DE69119231T2

DE69119231T2 - Verfahren und vorrichtung zur bestimmung von chemischen spezies in körperflüssigkeit

Info

Publication number: DE69119231T2
Application number: DE69119231T
Authority: DE
Inventors: William Miller; Donald Schoendorfer
Original assignee: Sudor Partners
Current assignee: Sudor Partners
Priority date: 1990-08-15
Filing date: 1991-07-24
Publication date: 1996-11-21
Anticipated expiration: 2011-07-25
Also published as: EP0543867A1; WO1992003731A1; US5203327A; CA2088921A1; AU654823B2; EP0543867B1; ATE137583T1; JPH06503875A; DE69119231D1; AU8313791A; JP3017286B2

Description

Verfahren und Vorrichtung zur Bestimmung von chemischen Spezies in Körperflüssigkeit

Die vorliegende Erfindung betrifft Diagnosekits zur Bestimmung der Gegenwart eines oder mehrerer Analyten in einer flüssigen Probe. Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere ein Konzentrierungspflaster für die Haut zur Konzentrierung eines Analyten, der von der Haut in einer leicht meßbaren Menge abgegeben wird.
Die Ermittlung des physiologischen Zustands eines Patienten erfolgt häufig zusammen mit einer chemischen Analyse des Vorhandenseins und/oder der Konzentration von vorherbestimmten chemischen Stoffen in einer Körperflüssigkeit. Diese üblicherweise in der Arztpraxis oder im Krankenhaus durchgeführten Tests können nach Art der Probennahme als invasiv, wie Blutanalysen, oder als nicht-invasiv, wie Urin- und Schweißanalysen, charakterisiert werden.
Blut wird häufig auf eine Vielzahl von Bestandteilen analysiert, und klinische Laboratorien sind üblicherweise mit Geräten ausgestattet, die ein hoch-quantitatives Profil der Blutzusammensetzung liefern. Die Blutentnahme ist jedoch inhärent invasiv und daher in mehrfacher Hinsicht nachteilig. Analysen, die auf einer Blutprobenentnahme beruhen, sind üblicherweise auf die Arztpraxis oder das klinische Labor beschränkt, was ambulant behandelten Patienten Unannehmlichkeiten bereitet und die Kosten stark erhöht. Darüberhinaus können die mit invasiven Verfahren zusammenhängenden Risiken von bestenfalls unerwünscht bis inakzeptabel reichen, je nach Zustand des Patienten und der Natur und Notwendigkeit des durchzuführenden Tests.
Viele interessierende Analyte oder Metabolite können auch im Urin nachgewiesen werden, für den seine ständige Verfügbarkeit und nicht-invasive Gewinnung charakteristisch ist. Eine Urinanalyse ist jedoch, wie nachstehend erläutert, nicht für den Hauptanwendungszweck des erfindungsgemäßen Konzentrierungspflasters geeignet.
Schweiß ist unter bestimmten Bedingungen eine ideale Körperflüssigkeit für Analysen zur Bestimmung des physiologischen Status. Da er nicht-invasiv gewonnen wird, kann er außerhalb der Arztpraxis verwendet werden, und aufgrund seines mit Blut vergleichbaren Gehalts an biologischen Molekülen kann er für ein breites Spektrum von physiologischen Tests verwendet werden.
Daher sind mehrere Diagnosekits zur Überwachung eines Analyten im Schweiß entwickelt worden. US-Patent Nr.3,552,929 von Fields et al. offenbart beispielsweise ein heftpflasterartiges Testpflaster, das besonders für die Bestimmung der Chloridionenkonzentration im Schweiß als ein Diagnoseverfahren für cystische Fibrose geeignet ist. Die von Fields beschriebene Vorrichtung umfaßt ein absorbierendes Schweißsammelpolster mit einer undurchlässigen äußeren Schicht zur Verhinderung der Verdunstung. Nach der Sättigung des absorbierenden Polsters wird das Pflaster von der Haut abgelöst und mit einer Reihe von Streifen in Kontakt gebracht, die mit steigenden Mengen Silberchromat oder -nitrat durchsetzt sind, dessen Farbe sich nach der Umwandlung in das Chloridsalz auf bekannte Weise ändert.
US-Patent Nr. 4,706,676 von Peck offenbart eine Sammelvorrichtung zur Anwendung auf der Haut, die ein Bindemittel zur Verhinderung der Rückwanderung eines Analyten, ein flüssiges Transfermedium, das den Transfer eines Analyten von der Hautoberfläche zum Bindemittel ermöglicht, und eine abschließende Schicht über dem oberen Teil des flüssigen Transfermediums und dem Bindemittel umfaßt.
Peck beschreibt die Verwendung des Sammelpflasters zur Anwendung auf der Haut zum Nachweis einer menschlichen Exponierung gegen verschiedene Umweltchemikalien. Nach dem Tragen der Sammelvorrichtung für die Haut von Patienten auf der Haut über einen bestimmten Zeitraum wird das Pflaster zur Analyse abgelöst. Eine Analyse umfaßt die chemische Trennung der interessierenden gebundenen Substanz von dem bindenden Reservoir und ihre anschließende qualitative und/oder quantitative Bestimmung durch übliche Laborverfahren.
WO 90/02511 offenbart ein Verfahren und eine Vorrichtung zur nicht-invasiven Bestimmung eines oder mehrerer vorherbestimmter Analyte in einer von der Haut abgegebenen Körperflüssigkeit. Die Flüssigkeit wird in einem Konzentrierungspflaster zur Anwendung auf der Haut gesammelt und durch Verdunsten eines Teils der Hauptfraktion des Wassers unter dem Einfluß von Körperwärme konzentriert. Der Analyt wird an einen immobilisierten spezifischen Bindungspartner als Komplex gebunden und die Gegenwart des Analyten sichtbar angezeigt.
Die im Stand der Technik bekannten Pflaster weisen den Nachteil einer oder mehrerer wesentlicher Einschränkungen auf, wenn sie als Diagnosetestpflaster in einer einfachen Reihenuntersuchung verwendet werden sollen. Insbesondere können die im Stand der Technik bekannten Diagnosetestpflaster üblicherweise nur zur Bestimmung der Gegenwart von in relativ hohen Konzentrationen im Schweiß enthaltenen Analyten wie Halogenidionen verwendet werden. Weitere im Stand der Technik bekannte Hautpflaster sind bloße Sammelvorrichtungen, aus denen die Analyte anschließend abgetrennt und konzentriert oder auf andere Weise zur Analyse durch bekannte Laborverfahren gewonnen werden müssen. Die im Stand der Technik bekannten Vorrichtungen mit einer abschließenden äußeren Schicht sind ferner für das Problem der Rückdiffusion des Schweißes und/oder der darin enthaltenen Analyte empfindlich.
Daher bleibt in vielen verschiedenen Anwendungen ein Bedarf nach einem Verfahren und einer Vorrichtung zur nicht-invasiven Bestimmung eines vorherbestimmten Analyten in einer Körperflüssigkeit wie Schweiß, mit dem die Gegenwart von gering konzentrierten Analyten im Schweiß nachgewiesen werden kann, ohne daß übliche Vorrichtungen verwendet werden müssen. Daher bleibt ferner ein Bedarf nach einem Verfahren und einer Vorrichtung zur nicht-invasiven Bestimmung eines vorherbestimmten Analyten in unsensiblem oder nicht durch körperliche Anstrengung entstehendem Schweiß. Der Testkit muß kostengünstig sein und von medizinisch nicht-geschultem Personal leicht verwendet werden können.
Es wird erfindungsgemaß bereitgestellt
ein Konzentrierungspflaster zur Anwendung auf der Haut zur Bestimmung der Gegenwart eines Analyten im Schweiß eines Säugerindividuums, wobei das Konzentrierungspflaster eine wasserdurchlässige Trägerschicht (20) umfaßt, die eine erste und eine zweite Seite hat, und ein Mittel zum wiederablösbaren Anbringen der ersten Seite der Trägerschicht (20) zum Flüssigkeitsaustausch mit der Haut des Individuums, bei dem Wasser durch die Trägerschicht (20) und nach außerhalb des Konzentrierungspflasters gelangen kann,
wobei das Konzentrierungspflaster dadurch gekennzeichnet ist, daß die Trägerschicht (20) mindestens ein daran immobilisiertes Reagens enthält, das einen spezifischen Bindungspartner für eine Referenzkomponente im Schweiß des Säugerindividuums umfaßt.
In einer Ausführungsform wird eine hydrophobe Membran zur Trennung der Konzentrierungszone von der Absonderungszone bereitgestellt. Mit "hydrophob" ist erfindungsgemäß gemeint, daß die Membran den Durchtritt der flüssigen Phase verhindert, jedoch das Entweichen der Gasphase der flüchtigen Bestandteile erlaubt. Diese hydrophoben Membranen werden hier nachstehend auch als "gasdurchlässige Membranen" bezeichnet. Bei Bereitstellung einer gasdurchlässigen Membran wird der Übergang der in der Konzentrierungszone angesammelten Körperflüssigkeit in die Gasphase unter dem Einfluß der Körperwärme beschleunigt, wodurch die nicht-flüchtigen und wenigerflüchtigen Bestandteile in der Konzentrierungszone konzentriert werden.
In einer anderen Ausführungsform können die Konzentrierungszone und die Absonderungszone durch eine hydrophile Schicht getrennt sein. Mit "hydrophil" ist im erfindungsgemäßen Zusammenhang gemeint, daß die Membran oder Schicht den Durchtritt sowohl der flüssigen als auch der gasförmigen Phase erlaubt. Diese hydrophilen Schichten werden hier nachstehend auch als "Flüssigkeits-durchlässige Membranen" bezeichnet. Die Flüssigkeits-durchlässigen Membranen erlauben den Durchtritt der flüssigen Phase in die Absonderungszone.
Das Konzentrierungspflaster wird vorzugsweise mit einer Analytbestimmungszone bereitgestellt, die Nachweisreagenzien, beispielsweise einen immobilisierten spezifischen Bindungspartner für einen in der Körperflüssigkeit zu bestimmenden Analyten, aufweist. Eine Analytreferenzzone wird bereitgestellt, die ein Mittel enthält, mit dem ermittelt werden kann, ob eine zur Bestimmung der Gegenwart des Analyten ausreichende Menge Körperflüssigkeit durch die Analytbestimmungszone gelangt ist. Die Analytreferenzzone erzeugt vorzugsweise eine sichtbare Anzeige nach der Exponierung bis zu einem vorherbestimmten Grenzwert, beispielsweise ein vorherbestimmtes Flüssigkeitsvolumen, oder einer Grenzmenge eines Referenzanalyten, beispielsweise IgG, Albumin oder ähnliches.
Gemäß einem weiteren erfindungsgemäßen Gesichtspunkt wird ein Verfahren zum Nachweis von falsch-negativen Ergebnissen in einem an einem Individuum durchgeführten Körperflüssigkeitstest als Folge des Nicht-Einhaltens des Testverfahrens durch das Individuum bereitgestellt. Das Verfahren umfaßt die Schritte des Anbringens eines Testpflasters an dem Individuum zum Austausch mit einer Körperflüssigkeitsquelle, wobei das Testpflaster ein zweites Nachweisreagens zum Nachweis der Gegenwart eines Analyten in der Körperflüssigkeit und ein erstes Nachweisreagens zum Nachweis der Gegenwart einer Referenzkomponente in der Körperflüssigkeit umfaßt.
Das Testpflaster wird nach einem ausreichenden Testzeitraum, in dem das zweite Nachweisreagens den Analyten nachweisen kann, sofern er in der Körperflüssigkeit vorhanden ist, vom Individuum abgelöst. Die durch das erste Nachweisreagens nachgewiesene Menge der Referenzkomponente wird anschließend ermittelt, und die Menge der ermittelten Referenzkomponente wird mit einem vorherbestimmten Wert verglichen, um zu entscheiden, ob das Testpflaster im wesentlichen über den gesamten Testzeitraum tatsächlich getragen wurde.
Weitere erfindungsgemäße Merkmale und Vorteile werden nachstehend im Kapitel "Genaue Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen" zusammen mit den Ansprüchen und angefügten Figuren erläutert.
Figur 1 ist eine perspektivische Ansicht eines Konzentrierungspflasters zur Anwendung auf der Haut gemäß einer erfindungsgemäßen Ausführungsform.
Figur 1a ist die Ansicht eines Querschnitts entlang der Linie 1a-1a des Konzentrierungspflasters zur Anwendung auf der Haut von Figur 1.
Figur 2 ist eine perspektivische Ansicht eines Konzentrierungspflasters zur Anwendung auf der Haut gemäß einer zweiten erfindungsgemäßen Ausführungsform.
Figur 2a ist die Ansicht eines Querschnitts entlang der Linie 2a-2a des Konzentrierungspflasters zur Anwendung auf der Haut von Figur 2.
Figur 3 ist eine perspektivische Ansicht einer dritten erfindungsgemäßen Ausführungsform des Konzentrierungspflasters zur Anwendung auf der Haut.
Figur 3a ist die Ansicht eines Querschnitts entlang der Linie 3a-3a des Pflasters von Figur 3.
Figur 4 ist eine perspektivische Ansicht einer Ausführungsform eines Reagenspakets, das verwendet wird, um eine Farbveränderung zu bewirken, die als Antwort auf die Gegenwart des Analyten im erfindungsgemäßen Konzentrierungspflaster erhalten wird.
Figur 5 ist eine gespreitete schematische Vorderansicht einer vierten erfindungsgemäßen Ausführungsform.
Figur 6 ist die Ansicht eines Querschnitts eines Pflasters zur Anwendung auf der Haut gemäß einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform.
Figur 7 ist eine Draufsicht eines Pflasters zur Anwendung auf der Haut gemäß einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform.
Figur 8 ist eine Vergrößerung einer auseinanderziehenden Ansicht eines Konzentrierungspflasters zur Anwendung auf der Haut gemäß einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform.
Figur 9 ist eine Draufsicht auf ein Konzentrierungspflaster zur Anwendung auf der Haut gemäß einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform.
Figur 10 ist eine gespreitete Vorderansicht einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform.
Figur 1 zeigt ein Konzentrierungspflaster 10 zur Anwendung auf der Haut gemäß einer erfindungsgemäßen Ausführungsform, das in der Darstellung auf der Hautoberfläche 12 haftet. Wie von einem Fachmann geschätzt werden wird, kann das erfindungsgemäße Konzentrierungspflaster für Veterinär- sowie humane Zwecke verwendet werden. Das Konzentrierungspflaster kann ferner in verschiedenen Anwendungen verwendet werden, beispielsweise in der Landwirtschaft oder in jedem anderen Milieu, wo ein chemischer Stoff in einer Flüssigkeit nachgewiesen werden soll und sich eine Wärmequelle, beispielsweise Körperwärme, Sonnenlicht etc., zur Herbeiführung der Verdunstung oder einer anderen Konzentrierungsfünktion des Pflasters verwenden läßt. Es wird jedoch vorzugsweise zur Ermittlung von vorherbestimmten chemischen Stoffen im Schweiß verwendet, und die nachstehende Erörterung ist letztlich grundsätzlich auf diese Anwendung ausgerichtet.
Die innerhalb des Umfangs des Testpflasters 10 von der Haut 12 abgegebene Feuchtigkeit sammelt sich zunächst in einer Konzentrierungszone 14 unterhalb der ersten Seite eines gasdurchlässigen Filters 16 an. Die Konzentrierungszone 14 enthält als Trägerschicht vorzugsweise ein Flüssigkeits-durchlässiges Medium 20, das Baumwollgaze oder ein anderes allgemein verfügbares durchlässiges Material sein kann. Es kann beispielsweise eine Schicht aus einem beliebigen bekannten Fasergewebe wie gestrickte Gewebe oder aus nicht-gewebter Kunstseide oder Cellulosefasern verwendet werden. "Filtration Sciences #39" ist ein Flüssigkeits-durchlässiges Medium, das als erfindungsgemaße Konzentrierungszone besonders bevorzugt verwendet wird.
Die Feuchtigkeit sammelt sich in den Faserzwischenräumen des Mediums 20 an, und der Einfluß der leicht von der Hautoberfläche durch die flüssige Phase geleiteten Körperwärme erleichtert die Verflüchtigung des Wasserbestandteils im Schweiß.
Wie vorstehend beschrieben, ist das Konzentrierungspflaster 10 mit einem gasdurchlässigen Filter 16 ausgestattet. Mit "gasdurchlässig" ist jedes Material gemeint, das den Durchtritt der Dampfphase von von der Haut abgegebenen Flüssigkeiten erlaubt, die flüssige Phase jedoch im wesentlichen in der Konzentrierungszone 14 zurückhält. Alle geeigneten, im Handel erhältlichen Mikrofiltrationsmembranfilter wie ein 0,45 Micron-Teflonfilter von Gore-Tex, hergestellt von W. L. Gore & Associates, Inc., Elkton, Maryland, können dazu verwendet werden.
Mit dem Begriff "Flüssigkeits-durchlässig" ist erfindungsgemäß ein Material gemeint, daß den Durchtritt von Schweiß in flüssiger Phase erlaubt. Ein Flüssigkeits- durchlässiges Filter erlaubt den Durchtritt von Wasser sowohl in der flüssigen als auch in der dampfförmigen Phase. Wenn hier der Begriff "Wasser" verwendet wird, ist daher Wasser sowohl in der flüssigen als auch der Dampfphase gemeint, sofern nicht ausdrücklich eine bestimmte Phase erwähnt ist.
Benachbart zur zweiten Seite des gasdurchlässigen Filters 16 ist eine Absonderungszone 18. Wie vorstehend beschrieben, hält das gasdurchlässige Filter 16 die flüssige Phase zurück, erlaubt jedoch das Entweichen der gasförmigen Phase des flüssigen Schweißbestandteils. Daher entweicht der primär aus Wasserdampf bestehende gasförmige Bestandteil kontinuierlich durch das gasdurchlässige Filter 16, dessen zweite Seite zur Absonderungszone 18 führt, die mit der Atmosphäre in Verbindung steht. In einer anderen Ausführungsform, die nicht extra dargestellt ist, wird das gasdurchlässige Filter 16 durch eine den Durchtritt der flüssigen Phase erlaubende Flüssigkeits-durchlässige Membran ersetzt. In dieser Ausführungsform kann eine Flüssigkeit oder eine Kombination aus Gas und Flüssigkeit aus dem Konzentrierungspflaster entweichen. Alle Flüssigkeits-durchlässigen Filter, die als Flüssigkeits-durchlässige Filter zur Verwendung in dieser erfindungsgemäßen Ausführungsform geeignet sind, sind im Handel erhältlich. Ein bevorzugtes Flüssigkeits-durchlässiges Filter wird von James River Paper Drape hergestellt.
Benachbart zur zweiten Seite von Filter 16 in der Absonderungszone 18 ist eine flexible, durchlässige äußere Schicht 22. Diese Schicht schützt das Filter 16 vor einer physikalischen Beschädigung wie Abrieb und kann ferner eine Barriere zur Verhinderung einer chemischen Verunreinigung des Filtermaterials von außen darstellen. Die Schicht 22 kann alle dem Fachmann bekannte, im Handel erhältliche gasdurchlässige Streifen und Folien umfassen. Die Schicht 22 kann vom nachstehend beschriebenen Klebestreifen 26 getrennt oder ein Teil davon sein. Je nach der beabsichtigten Verwendung des Pflasters kann in einer anderen Ausführungsform die Schicht 22 vollständig weggelassen werden, wenn das Konzentrierungspflaster 10 voraussichtlich nicht durch Abrieb oder externe Verunreinigung beschädigt wird.
Das in Figur 1 dargestellte Konzentrierungspflaster 10 wird mit einem peripheren Klebestreifen 26 auf der Hautoberfläche angebracht. Der Klebestreifen 26 umgibt das Pflaster 10 vorzugsweise auf allen Seiten. Beispielsweise kann ein kreisförmiger Ring des Klebestreifens zur Verwendung für ein kreisförmiges Pflaster ausgestanzt werden, oder das Zentrum eines rechteckigen Stücks des Klebestreifens kann entfernt werden, wobei eine Schicht 22 oder das Filter 16 eines rechteckigen Pflasters freigelegt wird. Vgl. Figur 1 bzw. 3. Alternativ können Schicht 22 und Klebestreifen 26 vollständig weggelassen und die Schichten 16 und 20 durch einen Verband auf der Hautoberfläche gehalten werden. In einem derartigen Verfahren befinden sich die Schichten 16 und 20 unter einer um Arm oder Bein gewickelten Binde oder Schutzhülle. Hier können Gas und/oder Flüssigkeit durch 16 und 20 in den Verband gelangen, wo sie sich entweder ansammeln oder in die Umgebung verflüchtigen.
Zahlreiche hypoallergene oder andere geeignete Klebestreifen, die zur Verwendung mit dem erfindungsgemäßen Konzentrierungspflaster 10 angepaßt werden können, sind im Stand der Technik gut bekannt. Verschiedene Klebestreifen oder Klebebänder können je nach der beabsichtigten Verwendung des Testkits erforderlich sein, was von ihrer Fähigkeit zur Haftung auf der Haut bei unterschiedlichen Bedingungen, beispielsweise beim Tragen tagsüber unter der Kleidung, während des Schlafs, bei starkem Schwitzen über längere Zeiträume oder beim Duschen abhängt. Es wurde festgestellt, daß die am stärksten bevorzugten Klebestreifen multiple Perforationen enthalten, die verhindern, daß sich Schweiß unter dem Klebestreifen ansammelt und eventuell den Zusammenhalt des Pflasters beeinträchtigt. Vorzugsweise wird ein Klebestreifen wie "Dermiclear", vertrieben von Johnson & Johnson, verwendet.
Zahlreiche Mittel können zum Anbringen des Konzentrierungspflasters 10 auf der Haut 12 verwendet werden. Der Klebestreifen 26 kann beispielsweise entfernt und die Gazeschicht 20 zur Erfüllung der gleichen Funktion auf der Unterseite mit einer Klebeschicht versehen werden. Eine derartige Klebemembran ist die "MN-100"- Klebemembran, hergestellt von Memtec of Minnetonka, Minnesota. Diese Membran ist Flüssigkeits-durchlässig, so daß sie Flüssigkeiten passieren läßt, wie die Gazeschicht 20, sie weist jedoch auf einer Seite eine Klebeschicht auf, so daß sie auf der Haut haftet. In einer anderen Ausführungsform kann die äußere Schutzschicht 22 einen ringförmigen Ansatz 23 umfassen, der sich radial über die äußeren Ränder von Filter 16 und Gaze 20 hinaus erstreckt. Vgl. Figur 2a. Die Unterseite von Ansatz 23 wird anschließend mit einem geeigneten Klebstoff versehen.
Die Oberflächentemperatur der menschlichen Haut ist regional unterschiedlich, sie ist jedoch üblicherweise im Bereich von 30 bis 32,2ºC (etwa 86º bis etwa 90ºF) im Ruhezustand und kann bei starker Anstrengung auf viel höhere Temperaturen steigen. Bei diesen Temperaturen haben einige für den erfindungsgemaßen Zweck interessante chemische Stoffe wie Kreatinkinase, die ein Lipoprotein mit einer hohen oder niedrigen Dichte ist, einen ausreichend niedrigen Dampfdruck, so daß die Verflüchtigung kein bedeutender Faktor in der Effizienz der Konzentrierungsfunktion ist. Gleichzeitig weist der wäßrige Hauptbestandteil einen Dampfdruck auf, der ausreichend hoch ist, um seine Verflüchtigung zu erleichtern, so daß die weniger flüchtigen Fraktionen konzentriert werden. In einigen Verwendungen weisen die interessierenden chemischen Stoffe, selbst bei der Ruhetemperatur, jedoch einen ausreichend hohen Dampfdruck auf, so daß das Entweichen der Dampfphase des interessierenden Analyten durch das gasdurchlässige Filter 16 der Wirksamkeit des Testpflasters schadet. Für diese Analyte muß ein modifiziertes Konzentrierungspflaster verwendet werden.
In den Figuren 2 und 2a ist ein modifiziertes erfindungsgemäßes Konzentrierungspflaster 11 dargestellt, das bei einem Analyten verwendet wird, der die Neigung zum Entweichen durch den gasdurchlässigen Filter 16 als Gas unter normalen Bedingungen aufweist. Das Testpflaster umfaßt eine Konzentrierungszone 14, die innen durch die Haut 12 begrenzt ist, an der das Konzentrierungspflaster 11 angebracht ist. Die äußere Grenze der Konzentrierungszone 14 ist durch das gasdurchlässige Filter 16 definiert, das die Konzentrierungszone 14 von der Absonderungszone 18 trennt. In der Konzentrierungszone 14 und benachbart zum durchlässigen Filter 16 ist eine Bindungsschicht 30 zur Bindung und Verhinderung des Entweichens von Molekülen des flüchtigen Analyten. Zwischen der Bindungsschicht 30 und der Gazeschicht 20 befindet sich eine poröse Schicht 28, die eine beliebige Folie umfassen kann, die die Bindungsschicht 30 festhält, jedoch den Durchtritt von Flüssigkeit erlaubt.
In der in Figur 2a dargestellten Ausführungsform sammelt sich der Schweiß in den Faserzwischenräumen der Gaze 20 und gelangt durch die poröse Schicht 28 in die Bindungsschicht 30. In dieser Schicht bewirkt ein chemisch oder biochemisch aktives Bindungsmaterial die selektive Bindung des flüchtigen Analyten, wodurch verhindert wird, daß er als Gas durch den gasdurchlässigen Filter 16 entweicht. Wie im Zusammenhang mit der in Figur 1 dargestellten Ausführungsform beschrieben, kann auch das gasdurchlässige Filter 16 durch eine Flüssigkeits-durchlässige Schicht ersetzt werden, bei der die Gegenwart von Flüssigkeit auf der Außenseite des Testpflasters nicht unerwünscht ist.
Die Bindungsschicht 30 kann ein beliebiges Bindungsmittel umfassen, je nach der Natur des zu bestimmenden flüchtigen Analyten. Das Bindungsmittel kann beispielsweise den zu bestimmenden Analyten chemisch binden oder adsorbieren. Die Bindungsschicht kann ferner einen spezifischen Bindungspartner des zu bestimmenden Analyten umfassen, beispielsweise einen polyclonalen oder monoclonalen Antikörper oder ein zu einem spezifischen im Schweiß zu bestimmenden Antikörper passendes Antigen.
Das Konzentrierungspflaster 11 wird ferner mit einem Klebestreifen 26 oder einem anderen Mittel zum Anbringen des Pflasters auf der Haut eines Individuums ausgestattet, wie es im Zusammenhang mit der in Figur 1 dargestellten Ausführungsform genauer beschrieben wurde. Das Konzentrierungspflaster 11 wird jedoch mit einer einheitlichen äußeren Schicht 22 dargestellt, die sich über den äußeren Rand der darunter liegenden Schichten hinaus erstreckt, wobei sie einen auf ihrer Unterseite mit einem Klebstoff ausgestatteten ringförmigen Ansatz 23 bildet. Wie im Zusammenhang mit der Ausführungsform von Figur 1 beschrieben, erlaubt die äußere Schutzschicht 22 das Entweichen von Wasserdampf, sie schützt jedoch das Filtermaterial vor einer chemischen Verunreinigung von außen.
In den Figuren 3 und 3a ist eine weitere Ausführungsform des erfindungsgemäßen Testpflasters dargestellt, in dem eine innere poröse Schicht 28 und eine äußere poröse Schicht 30 einen Zwischenraum zur Aufnahme einer Mikrokügelchen umfassenden Schicht 32 definieren. Die innere Schicht 28 und die äußere Schicht 30 bestehen vorzugsweise aus dem gleichen Material, das jedes geeignete Material sein kann, das einen ungehinderten Flüssigkeitsfluß durch das Pflaster zuläßt, während sie die Mikrokügelchen dazwischen festhalten. Ein Material, das als poröse Schicht 28 und 30 verwendet werden kann, ist eine als "Ultipor (nylon 6)" bezeichnete Flüssigkeits-durchlässige und mikroporöse Folie, hergestellt von Pall Corporation, Glen Cove, New York. Geeignete Nylon-Filtrationsmembranen werden beispielsweise auch von den Herstellern Micron Separations, Inc., Westborough, Massachusetts und Cuno, Meridan, Connecticut produziert. Die porösen Schichten 28 und 30 können auch aus einem anderen Material als Nylon wie Polycarbonat, modifiziertes Polyvinylchlorid und Polysulfon bestehen.
Die Gaze, die inneren und äußeren porösen Schichten und der Klebestreifen konnten in allen Ausführungsformen mit üblichen Stanzen zurechtgeschnitten werden. Die Gaze 20 und die innere poröse Schicht 28 konnten am Klebering 26 mit üblichen Klebstoffen befestigt werden, wie sie auf der Klebefläche selbst verwendet werden. In einer anderen Ausführungsform konnten sie durch Hitze oder Ultraschall miteinander verbunden werden. Die geeignete Menge an Mikrokügelchen konnte anschließend über der inneren porösen Schicht verteilt und die äußere poröse Schicht dann in der gleichen Weise angebracht werden. Üblicherweise wurden in einem Pflaster mit 2,54 cm (1 Inch) Durchmesser etwa 0,05 g bis etwa 1 g, vorzugsweise etwa 0,1 bis etwa 0,4 g Mikrokügelchen verwendet. Die inneren und äußeren porösen Schichten mußten in einem dem Fachmann bekannten Muster zusammengesteckt oder punktverschweißt werden, um die Ansammlung der Mikrokügelchen in einem Bereich zu verhindern.
Die freie haftende Oberfläche ist vorzugsweise mit einem Abziehpapier (nicht dargestellt) bedeckt, das zum Ergreifen mit den Fingern ausreichend weit übersteht. Das Pflaster wird in einem für die übliche Heftpflasterverpackung verwendeten, ähnlichen Papier- oder Plastikbeutel verpackt. Die zusammengebaute Einheit kann schließlich vor dem Verkauf sterilisiert oder pasteurisiert werden. In einer anderen Ausführungsform könnte die Verpackung eine Gasbarriere, beispielsweise eine Metall- oder "Mylar"- Folie, umfassen und sogar Sauerstoff oder ein Feuchtigkeits-absorbierendes Mittel einschließen, beispielsweise ein kleines Päckchen eines beliebigen bekannten Trockenmittels, beispielsweise Kieselgel, Calciumchlorid, Calciumcarbonat, Phosphorpentoxid oder andere, dem Fachmann bekannte Trockenmittel.
Die Gesamtdicke der Mikrokügelchen umfassenden Schicht 32 kann beträchtlich variiert werden. Wenn die Farbveränderung jedoch durch Eintauchen des Pflasters in geeignete Reagenzbäder entwickelt werden soll, ist die Schicht 32 vorzugsweise nicht dicker als etwa 3 mm, da Farbveränderungen, die an Immobilisierungsstellen bei dickeren Schichten auftreten, wahrscheinlich nicht zu beobachten sind. Die Mikrokügelchen umfassende Schicht weist stärker bevorzugt eine Dicke von etwa 1 mm bis etwa 2 mm auf. In einer anderen Ausführungsform könnte die Schicht 32 aus Mikrokügelchen aufgerissen werden, um lose Mikrokügelchen freizusetzen, die zur Durchführung von chemischen Analysen auf den unbekannten Stoff durch übliche Mittel wie in einer Küvette verwendet werden konnten.
Der Durchmesser der Kügelchen in der Mikrokügelchen umfassenden Schicht 32 ist im günstigsten Fall mindestens etwa eine Größenordnung größer als der Durchmesser der Poren in der inneren porösen Schicht 28 und der äußeren porösen Schicht 30. Die in der Mikrokügelchen umfassenden Schicht 32 enthaltenden Kügelchen weisen beispielsweise Durchmesser im Bereich von etwa 5 bis 50 µm und vorzugsweise im Bereich von etwa 5 bis etwa 10 µm auf. Bei der Verwendung von Kügelchen mit einem Durchmesser von 10 µm in der Mikrokügelchen umfassenden Schicht 32 weisen die innere poröse Schicht 28 und die äußere poröse Schicht 30 vorzugsweise beispielsweise eine mittlere Porengröße von etwa 1 µm auf.
Die Mikrokügelchen umfassende Schicht 32 kann aus einer beliebigen Vielfalt bekannter Materialien wie Polystyrol, Latex und Glas bestehen Kügelchen mit einer für die erfindungsgemäße Anmeldung geeigneten Größe von etwa 0,05 µm bis 100 µm sind von Polysciences of Warrington, Pennsylvania, erhältlich.
Die Mikrokügelchen umfassende Schicht 32 dient als Träger für einen immobilisierten spezifischen Bindungspartner des zu bestimmenden Analyten. Somit wird ein Molekül mit einer hohen chemischen Affinität für einen spezifischen Bestandteil in der zu analysierenden Flüssigkeit auf den Mikrokügelchen in der Mikrokügelchen umfassenden Schicht 32 immobilisiert.
In Figur 5 ist eine weitere erfindungsgemaße Ausführungsform dargestellt, die zur Verwendung bei Bedingungen mit geringer Schweißbildung, beispielsweise bei passivem unsensiblem Schwitzen, besonders geeignet ist, wobei das Testpflaster mit einer undurchlässigen äußeren Schicht 42 versehen wird. Zur Minimierung jeglicher Rückdiffüsion von Flüssigkeit zur Haut wird eine Absorptionsschicht 44 bereitgestellt, die ein Reservoir bildet, das die Feuchtigkeit von der Hautoberfläche und durch den Träger 46 hindurch aufnimmt, an den ein spezifischer Bindungspartner für mindestens einen zu bestimmenden Analyten gebunden ist. Schicht 44 kann Chemikalien zur Bindung oder Sammlung von Feuchtigkeit einschließen, beispielsweise ein Trockenmittel, wie vorstehend beschrieben, das zur hautnahen Verwendung geeignet ist. Das Pflaster kann ferner mit einer unteren porösen Schicht 48 zur Trennung des Trägers 46 von der Hautoberfläche versehen werden, und das Pflaster wird mit einem beliebigen Mittel zum Anbringen auf der Haut, wie vorstehend beschrieben, ausgestattet.
In einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform ist der im Schweiß zu bestimmende Analyt das Enzym Kreatinkinase MB (CK-MB), das vom Herzmuskel bei einem Herzinfarkt und anderen Herzbeschwerden abgegeben wird. Ein monoclonaler Antikörper gegen CK-MB kann gemäß einer beliebigen Vielfalt üblicher Verfahren auf den Mikrokügelchen immobilisiert werden, beispielsweise durch das Cyanbromid- Verfahren, das in der Produktbeschreibung von Pharmacia (Pharmacia, Inc., Piscataway, New Jersey) beschrieben ist.
Die monoclonalen Antikörper, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, können durch im Stand der Technik gut bekannte Verfahren, beispielsweise die von Milstein und Köhler, Nature 256 (1975), 495-497, beschriebenen, erzeugt und isoliert werden. Jackson beschreibt in Clin. Chem. 30/7 (1984), 1157-1162, insbesondere ein Verfahren zur Erzeugung von anti-CK-MM- (ein Indikator des Status der Skelettmuskulatur) und anti-CK-MB-Antikörpern.
Durch ein bekanntes Verfahren werden Mäuse, beispielsweise weibliche BALB/c-Mäuse oder andere Mausstämme oder auch andere geeignete Tiere wie Ratten oder Kaninchen zur Initiierung einer Immunantwort mit einer geeigneten Menge des CK-MB-Enzyms immunisiert. Die Dosis des Enzyms und der Immunisierungsplan zur Herstellung nützlicher Mengen an geeigneten Splenocyten kann je nach dem verwendeten Tierstamm leicht ermittelt werden.
Die Größe der Dosen von CK-MB oder eines anderen Antigens und der zeitliche Abstand ihrer Verabreichung sind von größter Bedeutung für die Antikörperantwort. Glücklicherweise liefern zahlreiche Antigendosen üblicherweise eine Immunität gegen Schadstoffe. Daher reicht eine kleine Antigendosis üblicherweise aus, um eine Antikörperantwort zu initiieren, d. h., Proteinmengen im Mikrogrammbereich reichen häufig aus. Üblicherweise gibt es jedoch eine minimale Dosis zur Initiierung einer Immunantwort, obwohl Antigendosen unterhalb der zur Initiierung einer Antikörperantwort erforderlichen Minimaldosis üblicherweise eine bereits begonnene Antikörperproduktion aufrechterhalten. Auf eine anfängliche Immunisierung mit etwa 50 µg Enzym kann beispielsweise eine Hyperimmunisierungsserie von fünf Injektionen folgen.
Die Vermischung von Verbindungen, die selbst nicht notwendigerweise antigen sind, mit einem Antigen bewirkt eine erhöhte Antikörperproduktion gegen das Antigen, wie durch große Antikörpermengen im Serum, eine längere Antikörperproduktionszeit und eine Antwort auf geringere Antigendosen angezeigt wird. Diese Substanzen werden als Adjuvanzien bezeichnet und schließen das inkomplette und komplette Freundsche-Adjuvans und Aluminiumsulfatgele ein. Eine bestimmte Antigendosis ist üblicherweise effektiver, wenn sie subcutan zusammen mit einem Adjuvans oder nacheinander in kleinen Aliquots injiziert wird, als wenn sie intravenös verabreicht wird.
Üblicherweise sind die "Freundschen"-Adjuvanzien bevorzugt. Das ursprüngliche "komplette Freundsche"-Adjuvansgemisch besteht aus Mineralöl, Wachs und abgetöteten Tuberkelbazillen. Das Antigen wird dem Adjuvansgemisch als wäßrige Phase zugesetzt, wobei eine Wasser-in-Öl-Emulsion entsteht, in der jeder Wassertropfen von einer die Tuberkelbakterien enthaltenden kontinuierlichen Ölphase umgeben ist. Das Gemisch wird üblicherweise subcutan in Versuchstiere injiziert. Die Injektion stimuliert eine deutliche granulomatöse Reaktion mit Läsionen, die zum großen Teil aus Ansammlungen von Histiocyten, Epithelzellen und Lymphocyten bestehen. Der lokale Lymphknoten zeigt eine geringfügige Zunahme an Plasmazellen.
Nach der Immunisierung mit einer primären Dosis eines löslichen Proteinantigens erscheinen üblicherweise erst nach einigen Tagen spezifische Antikörper im Serum, vermehren sich bis etwa zur zweiten Woche und verringern sich danach über einen Zeitraum von Wochen bis Monaten.
Die ersten nach der Antigenbehandlung erscheinenden Serumantikörper sind IgM-Antikörper. Danach erscheinen üblicherweise IgG-Antikörper. Nach der Erhöhung des Antikörpertiters im Serum verschwinden die IgM-Antikörper, wahrscheinlich aufgrund einer spezifischen Feedback-Suppression durch IgG-Antikörper.
Nach dem Ende der "Primärantwort" auf ein Protein erzeugt einige Monate oder sogar Jahre danach verabreichte zweite Dosis des gleichen Antigens üblicherweise eine intensive und beschleunigte "spezifische Sekündärantwort", in der sich die Erhöhung des Antikörpertiters im Serum üblicherweise innerhalb von zwei oder drei Tagen nach der Exponierung einstellt. Die Antikörpertiter im Serum bei einer Sekundärantwort können bis zu 10 mg/ml erreichen.
Das Tier wird anschließend geopfert, und seine Milzzellen werden in einem geeigneten Medium suspendiert und mit Myelomzellen, wie sie von der murinen Zellinie Sp2/O-Ag14 erhältlich sind, fusioniert. So werden als Hybridome bezeichnete Hybridzellen erhalten, die sich in vitro reproduzieren können und ein Gemisch von Antikörpern produzieren, die für jede der verschiedenen Erkennungsstellen auf dem CK- MB-Enzym spezifisch sind.
Die gewählte Myelomzellinie muß mit den Milzzellen kompatibel sein und am besten von der gleichen Spezies stammen. Obwohl festgestellt wurde, daß die murine Zellinie Sp2/O-Ag14 mit Mausmilzzellen effektiv verwendet werden konnte, waren andere Myelomzellinien alternativ verwendbar. Vgl. beispielsweise Nature 276 (1978), 269-270.
Die verwendete Myelomzellinie sollte vorzugsweise vom sogenannten Arzneimittel-resistenten Typ sein, so daß alle nicht-fusionierten Myelomzellen in einem Selektivmedium nicht überleben, während Hybridzellen überleben. Eine Vielfalt von Arzneimittel-resistenten Myelomen ist bekannt.
Das Gemisch von nicht-fusionierten Milzzellen, nicht-fusionierten Myelomzellen und fusionierten Zellen wird verdünnt und in einem Selektivmedium gezüchtet, das das Wachstum der nicht-fusionierten Myelomzellen nicht ausreichend lange unterstützt, so daß alle nicht-fusionierten Zellen absterben. Eine Arzneimittel-resistente nicht-fusionierte Myelomzellinie überlebt in einem Selektivmedium, beispielsweise einem HAT (Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin)-Medium, nur einige Tage. Somit sterben die nicht-fusionierten Myelomzellen ab. Da die nicht-fusionierten Milzzellen keine malignen Zellen sind, durchlaufen sie nur eine begrenzte Anzahl von Generationen, bis sie sich nicht mehr reproduzieren. Andererseits setzen die fusionierten Zellen ihre Reproduktion fort, da sie die von der parentalen Myelomzelle stammende maligne Eigenschaft und das von der parentalen Milzzelle stammende zum Überleben im Selektivmedium erforderliche Enzym aufweisen.
Der Überstand von jeder eine Vielzahl von Hybridomen enthaltenden Vertiefung wird auf die Gegenwart eines Antikörpers gegen eine spezifische, für die CK-MB-Enzymstruktur einzigartige Stelle überprüft. Anschließend wird auf die Hybridome, die den gewünschten Antikörper gegen diese spezifische Stelle produzieren, selektiert. Diese Selektion kann beispielsweise durch begrenzende Verdünnung durchgeführt werden, in der das Volumen des Verdünnungsmittels statistisch so berechnet wird, daß eine bestimmte Zahl von Zellen (z. B. 1 bis 4) in jeder separaten Vertiefung einer Mikrotiterplatte isoliert wird. So können einzelne Hybridome für eine weitere Clonierung isoliert werden.
Nach der Selektion kann das gewünschte Hybridom in Wirtstiere der gleichen wie zur Herstellung des Hybridoms verwendeten Art, vorzugsweise syngene oder semisyngene Tiere, injiziert werden. Die Injektion des Hybridoms bewirkt nach einer geeigneten Inkubationszeit die Bildung von Antikörper-erzeugenden Tumoren im Wirt, was eine sehr hohe Konzentration des gewünschten Antikörpers im Blutstrom und im Bauchhöhlenexsudat des Wirts zur Folge hat. Obwohl die Wirte normale Antikörper in ihrem Blut und Exsudat aufweisen, ist die Konzentration dieser normalen Antikörper nur etwa 5 % der Konzentration des gewünschten monoclonalen Antikörpers. Der monoclonale Antikörper kann anschließend gemäß im Stand der Technik bekannter Verfahren isoliert werden.
In einer anderen Ausführungsform als der beschriebenen Erzeugung von monoclonalen anti-CK-MM-Antikörpern könnten die Bestandteile eines im Handel erhältlichen Diagnosekits, das das an ein Kügelchenträger chemisch gebundene CK-MM- Enzym umfaßte, verwendet werden. Ein im Handel erhältlicher geeigneter Kit mit der Bezeichnung "Isomune-CK Diagnostic Kit" von Roche of Nutley, New Jersey, ist einer von kommerziell erhältlichen Kits. Dieser Kit schließt ein Ziegen-Antiserum gegen menschliches CK-MM und kovalent an Styrolkügelchen gebundenen Esel-anti-Ziegen- Antikörper ein. Durch Vermischen würde ein immobilisiertes Konjugat mit einer spezifischen Affinität für menschliches CK-MM entstehen. Ein direkteres und weniger kostspieliges Verfahren wäre jedoch die direkte Immobilisierung des monoclonalen anti-CK- MM-Antikörpers auf dem Mikrokügelchenträger gemäß den im Stand der Technik gut bekannten Verfahren.
Der für die Komplexbildung mit CK-MB zu verwendende Antikörper kann auf allen im Stand der Technik bekannten Trägern immobilisiert werden. Der anti-CK- MB-Antikörper kann beispielsweise an Polysaccharidpolymere unter Verwendung des im US-Patent Nr.3,645,852 offenbarten Verfahrens gebunden werden. In einer anderen Ausführungsform kann der Antikörper an Träger, die Filterpapier oder Plastikkügelchen umfassen, die aus Polyethylen, Polystyrol, Polypropylen oder einem anderen gewünschten geeigneten Material bestehen, gebunden werden. Der Träger stellt bestenfalls eine Vielzahl von Mikrokügelchen dar, aus denen die Mikrokügelchen umfassende Schicht 32, wie in Figur 3a dargestellt, leicht hergestellt werden kann.
Als Alternative zur Mikrokügelchen umfassenden Trägerschicht kann der spezifische Bindungspartner direkt auf der inneren porösen Schicht 20 oder 28 in Figur 3a oder auf der Unterseite von Filter 16 in Figur 1a immobilisiert werden. So kann die Mikrokügelchen umfassende Schicht 32 vollständig weggelassen werden. Flüssigkeitsdurchlässige Membranen, die zur Bindung von Antikörperproteinen spezifisch entwickelt wurden, sind im Handel erhältlich, beispielsweise "Zetapor" von Cuno und "Protrans" von ICN, Costa Mesa, Kalifornien.
In Figur 4 ist ein Reagensbehälter dargestellt, der mit dem erfindungsgemäßen Konzentrierungskit verwendet werden kann. Der Reagensbehälter 34 umfaßt einen Behälter 36 mit einem abnehmbar befestigten Deckel 38. Eine Lasche 40 am Deckel 38 erleichtert das Ergreifen des Deckels 38 und sein Abziehen vom Behälter 36, wobei das darin enthaltene Reagens sichtbar wird.
Nach einer geeigneten Tragzeit wird das Testpflaster üblicherweise durch den Träger (im Nicht-Arzneimittel-Durchmusterungstest) abgelöst und zur sichtbaren Anzeige des Testergebnisses entwickelt. Das Testpflaster ist zusammen mit einem Entwicklungsbehälter wie dem Behälter 34, der bekannte Entwicklungsreagenzien für den Immuntest enthält, im Handel erhältlich. Ein Färbemittel zur Proteinanfärbung nach einer Elektrophorese, beispielsweise Coomassie-Brilliantblau oder Amido-Schwarz 10b, kann beispielsweise an den im Reagensbehälter 34 enthaltenen gereinigten Analyten gebunden werden. Wenn ein Testpflaster in den Behälter 34 getaucht wird, werden alle durch den Analyten im Schweiß nicht gebundenen Antikörper im Testpflaster durch den gefärbten gereinigten Analyten im Behälter 34 besetzt. Es gibt daher einen umgekehrten Zusammenhang zwischen der durch das Pflaster absorbierten Färbemittelmenge und der durch das Pflaster gelangenden Enzymmenge. In dieser Ausführungsform taucht der Anwender das Pflaster in die Flüssigkeit von Behälter 34, wartet einen bestimmten Zeitraum, beispielsweise 30 Sekünden oder länger, spült das Pflaster unter Leitungswasser und setzt die erhaltene Farbe des Pflasters mit dem Vorhandensein des Enzyms in Beziehung. Eine Farbvergleichstabelle und eine Kontrollzone auf dem Pflaster ohne gebundenen Antikörper können für diese Interpretation als Hilfen bereitgestellt werden.
In einer anderen Ausführungsform kann der Anwender das Testpflaster auf ein offenes Gefäß, beispielsweise ein kleines Gefäß oder Fläschchen, oder einen leeren dem Reagensbehälter 34 im Design gleichenden Behälter legen, wobei der haftende Rand des Pflasters am Rand des Gefäßes angebracht und anschließend der Inhalt von Behälter 34 auf die Oberseite des Testpflasters gegossen wird. Die Schwerkraft unterstützt den Transport des Inhalts von Behälter 34 durch das Testpflaster zur Maximierung der Effizienz der Färbungslbindungsreaktion und zur Erleichterung der Wahrnehmung einer Farbveränderung.
Das System kann leicht so gestaltet werden, daß der Anwender die Interpretation der Analytkonzentrierung überhaupt nicht am Pflaster durchführt, sondern durch Beobachten des Behälterinhalts, nachdem er das Pflaster durchquert hat. Dieses Verfahren würde den üblichen ELISA-Testverfahren ähneln, in denen der Behälterinhalt mit spezifischen Enzymsubstraten reagierende Enzymkonjugate enthält. Die Enzymsubstrate würden dem Behälterinhalt zugesetzt, nachdem er das Testpflaster passiert hat.
Wenn der Schweiß interessierende Moleküle enthält, würden diese an den spezifischen immobilisierten Bindungspartner im Pflaster binden. In einem solchen Fall würden die Enzymkonjugate des Behälters leicht das Testpflaster durchdringen und enzymatisch das Enzymsubstrat modifizieren, wobei eine kontrollierte Farbveränderung in der Lösung des Behälters bewirkt wird. Wenn der Schweiß die gewünschten interessierenden Moleküle enthält, würden die Enzymkonjugate beim Durchgang durch das Pflaster gebunden und wären nicht verfügbar, um eine Farbänderung in der Substratlösung zu bewirken. Weitere Immuntestschemata können zur erfindungsgemäßen Verwendung durch einen Fachmann leicht adaptiert werden.
Obwohl das erfindungsgemäße Konzentrierungspflaster für alle möglichen Körperflüssigkeiten verwendet werden kann, wird vorzugsweise Schweiß aufgrund seiner ständigen Verfügbarkeit und Blutähnlichkeit, allerdings mit geringeren Analytkonzentrationen, verwendet. Speichel enthält anscheinend ebenfalls viele chemische Blutbestandteile, jedoch häufig sogar in noch geringeren Konzentrationen, als im Schweiß gefunden wurde.
Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das Konzentrierungspflaster in Abhängigkeit von einer Reihe von Faktoren an unterschiedlichen Körperstellen angebracht. Es ist selbstverständlich, daß die erzeugte Schweißmenge eine Funktion sowohl der Körperstelle als auch der physischen Aktivität während und unmittelbar vor der Sammlung ist. Dies beruht auf der unterschiedlichen Dichte von Schweißdrüsen an verschiedenen Körperstellen, sowie auf bestimmten regulatorischen Funktionen dieser Drüsen.
Es werden zwei Typen von Schweißdrüsen unterschieden. Der Ekkrin-Typ bewirkt primär eine Regulierung der Körpertemperatur durch Wärmeverlust beim Verdunsten. Schweißdrüsen vom Ekkrin-Typ sondern bei körperlicher Anstrengung Schweiß ab und liefern daher den Schweiß, der für viele Anwendungen des erfindungsgemäßen Konzentrierungspflasters interessant ist. Schweißdrüsen vom Apokrin-Typ sind größere sezernierende Elemente, die nur an relativ isolierten Körperstellen wie Achselhöhlen-, Scham- und Brustbereich vorhanden sind.
Obwohl die Ätiologie des Schwitzens relativ komplex ist, ist bekannt, daß sie durch mentale Zustände, beispielsweise mentale Anstrengung sowie emotionale Belastung, Wärmebelastung als Antwort eines sitzenden Körpers zur Temperaturregulierung und durch körperliche Belastung als Antwort des physisch aktiven Körpers zur Temperaturregulierung verursacht wird.
Das Schwitzen kann, zusätzlich zu den vorstehenden Unterscheidungen, entweder unsensibel oder sensibel sein. Unsensibler Schweiß wird anscheinend durch Wasserdiffusion durch dermale und epidermale Schichten verursacht. Er dient anscheinend nicht der Wärmeregulierung, sondern unterstützt beispielsweise die mechanische Wechselwirküng zwischen Haut und Oberflächen zur Erhöhung der Griffsicherheit. Weitere Vielschichtigkeiten entstehen in bezug auf die räumliche Verteilung der Schweißdrüsen und dem Schweißfluß bei den verschiedenen Typen des Schwitzens. Spezialisierte Bereiche der Handflächen und Fußsohlen schwitzen kontinuierlich, allerdings mit einer sehr geringen Rate. Die Rate des unsensiblen Schwitzens hängt von der Lage des jeweiligen bestimmten Bereichs relativ zum Herzen ab. Das Erheben von Gliedmaßen über das Herz verringert beispielsweise die Rate des unsensiblen Schwitzens.
Bei Temperaturen von weniger als etwa 31 ºC in einem ruhenden erwachsenen Menschen erfolgt das unsensible Schwitzen in einer Rate von etwa 6 bis 10 Gramm pro Stunde pro Quadratmeter Haut von Arm, Bein und Rumpf bis zu etwa 100 Gramm pro Stunde pro Quadratmeter Haut von Handfläche, Fußsohle und Gesicht. Die letzten drei Bereiche sind zusammen für etwa 42 % des Gesamtverlustes an Körperwasser im nicht- schwitzenden Zustand verantwortlich, was üblicherweise eine Lufttemperatur von zwischen etwa 24 bis 26ºC bedeutet. Dieses unsensible Schwitzen beginnt zunächst auf dem Fußrücken und breitet sich mit steigender Temperatur auf höhergelegene Körperpartien aus. Eine veröffentlichte Untersuchung wies nach, daß der durchschnittliche Wasserverlust aufgrund des unsensiblen Schwitzens bei einer Umgebungstemperatur von 22ºC, 27ºC bzw. 30ºC für 1,75 Quadratmeter Körperoberfläche im Bereich von 381 ml, 526 ml bzw. 695 ml pro Tag lag.
Im Gegensatz zum unsensiblen Schwitzen, das anscheinend nicht an ein bestimmtes Oberflächenelement der Haut gebunden ist, hängt das sensible Schwitzen mit der Ekkrin-Drüse zusammen. Die Zahl der aktiv sezernierenden Ekkrin-Drüsen ist individuell verschieden und hängt vom beobachteten Körperbereich und dem Typ der erzeugten Schweißantwort ab. Die maximale Drüsendichte schwankt von etwa 200 pro Quadratzentimeter auf dem Unterarm bis über 400 pro Quadratzentimeter auf dem Daumenballen.
Das sensible Schwitzen beginnt, wenn entweder die Hauttemperatur etwa 34,4ºC (94ºF) beträgt oder die Temperatur des Rektums etwa 0,11ºC (0,2ºF) über der normalen Kerntemperatur liegt. Der Maximalverlust an Schweiß kann ein Volumen von bis zu 2 Litern pro Stunde bei durchschnittlichen Personen und von bis zu 4 Litern pro Stunde über kurze Zeiträume erreichen. Das sensible Schwitzen beginnt am Ende der unteren Gliedmaßen und breitet sich bei steigender Umgebungstemperatur nach oben aus. Daher schwitzt der Fußrücken lange vor der Brust. Das Muster der sensiblen Schweißantwort ist auch bei erhöhter Wärmebelastung in verschiedenen Körperbereichen unterschiedlich. Bei geringer Wärmebelastung schwitzen im wesentlichen die unteren Gliedmaßen. Bei steigender Wärmebelastung breitet sich das Schwitzen über den Rumpf aus. Aufgrund seiner großen Oberfläche ist der Rumpf die Oberfläche mit dem größten Wasserverlust. Gelegentlich werden am Rumpf extrem hohe Raten festgestellt, während die Raten der unteren Gliedmaßen sogar sinken können. Die Stirn kann extrem hohe Schweißraten produzieren, sie gehört jedoch zu den Bereichen, die erst zuletzt eine Schweißantwort auf eine Wärmebelastung geben.
Wie vorstehend beschrieben, sind zahlreiche im Blut nachweisbare chemische Stoffe auch im Schweiß vorhanden, allerdings in einer viel geringeren Konzentration. Bisherige Untersuchungen der Zusammensetzung betrafen Elektrolyte wie Natrium, Chlorid, Calcium und Kalium. Extreme individuelle Unterschiede wurden festgestellt, und die Veränderung der Elektrolytzusammensetzung richtete sich auch danach, ob der Schweiß thermal, mental oder anders stimuliert wurde.
In weiteren Untersuchungen wurden zahlreiche weitere Schweißbestandteile wie Elektrolyte sowie komplexere biologische Moleküle identifiziert. Beispiele für einige im Schweiß identifizierte chemische Stoffe sind nachstehend in Tabelle I aufgeführt. Tabelle I Chemische Bestandteile von Schweiß Diphtherie-Antitoxin Ascorbinsäure Thiamin Riboflavin Nicotinsäure Aminosäuren Ethanol Antipyrin Kreatinin C-14-Methylharnstoff C-14-Acetamid C-14-Harnstoff Thioharnstoff Paraaminohippursäure Mannitsaccharose Lactat Natriumchlorid Kalium Calcium Magnesium Phosphor Mangan Theophyllin Parathion Tetrahydrocannabinol Insulin Cimetidin Dimethylacetamid Sulfate Iod Eisen Fluor Brom Wismut Milchsäure Pyruvatglucose Stickstoff Ammoniak Harnsäure Nicotin Morphin Sulfanilamid Atabrin Methadon Phencyclidin Aminopyrin Sulfaguanidin Sulfadiacin Aniphetanilne Benzoylecgonin Phenobarbital Androgensteroide Phencyclidin Phenytoin Carbamazepin
Jede Position in Tabelle 1, für die eine Affmitätschemie entwickelt werden kann, kann ein geeigneter Gegenstand eines erfindungsgemäßen Testpflasters sein. Da die meisten in Tabelle 1 aufgeführten Bestandteile nicht-flüchtig sind, werden sie in der Konzentrierungszone 14 des in Figur la dargestellten Konzentrierungspflasters 10 oder in der Bindungsschicht 30 von Figur 6 zurückgehalten. Einige Bestandteile, besonders Ethanol, verflüchtigen sich jedoch unter dem Einfluß der Körperwärme, so daß sie als Dampfphase durch das Testpflaster entweichen können. Wenn der zu bestimmende Analyt Ethanol oder ein anderer flüchtiger Bestandteil ist, kann das erfindungsgemäße Konzentrierungspflaster, wie im Zusammenhang mit der in Figur 2 dargestellten Ausführungsform beschrieben, modifiziert werden.
In Figur 6 ist ein modifiziertes erfindungsgemäßes Konzentrierungspflaster 13 dargestellt, in dem alle Zwischenschichten zwischen der Haut 12 und der Bindungsschicht 30 fehlen. Durch Anordnung der Bindungsschicht (d.h., die Schicht mit einem spezifischen Bindungspartner für einen zu bestimmenden Analyten) in direkter Nachbarschaft zur Haut wird die seitliche Schweißdiffüsion aus der Bindungsschicht 30 minimiert. Durch die Nähe der Bindungsschicht 30 zur Haut 12 kann die Absonderung jedes Schweißdrüsenkanals mit einem relativ kleinen Bereich der Bindungsschicht 30 in Kontakt oder in flüssigem Austausch sein. Aus mehreren dem Fachmann bekannten Gründen kann es auch erwünscht sein, eine mikroporöse Membran, vorzugsweise eine Flüssigkeits-durchlässige Membran 50 auf der Bindungsschicht 30 anzubringen.
Die Verdunstungskapazität der Bindungsschicht 30 und der Flüssigkeitsdurchlässigen Membran 50 reicht vorzugsweise relativ zur Absonderungskapazität der einzelnen Schweißkanäle aus, um die seitliche Schweißdiflüsion aus der unmittelbaren Umgebung des Kanals auf ein Minimum zu reduzieren. Diese Ausführungsform wird speziell zur Analyse der chemischen Zusammensetzung von unsensiblem Schweiß und/oder Schweiß aus nicht-körperlicher Anstrengung in Fällen mit einer begrenzten Schweißdrüsenabsonderung verwendet. Aufgrund des nachstehend beschriebenen Vergrößerungseffektes kann die erfindungsgemäße Ausführungsform ferner besonders zur Analyse von gering konzentrierten Analyten verwendet werden.
Indem die suppressiven Eigenschaften von Feuchtigkeit oder Wasser auf der Haut durch Verwendung von Materialien mit einer maximalen Verdunstungskapazität begrenzt werden, erlaubt die erfindungsgemäße Ausführungsform bei Maximierung der Schweißdrüsenabsonderung eine Erhöhung der Durchgangsrate von Schweiß im Pflaster. Nach Nadel und Stolwijk (J. Applied Physiology 35(5) (1973), 689-694) unterdrückt Wasser auf der Haut die Schweißdrüsenaktivität, wobei ein Unterschied der körperlichen Gesamtschweißrate zwischen feuchter und trockener Haut von 40 % feststellbar ist. Mitchell und Hamilton (Biological Chemistry 178 (1948), 345-361) stellten fest, daß beim unsensiblen Schwitzen die Absonderung von Wasser und gelösten Stoffen vermutlich aufhört, wenn die Hautoberfläche mit einem Wasserfilm bedeckt ist. Brebner und Kersiake (J. Physiology 175 (1964), 295-302) nehmen an, daß dies durch ein Anschwellen der Epidermiszellen der Haut beim Kontakt mit Wasser und der dadurch bewirkten Blockierung der Schweißkanäle verursacht wird.
Die Fähigkeit der vorliegenden Erfindung zur Erzeugung einer positiven Antwort bei relativ geringen Analytkonzentrationen ist besonders vorteilhaft in Anbetracht der Tatsache, daß während aktiver körperlicher Anstrengung ein Bereich der Haut von 0,64 cm (1/4") Durchmesser etwa 35 Mikroliter Schweiß pro Stunde liefert, wahrend ohne körperliche Anstrengung ein Bereich der Haut mit einem ähnlichen Durchmesser Schweiß in einer Rate von nur etwa 3,2 Mikroliter pro Stunde absondert. Ein weiterer Vorteil der erfindungsgemäßen Ausführungsform ist, daß sich der Anwender nicht körperlich anstrengen, sondern das Pflaster für einen ähnlich langen oder üblicherweise längeren Zeitraum ruhend oder bei normalen Aktivitätsniveaus tragen muß.
Daher wird die homogene Schweißdiffusion durch die Bindungsschicht vorzugsweise minimiert, wenn die vorliegende Erfindung im Zusammenhang mit dem unsensiblen Schwitzen und/oder Schwitzen ohne körperliche Anstrengung und/oder zur Bestimmung von geringen Analytmengen im Schweiß verwendet wird. Die Minimierung der seitlichen Schweißdiffusion an der Bindungsschicht 30 bewirkt erfindungsgemäß eine ergiebigere Schweißsammlung an jedem Schweißkanal, wodurch eine größere Menge an dort zu bestimmendem selektiertem Analyt erhalten wird.
Sato und Fusako (American J. Physiology 245(2) (1983), 203-208) nehmen an, daß ein Schweißdrüsenkanal einen Durchmesser von etwa 40 µm aufweist. Gemäß Scheupoein und Blank (Physiological Review 51(4) (1971), 702-747) ist die durchschnittliche Dichte von Schweißdrüsen auf der Hautoberfläche etwa 250 pro Quadratzentimeter. Daher stellt die Gesamtoberfläche der Schweißdrüsenkanäle der Haut 1/318 der Gesamtoberfläche des erfindungsgemäßen Pflasters dar. Das sichtbare Ergebnis auf einem erfindungsgemäßen Testpflaster ist beispielsweise bei Verwendung eines bekannten ELISA-Verfahrens zur Ermittlung eines gering-konzentrierten Analyten das Erscheinen einiger kleiner Farbveränderungen auf der Bindungsschicht 30 im Zusammenhang mit den Absonderungen von bestimmten Kanälen. Wenn bedeutende seitliche Schweißdiffusion vor dem Kontakt mit dem immobilisierten Bindungspartner stattgefunden hat, ist die Farbveränderung häufig zu diffus, um mit dem bloßen Auge nachgewiesen zu werden.
Obwohl ein die erfindungsgemäße Ausführungsform einschließendes Pflaster an jeder praktischen Stelle auf dem Körper getragen werden kann, schließen bevorzugte Stellen für das Pflaster die Haut der Fußsohle und Stellen auf Brust und Rücken ein. Das Pflaster kann an diesen Stellen unauffällig getragen und dort wegen des nicht übermäßigen Haarwuchses mit üblichen Klebestreifen angebracht werden.
Hertzman et al. (J. Applied Physiology 5 (1952), 153-161) wiesen nach, daß die Rate der Schweißabsonderung der Sohle von der Umgebungstemperatur nicht abhängt und daher vermutlich auch vom Aktivitätsniveau unabhängig ist. Da die Sohle bei körperlicher Anstrengung keinen Schweiß erzeugt, wäre die Schweißaufnahme des Pflasters an dieser Stelle daher unabhängig vom Aktivitätsniveau des Trägers.
In Figur 7 ist eine modifizierte Bindungsschicht 52 für ein erfindungsgemäßes Konzentrierungspflaster dargestellt, in dem die Bindungsschicht 52 mit mindestens zwei getrennten Zonen versehen ist. Eine Referenzzone oder mehrere getrennte Testzonen können sowohl für das im Zusammenhang mit Figur 6 beschriebene, aus einer einzigen Schicht bestehende Pflaster als auch für die im Zusammenhang mit den Figuren 1-3a und 5 beschriebenen Ausführungsformen verwendet werden. Die mehrere Zonen aufweisende Bindungsschicht 52 kann ferner bei Verwendung einer spezifischen Bindungschemie für bestimmte, hier nachstehend im Zusammenhang mit den Figuren 6 bis 10 beschriebene Ausführungsformen verwendet werden.
Mindestens eine Zone wie die Ermittlungszone 60 (Figur 7) wird, wie vorstehend beschrieben, zum Nachweis eines gesuchten Analyten im Schweiß verwendet. Mindestens eine der verbleibenden Zonen wie Referenzzone 61 wird als ein Referenzindikator verwendet.
Die Referenzzone 61 hat mehrere Funktionen, je nach der gewünschten Verwendung des Testpflasters. Die Referenzzone 61 kann beispielsweise mit einer chemischen Zusammensetzung mit Farbveränderungscharakter, wie vorstehend beschrieben, ausgestattet werden, um dem Träger anzuzeigen, daß das Pflaster ausreichend lange getragen wurde, so daß ein für einen aussagekräftigen Test auf den ausgewählten Analyten ausreichendes Probenvolumen durch das Pflaster gelangt ist. Dazu wird die Referenzzone 61 mit einer Affinitätschemie für einen vorherbestimmten Referenzsubstituenten, beispielsweise IgG, Albumin oder einen beliebigen anderen immer vorhandenen Schweißbestandteil ausgestattet. Der gewählte Referenzsubstituent soll eine einigermaßen genaue Messung des durch das System gelangten Schweißvolumens liefern.
Zur einfacheren Verwendung der Referenzzone 61 kann zunächst das ungefähre Konzentrationsverhältnis eines Referenzbestandteils wie Albumin zum zu bestimmenden Analyten ermittelt und das Pflaster mit einer chemischen Zusammensetzung mit Farbveränderungscharakter versehen werden, die die Gegenwart des Referenzbestandteils erst dann visuell anzeigt, wenn das Eluat des zu bestimmenden Analyten die untere Nachweisgrenze überschritten hat.
Referenzbestandteile wie Albumin sind üblicherweise in bedeutend größeren Mengen als der Analyt vorhanden. Um den Durchtritt eines ausreichenden Probenvolumens anzeigen zu können, ist die "Empfindlichkeit" des Pflasters für den Referenzbestandteil daher vorzugsweise geringer als für den Analyten. Dazu wird für den Referenzbestandteil eine proportional geringere Menge an spezifischem Bindungspartner als für den Analyten oder im Test andere Verdünnungen verwendet oder einfach ein in geringeren Mengen vorhandener Referenzbestandteil gewählt. Ein geeigneter Referenzbestandteil und seine Konzentration können durch einfache Experimente vom Fachmann leicht ermittelt werden.
In einer anderen Ausführungsform kann eine Referenzzone 61 besonders in Tests auf Drogen und ihre Metaboliten anzeigen, daß das Hautpflaster vom jeweiligen Patienten, Bewähningshäftling oder von einer anderen Person tatsächlich getragen wurde. Eine inhärente Einschränkung in einem Test, bei dem eine Person ein negatives Ergebnis wünscht, ist die Möglichkeit, das Pflaster nach der Verabreichung einfach zu entfernen und es kurz vor der erneuten Untersuchung wieder anzubringen. Dadurch kann der Träger sicherstellen, daß falsch-negative Ergebnisse erhalten werden.
Durch Bereitstellung einer Referenzzone 61 zum Nachweis eines bekannten Schweißbestandteils verraten die Testergebnisse jedoch Testpflaster, die nicht über den Testzeitraum getragen wurden. Referenzzone 61 stellt ein Verfahren zur Verhinderung falsch-negativer Bewertungen aufgrund von Manipulation oder Entfernung des Testpflasters bereit.
Eine Referenzzone 61 zum Nachweis eines bekannten Schweißbestandteils kann ferner als positive Kontrollzone zur Aufdeckung von falsch-negativen Testergebnissen aufgrund eines Abbaus von Reagenzien oder anderen Bestandteilen des Pflasters dienen.
In Untersuchungen auf Nicht-Drogen ist die in der Referenzzone 61 erzeugte Anzeige vorzugsweise eine sichtbare Farbveränderung durch eine chemische oder kobrimetrische Antikörper/Antigen-Interaktion, die erscheint oder für den Träger sichtbar wird, wenn eine festgelegte Menge des Referenzanalyten durch den Interaktionsbereich gelangt ist.
Gegebenenfalls kann eine Referenzzone 61 als negative Kontrollzone dienen, damit falsch-positive Ergebnisse aufgedeckt werden können. Eine bevorzugte negative Kontrollzone weist einen immobilisierten spezifischen Bindungspartner für einen Analyten auf, von dem bekannt ist, daß er in menschlichem Schweiß nicht vorhanden ist. Von dem spezifischen Bindungspartner des Analyten muß bekannt sein, daß er mit den im menschlichen Schweiß vorhandenen Bestandteilen nicht kreuzreagiert. Ein Beispiel für einen geeigneten Analyten ist das Hüllprotein des Bacteriophagen T4.
In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform (nicht dargestellt) werden zwei oder mehrere Analytbestimmungszonen 60 in einem einzelnen Testpflaster bereitgestellt. Mehrere Testzonen sind in Anwendungen, wie bei einem Test auf Drogen, wertvoll, bei denen ein Testen auf einen beliebigen oder auf mehrere einer Vielzahl von Analyten erwünscht ist. Ein einziges Testpflaster kann beispielsweise zum Nachweis von zahlreichen mißbräuchlich verwendeten Drogen wie THC, Phencyclidinmorphin und Methadon verwendet werden. Ein positives Ergebnis für jede beliebige zu testende Droge kann einen ausreichenden Nachweis für ein Vergehen wie dem Verstoß gegen Bewährungsauflagen liefern oder den Bedarf an weiteren quantitativen Nachuntersuchungen signalisieren. Bei einer Verwendung zur Voranalyse ist die vorliegende Erfindung von Vorteil, da sie nicht invasiv und kostengünstiger als übliche quantitative Analysen ist. Daher ist ein analytisches Testpflaster, wie hier beschrieben, zur Voruntersuchung von großen Bevölkerungsgruppen wie Bewährungshäftlingen, Häftlingen, Militärpersonal oder anderen besonders geeignet.
Die Analytbestimmungszone 60 und die Analytreferenzzone 61 können auf dem Pflaster physikalisch getrennt sein, beispielsweise in konzentrischen Kreisen oder diskreten Zonen, wie in Figur 7 dargestellt, oder bei nur zwei oder drei Analyten überall verteilt sein. Im letzten Fall würden positive Ergebnisse von verschiedenen Tests durch verschiedene Farben angezeigt.
Einige gut bekannte Immuntestschemata zur Sichtbarmachung der Gegenwart eines interessierenden Analyten sind im Stand der Technik gut bekannt und müssen hier nicht genauer beschrieben zu werden. Das optimale Innnuntestschema ist üblicherweise einfach und umfaßt möglichst wenige Schritte. Bei vielen Testtypen sind schnelle Ergebnisse, beispielsweise eine Farbveränderung, die ein positives oder negatives Ergebnis mit möglichst wenig Schritten anzeigt, im Interesse des Trägers. Andererseits werden Tests auf Drogenmißbrauch meistens durch Klinlkpersonal statt durch die Testperson ausgewertet, und daher wird weniger Wert auf ein benutzerfreundliches Produkt gelegt.
In einem erfindungsgemäßen Konzentrierungspflaster, das sowohl zur Bestimmung der Gegenwart des CK-MM- als auch des CK-MB-Enzyms entworfen wurde, befindet sich beispielsweise der immobilisierte spezifische Bindungspartner für jedes dieser Enzyme in separaten Bereichen des Testpflasters. Wenn das System eines Enzym-gebundenen Immuntests verwendet wird, können so ein gemeinsames Enzym und ein gemeinsames Substrat verwendet werden. Alternativ wird eine andere Farbe zur Anzeige der Gegenwart von verschiedenen Analyten verwendet.
Eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform, die anzeigt, ob ein Träger das Pflaster während des Untersuchungszeitraumes entfernt hat, ist in Figur 8 dargestellt. In dieser Ausführungsform wird das Konzentrierungspflaster 62 mit einem Klebeelement 65 auf der Haut 64 angebracht. Das Klebeelement 65 ist vorzugsweise aus einem Material aufgebaut, das stark genug ist, um das Konzentrierungspflaster 62 auf der Haut 64 zu halten, das jedoch, beispielsweise bei der Entfernung des Pflasters von der Haut, relativ leicht zerreißt. Ein geeignetes Material zur Verwendung in dieser bevorzugten Ausführungsform ist Tegaderm 1625, hergestellt von Minnesota, Mining and Manufacturing Corp., St. Paul, Minnesota. Weitere Firmen, einschließlich Avery and Johnson & Johnson, produzieren ähnliche geeignete Materialien, wobei das Johnson & Johnson-Produkt unter dem Handelsnamen "Bioclusive" im Handel erhältlich ist. Es wurde jedoch festgestellt, daß ein Träger mit ausreichender Geduld ein derartiges Kleheelement ablösen und austauschen kann, ohne daß dabei ein sichtbares Anzeichen zurückbleibt, daß das Klebeelement entfernt worden war. Daher weist das Klebeelement 65 in der dargestellten besonders bevorzugten Ausführungsform Belastungseinschnitte ("stress razors") 66 in Form von zahlreichen radialen Schlitzen am äußeren Rand auf. Die Belastungseinschnitte ("stress razors") 66 können in einer beliebigen Konfiguration und Dichte angeordnet werden und haben den Vorteil, daß sie beim Ablösen zerreißen, wie es einem Fachmann bekannt ist.
In der in Figur 8 dargestellten bevorzugten Ausführungsform erstrecken sich die radialen Schlitze 66 auf einer Lange von etwa 0,13 cm (0,05 Inch) vom äußeren Rand in Richtung auf das Zentrum des Konzentrierungspflasters 62. Die Schlitze 66 konnen in beliebigen regelmäßigen oder unregelmäßigen Abständen angeordnet werden und umgeben in der bevorzugten Ausführungsform den Rand des Konzentrierungspflasters 62 vorzugsweise in einem Abstand von etwa 0,25 cm (0,10 Inch). Das Haftungsvermögen des Materials des Klebeelements 65 übersteigt vorzugsweise die Kraft, die zum Abreißen des Klebeelements an den Belastungseinschnitten ("stress razors") 66 benötigt wird, so daß beim Ablösen des Konzentrierungspflasters 62 das Material des Klebeelements zerreißt. Wenn daher ein Konzentrierungspflaster dieser bevorzugten Ausführungsform getragen wird, zeigt ein zerrissenes Klebeelement, daß der Träger das Pflaster wahrscheinlich manipuliert hat. Die Abnahme der Festigkeit des Klebeelements 65 kann selbstverständlich auch durch Perforationen statt durch Schlitze erreicht werden, und die Schlitze oder Perforationen müssen nicht unbedingt radial ausgerichtet sein.
Bei der Aufbewahrung vor der Verwendung ist eine Umhüllung für das Klebeelement erforderlich, um ein Ankleben an Oberflächen zu verhindern, da die Belastungseirischnitte ("stress razors") 66 sonst vor der Verwendung zerreißen. In der in Figur 8 dargestellten bevorzugten Ausführungsform wird daher das Konzentrierungspflaster zum Schutz des Klebeelements 65 mit einer inneren Umhüllung 69 versehen. Die innere Umhüllung 69 wird vor dem Anbringen des Pflasters 62 auf der Haut einer Person entfernt, um das Klebeelement 65 freizulegen. Ein beliebiges, dem Fachmann bekanntes nicht-klebendes Material wie ein üblicher Klebeverbandsüberzug kann als innere Umhüllung 69 verwendet werden.
Das Konzentrierungspflaster 62 kann praktisch nicht abgelöst und ausgetauscht werden, ohne daß Zeichen einer Manipulation sichtbar sind. Daher enthält das Pflaster alle Schweißbestandteile, die während der Tragzeit des Pflasters von der Haut unter der Konzentrierungszone 14 abgegeben werden.
Eine besonders raffinierte Person, die falsch-negative Ergebnisse produzieren will, kann jedoch über weitere Testpflaster verfügen. Diese raffinierte Person würde falsch-negative Ergebnisse durch Ablösen des zuerst angebrachten Testpflasters und Ersetzen des Testpflasters unmittelbar vor seiner Entfernung für einen Test erhalten. Um sicherzustellen, daß das von der Person abgelöste Pflaster das gleiche Pflaster ist, das ursprünglich an der Person angebracht wurde, kann ein schwer reproduzierbarer kennzeichnender Marker in das Pflaster eingeschlossen werden. Ein Strichcode- Identifizierungsstreifen 67, der dem an den Kassen der Supermärkte verwendeten Strichcode gleicht, kann in das Pflaster eingeschlossen werden, vorzugsweise unmittelbar unter dem Klebeelement 65. Um den Austausch des Pflasters sicher zu erkennen, ist es wichtig, daß der Identifizierungsmarker nicht leicht entfernt und ersetzt werden kann, ohne daß die Manipulation des Pflasters angezeigt wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform weist das Pflaster 62 ein Filter 68 zwischen der äußeren Schicht 65 und der Konzentrierungszone 14 auf, wie vorstehend im Zusammenhang mit den Figuren 1-3a beschrieben. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das Filter ein Flüssigkeits-durchlässiges Filter, das aus "James River Paper Drape" hergestellt wird.
Die bevorzugten Klebeelemente der in Figur 8 dargestellten Ausführungsform, die aus relativ schwachen Klebematerialien wie "Tegaderm" hergestellt werden, wurden allgemein für nicht stark schwitzende Krankenhauspatienten konstruiert. Daher ist die Feuchtigkeits-Dampf-Transmissionsrate (MVTR) dieser Materialien relativ gering. Die MVTR von "Tegaderm" ist beispielsweise etwa 810 g/mm² x Tag (g/m x m x Tag). Eine aktive Person kann jedoch in spontanen Raten von bis zu 26 000 g/mm² x Tag (g/m x m x Tag) schwitzen. Daher kann eine aktive Person mehr Schweiß absondern als diese Klebeelemente an die Atmosphäre weiterleiten können. Bei einer Schweißansammlung über einen bedeutenden Zeitraum können sich Kanäle zwischen der Haut 64 und dem Klebeelement 65 bilden, durch die der Schweiß zwischen dem Klebeelement und der Haut abfließen kann, anstatt von dem Konzentrierungspflaster 62 absorbiert zu werden.
Gemäß einer weiteren, in Figur 9 dargestellten erfindungsgemäßen Ausführungsform wird daher ein Pflaster 70 bereitgestellt, das ein Klebeelement 72 aufweist, das dem Schweißüberschuß den freien Durchtritt durch die Lochperforationen 73 nach außen ermöglicht. Die Lochperforationen können über ein breites Band 75 verteilt sein, das sich vom äußeren Rand des Klebeelements bis zu einem schmalen Band 77 erstreckt, das den Testbereich 81 des Pflasters 70 umgibt.
Der Schweiß, der unter dem Testbereich 81 produziert wird, über dem sich keine Lochperforationen 73 befmden, wird von dem Testbereich absorbiert und nicht nach außen abgegeben. Der Testbereich 81 schließt den Bereich des Pflasters 70 direkt unter der Konzentrierungszone 14 des Pflasters sowie den Bereich unmittelbar außerhalb dieser Zone ein. Das schmale Band 77 außerhalb der Konzentrierungszone 14 des Pflasters weist keine Lochperforationen 73 auf und verhindert in hohem Maße einen Austausch von unter dem Testbereich 81 entstehendem Schweiß mit dem breiten Band 75, von wo der Schweiß nach außen abgegeben wird.
Die Breite des schmalen Bandes 77 ist vorzugsweise zwischen 0,064 und 0,64 cm (0,025 und 0,250 Inch), stärker bevorzugt zwischen 0,18 und 0,32 cm (0,05 und 0,125 Inch). Schmale Bänder mit einer geringeren als der bevorzugten Breite bleiben voraussichtlich nicht an der Haut haften, während sich bei schmalen Bändern mit einer größeren als der bevorzugten Breite Schweißkanäle bilden können, die einen sich mit der Außenseite austauschenden Schweißpfad innerhalb des Testbereichs 81 erzeugen.
Ein Träger des Drogentestpflasters ist vermutlich ziemlich kreativ bei der Umgehung der Schutzvorrichtungen des Pflasters. Ein kreativer Träger kann beispielsweise versuchen, die konzentrierten Schweißbestandteile aus dem Pflaster auszuwaschen, während das Pflaster auf der Haut des Trägers verbleibt. Dieses Waschen kann unter Verwendung einer Nadel und Spritze, die beispielsweise üblicherweise von intravenös spritzenden Drogenabhängigen zur Drogeninjektion verwendet werden, versucht werden.
Bei den Pflastern, die eine spezifische Bindungschemie verwenden, erweist sich wahrscheinlich ein Versuch der Elution der konzentrierten Bestandteile unter Verwendung von Wasser als nicht erfolgreich. Selbst bei solchen Pflastern, die keine spezifische Bindungschemie für den zu testenden Analyten verwenden, wäre eine Elution mit Wasser allein schwierig, wobei große Volumina Wasser erforderlich sind, um den Nachweis der Manipulation durch das Ablösen des Pflasters von der Haut zu vermeiden. Eine Elution mit Urin eines Tieres oder einer Person, die keine Drogen verwendet, könnte jedoch erfolgreich sein, um bestimmte Analyte aus dem Pflaster zu entfernen. Ferner könnten bestimmte Analyte unter Verwendung von nicht-wäßrigen Lösungsmitteln, beispielsweise Aceton, das weithih als Nagellackentferner erhältlich ist, zumindest teilweise erfolgreich eluiert werden.
Um eine Manipulation des Pflasters durch Elution des Inhalts des Pflasters unter Verwendung von Wasser oder anderen Lösungsmitteln nachzuweisen, kann der Konzentrierungszone daher bei der Herstellung des Pflasters eine bekannte Menge eines entweder in wäßrigen oder nicht-wäßrigen Lösungsmitteln leicht löslichen Markers zugesetzt werden. Der Marker muß leicht quantifizierbar sein. Der Marker muß ferner entweder in wäßrigen oder nicht-wäßrigen Lösungsmitteln je nach dem wahrscheinlichen Elutionsweg des Analyten löslich sein. Der Marker muß ferner für einen längeren Hautkontakt geeignet sein und darf durch die Haut nicht leicht absorbierbar sein. Eine Reihe von zur Herstellung von Makeup verwendeten Farbstoffen weist diese geeigneten Eigenschaften auf. "Oil red N" (Katalognummer 29,849-2), von Aldrich Chemical Corp., Milwaukee, Wisconsin vertrieben, ist ein geeigneter lipidlöslicher Farbstoff. "DG01 red" und "DH60 yellow", beide von Virginia Dare Extract Co., Brooklyn, N. Y. erhältlich, sind geeignete wasserlösliche Farbstoffe. Diese wasserlöslichen Farbstoffe können durch Elution aus dem Pflaster leicht quantifiziert werden, wobei anschließend die optische Dichte des roten Farbstoffs bei 6 500 nm oder des gelben Farbstoffs bei 5 800 nm gemessen wird. Die Restmenge an Farbstoff kann mit der Farbstoffmenge verglichen werden, die in Pflastern festgestellt wird, die ohne Manipulation über den gleichen Zeitraum kontinuierlich getragen wurden.
Ferner könnten unsichtbare Marker verwendet werden, um zu verhindern, daß der Träger des Pflasters eine Rückkoppelung in bezug auf die Menge an Restmarker im Pflaster erhält. Ein farbloses Protein kann dazu verwendet werden. Ein Protein muß gewählt werden, das im Labor leicht identifizierbar ist und ferner in menschlichem Schweiß fehlt. Rinder-Gammaglobuline, wie die von Sigma Chemical Co., St. Löuis, MO vertrieben, könnten beispielsweise auch als Marker verwendet werden. Die Gegenwart dieser Marker kann unter Verwendung des Rinder-IgG-RID-Kits, erhältlich von ICN, Costa Mesa, CA, leicht nachgewiesen werden.
Wenn zur Analyse des Pflasters auf einen bestimmten zu testenden Analyten ein geeigneter Marker im Konzentrierungspflaster verwendet wird, kann daher das Pflaster auch auf die Gegenwart des Markers analysiert werden. Bei sichtbaren Markern, beispielsweise Makeup-Farbstoffen, kann die Gegenwart des Markers durch einen einfachen Blick auf das Pflaster festgestellt werden. Nicht-sichtbare Marker können zusammen mit dem Analyten getestet werden. Eine bedeutende Abnahme der vorhandenen Markermenge würde eine Manipulation durch Lösungsmittelelution des Pflasters anzeigen.
Ein weiteres Verfahren zur Manipulation des Pflasters wäre die Zugabe eines die Testchemie störenden verfälschenden Stoffs zum Pflaster. Zahlreiche Materialien wurden verwendet, um Urintests auf Drogen zu verfälschen. Das am häufigsten verwendete und üblicherweise effektivste Verfahren zur Erzeugung eines falsch-negativen Ergebnisses in einem Urintest ist die Verdünnung des Urins durch Aufnahme von großen Flüssigkeitsmengen. Diese Vorgehensweise wäre vorteilhafterweise bei der Erzeugung falsch-negativer Ergebnisse im erfindungsgemaßen Schweißsammelpflaster wahrscheinlich nicht erfolgreich, da es weniger wahrscheinlich ist, daß die interstitielle Konzentration von Drogenmetaboliten durch Flüssigkeitsaufnaaane beeinflußt wird.
Die Zugabe von bestimmten verfälschenden Stoffen zum Pflaster kann jedoch die Analysechemie stören. Beispielsweise stören Säuren und Basen bekanntermaßen Tests auf viele Drogenmetaboliten durch Veränderung der Molekülstruktur der Metaboliten. Ferner wurden viele Haushaltsprodukte, beispielsweise Detergenzien, Ammoniak, Ascorbinsäure (Vitamin C) und Abflußreiniger, zur Störung von Urintests verwendet. Diese Produkte erzeugen extreme pH-Werte und bewirken erwartungsgemäß ein Hauttrauma, wenn sie in Tests mit dem erfindungsgemäßen Konzentrierungspflaster verwendet werden. Dieses Trauma könnte durch den Pflaster-ablösenden Fachmann festgestellt werden.
Von schwachen Säuren und Basen sowie Augentropfen, die im Handel unter dem Handelsnamen "Visine" erhältlich sind, ist ebenfalls bekannt, daß sie eine Reihe von Tests auf Drogenmetaboliten in Urinanalysen stören. Es wird jedoch angenommen, daß diese Materialien kein Hauttrauma erzeugen. Die Verwendung dieser Materialien oder anderer Test-störender Verbindungen, die kein Hauttrauma erzeugen, kann vom Pflaster-ablösenden Fachmann unbemerkt bleiben, wenn die flüssigen Bestandteile des Materials Zeit hatten, um durch die äußere Schicht des Pflasters zu verdunsten. Es wird jedoch angenommen, daß "Visine" und die meisten anderen Verfälschungsmittel ionische Materialien enthalten.
Zum Nachweis der Verwendung eines verfälschenden Stoffes können daher Teststreifen in das Konzentrierungspflaster eingeschlossen werden, die die Gegenwart von verschiedenen ionischen Materialien oder extremen pH-Werten nachweisen. Lackmuspapier, beispielsweise "Hydrion"-pH-Testpapier, erhältlich von Baxter Scientific Products, ist bekanntermaßen ein Indikator für pH-Änderungen. Daher könnte etwas Lackmuspapier, beispielsweise 1 cm x 1/2 cm, in das Pflaster eingeschlossen werden, um die verschiedenen vorstehend beschriebenen Haushaltsprodukte, die bekanntermaßen stark sauer oder basisch sind, nachzuweisen.
Viele Teststreifen sind auch dafür bekannt, daß sie die Gegenwart von ionischen Materialien nachweisen. Baxter Scientific Products liefert beispielsweise Teststreifen von einer Reihe von Herstellern zum Nachweis der folgenden Ionen: Aluminium, Ammonium, Chromat, Cobalt, Kupfer, Eisen, Nickel, Nitrat, Peroxid, Sulfit, Zinn und Calcium. Ferner sind Teststreifen unter der Bezeichnung "Quantab" von Baxter Scientific Products erhältlich, die die Gegenwart von Chloridionen nachweisen. Weitere vom gleichen Hersteller erhältliche Teststreifen zeigen Glucose, Protein und Ketone an. Die meisten dieser Teststreifen werden durch einen einfachen Vergleich der Farbe des Streifens mit einer in den Streifen enthaltenen Farbskala gelesen. Die Teststreifen liefern daher ein einfaches Verfahren, um die Einführung von zahlreichen verfälschenden Stoffen nachzuweisen.
Zum Nachweis von verfälschenden Stoffen wie "Visine", die der Test-durchführenden Person nicht bekannte ionische Materialien enthalten, muß der Tester zunächst auf den verfälschenden Stoff unter Verwendung einer Reihe von Ionenteststreifen testen, um zu ermitteln, welche Ionen in den Materialien vorhanden sind. Nach dem Nachweis der gesuchten Ionen können die Teststreifen, die diese Ionen nachweisen, in das Konzentrierungspflaster eingeschlossen werden, um eine Anzeige bereitzustellen, daß der verfälschende Stoff dem Pflaster zugesetzt wurde.
Erstaunlicherweise kann ein bestimmter verfälschender Stoff in einigen Tests falsch-negative Ergebnisse und in anderen falsch-positive Ergebnisse produzieren. Für jeden Test könnten die üblichen verfälschenden Stoffe, die zur Erzeugung falsch-negativer Ergebnisse verwendet werden könnten, identifiziert werden, indem die Tests durch Zugabe von kleinen Mengen dieser bekannten Materialien getestet werden. Die Teststreifen könnten dann in das Pflaster eingeschlossen werden, um die Zugabe dieser verfälschenden Stoffe nachzuweisen.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Teststreifen oder Streifen zur Haut hin angebracht, wo die Streifen dem Träger nicht sichtbar sind. Der Träger erhält dadurch keine Rückkoppelung, die dem Truager bei der Täuschung helfen könnte.
Es ist bekannt, daß viele biologische Bestandteile durch verschiedene Spektralbanden von Lichtenergie beeinflußt werden. Urinproben für die LSD-Analyse müssen beispielsweise vor der Exponierung gegen starkes Licht geschützt werden. (Schwartz, Arch. Inter. Med. 148 (1988), 2407-12). Weitere Beispiele für Verbindungen, die vor Licht geschützt werden müssen, sind Kokainhydrochlond (Martindale Extra Pharmacopoeia 29. Ausg., S.1213) und Morphinsulfat (ebenda, S. 1310). Es wird angenommen, daß diese und andere Verbindungen während der Konzentrierung im Konzentrierungspflaster durch Lichtexponierung beeinflußt werden.
Viele Analyte, die durch ein erfindungsgemaßes Konzentrierungspflaster nachgewiesen werden sollen, müssen im Pflaster über längere Zeiträume (bis zu mehreren Wochen) gesammelt und aufbewahrt werden. Diese Analyte sind daher bedeutenden Mengen an Photostrahlung ausgesetzt. Die Menge der Photostrahlung kann wesentlich größer sein als während eines Urintests für den gleichen oder einen ähnlichen Analyten. Viele Analyte weisen ferner eine besonders hohe Lichtempfindlichkeit auf. Bei Analyten, die eine besonders hohe Lichtempfmdlichkeit aufweisen oder über längere Zeit gesammelt und aufbewahrt werden mussen, ist es besonders wichtig, die lichtempfmdlichen Analyte während der langen Aufbewährung im Pflaster vor Licht zu schützen.
In noch einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform, die in Figur 10 dargestellt ist, wird daher ein Testpflaster 90 bereitgestellt, das eine Lichtabfangschicht 92 zwischen der äußeren Klebeschicht 65 und der Konzentrierungszone 14 aufweist. In Figur 10 ist die Klebeschicht 65 mit Belastungseinschnitten ("stress razors") 66 dargestellt, dieses Merkmal soll in dieser erfindungsgemäßen Ausführungsform jedoch selbstverständlich fakultativ sein.
Die Lichtabfangschicht 92 wird bereitgestellt, um den Durchtritt von Licht in die Konzentrierungszone 14 abzuschwächen, wo der interessierende biologische Bestandteil gesammelt und aufbewahrt wird. Die Schicht 92 muß im wesentlichen für den Durchtritt der Lichtstrahlung undurchlässig sein, jedoch auch den relativ unbeschränkten Durchtritt der wäßrigen Schweißbestandteile zur äußeren Klebeschicht 65 ermöglichen. Die Schicht 92 muß ausreichend porös sein, damit die Diffusion der wäßrigen Schweißbestandteile mindestens so schnell erfolgt, wie sich der Schweiß normalerweise im Pflaster ansammelt.
Da Licht zahlreicher Wellenlängen die verschiedenen, möglicherweise interessierenden biologischen Verbindungen abbauen kann, muß die Schicht 92 optische Eigenschaften aufweisen, die Licht über ein weites Spektrum abfangen. Das Abfangen kann entweder durch Reflektion oder Absorption von einfallendem Licht erhalten werden. Eine Reflektion kann beispielsweise durch Verwendung einer beliebigen Metalloberfläche erreicht werden. Bei Verwendung gemäß bestimmten bevorzugten erfindungsgemaßen Ausführungsformen muß die Lichtabfangschicht 92 den Durchtritt von wäßrigen Schweißbestandteilen erlauben. Zur Bereitstellung einer reflektierenden Schicht mit der geeigneten Durchlässigkeit kann eine dünne Metallfolie mit kleinen Löchern bereitgestellt werden. Beispielsweise kann Aluminiumfolie, die von vielen Quellen im Handel erhältlich ist, einschließlich der Reynolds Aluminum Co., mit zahlreichen kleinen Löchern perforiert werden.
Als absorbierende Lichtabfangschichten können schwarze Oberflächen verwendet werden. Diese Oberflächen wären vorzugsweise weiter für wäßrige Schweißbestandteile durchlässig. Es ist wesentlich, daß alle Farbstoffe oder Pigmentierungen in der Lichtabfangschicht 92 nicht abfärben, wenn sie den wäßrigen Schweißbestandteilen ausgesetzt sind, und ferner daß sie die Bindungschemie oder die Analyse des Analyten nicht stören. Zahlreiche dünne schwarze Papiere mit diesen Eigenschaften sind im Handel erhältlich und zur Verwendung in der Lichtabfangschlcht geeignet. Es wurde beispielsweise festgestellt, daß schwarze "Deltaware"-Zellulosemembranfilter, erhältlich von Baxter Scientific Products, zur Verwendung als Lichtabfangschichten besonders geeignet sind. Dieses Produkt ist in einer Vielzahl von Porengrößen erhäldich, wobei größere Poren bevorzugt sind. Daher werden in der bevorzugten Ausführungsform schwarze "Deltaware"-Filter von 0,6 µm bereitgestellt.
In einer zur Bereitstellung einer Lichtabfangschicht (nicht dargestellt) anderen Ausführungsform kann die Klebeschicht 65 entweder durch Absorption oder Reflektion zum Abfangen von Licht umgestaltet werden. Als ein Beispiel für eine absorbierende Klebeschicht könnte ein schwarzer Farbstoff, beispielsweise ein feines schwarzes Kohlenstoffpulver, in die Extrusion der Klebefohe eingeschlossen werden.
Die nachstehenden Beispiele beschreiben lediglich spezifische erfindungsgemäße Verwendungen.

Beispiel 1

Herstellung von Mikrokügelchen enthaltenden Testpflastern

Eine spezifische erfindungsgemäße Verwendung ist die Doppelbestimmung von Skelett- und Herzmuskelstatus nach körperlicher Anstrengung. Ein Konzentrierungspflaster zur Anwendung auf der Haut wird gemäß der in den Figuren 3 und 3a dargestellten Ausführungsform konstruiert. Die Gazeschicht wird durch Ausschneiden eines kreisförmigen Flickens mit einem Durchmesser von etwa 2,54 cm (1 Inch) aus einem nicht-klebenden Polster aus Gaze von Johnson & Johnson hergestellt. Die inneren und äußeren porösen Schichten werden anschließend durch Schneiden von zwei kreisförmigen Flicken aus Ultipor (nylon 6) von Pall Corporation, Glen Cove, New York, hergestellt. Die "Ultipor"-Membran ist sowohl Flüssigkeits-durchlässig als auch mikroporös, und es wird eine Membran mit beispielsweise einer Porengröße von 1 µm ausgewählt. Die Mikrokügelchen umfassende Schicht wird durch kovalente Bindung von gegen CK-MB erzeugten monoclonalen Antikörpern an zahlreiche Polystyrolkügelchen mit einer durchschnittlichen Teilchengröße von mindestens etwa 10 µm hergestellt.
Das Konzentrierungspflaster wird durch Verteilen von etwa 0,2 g Mikrokügelchen über der Oberfläche einer der porösen Schichten konstruiert. Die zweite poröse Schicht wird anschließend so angebracht, daß sie an die Mikrokugelchen angrenzt, und die Gazeschicht wird dann auf der zweiten porösen Schicht angebracht. Das Pflaster ist jetzt verkehrt herum. Die äußeren Ränder der ersten bzw. zweiten porösen Schicht und die Gazeschichten werden durch übliche Wärmeversiegelungs- Verfahren aneinander befestigt. Anschließend wird das Vorprodukt umgedreht und zur Herstellung eines vollständigen Konzentrierungspflasters ein Kreisring aus Klebestreifen mit einem äußeren Durchmesser von etwa 2 Inch und einem inneren Durchmesser von etwas weniger als 1 Inch daran befestigt.

Beispiel 2

Test des Herzmuskelstatus

Das Konzentrierungspflaster von Beispiel 1 wird anschließend an der Brust eines gesunden 40 Jahre alten Mannes befestigt und bei einer 36 Meilen (130 Minuten) langen Falrrradfahrt getragen. Nach Ablösen des Konzentrierungspflasters nach dem Radfahren wird das Testpflaster etwa 30 Minuten in eine erste, einen Überschuß an Enzym-markiertem anti-CK-MB enthaltende Lösung getaucht, damit der markierte Antikörper an den immobilisierten Analyten binden kann. Das Pflaster wird anschließend zur Entfernung von nicht-gebundenem markiertem Antikörper unter Leitungswasser gespült und in eine zweite ein Substrat für den gebundenen Enzymmarker enthaltende Lösung getaucht, wobei das Substrat durch die Wirkung des Enzyms seine Farbe ändert. Das Erscheinen der Farbe durch die obere poröse Schicht hindurch zeigt die Gegenwart von CK-MB und eine mögliche Herzverletzung an. Ein Vergleich mit einer Farbtabelle erlaubt eine grobe Quantifizierung.

Beispiel 3

Test auf eine Marihuana-Verwendung

Polydonale THC-Antikörper von Schafen, erhältlich von Biogenesis, Bournmouth, England, werden in PBS (pH 7,5) 1:100 verdünnt. Die Antikörper werden gemäß dem Protokoll im "Gelman Original Equipment Manufacturer"-Handbuch P. N. 31,084 an die "Gelman 0,45 µm (SU-450) Ultrabind Supported"-Membran gebunden. Die Membranen werden an der Luft getrocknet. Scheibchen mit einem Durchmesser von 0,95 cm (3/8 Inch) werden aus den beschichteten "Gelman"-Membranen ausgeschnitten. Diese Scheibchen mit einem Durchmesser von 0,95 cm (3/8 Inch) werden im Zentrum eines Löches mit einem Durchmesser von 0,64 cm (1/4 Inch) befestigt, das im Zentrum eines kreisförmigen Elements mit einem Inch Durchmesser aus "Tegaderm 1625 Transparent Dressing", erhältlich von Minnesota Mining and Manufacturing, St. Paul, Minnesota, ausgeschnitten wurde.
Drei befestigten Membranen werden auf der Brust einer Person befestigt, die anschließend eine Marihuana-Zigarette raucht. Drei befestigte Membranen werden ferner an einer Person befestigt, die nie Marihuana in irgendeiner Form verwendet hat und auch einer Nicht-Verwendung für die nächsten sieben Tage zustimmt. Die Membranen bleiben an Ort und Stelle, bis sie sieben Tage später entfernt werden. Jede der abgelösten Membranen wird fünfmal mit 300 µl 0,2% Tween 20 in PBS gespült. Die Membranen werden 30 Minuten in 100 µl "E-Z-Screen Cannabinoid"-Enzymkonjugat aus dem "E-Z-Screen"-Testkit (erhäldich von Environmental Diagnostics, Inc., Burlington, North Carolina) inkubiert.
Nach der Inkubation wird jede Membran dreimal mit 300 µl 0,2% Tween 20 in PBS gewaschen, wonach dreimal nur mit PBS gewaschen wird. Die Membranen werden anschließend in "TMB Membrane Peroxide"-Substrat (erhältlich von Kirkegaard & Perry Labs, Gaithersburg, Maryland) 10 Minuten inkubiert. Ein hellblauer Hintergrund erscheint auf allen sechs Membranen. Weiße Flecken erscheinen vor dem Hintergrund auf den drei Membranen, die von der Person stammen, die eine Marihuana-Zigarette geraucht hat, was die Schweißdrüsenabsonderung von THC-Derivate enthaltendem Schweiß anzeigt. Keine weißen Flecken erscheinen auf den drei Membranen, die von der kein Marijuana verwendenden Person stammen.

Beispiel 4

Positives Kontrollpflaster

Der monodonale Maus-anti-Mensch-IgG-Fc-Antikörper (erhäldich von ICN, Costa Mesa, Kalifornien) wird 1:100 in PBS (pH 7,5) verdünnt. Die Antikörper werden an die "Gelman 0,45 µm (SU-450) Ultrabind Supported"-Membran gemäß dem Protokoll im "Gelman Original Equipment Manufacturer"-Handbuch P. N. 31,084 gebunden. Die Membranen werden an der Luft getrocknet. Scheibchen mit einem Durchmesser von 3/8 Inch werden aus den beschichteten "Gelman"-Membranen ausgeschnitten. Diese Scheibchen mit einem Durchmesser von 0,95 cm (3/8 Inch) werden in einem Löch mit einem Durchmesser von 1/4 Inch zentriert und befestigt, das im Zentrum eines kreisförmigen Elements mit einem Inch Durchmesser aus "Tegaderm 1625 Transparent Dressing" ausgeschnitten wird.
Drei befestigte Membranen werden auf der Brust von fünf Personen befestigt. Die Membranen bleiben an Ort und Stelle, bis sie sieben Tage später entfernt werden. Jede der entfernten Membranen wird fünfmal mit 300 µl 0,2% Tween 20 in PBS gespült. Die Membranen werden 30 Minuten in 100 µl des Enzyms Meerrettichperoxidase inkubiert, das mit dem 1:1 000 in PBS verdünnten pelyclonalen Ziegen-anti-Mensch- IgG-Fc-Antikörper (erhältlich von ICN, Costa Mesa, Kalifornien) konjugiert ist.
Nach der Inkubation wird jede Membran dreimal mit 300 µl 0,2% Tween 20 in PBS gewaschen, wonach dreimal nur mit PBS gewaschen wird. Die Membranen werden anschließend in "TMB Membrane Peroxide"-Substrat (erhältlich von Kirkegaard & Perry Labs, Gaithersburg, Maryland) 10 Minuten inkubiert. Blaue Flecken, die den einzeinen Schweißkanälen entsprechen, erscheinen vor dem Hintergrund auf allen Membranen, was anzeigt, daß die Chemie der Pflaster beim Nachweis des im Schweiß aller Personen erwarteten IgG funktioniert.
Obwohl diese Erfindung in bezug auf bestimmte bevorzugte Ausführungsformen und Immuntestschemata beschrieben wurde, sind andere Ausführungsformen und Immuntests, die dem Durchschnittsfachmann bekannt sind, ebenfalls im erfindungsgemäßen Schutzbereich. Daher darf der erfindungsgemäße Schutzbereich nur durch Bezugnahme auf die angefügten Ansprüche definiert werden.

Claims

1. Konzentrierungspflaster zur Anwendung auf der Haut zur Bestimmung der Gegenwart eines Analyten im Schweiß eines Säugerindividuums, umfassend eine wasserdurchlässige Trägerschicht (20) zur Konzentrierung der Komponenten in der Schweißflüssigkeit, die eine erste und eine zweite Seite hat, und ein Mittel zum wiederablösbaren Anbringen der ersten Seite der Trägerschicht (20) zum Flüssigkeitsaustausch mit der Haut des Individuums, bei dem Wasser durch die Trägerschicht (20) und nach außerhalb des Konzentrierungspflasters gelangen kann; wobei das Konzentrierungspflaster dadurch gekennzeichnet ist, daß die Trägerschicht (20) mindestens ein daran immobilisiertes Reagens enthält, das einen spezifischen Bindungspartner für eine Referenzkomponente im Schweiß des Säugerindividuums umfaßt.

2. Konzentrierungspflaster zur Anwendung auf der Haut nach Anspruch 1, weiter umfassend eine durchlässige äußere Schutzschicht (30), die benachbart zu der zweiten Seite der Trägerschicht (20) angeordnet ist.

3. Konzentrierungspflaster zur Anwendung auf der Haut nach Anspruch 1, weiter umfassend ein an die Trägerschicht (20) immobilisiertes zweites Reagens, das einen spezifischen Bindungspartner für den Analyten in dem Schweiß des Säugerindividuums umfaßt.

4. Konzentrierungspflaster zur Anwendung auf der Haut nach Anspruch 1, bei dem das zweite Reagens ein spezifischer Bindungspartner für eine Droge oder ihren Metaboliten ist.

5. Konzentrierungspflaster zur Anwendung auf der Haut nach Anspruch 1, bei dem das Mittel zum Anbringen einen Klebestreifen umfaßt.

6. Konzentrierungspflaster zur Anwendung auf der Haut nach Anspruch 5, zusätzlich umfassend eine Vielzahl von auf dem Klebestreifen angeordneten Belastungseinschnitten ("stress razors") (66), so daß der Streifen nicht leicht als Ganzes abgelöst werden kann.

7. Konzentrierungspflaster zur Anwendung auf der Haut nach Anspruch 1, bei dem die Trägerschicht (20) mindestens eine Nachweiszone für den Analyten mit mindestens einem Nachweisreagens für den Analyten hat, das an jede Nachweiszone für den Analyten zum Nachweis der Gegenwart von mindestens einem Analyten immobilisiert ist.

8. Pflaster zur Anwendung auf der Haut nach Anspruch 7, bei dem das Nachweisreagens für den Analyten in mindestens einer der Nachweiszonen für den Analyten einen Antikörper mit einer Affinität für eine Droge oder einen Metaboliten davon umfaßt, die (der) durch die Haut gelangen kann.

9. Verfahren zur Bestimmung der Gegenwart eines Analyten in der Schweißflüssigkeit eines Säugers, umfassend die Schritte:

- Ansammlung einer Menge der Schweißflüssigkeit eines Säugers von einem Säugerindividuum;

- Entfernung mindestens eines Teils der Wasserkomponente aus der Schweißflüssigkeit unter dem Einfluß der Körperwärme zur Bildung eines Konzentrats; und

- Bestimmung der Menge mindestens eines Analyten in dem Konzentrat;

wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, daß es weiter den Schritt zur Bestimmung der Menge einer Referenzkomponente umfaßt, von der bekannt ist, daß sie in der Schweißflüssigkeit vorkommt.

10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei der Schritt zur Bestimmung der Menge mindestens eines Analyten die Bindung des Analyten an einen immobilisierten spezifischen Bindungspartner für den Analyten umfaßt.

11. Verfahren nach Anspruch 9, wobei der Schritt zur Bestimmung der Menge einer Referenzkomponente die Bindung der Referenzkomponente an einen immobilisierten spezifischen Bindungspartner für den Analyten umfaßt.

12. Verfahren nach Anspruch 9, wobei der Ansammlungsschritt die Ansammlung der Körperflüssigkeit in einer porösen Schicht für einen Testzeitraum umfaßt und zusätzlich umfaßt:

- die vorherige Bestimmung einer Menge der Referenzkomponente, die bestimmt werden würde, wenn sich die Körperflüssigkeit für im wesentlichen den gesamten Testzeitraum ansammeln würde; und

- den Vergleich der bestimmten Menge der Referenzkomponenten mit der vorherbestimmten Menge.

13. Konzentrierungspflaster zur Anwendung auf der Haut zur Bestimmung der Gegenwart eines Analyten im Schweiß eines Säugerindividuums, umfassend:

- eine wasserdurchlässige Trägerschicht (20), die als Konzentrierungszone für Komponenten in der Schweißflüssigkeit dient, mit einer ersten und einer zweiten Seite;

- eine Klebeschicht (65), die benachbart zu der zweiten Seite der Trägerschicht (20) angeordnet ist, zum wiederablösbaren Anbringen der ersten Seite der Träger schicht (20) zum Flüssigkeitsaustausch mit der Haut des Individuums, wobei Wasser durch die Trägerschicht (20) und nach außerhalb des Konzentrierungspflasters gelangen kann; und

- eine Vielzahl von Belastungseinschnitten ("stress razors") (66), die auf der Klebeschicht (65) angeordnet sind, so daß die Klebeschicht (65) nicht leicht als Ganzes abgelöst werden kann.

14. Konzentrierungspflaster zur Anwendung auf der Haut nach Anspruch 13, bei dem die Klebeschicht des Pflasters weiter eine Vielzahl von Lochperforationen (73) umfaßt, die über einen breiten Streifen der Klebeschicht (65) verteilt sind und sich vom äußeren Rand der Klebeschicht (65) bis zu einem engen, undurchlässigen, die Konzentrierungszone (14) umgebenden Streifen (77) erstreckt, wobei die Breite des undurchlässigen Streifens (77) zwischen 0,064 und 0,64 cm (0,025 bis 0,25 Inch) liegt.

15. Verfahren zum Nachweis von falsch-negativen Ergebnissen in einem Test für die Körperflüssigkeit eines Individuums, wobei die falsch-negativen Ergebnisse das Ergebnis der Nicht-Einhaltung des Testverfahrens bei dem Individuum sind, umfassend die Schritte:

- Anbringen eines Testpflasters mit einer Vielzahl von auf dem Klebestreifen angeordneten Einschnitten (66), der zum Anbringen des Pflasters bei dem Individuum verwendet wird, wobei das Testpflaster in der Art angebracht wird, daß es in Austausch mit einer Quelle von Körperflüssigkeit gebracht wird;

- Verbleiben des Testpflasters an Ort und Stelle für einen ausreichenden Zeitraum, damit die Gegenwart eines Analyten bestimmt werden kann; und danach

- Untersuchung des Testpflasters zur Bestimmung, ob das Testpflaster beschädigt ist, wobei ein beschädigtes Testpflaster anzeigt, daß das Testpflaster nicht ununterbrochen bei dem Individuum angebracht gewesen sein kann.

16. Konzentrierungspflaster zur Anwendung auf der Haut zur Bestimmung der Gegenwart eines photosensitiven Analyten im Schweiß eines Säugerindividuums, umfassend:

- eine wasserdurchlässige Trägerschicht (20), die als Konzentrierungszone für Komponenten in der Schweißflüssigkeit dient, mit einer ersten Seite und einer zweiten Seite, wobei die erste Seite in Flüssigkeitsaustausch mit der Haut eines Individuums gebracht werden kann;

- ein Mittel zum Anbringen der ersten Seite der Trägerschicht (20) zum Flüssigkeitsaustausch mit der Haut des Individuums; und

- eine Lichtabfangschicht (92), die der zweiten Seite der Trägerschicht (20) aufliegt und im wesentlichen für den Durchtritt von Lichtstrahlung undurchlässig ist, und wobei Wasser durch die Trägerschicht (20) und nach außerhalb der Konzentrierungszone (14) gelangen kann, wobei sich der Analyt in der Konzentrierungszone (14) ansammelt.

17. Pflaster nach Anspruch 16, bei dem das Mittel zur Anbringung der ersten Seite der Trägerschicht (20) zum Flüssigkeitsaustausch mit der Haut des Individuums eine an die zweite Seite der Trägerschicht (20) angeheftete Klebemembran ist.

18. Pflaster nach Anspruch 16, bei dem die Lichtabfangschicht (92) zur Anbringung der ersten Seite der Trägerschicht (20) zum Flüssigkeitsaustausch mit der Haut des Individuums klebend ist.

19. Konzentrierungspflaster nach Anspruch 16, bei dem die Lichtabfangschicht (92) den Durchtritt von wäßrigen Schweißkomponenten erlaubt.

20. Konzentrierungspflaster nach Anspruch 19, bei dem die Lichtabfangschicht (92) ein reflektierendes, mit einer vielzahl von kleinen Löchern perforiertes Material umfast.

21. Konzentrierungspflaster nach Anspruch 16, bei dem die Lichtabfangsschicht (92) ein Material umfaßt, das im wesentlichen einfallende Lichtenergie absorbieren kann.

22. Konzentrierungspflaster zur Anwendung auf der Haut zur Bestimmung der Gegenwart eines Analyten im Schweiß eines Säugerindividuums, bei dem falsch-negative Ergebnisse, die durch die Elution des Pflasters mit einem Lösungsmittel erhalten werden, nachgewiesen werden können, umfassend:

- eine wasserdurchlässige Trägerschicht (20), die als Konzentrierungszone für Komponenten in der Schweißflüssigkeit dient, mit einer ersten Seite und einer zweiten Seite, wobei die erste Seite auf der Haut des Individuums angebracht werden kann;

- ein Mittel zum wiederablösbaren Anbringen der ersten Seite der Trägerschicht (20) zum Flüssigkeitsaustausch mit der Haut des Individuums; und

- einen löslichen Marker innerhalb des Pflasters, dessen Gegenwart nach Ablösung des Pflasters nachgewiesen werden kann,

wobei ein bedeutender Mengenverlust des im Pflaster vorhandenen löslichen Markers nach Ablösung des Pflasters falsch-negative Ergebnisse anzeigt.

23 Konzentrierungspflaster zur Anwendung auf der Haut nach Anspruch 22, bei dem der Marker in nicht-wäßrigen Lösungsmitteln löslich ist.

24. Konzentrierungspflaster zur Anwendung auf der Haut nach Anspruch 22, bei dem der Marker ein sichtbarer Marker ist, keine bedeutsamen Schäden an der Haut bei ausgedehntem Hautkontakt verursacht und nicht leicht von der Haut absorbiert wird.

25. Verfahren zum Nachweis falsch-negativer Ergebnisse in einem Test für einen Analyten in einer Körperflüssigkeit eines Individuums, die das Ergebnis der Elutiom eines Testpflasters mit einem Lösungsmittel sind, umfassend die Schritte:

- Anbringen des Testpflasters bei einem Individuum zum Austausch mit einer Quelle von Körperflüssigkeit, das einen in dem für die Elution verwendeten Lösungsmittel löslichen Marker enthält;

- Ablösen des Testpflasters von dem Individuum nach einem ausreichenden Testzeitraum, der den Nachweis des Analyten durch einen Test für den Analyten ermöglicht;

- Bestimmung der Menge an im Testpflaster verbleibendem Marker; und

- Vergleich der in dem Testpflaster verbleibenden Menge an Marker mit einer Kontrolle, die eine empirisch bestimmte, in einem Testpflaster verbleibende Menge an Marker ist, das ununterbrochen von einem Individuum für den gesamten Zeitraum getragen wurde,

wobei eine in dem Testpflaster verbleibende Menge an Marker, die geringer als die Kontrolle ist, falsche Ergebnisse anzeigt.

26. Verfahren nach Anspruch 25, wobei angenommen wird, daß die Kontrolle im wesentlichen den gesamten in dem Pflaster verbleibenden Marker darstellt.

27. Verfahren nach Anspruch 26, wobei der Marker einen sichtbaren Farbstoff umfaßt und der Vergleichsschritt den Vergleich der Farbe des Testpflasters nach Ablösung des Pflasters mit der Farbe des Testpflasters vor der Anwendung umfaßt.

28. Konzentrierungspflaster zur Anwendung auf der Haut zur Bestimmung der Gegenwart eines Analyten im Schweiß eines Säugerindividuums, bei dem durch die Zugabe von verfälschenden Stoffen zu dem Testpflaster erhaltene falschnegative Ergebnisse nachgewiesen werden können, umfassend:

- eine wasserdurchlässige Trägerschicht (20), die als Konzentrierungszone für Komponenten in der Schweißflüssigkeit dient, mit einer ersten Seite und einer zweiten Seite, wobei die erste Seite auf die Haut des Individuums angebracht werden kann;

- ein Mittel zum wiederabläsbaren Anbringen der ersten Seite der Trägerschicht (20) zum Flüssigkeitsaustausch mit der Haut des Individuums;

- einen Testbereich zum Nachweis der Gegenwart eines verfälschenden Stoffes, der falsch-negative Ergebnisse in einem Test für den Analyten hervorbringen kann,

wobei Wasser durch die Trägerschicht (20) und nach außerhalb des Konzentrierungspflasters gelangen kann.

29. Konzentrierungspflaster zur Anwendung auf der Haut nach Anspruch 28, bei dem der Testbereich auf einem Streifen 20 ist, der innerhalb eines Bereiches des Pflasters angeordnet ist, der während des Tragens des Pflasters durch das Individuum dem Blick des Individuum entzogen ist, so daß dem Individuum keine sichtbare Anzeige des Testbereiches zur verfügung steht.

30. Konzentrierungspflaster zur Anwendung auf der Haut nach Anspruch 28, bei dem der Testbereich eine chemische Zusammensetzung mit Farbveränderungscharakter umfaßt, die auf die Gegenwart des verfälschenden Stoffes reagiert.

31. Konzentrierungspflaster zur Anwendung auf der Haut nach Anspruch 30, bei dem der Testbereich eine chemische Zusammensetzung mit Farbveränderungs-charakter umfaßt, die auf die Gegenwart eines verfälschenden Stoffes reagiert, ausgewählt aus Aluminium, Chromat, Kobalt, Kupfer, Eisen, Nickel, Nitrat, Peroxid, Sulfit, Zinn, Calcium, hohem pH-Wert, niedrigem pH-Wert, Glucose, Protein und Ketonen.

32. Verfahren zum Nachweis von falsch negativen Ergebnissen in einem Test für eine Körperflüssigkeit eines Individuums, die das Ergebnis der Zugabe eines verfälschenden Stoffes zu dem Testpflaster sind, umfassend die Schritte:

- Anbringen des Testpflasters bei dem Individuum zum Austausch mit der Quelle der Körperflüssigkeit, umfassend einen Teststreifen, der durch die Entwicklung einer nachweisbaren Veränderung auf dem Streifen den verfälschenden Stoff nachweisen kann;

- Bestimmung der Gegenwart des verfälschenden Stoffes aufgrund des Auftretens der nachzuweisenden Veränderung auf dem Teststreifen.

33. Verfahren nach Anspruch 32, wobei die nachzuweisende Veränderung eine Farbänderung ist.

34. Verfahren nach Anspruch 32, wobei der verfälschende Stoff ausgewählt ist aus Aluminium, Ammonium, Chromat, Chlor, Kobalt, Kupfer, Eisen, Nickel, Nitrat, Peroxid, Sulfit, Zinn, Calcium, hohem pH-Wert, niedrigem pH-Wert, Glucose, Protein und Ketonen.

35. Konzentrierungspflaster zur Anwendung auf der Haut zur Bestimmung der Gegenwart einer zu analysierenden Substanz im Schweiß eines Säugerindividuums, bei dem falsch-negative Ergebnisse, die durch die Ablösung des Pflasters durch das Individuum erzeugt werden, und das Ersetzen durch ein anderes Pflaster nachgewiesen werden können, umfassend:

- eine wasserdurchlässige Trägerschicht (20) mit einer ersten Seite und einer zweiten Seite, wobei die erste Seite in Flüssigkeitsaustausch mit der Haut eines Individuums gebracht werden kann;

- ein Mittel zum wiederablösbaren Anbringen der ersten Seite der Trägerschicht (20) zum Flüssigkeitsaustausch mit der Haut des Individuums;

- einen für jedes Pflaster einzigartigen Identifizierungsmarker, der für das Individuum schwierig zu reproduzieren ist, wobei der Marker das Pflaster als ein Pflaster identifiziert, das ursprünglich bei dem Individuum angebracht wurde,

wobei die Abwesenheit des einzigartigen Identifizierungsmarkers (67) in dem Pflaster nach dessen Ablösung falsche Ergebnisse anzeigt.

36. Konzentrierungspflaster zur Anwendung auf der Haut nach einem der Ansprüche 1, 22, 28 oder 35, wobei das Mittel zur wiederablösbaren Anbringung der ersten Seite der Trägersubstanz (20) eine Klebeschicht (65) ist, die weiter eine Vielzahl von Lochperforationen (73) umfaßt, die über einen breiten Streifen der Klebeschicht (65) verteilt sind und sich vom äußeren Rand der Klebeschicht (65) bis zu einem engen undurchlässigen, die Konzentrierungszone (14) umgebenden Streifen (77) erstrecken, wobei die Breite des undurchlässigen Streifens (77) zwischen 0,064 und 0,64 cm (0,025 bis 0,25 Inch) liegt.

37. Konzentrierungspflaster zur Anwendung auf der Haut nach Anspruch 35, bei dem der Identifizierungsmarker (67) ein Strichcode ist, der in einer von dem Blick des Individuums versteckten Position angeordnet ist.

38. Konzentrierungspflaster zur Anwendung auf der Haut nach Anspruch 37, bei dem der Identifizierungsmarker (67) zwischen der Trägerschicht (20) und dem Mittel zum wiederablösbaren Anbringen des Pflasters angeordnet ist, so daß der Marker in einer von dem Blick des Individuums versteckten Position angeordnet ist.