However, other methods are also possible, for example the transformation using ballistic methods which are used for the transformation of monocotyledons (Potrykus, 1991, Ann.
Rev. Plant Mol. Biol. Plant Physiol. 42, 205–225) verwendet wird.Rev. Plant Mol. Biol. Plant Physiol. 42, 205-225) is used.
Infolge der Übertragung der neuen Kombination von DNA-Sequenzen, die je einen Promotor, eine Kodierregion des Verzweigungs- und des Disproportionierungsenzyms oder eine Fusion der zwei Kodierregionen in antisense-Orientierung zum Promotor, und ein Terminierungs-/Polyadenylierungssignal enthalten, kommt es in den transgenen Pflanzen zur Bildung von RNA-Molekülen, die durch Wechselwirkung mit den endogenen mRNAs des Verzweigungsenzyms und des Disproportionierungsenzyms deren Synthese unterdrücken. Dadurch wird eine Stärke zugänglich, die in Bezug auf ihren Verzweigungsgrad und ihren Phosphatgehalt modifiziert ist.As a result of the transfer of the new combination of DNA sequences, each with a promoter, a coding region of the Branching and disproportionation enzyme or a fusion of the two coding regions in antisense orientation to the promoter, and contain a termination / polyadenylation signal it in the transgenic plants to form RNA molecules that by interacting with the endogenous mRNAs of the branching enzyme and the disproportionation enzyme suppress their synthesis. Thereby becomes a strength accessible, those in terms of their degree of branching and their phosphate content is modified.
Die in den transgenen Pflanzen gebildete Stärke kann mit gängigen Methoden aus den Pflanzen oder aus den Pflanzenzellen isoliert und nach der Reinigung zur Herstellung von Nahrungsmitteln und industriellen Produkten verarbeitet werden:The one formed in the transgenic plants Strength can with common Methods isolated from plants or from plant cells and after cleaning to produce food and industrial products are processed:
Hinterlegungendeposits
Das Plasmid p35-anti-BE (DSM 6144) und das Plasmid p35SH-anti-D (DSM 8479) wurden am 20.08.1990 bzw. am 26.08.1993 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM) in Braunschweig, Bundesrepublik Deutschland, nach den Vorschriften des Budapester Vertrags hinterlegt.The plasmid p35-anti-BE (DSM 6144) and the plasmid p35SH-anti-D (DSM 8479) on August 20, 1990 and on August 26, 1993 at the German Collection of Microorganisms (DSM) in Braunschweig, Federal Republic of Germany, according to the regulations of the Budapest Treaty.
Folgende zusätzliche Plasmide wurde gleichermaßen am 10.08.1994 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM) in Braunschweig, Bundesrepublik Deutschland, nach den Vorschriften des Budapester Vertrags hinterlegt: The following additional plasmids were deposited on August 10, 1994 at the German Collection of Microorganisms (DSM) in Braunschweig, Federal Republic of Germany, in accordance with the provisions of the Budapest Treaty:
Beschreibung der AbbildungenDescription of the pictures
- A = Fragment A (529 bp) beinhaltet den 35S Promotor des Blumenkohl-Mosaik-Virus (CaMV), d. h. Nukleotide 6909 bis 7437 des CaMV
- B = Fragment B (2909 bp) beinhaltet ein DNA-Fragment mit der Kodierregion des Verzweigungsenzyms von Solanum tuberosum
- C = Fragment C (192 bp) beinhaltet das Polyadenylierungssignal des Gens 3 der T-DNA des Ti-Plasmids pTi ACH5, Nukleotide 11749–11939.
- A = fragment A (529 bp) contains the 35S promoter of the cauliflower mosaic virus (CaMV), ie nucleotides 6909 to 7437 of the CaMV
- B = fragment B (2909 bp) contains a DNA fragment with the coding region of the branching enzyme of Solanum tuberosum
- C = fragment C (192 bp) contains the polyadenylation signal of gene 3 of the T-DNA of the Ti plasmid pTi ACH5, nucleotides 11749-11939.
- A = Fragment A (529 bp) beinhaltet den 35S-Promotor des Blumenkohl-Mosaik-Virus (CaMV), d. h. Nukleotide 6909 bis 7437 des CaMV
- B = Fragment B (1474 bp) beinhaltet ein DNA-Fragment mit der Kodierregion des Disproportionierungsenzyms von Solanum tuberosum
- C = Fragment C (192 bp) beinhaltet das Polyadenylierungssignal des Gens 3 der T-DNA des Ti-Plasmids pTiACH5, Nukleotide 11749–11939.
- A = fragment A (529 bp) contains the 35S promoter of the cauliflower mosaic virus (CaMV), ie nucleotides 6909 to 7437 of the CaMV
- B = fragment B (1474 bp) contains a DNA fragment with the coding region of the disproportionation enzyme of Solanum tuberosum
- C = fragment C (192 bp) contains the polyadenylation signal of gene 3 of the T-DNA of the Ti plasmid pTiACH5, nucleotides 11749-11939.
- A = Fragment A (529 bp) beinhaltet den 35S-Promotor des Blumenkohl-Mosaik-Virus (CaMV), d. h. Nukleotide 6909 bis 7437 des CaMV
- B = Fragment B (3068 bp) beinhaltet ein DNA-Fragment mit der Kodierregion des Verzweigungsenzyms von Solanum tuberosum
- C = Fragment C (192 bp) beinhaltet das Polyadenylierungssignal des Gens 3 der T-DNA des Ti-Plasmids pTiACH5, Nukleotide 11749–11939.
- A = fragment A (529 bp) contains the 35S promoter of the cauliflower mosaic virus (CaMV), ie nucleotides 6909 to 7437 of the CaMV
- B = fragment B (3068 bp) contains a DNA fragment with the coding region of the branching enzyme of Solanum tuberosum
- C = fragment C (192 bp) contains the polyadenylation signal of gene 3 of the T-DNA of the Ti plasmid pTiACH5, nucleotides 11749-11939.
- A = Fragment A (529 bp) beinhaltet den 35S-Promotor des Blumenkohl-Mosaik-Virus (CaMV), d. h. Nukleotide 6909 bis 7437 des CaMV
- B = Fragment B (1474 bp) beinhaltet ein DNA-Fragment mit der Kodierregion des Disproportionierungsenzyms von Solanum tuberosum
- C = Fragment C (192 bp) beinhaltet das Polyadenylierungssignal des Gens 3 der T-DNA des Ti-Plasmids pTiACH5, Nukleotide 11749–11939.
- A = fragment A (529 bp) contains the 35S promoter of the cauliflower mosaic virus (CaMV), ie nucleus otide 6909 to 7437 of the CaMV
- B = fragment B (1474 bp) contains a DNA fragment with the coding region of the disproportionation enzyme of Solanum tuberosum
- C = fragment C (192 bp) contains the polyadenylation signal of gene 3 of the T-DNA of the Ti plasmid pTiACH5, nucleotides 11749-11939.
- A = Fragment A (529 bp) beinhaltet den 35S-Promotor des Blumenkohl-Mosaik-Virus (CaMV), d. h. Nukleotide 6909 bis 7437 des CaMV
- B = Fragment B (1474 bp) beinhaltet ein DNA-Fragment mit der Kodierregion des Disproportionierungsenzyms von Solanum tuberosum
- C = Fragment C (192 bp) beinhaltet das Polyadenylierungssignal des Gens 3 der T-DNA des Ti-Plasmids pTiACH5, Nukleotide 11749–11939
- D = Fragment D (3068 bp) beinhaltet ein DNA-Fragment mit der Kodierregion des Verzweigungsenzyms von Solanum tuberosum.
- A = fragment A (529 bp) contains the 35S promoter of the cauliflower mosaic virus (CaMV), ie nucleotides 6909 to 7437 of the CaMV
- B = fragment B (1474 bp) contains a DNA fragment with the coding region of the disproportionation enzyme of Solanum tuberosum
- C = fragment C (192 bp) contains the polyadenylation signal of gene 3 of the T-DNA of the Ti plasmid pTiACH5, nucleotides 11749-11939
- D = fragment D (3068 bp) contains a DNA fragment with the coding region of the branching enzyme of Solanum tuberosum.
Die Gesamt-RNA wurde auf die Anwesenheit
von Transkripten, die für
das Verzweigungsenzym oder das Disproportionierungsenzym kodieren,
untersucht. Dabei wurden die für
diese Enzyme kodierenden cDNA-Moleküle als Hybridisierungsproben
verwendet.
Das obere der zwei Hybridisierungssignale entspricht Transkripten, die für das Verzweigungsenzym kodieren, und das untere Hybridisierungssignal entspricht Transkripten, die für das Disproportionierungsenzym kodieren.The top of the two hybridization signals corresponds to transcripts for encode the branching enzyme, and the lower hybridization signal corresponds to transcripts for encode the disproportionation enzyme.
Die Gesamt-RNA wurde auf die Anwesenheit
von Transkripten, die für
das Verzweigungsenzym oder das Disproportionierungsenzym kodieren,
untersucht. Dabei wurden die für
diese Enzyme kodierenden cDNA-Moleküle als Hybridisierungsproben
verwendet.
Das obere der zwei Hybridisierungssignale entspricht Transkripten, die für das Verzweigungsenzym kodieren, und das untere Hybridisierungssignal entspricht Transkripten, die für das Disproportionierungsenzym kodieren.The top of the two hybridization signals corresponds to transcripts for encode the branching enzyme, and the lower hybridization signal corresponds to transcripts for encode the disproportionation enzyme.
Die Gesamt-RNA wurde auf die Anwesenheit
von Transkripten, die für
das Verzweigungsenzym oder das Disproportionierungsenzym kodieren,
untersucht. Dabei wurden die für
diese Enzyme kodierenden cDNA-Moleküle als Hybridisierungsproben
verwendet.
Das obere der zwei Hybridisierungssignale entspricht Transkripten, die für das Verzweigungsenzym kodieren, und das untere Hybridisierungssignal entspricht Transkripten, die für das Disproportionierungsenzym kodieren.The top of the two hybridization signals corresponds to transcripts for encode the branching enzyme, and the lower hybridization signal corresponds to transcripts for encode the disproportionation enzyme.
Zum besseren Verständnis der erfindungsgemäßen Beispiele werden zunächst die wichtigsten Verfahren erläutert.To better understand the examples according to the invention be first the main procedures explained.
1. Klonierungsverfahren1. Cloning procedure
Zur Klonierung wurde der Vektor pUC18 (Yanisch-Perron et al. (1985) Gene 33, 103–119) benutzt.The vector pUC18 was used for cloning (Yanisch-Perron et al. (1985) Gene 33, 103-119).
Für die Pflanzentransformation wurden die Genkonstrukte in den binären Vektor BIN19 (Bevan (1984) Nucl. Acids Res. 12, 8711-8720) kloniert.For the plant transformations were the gene constructs in the binary vector BIN19 (Bevan (1984) Nucl. Acids Res. 12, 8711-8720).
2. Bakterienstämme2. Bacterial strains
Für die pUC-Vektoren wurden die E. coli-Stämme BMH71-18 (Messing et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 24, 6342–6346) oder TB1 benutzt. TB1 ist ein Rekombinations-negatives, Tetracyclinresistentes Derivat des Stammes JM 101 (Yanisch-Perron et al. (1985) Gene 33, 103–199). Der Genotyp des TB1-Stammes ist (Bart Barrel, pers. Mitteil.): F, traD36, proAB, lacl, lacZdM15, d(lac, pro), SupE, thiS, recA, Srl::Tn10(Tcr).For the pUC vectors were the E. coli strains BMH71-18 (Messing et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 24, 6342-6346) or TB1. TB1 is a recombination-negative, tetracycline-resistant derivative strain JM 101 (Yanisch-Perron et al. (1985) Gene 33, 103-199). The Genotype of the TB1 strain is (Bart Barrel, personal communication): F, traD36, proAB, lacl, lacZdM15, d (lac, pro), SupE, thiS, recA, Srl :: Tn10 (Tcr).
Die Pflanzentransformation wurde mit Hilfe des Agrobacterium tumefaciens-Stammes LBA4404 (Bevan (1984) Nucl. Acids Res. 12, 8711–8721), BIN19-Derivat, durchgeführt.The plant transformation was using the Agrobacterium tumefaciens strain LBA4404 (Bevan (1984) Nucl. Acids Res. 12, 8711-8721), BIN19 derivative.
3. Transformation von Agrobacterium tumefaciens3. Transformation from Agrobacterium tumefaciens
Bei BIN19-Derivaten erfolgt die Einführung der DNA in die Agrobakterien durch direkte Transformation nach der Methode von Holsters et al. (1978, Mol. Gen. Genet. 163, 181–187). Die Plasmid-DNA transformierter Agrobacterien wurde nach der Methode von Birnboim et al. (1979, Nucl. Acids Res. 7, 1513–1523) isoliert und nach geeigneter Restriktionsspaltung gelelektrophoretisch aufgetrennt.In the case of BIN19 derivatives, the DNA into the agrobacteria by direct transformation according to the method by Holsters et al. (1978, Mol. Gen. Genet. 163, 181-187). The Plasmid DNA transformed Agrobacteria was analyzed according to the method by Birnboim et al. (1979, Nucl. Acids Res. 7, 1513-1523) and separated by gel electrophoresis after suitable restriction cleavage.
4. Pflanzentransformation4. Plant transformation
10 kleine, mit einem Skalpell verwundete Blätter einer Kartoffel-Sterilkultur wurden in 10 ml MS-Medium mit 2% Saccharose gelegt, welches 30–50 μl einer unter Selektion gewachsenen Agrobacterium tumefaciens-Übernachkultur enthielt. Nach 3-5 minütigem leichten Schütteln wurden die Petrischalen bei 25°C im Dunkeln inkubiert. Nach 2 Tagen wurden die Blätter auf MS-Medium mit 1,6% Glucose, 2 mg/l Zeatinribose, 0,02 mg/l Naphthylessigsäure, 0,02 mg/l Giberellinsäure, 500 mg/l Claforan, 50 mg/l Kanamycin und 0,8% Bacto-Agar ausgelegt. Nach einwöchiger Inkubation bei 25°C und 3000 Lux wurde die Claforankonzentration im Medium um die Hälfte reduziert. Die weitere Kultivierung erfolgte wie von Rocha-Sosa et al. (1989, EMBO Journal 8, 29) beschrieben.10 small ones wounded with a scalpel leaves a potato sterile culture was placed in 10 ml MS medium with 2% sucrose placed, which 30-50 ul one under Selection contained grown Agrobacterium tumefaciens post-culture. To 3-5 minutes easy shake the Petri dishes were at 25 ° C incubated in the dark. After 2 days the leaves were on MS medium with 1.6% glucose, 2 mg / l zeatinribose, 0.02 mg / l naphthylacetic acid, 0.02 mg / l giberellic acid, 500 mg / l Claforan, 50 mg / l kanamycin and 0.8% Bacto agar. After a week Incubation at 25 ° C and 3000 lux, the Claforan concentration in the medium was reduced by half. The further cultivation was carried out as described by Rocha-Sosa et al. (1989, EMBO Journal 8, 29).
5. Analyse genomischer DNA aus transgenen Pflanzen5. Analysis genomic DNA from transgenic plants
Die Isolierung genomischer Pflanzen-DNA erfolgte nach Rogers et al. (1985, Plant Mol. Biol. 5, 69–76). Für die DNA-Analyse wurden 10–20 μg DNA nach geeigneter Restriktionsspaltung mit Hilfe von "Southern Blots" auf Integration der zu untersuchenden DNA-Sequenzen analysiert.Isolation of plant genomic DNA was done according to Rogers et al. (1985, Plant Mol. Biol. 5, 69-76). For DNA analysis 10-20 μg of DNA were found suitable restriction cleavage with the help of "Southern blots" for integration of the DNA sequences to be examined analyzed.
6. Analyse der Gesamt-RNA aus transgenen Pflanzen6. Analysis of total RNA from transgenic plants
Die Isolierung pflanzlicher Gesamt-RNA erfolgte nach Logemann et al. (1987, Analytical Biochem. 163, 16–20). Für die Analyse wurden je 50 μg Gesamt-RNA mit Hilfe von "Northern Blots" auf die Anwesenheit der gesuchten Transkripte untersucht.Isolation of total plant RNA was done according to Logemann et al. (1987, Analytical Biochem. 163, 16-20). For analysis were each 50 μg Total RNA using "Northern Blots "on the presence of the searched for transcripts.
7. Bestimmung des Phosphatgehalts von aus transgenen Kartoffelpflanzen isolierter Stärke7. Determination of the phosphate content of isolated from transgenic potato plants Strength
Um den Phosphatgehalt von in transgenen Pflanzen gebildeter Stärke zu bestimmen, wurde Stärke aus Kartoffelknollen isoliert und 250 mg dieser Stärke in 1 ml 0,7 N HCl suspendiert. Die Suspension wurde 4 h bei 100°C inkubiert. 800 ml Puffer (100 mM MOPS-KOH mit einem pH-Wert von 7,5; 10 mM MgCl2; 2 mM EDTA) wurden zu einem 100 ml-Aliquot zugefügt, das Gemisch in eine Küvette überführt und durch Zugabe von 100 ml 0,7 N KOH neutralisiert. Anschließend wurden nacheinander zugegeben: NAD (Endkonzentration: 0,4 mM) und Glucose-6-phosphatdehydrogenase von Leuconostoc (Sigma) (Endvolumen der Testcharge: 1 ml). Die Absorptionsänderung wurde bei einer Wellenlänge von 340 nm gemessen.In order to determine the phosphate content of starch formed in transgenic plants, starch was isolated from potato tubers and 250 mg of this starch were suspended in 1 ml of 0.7 N HCl. The suspension was incubated at 100 ° C for 4 h. 800 ml of buffer (100 mM MOPS-KOH with a pH of 7.5; 10 mM MgCl 2 ; 2 mM EDTA) were added to a 100 ml aliquot, the mixture was transferred to a cuvette and 100 ml of 0 were added , 7 N KOH neutralized. The following were then added in succession: NAD (final concentration: 0.4 mM) and glucose-6-phosphate dehydrogenase from Leuconostoc (Sigma) (final volume of the test batch: 1 ml). The change in absorption was measured at a wavelength of 340 nm.
Die nachfolgenden Beispiele erläutern den Gegenstand der Erfindung ohne ihn einzuschränken, wobei zunächst die Konstruktion von binären Plasmiden und anschließend die Herstellung von transgenen Kartoffelpflanzen, die die DNA-Sequenz-Kombination enthalten, gezeigt werden.The following examples explain the Subject of the invention without restricting it, initially the Construction of binary Plasmids and then the production of transgenic potato plants that combine the DNA sequence included.
In analoger Verfahrensweise können auch andere Nutzpflanzen, bei denen ein Verzweigungs- und ein Disproportionierungsenzym an der Modifikation der Stärke beteiligt sind, transformiert werden.In an analogous procedure, too other crops in which a branching and a disproportionation enzyme on the modification of the strength are involved.
Beispiel 1example 1
Konstruktion des binären Plasmids p35S-anti-BEConstruction of the binary plasmid p35S-anti-BE
Entsprechend der in der WO 92/14827 widergegebenen Vorschrift wurde das Plasmid p35S-anti-BE (DSM 6144) hergestellt, wobei insbesondere die folgenden Schritte ausgeführt wurden: Aus einer im Expressionsvektor λgt11 angelegten cDNA Bank von Knollengewebe aus Solanum tuberosum var. Desirée wurden verschiedene Klone identifiziert, die von einem gegen das Verzweigungsenzym gerichteten Antiserum erkannt wurden (zur Durchführung der immunologischen Bestimmung s. Beispiel 3, "Western Blot"). Diese Klone wurden verwendet, um aus einer in der HindIII-Schnittstelle des Plasmid pUCl9 angelegten cDNA Bibliothek aus wachsenden Knollen von Solanum tuberosum Klone voller Länge (full-length clones) zu isolieren. Ein Klon mit einer Insertion der Größe 2.909 bp wurde für die weitere Klonierung verwendet.Corresponding to that in WO 92/14827 the plasmid p35S-anti-BE (DSM 6144) produced, the following steps in particular being carried out: From one in the expression vector λgt11 cDNA bank of tuber tissue from Solanum tuberosum var. Desirée Different clones were identified, one against the other Branching enzyme directed antiserum were recognized (to carry out the immunological determination s. Example 3, "Western Blot"). These clones were used to from a set up in the HindIII site of the plasmid pUCl9 cDNA library from growing tubers of Solanum tuberosum clones full length (full-length clones). A clone with an insertion size 2.909 bp was for used the further cloning.
Zur Herstellung des Plasmids p35S-anti-BE
wurde die cDNA-Insertion mit dem Promotor der 35S-RNA des Blumenkohl-Mosaik-Virus
(CaMV), sowie dem Polyadenylierungssignal der Octopinsynthase des
Ti-Plasmids pTiACH5 versehen. Dabei wurde die Orientierung der cDNA
so gewählt,
dass ausgehend vom Promotor der nichtkodierende Strang abgelesen
wird (antisense-Orientierung). Das Plasmid p35S-anti-BE hat eine
Größe von 13,6
kb und besteht aus den drei Fragmenten A, B und C, die in den Polylinker
des Plasmids pBIN19 (Bevan, Nucl. Acids Res. 12, 8711–8721) insertiert
sind (s.
Fragment A (529 bp) beinhaltet den Promotor des CaMV und umfasst die Nukleotide 6909 bis 7437 (Franck et al., Cell 21: 285–294). Es wurde als EcoRI/KpnI-Fragment aus dem Plasmid pDH51 (Pietrzak et al., Nucl. Acid Res. 14, 5857–5868) isoliert und zwischen die EcoRI/KpnI-Schnittstellen des Polylinkers von pBIN19 ligiert. Dabei entstand pBIN19-A.Fragment A (529 bp) contains the CaMV promoter and includes nucleotides 6909 to 7437 (Franck et al., Cell 21: 285-294). It was generated as an EcoRI / KpnI fragment from the plasmid pDH51 (Pietrzak et al., Nucl. Acid Res. 14, 5857-5868) isolated and between the EcoRI / KpnI interfaces of the polylinker ligated from pBIN19. This resulted in pBIN19-A.
Fragment C (192 bp) beinhaltet das Polyadenylierungssignal des Gens 3 der T-DNA des Ti-Plasmids pTiACH5 (Gielen et al., EMBO J. 3, 835–846), Nukleotide 11749–11939, welches als PvuII/HindIII-Fragment aus dem Plasmid pAGV40 (Herrera-Estrella et al., Nature 303, 209–213) isoliert und nach Addition von SphI-Linkern an die PvuII-Schnittstelle zwischen die SphI- und die HindIII-Schnittstelle von pBIN19-A ligiert wurde. Dabei entstand pBIN19-AC.Fragment C (192 bp) contains this Polyadenylation signal of gene 3 of the T-DNA of the Ti plasmid pTiACH5 (Gielen et al., EMBO J. 3, 835-846), Nucleotides 11749-11939, which as a PvuII / HindIII fragment the plasmid pAGV40 (Herrera-Estrella et al., Nature 303, 209-213) was isolated and after adding SphI linkers to the PvuII interface between the SphI and HindIII sites of pBIN19-A were ligated. This resulted in pBIN19-AC.
Fragment B enthält die 2909 bp große cDNA
des Verzweigungsenzyms von Solanum tuberosum und wurde als HindIII/SmaI-Fragment
aus dem oben beschriebenen pUC19 Derivat isoliert. Nach Auffüllen der
HindIII-Schnittstelle mit Hilfe der DNA-Polymerase wurde das Fragment
in die SmaI-Schnittstelle des zuvor beschriebenen Derivats pBIN19-AC
ligiert (s.
Beispiel 2Example 2
Konstruktion des Plasmids p35SH-anti-DConstruction of the plasmid p35SH anti-D
Unter Verwendung zweier synthetisch hergestellter DNA-Oligonukleotide der Sequenzen: als Primer für eine Polymerase-Kettenreaktion an cDNA aus Knollengewebe von Solanum tuberosum wurde eine Kopie der Kodierregion des Disproportionierungsenzyms erzeugt, die wegen der spezifischen Sequenz der Oligonukleotide am 3'-Ende des kodoge nen Stranges mit einer Kpnl-Schnittstelle und an dessen 5'-Ende mit einer SmaI-Schnittstelle ausgestattet ist. Mit Hilfe dieser beiden Schnittstellen ist es möglich, die Kodierregion des Disproportionierungsenzyms in antisense-Orientierung zwischen die Kpnl- und die SmaI-Schnittstelle des binären Plasmids pBIN19-HYG zu klonieren. Das Plasmid pBIN19-HYG trägt das hphI-Gen für Hygromicinresistenz in der T-DNA. Die Verwendung dieses Plasmids ist notwendig, um Pflanzen, die bereits mit einem pBIN19-Derivat transformiert wurden, einer erneuten Transformation und Selektion unterziehen zu können. Für die Herstellung des Plasmids p35SH-anti-D wurde ein Derivat von pBIN19-HYG verwendet, das entsprechend der in Beispiel 1 beschriebenen Vorgehensweise mit den dort beschriebenen Fragmenten A und C ausgestattet worden war. Dies hatte zu dem Plasmid pBIN19-HYG-AC geführt.Using two synthetically produced DNA oligonucleotides of the sequences: As a primer for a polymerase chain reaction on cDNA from tuber tissue from Solanum tuberosum, a copy of the coding region of the disproportionation enzyme was generated, which because of the specific sequence of the oligonucleotides at the 3'-end of the codogenic strand with a Kpnl site and at its 5'- End is equipped with an SmaI interface. With the help of these two interfaces it is possible to clone the coding region of the disproportionation enzyme in the antisense orientation between the Kpnl and the SmaI interface of the binary plasmid pBIN19-HYG. The plasmid pBIN19-HYG carries the hphI gene for hygromicin resistance in the T-DNA. The use of this plasmid is necessary in order to be able to subject plants which have already been transformed with a pBIN19 derivative to a new transformation and selection. For the preparation of the plasmid p35SH-anti-D, a derivative of pBIN19-HYG was used, which had been equipped with the fragments A and C described there in accordance with the procedure described in Example 1. This led to the plasmid pBIN19-HYG-AC.
Durch Ligation des mit Kpnl und SmaI
geschnittenen Produkts der Polymerase-Kettenreaktion zur Vervielfältigung
der Kodierregion des Disproportionierungsenzyms zwischen die Kpnl-
und SmaI-Schnittstellen von
pBIN19-HYG-AC entstand das Plasmid p35SH-anti-D (siehe
Beispiel 3Example 3
Konstruktion des binären Plasmids p35SH-anti-BEConstruction of the binary plasmid p35SH-anti-BE
Es wurde ein weiterer Klon, BE7, mit einer Insertion von 3047 Basenpaaren, die für das Verzweigungsenzym kodieren, wie in Beispiel 1 beschrieben aus einer cDNA-Bibliothek aus Kartoffelknol lengewebe isoliert und in den Expressionsvektor λZAPII (Kossmann et al., Mol. Gen. Genet. 230, 39–44) eingefügt.Another clone, BE7, with an insertion of 3047 base pairs that code for the branching enzyme, as described in Example 1 from a cDNA library from potato tuber tissue isolated and into the expression vector λZAPII (Kossmann et al., Mol. Gene. Genet. 230, 39-44) inserted.
Wie in den Beispielen 1 und 2 beschrieben,
wurde dieses cDNA-Molekül als Fragment
B in antisense-Orientierung zu dem 355-Promotor in den Vektor pBIN19-HYG-AC
eingefügt.
Die für
das Verzweigungsenzym kodierende DNA-Region wurde als SmaI/HindIII-Fragment mit 3068
bp aus einem BE7-Klon isoliert. Nach dem Auffüllen der überstehenden HindIII-Enden
mit Hilfe des Klenow-Fragments
der DNA-Polymerase aus Escherichia coli wurde das Fragment in die
SmaI-Schnittstelle des in Beispiel 2 beschriebenen Derivats pBIN19-HYG-AC
ligiert. Das entstandene Plasmid p35SH-anti-BE ist in
Beispiel 3Example 3
Konstruktion des binären Plasmids p35SH-anti-BEConstruction of the binary plasmid p35SH-anti-BE
Es wurde ein weiterer Klon, BE7, mit einer für das Verzweigungsenzym kodierenden 3047 bp-Insertion wie in Beispiel 1 beschrieben aus einer cDNA-Bibliothek aus Kartoffelknollengewebe isoliert und in den Expressionsvektor λZAPII eingefügt (Kossmann et al., Mol. Gen. Genet. 230, 39–44).Another clone, BE7, with one for the branching enzyme encoding 3047 bp insert as in Example 1 described from a cDNA library from potato tuber tissue isolated and inserted into the expression vector λZAPII (Kossmann et al., Mol. Gen. Genet. 230, 39-44).
Wie in Beispielen 1 und 2 beschrieben,
wurde dieses cDNA-Molekül
als Fragment B in den Vektor pBIN19-HYG-AC in antisense-Orientierung
zum 35S-Promotor eingefügt.
Die für
das Verzweigungsenzym kodierende cDNA wurde aus dem BE7-Klon als
ein SmaI/HindIII-Fragment
mit 3068 bp isoliert. Nach dem Auffüllen der überlappenden HindIII-Enden
mit Hilfe des Klenow-Fragments der DNA-Polymerase I aus Escherichia coli wurde
das Fragment in die SmaI-Schnittstelle des in Beispiel 2 beschriebenen
Derivats pBIN19-HYG-AC ligiert. Das resultierende Plasmid p35SH-anti-BE
ist in
Beispiel 4Example 4
Konstruktion des binären Plasmids p35SH-anti-DConstruction of the binary plasmid p35SH anti-D
Analog zu Beispiel 2 wurde das dort
beschriebene PCR-Fragment, das für
das Disproportionierungsenzym kodiert, als Fragment B in den in
Beispiel 1 beschriebenen Vektor pBIN19-AC in antisense-Orientierung zu dem
35S-Promotor eingefügt.
Das resultierende Plasmid p35S-anti-D ist in
Beispiel 5Example 5
Konstruktion des binären Plasmids p35S-anti-D-anti-BEConstruction of the binary plasmid p35S-anti-D-anti-BE
Das in Beispiel 3 beschriebene Insert,
das für
das Verzweigungsenzym kodiert, wurde als ein NotI-Fragment (Fragment
D) mit 3031 bp in das in Beispiel 4 beschriebene Plasmid p35S-anti-D
in antisense-Orientierung zum 35S-Promotor eingefügt. Nach
dem Auffüllen
der NotI-Schnittstellen mit Hilfe des Klenow-Fragments der DNA-Polymerase
I wurde das Fragment in mit SmaI gespaltenes Plasmid p35S-anti-D
ligiert. Das resultierende Plasmid p35S-anti-D-anti-BE ist in
Beispiel 6Example 6
Transformation von Agrobacterium tumefaciens mit binären Plasmiden und genetische Veränderung von Pflanzen mit Hilfe transformierter AgrobakterienAgrobacterium transformation tumefaciens with binary Plasmids and genetic modification of plants using transformed agrobacteria
Zur Transformation von Agrobacterium tumefaciens wurden die binären Plasmide aus den Beispielen 1 bis 5 durch direkte Transformation nach der Methode von Höfgen & Willmitzer (1988, Nucl. Acids Res. 16, 9877) in die Zellen eingeführt. Die Plasmid-DNA transformierter Agrobakterien wurde nach der Methode von Birnboim et al. (1979, Nucl. Acids Res. 7, 1513–1523) isoliert und nach geeigneter Restriktionsspaltung gelelektrophoretisch analysiert.The binary plasmids from the examples were used to transform Agrobacterium tumefaciens 1 to 5 into the cells by direct transformation according to the method of Höfgen & Willmitzer (1988, Nucl. Acids Res. 16, 9877). The plasmid DNA of transformed agrobacteria was determined by the method of Birnboim et al. (1979, Nucl. Acids Res. 7, 1513-1523) isolated and analyzed by gel electrophoresis after suitable restriction cleavage.
Agrobakterien, bei denen die Integrität der in den Ausführungsbeispielen 1 bis 5 beschriebenen binären Plasmide nach der Transformation durch Restriktionsanalyse nachgewiesen worden war, wurden zur genetischen Veränderung von Kartoffelpflanzen eingesetzt.Agrobacteria, where the integrity of the in the embodiments 1 to 5 described binary Plasmids detected after transformation by restriction analysis had been used to genetically modify potato plants used.
Zur Transformation z. B. von Kartoffelpflanzen werden beispielsweise 10 kleine, mit einem Skalpell verwundete Blätter einer Sterilkultur in 10 ml MS-Medium mit 2% Saccharose gelegt, welches 30–50 μl einer unter Selektion gewachsenen Agrobacterium-Übernachtkultur enthält. Nach 3 – 5 minütigem leichtem Schütteln werden die Petrischalen bei 25°C im Dunkeln inkubiert. Nach 2 Tagen werden die Blätter auf MS-Medium mit 1,6% Glucose, 2 mg/l Zeatinribose, 0,02 mg/l Naphthylessigsäure, 0,02 mg/l Giberellinsäure, 500 mg/l Claforan, 50 mg/l Kanamycin und 0,8% Bacto-Agar ausgelegt. Nach einwöchiger Inkubation bei 25°C und 3000 Lux wird die Claforankonzentration im Medium um die Hälfte reduziert. Die weitere Kultivierung erfolgte wie von Rocha-Sosa et al. (1989, EMBO J. 8, 29) beschrieben.To transform z. B. of potato plants For example, 10 small leaves wound with a scalpel become one Sterile culture in 10 ml MS medium with 2% sucrose, which 30–50 μl one under Selection of grown Agrobacterium overnight culture contains. After 3 - 5 minutes gentle shaking the Petri dishes at 25 ° C incubated in the dark. After 2 days, the leaves on MS medium with 1.6% Glucose, 2 mg / l zeatin ribose, 0.02 mg / l naphthylacetic acid, 0.02 mg / l giberellic acid, 500 mg / l Claforan, 50 mg / l kanamycin and 0.8% Bacto agar. To one week Incubation at 25 ° C and 3000 lux, the Claforan concentration in the medium is reduced by half. The further cultivation was carried out as described by Rocha-Sosa et al. (1989, EMBO J. 8, 29).
Zur Einführung der erfindungsgemäßen DNA-Kombination in Pflanzen wurden die drei nachstehenden unterschiedlichen Verfahren ausgewählt:
- a) Im ersten Fall wurden Kartoffelpflanzen zunächst mit dem in Beispiel 1 beschriebenen Plasmid transformiert, da der Erfolg der Antisense-Inhibition der Bildung des Verzweigungsenzym leicht mit dem in Beispiel 1 beschriebenen Antiserum vorgenommen werden kann. Transgene Pflanzen, bei denen kein Verzweigungsenzym mehr nachweisbar ist, werden für eine Superinfektion mit Plasmid p35SH-anti-D eingesetzt. Anstelle des Kanamycins wird nun zur Selektion Hygromycin in einer Konzentration von 3 mg/l verwendet.
- b) Analog zu dem unter a) beschriebenen Verfahren wurden Kartoffelpflanzen zunächst mit dem in Beispiel 3 beschriebenen Plasmid in einem reziproken Verfahren transformiert, und ein gegen das Disproportionierungsenzym gerichtetes Antiserum wurde verwendet, um Pflanzen zu identifizieren und auszuwählen, die eine stark verminderte Expression des Disproportionierungsenzym zeigen. Diese Pflanzen wurden dann mit dem in Beispiel 4 beschriebenen Plasmid superinfiziert.
- c) Alternativ werden Kartoffelpflanzen mit dem in Beispiel 5 beschriebenen Plasmid p35S-anti-D-anti-BE transformiert und Regeneranten ausgewählt, die einen stark verminderten Gehalt beider Proteine aufweisen.
- a) In the first case, potato plants were first transformed with the plasmid described in Example 1, since the success of the antisense inhibition of the formation of the branching enzyme can easily be carried out with the antiserum described in Example 1. Transgenic plants in which no branching enzyme can be detected are used for superinfection with plasmid p35SH-anti-D. Instead of the kanamycin, hygromycin is now used in a concentration of 3 mg / l for the selection.
- b) Analogously to the method described under a), potato plants were first transformed with the plasmid described in Example 3 in a reciprocal process, and an antiserum directed against the disproportionation enzyme was used to identify and select plants which show a greatly reduced expression of the disproportionation enzyme demonstrate. These plants were then superinfected with the plasmid described in Example 4.
- c) Alternatively, potato plants are transformed with the plasmid p35S-anti-D-anti-BE described in Example 5 and regenerants are selected which have a greatly reduced content of both proteins.
Die Überprüfung des Erfolgs der genetischen
Veränderung
der Pflanzen ist durch Analyse der Gesamt-RNA bezüglich der
Abwesenheit der mRNA des Q- und des D-Enzyms möglich. Die Isolierung pflanzlicher
Gesamt-RNA erfolgte nach Logemann et al. (1987, Anal. Biochem. 163,
16–20).
Für die
Analyse werden je 50 μg
der Gesamt-RNA mit Hilfe von "Northern
Blots" auf die Abwesenheit
des Q- und des D-Enzym-Transkripts untersucht. Die Ergebnisse dieser "Northern Blot"-Analysen sind in
den
Zur Überprüfung der Anwesenheit des Q-Enzyms in transgenen Pflanzen erfolgte eine Extraktion von Gesamtprotein aus Pflanzengewebe und anschließende "Western Blot"-Analyse mit einem entsprechenden Antiserum. Hierzu werden Proteinextrakte nach Molekulargewicht mittels SDS-PAGE getrennt. Nach SDS-PAGE werden Proteingele für 15–30 Minuten in Transfer-Puffer für Graphitelektroden (48 g/l Tris, 39 g/l Glycin, 0,0375% SDS, 20% Methanol) äquilibriert und anschließend bei 4°C auf ein Nitrozellulose-Filter mit 1,3 mA/cm2 für 1–2 Stunden transferiert. Das Filter wird 30 Minuten mit 3% Gelatine in TBS-Puffer (20 mM Tris/HCl, pH 7,5; 500 mM NaCl) abgesättigt. Anschließend wird das Filter für 2 Stunden mit dem Antiserum in geeigneter Verdünnung (1: 1000–10.000 in TBS-Puffer) bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wird das Filter jeweils für 15 Minuten mit TBS-, TTBS- (TBS-Puffer mit 0,1% Sorbitanmonolaurat 20 EO) und TBS-Puffer gewaschen. Nach dem Wachen wird das Filter für 1 Stunde bei Raumtemperatur mit alkalischer Phosphatase konjugierten Goat-anti-Rabbit (GAR)-Antikörpern (1 : 7500 in TBS) inkubiert. Anschließend wird das Filter wie oben beschrieben gewaschen und in AP-Puffer (100 mM Tris/HCl, pH 9,5; 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2) äquilibriert. Die Alkalische-Phosphatase Reaktion wird durch Substratzugabe von 70 μl 4-Nitrotetrazolium (NBT)-Lösung (50 mg/ml NBT in 70% Dimethylformamid) und 35 μl 5-Brom-4-Chlor-3-Indolylphosphat (BCIP)(50 mg/ml BCIP in Dimethylformamid) in 50 ml AP Puffer gestartet. Nach 5 Minuten können in der Regel erste Signale beobachtet werden.To check the presence of the Q enzyme in transgenic plants, total protein was extracted from plant tissue and then "Western blot" analyzed with an appropriate antiserum. For this, protein extracts are separated by molecular weight using SDS-PAGE. After SDS-PAGE, protein gels are equilibrated for 15-30 minutes in transfer buffer for graphite electrodes (48 g / l Tris, 39 g / l glycine, 0.0375% SDS, 20% methanol) and then at 4 ° C. on a nitrocellulose -Filter transferred at 1.3 mA / cm 2 for 1-2 hours. The filter is saturated for 30 minutes with 3% gelatin in TBS buffer (20 mM Tris / HCl, pH 7.5; 500 mM NaCl). The filter is then incubated for 2 hours with the antiserum in a suitable dilution (1: 1000-10,000 in TBS buffer) at room temperature. The filter is then washed for 15 minutes with TBS, TTBS (TBS buffer with 0.1% sorbitan monolaurate 20 EO) and TBS buffer. After waking, the filter is incubated for 1 hour at room temperature with goat anti-rabbit (GAR) antibodies conjugated to alkaline phosphatase (1: 7500 in TBS). The filter is then washed as described above and equilibrated in AP buffer (100 mM Tris / HCl, pH 9.5; 100 mM NaCl, 5 mM MgCl 2 ). The alkaline phosphatase reaction is carried out by adding 70 μl of 4-nitrotetrazolium (NBT) solution (50 mg / ml NBT in 70% dimethylformamide) and 35 μl of 5-bromo-4-chloro-3-indolylphosphate (BCIP) (50 mg / ml BCIP in dimethylformamide) started in 50 ml AP buffer. The first signals can usually be observed after 5 minutes.
Zur Bestimmung des Amylose/Amylopektin-Gehalts in der Stärke transgener Kartoffelpflanzen, die eine Stärke mit einem veränderten Verzweigungsgrad produzieren, werden Blattstückchen mit einem Durchmesser von 10 mm unter Dauerlicht auf 6%-iger Saccharoselösung 14 Stunden lang flotiert. Durch diese Lichtinkubation wird eine stark erhöhte Stärkebildung in den Blattstückchen induziert. Nach der Inkubation wird die Amylose- und Amylopektin- Konzentration nach Hovenkamp-Hermelink et al. (1988, Potato Research 31, 241–246) bestimmt.To determine the amylose / amylopectin content in the starch of transgenic potato plants that produce a starch with a different degree of branching, leaf pieces with a diameter of 10 mm are floated in 6% sucrose solution under constant light for 14 hours. This light incubation induces a greatly increased starch formation in the leaf pieces. After the incubation, the amylose and amylopectin concentration is determined according to Hovenkamp-Hermelink et al. (1988, Potato Research 31, 241-246).
Die Bestimmung des Verzweigungsgrades (Gehalt an α-1,6-Bindungen), der Kettenlänge sowie der Größe der Stärkekörner erfolgt nach Morrison et al. (1990, Methods in Plant Biochemistry Academic Press Lmtd. 2, 323–352).The determination of the degree of branching (Content of α-1,6 bonds), the chain length and the size of the starch granules according to Morrison et al. (1990, Methods in Plant Biochemistry Academic Press Lmtd. 2, 323-352).
Claims (28)
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE69432796T DE69432796T2 (en) | 1993-09-09 | 1994-09-08 | COMBINATION OF DNA SEQUENCES WHICH ENABLES THE FORMATION OF MODIFIED STARCH IN PLANT CELLS AND PLANTS, METHOD FOR THE PRODUCTION OF THESE PLANTS |
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE4330960A DE4330960C2 (en) | 1993-09-09 | 1993-09-09 | Combination of DNA sequences that enable the formation of highly amylose-containing starch in plant cells and plants, processes for producing these plants and the modified starch that can be obtained therefrom |
DE4330960 | 1993-09-09 | ||
DE69432796T DE69432796T2 (en) | 1993-09-09 | 1994-09-08 | COMBINATION OF DNA SEQUENCES WHICH ENABLES THE FORMATION OF MODIFIED STARCH IN PLANT CELLS AND PLANTS, METHOD FOR THE PRODUCTION OF THESE PLANTS |
PCT/EP1994/003031 WO1995007355A1 (en) | 1993-09-09 | 1994-09-08 | Combination of dna sequences which enable the formation of modified starch in plant cells and plants, processes for the production of these plants and the modified starch obtainable therefrom |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE69432796D1 DE69432796D1 (en) | 2003-07-10 |
DE69432796T2 true DE69432796T2 (en) | 2004-04-29 |
Family
ID=25929479
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE69432796T Expired - Lifetime DE69432796T2 (en) | 1993-09-09 | 1994-09-08 | COMBINATION OF DNA SEQUENCES WHICH ENABLES THE FORMATION OF MODIFIED STARCH IN PLANT CELLS AND PLANTS, METHOD FOR THE PRODUCTION OF THESE PLANTS |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
DE (1) | DE69432796T2 (en) |
WO (1) | WO1995007355A1 (en) |
Families Citing this family (22)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE19509695A1 (en) * | 1995-03-08 | 1996-09-12 | Inst Genbiologische Forschung | Process for the preparation of a modified starch in plants, and the modified starch isolatable from the plants |
DE69637153T8 (en) | 1995-05-05 | 2008-07-24 | National Starch And Chemical Investment Holding Corporation, New Castle | IMPROVEMENTS IN OR RELATED TO PLANT STRENGTH CONNECTIONS |
EP1702518A1 (en) | 1995-09-19 | 2006-09-20 | Bayer BioScience GmbH | Plants which synthesise a modified starch, process for the production thereof and modified starch |
SE513209C2 (en) | 1995-11-29 | 2000-07-31 | Lars Rask | Process for producing transgenic potatoes with increased or decreased degree of branching of amylopectin starch |
DE19653176A1 (en) * | 1996-12-19 | 1998-06-25 | Planttec Biotechnologie Gmbh | New maize nucleic acid molecules and their use to produce a modified starch |
DE19709775A1 (en) | 1997-03-10 | 1998-09-17 | Planttec Biotechnologie Gmbh | Nucleic acid molecules encoding corn starch phosphorylase |
US5994623A (en) * | 1997-04-09 | 1999-11-30 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Corn 4-α-glucanotransferase |
NZ507093A (en) | 1998-04-08 | 2003-08-29 | Commw Scient Ind Res Org | Methods and means for reducing the phenotypic expression of a nucleic acid of interest in a plant |
DE19836097A1 (en) | 1998-07-31 | 2000-02-03 | Hoechst Schering Agrevo Gmbh | Nucleic acid molecules coding for an alpha-glucosidase, plants that synthesize a modified starch, process for producing the plants, their use and the modified starch |
CA2348366C (en) | 1998-11-09 | 2012-05-15 | Planttec Biotechnologie Gmbh | Nucleic acid molecules from rice and their use for the production of modified starch |
WO2003000854A2 (en) | 2001-06-25 | 2003-01-03 | Ses Europe N.V./S.A. | Double fructan beets |
JP4467305B2 (en) | 2001-12-21 | 2010-05-26 | バイエル・クロツプサイエンス・アクチエンゲゼルシヤフト | Pregelatinized starch and method for producing the same |
DE10212892A1 (en) | 2002-03-20 | 2003-10-09 | Basf Plant Science Gmbh | Constructs and methods for regulating gene expression |
AU2006298844B2 (en) | 2005-09-20 | 2012-01-12 | Basf Plant Science Gmbh | Methods for controlling gene expression using ta-siRAN |
JP5558490B2 (en) | 2009-01-19 | 2014-07-23 | バイエル・クロップサイエンス・アーゲー | Cyclic diones and their use as insecticides, acaricides and / or fungicides |
BRPI1015543A8 (en) | 2009-05-06 | 2016-05-24 | Bayer Cropscience Ag | CYCLOPENTANEDIONE COMPOUNDS AND THEIR USE AS INSECTICIDES, ACARICIDES AND/OR FUNGICIDES. |
RS55986B1 (en) | 2010-01-22 | 2017-09-29 | Bayer Ip Gmbh | Acaricides and/or insecticidal agent combinations |
WO2011154158A1 (en) | 2010-06-09 | 2011-12-15 | Bayer Bioscience N.V. | Methods and means to modify a plant genome at a nucleotide sequence commonly used in plant genome engineering |
CN103119169B (en) | 2010-06-09 | 2018-11-20 | 拜尔作物科学公司 | Plant Genome transformation in commonly on nucleotide sequence modified plant genome Method and kit for |
US9265252B2 (en) | 2011-08-10 | 2016-02-23 | Bayer Intellectual Property Gmbh | Active compound combinations comprising specific tetramic acid derivatives |
CN104245940A (en) | 2012-04-23 | 2014-12-24 | 拜尔作物科学公司 | Targeted genome engineering in plants |
WO2013184768A1 (en) | 2012-06-05 | 2013-12-12 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Compositions and methods of gene silencing in plants |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5349123A (en) * | 1990-12-21 | 1994-09-20 | Calgene, Inc. | Glycogen biosynthetic enzymes in plants |
SE9004095L (en) * | 1990-12-21 | 1992-06-01 | Amylogene Hb | GENETIC MODIFICATION OF POTATOIS BEFORE EDUCATION OF AMYLOST TYPE |
DE4104782B4 (en) * | 1991-02-13 | 2006-05-11 | Bayer Cropscience Gmbh | Novel plasmids containing DNA sequences that cause changes in carbohydrate concentration and carbohydrate composition in plants, as well as plants and plant cells containing these plasmids |
-
1994
- 1994-09-08 DE DE69432796T patent/DE69432796T2/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-09-08 WO PCT/EP1994/003031 patent/WO1995007355A1/en active IP Right Grant
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO1995007355A1 (en) | 1995-03-16 |
DE69432796D1 (en) | 2003-07-10 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
DE69432796T2 (en) | COMBINATION OF DNA SEQUENCES WHICH ENABLES THE FORMATION OF MODIFIED STARCH IN PLANT CELLS AND PLANTS, METHOD FOR THE PRODUCTION OF THESE PLANTS | |
DE4330960C2 (en) | Combination of DNA sequences that enable the formation of highly amylose-containing starch in plant cells and plants, processes for producing these plants and the modified starch that can be obtained therefrom | |
DE4104782B4 (en) | Novel plasmids containing DNA sequences that cause changes in carbohydrate concentration and carbohydrate composition in plants, as well as plants and plant cells containing these plasmids | |
DE69133285T3 (en) | GENETIC TECHNOLOGY OF THE POTATO TO PRODUCE AMYLOPEKTINTYPIC STRENGTH | |
DE69333833T2 (en) | DNA SEQUENCES LEADING TO THE FORMATION OF POLYFRUCTANES (LEVANES), PLASMIDS WITH CORRESPONDING SEQUENCES, AND A PROCESS FOR THE MANUFACTURE OF TRANSGENIC PLANTS | |
DE69133347T2 (en) | Plasmids which contain the DNA sequences for changing the carbohydrate and protein content or composition in plants, and plants and plant cells containing these plasmids | |
EP0791066B1 (en) | Dna molecules that code for enzymes involved in starch synthesis, vectors, bacteria, transgenic plant cells and plants containing said molecules | |
DE60038496T2 (en) | PLANTS WITH REDUCED ACTIVITY IN TWO OR MORE STRENGTH-MODIFYING ENZYMES | |
EP1435205B1 (en) | Process for the production of a modified starch | |
DE69737507T2 (en) | NEW NUCLEIC ACID MOLECULES FROM MAIS AND THEIR USE FOR THE PRODUCTION OF MODIFIED STARCH | |
DE69634875T2 (en) | COLD-ENHANCED PROMOTER SEQUENCES | |
EP0874908B1 (en) | Nucleic acid molecules from plants encoding enzymes which participate in the starch synthesis | |
DE19509695A1 (en) | Process for the preparation of a modified starch in plants, and the modified starch isolatable from the plants | |
WO2000008175A2 (en) | Nucleic acid module coding for alpha glucosidase, plants that synthesize modified starch, methods for the production and use of said plants, and modified starch | |
DE19836099A1 (en) | Nucleic acid molecules coding for a β-amylase, plants which synthesize a modified starch, process for the preparation of the plants, their use and the modified starch | |
EP0904389A1 (en) | Nucleic acid molecules coding soluble maize starch synthases | |
DE4447387A1 (en) | Debranching enzymes from plants and DNA sequences encoding these enzymes | |
DE4004800A1 (en) | HABITUS AND YIELD CHANGED TRANSGENIC PLANTS | |
DE69132758T2 (en) | Plasmids for the production of transgenic plants which have changed their habit and yield | |
DE4327165A1 (en) | New de:branching enzyme and DNA | |
EP1268831A2 (en) | Method for the production of leguminous plants with increased protein content and longer seed filling duration |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
8364 | No opposition during term of opposition | ||
8327 | Change in the person/name/address of the patent owner |
Owner name: BAYER CROPSCIENCE AG, 40789 MONHEIM, DE |