DE69420034T2

DE69420034T2 - Synthetische mischpeptide, die die entstehung von neutralisierenden antikörpern und die wirkung der cytotoxischen t-lymphozyten gegen hiv hervorufen

Info

Publication number: DE69420034T2
Application number: DE69420034T
Authority: DE
Inventors: Jeffrey Ahlers; Jay Berzofsky; Peter Nara; C. Pendleton; Mutsunori Shirai
Original assignee: US Department of Health and Human Services
Current assignee: US Department of Health and Human Services
Priority date: 1993-05-14
Filing date: 1994-05-13
Publication date: 2000-03-02
Anticipated expiration: 2014-05-14
Also published as: WO1994026785A1; DE69420034D1; US5932218A; DK0701572T3; JP2006056893A; GR3031790T3; ATE183200T1; EP0701572A1; US6214347B1; US7094405B1; CA2162880A1; JP3802049B2; AU7017394A; EP0701572B1; US6294322B1; CA2162880C; ES2138086T3; AU688333B2; JPH09500614A

Description

VERWANDTE ANMELDUNGEN

Diese Anmeldung ist eine Teilfortführungsanmeldung der ebenfalls anhängigen United States Patentanmeldung Ser. Nr. 07/847,311, eingereicht am 6. März 1992, die wiederum eine Teilfortführungsanmeldung der United States Patentanmeldung Ser. Nr. 07/148,692, eingereicht am 26. Januar 1988, ist. Diese Anmeldung ist auch eine Teilfortführungsanmeldung der ebenfalls anhängigen United States Patentanmeldung Ser. Nr. 07/751,998, eingereicht am 29. August 1991. Auf alle diese Anmeldungen wird hiermit in ihrer Gesamtheit ausdrücklich Bezug genommen.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betritt Peptide, die kovalent gebundene T-Helfer (Th)-Epitope, cytotoxische T-Lymphocyten (CTL)-Epitope und Epitope, die eine neutralisierende Antikörperreaktion (AbN) gegen infektiöse Agenzien, insbesondere parasitäre oder virale Pathogene, bewirken, enthalten. Spezifische Beispiele zielen auf eine Anwendung der Erfindung gegen das Human Immunodeficiency Virus (HIV). Die Peptide sind weiterhin dadurch charakterisiert, daß sie alle drei dieser Reaktionen in Wirten mit einer Vielfalt von Haupthistokompatibilitätskomplexen (MHC) auslösen.
Die Erfindung betritt auch Verfahren zur Diagnose von Immunfunktionen unter Verwendung der oben beschriebenen Peptide in Individuen, die mit HIV infiziert sind, und sie betritt weiterhin prophylaktische oder therapeutische Impfstoffe, die die oben beschriebenen Peptide als eine Komponente enthalten, oder möglicherweise sogar als einzigen Wirkstoff in der Impfstoffzusammensetzung.

Beschreibung des Standes der Technik

Die Immunantworten auf HIV-Antigene, die während einer natürlichen Infektion auftreten, können ein Gleichgewicht zwischen solchen, die die virale Infektion regulieren, und solchen, die sich antagonistisch zur Integrität der Immunfunktion verhalten, darstellen (1-3). Die Determinanten, die einen günstigen oder ungünstigen Einfluß auf dieses Gleichgewicht haben, stehen nicht mit Sicherheit fest. Die Fähigkeit zu einer initialen Immunantwort des Wirtes scheint den Verlauf einer persistie renden HIV-Infektion, die zu einer fortschreitenden schwächenden Krankheit, verbunden mit zunehmender immunologischer Dysfunktion, führt, zu beeinflussen (4-7). Der Virus kann Strukturen enthalten, die es ihm ermöglichen, sich dem Immunsystem zu entziehen, wie z. B. suppressive Epitope oder maskierende Kohlenhydrate, Strukturen, die klonale Restriktion induzieren (8-10), oder Strukturen, die schädliche Wirkungen hervorrufen, wie zum Beispiel Antikörper, die die virale Infektivität erhöhen (11-16), oder autoreaktive Antikörper, oder T-Zellen, die zur Immunschwäche beitragen (17-20).
Die prinzipielle neutralisierende Determinante (PND) der HIV-Hülle liegt in der dritten hypervariablen Region oder V3-Schleife zwischen den Cystein-Resten 301 und 331 (21-23). Nachdem zunächst gezeigt wurde, daß Antikörper gegen diese Region in ihren neutralisierenden Eigenschaften typspezifisch sind und erhöhte Kreuzreaktivität bei Untersuchungen mit peptidbindendem ELISA aufweisen (23- 26), wurden auch Antikörper gegen die V3-Schleife gefunden, die breitere neutralisierende Eigenschaften haben (27). Zum Glück für die Entwicklung von synthetischen Impfstoffen können solche Antikörper durch Immunisierung mit kurzen Peptiden erzeugt werden (21, 28, 29). In Untersuchungen mit Schimpansen wurde die Schutzwirkung von V3-spezifischen Antikörpern gegen Provokation durch homologe zellfreie Viren gezeigt (15, 30, 31), und vor kurzem wurde ein Schutz gegen virale Provokation durch passiven Transfer eines chimeren Maus/Human IgGI monoklonalen Antikörpers, der spezifisch für die V3-Schleife ist, erreicht (32). Sequenzvariationen in dem viralen Hüllprotein innerhalb dieser Region, und auch Sequenzvariationen außerhalb dieser Region, die jedoch diese Region beeinträchtigen, führen sowohl zu Mutanten, die der Neutralisierung entgehen können, potentiellen CTL Escape Mutanten, als auch zu einem veränderten zellulären Tropismus (33- 37).
In infizierten Individuen kann ein hohes Maß an genetischer Variabilität in HIV- Isolaten gefunden werden (38-40). Bei gegebenen Individuen scheinen sich die HIV-Isolate im Verlauf der Krankheit zu ändern. Unter Immundruck scheint das Virus im Verlauf der Infektion Veränderungen in phänotypischen Charakteristika, wie z. B. Cytopathizität, Replikationsrate und zellulärem Tropismus, zu zeigen. Hinweise darauf, daß das Virus sich während einer Infektion ständig auf niedrigem Niveau vermehrt und nie das Stadium einer "wahren Latenz" erreicht, unterstützen die Ansicht, daß HIV-1 eine chronische aktive Infektion bewirkt und selektive Mechanismen eine wichtige Rolle bei der viralen Persistenz spielen (33). Multiple unterschiedliche V3-Regionen, die die PND des Hüllproteins codieren, sind in HIV- Isolaten aus peripheren mononuklearen Blutzellen (PBMC) nachgewiesen worden, was nahelegt, daß positive Selektion zu großer Diversität von HIV env Genen in vivo führt (40). Nichtsdestotrotz gibt es Belege dafür, daß die PND konservierte Epitope enthält, auf die neutralisierende Antikörper gerichtet sind, die durch Sequenzdivergente Isolate erzeugt wurden, und daß eine begrenzte Anzahl von Peptiden aus der PND neutralisierende Antikörper aktivieren kann, die multiple Isolate erkennen, wenn auch bei einem niedrigeren Titer, und wahrscheinlich bei geringerer Affinität (24, 25, 41).
Ein wirksamer Impfstoff muß nicht nur das Kriterium erfüllen, daß er sicher ist, d. h. daß er keine Epitope enthält, die eine Autoimmunantwort oder eine virusverstärkende Reaktion auslösen, sondern er muß auch in der Lage sein, sowohl eine zelluläre Immunantwort als auch eine Reaktion der neutralisierenden Antikörper gegen alle potentiellen HIV-Varianten, die in der infizierten Bevölkerung verbreitet sind, zu bewirken. Da das MHC-Molekül eines gegebenen Individuums nur eine Teilmenge der potentiellen antigenischen Determinanten, die von der gesamten Spezies erkannt werden, bindet und erkennt, muß ein synthetischer Peptidimpfstoff darüberhinaus auch genügend antigene Determinanten beinhalten, um eine Erkennung durch T-Zellen der meisten HLA-Typen zu bewirken.
Demzufolge haben wir in einer früheren Untersuchung sechs synthetische Peptide von jeweils 20-33 Resten synthetisiert, die sechs multideterminanten T-Helfer- Regionen der HIV-Hülle entsprechen (42). Diese sogenannten "Clusterpeptide" umfassen Cluster verschiedener, jedoch überlappender T-Helfer-Epitope, die durch sich fortpflanzende T-Zellen von drei oder vier Maus-Haplotypen erkannt werden. Diese Cluster-Peptide wurden daraufhin untersucht, ob sie in der Lage sind, T-Zellenreaktionen in mit rekombinantem gp160 (rgp160) immunisierten Mäusen und in Lymphocyten aus peripherem Blut von mit HIV infizierten Menschen auszulösen. Ebenso wurden Mäuse mit den Clusterpeptiden immunisiert, um zu testen, ob die Induktion von T-Zellen in vitro auf intaktes gp160 anspricht. Die Clusterpeptide 3, 4 und 6 (siehe Sequenzen in Tabelle I) stimulierten die T-Zellen von Mäusen aller vier MHC-Haplotypen, die mit rgp160 immunisiert worden waren; und lösten bei mit den Clusterpeptid immunisierten Mäusen T-Zellenreaktionen aus, die in der Lage waren, das gesamte Hüllprotein in vitro zu erkennen. Das Clusterpeptid 1, das in dieser vorliegenden Studie ebenfalls verwendet wurde, stimulierte in nur einem Mäusestamm eine starke Proliferation, trotz der Tatsache, daß die anderen drei Stämme Komponenten der multideterminanten Region erkannten, aus denen dieses Peptid hergestellt worden war. Die Gesamtaktivität war also ge ringer als die Summe der Teilaktivität (42). Die Clusterpeptide 1, 3, 4 und 6 stimulierten beträchtliche IL-2-Reaktionen in Lymphocyten aus peripherem Blut von HIV-positiven, Influenza-positiven Menschen in 64, 73, 52 bzw. 58% der untersuchten Fälle. Es ist hierzu anzumerken, daß diese starken Reaktionen interessanterweise beobachtet wurden, obwohl die untersuchten Probanden vermutlich mit einer großen Anzahl verschiedener HIV-Unterstämme infiziert waren. Die Clusterpeptide 1, 3 und 4 weisen Sequenzen auf, die bei nordamerikanischen und europäischen HIV-Isolaten relativ stark konserviert sind, und das Clusterpeptid 6 überspannt die Grenze zwischen konservierten und variablen Sequenzen (43).
Ein erfolgreicher Peptidimpfstoff sollte in der Lage sein, sowohl T-Helfer- (Th) und cytotoxische T-Lymphocyten- (CTL) Reaktionen als auch eine Reaktion von neutralisierenden Antikörpern in Impflingen mit multiplen HLA-Typen auszulösen. Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) Klasse I-beschränkte CTL scheinen eine zentrale Rolle bei der Genesung von viralen Infektionen zu spielen (81). Obwohl exogene Lymphokine bei der Reifung von CTL-Vorstufen in vitro an die Stelle von T-Zellen-Unterstützung treten können, ist die Rolle von Th beim Sensibilisieren von CTL in vivo immer noch in nur geringem Maße aufgeklärt, verglichen mit der Kooperation von Th-B-Zellen. Obgleich es viele Belege dafür gibt, daß Helfer bei der CTL-Induktion erforderlich sind (82-90), gibt es auch Anzeichen auf CTL-Reaktionen, die unabhängig von Helfern sind (85, 91-95). Weiterhin hat bis heute noch keine Untersuchung gezeigt, daß es als Voraussetzung für Hilfe der kovalenten Bindung einer antigenen Helfer-Determinante an eine CTL-Determinante, analog zu der Bindung von Carrier und Hapten bei der Cognat-Hilfe für B-Zellen, bedarf Dieser Mangel an Belegen kann darauf zurückzuführen sein, daß CTL auf ganze Zellen zielen, und daß bis vor kurzem ganze Zellen (oder Gewebetransplantate) oder lebende Viren zur Immunisierung erforderlich waren. Indem man zeigte, daß die Helfer-Determinante und die CTL-Determinante auf demselben Hauttransplantat vorhanden sein müssen, um Abstoßung zu bewirken, konnte man allenfalls eine Determinanten-Bindung nahelegen (89), aber dieses konnte nicht weiter auf der molekularen Ebene verfolgt werden. Nachdem nun die Möglichkeit einer Peptidimmunisierung für CTL-Induktion aufgezeigt worden ist (96-100), erscheint es möglich, diese Frage anzugehen, indem man Peptide verwendet, die sowohl Helfer- als auch CTL-Determinanten enthalten. Obwohl neuere Ergebnisse darauf hindeuteten, daß eine Helfer-Bindungstelle vorteilhaft ist (90, 101, 102), war es nicht klar, ob die Helfer- und CTL-Bindungstellen verbunden sein mußten. Es war in der Tat sogar so, daß in zwei Studien (90, 102) nicht miteinander gekoppelte Helfer- und CTL- Epitop-Peptide Wirkung zeigten und in der anderen Studie (101) nicht untersucht wurden, jedoch wurde in den früheren Studien die Mischung aus Helfer- und CTL- Determinanten-Peptiden in einer Emulsion von inkomplettem Freudschem Adjuvans verabreicht, wobei die beiden Peptide in die gleiche Mikroumgebung aufgenommen wurden, oder sie wurde in hohen Dosen für multiple Immunisierungen verabreicht.

KURZE DARSTELLUNG DER ERFINDUNG

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Peptide, die eine breite Immunantwort auf ein durch ein Pathogen exprimiertes Antigen liefern. Das Antigen leitet sich typischerweise von einem viralen oder parasitären Pathogen ab. Beim Design von Peptiden war es unsere Strategie, jedes Clusterpeptid mit einem kurzen synthetischen Peptid (Peptid 18), das zuvor als eine immundominante Stelle identifiziert worden war, die durch CD8 cytotoxische T-Zellen in Verbindung mit Klasse I- Molekülen erkannt wird, und das innerhalb der V3-Schleife oder der Principal Neutralizing Determinant-Region des HIV-IIIB-Hüllproteins zu finden ist, zu verbinden.
Die Immunisierung von Wirten mit einem breiten Spektrum von MHC-Typen (den H-2 loci in Mäusen, äquivalent zu den humanen HLA loci) mit einem erfindungsgemäßen Peptid löst eine Immunantwort mit sowohl humoralen als auch zellulären Komponenten aus. Auf der humoralen Seite wird eine Antwort mit einem hohen Titer an neutralisierenden Antikörpern beobachtet. In bezug auf die zelluläre Immunantwort werden sowohl cytotoxische T-Lymphocyten als auch T-Helferzellen aktiviert.
Durch die richtige Wahl der verwendeten Epitope wird eine Antwort ausgelöst, die eine breite Spezifität für eine Reihe von Pathogenstämmen aufweist. Dies ist besonders dann wichtig, wenn es große Unterschiede in den Antigenstrukturen der Pathogenzielstämme gibt, wie es zum Beispiel für HIV beobachtet wird. Eine Methode zur Entwicklung von Peptiden, die eine breite spezifische Reaktion auf eine Reihe von HIV-Stämmen hervorrufen, ist in der ebenfalls anhängigen United States Patentanmeldung 07/760,530, auf die hiermit in ihrer Gesamtheit ausdrücklich Bezug genommen wird, beschrieben.
Es ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Peptide bereitzustellen, die sowohl eine T-Helfer-Reaktion, eine Reaktion von cytotoxischen T-Lymphocyten als auch einen hohen Titer von neutralisierenden Antikörpern in einer Mehrzahl von Wirten, die ein breites Spektrum von MHC-Typen exprimieren, bewirken.
Die Peptide der vorliegenden Erfindung haben auch diagnostischen Nutzen. Die in den Beispielen offenbarten speziellen Peptide können zum Beispiel in verschiedenen Assay-Formaten Verwendung finden, um die Immunfunktion von T-Helferzellen, cytotoxischen T-Lymphocyten und B-Zellen (sowohl B-Zellen-Vorläufern als auch reifen Plasmazellen) in mit HIV infizierten Individuen zu bestimmen. Es ist daher eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, diagnostische Methoden und Immunfunktionsassays bereitzustellen, in denen die hier beschriebenen Peptide als Reagenzien verwendet werden.
Dank der breiten Immunantwort, die in einem mit den Peptiden der vorliegenden Erfindung immunisierten Wirt hervorgerufen wird, ist es eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Impfstoffe gegen eine parasitäre oder virale Infektion und insbesondere gegen eine HIV-1-Infektion bereitzustellen, entweder prophylaktischer oder therapeutischer Art, oder beides.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Methode zur Immunisierung von Säugetierwirten bereitzustellen, die eine breite Immunantwort gegen ein parasitäres oder virales Pathogen, insbesondere den HIV-1-Virus, hervorruft.
Die Peptide der vorliegenden Erfindung bestehen aus einer kovalenten Verbindung eines Peptides mit multideterminantem T-Helfer-Epitop, wie in der U. S. Patentanmeldung Ser. Nr. 751,998 beschrieben, einem Peptid mit cytotoxischem C-Lymphocyten-(CTL)-Epitop, welches vorzugsweise CTL aktiviert, die mit verschiedenen Stämmen des Target-Virus kreuzreaktiv sind, wie in U. S. Patentanmeldung Ser. Nr. 07/847,311 oder Ser. Nr. 07/148,692 beschrieben, und einem Peptid mit einer Determinante, welche neutralisierende Antikörper aktiviert (eine "principal neutralizing determinant" (PND)). In jedem Fall sind die Epitope solche, von denen gezeigt werden kann, daß sie von Wirten mit einem breiten Spektrum von Haupthistokompatibilitätskomplex-Antigenen (MHC) erkannt werden. Die humanen MHCs werden auch HLAs genannt und sind die Zelloberflächenproteine, die mitbestimmen, ob Gewebetransplantate von dem Wirt angenommen oder abgestoßen werden. Die MHC-Proteine spielen bei der Immunsystem-Präsentation von Antigenen in den frühen Stadien einer Immunantwort eine Rolle. Dank der Tatsache, daß die Peptide der vorliegenden Erfindung von einer Reihe verschiedener MHC- oder HLA-Typen erkannt werden, kann von ihnen angenommen werden, daß sie in einem großen Teil der Wirtspopulation wirksam sind.
Die Peptide der vorliegenden Erfindung haben darüberhinaus die Eigenschaft, daß sie einen hohen Titer von neutralisierenden Antikörpern gegen das Antigen, von dem sich ihre Sequenzen ableiten, bewirken.
Die Methoden zur Untersuchung der Immunfunktion eines an einer Virusinfektion leidenden Individuums unter Verwendung der Peptide der vorliegenden Erfindung sind in vitro-Tests, mit denen die Reaktion von isolierten Zellen eines Individuums auf Inkubation der Zellen mit dem Peptid gemessen wird. Th-Aktivität kann zum Beispiel durch Messung von Cytokinen, die spezifisch als Antwort auf Inkubation von Zellen aus dem peripheren Blut eines Patienten mit einem Peptid der vorliegenden Erfindung freigesetzt werden, untersucht werden. Das vorzugsweise zu messende Cytokin ist Interleukin-2 (IL-2). Als Meßmethode kann eine aus dem Stand der Technik bekannte Methode verwendet werden, zum Beispiel die Messung der Vermehrung einer Interleukin-2-abhängigen Zellinie in Überständen von Kulturen der inkubierten Zellen aus peripherem Blut. Alternativ dazu kann ein ELISA-Assay des IL-2 (oder eines anderen Cytokins) durchgeführt werden (siehe USSN 07/751,998, auf die hiermit ausdrücklich Bezug genommen wird). Die Methoden zur Immunisierung mit dem Peptid der vorliegenden Erfindung können relativ einfache Methoden sein, wie z. B. intravenöse Injektion einer sterilen Zusammensetzung, die eins oder mehrere der Peptide der vorliegenden Erfindung und eine pharmazeutisch unbedenkliche Trägerlösung oder ein Adjuvans enthält. Alternativ dazu können die Peptide an die Oberfläche von bestrahlten Antigen-präsentierenden Zellen gebunden verabreicht werden, wie es in der ebenfalls anhängigen United States Patentanmeldung Ser. Nr. 08/031,494 beschrieben ist (auf die hiermit in ihrer Gesamtheit ausdrücklich Bezug genommen wird).

KURZE BESCHREIBUNG DER DIAGRAMME

Abb. 1A, 1B. P18-spezifische Antikörperreaktion von Mäusen mit vier verschiedenen MHC-Haplotypen nach Immunisierung mit dem Clusterpeptid 6-18. (a) die primäre Antikörperreaktion 31 Tage nach der Immunisierung mit 20 Nanomol Peptid (am 21. Tag waren die Spiegel niedriger; siehe Ergebnisse). (b) eine anamnestische Reaktion auf eine Auffrischungsimpfung mit 10 Nanomol Peptid, 37 und 49 Wochen nach der PrimärImmunisierung. Die Symbole entsprechen einzelnen Mäusen, mit Ausnahme von +, welches einen Prebleed Pool bezeichnet.
Abb. 2A-2H. HIV-1-IIIB-Neutralisationsprofile von vier Mäusestämmen, 31 Tage nach einer einzelnen Immunisierung mit Peptid PCLUS 6-18.
Abb. 3A-3D. HIV-1-IIIB-Neutralisationsprofile von vier Mäusestämmen 10 Tage nach einer einzelnen Auffrischungsimpfung mit 10 Nanomol PCLUS 6-18, 39-42 Wochen nach der PrimärImmunisierung. Für jedes numerierte Serum, wie in Abb. 2, ist Vn/Vo gegen die reziproke Verdünnung aufgetragen. Die dargestellten Nummern und Symbole der Tiere entsprechen denen in Abb. 2 für die Primärantwort. Es ist zu beachten, daß sich die Abszisse für den Mäusestamm BALB/c von der der anderen Stämme darin unterscheidet, daß die Endpunktverdünnung für BALB/c 1 : 32.768 ist, während sie für die anderen Stämme 1 : 4096 beträgt.
Abb. 4A, 4B. Kompetitive Bindungskurven unter Verwendung von p18 und rgp 120 als Kompetitoren, zur Bestimmung der Affinität der Antikörper zum Peptid und zum Gesamtprotein. Ausgefüllte Symbole stehen für Seren mit Neutralisierungsaktivität > 90% bei einer der getesteten Verdünnungen, und die unausgefüllten Symbole stehen für Seren mit Neutralisierungsaktivität < 90% bei der geringsten getesteten Verdünnung. Die Werte repräsentieren 3-4 Experimente.
Abb. 5A, 5B. Feinspezifität von neutralisierenden gegen nichtneutralisierende Seren in PCLUS 3-18- (Abb. 5A) und PCLUS 6-18- (Abb. 5B) immunisierten Mäusen. Die neutralisierenden Seren (ausgefüllte Balken) und die nichtneutralisierenden Seren (unausgefüllte Balken) wurden in einem ELISA-Assay auf mit P18- substituierten Peptiden beschichteten Vertiefungen getestet. Fünfzehn Peptide mit einer einzigen Aminosäuresubstitution von der HIV-1-IIIB-Sequenz (RIQRGPGRAFVTIGK, SEQ. LD. NR. 7) bis zur HIV-1-RF-Sequenz (**TKGPGRVIYATGQ, SEQ. LD. NR. 8) wurden zur Beschichtung der Vertiefungen verwendet (siehe Tabelle V). Wenn die zwei Sequenzen identisch waren, wurde ein Ala substituiert. Die Peptide wurden mit 18-1 bis 18-15 bezeichnet, wobei die zweite Nummer die Position in der Sequenz angibt, die substituiert wurde. Der Buchstabe unter der Nummer in jedem Graphen gibt die Aminosäure aus der RF-Sequenz (oder Ala) an, die an dieser Position in der entsprechenden P18 IIIB- Sequenz substituiert wurde. Ein Sternchen bedeutet eine Deletion. Die Seren wurden bei einer Verdünnung von 1 : 1000 miteinander verglichen.
Abb. 6A, 6B. Bindung an P18-Varianten, die in der zentralen V3-Schleifenregion substituiert sind. An Position 3-10 (wie in Tabelle V gezeigt) substituierte Peptid 18-Varianten wurden zur Beschichtung von Mikrotiter-Vertiefungen verwendet, und die Seren wurden in einem ELISA-Assay auf Bindung getestet. Der Buchstabe unter der Nummer in jedem Graphen gibt die Aminosäure aus der RF-Sequenz (oder Ala) an, die an dieser Position in der entsprechenden P18 IIIB-Sequenz sub stituiert wurde. Ausgefüllte Balken stehen für neutralisierende Seren und offene Balken stehen für nichtneutralisierende Seren. Die Säulen repräsentieren das mittlere Extinktionsverhältnis der Bindung an substituiertes Peptid gegen P18 bei 405 nm, von Doppelablesungen für die einzelnen Seren, gekennzeichnet durch Nummer, von mit PCLUS 3-18 (Abb. 6A) oder PCLUS 6-18 (Abb. 6B) immunisierten Tieren.
Abb. 7A-7C. Induktion von HIV-1 Hülle gp160-spezifischer CTL-Aktivität durch Immunisierung mit zusammengesetzten Peptiden in QS21 Adjuvans. In allen Experimenten wurden 15-12-transfektierte Target-Zellen verwendet. Abb. 7A, CTL von B10.D2-Mäusen; Abb. 7B CTL von B10.A(5R)-Mäusen; Abb. 7C, CTL von B10.S(9R)-Mäusen. Da die Standardabweichung des Mittelwertes (SEM) von Dreifachvertiefungen durchweg weniger als 8% des Mittelwertes betrug, wurden Fehlerbalken der besseren Übersichtlichkeit wegen weggelassen.
Abb. 8A, 8B. Die Anforderungen für die Verbindung zwischen Helfer und CTL- Determinanten zum Sensibilisieren von CTL. CTL von B10.D2-Mäusen (Abb. 8A und 8C) oder B10.A(5R)-Mäusen (Abb. 8B und 8D) wurden mit 15-12-transfektierten Zellen inkubiert und in vitro mit P18 + Interleukin 2 (Abb. 8A und 8B) oder mit P18 gepulsten BALB/c 3T3 Fibroblasten (Abb. 8C und 8D) als Targets restimuliert.
Abb. 9A, 9B. Phänotyp der durch Immunisierung mit dem zusammengesetzten Peptidkonstrukt induzierten CTL-Effektoren (Abb. 9A) und T-Helferzellen (Abb. 9B). In Abb. 9B wurde die Immunisierung mit PCLUS4-18 durchgeführt.
Abb. 10A-10H zeigen die HIV-neutralisierende Aktivität von mit PCLUS3-18MN aufgefrischten Seren (Abb. 10A-10D) und von mit PCLUS6-18MN aufgefrischten Seren (Abb. 10E-10H).
Abb. 11A-11H zeigen die HIV-neutralisierende Aktivität von mit PCLUS6-18MN aufgefrischten Seren (Abb. 11A-11H) und von mit PCLUS6.1-18MN aufgefrischten Seren (Abb. 11E-11H).
Abb. 12A, 12B zeigen die durch Immunisierung mit P18-MN und PCLUS3-18MN in verschiedenen Adjuvansien hervorgerufenen CTL-Reaktionen.
Abb. 13A, 13B zeigen die CTL-Reaktionen nach zwei Peptid P18- oder PCLUS6.1MN-Immunisierungen in verschiedenen Adjuvansien.

DETALLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

In dem Bestreben, eine verstärkte Reaktion neutralisierender Antikörper zu unterstützen, haben wir Clusterpeptide direkt mit dem in der PND enthaltenen Peptid 18 (P18) verbunden. P18 besteht aus den Aminosäureresten 308-322 von HIV-1 IIIB gp160 (Sequenznumerierung gemäß der Los Alamos database (43), welche um 7 niedriger ist als die Numerierung von Ratner et al. (44), die wir früher benutzten (42)). P18 enthält auch eine immunodominante Bindungsstelle für cytotoxische T- Zellen (45, 46). Es versteht sich, daß die Regionen von gp160 Hüllproteinen von nicht-IIIB HIV-Stämmen, die homolog zu der P18-Region sind, in analoger Weise verwendet werden können. So werden zum Beispiel in Beispiel III die bei Verwendung der P18-Region des Stammes MN als CTL-Epitop in dem immunogenen Peptid erhaltenen Ergebnisse gezeigt. Die Peptide, die repräsentativ die P18-Region von verschiedenen HIV-Stämmen stehen, sind in der ebenfalls anhängigen United States Patentanmeldung 07/847,311 offenbart.
Es ist gezeigt worden, daß die Immunogenität von Haptenpeptiden durch lineare Polymerisation oder Kopplung mit T-Helfer-Determinanten erhöht wird (47-49). Die Clusterpeptide sollten in multiplen MHC-Haplotypen helfen. Bemerkenswert hohe Neutralisationstiter wurden in Mäusen mehrerer MHC-Typen nach nur einer einzigen Auffrischung mit einigen dieser Peptide erhalten. Wir versuchten darüberhinaus, die Feinspezifität und die Affinität der gegen Peptid 18 gerichteten neutralisierenden Antikörper zu untersuchen. Über diesen Ansatz können Peptide für einen synthetischen Peptidimpfstoff für die Immunprophylaxe und Immuntherapie von HIV-Infektionen entwickelt werden (50).
Einige der Materialien und Methoden, die in den Beispielen unten verwendet werden, kommen in mehr als einem der Beispiele zum Einsatz. Diese Materialien und Methoden werden unter "Allgemeine Materialien und Methoden" beschrieben.

Allgemeine Materialien und Methoden

Peptidsynthese. Die Clusterpeptid-Peptid-18- und T-Helfer-Peptid-18-Konstrukte wurden mit einem automatischen Peptid-Synthesizer (Nr. 430A; Applied Biosystems, Foster City, CA) unter Verwendung von t-boc-Chemie (51) gemäß der in Tabelle I gezeigten Sequenzen (SEQ. I. D. NR. 1-6) synthetisiert. Die Peptide wurden mit HF vom Harz abgespalten und zunächst durch Ausschlußchromatographie (P4 Biogel; BioRad Laboratories, Mountain View, CA) gereinigt. Reinigung zu einzelnen Peaks wurde durch reverse-phase HPLC mit analytischen und präparativen ubondapack reverse-phase C18-Säulen (Waters Associates, Milford, MA) erreicht. Das Peptid 55-18 wurde mit einem zusätzlichen Ala am N-Terminus synthetisiert, um ein N-terminales Gin zu vermeiden, das unter Bildung von Pyroglutaminsäure zyklisieren würde. Tabelle 1 Seguenzen von mit Peptid 18 HIV-1 IIIB verbundenen T-Helfer-Bindungsstellen
*Die HIV-1-IIIB-Numerierung erfolgte gemäß der Los Alamos Protein sequence database (43). Bei früheren Verweisen auf diese Peptide (42) wurde das Ratner-Numierungssystem (44) verwendet.
Das Peptid 55-18 ist mit dem zusätzlichen Alanin am N-Terminus zum Vermeiden der Bildung von Pyroglutaminsäure gezeigt.
Die die individuellen oder multideterminanten Epitope enthaltenden Peptide können durch Synthese als ein kolineares Peptid, wie oben beschrieben, zusammengefügt werden. Alternativ dazu können Carbonsäure- und Aminogruppen in den Seitenketten zur Bildung von Peptidbindungen herangezogen werden; die Verbindung der Peptide über die Seitenketten liefert ein Immunogen mit verzweigter Struktur. In einer dritten Ausführung können die Peptide durch nicht peptidische Konjugationen verbunden werden. Vom Stand der Technik sind mehrere Methoden zur Konjugation von Peptiden wohlbekannt. Eine dieser Methoden wird in U. S. Patent 4,886,782 beschrieben.
Mäuse. Kongene H-2-Mäuse mit B 10 Hintergrund und BALB/c-Mäuse wurden von Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) erworben oder in unserer Kolonie bei Bio- Con Inc., Rockville, MD, gezüchtet. Die in dieser Untersuchung verwendeten Mäuse waren 8-20 Wochen alt.
ELISA. Die Vertiefungen von flexiblen PVC-Mikrotiterplatten mit rundem Boden (#3912 Falcon Labware, Oxnard, CA) wurden über Nacht bei 4ºC mit 100 ul von 10 uM Peptid 18, substituiertem Peptid 18, Clusterpeptid 3, Clusterpeptid 6, 0,2 ug/ml rekombinantem gp 120 (ABT, Advanced Biotechnologies, MA) oder 2 uM Pottwal-Myoglobin in 0,1M Carbonatpuffer pH 9,6 beschichtet. Platten mit rekombinantem gp120 wurden mit 100 ul einer 0,2 ug/ml-Lösung von affinitätsgereinigtem rgp 120 (ABT) in Carbonatpuffer beschichtet. Die Platten wurden mit 1% BSA in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) für 1-1,5 h bei 4ºC geblockt und mit einer PBS enthaltend 0,05% Tween 20 und 1% BSA (PBSTB) gewaschen. Daraufhin wurden 100u1 Testserum in Doppelvertiefungen gegeben und bei 4ºC für 1-1,5 h inkubiert. Die Testseren wurden bei 10-fachen Verdünnungen in PBSTB von 1 : 100 - 1 : 10.000 gemessen. Die Vertiefungen wurden dann 10-mal mit 200 ul PBSTB unter Verwendung eines automatischen Plattenwäschers (BioRad Modell 1550) gewaschen und bei 4ºC eine Stunde lang mit 100 ul mit alkalischer Phosphatase konjugiertem Ziege/Anti-Maus IgG (Promega, Madison, WI), verdünnt 1 : 7500 in PBSTB, inkubiert. Nach 10 Wäschen wurden gebundene Antikörper durch Zugabe von 100 ul einer 1mg/ml-Lösung von para-Nitrophenylphosphat als Substrat nachgewiesen. Mit einem ELISA-Reader wurde die optische Dichte bei 405 nm gelesen. Die spezifische Extinktion wurde als mittlere optische Dichte bei 405 nm der relevanten Antigen-beschichteten Vertiefungen minus der optischen Dichte bei 405 nm der nichtrelevanten Pottwal-Myoglobin-beschichteten Vertiefungen bestimmt. Peptid 18-spezifisches IgM wurde mit Ziege/Anti-Maus u-kettenspezifischen Antikörpern (Sigma Chemical Co., St Louis, MO), gefolgt von mit alkalischer Phosphatase konjugiertem Anti-Ziege, nachgewiesen. Gesamt-IgG und IgGI- und IgG2a-Isotypen wurden mit Biotin-konjugierten Ratte/Anti-Maus monoklonalen Antikörpern LO-MG1-13 für IgGI und LO-MG2a-3 für IgG2a (BioSource International, Westlake Village, CA) nachgewiesen. Nach der Zugabe von Strepavidin/alkalische Phosphatase (Sigma Immunochemicals, St. Louis, MO) wurde Substrat zugegeben, und die Platten wurden auf dem ELISA-Reader gelesen.
Die Erfindung wird detailliert durch die unten angegebenen Beispiele erläutert. Die Beispiele gelten als Erläuterung der bevorzugten Ausführungen der Erfindung und sollen die Erfindung in keiner Weise einschränken.

BEISPIEL I: IMMUNISIERUNG VON MÄUSEN ZUR HERSTELLUNG EINES HOHEN TITERS NEUTRALISIERENDER ANTIKÖRPER GEGEN HIV-1

Die Peptide der vorliegenden Erfindung können verwendet werden, um durch Immunisierung eines Säuge-tierwirtes mit dem Peptid einen hohen AbN-Titer gegen das Target-Antigen zu erzeugen. In diesem Beispiel werden von der Sequenz des HIV-1 Hüllglycoproteins gp 120 abgeleitete Peptide zur Erzeugung eines hohen AbN-Titers in Mäusen herangezogen.
Immunisierungen. Mäuse wurden intraperitoneal mit 20 Nanomol jedes Peptids, emulgiert 1 : 1 in komplettem Freudschem Adjuvans (CFA), immunisiert. Am 21. und 31. Tag nach der Immunisierung wurde Blut retroorbital entnommen. Das Blut wurde gerinnen gelassen, und das Serum wurde entnommen und bei -20ºC eingefroren. Da die Antikörper-Spiegel zwischen Tag 21 und Tag 31 nach der Primärimmunisierung noch anstiegen, sind die Ergebnisse von 31 Tage alten Seren angegeben. Ausgewählte Tiergruppen wurden 36-52 Wochen nach der Primärimmunisierung durch intraperitoneale Gabe von 10 Nanomol Peptid in CFA aufgefrischt, und 10-11 Tage später, als die Sekundärantwort im allgemeinen das Optimum erreicht hatte, wurde Blut entnommen.
HIV-1 -Neutralisationsassays. Der quantitative Infektivitätsmikroassay unter Verwendung von CEM-5S-Zellen wurde wie beschrieben durchgeführt (52). Kurz gesagt wurden zweifache Reihenverdünnungen von 50 ul hitzeinaktiviertem (56ºC, 30 min) Testserum mit 50 u1 eines Kulturüberstandes enthaltend 200 Synzytiumbildende Einheiten (SFU) eines HIV-1-IIIB- oder HIV-1-MN-Stammes, der optimal aus logarithmischen H9-Zellkulturen herangezogen wurde und zuvor cryokonserviert und getitert wurde, gemischt und 30 Minuten bei Raumtemperatur inku biert. Die Mischungen wurden bei 37ºC für 1 Stunde zu in Doppelvertiefungen befindlichen CEM-SS-Zellen, die mit 5 · 10&sup4; DEAE-Dextran behandelt worden waren, gegeben, und die Virus/Antikörper-Mischungen wurden dann entfernt und durch Medium ersetzt, und die Zellen wurden dann nur in komplettem Medium bei 37ºC in 5% CO&sub2; kultiviert, entweder 5 Tage (für HIV-1 IIIB) oder 4 Tage (für HIV-1MN, als optimal für den jeweiligen Virusstamm bestimmt). Infektiöse Viruseinheiten wurden durch anschließende Synzytiabildung von infizierten Zellen unter einem umgekehrten Mikroskop quantifiziert. Der reziproke geometrische mittlere Neutralisationstiter wurde als diejenige Serumverdünnung ausgedrückt, bei der HIV-1-Foki zu mehr als 90% gehemmt werden können, verglichen mit HIV-1- infizierten CEM-5S-Kontrollzellen, die mit dem benannten HIV-1-Stamm infiziert waren (d. h. Vn/Vo < 0,1). In dem Assay wird die Neutralisation zellfreier Viren in der ersten Inkubation gemessen, nicht die Hemmung der Synzytiumbildung, welche nur der Ausdruck für die Liste der infektiösen Viren ist. Für das Serum allein wurden bei der höchsten getesteten Konzentration keine cytostatischen oder toxischen Wirkungen auf CEM-SS-Zellen beobachtet. Es wurde gleichfalls gezeigt, daß die 30-minütige Hitzeinaktivierung bei 56ºC die nichtspezifische neutralisierende Aktivität der Mäuseseren eliminiert (53).
Bestimmung der direkten Bindung durch Immunofluoreszenz. Zur Bestimmung der Bindung von Peptid-induzierten Antikörpern an natives gp 120 wurden zehnfache Reihenverdünnungen von ausgewählten neutralisierenden und nichtneutralisierenden Seren in einem Immunofluoreszenz-Assay (IFA) (52) mit lebenden Zellen auf Bindung an virales gp 120, welches auf der Oberfläche von mit HIV-1 IIIB produktiv infizierten Zellen exprimiert wird, getestet.
Kompetition-ELISA-Bindungskurven. Die Bindungstests wurden durchgeführt, indem in sterilen Polypropylenröhrchen 125 ul verschiedener p18-(0-20 uM)- oder rgp120-(0-160 nM)-Verdünnungen in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung, pH 7,2, 1% Ovalbumin, 0,05% Tween 20, mit 125 ul einer konstanten Antiserum- Verdünnung gemischt wurden, die als in dem linearen Absorptionsbereich gegen eine Antikörper-Verdünnung in demselben Puffer bestimmt worden war. Die Mischungen wurden über Nacht bei 4ºC und leichtem Schütteln inkubiert, und 100 ul wurden dann in Doppelvertiefungen einer mit dem entsprechenden konkurrierenden Antigen p18 oder gp120 beschichteten Mikrotiterplatte gegeben und bei 4ºC 20 Minuten lang inkubiert, und ein Standard-ELISA-Assay wurde durchgeführt. Die Bindungskurven wurden mit Hilfe einer vier Parameter umfassenden Logistikfunktion des log der Serumverdünnung gegen die Extinktion unter Verwendung eines kommerziellen Softwareprogramms (Biometalics Inc., Princeton, NJ) erstellt, und eine geschätzte Dissoziationskonstante (Kd-Wert) für die einzelnen Seren wurde bestimmt.
Bindung an P18-substituierte Peptide. Die Spezifität von neutralisierenden und nichtneutralisierenden Seren wurde in einem Standard-ELISA-Assay für die Bindung von 15 substituierten p18-Peptiden (37) untersucht, mit denen Mikrotitervertiefungen aus Plastik beschichtet waren.
Die synthetischen multideterminanten Peptide (Tabelle I), "Clusterpeptide" genannt (in den Namen spezifischer Konstrukte als PCLUS abgekürzt), stellen jeweils Cluster überlappender, aber verschiedener, kurzer T-Helfer-Determinanten, die in früheren Studien (42, 54, 55) identifiziert worden waren, dar. Die drei Clusterpeptide PCLUS 3, 4 und 6, die in dieser Studie verwendet wurden, wurden gewählt, weil sie das Kriterium des Auslösens von proliferativen Reaktionen in vier unabhängigen Maus-MHC-Haplotypen erfüllen, die sich sowohl in einem I-A- und in einem I-E- Molekül unterscheiden, und Darüberhinaus auch in Menschen mit multiplen HLA- Typen (42,56,57). PCLUS 1 wurde von nur einem Mäusestamm, B10.BR, gut erkannt, stimulierte jedoch die IL-2-Produktion in 23 von 36 HIV seropositiven, Grippepositiven Spendern. Peptid HP53 (Reste 827-841 nach der Los Alamos database (43) Numerierung, welche um 7 niedriger ist als die von Ratner (44), die früher benutzt wurde (42,54,55)) und Peptid HP55 (Reste 834-848) sind bereits als T- Helfer-Epitope auf der HIV-IIIB-Hüllensequenz in Mäusen der AkEk- und AbEb- Haplotypen bzw. der AkEk-, AbEb-, AdEd- und AsEs-Haplotypen identifiziert worden und sind Teil der längeren PCLUS-Peptide. (Eb und Es werden hier verwendet, um die exprimierten EβbEα beziehungsweise EβsEα-Moleküle zu bezeichnen. Obwohl das nichtpolymorphe Eα in reinen H-2b- und H-2s-Haplotypen nicht exprimiert wird, verwendeten wir rekombinante Stämme, die Eα exprimieren.) Vom Peptid HP53 (auch als env TH 4.1 bezeichnet) ist ebenfalls schon gezeigt worden, daß es die IL- 2-Produktion in Lymphocyten aus peripherem Blut von asymptomatischen HIV- seropositiven menschlichen Patienten anregt (57). Peptid 18 (Reste 308-322) ist ein B-Zellen-Epitop, das sich auf der hypervariablen V3-Schleifenregion der HIV-1- IIIB-Hülle befindet, bekannt als principal neutralizing determinant (PND), und ist das bedeutendste immunodominante Epitop cytotoxischer T-Zellen von Mäusen (45), und es wird außerdem von humanen CTL erkannt (46).
Synthetische Peptidimpfstoff-Konstrukte wurden hergestellt, indem Peptid 18 an den Carboxyl-Terminus des Clusterpeptids synthetisiert wurde. Immunisierung von Mäusen mit 20 Nanomol dieser Konstrukte führte zur Bildung von vermehrten Peptid-18-spezifischen Antikörpern, während in Mäusen, die nur mit Peptid 18 immunisiert worden waren, keine Peptid-18-spezifischen Antikörper nachgewiesen werden konnten (Tabelle II). Die Orientierung von T-Helferzellen- und B-Zellen- Epitopen stellte sich als entscheidend für die Immunogenizität des Konstruktes heraus, denn, obwohl das Clusterpeptid 3-18 eine Antikörperreaktion in allen vier untersuchten Stämmen bewirkte, rief das Konstrukt mit umgekehrter Polarität, P18- Clusterpeptid 3, bei dem die Helfer-Bindungsstelle sich am C-Terminus von P18 befand, eine Antikörperreaktion auf Peptid 18 in nur einem Stamm, B10.HTT, hervor, und das auf entscheidend niedrigerem Niveau. Tabelle II HIV-III-Peptid-18-spezifische Antikörperreaktion und neutralisierende Aktivität in vier Mäusestämmen 31 Tage nach einer einzelnen Immunisierung mit 20 Nanomol T-Helfer-P18-Peptid
* Mittlere p 18-spezifische Extinktion ± S. E. M. * von 5 Mäuseseren, getestet bei einer Serumverdünnung von 1 : 1000
Reziproker geometrischer mittlerer HIV-IIIB-neutralisierender Antikörpertiter, ausgedrückt als Serumverdünnung, bei der HIV-IIIB-spezifische Foki zu mehr als 90% gehemmt werden können, verglichen mit HIV-IIIB-infizierten CEM-SS-Kontrollzellen.
(Anzahl der Mäuse mit positiven neutralisierenden Titern/Gesamtanzahl der getesteten Mäuse.)
++ NU nicht untersucht B10.D2- und/oder B10.A-Mäusestämme wurden verwendet.
§ Für PCLUS 3-18 und PCLUS 6-18 sind zwei verschiedene Experimente gezeigt.
Standardabweichung des Mittelwertes
In den meisten Fällen unterstüzte die T-Helfer-Peptidkompetenz unserer Konstrukte die Peptid-18-spezifischen Antikörper in den Stämmen, in denen diese T- Zellen-Epitope in früheren Studien (54, 58) proliferative Reaktionen bewirkten. Bei den Peptiden 53-18 und 55-18 reagierten die AbEb- und AkEk-Haplotypen auf Peptid 53-18, und die AsEs-, AdEd- und AbEb-Haplotypen reagierten auf Peptid 55-18 (Tabelle 11). Zusätzlich reagierten AgEs-Mäuse auf Peptid 53-18, jedoch produzierten AkEk-Mäuse keine Anti-P18 Antikörper gegen Peptid 55-18, obwohl bereits gezeigt wurde, daß sie sich als Reaktion auf P55 vermehren (54). PCLUS 1-18, welches T-Helferzellen-Epitope enthält, die von allen vier in dieser Studie verwendeten Mäusestämmen erkannt werden, war bei nur einem Stamm, B 10. BR, dazu in der Lage, eine deutliche Antikörperreaktion zu bewirken, und bewirkte in zwei weiteren Stämmen, B10.D2 und B10.HTT, eine geringfügige Reaktion. Dies war nicht überraschend, da wir in unserer früheren Untersuchung (42) gezeigt haben, daß das Clusterpeptid 1 nicht einfach eine Summe seiner Teile ist, sondern daß es bei einigen Stämmen nicht dazu in der Lage war, die Proliferation zu stimulieren, obwohl eine kleinere Komponente des Clusterpeptides dies bewirken konnte. Das größere Peptid könnte sich auf sich selbst zurückfalten und so eine Wechselwirkung mit dem MHC oder T-Zellen-Rezeptor verhindern, oder es könnte anders prozessiert werden, was eine Zerstörung eines Komponentenepitops zur Folge haben könnte. PCLUS 3-18, 4-18 und 6-18 lösten bei allen getesteten Mäusestämmen in wenigstens einem Experiment eine deutliche Peptid-18-Antikörperreaktion aus, gemessen durch ELISA. Diese Ergebnisse zeigen, daß durch das Verbinden eines B- Zellen-Epitops mit dem Carboxyl-Terminus eines Clusters immunodominanter T- Zellen-Epitope in den meisten Fällen ein Prozessieren der individuellen Epitope offenkundig ist, und daß die angeregten T-Zellen in der Lage sind, die B-Zellen bei der Herstellung spezifischer Antikörper zu unterstützen. Da eine einzige Immunisierung mit diesen Clusterpeptid-Peptid-18-Konstrukten hohe Spiegel an P18- spezifischen Antikörpern induzieren konnte, untersuchten wir, ob eine Auffrischung, die eine virale Provokation darstellen könnte, eine charakteristische anamnesische Reaktion bewirken würde, die zu einer verbesserten Peptid-18-spezifischen Antikörperreaktion führen würde (Abb. 1). Nach der Primärimmunisierung, auf die die Antwort langsamer ist als auf eine zweite Immunisierung, wurden Seren am 21. und 31. Tag gewonnen, die Antikörperspiegel nahmen jedoch auch am 31. Tag noch zu. Daher werden in Tafel A die individuellen mittleren Peptid-18- spezifischen Extinktionswerte für Tiere gezeigt, die mit 20 Nanomol PCLUS 6-18 immunisiert wurden und denen 31 Tage nach der Immunisierung Blut entnommen wurde, und in Tafel B werden individuelle Extinktionswerte für Tiere gezeigt, die eine Auffrischungsimpfung mit 10 Nanomol PCLUS 6-18 erhielten, 37 und 49 Wochen nach der Primärimmunisierung, und denen 11 Tage später Blut entnommen wurde, zu welchem Zeitpunkt die Sekundärantwort gewöhnlich ihren Höhepunkt erreicht. Die Zunahme der nach der Auffrischungsimpfung beobachteten Antikörperreaktion war zwischen 2,5- und 12-fach.
Um den Nutzen dieser synthetischen Peptidkonstrukte in einem Impfstoff abschätzen zu können, war es notwendig herauszufinden, ob die gegen Peptid 18 gerichteten Antikörper nach einer einzigen Immunisierung mit diesen Konstrukten in der Lage sind, das Virus in vitro zu neutralisieren. Eine neutralisierende Aktivität, ausgedrückt als der reziproke geometrische mittlere Titer, bei dem zellfreie infektiöse HIV-IIIB-Einheiten zu mehr als 90% gehemmt werden, verglichen mit HIV-IIIB- infizierten CEM-SS-Kontrollzellen, wurde durch Peptid 53-18, 55-18 und PCLUS 1-18 in den Stämmen bewirkt, die durch eine spezifische Antikörperreaktion antworteten. Die Antikörper hatten jedoch nur in einem von fünf mit 53-18 immunisierten Tieren und nur in zwei von fünf mit 55-18 und PCLUS 1-18 immunisierten Tieren neutralisierende Aktivität (Tabelle 11), trotz gleicher oder höherer Spiegel von Peptid-18-spezifischen Antikörpern nach ELISA in anderen Tieren der Gruppe. Die Feststellung, daß die Peptid-18-spezifischen Antikörper-Gesamtspiegel nicht mit der Neutralisation korrelieren, wurde durch einen Vergleich zwischen verschiedenen Stämmen von mit PCLUS 4-18 immunisierten Tieren ausgeweitet. Obwohl gemäß ELISA alle Stämme mit beträchtlichen Antikörperspiegeln auf Peptid 18 reagierten, verglichen mit Prebleed-Kontrollen, produzierte nur eines von vier Tieren des BALB/c-Stammes neutralisierende Antikörper bei der niedrigsten getesteten Verdünnung (Tabelle 11). Die mangelnde Korrelation zwischen einer spezifischen Peptid-18-Antikörperreaktion und neutralisierender Aktivität war besonders in mit PCLUS 3-18 immunisierten Tieren augenscheinlich. In allen mit PCLUS 3-18 immunisierten Mäusestämmen wurden, wie durch ELISA bestimmt, beträchtliche Peptid-18-spezifische Antikörperspiegel bewirkt, und die Tiere des AsEs-Haplotyps zeigten die stärkste Antikörperreaktion auf dieses Konstrukt. Nichtsdestotrotz stellten nur Tiere des H-2d-Haplotyps Antikörper her, die dazu in der Lage waren, das Virus in vitro zu neutralisieren (9 von 10 Tieren), trotz niedrigerer Antikörperspiegel nach ELISA. Diese Feststellung legt nahe, daß die in vivo-Induktion von neutralisierenden Antikörpern durch das B-Zellen-Epitop-(Peptid 18) Immunogen von noch anderen Faktoren als nur dem Maß der Unterstützung abhängt, wie z. B. der Spezifität der T-Helferzellen, oder anderen MHC-abhängigen regulatorischen Faktoren.
In allen untersuchten Stämmen, in denen es eine signifikante Antikörperreaktion nach ELISA hervorrief, aktivierte PCLUS 6-18 in reproduzierbarer Weise neutrali sierende Antikörper (Tabellen II und III). Die geometrischen mittleren Titer neutralisierender Antikörper, die in BALB/c (42,2) und B10.BR (32,0) erreicht wurden, entsprechen Spiegeln einer gegen die V3-Schleife gerichteten neutralisierenden Aktivität, von denen gefunden wurde, daß sie ausreichen, um Schimpansen gegen eine homologe Provokation mit lebendem Virus zu schützen (30). Die Neutralisationstitrationsprofile von zwei separaten Experimenten für jede Tiergruppe nach einer einzelnen Immunisierung mit PCLUS 6-18 sind in Abb. 2 gezeigt.
Jedes Tier erhielt 20 Nanomol von in CFA emulgiertem synthetischem Peptid (1 : 1) intraperitoneal in einem Volumen von 0,1 ml. Die neutralisierende Aktivität wird in einem Synzytium-bildenden Mikrokulturassay unter Verwendung des HIV-1-IIIB- HX3-Stammes bestimmt und als Vn/Vo ausgedrückt, wobei Vn die mittlere Anzahl an Synzytia bildenden Einheiten (SFU) in Doppeltestvertiefungen und Vo die Anzahl an SFU in Kontrollvertiefungen, die ohne Testseren inkubiert wurden, ist. Jede Kurve stellt eine zweifache Reihenverdünnung individueller Mäuseseren (bezeichnet nach der Tiernummer) dar, mit Ausnahme des Prebleed-Pools, der alle Tiere einer Gruppe einschließt. Die zwei Säulen stellen zwei separate Experimente dar.
Mit Interesse kann festgestellt werden, daß drei von fünf in der ersten Tafel gezeigten BALB/c-Mäusen 90%-Neutralisationstiter größer als 64 aufwiesen, welches der größten untersuchten Verdünnung entspricht. Darüberhinaus zeigten vier von zehn in Tafeln 3 und 4 gezeigten B 10.BR-Mäusen Neutralisationstiter größer als 64. Mehr als die Hälfte (22/40) aller mit Clusterpeptid 6-18 immunisierten Tiere zeigte eine 50%-ige Neutralisierung von lebenden Viren bei einer Verdünnung von 1 : 64, und alle bis auf eins neutralisierten 50% des Virus bei einer der untersuchten Verdünnungen. Dieses einzelne Tier mit der Nummer 6269 B lO. HTT zeigte eine nur unbedeutende Antikörperreaktion in einer Gruppe, die nur wenig immunisiert schien. Die Mäuse, die auf die Primärimmunisierung ansprachen, erhielten eine einzelne Auffrischungsimpfung mit demselben Konstrukt in CFA, 37 oder 49 Wochen nach der ersten Immunisierung. Diese einzelne Auffrischungsimpfung ergab bemerkenswert hohe Titer neutralisierender Antikörper mit 90% Neutralisation selbst bei 1 : 2048-1 : 4096 in vielen Tieren und bei einigen sogar bei 1 : 16.384 (Abb. 3 und Tabelle IV). Diese Neutralisationstiter gegen den homologen Virusstamm, nach nur zwei Immunisierungen, sind wenigstens 4- bis achtmal höher als die höchsten Titer anderer durch Immunisierung induzierter polyklonaler Seren, die wir jemals beobachtet haben (8, 59). Darüberhinaus deutet der zeitliche Verlauf darauf hin, daß die Erinnerung an die Primärimmunisierung wenigstens 11 Monate lang anhält. Weiterhin waren in drei von vier mit PCLUS 6- 18 IIIB (SEQ. I.D. NR. 36) aufgefrischten Stämmen die Seren auch dazu in der Lage, den HIV-1MN-Stamm zu neutralisieren, wenn auch bei einem sehr viel niedrigeren Titer (Tabelle IV). Obwohl Mäuse des H-2d-Haplotyps einige der höchsten Neutralisationstiter gegen HIV-1 IIIB (z. B. 1 : 16.384) nach einer einzigen Auffrischungsimpfung aufwiesen, zeigte keines dieser Seren eine kreuzneutralisierende Aktivität gegen den MN-Stamm.
In einem Versuch zu erklären, warum einige Seren eine hohe neutralisierende Aktivität hatten und andere Seren mit einem ähnlichen ELISA-Titer für die gleiche kurze Sequenz nicht, verglichen wir Affinität, Isotyp, Feinspezifität und andere Eigenschaften neutralisierender und nichtneutralisierender, von jedem der Clusterpeptid- Peptid-18-Immunisierungen erzeugter Antikörper (zusammengefaßt in Tabelle III). Es ist wichtig festzustellen, daß alle untersuchten Seren, mit Ausnahme des Serums eines Tieres (B10.BR # 9770), dazu in der Lage waren, das Virus bei einer gewissen Verdünnung zu neutralisieren, wenn man als Maßstab eine 50%-ige Hemmung im Vergleich mit den Kontrollseren anlegt, auch wenn sie gemäß dem Kriterium einer 90%-igen Hemmung nichtneutralisierend waren. Es könnte daher schwieriger sein, zwischen Spezifitätsunterschieden zu differenzieren, da Seren, die bei 90% Hemmung nichtneutralisierend sind, niedrige Spiegel neutralisierender Antikörper aufweisen können, die Unterschiede verwischen könnten. Tabelle III Eigenschaften von durch Clusterpeptid-P18-Immunisierung erzeugten neutralisierenden Antikörpern Tabelle III (fortgesetzt) Tabelle IV Eigenschaften von mit 10 Nanomol Clusterpeptid-P18 aufgefrischten Seren
Die ELISA-Werte wurden bei 405 nm gemessen, und die reziproken Verdünnungsneutralisationstiter individueller Mäuseseren wurden 39-52 Wochen nach einer einzelnen Auffrischungsimpfung mit 10 Nanomol Clusterpeptid 3 oder 6 in vier verschiedenen Mäusestämmen gemessen. Die Neutralisierung von homologen Viren bei den 90% und 50% Endpunkten wird in der mit IIIB bezeichneten Spalte, die HIV-1 IIIB darstellt, angegeben, und die Kreuzneutralisation wird in der Spalte MN, die HIV-1MN repräsentiert, angegeben.
* - bedeutet negativ bei der geringsten getesteten Verdünnung, 1 : 64.
Die Ergebnisse in Spalte 4 zeigen die direkte Bindung an HIV-IIIB-infizierte Zellen durch Immunofluoreszenz. Drei von fünf Seren von mit Clusterpeptid 6-18 immunisierten Tieren, die in der Lage sind, das Virus im Synzytium-Bildungsassay zu 90% zu neutralisieren, zeigten Bindung an virusinfizierte Zellen, obwohl es zwischen Neutralisationstiter und IFA-Titer keine Korrelation gab. Zwei neutralisierende Seren von mit PCLUS 3-18 und PCLUS 6-18 immunisierten Mäusen, #6245 bzw. #6249, zeigten keine Bindung an infizierte Zellen nach IFA. Darüberhinaus zeigte eines von zwei nichtneutralisierenden Seren, von der mit PCLUS 6-18 immunisierten Maus #9770, Bindung an virusinfizierte Zellen, trotz Abwesenheit jeglicher neutralisierenden Aktivität bei der 50% Hemmschwelle im Synzytium- Bildungsassay. In dieser kleinen Probe konnten wir durch IFA keinen Unterschied zwischen neutralisierenden und nichtneutralisierenden Seren feststellen.
Die Seren von den mit den Clusterpeptiden immunisierten Tieren wurden in einem ELISA-Assay auf Bindung an rgp 120 untersucht. Es ist zu beachten, daß die Extinktionswerte aus den ELISA-Assays in Tabelle III nur innerhalb der Spalten und nicht zwischen Spalten sinnvoll miteinander verglichen werden können, da verschiedene Reagenzien und Assaybedingungen bei den jeweiligen ELISA-Tests zum Einsatz kamen. Alle getesteten Immunseren banden rgb 120, während die Prebleed- Kontrollseren dies nicht taten, und es gab keine signifikanten Unterschiede bei den für neutralisierende und nichtneutralisierende Seren gefundenen Spiegeln. Darüberhinaus konnten keine Unterschiede in den IgM-Spiegeln zwischen Seren gefunden werden, die P18 oder rgp 120 binden. In einer kleinen Probe wurde der Isotyp des durch P18 aktivierten Antikörpers als IgG&sub1; bestimmt. Keines der getesteten Seren wies Antikörper des Isotyps IgG2a auf. Zwischen Isotyp und neutralisierender Aktivität wurde keine Korrelation gefunden.
Da die gegen die T-Helfer-Bindungsstellen aktivierten Antikörper in einer folgenden viralen Infektion eine Rolle spielen können, war es wichtig herauszufinden, ob die Seren von mit den Clusterpeptid-Peptid-18-Konstrukten immunisierten Tieren selbst Antikörper gegen die Clusterpeptide enthielten. Zudem könnten, wenn die Antikörper gegen die Helfer-Bindungsstellen neutralisierend wären, diese für die mangelnde Korrelation zwischen der Bindung an Peptid 18 und der Neutralisierung verantwortlich gemacht werden. Wir untersuchten diese Möglichkeit mit einem ELISA unter Verwendung von nur mit Clusterpeptid 3 oder Clusterpeptid 6 beschichteten Platten. Keines der getesteten Tierseren zeigte Bindung an PCLUS 3. Im Gegensatz dazu produzierten alle mit PCLUS 6-18 immunisierten Tiere Antikörper, die gegen die T-Helfer-Bindungsstelle Reaktivität zeigten, und die Konzentration der produzierten Antikörper war proportional zu ihrer Reaktion auf Peptid 18, während keines der Kontrolltiere Anti-Clusterpeptid-6-Antikörper produzierte. Es ist jedoch unwahrscheinlich, daß die neutralisierende Aktivität dieser Seren auf Antikörper gegen Clusterpeptid 6 zurückzuführen ist, wegen seiner Lage in dem intracytoplasmischen Schwanz von gp 41 und der mangelnden Kreuzneutralisation des MN-Stammes (Tabelle III), wie weiter unten diskutiert. Daher muß sich die neutralisierende Aktivität hauptsächlich gegen den P18-Teil des Konstruktes richten.
Es war weiterhin möglich, daß Unterschiede in der Fähigkeit zur Neutralisation auf Unterschiede in der Antikörperaffinität zurückzuführen waren. Um diese Möglichkeit zu untersuchen, wurden Seren, die auf der Grundlage ihrer Fähigkeit, das Virus in dem quantitativen infektiven Synzytium-Plaque-Bildungsassay zu neutralisieren ausgesucht wurden, mit verschiedenen Peptid-18- oder rgp 120-Konzentrationen gemischt und ein Lösungsphasengleichgewicht erreichen gelassen. Durch Inkubation über Nacht bei 4ºC mit einer 10&supmin;³-Verdünnung von jedem Antiserum wurde es Kompetitorverdünnungen ermöglicht, ein Lösungsphasengleichgewicht zu erreichen. Freie Antikörper wurden dann mittels einer kurzzeitigen Inkubation auf konkurrierenden Peptid-18- bzw. Rgp 120- beschichteten Platten in einem ELISA- Assay bestimmt. Die für 50% maximale Kompetition (IC&sub5;&sub0;) erforderlichen Konzentrationen, als Schätzungen von Kd, wurden für jedes getestete Serum aus den Bindungskurven bestimmt. Jedes Experiment wurde drei- bis viermal wiederholt, und repräsentative Resultate sind in Abb. 4 dargestellt. Die Bindungsaviditäten (reziprok zu Kd) aller getesteten Seren waren beim rgp 120-Test um mehr als zwei logs höher (d. h. die IC&sub5;&sub0; war zwei logs niedriger), verglichen mit dem Peptid 18- Test (Tabelle III). Die Bindungsaviditäten der neutralisierenden und nichtneutralisierenden Seren gegenüber Peptid 18 waren vergleichbar, und jegliche Unterschiede bei der rgb 120-Avidität waren zweifelhaft. In einem Fall zeigte ein Neutralisierungsserum von einem mit Clusterpeptid 6-18 immunisiertem Tier, B10.BR-Maus Nummer 9772, eine 5-fach geringere Avidität gegenüber rgp 120 als das entsprechende nichtneutralisierende Serum, BALB/c Nummer 6251, während ein anderes neutralisierendes Serum aus der gleichen Gruppe, B10.A(5R) Maus Nummer 9777, nur eine 1,4-fach niedrigere Avidität als das entsprechende nichtneutralisierende Serum 6251 zeigte. Die Tatsache, daß die Bindungskurven nicht so steil waren wie erwartet, zeigt, daß diese Seren nicht homogen oder monoklonal in der Population der entweder Peptid 18 oder rgp 120 bindenden Antikörper waren, und die Heterogenität kann diese Ergebnisse beeinflußt haben. Die Tatsache, daß neutralisierende Seren oft niedrigere Aviditäten als nichtneutralisierende Seren zeigten, legt jedoch nahe, daß die Neutralisation nicht mit einer höheren durchschnittlichen Avidität gegenüber dem Peptid oder den rekombinanten gp 120 korreliert.
Um die Möglichkeit zu ergründen, ob die Unterschiede in der neutralisierenden Aktivität von Seren mit vergleichbaren Peptidbindungsaktivitäten durch Unterschiede in der Feinspezifität erklärt werden können, verwandten wir Peptide mit einzelnen Aminosäuresubstitutionen, in denen einzelne Reste aus der HIV-1-RF-Sequenz Reste aus der HIV-1-IIIB-Sequenz ersetzten (siehe Tabelle V, SEQ. I.D. NR. 8-23), um die Auswirkung jedes Restes auf die Bindung von neutralisierenden und nicht neutralisierenden Seren von mit PCLUS 3-18 und PCLUS 6-18 immunisiertten Tieren zu untersuchen (Abb. 5). Tabelle V Zur Bestimmung der Bindungsspezifität verwendete substituierte Peptide (37)
* Bedeutet eine Deletion
++ Die unterstrichenen Aminosäuren sind Substitutionen in der 18-IIIB-Sequenz.
Weder am Amino- noch am Carboxyl-Terminus des Peptids 18 durchgeführte Substitutionen scheinen Auswirkungen auf die Bindung entweder durch neutralisierende Seren, dargestellt durch die ausgefüllten Säulen, oder durch nichtneutralisierende Seren, dargestellt durch die offenen Säulen, von mit PCLUS 3-18 oder PCLUS 6- 18 immunisierten Tieren zu haben. Im Vergleich zu einer Peptid-18-Kontrolle kam es sogar zu einer verstärkten Bindung, wenn ein Tyrosin in Position Nummer 11 gegen ein Valin ausgetauscht wurde, und Substitutionen in den Positionen Nummer 12, 13, 14 und 15 zeigten ähnliche Verstärkungen. Die Bindung beider Serengruppen war reduziert, wenn Substitutionen in der zentralen Schleifenregion der Peptid- 18-Sequenz PGRAF durchgeführt wurden. Dies war nicht überraschend, da gezeigt worden ist, daß die Sequenz GPGR die Bindungsstelle für neutralisierende Antikörper ist und eine wohldefinierte β-Faltenkonformation bewahrt (60). Es war überraschend, daß eine Substitution von Alanin für Glycin am Rest 312 (Peptid 18-5) die Bindung nicht beeinflußte. Es war ebenfalls überraschend, daß eine Substitution von Alanin für Prolin am Rest 313 (Peptid 18-6) die Bindung nicht in größerem Maße aufhebt, trotz ihrer Auswirkung in Form einer Unterbrechung der putativen Umkehrfallenkonformation. Die interessanteste Substitution war die Substitution in Po sition Nummer 8, Aminosäurerest 315. Neutralisierende Seren banden immer noch, wenn auch bedeutend weniger als an unsubstituiertes Peptid 18, an ein Peptid mit einer Alanin-für-Arginin-Substitution an diesem Rest, während nichtneutralisierende Seren nicht an dieses substituierte Peptid banden. Mit zusätzlichen Seren untersuchten wir die zentrale Schleifenregion genauer. Es war uns möglich, diese Ergebnisse in drei weiteren Experimenten zu reproduzieren. Die Ergebnisse eines solchen Experiments sind in Abb. 6 wiedergegeben. Sowohl neutralisierende als auch nichtneutralisierende Seren von mit Clusterpeptid 3-18 immunisierten Tieren (Abb. 6A) zeigten reduzierte Bindung an in Position 6, 7, 8 und 9 erfolgten Substitutionen. Neutralisierende Seren jedoch bewahrten ein geringes Bindungsvermögen für das in Position Nummer 8 substituierte Peptid, während nichtneutralisierende Seren keine Bindung eingingen. Ähnlich zeigten in der niedrigeren Tafel neutralisierende und nichtneutralisierende Seren von mit PCLUS 6-18 immunisierten Tieren eine dramatische Verringerung in der Bindung an Peptide mit Substitutionen in Position 6, 7, 8 und 9. Wiederum jedoch behielten neutralisierende Seren ein höheres Bindungsvermögen für das Peptid mit der Alanin für-Arginin-Substitution in Position 8. In einem anderen Experiment ergab der Effekt von Position 8 einen größeren Unterschied zwischen neutralisierenden und nichtneutralisierenden Seren, obwohl nicht so viele Substitutionen getestet wurden. Die aus der Alanin-für-Arginin- Substitution am Rest 315 resultierenden Implikationen sind unklar, da es die neutralisierenden Seren sind, die ein geringfügiges Bindungsvermögen bewahren. Nimmt man dieses Resultat jedoch zusammen mit dem geringfügig größeren Effekt von Substitutionen an Positionen 6 und 7 auf die Bindung von neutralisierenden Seren im Vergleich zu nichtneutralisierenden Seren, so legt dies nahe, daß neutralisierende Seren möglicherweise mehr auf die Spitze der Schleife fokussiert sind, und nichtneutralisierende Seren mehr auf die der zentralen Schleife benachbarte Carboxyl-Bindungsstelle fokussiert sind. So könnten die Unterschiede in der neutralisierenden Aktivität zwischen Seren mit vergleichbaren Peptid- und gp 120- Bindungsaktivitäten durch geringfügige Unterschiede in der Feinspezifität erklärt werden.
In der vorliegenden Studie wird der Nutzen einer Kombination von neutralisierenden B-Zellen-Epitopen mit einem Cluster von immunodominanten T-Helfer- Bindungsstellen zum Zweck der Konstruktion von synthetischen Peptidimpfstoffen mit verbesserter Immunogenität in multiplen MHC-Typen gezeigt. Die für diese Studie gewählten T-Helfer-Bindungsstellen beinhalten multideterminante Regionen des HIV-Hüllproteins gp160, von denen bereits gezeigt wurde, daß sie sowohl von Mäusen multipler H-2-Typen als auch von humanen T-Zellen HIV-infizierter Pati enten, die ein breites Spektrum von HLA-Typen repräsentieren, erkannt werden. Unsere Strategie war es, jedes Clusterpeptid mit einem kurzen synthetischen Peptid (Peptid 18) zu verbinden, das bereits als eine immunodominante Bindungsstelle, die von CD8 cytotoxischen T-Zellen in Verbindung mit Klasse I Molekülen erkannt wird, identifiziert worden ist und in der V3-Schleife bzw. der principal neutralizing determinant Region des HIV-IIIB-Hüllproteins gefunden wird. Alle diese Konstrukte, PCLUS 3-18, PCLUS 4-18 und PCLUS 6-18 (Tabelle I), aktivierten nach einer einzigen Immunisierung Peptid-18-spezifische Antikörper, die dazu in der Lage sind, rgp 120 zu binden. Antikörper von Mäusen, die vier verschiedene MHC- Haplotypen repräsentieren und mit einem dieser Konstrukte, PCLUS 6-18, immunisiert wurden, waren dazu fähig, das Virus zu neutralisieren. Bei 24 von 35 (69%) aller Tiere aller mit PCLUS 6-18 immunisierten Stämme hemmten die nach einer einzigen Immunisierung aktivierten Antikörper die Infektiosität des homologen Virus zu mehr als 90%. In drei der untersuchten Stämme aktivierte PCLUS 6-18 neutralisierende Antikörper in 80-90% der Tiere, die gemäß ELISA eine Peptid-18- spezifische Reaktion zeigten. Es ist interessant festzustellen, daß in einem Experiment der reziproke geometrische mittlere Titer an neutralisierenden Antikörpern, der in zwei Maus-Haplotypen erzielt wurde, 42,2 in H-2d und 32,0 in H-2k, sich auf einem Niveau befand, das an die Niveaus heranreichte, von denen bekannt ist, daß sie in Schimpansen eine Schutzwirkung gegen intravenöse Virusprovokation entfalten (30). Dieser Mittelwert ist niedrig geschätzt, da eine Anzahl von Tieren in jeder Gruppe Neutralisationstiter größer als 64, der größten getesteten Verdünnung, aufwies. Darüberhinaus führte eine einzige Auffrischungsimpfung zu 90% Neutralisationstitern von 1 : 1.000 bis 1 : 16.000, wesentlich höher, als wir das bisher in unserer Erfahrung mit anderen Immunisierungsmethoden gesehen haben (8,59). PCLUS 3-18 aktivierte peptidspezifische Antikörper in allen untersuchten Stämmen, jedoch waren diese Antikörper nur in Tieren des H-2d-Haplotyps durchweg neutralisierend (neun von zehn Mäusen).
Das Maß der Antikörper-Bindungsaktivität im ELISA, entweder gegenüber Peptid 18 oder gegenüber rgp 120, ließ keine Vorhersage darüber zu, ob die von dem Clusterpeptid-Peptid-18-Konstrukt aktivierten Antikörper neutralisierend sein würden oder nicht. Dies legt nahe, daß zusätzlich zu dem Ausmaß der T-Zellen-Hilfe zur Verstärkung der Antikörperreaktion noch andere Faktoren die qualitative Antwort auf das Konstrukt beeinflussen. Um den Mechanismus zu untersuchen, der zu den ausgeprägten Unterschieden in der neutralisierenden Aktivität von Seren mit vergleichbarer Peptid-18-Bindungsaktivität im ELISA führt, verglichen wir die Spezifität, Affinität und die Isotypen der Antikörper. Interessanterweise enthielten alle Seren mit Peptid-18-spezifischen Antikörpern auch hohe Konzentrationen an Antikörpern, die an das Hüllprotein rgp 120 banden, obwohl die Tiere mit Peptid immunisiert worden waren. Dieses Resultat legt nahe, daß die bevorzugte Konformation der kurzen synthetischen Sequenz von Peptid 18 in gewissem Grade der der entsprechenden Region in dem größeren Hüllprotein ähnelt. Obwohl drei von fünf getesteten neutralisierenden Seren von Tieren, die mit PCLUS-6-Peptid-18 immunisiert worden waren, in einem IFA-Assay virusinfizierte Zellen, die natives gp 120 exprimierten, banden, konnten wir keine Korrelation zwischen Neutralisierungstiter und IFA-Bindung finden. Darüberhinaus zeigten die neutralisierenden Seren, entgegen den Erwartungen, eine etwas geringere Avidität gegenüber rgp 120 als nichtneutralisierende Seren. Die Neutralisierung wird also eindeutig noch durch andere Faktoren als das Ausmaß und die Affinität der Bindung zur V3-Schleife von gp 120 beeinflußt.
Um dies zu ermitteln, suchten wir nach Unterschieden beim Isotyp und der Feinspezifität. Es wurden keine Isotypunterschiede gefunden. Sowohl neutralisierende als auch nichtneutralisierende Seren zeigten eine verminderte Bindung an Substitutionen in der zentralen Schleifenregion von Peptid 18 (PGRAF), obwohl die Ergebnisse nahelegten, daß die neutralisierenden Seren möglicherweise mehr auf die Spitze der Schleife fokussiert sind, und die nichtneutralisierenden Antikörper mehr auf die der zentralen Schleife benachbarte Carboxylseite, in Übereinstimmung mit den Ergebnissen von Javaherian et al. (61).
Die Ergebnisse dieser Studie sind mit früheren Ergebnissen vereinbar, bei denen ein synthetischer Impfstoff hergestellt wurde, indem eine T-Helfer-Bindungsstelle, T1- Peptidreste 421-436, mit einem längeren Peptid namens SP10, Reste 296-314 auf der V3-Schleife, gekoppelt wurde (62, 63). Mit diesem Konstrukt immunisierte Tiere entwickelten sowohl proliferative Reaktionen auf das gp 120-Hüllprotein, als auch neutralisierende Antikörper, nach einer Reihe von Immunisierungen unter Verwendung verschiedener Immunisationsprotokolle. T1 ist ein Teil von PCLUS 3, stellt jedoch keine multideterminante Region dar, und SP10 überlappt Peptid 18, jedoch fehlen acht Reste am Carboxyl-Terminus der zentralen Schleife. Obwohl die V3-Schleife nicht die einzige Bindungsstelle auf der viralen Hülle ist, die neutralisierende Antikörper aktiviert (64-67), scheint es die wichtigste zu sein, die durch eine lineare Peptidsequenz definiert werden kann und gegen die Antikörper das Virus neutralisieren können, nachdem es an seinen zellulären Rezeptor, das CD4-Molekül, gebunden hat (24, 61, 68, 69).
Als Folge der Hypervariabilität dieser Region stellt sich die Frage, wieviele Varianten dieser Sequenz in einem Impfstoff enthalten sein müssen. PCR-Studien von Viren nordamerikanischer und europäischer Isolate legen nahe, daß es eine Konsensussequenz gibt, die relativ gut konserviert ist und MN- oder SC-Isolaten am ähnlichsten ist (24). In einer weiteren unabhängigen Untersuchung von infizierten Individuen in Nordamerika und Europa wurde gezeigt, daß die Mehrzahl der Testpersonen Antikörper besitzt, die mit einer MN-ähnlichen Variante der V3-Schleife reagieren (70, 71). Von einem relativ gut konservierten Teilabschnitt der Schleife, GPGRAF, wurde gezeigt, daß es Antikörper aktiviert, die vier von sieben getesteten HIV-Isolaten neutralisieren (61). Eine Isolat-spezifische Neutralisation kommt häufig vor. Das Vorkommen von Mutanten, die der Neutralisation entgehen können, in infizierten Patienten kann sowohl auf Sequenzvariation innerhalb der V3- Schleife selbst als auch auf Sequenzvariation außerhalb der Schleife, die zu Konformationsänderungen führen, zurückzuführen sein (33, 72). Es ist wahrscheinlich, daß ein synthetischer Peptidimpfstoff multiple Konstrukte mit divergenten V3- Schleifenpeptiden enthalten muß, die neutralisierende Antikörper einer auf eine große Anzahl von übertragenden Isolaten passenden Konformationsspezifizität erzeugen.
Wir haben in der vorliegenden Untersuchung ebenfalls gezeigt, daß eine Auffrischungsimmunisation mit PCLUS 6-18, verabreicht bis zu 49 Wochen nach der Impfung, zu einer Reaktion führt, die, gemäß ELISA, 2,5-10-mal so groß ist wie die der ursprünglichen Reaktion. Bemerkenswerterweise korreliert dieser Anstieg bei den Antikörperspiegeln mit einem noch höheren Anstieg in den Neutralisierungstitern von bis zu 1 : 1.000 zu 1 : 16.000 für 90%-ige Neutralisation, und sogar noch höher für 50%-ige Neutralisation (Abb. 3 und Tabelle IV). Mit dem MN- Isolat wurde auch eine Kreuzreaktivität mit niedrigerem Titer beobachtet. Fünf Monate nach der Auffrischungsimpfung waren die durch ELISA gemessenen Antikörpertiter gegen P18 immer noch auf einem hohen Niveau.
Eine wichtige Frage war es festzustellen, ob die Immunisation mit PCLUS 3-18 oder 6-18 Antikörper aktivierte, die gegen die T-Helfer-Bindungsstellen selbst gerichtet sind. Es ist unwahrscheinlich, daß gegen die T-Helfer-Bindungsstellen gerichtete Antikörper den T-Zellen-Rezeptor davon abhalten würden, die durch die Antigen-präsentierende Zelle präsentierte Bindungsstelle zu erkennen, da es schon gezeigt worden ist, daß Antikörper, die gegen ganze Proteine gerichtet sind, die Aufnahme des Moleküls und dessen T-Zellen-Präsentation verbessern, und es ist normalerweise nicht möglich, die Präsentation von Antigenen gegenüber T- Helferzellen durch gegen ein T-Zellen-Epitop gerichtete Anti-Peptid-Antikörper zu unterbinden (73-76), obwohl Ausnahmen beschrieben wurden (77, 78). In Tieren, die mit Clusterpeptid 6-18 immunisiert wurden, haben wir nach einer einzelnen Auffrischungsimpfung 36-52 Wochen nach der Impfung keine Abschwächung der Reaktion beobachtet, obwohl wir zeigen konnten, daß einige Antikörper gegen die T-Helfer-Region dieses Konstruktes aktiviert werden. Anlaß zu Bedenken könnte möglicherweise auch die Antikörper-vermittelte Antikörper-Verstärkung der viralen Infektivität geben, die durch den Fc-Rezeptor und den Komplement-Rezeptor vermittelt wird (16, 79). Es ist gegenwärtig unklar, gegen welche Bindungsstelle(n) verstärkende Antikörper während der natürlichen Infektion aktiviert werden, obwohl von einigen gefunden wurde, daß sie an den N-terminalen Teilabschnitt von gp 41 binden (11, 79). Es konnte nicht nachgewiesen werden, daß Antikörper gegen die in PCLUS 3 enthaltene Region die Infektiosität verstärken. Das Clusterpeptid 6 befindet sich in der intracytoplasmischen gp 41 Region des Virushüllproteins, und es ist daher weniger wahrscheinlich, daß es verstärkend oder neutralisierend wirkt. Schließlich halten wir es für unwahrscheinlich, daß ein größerer Teil der neutralisierenden Aktivität gegen die Helfer-Clusterpeptide gerichtet war, aus zwei Gründen: erstens konnten wir mit ELISA keine Antikörper gegen PCLUS 3 in den neutralisierenden Seren von mit dem PCLUS 3-18-Konstrukt immunisierten Tieren nachweisen. In mit PCLUS 6-18 immunisierten Tieren wurden einige Antikörper gegen PCLUS 6 gefunden, aber da diese gegen den intracytoplasmatischen Schwanz von gp 41, von dem nicht angenommen wird, daß er dem Virion ausgesetzt ist, gerichtet sind, ist es unwahrscheinlich, daß sie Viren neutralisieren können. Zweitens würde von Antikörpern gegen PCLUS 3 oder PCLUS 6, falls sie neutralisierend sind, anzunehmen sein, daß sie den MN-Stamm von HIV-1 kreuzneutralisieren, da diese Regionen relativ gut konserviert sind, verglichen mit der P18-Region, gegen die die neutralisierenden Antikörper im allgemeinen typspezifisch sind. Die mangelnde Kreuzneutralisierung (Tabelle III) deutet deshalb darauf hin, daß die neutralisierende Aktivität primär gegen P18 und nicht gegen die Helfer- Bindungsstellen gerichtet ist. Darüberhinaus wurde gefunden, daß Antikörper gegen das T1-Peptid, welches einen bedeutenden Teilabschnitt des PCLUS 3-Peptids ausmacht, nicht mit der Neutralisierung in einer anderen Untersuchung (80) korrelieren.

BEISPIEL II: IMMUNISIERUNG VON MÄUSEN ZUR AKTIVIERUNG VON CTL GEGEN HIV-1

Da sich HIV durch Übertragung von Zelle zu Zelle ausbreiten kann, könnte die Fähigkeit, eine virusspezifische CTL-Reaktion zu bewirken, für einen synthetischen Peptidimpfstoff wichtig sein, um eine wirksame immuntherapeutische Modalität darzustellen.
Zusätzlich zu einem Th-Epitop und PND enthalten die in Beispiel 1 beschriebenen Peptide ein CTL-Epitop. Die Peptide wurden deshalb auch auf Induktion von CTL- Aktivität in Mäusen untersucht.
Wir gehen diese Frage hier mit einer einzelnen Immunisierung unter Verwendung eines Saponin-Adjuvans, QS21 (103), an, das keine Emulsion benötigt, und es war uns so möglich, die Anforderung für eine kovalente Bindung zwischen Helfer und CTL-Epitop unter eingeschränkten Bedingungen zu untersuchen. Wir sprachen auch die MBC-Bindung von Helfer-Aktivität an, indem wir kongene Mäusestämme verwendeten, die sich im Klasse-II-MHC unterschieden, jedoch die H-2Dd-Klasse-I- Moleküle, die die CTL-Determinante präsentieren, gemein haben.
Wir haben bereits die Konstruktion eines synthetischen Peptides beschrieben, das die immunodominanten Th-Peptide einschließt, die sich über die multideterminanten Regionen (54) des HIV-Hüllproteins gp160 (42) erstrecken. Diese sogenannten Clusterpeptide, die jeweils aus einem Cluster sich überlappender Determinanten bestehen, induzieren in vitro T-Zellen-Proliferation und Cytokinproduktion in Mäusen bzw. Menschen multipler MHC-Typen (42). In der vorliegenden Untersuchung kommen drei Clusterpeptide zum Einsatz: PCLUS3 (Reste 421-444, KQIINMWQEVGKAMYAPPISGQIR, SEQ. I. D. NR. 24) PCLUS4 (Reste 476- 499, RDNWRSELYKYKVVKIEPLGVAPT, SEQ. LD. NR. 25) und PCLUS 6 (Reste 821-853, AVAEGTDRVIEVVQGAYRAIRIPRRIRQGLER, SEQ. I. D, NR. 26), bei denen die HIV-1-IIIB-Numerierung gemäß der Los Alamos database (43) erfolgte (7 weniger als die in früheren Publikationen (42) verwendete Numerierung von Ratner et al. (44)).
Um einen in multiplen MHC-Typen immunogenen Peptidimpfstoff zu entwickeln, und um die CTL-Sensibilisierungsmechanismen in vivo zu untersuchen, synthetisierten wir jedes der Clusterpeptide kolinear an den N-Terminus der immunodominanten CTL-Determinante, P18 (45) (Reste 308-322, RIQRGPGRAFVTIGK, SEQ. I. D. NR. 7), von der schon festgestellt wurde, daß sie sowohl von murine- CD8&spplus;-CTL von vier unterschiedlichen MHC-Typen erkannt wird (104), als auch von menschlichen T-Zellen HIV-infizierter Patienten, die ein breites Spektrum an HLA-Typen repräsentieren (46). Das P18-Peptid entspricht Teilen der gp160 V3- Schleife und der principal neutralizing determinant (PND) Region von gp160 (21- 23), und es wird auch von einem Klasse-II-MHC-Molekül (I-Ad) den T-Helferzellen in Mäusen eines entsprechenden MHC-Typs präsentiert (105).
Die Clusterpeptid-Peptid-18-Konstrukte wurden in einem automatischen Peptidsynthesizer (Model. 430A; Applied Biosystems, Foster City, CA) unter Verwendung von t-boc-Chemie (51) synthetisiert. Die Peptide wurden mit Hilfe von HF vom Harz abgespalten und zunächst durch Ausschlußchromatographie gereinigt. Reinigung zu einzelnen Peaks geschah durch reverse-phase HPLC auf ubondapack reverse-phase C18-Säulen (Waters Associates, Milford, MA). 8-20 Wochen alte Mäuse wurden subkutan am Schwanzansatz immunisiert, unter Verwendung von 20 nMol jedes Peptides gemischt mit QS21 (15 ug), der hochaufgereinigten Saponinfraktion des Seifenbaums Quillaja saponaria, die noch eine sehr große Adjuvansaktivität aufweist, aber nicht toxisch ist (103). Zwei Wochen nach einer einzelnen Immunisation wurden immune Milzzellen von B 10. D2- (H-2d) (Abb. 7A), B10.A(5R)- (H-2i5) (Abb. 7B), oder B10.S(9R)- (H-2i4) (Abb. 7C) Mäusen (5·10&sup6;/ml in Kulturplatten mit 24 Vertiefungen in komplettem T- Zellen-Medium (1 : 1 Mischung von RPMI 1640 und EHAA-Medium mit 10% fötalem Kälberserum, 2 mM L-Glutamin, 100 U/ml Penicillin, 100 ug/ml Streptomycin und 5·10&supmin;&sup5;M 2-ME)) sechs Tage lang in vitro mit 0,1 uM P18 und 10% Con A- Überstand-enthaltendem Medium (Rat T stim; Collaborative Research, Inc., Bedford, MA) re- stimuliert. Die cytolytische Aktivität von in vitro sekundären CTL wurde wie zuvor beschrieben (104) in einem 6-Stunden-Assay mit &sup5;¹Cr-markierten Targets gemessen: Als Target-Fibroblasten wurden BALB/c.3T3-Transfektanden (H-2d, Klasse-I-MHC&spplus;, Klasse-II-MHC) verwendet, die das gesamte gp160-Protein endogen exprimieren (Zellinie 15-12 (Lit. (45))). Mit BALB/c 3T3-Kontrollzellen, die nur mit dem Neomycinresistenzgen (18neo-Zellen) transfektiert wurden, das mit 1 uM P18 gepulst wurde, wurden ähnliche Ergebnisse erzielt (Resultate nicht gezeigt). Als Kontrolle sowohl für die gp160-Transfektanden als auch die Peptidgepulsten 18neo-Zellen war die Hintergrundlyse unter Verwendung von nichtgepulsten 18neo-Targetzellen in Abwesenheit von spezifischem Peptid weniger als 8%. Die Effektoren wurden mit den Peptidgepulsten Targets bei den angegebenen E:T- Verhältnissen kokultiviert. Der Anteil der spezifischen &sup5;¹Cr-Freisetzung in Prozent wurde berechnet als 100 X ((experimentelle Freisetzung - spontane Freiset zung)/(maximale Freisetzung - spontane Freisetzung)). Die maximale Freisetzung wurde aus Zellüberständen bestimmt, die durch Zugabe von 5% Triton X-100 lysiert wurden. Die spontane Freisetzung wurde mittels Targetzellen bestimmt, die ohne zugesetzte Effektorzellen inkubiert wurden. Jede Bestimmung wurde dreimal ausgeführt, mit 5000 Targetzellen pro Vertiefung.
So wurden Mäuse dreier Haplotypen, B10.D2 (H-2d; AdEd), B10.A(5R) (H-2i5; AbEb/k), und B10.S(9R)(H-2i4; AsEs/d), die sich in Klasse-II-Molekülen unterschieden aber die Klasse-I-Dd-Moleküle gemein hatten, einmal subkutan am Schwanzansatz mit gereinigtem Saponin (QS21) immunisiert, das die zusammengesetzten Peptide PCLUS3-18, PCLUS4-18 oder PCLUS6-18, oder P18 alleine, enthielt. Nachdem ihre immunen Milzzellen in vitro mit P18 in Gegenwart von IL2 restimuliert worden waren, erhielten wir CTL, die transfektierte BALB/c 3T3- Fibroblastentargets, welche endogen das gesamte gp160-Protein exprimieren (bezeichnet als 15-12; Lit. (45)), abtöten konnten (Abb. 7), nicht jedoch BALB/c 3T3- Kontrollfibroblastentargets (bezeichnet als 1 Bneo, nur mit dem Neomycinresistenzgen transfektiert). Sie konnten auch gp160-negative 18neo-Zellen, die mit Peptid P18 gepulst waren, abtöten (siehe Abb. 8), ein Beweis dafür, daß die Abtötung für den P18-Abschnitt spezifisch war. Die in vivo mit den zusammengesetzten Peptiden sensibilisierten Mäuse wiesen sowohl starke CTL-Aktivität gegen 15-12 als auch gegen P18-gepulste Targets bei Effektor/Target-(E:T)Verhältnissen von nur 7 : 1 auf, und erreicheten Niveaus von 45-75% spezifischer Lyse bei E:T-Verhältnissen von 60 : 1 (Abb. 7A, B, C). Im Gegensatz dazu zeigten nur mit P18 immunisierte Mäuse eine nur marginale CTL-Aktivität, auch bei maximalen E:T-Verhältnissen von 60 : 1. Die Verschiebung der Kurven des E:T-Verhältnisses beim Abtöten von 15-12-Targets deutet auf eine 10-fach größere Anzahl von CTL-lysierenden Einheiten in mit dem zusammengesetzten Peptid sensibilisierten Mäusen hin, verglichen mit Mäusen, die in vivo nur mit P18 sensibilisiert wurden. Nichtimmunisierte Mäuse oder Mäuse, die nur mit Adjuvans oder Peptid immunisiert wurden, erzeugten gleichfalls keine CTL. Auch Clusterpeptide ohne die P18-Komponente sensibilisierten keine spezifischen CTL. Die stark reduzierte oder abwesende CD8&spplus; CTL- Reaktion auf P18 in mit nur mit QS21 gemischtem P18 immunisierten Mäusen könnte bedeuten, daß die in vivo-Sensibilisierung von P18-spezifischen CTL CD4 Klasse-II-eingeschränkte Hilfe erfordert, und daß diese Hilfe durch die Immunisierung mit den zusammengesetzten Peptiden, die die Cluster-Th-Determinanten enthalten, gewährt wird.
Um herauszufinden, ob die kovalente Bindung der Helfer-Determinante an die CTL-Determinante zur in vivo Sensibilisierung von Mäusen für eine CTL-Reaktion erforderlich ist, oder ob eine Mischung von nichtkovalent verbundenen Peptiden ausreichend ist, immunisierten wir B10.D2- oder B10.A(5R)-Mäuse mit den zusammengesetzten Peptiden PCLUS3-18 bzw. PCLUS4-18, oder mit Mischungen der freien Peptide PCLUS3 oder PCLUS4 und P18, oder mit P18 alleine in QS21- Adjuvans (Abb. 8A-8D). Die Mäuse wurden mit PCLUS3-18 bzw. PCLUS4-18 immunisiert, oder mit Mischungen von PCLUS3 oder PCLUS4 und P18, oder nur mit P18, in QS21-Adjuvans. Milzzellen immunisierter Mäuse wurden 6 Tage lang mit 0,1 uM P18 und rIL2 (10 Einheiten/ml, Genzyme, Cambridge, MA) restimuliert. Die Effektoren wurden mit der gp160-transfektierten Linie 15-12 (Abb. 8A, 8B) oder mit nur neo-transfektierten 3T3-Fibroblasten (18neo), die mit P18 gepulst worden waren (1 uM, über Nacht), getestet (Abb. 8C, 8D). Die Hintergrundlyse auf 18neo-Kontrollfibroblasten in Abwesenheit von Peptid betrug weniger als 8%. Die Standardabweichung des Mittelwertes von drei Versuchen betrug weniger als 7,2% des Mittelwertes.
So wurden in vivo mit den Peptiden der vorliegenden Erfindung immunisierte Milzzellen mit P18 und IL-2 restimuliert, was eventuelle fehlende T-Zellen-Hilfe in vitro kompensiert (weil in der Kultur keine Th-Zellen vorhanden sind). Die cytolytische Aktivität wurde sowohl für die transfektierten 15-12-Fibroblastenzellinie, die endogen gp160 exprimiert, als auch für die mit P18 gepulsten oder nicht Peptidgepulsten 18neo-Kontrollfibroblasten bestimmt. In Abwesenheit von Peptid wurde bei den Kontrolltargets keine Lyse beobachtet. Überraschenderweise war die CD8&spplus; CTL-Aktivität von immunen Milzzellen von mit der Mischung oder nur mit P18 immunisierten Mäusen vernachlässigbar, während die Immunisierung mit dem zusammengesetzten Peptid eine starke CTL-Reaktion in beiden Stämmen bewirkte (Abb. 8A-8D). Die Lyse von nur mit P18 gepulsten Targets, zusammen mit der mangelnden CTL-Aktivität gegen mit PCLUS3 und PCLUS4 gepulsten Targets, deutet darauf hin, daß eine Verbindung zur Induktion von CTL-Aktivität speziell gegen die P18-Determinante erforderlich ist, und daß sie daher nicht auf irgendeiner anderen Aktivität beruht, die durch das zusammengesetzte Peptid induziert worden sein könnte und bei den gp160-exprimierenden Targets gemessen wird. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, daß eine kovalente Verbindung der Clusterpeptide als Helfer-Bindungsstellen zu der CTL-Bindungsstelle in den zusammengesetzten Peptiden PCLUS3-18 und PCLUS4-18 zur Sensibilisierung von CTL in vivo erforderlich war. Dieses Ergebnis konnte in drei unabhängigen Experimenten übereinstimmend reproduziert werden.
Da eine Immunisierung mit dem zusammengesetzten Peptid CD4&spplus; CTL sensibilisieren könnte, bestimmten wir den Phenotyp der durch die Peptide spezifisch sensibilisierten CTL. B 10.D2- und B 10.A(5R)-Mäuse wurden mit 20 nmol der zusammengesetzten Peptide in 15 ug QS21 immunisiert und mit 0,1 um P18 plus rIL-2 restimuliert. Diese Mäuse-CTL wurden entweder mit Anti-CD8 monoklonalen Antikörpern (3.155; Ratten IgM) (114) plus Komplement (ausgefüllter Balken) oder Anti-CD4 monoklonalen Antikörpern (RL.174; Ratten IgM) (113) plus Komplement (unausgefüllter Balken), oder nur mit Komplement (nicht gezeigt) wie zuvor beschrieben (28) behandelt und mit P18-gepulsten 18neo als Targets getestet. Die Ergebnisse sind in Abb. 9A gezeigt.
Wie in Abb. 9A gezeigt, waren die CTL konventionelle CD8&spplus;CD4&supmin; CTL. Da die Targets nur Klasse-I, aber nicht Klasse-II, MHC-Moleküle exprimieren, müssen die CTL durch Klasse-I-MHC-Moleküle eingeschränkt sein. Mit Hilfe von L-Zellen, die mit jedem der H-2d-Klasse-I-Moleküle transfektiert waren, wurde die Restriktion dem Dd-Molekül zugeordnet.
Im Gegensatz dazu waren die durch die PCLUS-18-Konstrukte induzierten Helferzellen CD4&spplus;; zumindest wurde dies bei der in vitro Stimulation von immunen Milzzellen gemessen. So wurden zum Beispiel B10.A(5R)-Mäuse mit 20 nmol PCLUS4-18 immunisiert, und ihre Milzzellen wurden mit oder ohne Anti-CD4 (RL 174, Literaturstelle 113) plus Komplement behandelt, und sie wurden dann 6 Tage lang mit PCLUS4-18 oder nur mit P18 in Gegenwart oder Abwesenheit von rekombinantem IL-2 (rIL-2, 10 E/ml) restimuliert. Die erhaltenen Effektorzellen wurden auf gp160-exprimierenden 15-12 BALB/c-Fibroblastenzellinien oder auf nur neo-transfektierten Fibroblastenzellen (nicht gezeigt) als Targets getestet (Abb. 9B). Bei den nur neo-transfektierten Kontrolltargets wurde keine Lyse beobachtet (weniger als 4,2%). Die Standardabweichung des Mittelwertes von drei Versuchen betrug weniger als 7,3% des Mittelwertes. Als Kontrolle induzierte PCLUS4 alleine (nicht mit P18 verbunden) in Gegenwart von IL-2 keinerlei CTL-Aktivität. PCLUS4-18, nicht jedoch P18 alleine, stimulierte die Induktion von CTL-Aktivität in Abwesenheit von rIL-2, die dann Hilfe ersetzte (Abb. 9B). Dieses Ergebnis legt nahe, daß das PCLUS4-18-Peptid T-Zellen-Hilfe in der restimulierten Kultur herbeiflährte, und somit exogenes IL-2 nicht erforderlich war. In Abwesenheit von IL- 2, nicht jedoch in der Gegenwart von IL-2, verhinderte die Eliminierung von CD4&spplus;- Zellen die Induktion von CTL-Aktivität (Abb. 9B). Daher waren die Helferzellen, die in gegenüber PCLUS4-18 immunen Zellkulturen, welche mit PCLUS4-18 re stimuliert worden waren, induziert wurden, CD4-positiv. Die Induktion von CTL- Aktivität in den Kulturen von mit Anti-CD4 behandelten Zellen in Gegenwart von rIL-2 zeigt an, daß die Behandlung mit Antikörpern und Komplement die CTL-Vorstufen selbst nicht beeinflußte. Die CTL-Vorstufen, wie auch die CTL- Effektorzellen (Abb. 9), waren daher CD4-negativ.
Wir haben damit gezeigt, daß die Induktion von CTL einer Helfer-CTL- determinanten Verbindung in vivo bedarf, was niemals zuvor für CTL gezeigt wurde, im Gegensatz zur Th-B-Zellen-Kooperation, bei der seit vielen Jahren breite Übereinstimmung darin besteht, daß in vivo Cognat-Unterstützung erforderlich ist. Dieses Resultat scheint zwei jüngeren Studien mit Mischungen von Helfer- und CTL-antigenen Peptiden zu widersprechen, bei denen eine kovalente Verbindung nicht obligatorisch war (90, 102). Wir können diese Ergebnisse miteinander vereinbaren, indem wir nahelegen, daß in der ersten Studie (90) die Peptide durch Kosequestrieren in einer Adjuvansemulsion physisch in Ölmikrotröpfchen beieinander blieben, und daß in der zweiten Studie (102) multiple hohe Peptiddosen verwendet wurden, die fähig waren, die der nichtverbundenen Mischung eigenen Nachteile zu umgehen. Diese Erklärung läßt sich mit dem Erfordernis für Nähe oder Präsentation auf der gleichen präsentierenden Zelle vereinbaren, das auch durch die Bedingung gezeigt wird, daß Helfer und CTL-Determinanten auf demselben Hauttransplantat vorhanden sein müssen, um eine Abstoßungsreaktion in vivo zu induzieren (89). Diese Erklärung läßt sich auch mit unseren in vitro Befunden vereinbaren, daß in der Beengtheit einer Kulturvertiefung eine Mischung von Clusterpeptid und P18 genügt, um fast so wirkungsvoll wie das kovalente Konstrukt eine CTL-Reaktion ohne zugesetztes IL-2 zu bewirken. Die niedrigere Dosis ohne Adjuvansemulsion kann einer natürlichen Infektion mehr ähneln. Da das Peptid, welches die stärkste CTL-Reaktion induziert, von Stamm zu Stamm verschieden ist (Abb. 7A-7C), kann die Verstärkung der CTL-Reaktion durch das zusammengesetzte Peptid nicht einfach auf die Wirkung der Helfer-Bindungsstelle auf die Resistenz oder Suszeptibilität des Peptids gegen enzymatischen Abbau in vivo zurückgeführt werden. Die reproduzierbaren Unterschiede im Ansprechen auf verschiedene Peptidkonstrukte bei kongenen rekombinanten Mäusestämmen, die im Klasse 11-Molekul differieren, aber das gleiche H-2D4-Klasse-I-Molekül teilen, implizieren sogar, daß die T- Helferzellen Klasse-II-MHC-eingeschränkt sind und daß die Clusterpeptide nicht durch alle Klasse-II-Moleküle gleichermaßen präsentiert werden. Nichtsdestrotrotz erlaubt die Verwendung der Cluster-Peptide eine wesentlich breitere Helfer- Erkennung bei Mäusen verschiedener MHC-Typen als durch einzelne Helferdeterminanten bewirkt werden würde (42).
Der Mechanismus der CTL-Induktion in vivo durch zusammengesetzte Peptide sieht wahrscheinlich so aus, daß die längeren Peptide durch spezialisierte Klasse-II- exprimierende antigenpräsentierende Zellen (APC), von denen vermutet wird, daß sie eine Rolle bei der CTL-Induktion spielen (100, 106, 107), aufgenommen werden, wahrscheinlich an der Injektionsstelle oder in ableitenden Lymphknoten, vor dem Abbau der Peptide durch Protease im Serum oder in extrazellulärer Flüssigkeit, so daß die gleiche Zelle sowohl CTL- als auch Th-Epitope durch Klasse-I- bzw. Klasse-II-MHCs präsentieren kann. Diese Präsentation mag effektiver sein als andere, bei denen die zwei Epitope unabhängig von verschiedenen APC präsentiert werden. Die größere Effizienz der Präsentation durch die gleichen APC kann darauf zurückzuführen sein, daß es die T-Helferzelle und die CTL-Vorstufe zusammenführt zu einer effektiveren Übertragung kleiner Mengen labiler Lymphokine, oder, wie von Gill und Lafferty (108) vorgeschlagen, daß die APC durch die Helferzelle aktiviert werden und dann ihrerseits das Antigen dem CTL effektiver präsentieren können. Im ersten Fall müßten die Präsentationen den beiden Zellen gegenüber zeitlich nahe beieinander liegen, während sie in dem letzteren Fall zu verschiedenen Zeitpunkten erfolgen könnten. In jedem Fall würde die gleiche APC effizienter sein als zwei getrennte APC, und deshalb würden die verbundenen Determinanten effektiver sein als die, die voneinander wegdiffundieren könnten, nachdem sie einmal in vivo injiziert worden sind. Dies stimmt mit der jüngeren Beobachtung überein, daß spezialisierte APC, die Klasse-II-MHC exprimieren, gleichzeitig extrazelluläre Antigene, sowohl durch Klasse-I- als auch durch Klasse-II-MHC-Routen, CTL bzw. Th gegenüber präsentieren (107), und mit den Hauttransplantationsexperimenten, die schon zitiert wurden (89). QS21 mag dazu in der Lage sein, Zellmembranen zu durchdringen und Antigen ins Cytoplasma zu schleusen, von wo aus es dann den MHC-Klasse-I-Präsentationspfad betreten kann (103). Welcher der oben genannten Mechanismen auch immer zutrifft, die Stimulierung beider Zellen durch die gleiche APC sollte die Überbringung von Hilfe erleichtern.
Das Fortschreiten einer HIV-I-Infektion zu AIDS scheint mit einer Verschiebung von einem Th1- zu einem TH2-Übergewicht in der HIV-1-spezifischen Cytokinreaktion zu korrelieren (109, 110). In einer früheren Untersuchung aus unserem Labor schien eine reduzierte CTL-Reaktion auf P18 aufgrund gleichzeitiger Schistosomeninfektion mit einer Verschiebung von IL2-produzierendem Th1 zu einem Überwiegen von Th2 zu korrelieren (111). Es wird angenommen, daß Th1-Zellen die CD4&spplus;-Klasse-II-eingeschränkte Hilfe für die CTL-Sensibilisierung stellen, während Th2-Zellen Cytokine absondern könnten, die die Erzeugung von CTL hem men. Daher sollte eine Immunisierung von HIV-1-Trägern für die Immuntherapie am wirkungsvollsten sein, wenn sie sowohl Th1 CD4&spplus;-Zellen und CTL verstärkt, wie es durch diese zusammengesetzten Konstrukte beabsichtigt ist.
Hilfe für eine Induktion von P18-spezifischen neutralisierenden Antikörpern wurde auch nach einer einzelnen Immunisierung in Mäusen vierer verschiedener Haplotypen mit diesen zusammengesetzten, Clusterpeptid-enthaltenden Konstrukten beobachtet (Beispiel I). Obwohl die hier vorgestellten Immunisierungsexperimente in Versuchstieren durchgeführt werden mußten, legt die Tatsache, daß die gleichen Epitopen auch durch menschliche T-Helferzellen und CTLs mit mehr als einem Histokompatibilitätskomplex (HLA) Klasse-II- oder Klasse-I-Molekül erkannt werden (42, 46), nahe, daß die gleiche Methode auch für die Immunisierung von Menschen angewendet werden kann. Cluster 3 und 4 enthalten Sequenzen, die bei nordamerikanischen und europäischen HIV-1-Isolaten relativ konserviert sind, und Cluster 6 überspannt die Grenze zwischen konservierten und variablen Sequenzen (43).
Unsere vorliegenden Ergebnisse unter Verwendung von rekombinanten Mäusen, die sich in den Klasse-II-MHC-Molekülen unterscheiden, legen nahe, daß Th-Determinanten kovalent mit der CTL-Determinante in einem einzigen Peptid verbunden sein müssen, um die T-T Kollaboration und die CD4&spplus;-Klasse-II-eingeschränkte Hilfe zum Sensibilisieren der CTL-Reaktion in vivo zu erleichtern. Diese Clusterpeptid-P18-Konstrukte, von denen schon gezeigt wurde, daß sie hohe Titer an HIV-neutralisierenden Antikörpern bewirken (Beispiel I, oben) sind außerdem nützliche Immunkonstrukte zum Aktivieren sowohl von CTL als auch von neutralisierenden Antikörpern gegen HIV in Individuen mit multiplen MHC-Typen.

BEISPIEL III: BREITE IMMUNANTWORT, BEWIRKT DURCH EIN MIT DEM P18-PEPTID DER HIV-1-VARIANTE MN VERBUNDENEN CLUSTERPEPTID

Die Hypervariabilität der V3-Schleife des HIV-1 Virus hat zu Bedenken geführt, daß gegen bestimmte Aminosäuresequenzen in dieser Region gerichtete Impfstoffe keinen Schutz gegen das breite Repertoire von Stämmen bieten könnten, dem Individuen ausgesetzt sein können. Ein Ansatz zur Überwindung des Problems der Stammvariation besteht darin, ein Individuum mit einem Präparat zu immunisieren, welches eine Mischung verschiedener Peptide enthält, von denen jedes gegen einen anderen Stamm des Zielpathogens gerichtet ist. Um die Wirksamkeit der Peptide der vorliegenden Erfindung gegen andere HIV-I-Stämme abzuschätzen, stellten wir eine Reihe von mit dem von der V3-Schleife des MN-Stammes von HIV-I abgeleiteten P18-Peptid verbundenen Cluster-Peptiden her.
Die Peptide wurden wie in den Allgemeinen Methoden oben beschrieben dargestellt. Die Sequenzen der PCLUS-18MN-Peptide sind in Tabelle VI wiedergegeben (SEQ. I. D. NR. 27-33).

Tabelle VI

PCLUS-18MN-PEPTIDE@

PCLUS1-18MN

EQMHEDIISLWDQSLKPCVKRIHIGPGRAFYTTKN

PCLUS3-18MIN

KQIINMWQEVGKAMYAPPISGQIRRIHIGPGRAFYTTKN

PCLUS4-18MN

RDNWRSELYKYKVVKIEPLGVAPTRIHIGPGRAFYTTKN

PCLUS6-18MN

AVAEGTDRVIEVVQGAYRAIRHIPRRIRQGLERRIHIGPGRAFYTTKN

PCLUS6.1-18MN

DRVIEVVQGAYRAIPiIPRRIRQGLERRIHIGPGR3JYTTKN

P53-18MN

DRVIEWQGAYRAIRRIHIGPGRAFYTTKN

P55-18MN

AQGAYRAIRHIPRRIRRIHIGPGRAFYTTKN
@ PISMN-Teilabschnitt = RIHIGPGRAFYTTKN, der PCLUS-Teilabschnitt ist wie in Tabelle I beschrieben
Vier Mäusestämme, die vier verschiedene Haplotypen repräsentieren (siehe Beispiel I, Tabelle II), wurden intraperitoneal wie in Beispiel I beschrieben mit 20 Nanomol P18MN-, PCLUS 3-18MN- oder PCLUS6-18MN-Peptid emulgiert in komplettem Freudschem Adjuvans (CFA) immunisiert. Sieben bis acht Wochen später wurden die Mäuse mit einer zweiten Immunisierung aufgefrischt, wiederum mit 20 nmol I. P., und die AbN-Titer gegen den HIV-1-Stamm MN wurden bestimmt. Die Ergebnisse dieses Experimentes sind in Abb. 10 gezeigt.
In einem ähnlichen Experiment zum Vergleich der Peptide PCLUS6-18MN und PCLUS6.1-18MN wurden Mäuse wie oben beschrieben immunisiert, jedoch unter Verwendung der genannten Peptide. Die Ergebnisse dieses Experiments sind in Abb. 11A-11H wiedergegeben.
Aus diesen zwei Experimenten wurde geschlossen, daß PCLUS3-18MN, PCLUS6- 18MN und PCLUS6.1-18MN AbN-Spiegel induzieren, die in allen getesteten Mäusestämmen einen Titer von mehr als 1 : 64 aufweisen, mit der Ausnahme, daß PCLUS3-18MN keine Immunantwort in BALB/c-Mäusen bewirkt. Der H-2d- Haplotyp spricht also nicht auf das PCLUS3-18MN-Peptid an.
Die CTL-Reaktion auf das PCLUS-18MN-Peptid wurde mit P18MN- und PCLUS3-18MN-Peptiden untersucht. Die Primärimmunisierung von Gruppen von BALB/c-Mäusen wurde mit 20 nmol des Peptides durchgeführt, die 1 : 1 mit einem der folgenden Adjuvansien emulgiert wurden: Alum, inkomplettes Freudsches Adjuvans (IFA), QS21 (oben beschrieben), DOTAP (Boehringer Mannheim Biochimica. Kat. Nr. 1202 375; DOTAP ist ein Lipofektionsreagens zum Einschleusen von Makromolekülen in Zellen durch die Plasmamembran.) und C259/763 (C259/763 ist eine gesetzlich geschützte Verbindung, die von Dr. Fredrick Durr, Lederle Laboratories, zur Verfügung gestellt wurde).
Nach zwei bis drei Wochen wurde den Mäusen eine Auffrischungsimpfung von 10 nmol Peptid verabreicht, und nach weiteren zwei bis drei Wochen wurde zwei Mäusen pro Gruppe die Milz entfernt, die dann in vitro stimuliert wurde, wie oben in Beispiel II beschrieben. Sechs Tage später wurden die Zellen geerntet und in einem konventionellen cytotoxischen-T-Zellen-Assay untersucht, wiederum wie in Beispiel II beschrieben. Die Ergebnisse sind in Abb. 12A-12B gezeigt.
Um zu bestimmen, ob das PCLUS6-18MN-Peptid dazu in der Lage ist, eine CTL- Reaktion zu bewirken, wurde ein weiteres Experiment durchgeführt. Immunisierungen ähnlich denen, die oben verwendet wurden, um CTL gegen PCLUS3-18MN zu aktivieren, wurden verwandt, wobei in diesem zweiten Fall die Reaktionen auf P18MN und PCLUS6-18MN und PCLUS6.1-18MN verglichen wurden. Die Auffrischungsimmunisation wurde jedoch unter Verwendung von 20 nmol Peptid durchgeführt, und die Milzzellen wurden nach in vitro-Stimulation mit Peptid P18 und IL-2, das letztere, um nichtspezifische Hilfe zur Verfügung zu stellen, auf ihren CTL Gehalt untersucht. Die Ergebnisse dieses Experiments sind in Abb. 13A-13B gezeigt.
Wie aus den CTL-Experimenten klar hervorgeht, bewirken die PCLUS-18MN- Peptide eine stärkere CTL-Reaktion als das P18MN-Peptid. Die CTL-Reaktion wird in Mäusen mit einem breiten Spektrum verschiedener MHC-Haplotypen hervorgerufen. Darüberhinaus kann die bessere Wirksamkeit der PCLUS-18MN- Peptide beim Hervorrufen einer CTL-Reaktion in einer Vielzahl von Adjuvansien gezeigt werden.
Obwohl die Hypervariabilität der V3-Schleife zu Bedenken in bezug auf die Entwicklung von Impfstoffen führte, die auf die Aktivierung von neutralisierenden Antikörpern und für diese Region spezifischen CTL führte, ist es anspornend, daß die gleichen Konstrukte mit der P18-Region des HIV-1 MN-Isolates, welches repräsentativ für die meisten vorherrschenden Stämme in Europa und Nordamerika ist (24, 71), auch in vivo eine Sensibilisierung für einen CTL-Reaktion bewirken und zu einer Reaktion von neutralisierenden Antikörpern gegen die MN-Variante führen. Vor kurzem haben wir darüberhinaus gefunden, daß CTL-Populationen mit breiten Spezifitäten in Hinsicht auf den Virusstamm erzeugt werden können, wenn IIIB-gp160-sensibilisierte Milzzellen der Maus mit MN-artigem Peptid mit einer aliphatischen Substitution in einer Position restimuliert werden (112).
Wie in den Beispielen oben gezeigt, sollten die Peptide der vorliegenden Erfindung, die eine effiziente verbundene Hilfe zur Induktion sowohl von neutralisierenden Antikörpern als auch von CTL in Wirten, die ein breites Spektrum an MHC- Haplotypen präsentieren, bereitstellen, als Impfstoffkandidaten für die Prävention oder Immuntherapie von AaS in Frage kommen. Der hier vorgestellte Ansatz, das heißt die kovalente Anbindung von Epitopen, bestehend aus Th-Epitopen, CTL- Epitopen und PND, für neutralisierende Antikörper zu einem einzigen immunogenen Polypeptid, das dazu in der Lage ist, alle diese Immunantworten in einer Viel zahl von Wirten mit einem breiten Spektrum von MHC-Typen hervorzurufen, kann auch auf andere Pathogene angewandt werden.
Insbesondere ist zu erwarten, daß dieser Ansatz auf die Entwicklung von Impfstoffen gegen andere virale Pathogene übertragen werden kann, wie zum Beispiel, jedoch nicht beschränkt auf, das Cytomegalovirus, Hepatitisviren, HTLV-I, das Tollwutvirus, usw. Darüberhinaus können unter Verwendung des Ansatzes der vorliegenden Erfindung auch Impfstoffe gegen Viren mit nichthumanen Wirten, wie z. B. das Katzenleukämievirus, das Katzenimmunschwächevirus, usw., produziert werden.

BEISPIEL IV: ERZEUGEN EINER BREITEN IMMUNANTWORT GEGEN DAS MALARIA CIRCUMSPOROZOIT-ANTIGEN

In dem U. S. Patent 5,028,425 wird die Herstellung eines gegen das Circumsporozoit-(CS) Protein von Plasmodium falciparum gerichteten synthetischen Impfstoffes beschrieben. Dieser Impfstoff besteht aus einem Peptidimmunogen, welches ein CTL-Epitop des CS-Antigens enthält. In dem U. S. Patent 4,886,782 wird ein zweiter gegen das CS-Protein gerichteter synthetischer Impfstoff beschrieben, welcher aus einem Th-Epitop besteht, das mit einem AbN-Epitop verbunden ist. Auf alle diese Patente wird hiermit in ihrer Gesamtheit ausdrücklich Bezug genommen.
Um einen Peptidimpfstoff herzustellen, der von einem breiten Spektrum von MHC- Typen erkannt wird und der eine Th-Reaktion, eine CTL-Reaktion und eine hochtitrige AbN-Reaktion bewirkt, wird ein Peptid mit der Sequenz
PSDKKIEQYLKKIKNSISCHP (NANP)&sub5;NAKPKDELDYENDIEKKICKMEKCS
(SEQ. I. D. NR. 35) wie oben beschrieben synthetisiert. Das Peptid wird wie in Beispiel 11 beschrieben Mäusen mit verschiedenen MHC-Haplotypen (Stämme B 10. D2, B 10A(5R) und B 10.S(9R)) verabreicht. Die AbN- und CTL-Reaktion wird wie in Beispielen I bzw. II beschrieben ausgewertet.

BEISPIEL V: KLINISCHE VERSUCHE MIT MENSCHLICHEN PROBANDEN

Die Peptide der vorliegenden Erfindung können menschlichen Probanden entweder als prophylaktischer oder als therapeutischer Impfstoff verabreicht werden. Zunächst werden klinische Versuche zum Abschätzen der Sicherheitsrisiken und der maximal verträglichen Dosis mit menschlichen Probanden, die bereits HIV infiziert sind, durchgeführt. Daher wird in diesem Beispiel ein Experiment beschrieben, das vorläufige Belege dafür bietet, daß die Impfstofformulierung auf therapeutische Weise wirksam ist.
Die Peptide der vorliegenden Erfindung können mit vom Stand der Technik wohlbekannten Materialien und Methoden als pharmazeutische Zubereitungen formuliert werden. So können die Peptide zum Beispiel mit beliebigen sterilen, pharmazeutisch unbedenklichen Trägerlösungen, z. B. Kochsalzlösung, gemischt werden und in Spritzenfläschchen zum Zweck der Herstellung einer injizierbaren Zusammensetzung verpackt werden.
Die Dosierung des verabreichten Peptids kann ebenfalls durch vom Stand der pharmazeutischen Technik bekannte Methoden bestimmt werden. Die tatsächlich verabreichte Dosierung wird abhängig von verschiedenen pharmakokinetischen Eigenschaften des Peptides, einschließlich Halbwertszeit, Aufnahme durch verschiedene Gewebe, Verabreichungsweg, usw., variieren. Peptidarzneimittel werden typischerweise in Mengen von 0,1 bis 50 ug/kg Körpergewicht des Probanden verabreicht.
In dem hier beschriebenen klinischen Versuch bestand die Gruppe der Testpersonen aus HIV infizierten Patienten, Alter 18-75, mit CD4&spplus;-Zahlen von > 600 Zellen/ml. Es wird darauf geachtet, daß die an dem Versuch teilnehmenden Patienten eine intakte T-Zellen-Immunfunktion aufweisen können, gemessen als Reaktion auf ein ins Gedächtnis zurückgerufenes Antigen, zum Beispiel das Grippevirus, wie in Literaturstelle 57 beschrieben, in einem IL-2-Produktionsassay. Während der ersten vier Monate des Versuchs sollten die Patienten keiner Antiretrovirus-Therapie unterzogen werden. Falls, beginnend 3 Monate nach der Versuchsteilnahme, die CD4&spplus;-Zahl unter 500 Zellen/ml fällt und dort für einen Monat bleibt, wird dem Patienten die normale Antiretrovirus-Therapie angeboten.
Die Peptide PCLUS3-18 und PCLUS6.1-18 werden den Patienten subkutan in Montanide ISA-51-Adjuvans verabreicht, in einer Formulierung, die unter GMP-Standards durch Seppic, Inc. (Fairfield, NJ) hergestellt wurde. Der Impfstoff wird an Tag 0 verabreicht, und Auffrischungsimmunisierungen werden nach 1, 3, 6, 9 und 12 Monaten gegeben. Die folgenden Immunisierungsgruppen werden eingerichtet:
1. 80 ug PCLUS3-18
2. 80 ug PCLUS6.1-18
3. 160 ug PCLUS3-18
4. 160 ug PCLUS6.1-18
5. 80 ug PCLUS3-18 + 80 ug PCLUS6.1-18
6. 160 ug PCLUS3-18 + 160 ug PCLUS6.1-18
Die Patienten werden zunächst den Gruppen 1 und 2, dann den Gruppen 3 und 4, dann der Gruppe 5 und schließlich der Gruppe 6 zugeteilt. Mit zunehmender Erfahrung bei der Verabreichung des Peptids an Menschen könnte Patienten in Gruppe 1- 4 erlaubt werden, die Kombination von PCLUS3-18 und PCLUS6.1-18 zu erhalten, nach 6-monatiger Verabreichung von dem einen oder dem anderen der einzelnen Peptide.
In jedem Patienten wird eine Vielzahl von Immunsystemparametern verfolgt, einschließlich der folgenden:
routinemäßige chemische und hämatologische Parameter;
toxikologische Untersuchung und Untersuchung auf opportunistische Infektionen;
Lymphocyten-Untergruppen;
Serum HIV p24-Antigenspiegel;
Serum, Plasma und Zellen werden zu bestimmten Zeitpunkten zur Messung der Virenbeladung eingefroren; die Messung erfolgt durch Assays, die gegenwärtig dem Stand der Technik entsprechen, einschließlich auf PCR basierenden Assays;
Messung von Antikörpern, die für die Peptide und andere Determinanten auf HIV spezifisch sind;
Bestimmung des Titers an HIV-neutralisierenden Antikörpern;
Cytokinproduktion, einschließlich Interleukin-2-Produktion, als Reaktion auf Mitogene, Alloantigene, gewöhnliche Antigene (z. B. Grippe) und HIV-Antigene;
Messung der CTL-Aktivität gegen HIV-Antigene;
Hauttests auf Immunantworten auf Antigene, die sich von den bei der Untersuchung der Cytokinreaktion verwandten unterscheiden.
Die für jeden dieser Assays verwandten Techniken entsprechen dem Stand der Technik.

BEISPIEL VI: VERWENDUNG DER PEPTIDE DER VORLIEGENDEN ERFINDUNG IN DIAGNOSTISCHEN ASSAYS

Es ist dem Fachmann natürlich sofort klar, daß die Peptide der vorliegenden Erfindung, zusätzlich zu ihrem Nutzen als Immunogene zum Auslösen einer breiten Immunantwort, auch in diagnostischer Weise zum Bestimmen von Antikörper- und CTL-Funktion in einem Patienten zum Einsatz kommen können.
Die grundlegenden Formate für Antikörperassays sind dem Fachmann wohlbekannt, einschließlich Festphasenassays wie ELISA, RIA, usw. In solchen Festphasenassays wird das Peptid der vorliegenden Erfindung an ein unlösliches Substrat gebunden, und das Substrat, mit dem daran gebundenen Peptid, wird mit der zu untersuchenden Probe in Kontakt gebracht, unter Bedingungen, die so gewählt sind, daß, falls spezifische Anti-Peptidantikörper in der Probe vorhanden sind, sie an das Peptid binden können. Die gebundenen Antikörper werden dann durch eine einer Vielzahl von Methoden, welche ebenfalls im Stand der Technik wohlbekannt sind, nachgewiesen. Bei einer dieser Nachweismethoden wird ein zweiter, radioaktiv oder enzymmarkierter Antikörper verwendet, der zum Beispiel spezifisch für die Fc- Region von IgG ist.
Die Messung der CTL-Reaktion ist ebenfalls wohlbekannt. Eine Methode zur Messung der CTL-Reaktion ist in Beispiel II beschrieben. Zellen aus dem peripherären Blut eines Patienten können mit Peptiden der vorliegenden Erfindung inkubiert werden, und zusammen mit einer eine Fibroblastenzellinie enthaltenden Targetzellenpopulation die MHC-Moleküle exprimiert, die das Peptid der vorliegenden Erfindung auf ihrer Oberfläche präsentieren. Die Peptid-spezifische Lyse der Targetzellen bietet ein Maß der CTL-Funktion des Patienten.
Nachdem die Erfindung nun beschrieben ist, wird es dem Fachmann klar sein, daß verschiedene Modifikationen der zur Herstellung oder Durchführung der Erfindung verwendeten Materialien und Methoden eingesetzt werden können. Solche Modifikationen werden als von der Definition der Erfindung, wie sie unten beansprucht wird, eingeschlossen angesehen.

LITERATURVERZEICHNIS

In dieser Veröffentlichung wird immer wieder auf eine Reihe von Artikeln aus der wissenschaftlichen und Patentliteratur verwiesen. Auf alle diese Veröffentlichungen wird hiermit in ihrer Gesamtheit ausdrücklich Bezug genommen. Diejenigen Artikel, die in der wissenschaftlichen Literatur gefunden werden können, sind unten aufgeführt:
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SEQUENZPROTOKOLL

(1) ALLGEMEINE INFORMATION:

(i) ANMELDER:
(A) NAME: Gov't of the United States as represented by the Department of Health and Human Services/National Institutes of Health
(B) STRASSE: Box OTT
(C) ORT: Bethesda
(D) STAAT ODER PROVINZ: Maryland
(E) LAND: Vereinigte Staaten von Amerika
(F) POSTLEITZAHL: 20892
(ii) TITEL DER ERFINDUNG: SYNTHETISCHE MISCHPEPTIDE, DIE DIE ENTSTEHUNG VON NEUTRALISIERENDEN ANTIKÖRPERN UND DIE WIRKUNG DER CYTOTOXISCHEN T-LYMPHOCYTEN GEGEN HIV HERVORRUFEN
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 36
(iv) ADRESSE FÜR KORRESPONDENZ:
(A) ADRESSAT: Birch, Stewart, Kolasch & Birch
(B) STRASSE: P. O. Box 747
(C) ORT: Falls Church
(D) STAAT: Virginia
(E) LAND: USA
(F) POSTLEITZAHL: 22040-0747
(v) COMPUTERLESBARE FORM:
(A) DATENTRÄGER: Floppy disk
(B) COMPUTER: IBM PC-kompatibel
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: Patentln Release Nr. 1,0, Version Nr. 1,25
(vi) AKTUELLE ANMELDEDATEN:
(A) ANMELDUNGSNUMMER: US 08/060,988
(B) ANMELDEDATUM: 14. Mal 1993
(C) KLASSIFIKATION:
(viii) INFORMATIONEN ÜBER RECHTSANWALT/VERTRETER:
(A) NAME: Svensson, Leonard R.
(B) ZULASSUNGSNUMMER: 30330
(C) AKTENZEICHEN/REGISTERNUMMER: 1173-434P
(ix) TELEKOMMUNIKATIONSINFORMATION:
(A) TELEFON: 703-205-8000
(B) TELEFAX: 703-205-8050

(2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NR: 1:

(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 35 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(v) ART DES FRAGMENTS: intern
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
(B) LAGE: 1..35
(D) WEITERE INFORMATION: Bezeichnung = Peptid /Anmerkung = "pclus 1-18/p18IIIB Peptid, siehe Tabelle 1"
(ix) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 1

(2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NR: 2:

(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 39 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(v) ART DES FRAGMENTS: intern
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
(B) LAGE: 1..39
(D) WEITERE INFORMATION: Bezeichnung = Peptid /Anmerkung = "pclus 3-18/p18IIIB Peptid, siehe Tabelle 1"
(ix) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 2:

(2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NR: 3:

(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 39 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(v) ART DES FRAGMENTS: intern
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
(B) LAGE: 1..39
(D) WEITERE INFORMATION: Bezeichnung = Peptid /Anmerkung = "pclus 4-18/p18IIIB Peptid, siehe Tabelle 1"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 3:

(2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NR: 4:

(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 48 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(v) ART DES FRAGMENTS: intern
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
(B) LAGE: 1..48
(D) WEITERE INFORMATION: /Bezeichnung = Peptid /Anmerkung = "pclus 6-18/p 18IIIB Peptid, siehe Tabelle 1"
(ix) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 4:

(2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NR: 5.

(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 30 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(v) ART DES FRAGMENTS: intern
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
(B) LAGE: 1..30
(D) WEITERE INFORMATION: /Bezeichnung = Peptid /Anmerkung = "p53/p18IIIB Peptid, siehe Tabelle 1"
(ix) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 5.

(2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NR: 6:

(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 31 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(II) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(v) ART DES FRAGMENTS: intern
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
(B) LAGE: 1..31
(D) WEITERE INFORMATION: Bezeichnung = Peptid /Anmerkung = "p55/p 18IIIB Peptid, siehe Tabelle 1"
(ix) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 6:

(2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NR: 7:

(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 15 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(v) ART DES FRAGMENTS: intern
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
(B) LAGE: 1..15
(D) WEITERE INFORMATION: Bezeichnung = Peptid /Anmerkung = "p18IIIB Peptid, siehe Tabelle V"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 7:

(2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NR: 8:

(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 13 Aminosäuren
(8) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(v) ART DES FRAGMENTS: intern
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
(B) LAGE: 1..13
(D) WEITERE INFORMATION: Bezeichnung = Peptid /Anmerkung = "18 RF Peptid; Peptid homolog zu p18IIIB im RF-Stamm von HIV, siehe Tabelle V"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 8:

(2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NR: 9:

(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(8) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(v) ART DES FRAGMENTS: intern
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
(8) LAGE: 1..14
(D) WEITERE INFORMATION: /Bezeichnung = Peptid /Anmerkung = "p18-1, siehe Tabelle V"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 9:

(2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NR: 10:

(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(v) ART DES FRAGMENTS: intern
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
(B) LAGE: 1..14
(D) WEITERE INFORMATION: Bezeichnung = Peptid /Anmerkung = "p18-2, siehe Tabelle V"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 10:

(2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NR: 11:

(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 15 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(v) ART DES FRAGMENTS: intern
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
(B) LAGE: 1..15
(D) WEITERE INFORMATION: Bezeichnung = Peptid /Anmerkung = "p18-3, siehe Tabelle V"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 11:

(2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NR: 12:

(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 15 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(v) ART DES FRAGMENTS: intern
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
(B) LAGE: 1..15
(D) WEITERE INFORMATION: /Bezeichnung = Peptid /Anmerkung = "p18-4, siehe Tabelle V"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 12:

(2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NR: 13:

(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 15 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(v) ART DES FRAGMENTS: intern
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
(B) LAGE: 1..15
(D) WEITERE INFORMATION: Bezeichnung = Peptid /Anmerkung = "p18-5, siehe Tabelle V"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 13:

(2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NR: 14:

(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 15 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(v) ART DES FRAGMENTS: intern
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
(B) LAGE: 1..15
(D) WEITERE INFORMATION: Bezeichnung = Peptid /Anmerkung = "p18-6, siehe Tabelle V"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 14:

(2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NR: 15:

(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 15 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(v) ART DES FRAGMENTS: intern
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
(B) LAGE: 1..15
(D) WEITERE INFORMATION: Bezeichnung = Peptid /Anmerkung = "p 18-7, siehe Tabelle V"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 15:

(2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NR: 16:

(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 15 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(v) ART DES FRAGMENTS: intern
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
(B) LAGE: 1..15
(D) WEITERE INFORMATION: /Bezeichnung = Peptid
Anmerkung = "p18-8, siehe Tabette V"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 16:

(2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NR: 17:

(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 15 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(v) ART DES FRAGMENTS: intern
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
(B) LAGE: 1..15
(D) WEITERE INFORMATION: /Bezeichnung = Peptid /Anmerkung = "p18-9, siehe Tabelle V"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 17:

(2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NR: 18:

(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 15 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(v) ART DES FRAGMENTS: intern
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
(B) LAGE: 1..15
(D) WEITERE INFORMATION: Bezeichnung = Peptid /Anmerkung = "p18-10, siehe Tabelle V"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 18:

(2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NR: 19:

(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 15 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear.
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(v) ART DES FRAGMENTS: intern
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
(B) LAGE: lAS
(D) WEITERE INFORMATION: Bezeichnung = Peptid /Anmerkung = "p18-11, siehe Tabelle V"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 19:

(2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NR: 20:

(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
(A) LANGE: 15 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(v) ART DES FRAGMENTS: intern
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
(B) LAGE: 1..15
(D) WEITERE INFORMATION: /Bezeichnung = Peptid /Anmerkung = "p18-12, siehe Tabelle V"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 20:

(2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NR: 21:

(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 15 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(v) ART DES FRAGMENTS: intern
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
(B) LAGE: 1..15
(D) WEITERE INFORMATION: Bezeichnung = Peptid /Anmerkung = "p18-13, siehe Tabelle V"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 21:

(2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NR: 22:

(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 15 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(v) ART DES FRAGMENTS: intern
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
(B) LAGE: 1..15
(D) WEITERE INFORMATION: /Bezeichnung = Peptid /Anmerkung = "p18-14, siehe Tabelle V"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 22:

(2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NR: 23:

(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 15 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(v) ART DES FRAGMENTS: intern
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
(B) LAGE: 1..15
(D) WEITERE INFORMATION: Bezeichnung = Peptid /Anmerkung = "p18-15, siehe Tabelle V"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 23:

(2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NR: 24:

(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 24 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(v) ART DES FRAGMENTS: intern
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
(B) LAGE: 1..24
(D) WEITERE INFORMATION: Bezeichnung = Peptid /Anmerkung = "pclus3 Peptid"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 24:

(2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NR: 25:

(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 25 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(v) ART DES FRAGMENTS: intern
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
(B) LAGE: 1..25
(D) WEITERE INFORMATION: Bezeichnung = Peptid /Anmerkung = "pclus4 Peptid"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 25:

(2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NR: 26:

(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 33 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(v) ART DES FRAGMENTS: intern
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
(B) LAGE: 1..33
(D) WEITERE INFORMATION: Bezeichnung = Peptid /Anmerkung = "pclus6 Peptid"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 26:

(2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NR: 27:

(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 35 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(v) ART DES FRAGMENTS: intern
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
(B) LAGE: 1..35
(D) WEITERE INFORMATION: Bezeichnung = Peptid /Anmerkung = "pclus1-18MN Peptid, siehe Tabelle VI"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 27:

(2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NR: 28:

(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 39 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(v) ART DES FRAGMENTS: intern
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
(B) LAGE: 1..39
(D) WEITERE INFORMATION: Bezeichnung = Peptid /Anmerkung = "pclus3-18MN Peptid, siehe Tabelle VI"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 28:

(2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NR: 29:

(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 39 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(v) ART DES FRAGMENTS: intern
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
(B) LAGE: 1..39
(D) WEITERE INFORMATION: Bezeichnung = Peptid /Anmerkung = "pclus4-18MN Peptid, siehe Tabelle VI"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 29:

(2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NR: 30:

(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 48 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(v) ART DES FRAGMENTS: intern
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
(B) LAGE: 1..48
(D) WEITERE INFORMATION: Bezeichnung = Peptid /Anmerkung = "pclus6-18MN Peptid, siehe Tabelle VI"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 30:

(2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NR: 31:

(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 42 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(v) ART DES FRAGMENTS: intern
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
(B) LAGE: 1..42
(D) WEITERE INFORMATION: /Bezeichnung = Peptid /Anmerkung = "pclus6.1-18MN Peptid, siehe Tabelle VI"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 31:

(2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NR: 32:

(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 30 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(v) ART DES FRAGMENTS: intern
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
(B) LAGE: 1..30
(D) WEITERE INFORMATION: /Bezeichnung = Peptid /Anmerkung = "p53-18MN Peptid, siehe Tabelle VI"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 32:

(2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NR: 33:

(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 31 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(v) ART DES FRAGMENTS: intern
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
(B) LAGE: 1..31
(D) WEITERE INFORMATION: /Bezeichnung = Peptid /Anmerkung = "p55-18MN Peptid, siehe Tabelle VI"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 33:

(2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NR: 34:

i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 15 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(v) ART DES FRAGMENTS: intern
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
(B) LAGE: 1..15
(D) WEITERE INFORMATION: /Bezeichnung = Peptid /Anmerkung = "p18MN Peptid"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 34:

(2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NR: 35:

(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 66 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(v) ART DES FRAGMENTS: intern
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
(B) LAGE: 1..66
(D) WEITERE INFORMATION: /Bezeichnung = Peptid /Anmerkung = "Peptid vom P. falciparum CS-Antigen"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 35:

(2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NR: 36:

(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 42 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(v) ART DES FRAGMENTS: intern
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
(B) LAGE: 1..42
(D) WEITERE INFORMATION: Bezeichnung = Peptid /Anmerkung = "pclus6.1-18IIIB Peptid"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 36:

Claims

Ein isoliertes gereinigtes Polypeptid, enthaltend:

a) ein erstes Peptid mit einem Epitop, das sich von einem Target-Antigen ableitet, das dazu in der Lage ist, eine T-Helferzellenreaktion auszulösen, wobei das Peptid ein Clusterpeptid ist;

b) ein zweites Peptid mit einem Epitop, welches dazu in der Lage ist, eine Reaktion cytotoxischer T-Zellen auszulösen; und

c) ein drittes Peptid mit einem Epitop, das dazu in der Lage ist, eine neutralisierende Antikörperreaktion mit hohem Titer gegen das besagte Antigen zu bewirken;

wobei sowohl das zweite als auch das dritte Peptid von der V3-Schleife des gp¹&sup6;&sup0; von HIV- I abgeleitet sind, wobei jede Reaktion in mehreren Individuen einer Säugetierspezies hervorgerufen wird, die eine Vielfalt an transplantierten Antigen-Haplotypen präsentieren, und wobei weiterhin jedes der besagten Peptide mit den beiden anderen in angrenzender Weise verbunden ist.
2. Ein Polypeptid nach Anspruch 1, wobei das Epitop cytotoxischer T- Lymphocyten und das neutralisierende Antikörper-Epitop in überlappenden Aminosäuresequenzen enthalten sind.
3. Ein Polypeptid nach Anspruch 1, wobei jedes der Peptide in einer seriellen, linearen Weise verbunden ist.
4. Ein Polypeptid nach Anspruch 3, wobei das ein T-Helferzellen-Epitop aufweisende Peptid mit dem Amino-Terminus des ein Epitop cytotoxischer T-Zellen aufweisenden Peptids verbunden ist, welches wiederum mit dem Amino-Terminus des ein Epitop neutralisierender Antikörper aufweisenden Peptids verbunden ist.
5. Ein Polypeptid nach Anspruch 3, wobei das ein T-Helferzellen-Epitop aufweisende Peptid mit dem Amino-Terminus des ein Epitop neutralisierender Antikörper aufweisenden Peptids verbunden ist, welches wiederum mit dem Amino-Terminus des ein Epitop cytotoxischer T-Zellen aufweisenden Peptids verbunden ist.
6. Ein Polypeptid nach Anspruch 3, wobei das Peptid mit einem Epitop cytotoxischer T-Zellen und das Peptid mit einem Epitop neutralisierender Antikörper aus überlappenden Aminosäuresequenzen in einem einzelnen Peptid gebildet werden.
7. Ein Polypeptid nach Anspruch 6, wobei das Peptid mit einem T- Helferzellen-Epitöp mit dem Amino-Terminus des Peptids mit überlappenden Aminosäuresequenzen verbunden ist.
8. Ein Polypeptid nach Anspruch 1, wobei die Peptide über Peptidbindungen ovalent verbunden sind und eine verzweigte Struktur bilden.
9. Ein Immunogen, enthaltend:

a) ein erstes Peptid mit einem Epitop, das sich von einem Target-Antigen ableitet, das dazu in der Lage ist, eine T-Helferzellenreaktion auszulösen, wobei dieses erste Peptid ein Clusterpeptid ist;

b) ein zweites Peptid mit einem Epitop, welches dazu in der Lage ist, eine Reaktion cytotoxischer T-Zellen auszulösen; und

c) ein drittes Peptid mit einem Epitop, das dazu in der Lage ist, eine Reaktion neutralisierender Antikörper mit hohem Titer gegen das besagte Antigen auszulösen;

wobei sowohl das zweite als auch das dritte Peptid von der V3-Schleife des gp¹&sup6;&sup0; von HIV- I abgeleitet sind, wobei jede Reaktion in mehreren Individuen einer Säugetierspezies iervorgerufen wird, die eine Vielfalt an transplantierten Antigen-Haplotypen präsentieren, und wobei weiterhin jedes der Peptide durch eine Nicht-Peptidbindung kovalent verbunden ist.
10. Ein Polypeptid aus der Gruppe
11. Eine pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend ein Polypeptid gemäß den Ansprüchen 1 bis 8.
12. Eine pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend das Immunogen nach Anspruch 9.
13. Verwendung eines Polypeptids gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Herstellung eines Medikaments für die Prävention oder zur Behandlung einer HIV- Infektion.
14. Ein Verfahren zur Diagnose einer Pathogen-Exposition oder zur Bestimmung einer Immunfunktion, dadurch gekennzeichnet, daß:

i) eine von einer Versuchsperson entnommene Probe mit einem Peptid nach Anspruch 1 in Kontakt gebracht wird;

ii) eine Immunantwort auf das Peptid bestimmt wird, wobei die Immunantwort aus der Gruppe der T-Helferzellenreaktionen, der Reaktionen cytotoxischer T-Zellen und der Antikörper-Titer ausgewählt ist.
15. Ein Verfahren nach Anspruch 14, wobei der Bestimmungsschritt (ii) durchgeführt wird, indem auf eine Antwort aus der Gruppe aus Interleukin-2-Produktion, T-Zellen-Proliferation und Antikörper-Bindungsaktivität hin untersucht wird.
16. Ein Immunogen gemäß Anspruch 9, wobei das Polypeptid die Aminosäuresequenz

aufweist.
17. Eine pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend ein Polypeptid gemäß Anspruch 10.
18. Verwendung eines Polypeptids gemäß Anspruch 10 zur Herstellung eines Medikaments für die Prävention oder zur Behandlung einer HIV-Infektion.
19. Ein Verfahren zur Diagnose einer Pathogen-Exposition oder zur Bestimmung einer Immunfunktion, dadurch gekennzeichnet, daß:

i) eine von einer Versuchsperson entnommene Probe mit einem Peptid nach Anspruch 10 in Kontakt gebracht wird;

ii) eine Immunantwort auf das Peptid bestimmt wird, wobei die Immunantwort aus der Gruppe der T-Helferzellenreaktionen, der Reaktionen cytotoxischer Zellen und der Antikörper-Titer ausgewählt ist.
20. Ein Verfahren nach Anspruch 19, wobei der Bestimmungsschritt (ii) durchgeführt wird, indem auf eine Antwort aus der Gruppe aus Interleukin-2-Produktion, T-Zellen-Proliferation und Antikörper-Bindungsaktivität hin untersucht wird.