DE69230361T2

DE69230361T2 - Direkter Nachweis der RNS des Hepatitis-C-Virus

Info

Publication number: DE69230361T2
Application number: DE69230361T
Authority: DE
Inventors: Ke-Qin Hu; John M. Vierling
Original assignee: Cedars Sinai Medical Center
Current assignee: Cedars Sinai Medical Center
Priority date: 1991-09-12
Filing date: 1992-09-09
Publication date: 2000-04-20
Anticipated expiration: 2012-09-10
Also published as: JPH06502770A; WO1993005181A1; CA2077519A1; US5914228A; AU665204B2; DE69230361D1; EP0531974B1; AU2283792A; EP0531974B2; ATE187204T1; MX9205203A; EP0531974A1; ES2141094T3

Description

Hintergrund der Erfindung

Fünf besondere menschliche Hepatitis-Viren wurden identifiziert (1-5). Das Hepatitis-A-Virus und Hepatitis-E- Virus sind enterisch übertragene RNA-Viren, die keine chronische Lebererkrankung hervorrufen. Im Gegensatz werden das Hepatitis-B-Virus, Hepatitis-C-Virus und Hepatitis-D- Virus (HBV, HCV bzw. HDV) parenteral übertragen und verursachen eine chronische Infektion. Sie sind gefährliche Verseuchungen der Blutversorgung. Kürzlich wurden Untersuchungen auf einfachem Wege zur Untersuchung auf HBV im Blut erhältlich, die die Durchmusterung auf dieses Pathogen und die Eliminierung der infizierten Proben aus der Blutversorgung erlauben (6).
Gleichzeitig mit der Verfügbarkeit der HBV-Untersuchung trat eine Zunahme des Anteils der Fälle von Posttransfusions- Hepatitis aufgrund von Nicht-A-, Nicht-B- (NANB-) Mitteln auf. Bis vor kurzem war kein Test für den Nachweis der NANB- Mittel verfügbar. Das hauptsächliche NANB-Mittel, HCV, wurde kürzlich durch molekulares Klonieren von Segmenten des HCV- Genoms identifiziert (3). HCV ist ein RNA-Virus, das mit menschlichen Flaviviren und tierischen Pestiviren verwandt ist (7, 8).
Voraussichtliche Untersuchungen ausgewählter Bezirke in den Vereinigten Staaten durch die "Centers for Disease Control" (CDC) deuten an, daß ca. 170 000 neue Fälle von NANB/HCV- Infektionen pro Jahr auftreten (9). Wenigstens 50% dieser Infektionen scheinen zu einer chronischen Lebererkrankung fortzuschreiten. Ernsthafte Folgeerscheinungen schließen die Entwicklung von dekompensierter Zirrhose, was eine Lebertransplantation erforderlich macht, und die Entwicklung von Leberzellenkarzinom ein (10,11).
Das positiv-strängige RNA-Genom des HCV enthält ca. 10 000 Nukleotide. Das HCV-Genom wirkt als langer offener Leserahmen ("open reading frame", ORF), der eine Polyprotein-Vorstufe mit 3 010 Aminosäuren kodieren kann, aus der individuelle Virusproteine, sowohl strukturelle als auch nichtstrukturelle, erzeugt werden (7,12-14). Es gibt wenigstens 324 Nukleotide am 5'-Ende des ORF, von denen bisher nicht gezeigt wurde, daß sie für ein Protein kodieren. Daher wird diese Sequenz als der 5'-nicht-kodierende Bereich bezeichnet (7,12-17). Verschiedene Forschungsgruppen haben von der Nukleotidsequenz entweder des gesamten HCV-Genoms oder spezifischer subgenomischer Bereiche berichtet (7,12-22). Ein Vergleich dieser Sequenzen zeigt Variationen in den strukturellen und nicht-strukturellen Bereichen (im Bereich von 9 bis 26%) unter unterschiedlichen HCV-Stämmen. Im Gegensatz dazu scheinen die Sequenzen des 5-nichtkodierenden Bereichs eine Homologie von ca. 99% unter unterschiedlichen Stämmen zu haben (16, 17). Der 5-nichtkodierende Bereich weist ebenfalls eine beträchtliche Homologie (45 bis 49%) mit dem äquivalenten Bereich von tierischen Pestiviren auf (7).
Zwei Haupttechniken werden derzeit zum Nachweis einer HCV- Infektion verwendet. Die erste Technik weist die als Antwort auf die HCV-Infektion erzeugten Antikörper nach (Anti-HCV) (23-28). Da mehrere Wochen erforderlich sind, bis infizierte Patienten nachweisbare IgG-Antikörper gegen HCV-Antigene entwickeln, ist diese Untersuchung nutzlos beim Nachweis einer akuten HCV-Infektion. Ferner deuten Untersuchungen an, daß die Antikörper-Untersuchung sowohl mit falsch-positiven als auch falsch-negativen Ergebnissen verbunden ist (29).
Diese Mängel in den ursprünglichen Assays haben die Entwicklung neuerer, ergänzender Antikörper-Untersuchungen zur Diagnose einer HCV-Infektion angetrieben (30). Vorläufige Ergebnisse mit ergänzenden Assays deuten auf eine Abnahme der Häufigkeit von falsch-positiven und -negativen Ergebnissen. Jedoch treten noch immer falsch-positive und -negative Ergebnisse auf, und ergänzende Untersuchungen bleiben ungeeignet zum Nachweis einer akuten Infektion (31).
Die zweite Technik, der Nachweis von HCV-RNA durch eine RNA- Polymerase-Kettenreaktion (PCR), war auf die Forschungsverwendung beschränkt. Die HCV-PCR wertet eine Infektion durch den Nachweis von HCV-RNA in Blut- oder Gewebeextrakten durch reverse Transkription und cDNA- Amplifizierung aus (7,32-41). HCV-PCR stellt eine empfindliche direkte Technik dar, erfordert aber eine akribische Sorgfalt (7) zur Verhinderung falsch-positiver und -negativer Ergebnisse. Im Gegensatz zu den Antikörper- Untersuchungen kann die HCV-PCR-Technik zirkulierende HCV-RNA während einer akuten Infektion nachweisen.
Die ursprünglichen HCV-PCR-Untersuchungen verwendeten Primer, die spezifisch für Sequenzen im nicht-strukturellen Bereich des HCV-Genoms sind (32-36). Infolge wurde HCV-PCR unter Verwendung mehrerer Primer für den 5'-nicht-kodierenden Bereich im Genom durchgeführt (37,39). In unserem Labor haben wir HCV-PCR sowohl für nicht-strukturelle als auch 5-nicht- kodierende Bereiche eingerichtet. Unsere Vergleichsergebnisse deuten an, daß die HCV-PCR aus dem 5'-nicht-kodierenden Bereich empfindlicher beim Nachweis einer HCV-Infektion ist (41).
Trotz des Erfolgs der HCV-PCR hat die Technik viele inhärente Beschränkungen. Zuerst ist sie zeitaufwendig, teuer und von einer akribischen Technik abhängig. Die exquisite Empfindlichkeit der PCR macht falsch-positive Ergebnisse aufgrund von Verunreinigung mit exogener HCV-RNA zu einer konstanten Sorge (42). Ferner führen die Variation sowohl der reversen Transkription von HCV-RNA zu cDNA als auch der Amplifizierung von cDNA zu einer schwierigen Quantifizierung der HCV-PCR (38, 40, 42). Kürzliche Versuche, diese Schwierigkeiten zu überwinden, haben bestenfalls in halbquantitativen Assays resultiert (38). Wichtiger hängt nach unserer Erfahrung die Effizienz der HCV-PCR zu einem großen Teil von den eingesetzten spezifischen Primern ab. Es wurden nicht nur Standards für Primer nicht entwickelt, sondern die in der PCR eingesetzten Polymerasen haben unterschiedliche Wirksamkeiten. Daher wird es wahrscheinlich schwierig sein, PCR-Ergebnisse aus unterschiedlichen Labors zu vergleichen.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Band 88, 1711-1715 (1991) (Han et al.) berichtet von der Bestimmung der Nukleotidsequenz der 5'- und 3'-Termini des HCV-Genoms, wobei PCR-Techniken angewendet wurden. Dieses Bestimmungsverfahren macht Gebrauch von Nukleinsäuresonden, die Nukleinsäure aus dem 5'-nicht- kodierenden Bereich des HCV-Genoms enthalten.
EP-A-0 398 748 beschreibt DNA-Polynukleotide, die bei der Durchmusterung des Hepatitis-C-Virus verwendet werden können.
EP-A-0 461 863 offenbart eine Nukleotidsequenz des 5-nicht- kodierenden Bereichs von NANB-Hepatitis-Virus-RNA.
Um die Beschränkungen der derzeitigen Antikörper- und HCV- PCR-Techniken zum Nachweis einer HCV-Infektion auszuräumen, ist es wünschenswert, einen Test zu entwickeln, der hochempfindlich, spezifisch, bezahlbar und für die Untersuchung großer Gruppen von Patienten oder Blutspendern anwendbar ist. Der optimale Test wäre in der Lage zum Nachweis sowohl akuter als auch chronischer Infektionen. Ferner würde er quantitativ sein, um Informationen bezüglich sowohl der Naturgeschichte als auch der Wirksamkeit der derzeitigen oder zukünftigen Antivirus-Therapien bereitzustellen. Er wäre fähig für einheitliche Ergebnisse. Diese Vorbedingungen können durch eine Technik zum direkten Nachweis von HCV-RNA erfüllt werden.

Zusammenfassung der Erfindung

Die Verfahren und Zusammensetzungen dieser Erfindung stellen ein schnelles, genaues Mittel zur direkten Bestimmung der Gegenwart und Menge von HCV in einer Probe und damit in einem Patienten durch Hybridisierung an Patientenproben unter Verwendung einer für HCV spezifischen Sonde bereit.
Ferner stellen die Verfahren und Zusammensetzungen dieser Erfindung ein Mittel zum Nachweis sowohl einer akuten als auch einer chronischen HCV-Infektion bereit.
Die hier beschriebenen Verfahren und Zusammensetzungen erlauben eine quantitative Analyse der HCV-Gegenwart und -Infektion. Sie stellen ein zuvor nicht erhältliches Mittel zur Einheitlichkeit der Ergebnisse bereit.
Zusätzlich sind diese Verfahren und Zusammensetzungen hochempfindlich und spezifisch für das HCV-Virus.
Diese Verfahren und Zusammensetzungen sind sowohl schnell als auch wirtschaftlich, was sie zur Durchmusterung großer Gruppen geeignet macht. Sie liefern schnelle Ergebnisse, die bei der Behandlung von infizierten Patienten helfen können. Sie erlauben ebenfalls eine schnelle und wirtschaftliche Durchmusterung der Blutversorgung auf Verseuchung durch HCV.
Zusätzlich zu der offensichtlichen Bedeutung in der differentiellen Diagnose einer Lebererkrankung und der Durchmusterung von gespendetem Blut erleichtert der direkte Nachweis von HCV-RNA Untersuchungen der Pathogenese der HCV- Infektion. Speziell können diese Verfahren unter anderem verwendet werden zur: 1) präzisen Quantifizierung der Menge an zirkulierendem HCV; 2) Analyse der molekularen Formen von HCV-RNA während der Entwicklung der Erkrankung; 3) Lokalisierung von HCV in Leber- und/oder nicht zur Leber gehörigen Geweben; und 4) Untersuchung des Verhältnisses zwischen HCV-Infektion, hepatozellulärer Nekrose und Leberzellenkarzinom.
Diese Verfahren und Zusammensetzungen erlauben ebenfalls die wirksame Überwachung von therapeutischen Verfahren zur Behandlung einer HCV-Infektion.

Kurze Beschreibung der Abbildungen

Die vorliegende Erfindung kann durch die Fachleute besser verstanden und ihre Vorteile gewürdigt werden unter Bezugnahme auf die begleitenden Abbildungen, worin gilt:
Fig. 1 zeigt die allgemeine Struktur des HCV-Genoms, wie in Referenz 7 und 13 beschrieben.
Fig. 2 zeigt die Oligonukleotid-Sequenzen von in den Beispielen für HCV-PCR verwendeten Primern.
Fig. 3 stellt die Struktur des Plasmids pGHCV1A dar.
Fig. 4 zeigt die cDNA-Sequenzen von kloniertem HCV-5'-nicht- kodierendem Bereich in pGHCV1A.
Fig. 5 zeigt eine Proben-Slot-Hybridisierung an verschiedenen Patientenproben.
Fig. 6 zeigt Assays auf die Spezifizität der Slot- Hybridisierung.
Fig. 7 stellt einen Northern-Blot von HCV-RNA dar.

Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren und Zusammensetzungen zum Nachweis von HCV durch die Verwendung von RNA-Slot-Blots und die hier identifizierten, speziellen Sonden bereit.
RNA-Slot-Hybridisierung stellt eine klassische Technik zum Nachweis von RNA durch Hybridisierung an spezifischen Nukleotid-Sonden dar, die entweder mit Radioisotopen oder nicht-radioaktiven Stoffen, wie fluoreszenten oder Enzymgebundenen Markern, markiert sind. Diese Technik hat eine ausgezeichnete Empfindlichkeit beim Nachweis von anderen Virusinfektionen geliefert (43). Ursprüngliche Daten über HCV deuteten jedoch an, daß der Titer des zirkulierenden Virus zu gering sein würde, um durch direkte Hybridisierungsverfahren nachgewiesen zu werden (3). In der ursprünglichen Veröffentlichung der molekularen Klonierung von HCV wurde eine ³²P-markierte, nicht-strukturelle HCV-cDNA verwendet, um die Spezifizität von klonierter HCV-cDNA zu zeigen (3). Die veröffentlichten Northern-Blots waren Hybridisierungen zwischen der cDNA-Sonde und Poly(A+)-RNA aus der Leber eines infizierten Schimpansen. Anschließende Untersuchungen der RNA-Hybridisierung von Blut oder Gewebe wurden nicht berichtet, und kürzliche Berichte (7,47) argumentieren, daß die in infizierten Proben gefundenen Mengen an HCV-RNA unzureichend zum Nachweis durch direkte Hybridisierung sind.
Auf der Grundlage unserer eigenen Ergebnisse (41) und derjenigen, die in der Literatur veröffentlicht sind (7,16,17), die anzeigen, daß der 5'-nicht-kodierende Bereich des HCV-Genoms stärker konserviert ist als entweder die strukturellen oder nicht-strukturellen Bereiche, haben wir eine ausführliche Analyse von HCV-PCR unter Verwendung von für diesen Bereich spezifischen Primern durchgeführt. Wie oben angegeben, ist die HCV-PCR im 5-nicht-kodierenden Bereich empfindlicher als die HCV-PCR unter Verwendung von Primern, die entweder spezifisch für die NS3- oder NS4- Bereiche sind (siehe Fig. 1 für den Ort dieser Bereiche) (7,13). Auf der Grundlage dieser Ergebnisse haben wir eine Reihe von Sonden für den 5'-nicht-kodierenden Bereich zum Nachweis zirkulierender HCV-RNA unter Verwendung der RNA- Slot-Hybridisierung entwickelt (44).
Zusätzlich sind diese Sonden nützlich zum Nachweis von HCV- RNA durch Northern Blots, in-situ-Hybridisierung in Geweben ebenso wie als Primer für PCR.

Definitionen

Der 5'-nicht-kodierende Bereich von HCV-Nukleotiden bezeichnet die gesamte Nukleotidsequenz aller HCV-Stämme, die stromaufwärts (5'-Ende) des Anfangs-Kodons des großen HCV-ORF lokalisiert sind. Dies schließt die Sequenz mit 241 Basenpaaren von Nukleotid 7 bis Nukleotid 248 der HCV- Sequenz ein, die gemäß dem System von Okamoto et al. (16) numeriert ist.
Sonde bezeichnet eine definierte RNA-Nukleotidseguenz (Ribosonde) einer beliebigen Länge, die markiert ist. Jedes auf diesem Gebiet bekannte Markierungsverfahren kann verwendet werden, wie Radioisotope, FITC oder andere Fluorochrom-Marker, Enzyme, Biotin, Digoxigenin oder andere Moleküle, die zum sekundären Nachweis fähig sind.
Nachweis bezeichnet jede auf diesem Gebiet bekannte Technik, in der Sonden zum Nachweis der Gegenwart von HCV-RNA verwendet werden können, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Dot-Blot-Hybridisierung, Slot-Blot- Hybridisierung, Northern-Blot- oder in-situ-Hybridisierung.
Proben bezeichnet klinische Materialien, einschließlich aber nicht beschränkt auf Blut, Sekrete, Gewebe oder Organe von HCV-infizierten Patienten und Tieren, und Zell-Linien, die ganze HCV-Genome oder subgenomische Elemente enthalten, die durch Infektion, Injektion, Transfektion, Transformation, Lipofektion, Elektroporation oder andere auf diesem Gebiet bekannte Mittel zur Übertragung von Nukleinsäure in oder auf Zellen oder durch Erzeugung von Hybridomen induziert werden.

Auswahl der Sonden

Die Erfindung stellt Ribosonden zum Nachweis bereit. Der 5'- nicht-kodierende Bereich wird hier als die Quelle für nützliche Sonden zum Nachweis von HCV identifziert. Sonden wurden aus dem 5'-nicht-kodierenden Bereich des HCV-Genoms kloniert und auf ihre Homologie zum HCV und ihre Spezifizität für dieses Virus untersucht. Jede einer Vielzahl von auf diesem Gebiet wohlbekannten Techniken kann für diesen Zweck verwendet werden (46). DNA-Sonden können aus Virus-RNA unter Verwendung einer Vielzahl von Techniken hergestellt werden, eingeschlossen, aber nicht beschränkt auf herkömmliche cDNA- Klonierung und reverse Transkriptions-PCR, wie unter Verwendung eines GeneAmp-RNA-PCR-Kits (Perkins Elmer Cetus, Norwalk, CT). Wenn reverse Transkriptions-PCR verwendet wird, wird ein spezifisches PCR-Produkt dann durch Agarose- Elektrophorese, Ethidiumbromid-Anfärbung und Southern-Blot- Hybridisierung unter Verwendung von markierten Primern als Sonde identifiziert.
Ausgewählte cDNAs werden dann zur späteren Verwendung als Sonden vervielfältigt. Beispiele für Verfahren für diese Vermehrung sind PCR, Synthese von Ribosonden und zelluläre Vermehrung von cDNA-Klonen. Der Aufbau solcher Klone erfolgt durch Standardverfahren. Spaltung wird durchgeführt durch Behandlung mit Restriktionsenzym(en) in geeigneten Puffern. Verunreinigendes Protein kann durch eine Vielzahl von Verfahren entfernt werden, wie Phenol/Chloroform-Extraktion (46). Die cDNA wird hergestellt zur Insertion in geeignete Vektoren unter Verwendung entsprechender Techniken, wie Abstumpfen der Enden ("blunt ending"), über einsträngige Exonukleasen oder Auffüllreparatur ("fill in repair"), oder durch Zugabe von Linkem, falls zur Erleichterung der Ligierung erforderlich. Zusätzlich können Einfügungen je nach Anforderung dephosphoryliert oder phosphoryliert werden, um bei der Insertion der entsprechenden Anzahl von Kopien in den Vektor zu helfen.
Vektoren können auf eine Anzahl von Eigenschaften hin ausgewählt werden, wie ihre Einfachheit der Amplifizierung und ihre Fähigkeit, die Einfügung der geeigneten Größe einzuführen. Ligierung und Vervielfältigung erfolgen durch auf diesem Gebiet bekannte Standardtechniken (46).
Nach der Vervielfältigung der Sondensequenz werden die Sonden von ihrem Vervielfältigungsmittel getrennt, wie durch Spaltung und Reinigung aus den Vervielfältigungsvektoren oder durch Reinigung aus der PCR-Herstellung oder Ribosonden- Herstellung.
Die Empfindlichkeit der Sonde wird erhöht, wenn nur der Antisense-Anteil verwendet wird. Falls eine solche Erhöhung der Empfindlichkeit gewünscht ist, können die Antisense- Stränge von den Sense-Strängen durch eine Vielzahl von Mitteln getrennt werden. Wenn Sonden wie Ribosonden verwendet werden, kann allein der Antisense-Strang vervielfältigt werden, was die Notwendigkeit zur Entfernung etwaiger Sense- Stränge überflüssig macht.
Die Sonde wird durch jede auf diesem Gebiet bekannte Standardtechnik markiert, wie Radiomarkierung, Fluoreszenz und Enzym-gebundene Immunoassays.
Die Sonden dieser Erfindung enthalten wenigstens einen durchgehenden Sequenzabschnitt im 5'-nicht-kodierenden Bereich des HCV-Genoms, der ausreichend lang ist, um eine Hybridisierung an HCV-RNA oder cDNA in der Probe zu erlauben. Eine bevorzugte Sondensequenz enthält wenigstens 20 aufeinanderfolgende Nukleotide aus der in Fig. 4 gezeigten Sequenz (SEQ ID NO: 1). Die derzeitigen Beweise zeigen, daß ein Oligonukleotid von nur sechs Nukleotiden zur Hybridisierung ausreicht (48). Zusätzlich können Sonden aus dem 5'-nicht-kodierenden Bereich mit Sequenzen aus anderen Bereichen des HCV-Genoms vermischt werden, wie strukturellen oder anderen nicht-strukturellen Bereichen, um die Empfindlichkeit zu steigern. Sonden werden so konstruiert, daß nicht-homologe Bereiche der Sonden nicht mit der Hybridisierung durch den (die) homologe(n) Bereich(e) interferieren. Nicht-homologe Bereiche können nicht homolog mit anderen DNA- oder RNA-Sequenzen sein, die ebenfalls aufgrund Verunreinigung oder Gegenwart im Genom der Zelle in der Probe enthalten sein könnten. Zusätzlich können nicht- homologe Bereiche nicht so lang sein, daß sie die Hybridisierung durch die homologen Bereiche durch physikalische Wechselwirkung mit dieser Hybridisierung an der HCV-Nukleinsäure in der Probe verhindern.

Probenvorbereitung

Zum Nachweis der Gegenwart von HCV können Proben aus Serum oder anderen Flüssigkeiten oder Geweben von Patienten leicht zur Hybridisierung mit den Sonden dieser Erfindung vorbereitet werden. Virus-RNA wird aus Volumen aus Patienten- Serumproben von nur 0,4 bis 0,5 ml gemäß Standardverfahren isoliert. Verfahren zur RNA-Reinigung unter Verwendung von Guanidiniumisothiocyanat haben sich als besonders nützlich bei der Bereitstellung ausreichender RNA aus Patientenproben erwiesen (45, 46).

Hybridisierung

Die oben identifizierten Sonden können in einer Anzahl von Verfahren für den einfachen Nachweis von HCV verwendet werden. Slot-Hybridisierung stellt ein besonders einfaches und schnelles Verfahren für diesen Nachweis bereit. Techniken zur Slot-Hybridisierung sind wohlbekannt auf diesem Gebiet und sind in einer Vielzahl von Veröffentlichungen beschrieben, wie Referenz 41. Zusätzlich können die Sonden dieser Erfindung zur Northern-Blot-Hybridisierung, in-situ- Hybridisierung von Geweben ebenso wie für Primer für PCR verwendet werden.

Quantifizierung

Die in einer Probe vorhandene Menge an HCV kann unter Verwendung der Intensität der gebundenen Markierung im Vergleich einer Serie von Standards gemessen werden. HCV wird allgemein in Schimpansen-infektiösen Dosen ("Chimpanzee Infectious Doses") oder CID gemessen (49). Eine Reihe von Verdünnungen von HCV-RNA kann als Standard verwendet werden, gegen den die Ergebnisse der Slot-Blot-Hybridisierungsanalyse einer Probe verglichen werden können.
Die Fähigkeit zur Quantifizierung von HCV erleichtert die Analyse der Naturgeschichte der unbehandelten Erkrankung. Zusätzlich erlaubt die Quantifizierung die Überwachung des therapeutischen Potentials von gegenwärtig verwendeten ebenso wie potentiellen neuen therapeutischen Regimen.

Diagnostische Untersuchungen

Die Sonden und Verfahren dieser Erfindung können in einer Form abgepackt werden, die zur diagnostischen Untersuchung auf Gegenwart von HCV in Patientenproben geeignet ist. Z. B. kann ein Slot-Blot-Kit mit Mitteln zur Analyse von Proben ausgestattet werden, einschließlich Mitteln zur Vorbereitung der Proben, einschließlich Reinigung von RNA und seriellen Verdünnungen, markierten Sonden, Hybridisierungslösungen ebenso wie Standards zum quantitativen Vergleich.
Solche Test-Kits können zur Diagnose einer Infektion durch HCV verwendet werden. Aufgrund der quantitativen Natur der Test-Kits können sie ebenso zur Überwachung des Fortschreitens der Infektion und Auswertung von Antivirus- Therapien verwendet werden, die den Patienten verabreicht oder in vitro untersucht werden. Derzeit kann die Auswertung der Pathogenese und von Antivirustherapien zur Infektion durch HBV in Gewebekulturen durch Transfektionen der Zellen durch HBV untersucht werden (50). Vergleichbare Gewebekultursysteme ebenso wie Tiermodelle mögen für die Untersuchung von HCV erhältlich werden. Die Verfahren und Sonden dieser Erfindung werden eine schnelle und effiziente Überwachung der HCV-Pathogenese und Ansprechbarkeit auf Arzneistoff-Therapien in diesen in-vitro- und Tiermodellsystemen ebenso wie am Menschen erlauben.
Zusätzlich können Test-Kits von Blutbanken zur Durchmusterung von Blutproben auf Verseuchung mit HCV verwendet werden. Diese direkte HCV-PNA-Untersuchung zum Nachweis einer akuten oder chronischen Infektion ist der Antikörper-Durchmusterung aufgrund ihrer hervorragenden Genauigkeit und Empfindlichkeit überlegen. Deshalb werden die Techniken dieser Erfindung eine wesentliche Reduzierung des Risikos der Posttransfusions-HCV- Infektion erlauben und die derzeitige Notwendigkeit ausräumen, gespendetes Blut mit falsch-positiven Anti-HCV- Untersuchungen zu entsorgen.
In ähnlicher Weise können die obigen diagnostischen und Überwachungsaktivitäten unter Verwendung der Verfahren und Sonden dieser Erfindung in einer nicht-abgepackten Form verwendet werden. Die hier zur Vorbereitung der Sonden, Vorbereitung von Proben, Hybridisierung von Sonden an Proben und zum Nachweis und zur Quantifizierung der Hybridisierung beschriebenen Verfahren sind standardmäßig und für den Durchschnittsfachmann leicht erhältlich, Deshalb wird ein solcher Fachmann durch die Lehre dieser Erfindung in die Lage versetzt werden, die entsprechenden Bestandteile zusammenzusuchen und die notwendigen Schritte durchzuführen, um HCV-RNA erfindungsgemäß nachzuweisen.
Die folgenden Beispiele werden zur Erläuterung bereitgestellt, um das Verständnis dieser Erfindung zu unterstützen.

Beispiel 1

Entwicklung von Sonden

Um HCV-cDNA-Nukleotidsequenzen aus dem 5'-nicht-kodierenden Bereich zu erhalten, verwendeten wir ein Paar von Oligonukleotiden (Fig. 2) als Primer für HCV-PCR, gemäß den Sequenzen von HC-J1, von denen von Okamoto et al. berichtet wurde (16). HCV-RNA wurde aus einer Serumprobe von 0,4 ml aus einem mutmaßlich HCV-infizierten Individuum unter Verwendung der Guanidiniumisothiocyanat-Säure-Phenol-Technik isoliert (45). Reverse Transkriptions-PCR wurde an der RNA unter Verwendung eines GeneAmp-RNA-PCR-Kits (Perkins Elmer Cetus, Norwalk, CT) durchgeführt. Ein spezifisches PCR-Produkt wurde durch Agarose-Elektrophorese, Ethidiumbromid-Anfärbung und Southern-Blot-Hybridisierung unter Verwendung von markierten Primern (Fig. 2) als Sonde identifiziert.
Nach Bestimmung der Spezifizität des PCR-Produkts durch Southern-Blot-Analyse unter Verwendung der PCR-Primer, wurde das Produkt gereinigt und unter Verwendung von T4-DNA- Polymerase gemäß Standard-Verfahren an den Enden abgestumpft (46). Das Fragment wurde dann in die Smal I-Stelle von pGEM-32, einem Plasmid-Vektor (Promega Co., Madison WI), kloniert. Eine E. coli-Zell-Linie, DH5α (GIBCO/BRL Inc., Gaithersberg, MD), wurde mit klonierter DNA transformiert. Positive Klone wurden dann durch Restriktionsverdauung und ³²P-markierte Oligonukleotide durchmustert. Fig. 3 zeigt die Struktur von pGHCV1A, das eine Insertion von 241 Basenpaaren aus dem HCV-5'-nicht-kodierenden Bereich enthält.
Die DNA-Sequenzierung wurde dann zur Bestimmung der Spezifizität der klonierten HCV-Sequenz in pGHCV1A durchgeführt. Das Sequenzierungs-Kit wurde erhalten von USB Co., Cleveland, Ohio, und die SP6- und T7-Primer wurden von Promega, Co. erworben. Wie in Fig. 4 gezeigt, enthält pGHCV1A eine Sequenz von 241 Basenpaaren des HCV-5'-nicht- kodierenden Bereichs, die zu 100% homolog mit der Sequenz des HC-J1-Stammes ist, von dem von Okamato et al. berichtet wird (16). Wie in Fig. 4 gezeigt, unterscheiden sich vier Nukleotide zwischen dem HC-J1-Stamm und dem von der Houghton- Group (12,14) berichteten HCV-I-Stamm. Die Orientierung unserer klonierten HCV-Sequenz ist in Fig. 3 gezeigt.
Um eine HCV-cDNA-Sonde zu erhalten, wurden das klonierte HCV- Fragment durch simultane Restriktionsverdauung mit Bam HI und Kpn I und Glaspulverelution gereinigt (46). Das gereinigte HCV-Fragment wurde dann mit ³²P-dCTP durch Nick-Translation oder durch ein DNA-Markierungs-Kit mit zufälligem Primer (BIO-RAD Lab, Richmond, CA) markiert. RNA-Sonden (Ribosonden) wurden in vitro aus der in pGHCV1A vorhandenen HCV-cDNA- Schablone durch sowohl SP6- als auch T7-RNA-Polymerase- Reaktionen synthetisiert (Boehringer Mannheim Co., Indianapolis, IN). Die Ribosonden wurden durch Einfügen von ³²P-UTP markiert. SP6-RNA-Polymerase synthetisiert eine HCV-Ribosonde mit Sense-Orientierung, wohingegen T7-RNA- Polymerase eine HCV-Ribosonde mit Antisense-Orientierung synthetisiert (siehe Fig. 3).

Beispiel 2

Slot-Hybridisierung von HCV-RNA

Verfahren

RNA-cDNA-Hybridisierung (Referenzverfahren). 1) RNA- Extraktion: Eine 0,4 Aliquote an Serum wurde geklärt und unter Verwendung der Guanidiumisothiocyanat-Säure-Phenol- Technik (45) RNA-extrahiert. 2) Slot-Blot: ein Standardverfahren wurde verwendet (46). Nytran-Nylon-Membran (Schleicher & Schuell Inc., Keene, NH) wurde zum Blotting der untersuchten Proben verwendet. 3) Sonden: Die Verfahren zur Herstellung von ³²P-markierten HCV-Sonden wurden oben in Beispiel 1 beschrieben. Die Sonden wurden ferner durch Sephadex G50-Säulenchromatographie gereinigt (46). 4) Vorhybridisierung und Hybridisierung: Geblottete Membranen wurden bei 65ºC für 3 bis 4 h vorhybridisiert und dann mit ³²P-markierten HCV-Sonden (46) bei 65ºC für 20 bis 24 h hybridisiert. 5) Autoradiographie: Nach Waschen wurden die Membranen bei -70ºC für 24 bis 48 h auf Röntgenfilm (Kodak, Rochester, NY) ausgesetzt.
RNA-RNA-Hybridisierung. Das Verfahren war ähnlich der RNA- cDNA-Hybridisierung, außer daß Ribosonden anstelle von cDNA- Sonden verwendet wurden. Nach der Markierung wurden die Ribosonden durch DNase-Verdauung und Sephadex G50- Säulenchromatographie gereinigt (46).

Ergebnisse

Spezifizität: Fig. 5 zeigt die Ergebnisse einer RNA-cDNA- Slot-Hybridisierung. Die Spezifizität wurde durch die folgenden Untersuchungen bestimmt: 1) Die Sonde wurde sequenziert, um ihre Homologie mit veröffentlichten HCV- Sequenzen zu bestätigen (Fig. 4); 2) normales menschliches AB-Serum und normales Pferdeserum wurden als negative Kontrollen verwendet; keine davon hybridisierte mit den HCV- Sonden; 3) eine Übereinstimmung von 96% wurde zwischen der RNA-Slot-Hybridisierung und HCV-PCR unter Verwendung von Primern für den 5'-nicht-kodierenden Bereich beobachtet (Tabelle 1); 4) Hybridisierungssignale (Fig. 6 A1) wurden durch Vorbehandlung von Virus-RNA mit RNase A bei 37C für 30 min unterdrückt (Fig. 6 A2); 5) unter Verwendung von Ribosonden erzeugte nur die Antisense-Ribosonde, die aus TZ- RNA-Polymerase synthetisiert wurde, ein Hybridisierungssignal (Fig. 6 B1, B2); und 6) Northern-Blot-Assays zeigten, daß unsere Sonde mit HCV-infizierten Serumproben unter Erzeugung einer Signalbande von ca. 10 kb hybridisiert (Fig. 7). Unsere gesammelten Daten zeigen, daß unsere Slot- Hybridisierungs-Technik sehr spezifisch für HCV-RNA ist. Darüber hinaus zeigte unsere Slot-Hybridisierung im Vergleich mit HCV-PCR keine falsch-psotiven Reaktionen mit Serumproben von Patienten ohne HCV-Infektion (Tabelle 1). Tabelle 1 Übereinstimmung von HCV-PCR und Slot-Hybridisierung
Empfindlichkeit: Eine hohe Empfindlichkeit wurde durch eine Übereinstimmung von 96% zwischen der Slot-Hybridisierung und HCV-PCR und der Abwesenheit von falsch-positiven Ergebnissen gezeigt (Tabelle 1). Im Vergleich mit den Sonden mit NS4 (34) war die Sonde des 5'-nicht-kodierenden Bereichs viel empfindlicher (Tabelle 2). Die Empfindlichkeit wird durch eine HCV-infizierte Schimpansen-Blutprobe mit bekannten, quantifizierten infektiösen Einheiten an HCV ausgewertet (Geschenk von H. Alter, M. D., NIH, Bethesda, MD). Die Verwendung einer Antisense-Ribosonde für die RNA-RNA- Hybridisierung zeigt eine größere Empfindlichkeit als die cDNA-Sonde (Tabelle 2). Tabelle 2 Vergleich der HCV-RNA-Untersuchung unter Verwendung unterschiedlicher Assays
Obwohl die bevorzugten Ausführungsformen beschrieben und erläutert wurden, können verschiedene Substitutionen und Modifizierungen daran ohne Abweichen vom Umfang der Erfindung, wie sie in den angehängten Ansprüchen definiert ist, gemacht werden. Entsprechend ist es selbstverständlich, daß die vorliegende Erfindung zur Erläuterung und nicht zur Beschränkung beschrieben wurde.

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Claims

1. Verfahren zum Nachweis der Gegenwart von HCV in biologischen Proben, worin die biologischen Proben ausgewählt sind aus der Gruppe, die aus Blut, Sekreten, Zellen, Geweben oder Organen von HCV-infizierten Patienten und Tieren besteht, und worin das HCV nicht in vitro vermehrt wird, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:

a) In-Kontakt-Bringen der Probe mit Mehrfachkopien einer Ribosonde, die Nukleinsäure umfaßt, die zu wenigstens 90% komplementär, gegebenenfalls zu wenigstens 95% komplementär, weiter gegebenenfalls vollständig komplementär zu wenigstens 20 aufeinanderfolgenden Nukleotiden des 5-nicht- kodierenden Bereiches des HCV-Genoms ist;

b) Hybridisieren der Ribosonde mit HCV-RNA in den Proben unter Bedingungen, unter denen die Ribosonde spezifisch mit HCV- und nicht mit Nicht-HCV- Nukleinsäure hybridisiert; und

c) Nachweis der hybridisierten Ribosonde als Hinweis auf die Gegenwart von HCV in den Proben.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, worin der 5'-nichtkodierende Bereich des HCV-Genoms zu wenigstens 90% zwischen HCV-Stämmen konserviert ist.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, worin die Ribosonde Nukleinsäure umfaßt, die vollständig komplementär zu wenigstens 20 aufeinanderfolgenden Nukleotiden innerhalb der Nukleotide 7-248 des HCV-Genoms ist.

4. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, worin die Ribosonde Nukleinsäure umfaßt, die zu wenigstens 90% komplementär, gegebenenfalls zu wenigstens 95% komplementär zu 20 aufeinanderfolgenden Nukleotiden im 5'-nicht-kodierenden Bereich des HC-J1-Stammes von HCV ist.

5. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, worin die Hybridisierung durch ein Verfahren erfolgt, das ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Slot- Hybridisierung, Northern-Hybridisierung und in situ- Hybridisierung besteht.

6. Kit zum Nachweis der Gegenwart von HCV-RNA in einer biologischen Probe, worin die biologischen Proben ausgewählt sind aus der Gruppe, die aus Blut, Blutkomponenten, Sekreten, Zellen, subzellulären Komponenten, Geweben oder Organen von HCV = infizierten Patienten und Tieren besteht, und worin das HCV nicht in vitro vermehrt wird, umfassend

(a) Mehrfachkopien einer Ribosonde, die Nukleinsäure umfaßt, die zu wenigstens 90% komplementär, gegebenenfalls zu wenigstens 95% komplementär, weiter gegebenenfalls vollständig komplementär zu wenigstens 20 aufeinanderfolgenden Nukleotiden des 5'-nicht-kodierenden Bereiches des HCV-Genoms ist;

(b) Vorrichtung zur Durchführung der Slot- Hybridisierung an der biologischen Probe mit der Ribosonde unter Bedingungen, unter denen die Ribosonde spezifisch mit HCV- und nicht mit Nicht- HCV-Nukleinsäure hybridisiert; und

(c) Einrichtung zum Nachweis der Hybridisierung zwischen der Probe und der Sonde.

7. Kit gemäß Anspruch 6, worin der 5'-nicht-kodierende Bereich des HCV-Genoms zu wenigstens 90% zwischen HCV- Stämmen konserviert ist.

8. Kit gemäß Anspruch 6 oder 7, worin die Ribosonde Nukleinsäure umfaßt, die vollständig komplementär zu wenigstens 20 aufeinanderfolgenden Nukleotiden innerhalb der Nukleotide 7-248 des HCV-Genoms ist.

9. Kit gemäß Anspruch 6 oder 7, worin die Ribosonde Nukleinsäure umfaßt, die zu wenigstens 90% komplementär, gegebenenfalls zu wenigstens 95% komplementär zu 20 aufeinanderfolgenden Nukleotiden im 5'-nicht-kodierenden Bereich des HC-J1-Stammes von HCV ist.

10. Kit gemäß einem der Ansprüche 6 bis 9, worin die Einrichtung zum Nachweis der Hybridisierung in Schritt (c) eine solche durch Bereitstellen der Ribosonde in Schritt (a) mit angebrachten Marker ist, worin der Marker optional ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Fluoreszenzmarkern, Enzymmarkern und Radiaktivität besteht.

11. Kit gemäß einem der Ansprüche 6 bis 10, das zusätzlich Standardkonzentration-Proben von HCV-RNA zur Quantifizierung der HCV-RNA in der biologischen Probe umfaßt.

12. Verfahren zur Zubereitung von HCV-freiem Blut, worin das HCV nicht in vitro vermehrt wird, durch Durchmusterung von Blutproben, umfassend

(a) Bereitstellen von Blutproben;

(b) Bereitstellen von Mehrfachkopien einer Ribosonde, die Nukleinsäure umfaßt, die zu wenigstens 90% komplementär, gegebenenfalls zu wenigstens 95% komplementär, weiter gegebenenfalls vollständig komplementär zu wenigstens 20 aufeinanderfolgenden Nukleotiden des 5'-nicht-kodierenden Bereiches des HCV-Genoms ist;

(c) Hybridisieren der Proben mit der Ribosonde unter Bedingungen, unter denen die Ribosonde spezifisch mit HCV- und nicht mit Nicht-HCV-Nukleinsäure hybridisiert;

(d) Nachweisen von Proben, in denen eine Hybridisierung aufgetreten ist; und

(e) Entfernen der Proben, in denen eine Hybridisierung nachgewiesen wird.

13. Verfahren gemäß Anspruch 12, worin der 5'-nichtkodierende Bereich des HCV-Genoms zu wenigstens 90% zwischen den HCV-Stämmen konserviert ist.

14. Verfahren gemäß Anspruch 12 oder 13, worin die Ribosonde Nukleinsäure umfaßt, die vollständig komplementär zu wenigstens 20 aufeinanderfolgenden Nukleotiden innerhalb der Nukleotide 7-248 des HCV-Genoms ist.

15. Verfahren gemäß Anspruch 12 oder 13, worin die Ribosonde Nukleinsäure umfaßt, die zu wenigstens 90% komplementär, gegebenenfalls zu wenigstens 95% komplementär zu 20 aufeinanderfolgenden Nukleotiden im 5'-nicht-kodierenden Bereich des HC-J1-Stammes von HCV ist.

16. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 12 bis 15, worin die Hybridisierung durch ein Verfahren erfolgt, das ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Slot- Hybridisierung und Northern-Hybridisierung besteht.

17. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 12 bis 16, worin die Einrichtung zum Nachweis in Schritt (d) der Hybridisierung in Schritt (c) eine solche durch Bereitstellen der Sonde in Schritt (a) mit angebrachtem Marker ist, worin der Marker optional ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Fluoreszenzmarkern, Enzymmarkern und Radioaktivität besteht.

18. Verfahren zur Diagnose von HCV-Infektion, worin das HCV nicht in vitro vermehrt wird, umfassend

(a) Bereitstellen biologischer Proben, worin die biologischen Proben ausgewählt sind aus der Gruppe, die aus Blut, Sekreten, Zellen, Geweben oder Organen von HCV-infizierten Patienten und Tieren besteht;

(b) Bereitstellen von Mehrfachkopien einer Ribosonde, die Nukleinsäure umfaßt, die zu wenigstens 90% komplementär, gegebenenfalls zu wenigstens 95% komplementär, weiter gegebenenfalls vollständig komplementär zu wenigstens 20 aufeinanderfolgenden Nukleotiden des 5'-nicht-kodierenden Bereichs des HCV-Genoms ist;

(c) Hybridisieren der Probe mit der Ribosonde unter Bedingungen, unter denen die Ribosonde spezifisch mit HCV- und nicht mit Nicht-HCV-Nukleinsäure hybridisiert;

(d) Nachweisen von Proben, in denen eine Hybridisierung als Hinweis auf die Gegenwart von HCV in den Proben aufgetreten ist; und

(e) Diagnostizieren der HCV-Infektion in den Patienten oder Tieren durch die Gegenwart von HCV in der Probe.

19. Verfahren gemäß Anspruch 18, worin der 5-nicht- kodierende Bereich des HCV-Genoms zu wenigstens 90% zwischen HCV-Stämmen konserviert ist.

20. Verfahren gemäß Anspruch 18 oder 19, worin die Ribosonde Nukleinsäure umfaßt, die vollständig komplementär zu wenigstens 20 aufeinanderfolgenden Nukleotiden innerhalb der Nukleotide 7-248 des HCV-Genoms ist.

21. Verfahren gemäß Anspruch 18 oder 19, worin die Ribosonde Nukleinsäure umfaßt, die zu wenigstens 90% komplementär, gegebenenfalls zu wenigstens 95% komplementär zu 20 aufeinanderfolgenden Nukleotiden im 5'-nicht-kodierenden Bereich des HC-J1-Stammes von HCV ist.

22. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 18 bis 21, worin die Hybridisierung des Schrittes (c) eine solche durch ein Verfahren ist, das ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Slot-Hybridisierung und Northern-Hybridisierung besteht.

23. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 18 bis 21, worin die Einrichtung zum Nachweis der Hybridisierung eine solche durch Bereitstellen der Ribosonde mit angebrachtem Marker ist, worin der Marker optional ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Fluoreszenzmarkern, Enzymmarkern und Radioaktivität besteht.

24. Verfahren zur Überwachung einer Anti-HCV-Therapie durch Nachweis der Gegenwart und relativen Menge von HCV in biologischen Proben zu unterschiedlichen Zeitpunkten, worin die biologischen Proben ausgewählt sind aus der Gruppe, die aus Blut, Sekreten, Zellen, Geweben oder Organen von HCV-infizierten Patienten und Tieren besteht, und worin das HCV nicht in vitro vermehrt wird, umfassend

(a) Bereitstellen der biologischen Proben zu verschiedenen Punkten vor, während und nach Verabreichung der Therapie;

(c) Hybridisieren der Proben mit der Ribosonde;

(d) Nachweis von Proben, in denen eine Hybridisierung aufgetreten ist;

(e) Quantifizieren der Menge von HCV-RNA, die in jeder Probe vorhanden ist, in der eine Hybridisierung nachgewiesen wird; und

(f) Vergleichen der Ergebnisse von Schritt (e) von wenigstens zwei beliebigen Proben, die zu unterschiedlichen Punkten vor, während oder nach der Verabreichung der Therapie genommen wurden.

25. Verfahren gemäß Anspruch 24, worin der 5'-nichtkodierende Bereich des HCV-Genoms zu wenigstens 90% zwischen HCV-Stämmen konserviert ist.

26. Verfahren gemäß Anspruch 24 oder 25, worin die Ribosonde Nukleinsäure umfaßt, die vollständig komplementär zu wenigstens 20 aufeinanderfolgenden Nukleotiden innerhalb der Nukleotide 7-248 des HCV-Genoms ist.

27. Verfahren gemäß Anspruch 24 oder 25, worin die Ribosonde Nukleinsäure-Sequenz umfaßt, die zu wenigstens 90% komplementär, gegebenenfalls zu wenigstens 95% komplementär zu 20 Nukleotiden im 5'-nicht-kodierenden Bereich des HC-J1-Stamms von HCV ist.

28. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 24 bis 27, worin die Hybridisierung des Schrittes (c) durch ein Verfahren erfolgt, das ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Slot-Hybridisierung und Northern-Hybridisierung besteht.

29. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 24 bis 27, worin die Einrichtung zum Nachweis der Hybridisierung eine solche durch Bereitstellen der Ribosonde mit angebrachtem Marker ist, worin der Marker optional ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Fluoreszenzmarkern, Enzymmarkern und Radioaktivität besteht.

30. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 24 bis 27, worin die Quantifizierung erfolgt durch Vergleich des Maßes an Hybridisierung in der Probe mit dem Maß an Hybridisierung in Standardlösungen, die bekannte Mengen von HCV-RNA enthalten.