Gebiet der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung betrifft eine fungistatische
Zusammensetzung mit einer Endoglycosidase vom Typ II sowie
einer Peroxidase, wie auch ein fungistatisches Verfahren
unter Verwendung einer solchen Zusammensetzung.
Hintergrund der Erfindung
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Früchte, Gemüse und Pflanzen unterliegen alle dem Angriff
durch Pilze, was zu einem Ertragsverlust führt, zu einer
verminderten Lebensdauer von Produkten und schließlich zu
höheren Kosten für den Verbraucher. Viele Pilze sind bekannte
Krankheitserreger in mehreren Krankheiten, welche Ernten weltweit
beeinträchtigen oder zerstören. Zu Beispielen von solchen
Pilzen gehören, ohne daß eine Beschränkung hierauf erfolgt,
Penicillium italicum, Penicillium expansum, Penicillium digitatum,
Diplodia natalenses, Botrytis cinerea, Monilinia fructicola,
Rhizophus stulonifer sowie Rhizopus nigricans. Diese Pilze
greifen solche Produkte an, wie Zitrusfrüchte, Äpfel, Kirschen,
Erdbeeren, Nektarinen, Pfirsiche usw.
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Ein besonders schädlicher Pilz ist Botrytis cinerea, der zu
einer Grauschimmelfäule im Falle von Früchten, wie
Zitrusfrüchten, Äpfeln, Weintrauben, Birnen, Erdbeeren und Kirschen, führt.
Der Grauschimmel oder die Fruchtfäule ist eine weitverbreitete
Krankheit, die zu schweren Ernteverlusten führt. Die Fäule kann
auf dem Feld eintreten, doch können latente Infektionen nicht
sichtbar werden, bis die Frucht geerntet worden ist, was zu
einer verminderten Lagerungsfähigkeit, Versendbarkeit und
Lebensdauer der erhaltenen Produkte führt. Es besteht ein
Bedürfnis zur Entwicklung von antifungalen Mitteln, die gegen
viele Pilze eingesetzt werden können, insbesondere Botrytis,
wobei ein solches Mittel zu verwenden ist als Vor- oder Nach-
Erntebehandlungsmittel für Früchte, die einer solchen Infektion
unterliegen.
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Die EP-A-0 184 288 beschreibt die Verwendung von Enzymen, die
eine schützende oder tragende Komponente eines Zielorganismus
in Herbiziden, Insektiziden oder fungiziden Zusammensetzungen
abzubauen vermag.
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Die WO 91/06312 beschreibt ein Verfahren zum Schutze von
geernteten Früchten gegenüber Krankheitserregern, bei dem man
auf die geernteten Früchte und auf die hierauf vorliegenden
Krankheitserreger eine Verbindung aufbringt, die einen
aktiven Oligomer-Elicitor in der Frucht oder dem Krankheitserreger
zu erzeugen vermag. Die Verbindung wird mit einem
Penetrierungsmittel aufgebracht, das den Eintritt der Verbindung in die
Epidermisschicht der geernteten Frucht oder des Krankheitserregers
unterstützt.
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Die WO 91/06313 beschreibt ein Verfahren zum Schutze einer
wachsenden Frucht gegenüber Krankheitserregern, bei dem man auf
die wachsende Frucht und einen Krankheitserreger, der sich
hierauf befindet, eine Verbindung aufbringt, die einen aktiven
Oligomer-Elicitor in der Frucht oder dem Krankheitserreger zu
erzeugen vermag.
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Die EP-A-0 425 019 beschreibt antimikrobische
Zusammensetzungen mit Endo-β-N-acetylglucoseaminidase und/oder
Endoglycopeptidase sowie Wiederkäuer-Magen-Lysozym.
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Die JP 54 073 182 (Derwent Abstract 79-537128/29) beschreibt
ein Verfahren zur Herstellung eines bakteriolytischen Enzyms
mit einem breiten bakteriolytischen Spektrum, und ist
geeignet als Nahrungsmittel-Antiseptikum, Pflanzenpestizid usw.,
durch Kultivierung von Bakterien, die zum Bazillus-Genus
gehören und dazu befähigt sind, β-1,3-Glucanase, Protease und
Lysozym-analoge bakteriolytische Enzyme zu erzeugen.
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Infolgedessen ist es ein Ziel dieser Erfindung, antifungale
Mittel bereitzustellen, die gegen eine Vielzahl von fungalen
Krankheitserregern eingesetzt werden können. Ein anderes Ziel
dieser Erfindung besteht in der Bereitstellung von
fungistatischen Mitteln, die gegen Botrytis eingesetzt werden können.
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Weiterhin besteht ein anderes Ziel dieser Erfindung in der
Bereitstellung von Verfahren der Verwendung solcher
fungistatischer Mittel.
Zusammenfassung der Erfindung
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Bereitgestellt wird eine fungistatische Zusammensetzung für die
Inhibierung des Pilzwachstums mit (a) einer Endoglycosidase vom
Typ II und (b) einer Peroxidase, sowie ein fungistatisches
Verfahren unter Verwendung dieser Zusammensetzung. Gemäß einem
Aspekt der Erfindung dienen die fungistatische Zusammensetzung und
das Verfahren zur Inhibierung oder Verzögerung des fungalen
Wachstums. Das Inhibierungsverfahren umfaßt das Kontaktieren einer
Frucht oder Ernte, die mit einem Pilz infiziert ist, wie zum
Beispiel Botrytis, mit einer fungistatisch wirksamen
Konzentration von Endoglycosidase vom Typ II und Peroxidase. Das
Verfahren zur Behandlung von Pflanzen, Früchten oder Gemüsen umfaßt
das Kontaktieren, entweder vor oder nach der Ernte, der
Oberfläche von solchen Früchten mit einer wirksamen Menge von solchen
fungistatischen Enzymen. Auch bereitgestellt werden
fungistatische Zusammensetzungen mit einer oder mehreren von (a) und oder
mehreren Endoglycosidasen vom Typ II, (b) einer oder mehreren
von (b) in einem landwirtschaftlich akzeptablen Träger.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
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Zu den fungistatischen Enzymen, die im Rahmen der vorliegenden
Erfindung geeignet sind, gehören drei Klassen von Enzymen.
Endoglycosidasen vom Typ II
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Die Endoglycosidasen vom Typ II, die im Rahmen der
vorliegenden Erfindung geeignet sind, stellen eine Kategorie von
Endoglycosidasen dar, die spezifische innere glycosidische
Bindungen aufzuspalten vermögen, die sich in Glycoproteinen finden.
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Die bevorzugten Endoglycosidasen vom Typ II der vorliegenden
Erfindung werden ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus
Endo-β-N-acetylglucosaminidase ("Endo") H, D, F und L sowie
Endoglycopeptidasen, wie zum Beispiel PNGase F. Diese Enzyme
werden vollständig beschrieben in der mitübertragenen
EPO-Publikation 0 425 016, der EPO-Publikation 0 425 017 und der EPO-
Publikation 0 425 018, wobei auf die Offenbarungen dieser
Publikationen hier Bezug genommen wird.
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Einige bekannte Endoglycosidasen vom Typ II sind in Tabelle I
gemeinsam mit dem natürlichen biologischen Ursprung von
solchen Enzymen aufgelistet. Eine Endoglycosidase vom Typ II, die
nicht in Tabelle I aufgeführt ist, ist die Endoglycopeptidase
Glycopeptidase F, die gelegentlich auch als Pngase F bezeichnet
wird. Pngase F kann erhalten werden von dem Flavobacterium
meningosepticum. Sie ist ferner im Handel erhältlich von der Firma
Boehringer Mannheim Biochemical, Indianapolis, IN. und Genzyme,
Boston, MA.
TABELLE I
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Die vorliegende Erfindung ist nicht beschränkt auf die zum
gegenwärtigen Zeitpunkt bekannte Spezifizität von
Endoglycosidasen vom Typ II. Bis vor kurzem waren die Endoglycosidasen,
die im Handel zur Verfügung standen, teuer aufgrund ihres
relativ niedrigen Expressionsgrades in ihren natürlich
vorkommenden Lieferanten. Infolgedessen ist die Reaktivität von
solchen Enzymen nicht gründlich untersucht worden. Mit den
Fortschritten auf dem Gebiet der Molekularbiologie jedoch sowie
der Gen-Klonierung wurden größere Mengen an Endoglycosidasen
verfügbar gemacht oder werden verfügbar gemacht werden.
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Endoglycosidasen vom Typ II, die erfindungsgemäß verwendet
werden, können erhalten werden von Organismen, die in Tabelle I
aufgelistet sind, und zwar nach Verfahren, die dem Fachmann
bekannt sind. Einige der Endoglycosidasen vom Typ II in
Tabelle 1, zum Beispiel Endo-H von Streptomyces plicatus
(ursprünglich klassifiziert als Streptomyces griseus) und erzeugt in
S. plicatus oder S. lividans und Endo-D von Diplococcus
pneumoniae, sind im Handel von der Firma Boehringer Mannheim
Biochemical, Indianapolis, IN. erhältlich. Zusätzlich zu den im
Handel zur Verfügung stehenden Präparaten kann Endo-H abgeleitet
werden von E. coli, transformiert mit einem Plasmid, das das
Endo-H-Gen von Streptomyces plicatus encodiert und dem Promoter
von alkalischer Phosphatase (Oka, T., und Mitarbeiter, (1985)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 7212-7216) nach Methoden, die
ähnlich sind jenen, die veröffentlicht wurden für die
Klonierung und Expression von Endo-H von Streptomyces plicatus in
E. coli (Robbins und Mitarbeiter, (1981) J. Biol. Chem. 256;
10 640). Verwiesen wird ferner auf Trumbly, R.J. und
Mitarbeiter (1985) J. Biol. Chem., 260, 5638. Endo-H kann ferner
abgeleitet werden von Streptomyces-Zellen, die so verändert wurden,
daß sie Endo-H, abgeleitet von Streptomyces plicatus,
exprimieren (EPO-Veröffentlichung Nr. 0 179 449, 30. April 1986).
Alternativ kann Endo-H von jeder geeigneten Wirtszelle produziert
werden, wie zum Beispiel Bacillus subtilis, unter Anwendung von
Methoden, die dem Fachmann bekannt sind. Die Aminosäure- und
DNA-Sequenzen von Endo-H für S. plicatus (S. griseus) sind
publiziert worden. Robbins, P.W. und Mitarbeiter (1984) J. Biol.
Chem., 259, 7577-7583.
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Die hier in den Beispielen verwendeten Endo-H wurde erhalten
von E. coli- oder B. subtilis-Wirten, die transformiert wurden,
um Endo-H von S. plicatus zu exprimieren.
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Eine Einheit der Endo-H-Aktivität ist die Menge des Enzyms, die
erforderlich ist, um 1µMol von (³H)-Dansyl-Asn-Glcnac von (³H)-
Dansyl-Asn-(GICNAC)4(Man)6 bei einem pH-Wert von 5,5 bei 37ºC
in einer Minute freizusetzen. Tarentino, A. und Mitarbeiter
(1978) Methods in Enzymology, 50, 574. Die Einheiten-Aktivität
von anderen Endoglycosidasen vom Typ II, einschließlich
Endoglycopeptidasen, ist im Falle eines geeigneten Substrates
ähnlich definiert.
Peroxidasen
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Peroxidasen, wie zum Beispiel Ligninperoxidase (LiP) und
Mangan (II)peroxidase (MnP), isoliert aus Phanerochaete
chrysosponum sind ausgiebig bezüglich ihrer Rolle bei dem biologischen
Ligninabbau untersucht worden. H.E. Schoemaker, und
Mitarbeiter, Journal of Biotechnology, 13 (1990) 101-109. Aufgrund
dieser Aktivität wurden diese Enzyme als geeignet für
kommerzielle Bleich- und Biopulping-Prozesse vorgeschlagen. Schoemaker,
und Mitarbeiter (supra).
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Viele Mikroorganismen erzeugen Lignin abbauende Enzyme. Enzyme
von Streptomyces viridosporus, Phanerochete chrysoporium und
Trametes (Coriolus) versicolor sind ausgiebig untersucht
worden. P. chrysoporium und T. versicolor erzeugen zwei
Häm-Proteine mit Peroxidase-Aktivitäten. Ein Enzym ist abhängig von
Mangan (II) und wird als Mangan (II) Peroxidase (MnP)
bezeichnet. Das andere wird allgemein als Ligninperoxidase bezeichnet.
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Überraschenderweise wurde gefunden, daß diese Peroxidasen
einen fungistatischen Effekt aufweisen, insbesondere gegenüber
dem Wachstum von Botrytis. Der Wirkungsmechanismus einer
solchen fungistatischen Aktivität ist noch nicht voll geklärt.
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Zu Peroxidasen, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung
geeignet sind, gehören, ohne daß eine Beschränkung hierauf
erfolgt, Peroxidasen, die isoliert wurden von dem Weiß-Fäulnis-
Pilz Phanerochaete chrysosponum, Streptomyces viridosporus
oder Trametes (Coriolus) versicolor, wie auch
Meerrettich-Peroxidase, die im Handel erhältlich ist von Sigma.
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Die in den Beispielen hier verwendete MnP (ohne LiP-Aktivität)
wurde erhalten durch Fermentation von Phanerochete chrysoporium.
Das Das Enzym in der Brühe wird in Polyethylenglykol
(PEG)fraktionen extrahiert (PEG gesättigt mit Wasser).
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Die hier beschriebenen Zusammensetzungen können in einer
Vielzahl von physikalischen Formen hergestellt werden,
einschließlich Flüssigkeiten, Gelen, Pasten und festen Teilchen, wie zum
Beispiel Pulvern und Granulaten. Die Zusammensetzungen können
hergestellt werden nach Verfahren, wie sie dem Fachmann auf dem
Gebiet der Herstellung landwirtschaftlicher Präparate bekannt
sind, und diese können enthalten oberflächenaktive Stoffe,
Bindemittel, Puffer, Enzym-Stabilisatoren oder solche anderen
Additive, die dem Fachmann bekannt sind. Zu bekannten Trägerstoffen
gehören oberflächenaktive Mittel, wie zum Beispiel Triton X 100,
das im Handel erhältlich ist von den Firmen Rohm-Haas oder Sigma,
und Puffersysteme mit Natriumacetat. Der pH-Wert der
Zusammensetzungen hängt von dem optimalen pH-Wert für das Enzym ab,
wobei die Zusammensetzungen vorzugsweise einen pH-Wert +/- 1 pH
Einheit von der optimalen Enzym-Leistung aufweisen. Somit haben
die Zusammensetzungen vorzugsweise einen pH-Wert von etwa 3 bis
11, in besonders vorteilhafter Weise von etwa 4 bis 8, bei einer
guten Enzym-Leistung, wobei darauf hinzuweisen ist, daß eine
optimale Enzym-Leistung ein Faktor sein kann, der davon abhängt,
welches Substrat das Enzym hydrolysiert.
Endoglycosidase und Peroxidase
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Von den Endoglycosidasen vom Typ II sind
Endo-β-N-acetylglucosaminidasen H, D, F und L sowie Endoglycopeptidase,
Pngase F, bevorzugt verwendete Präparate zur Herstellung von
fungistatischen Zusammensetzungen und für die Verwendung im
Rahmen der fungistatischen Verfahren. Am meisten bevorzugt
wird Endo-H verwendet. Die bevorzugte Peroxidase der
vorliegenden Erfindung ist MnP.
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In der fungistatischen Zusammensetzung, die ein oder mehrere
Endoglycosidasen vom Typ II und eine oder mehrere Peroxidasen
umfaßt, liegt jede der Komponenten in einer Konzentration vor,
die ausreicht, um einen fungistatischen Effekt herbeizuführen.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform ist eine solche
Kombination, die verwendet wird für die Behandlung von Früchten,
die mit Botrytis infiziert sind.
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Der hier gebrauchte Ausdruck "fungistatischer Effekt" schließt
ein die Inhibierung oder die Verzögerung des Wachstums, eine
Veränderung in der Gesamt-Morphologie, eine
Protoplastenbildung und/oder einen Abbau der Zellwände eines Pilzes bei
Kontakt mit einer Endoglycosidase vom Typ II sowie einer
Peroxidase.
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Der hier gebrauchte Ausdruck "fungistatisches Verfahren"
bezieht sich auf ein Verfahren, das einen fungistatischen Effekt
herbeiführt. Gemäß einem Aspekt der Erfindung verursacht das
fungistatische Verfahren die Inhibierung oder die Verzögerung
von Pilzwachstum und/oder Veränderungen in der
Gesamt-Morphologie des Pilzes.
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Die vorliegenden fungistatischen Zusammensetzungen können in
Form eines Vor- oder Nach-Ernteschutzes von Früchten
verwendet werden. Vor-Ernte-Zusammensetzungen, die auf Früchte für
eine Pilzkontrolle aufgebracht werden, können sich in Form
einer Lösung befinden, die auf die Früchte nach aus dem
Stande der Technik bekannten Methoden aufgebracht wird,
beispielsweise durch Aufsprühen. Nach-Ernte-Zusammensetzungen,
die auf Pflanzen, Früchte oder Gemüse zur Pilzkontrolle
aufgebracht werden, können aufgetragen werden durch Bäder, durch
Brausen, durch Aufsprühen oder durch Wachse auf solche
Pflanzen, Früchte oder Gemüse, wie es dem Fachmann bekannt ist.
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Beispiele für Pilzkrankheiten und ihre Wirte sind in Tabelle II
angegeben.
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Die Enzyme, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung
geeignet sind, können aktiv sein gegenüber beliebigen der
aufgelisteten fungalen Krankheitserreger zusätzlich zu anderen
fungalen Krankheitserregern, die nicht aufgelistet sind. Die hier
erfolgte Beschreibung soll nicht in irgendeiner Weise
bezüglich des Bereiches der fungistatischen Aktivität von
Endoglycosidasen, Peroxidasen und/oder Chitinasen, die allein oder in
Verbindung miteinander verwendet werden, begrenzend sein.
TABELLE II
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Zusätzlich ist bekannt, daß fungale Krankheitserreger die
ursächlichen Mittel im Falle mehrerer anderer Vor- und
Nach-Erntekrankheiten in Früchten und Gemüsen sind. Eine Diskussion von
bestimmten solcher Krankheitszustände ist im folgenden
angegeben, wobei darauf hinzuweisen ist, daß die vorliegende
Erfindung nicht beschränkt ist auf die fungalen Krankheitserreger
und/oder speziellen Früchte, Gemüse oder Pflanzen, die im
folgenden diskutiert werden.
Tomaten und Kartoffeln
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Der gefährlichste foliare Krankheitserreger von
Gewächshaustomaten ist der Blattschimmel, der von Cladosporium fulva
hervorgerufen wird. Dieser Blattschimmel hat eine starke
Verbreitung
gefunden und es wurde von schwerwiegenden Verlusten
berichtet nach dem Ausbruch im Falle von Feldfrüchten in
tropischen und subtropischen Gegenden.
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Tomaten und Kartoffeln sind empfänglich für den frühen
Mehltau, der hervorgerufen wird von Alternaria solani.
Schwerwiegende Infektionen können zu einer Entblätterung führen, zu
einer Dolden- (truss)Verkümmerung und zu der Entwicklung von
Schwarzschimmel auf sich entwickelnden Früchten. Der späte
Mehltau wird verursacht von Phytophthora infestans, wobei es
sich ebenfalls um ein Hauptproblem im Falle von Kartoffeln
handelt. Phytophthora spp führt zu einem Bereich von Symptomen
auf Tomaten einschließlich einer Abdämpfung, von Wurzel- und
Fußfäule, zu einer Fruchtfäule und zu Stamm- oder
Stengel-Infektionen.
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Anthrakose, Colletotrichum coccoides, ist ein Hauptproblem bei
Tomaten weltweit und erzeugt ebenfalls einen Bereich von
Symptomen, wozu gehören schwarze Punkte, eine Frucht-Anthrakose,
sowie eine Stamm- und Wurzelfäule. Anthrakose ist
hauptsächlich ein Problem im Falle auf dem Felde gezüchteter Tomaten,
kann jedoch auch auftreten im Falle von schlecht behandelten
geschützten Früchten.
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Eine Fusarium-Verwelkung wird durch Fusarium lycopersici
verursacht und ist am destruktivsten im warmen Klima und warmen
Sandböden in gemäßigten Regionen. Obgleich primär ein
Krankheitserreger im Falle von auf dem Feld gezüchteten Tomaten, können
starke Verluste auch im Falle geschützter Früchte auftreten.
Eine Infektion mit dem Krankheitserreger führt zu einem
starken Verwelken und zu einem Chloroplasten-Abbau, was zum Tode
der Pflanze führt. Verticillium alboatrum kann ebenfalls
ähnliche Symptome herbeiführen, doch entwickelt sich die Krankheit
langsamer und verursacht eine Verkümmerung und eine Verminderung
der Ausbeute anstatt des Todes der Pflanze.
Steinfrüchte
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Steinfrüchte, wozu Pfirsiche, Pflaumen, Aprikosen und
Kirschen gehören, wachsen in den gemäßigten und subtropischen
Regionen der Welt. Eine Anzahl von fungalen Krankheiten kann
zu beträchtlichen Verlusten führen, sowohl auf dem Feld wie
auch im Falle geernteter Früchte.
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Braunfäule wird verursacht von Monilinia fructicola und tritt
auf im Falle von Pfirsichen, Kirschen, Pflaumen und Aprikosen
mit gleicher Stärke. Verluste treten im Falle der meisten
Regionen, in denen Steinfrüchte wachsen, auf, wo starke
Regenfälle während der Reifungsperiode der Früchte stattfinden.
Diese Verluste bestehen primär in einer Fäulnis der Frucht im
Obstgarten, obgleich schwerwiegende Verluste auch während des
Transportes und beim Vertrieb auftreten. Auch können die
Ausbeuten durch Zerstörung der Blüten vermindert werden. Im Falle
von schwerwiegenden Infektionen und in Abwesenheit von guten
Kontrollmaßnahmen können 50 bis 75 % der Früchte am Baum
verfaulen und der Rest kann infiziert werden, bevor er den Markt
erreicht.
Weintrauben
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Weintrauben werden durch vier hauptsächliche fungale
Krankheiten beeinträchtigt, die sich in sämtlichen Weintrauben
erzeugenden Gegenden finden und diese Krankheiten können ein
wesentliches Produktionsproblem sein.
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Pulveriger Mehltau, Uncinula necator, infiziert ebenfalls die
Roßkastanie und die Linde und ist augenblicklich ein
Hauptproblem in Argentinien, Brasilien, Chile und in der Türkei. Stark
befallene junge Blätter werden zerstört und entfärbt, und
werden Blumen infiziert, so setzen diese keine Früchte an. Die
Entwicklung der Krankheit wird begünstigt durch trockene
Bedingungen und ist zur Zeit die nachteiligste Krankheit im Falle von
Weintrauben in Kalifornien. Die Krankheit breitet sich auf dem
Luftwege durch Konidiosporen aus, überwintert jedoch entweder
auf infiziertem Material oder in Form von Sporen im Boden.
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Flaumiger Mehltau, Plasmopara viticola, ist sehr destruktiv
in Europa und in dem Osten der USA und führt zu
Ertragsverlusten von bis zu 75 %, falls keine Behandlung erfolgt. Die
Gefährlichkeit dieses Krankheitserregers in einer Gegend oder
während einer Jahreszeit hängt von der Feuchtigkeit und der
Häufigkeit/Dauer des Sommerregens oder der Schwere der
Feuchtigkeit ab.
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Obgleich verschiedene Spezies von Pilzen zu einer Fruchtfäule
führen können, ist der graue Schimmel, verursacht von Botrytis
cinerea, der gefährlichste. Schäden können auftreten im Falle
von reifen Trauben auf dem Feld oder bei der Verschiffung. Der
Krankheitserreger ist bei niedrigen Temperaturen aktiv und kann
beträchtliche Verluste an den geernteten Früchten herbeiführen,
die im Kalten aufbewahrt werden. Die Infektion findet im
allgemeinen während der Blüte statt, doch bleiben die Poren latent,
bis die Frucht beginnt zu reifen. Freie Feuchtigkeit auf der
Fruchtoberfläche durch Regen oder im Falle von Risse
aufweisenden Beeren ist extrem förderlich für das Wachstum und die
Entwicklung des Krankheitserregers.
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Der Fungus Guignardia bidwellii ist vorhanden in Europa,
Kanada und in den USA. Es ist wahrscheinlich die gefährlichste
Krankheit von Trauben, wo immer sie auftritt, insbesondere in
warmen, feuchten Regionen. In Abwesenheit einer wirksamen
Überwachung können die Früchte total zerstört werden, entweder
durch direkte Fäulnis der Beeren oder durch Vernichtung der
Blütentrauben. Eine Infektion über Ascosporen und
Konidiosporen erfolgt während des Frühlings und Sommers, wobei eine
Verbreitung und nachfolgende Infektion durch freie Feuchtigkeit
begünstigt wird. Der Krankheitserreger erzeugt zahlreiche rote
necrotische Flecken auf jungen Blättern, die das Inoculum für
die sekundären Infektionen von Beeren und Stengeln liefern.
Erdnüsse
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Nußkernverluste durch sämtliche Krankheiten werden auf
ungefähr 20 % der gesamten Ernte geschätzt. Die Verluste sind
selten quantifiziert worden, jedoch hauptsächlich aufgrund
fehlender Informationen der Effekte von speziellen
Krankheitserregern auf Flächenbasis. Blattflecken, verursacht durch
Cercospora arachidicola ist eine weit verbreitete Krankheit,
deren Entwicklung begünstigt wird durch warme und feuchte
Bedingungen. Schwerwiegende Infektionen können zu einer totalen
Entblätterung der Pflanze führen.
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Sclerotinia sclerotiorum verursacht eine Stengel- oder
Stammfäule und ist von großer ökonomischer Bedeutung in den USA,
wo geschätzt wird, daß Blattflecken und Stengelfäule zusammen
über 50 % sämtlicher Verluste ausmachen, die auf Erkrankungen
von Erdnüssen zurückzuführen sind.
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Rost wird durch Puccinia arachidis hervorgerufen und scheint
von steigender Bedeutung in Indien und Afrika zu sein. Die
Entwicklung dieser Krankheit wird begünstigt durch warme, feuchte
Bedingungen und Pflanzen können vollständig entblättert werden
und als Folge von schweren Infektionen sterben. Rost beschränkt
gegenwärtig die Erdnußproduktion in Zentralamerika und auf den
karibischen Inseln.
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Sämlings-Fäule ist die hauptsächliche Ursache von lückenhaften
Beständen und Aspergillus spp findet sich in allen Erdnuß
erzeugenden Ländern. Aspergillus flavus infiziert gelagerte Samen
und erzeugt Aflatoxin, das sich fatal auswirkt, wenn es von den
Menschen aufgenommen wird oder in Form eines gepreßten Kuchens
an Rinder und Geflügel verfüttert wird.
Äpfel und Birnen
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Äpfel sind besonders empfindlich gegenüber einem fungalen
Angriff in sämtlichen produzierenden Ländern. Schorf, verursacht
durch Venturia inaegualis, ist die wichtigste und weit
verbreitetste
Krankheit von Äpfeln und stellt gegenwärtig ein
Hauptproblem in Europa und Nordamerika dar. Starke Infektionen
führen zu einer Verminderung des Photosynthese-Bereiches, zu
einer ausgiebigen Entblätterung und zu einer verminderten
Fruchtknospenentwicklung. Falls nicht überwacht, können die
Verluste durch Apfelschorf in stark infizierten Obstgärten bei
mehr als 70 % des gesamten Ernteertrages liegen. Doch variiert
der Grad der Krankheit von Jahr zu Jahr, wobei warme, feuchte
Frühlinge die Krankheitsentwicklung von Sporen begünstigen,
die auf dem Boden des Obstgartens überwintert haben.
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Der pulverige Mehltau wird verursacht durch Podosphaera
leucotricha und kann unter Bedingungen, welche die Entwicklung der
Krankheitserreger begünstigen, so schädlich sein wie Schorf,
wobei hauptsächlich junge Zweige und Blätter angegriffen
werden.
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Neu gepflanzte Bäume in Obstgärten bilden sich oftmals nicht
gut aus. Die kausalen Mittel dieser "Neuanpflanzungs-Krankheit"
sind noch nicht voll geklärt worden, doch wird in Großbritannien
angenommen, daß Phythium spp involviert ist, während in der
Tschechoslowakei andere Mikroorganismen als Ursache angenommen
werden.
Erdbeeren
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Erdbeeren sind Früchte von hohem Wert, die über ganz Europa
und in Nordamerika angebaut werden und die empfänglich für
eine Anzahl von potentiell vernichtenden Krankheiten sind.
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Grauschimmel/Fruchtfäule wird verursacht durch Botrytis cinerea
und ist eine weit verbreitete Krankheit, die zu schwerwiegenden
Verlusten an Ernteerträgen in feuchten Jahreszeiten führt. Die
Fäule kann auf dem Feld auftreten, doch können latente
Infektionen nicht sichtbar werden, bevor die Frucht geerntet worden
ist. Die Weichfäule, hervorgerufen durch Rhizopus sp, ist eine
Hauptursache von Ernteverlusten, insbesondere bei der Lagerung
und beim Transport. Sind die Bedingungen günstig, so kann sich
die Krankheit rasch in den Aufbewahrungsbehältern ausbreiten
und die Verluste können innerhalb einer sehr kurzen Zeitspanne
sehr hoch sein.
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Mehltau, Sphaerotheca macularis, ist besonders schädlich im
Falle von geschützten Früchten, wobei sowohl Blätter als auch
sich entwickelnde Früchte beeinträchtigt werden, die nicht
verkäuflich sein können.
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Das ursächliche Mittel der Verwelkung, Verticillium dahliae,
ist in Böden weit verbreitet, doch treten schwerwiegende
Symptome lediglich an einzelnen Stellen auf, insbesondere
aufleichten Böden. Eine Infektion führt zu einer Verwelkung und dem Tod
und ist am schwerwiegendsten in Gegenden, wo nachteilige
Bodenbedingungen die Entwicklung der Verwelkung begünstigen.
EXPERIMENTELLER TEIL
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Das folgende wird anhand eines Beispieles lediglich dargestellt
und ist nicht im Sinne einer Begrenzung des Bereiches der
Erfindung zu verstehen.
Fernbach-Protokoll
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Die Beispiele 1-6 wurden durchgeführt unter Verwendung des
Fernbach-Protokolls, wie es hier angegeben ist. Frische Erdbeeren
( 24 Stunden nach dem Pflücken) wurden von einem lokalen Markt
erhalten. In einem sterilen Abzug wurden die Erdbeeren in 70 ml
einer Testlösung getaucht (unter Verwendung eines 100 ml Bechers).
Die Testlösungen, die im Falle eines jeden Experimentes
verwendet wurden, sind in jedem Beispiel angegeben. Jede Erdbeere wurde
10 mal eingetaucht. Es wurde darauf geachtet, daß die gesamte
Erdbeere, einschließlich des Kelches, befeuchtet wurde. Die
Erdbeeren wurden ungefähr 5 Minuten lang auf einem absorbierenden
Papiertuch in einer sterilen Haube mit eingeschaltetem Gebläse
trocknen gelassen. Nach 5 Minuten wurden die Erdbeeren in einen
sterilen Fernbach-Kolben gebracht, der mit einem sterilen
Baumwollstöpsel abgedeckt wurde, worauf bei 15ºC inkubiert wurde. Die
Erdbeeren wurden derart in den Fembach-Kolben gebracht, daß le
diglich eine Schicht von Erdbeeren gebildet wurde, wobei sich
sämtliche Erdbeeren berührten. Nach einer Inkubationsdauer
von 3 Tagen wurden die Kolben durch Untersuchungspersonen
bezüglich des Grades der fungalen Verunreinigung bewertet.
BEISPIEL 1 (Vergleichsbeispiel)
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Es wurden die folgenden Bedingungen im Falle frischer
Erdbeeren getestet:
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A) Keine Behandlung - Vergleich.
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B) Pufferlösung Vergleich: 1:20 Verdünnung von 10 mM TES,
85 mM NaCl, pH-Wert 7f0 Puffer (Puffer für Enzym-Vorrat).
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C) Enzym-Behandlungslösung: 1:20 Verdünnung von Endo-H-Enzym-
Vorrat einschließlich Antifungus-Komponente (in 10 mM TES,
85 mM NaCl, pH-Wert 7,0 Puffer). Endgültige aktive
Enzymkonzentration 140 ppm Endo-H.
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D) Antifungus-Komponentenlösung: 1:20 Verdünnung (in
destilliertem Wasser) der Antifungus-Komponente, isoliert von
dem Enzym-Vorrat).
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Die Erdbeeren wurden über Nacht inkubiert.
Untersuchungspersonen bewerteten D am besten, d.h. mit dem geringsten Grad an
fungalem Wachstum. Die Ergebnisse dieses Versuches,
betrachtet im Licht der Ergebnisse der folgenden Experimente, die
unten im Detail wiedergegeben sind, legen nahe, daß der
PufferpH-Wert (7,0) für das Enzym nicht optimal war und daß somit
die Antifungus-Komponente oben zu den besten Ergebnissen führte.
BEISPIEL 2 (Vergleichsbeispiel)
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Aufgrund der Ergebnisse des Beispieles 1 wurde Beispiel 1 mit
zwei Abweichungen wiederholt:
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1) Sämtliche Verdünnungen erfolgten im Puffer: 50 mM
Natriumacetat, 25 mM NaCl, pH-Wert 5,5.
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2) Die Erdbeeren wurden 3 Tage lang bei 15ºC inkubiert.
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Nach einer 3-tägigen Inkubation bewerteten die
Untersuchungspersonen
die Enzym-Behandlungslösung (Behandlung C oben)
als die beste. Nach einer Inkubation von 4 Tagen hatten die
Untersuchungspersonen Schwierigkeiten, zwischen dem
Pufferlösungsvergleich (Behandlung B) und der
Enzym-Behandlungslösung (Behandlung C) zu unterscheiden.
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Da die Endo-H-Behandlung mit der Antifungus-Komponente,
hierin co-gereinigt, besser beurteilt wurde als die Antifungus-
Komponente allein unter optimalen pH-Wertsbedingungen für das
Enzym, wurden die Effekte dem Enzym zugeschrieben und nicht
der Antifungus-Komponente.
BEISPIEL 3 (Vergleichsbeispiel)
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Es wurden die folgenden Behandlungen auffrischen Erdbeeren
getestet:
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A) Unbehandelter Vergleich.
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B) Puffer-Vergleich: 5:14 Verdünnung des Puffers für Enzym-
Vorrat in 10 nM Natriumacetat, pH-Wert 5,2.
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C) Enzym-Behandlung: 5:14 Verdünnung des Endo-H-Vorrats,
einschließlich der Antifungus-Komponente, in 10 mM
Natriumacetat, pH-Wert 5,2 (endgültige Enzymkonzentration 1000 ppm).
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D) Inaktivierte Enzym-Behandlung: 5:14 Verdünnung des Enzym-
Vorrats, 10 Minuten lang aufgekocht in 10 mM Natriumacetat,
pH-Wert 5,2.
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Nach einer 3-tägigen Inkubation zeigte die Enzym-Behandlung
(Behandlung C) kein fungales Wachstum und sämtliche
Untersuchungspersonen wählten die Behandlung C als die beste aus. Das
Enzym zeigte das beste Verhalten bei einem pH-Wert von 5,2 bei
einer Konzentration von 1000 ppm.
BEISPIEL 4 (Vergleichsbeispiel)
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Es wurden die folgenden Behandlungen im Falle frischer
Erdbeeren getestet:
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A) Puffer-Vergleich, 20 mM Natriumacetat, pH-Wert 5,0.
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B) Mangan (II) Peroxidase-Behandlung: 16 ppm (Protein)
lösung in 20 mM Natriumacetat, pH-Wert 5,0.
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Sieben Untersuchungspersonen bewerteten die Erdbeeren.
Sämtliche (7) Untersuchungspersonen bewerteten die MnP-Behandlung
(Behandlung B) als besser gegenüber dem Puffer-Vergleich
(Behandlung A) bezüglich der Zurückdrängung des fungalen
Wachstums auf Erdbeeren.
BEISPIEL 5 (Vergleichsbeispiel)
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Frische Erdbeeren wurden den folgenden Behandlungen
unterworfen:
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A) Keine Behandlung - Vergleich.
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B) Puffer-Vergleich: 10 mM Natriumacetat, pH-Wert 5,0.
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C) 1000 ppm Endo-H (erzeugt in E. coli, ohne jede Antifungus-
Komponente) in Natriumacetat, pH-Wert 5,0 Puffer.
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D) 500 ppm Endo-H (erzeugt in E. coli, ohne jede Antifungus-
Komponente) in Natriumacetat, pH-Wert 5,0 Puffer.
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E) 500 ppm Endo-H (erzeugt in E. coli, ohne jede Antifungus-
Komponente) und 16 ppm Mangan (II) Peroxidase in
Natriumacetat, pH-Wert 5,0 Puffer.
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F) 16 ppm Mangan (II) Peroxidase in Natriumacetat, pH-Wert
5,0 Puffer.
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G) 500 ppm Endo-H (von Bacillus, enthielt antifungales
Molekül) in Natriumacetat, pH-Wert 5,0 Puffer.
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H) 0,01 % Triton X-100 in Natriumacetat, pH-Wert 5,0 Puffer.
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Sieben Untersuchungspersonen bewerteten die Erdbeeren im
Hinblick auf ein fungales Wachstum. Die Erdbeeren mit dem
geringsten fungalen Wachstum wurden als die besten bewertet. Die
Erdbeeren, die mit der Kombination Endo-H und Mangan (II)
Peroxidase (Behandlung E) behandelt worden waren, wurden am besten
bewertet, obgleich Mangan (II) Peroxidase allein oder Endo-H
allein wirksamer waren als keine Behandlung.
Beispiel 6 (Vergleichsbeispiel)
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Bartlet-Kirschen wurden vom lokalen Markt erhalten. Die
Kirschen waren in dem Geschäft mit Chlorwasser gewaschen und
mit Prolidon, DCNA und Mineralöl-Paraffin behandelt worden.
Die Kirschen wurden in die Behandlungslösungen getaucht, die
unten beschrieben werden, und der Versuch wurde durchgeführt
unter Verwendung des zuvor beschriebenen Fernbach-Protokolls.
Jeder Behandlung wurden ungefähr 30 Kirschen unterworfen.
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A) Unbehandelter Vergleich.
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B) Puffer-Vergleich, 10 mM Natriumacetat, pH-Wert 5,0.
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C) 500 ppm Endo-H* in Natriumacetat-Puffer, pH-Wert 5,0.
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D) 500 ppm Endo-H* + 16 ppm Mangan (II) Peroxidase in
Natriumacetat-Puffer pH-Wert 5,0.
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E) 16 ppm Mangan (II) Peroxidase in Natriumacetat-Puffer,
pH-Wert 5,0.
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F) 1000 ppm Endo-H* in Natriumacetat-Puffer, pH-Wert 5,0.
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G) 500 ppm Endo-H* + 12,3 ppm Mais-Chitinase in
Natriumacetat-Puffer, pH-Wert 5,0.
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H) 12,3 ppm Mais-Chitinase in Natriumacetat-Puffer, pH-Wert 5,0.
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*Endo-H-Präparat mit der Antifungus-Komponente.
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Die Kirschen wurden in Gewächskammern 5 Tage lang aufbewahrt
und dann über Nacht bei Raumtemperatur. Die Kirschen waren
schwer zu bewerten, da sie Gegenstand sowohl der braunen Fäule
als auch einer weißen Sporenbildung waren.
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Die durchschnittliche Bewertung der Kirschen durch drei
Untersuchungspersonen war:
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F (beste Bewertung) > C> G> D> B> E> A> H> .
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Beispiel 5 zeigt, daß die Behandlung von Früchten mit der
beanspruchten Zusammensetzung im Vergleich zu den anderen
Behandlungen zu den besten Ergebnissen führt. Weiterhin zeigt die
Zusammensetzung des Beispieles 6 gute Ergebnisse.