DE69026954T2 - Kontinuierliche zellkulturanlage von hoher dichtheit - Google Patents

Description

• Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Kultivierung von Zellen.
• Zellen werden üblicherweise in zylinderförmigen Flaschen aus Glas oder Kunststoff sowie Glaskolben gezüchtet, an deren Flächen sie anhaften. Auf diese Weise ist jedoch ein Zellwachstum mit hoher Dichte oder eine kontinuierliche Zellkultur nicht erzielbar. Vielmehr ist relativ viel Medium und Raum erforderlich. Diese Art ist ferner sehr arbeitsintensiv.
• Zur Erzielung von Wachstumsbedingungen, die zu einer höheren Dichte führen, sind verschiedene Versuche gemacht und Anordnungen mit aneinandergeschichteten Platten verwendet worden, deren Oberflächen eine vergrößerte Fläche für die Zell- ansiedlung und das Zellwachstum bieten. Trotz verschiedener Versuche haben die bekannten Zellkultureinrichtungen verschiedene Nachteile, einschließlich des Erfordernisses einer großen Menge an Medium, der Unmöglichkeit, einen kontinuierlichen Nährstoffluß zu allen Zell-Wachstumsflächen zu führen, dem Erfordernis einer arbeitsintensiven Überwachung des Zellwachstums und der Unmöglichkeit einer kontinuierlichen Arbeitsweise.
• Eine Aufgabe der Erfindung besteht darin, eine Zellkulturanlage zu schaffen, in der Zellen mit einer im Vergleich zu der Menge des in dem System enthaltenden Nährstoffmediums hohen Dichte gezüchtet werden können.
• Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht darin, eine Anordnung zur Zellkultur zu schaffen, die eine Mehrzahl von Wachstumskammern aufweist, die jeweils einen gleichen Mediumfluß aufnehmen.
• Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht darin, eine Anordnung zur Zellkultur zu schaffen, der automatisch und kontinuierlich Nährstoffmedium zugegeben und konditioniertes Medium, welches die durch die Zellen erzeugten Produkte und Abfallstoffe enthält, entzogen werden kann.
• Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht darin, eine Anordnung zur Zellkultur und ein System zu schaffen, bei dem die zellularen Umgebungsbedingungen kontinuierlich überwacht werden, wobei jede Abweichung von gewünschten Bedingungen automatisch korrigiert oder ein Alarm gegeben wird.
• Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht darin, ein kontinuierliches Fließsystem zu schaffen, um die Herstellung einer gewünschten chemostatischen Umgebung für die Zellen zu erleichtern und eine Optimierung des Ertrages und der Ausbeute an Zellprodukten, wie zum Beispiel biochemischen Stoffen, Impfviren und pharmazeutischen Produkten zu ermöglichen.
• Somit wird unter einem ersten Gesichtspunkt der Erfindung eine Gewebekulturanlage mit folgenden Merkmalen geschaffen: einer Mehrzahl von Zell-Wachstumskammern (24), deren innere Flächen an das Wachstum der Zellen angepaßt sind; einem Einlaßkanal (16) zur Schaffung einer Quelle eines Flusses zu den Kammern (24); einem Auslaßkanal (18) zum Ableiten von Flüssigkeit aus den Kammern; und Flüssigkeits-Begrenzungseinrichtungen (22, 23, 48, 50) zur Schaffung einer Flüssigkeitsverbindung zwischen mindestens einem der Kanäle (16, 18) und jeder Wachstumskammer (24), wobei die Summe der Querschnittsflächen des engsten Abschnittes der Flüssigkeits- Begrenzungseinrichtungen (22, 23, 48, 50) gleich oder kleiner ist, als die Querschnittsfläche des Einlaßkanals (16). Bei einer bevorzugten Ausführungsform der unter dem ersten Gesichtspunkt betrachteten Erfindung sind die Zell-Wachstumskammern (24) durch die Abstände zwischen einer Mehrzahl von aneinandergeschichteten Platten (26) abgegrenzt.
• Unter einem zweiten Gesichtspunkt der Erfindung wird eine Gewebekultur-Platte (26) geschaffen, die mit ähnlichen Platten (26) zur Bildung einer Gewebekultureinrichtung gemäß Anspruch 3 aneinandergeschichtet werden kann, wobei die Platte (26) eine geformte rechteckige Plattform umfaßt, die eine im wesentlichen flache obere (30) und untere (36) Oberfläche aufweist, wobei mindestens eine der Oberflächen (30, 36) einen am Umfang verlaufenden Steg (32) aufweist und die Platte (26) ferner ein Paar diagonal gegenüberliegender Ecken (40) umfaßt, die bis zur Höhe des entlang des Umfangs verlaufenden Steges (32) ausgefüllt sind und eine durch jede ausgefüllte Ecke (40) verlaufende Bohrung (42, 44) aufweisen, deren Achse senk- recht zu der durch die Plattform gebildeten Ebene verläuft, und ein zweiter Durchgang (48) vorgesehen ist, der eine Verbindung zwischen der Bohrung (42, 44) und dem inneren, durch die Stege (32) und die Plattform abgegrenzten Raum herstellt.
• Weitere Ausführungsformen der Erfindung unter ihrem ersten oder zweiten Gesichtspunkt werden in den Unteransprüchen beschrieben.
• Mit der Erfindung wird eine kontinuierliche Zellkultureinrichtung geschaffen, die eine Anordnung von Wachstumskammern aufweist, welche einen sehr großen Oberflächenbereich für ein Zellwachstum mit hoher Dichte in einem kleinen Volumen abgrenzen. Die Einrichtung ist so konstruiert und angeordnet, daß ein gerichteter Fluß durch die Wachstumskammern geschaffen wird, der kontinuierlich ist und alle Wachstumsflächen innerhalb jeder Kammer erreicht. Ein angemessener Fluß innerhalb jeder Kammer wird dadurch erzielt, daß jede Kammer mit einer den Fluß begrenzenden Öffnung versehen ist, wobei diese Öffnungen eine Steuerung und Verteilung des Flusses in jeder Wachstumskammer bewirken.
• Die Zellkultureinrichtung umfaßt vorzugsweise eine Anordnung von Zell-Wachstumskammern, die durch die Räume zwischen einer Mehrzahl von aneinandergeschichteten Platten abgegrenzt sind. Mit einem Einlaßkanal wird eine Quelle für das Nährmittelmedium in ein Rohr geschaffen, das über die den Fluß begrenzenden öffnungen in Flüssigkeitsverbindung mit den Zell-Wachstumskammern steht. Die Summe der Querschnittsflächen der engsten Bereiche der den Fluß begrenzenden Öffnungen ist kleiner, als die Querschnittsfläche des Einlaßkanals, wodurch ein Druckabfall über jeder Fluß-Begrenzungsöffnung geschaffen und eine angemessene Strömung der Flüssigkeit durch jede Wachstumskammer sichergestellt wird.
• Die Fluß-Begrenzungsöffnungen und die Wachstumskammern sind vorzugsweise so konstruiert und angeordnet, daß die Verteilung und die kontinuierlich gerichtete Strömung des Flüssigkeitsmediums zu allen Wachstumsflächen mit einem Minimum an Turbulenzen unterstützt wird. Dies kann dadurch erreicht werden, daß Wachstumskammern geschaffen werden, die im wesentlichen quadratische Boxen mit einer Einlaß-Begrenzungsöffnung und einer Auslaß-Begrenzungsöffnung an gegenüberliegenden Ecken der Box sind. Die Fluß-Begrenzungsöffnungen können einen verengten Zwischenabschnitt aufweisen. Die Ecken können gekrümmte Oberflächen aufweisen, um die Flüssigkeitsverteilung und die nichtturbulente Strömung zu verbessern. Zwischen gegenüberliegenden Flächen der Platten können Rippen vorgesehen sein, um eine strukturelle Verstärkung zu schaffen und die Strömung der Flüssigkeit noch besser auszurichten.
• Mit der Erfindung wird somit ein geschlossenes steriles System zur Kultivierung von Zellen geschaffen und sowohl verhindert, daß das Laborpersonal den Zellen und ihren Produkten ausgesetzt, als auch die Kultur durch die äußere Umgebung verschmutzt wird. Die Wachstumsbedingungen können automatisch erfaßt werden, wobei in Abhängigkeit von den gemessenen Bedingungen Nährmittel hinzugefügt und Zellprodukte entfernt werden können.
• Die Einrichtung kann wirtschaftlich betrieben und in großem Maßstab hergestellt werden.
• Figur 1 zeigt eine perspektivische Ansicht eines erfindungsgemäßen Zellkulturgefäßes von einer oberen rechten Seite;
• Figur 2 zeigt einen perspektivischen Querschnitt entlang der Linie a-a in Figur 1;
• Figur 3 zeigt eine perspektivische Ansicht einer einzelnen Kulturplatte von oben und von vorn, die zum Aufbau des Zellkulturgefäßes gemäß Figur 1 verwendet wird;
• Figur 4 zeigt eine vergrößerte Darstellung einer Ecke der in Figur 3 gezeigten Platte;
• Figur 5 zeigt eine perspektivische Ansicht einer zylindrischen Ausführungsform eines Zellkulturgefäßes gemäß der Erfindung, bei dem die nahe Seite des Gehäuses entfernt ist, um die Oberfläche und das Ende der enthaltenen Wachstumskammer darzustellen;
• Figur 6 zeigt eine Endansicht der spiralförmigen Wachstumskammer gemäß Figur 5 im Querschnitt;
• Figur 7 zeigt eine schematische Ansicht eines erfindungsgemäßen Zellkulturgefäßes in einer kontinuierlichen Zellkulturanordnung; und
• Figur 8 zeigt eine Ansicht einer Ausführungsform einer Plattenanordnung von vorne in Explosionsdarstellung mit einer Dichtung, die die Höhe und die Konfiguration des Raumes zwischen den Platten abgrenzt, die zur Bildung des Kulturgefäßes gemäß Figur 1 verwendet werden.
• Die Zellkultureinrichtung der bevorzugten Ausführungsform umfaßt eine Anordnung von Wachstumskammern, die in einem Gefäß eingeschlossen sind. Die Wachstumskammern schaffen eine große Fläche (Oberflächenbereich) für das Zellwachstum. In der äußeren Ansicht (Figur 1) ist das Gefäß 10 eine im wesentlichen quadratische Box mit einer quadratisch geformten Oberseite 12 und einer Basis 13 sowie vertikal geformten Seitenwänden 14, die entlang der Kanten abgedichtet sind, um eine flüssigkeitsdichte Anordnung zur Aufnahme der Wachstumskammern zu bilden. Von diagonal gegenüberliegenden Ecken der Oberseite 12 erstreckt sich ein Einlaßkanal 16 bzw. ein Auslaßkanal 18. Der Einlaßkanal 16 schafft einen Flüssigkeitszugang zu dem Innenraum des Gefäßes 10, während der Auslaßkanal 18 einen Flüssigkeitsausgang aus dem Innenraum des Gefäßes 10 bildet. Der Auslaßkanal 18 kann sich auch durch die Basis 13 hindurcherstrecken, und nicht nur durch die Oberseite 12, wie es in der Figur 1 zu erkennen ist.
• Gemäß Figur 2 ist der Einlaßkanal 16 axial zu einem Ansaugrohr 20 ausgerichtet und steht in Flüssigkeitsverbindung mit diesem, welches sich an der Ecke transversal durch den Innenraum des Gefäßes 10 erstreckt. Einlaß-Begrenzungsöffnungen 22 schaffen eine Flüssigkeitsverbindung zwischen dem Ansaugrohr 20 und einer Mehrzahl von Zell-Wachstumskammer 24, die in dem Gefäß 10 angeordnet sind, wobei die Kammern 24 an oberen und unteren Bereichen durch eine Anordnung von aneinandergeschichteten Platten 26 abgegrenzt sind. An der dem Ansaugrohr 20 gegenüberliegenden Ecke des Gefäßes befindet sich ein Auslaßrohr 28, welches in Flüssigkeitsverbindung mit dem Auslaßkanal 18 steht. Jede Wachstumskammer 24 steht über eine Flüssigkeits- Begrenzungsöffnung 23 am Auslaß mit dem Auslaßrohr 28 in Flüssigkeitsverbindung. Die Anordnungen der Ansaug- und Auslaßrohre sind bei der bevorzugten Ausführungsform spiegelbildlich zueinander, so daß die Strömungseigenschaften bei einem Fluß des Mediums von dem Einlaß- zu dem Auslaßende die gleichen sind, wie in umgekehrter Richtung.
• Die relativen Größen der Begrenzungsöffnungen 22, 23 und der Kanäle 16, 18 bilden einen wesentlichen Teil der Erfindung. Um sicherzustellen, daß in jeder Kammer eine kontinuierliche und gesteuerte Strömung des fließenden Mediums vorhanden ist, muß über der die Strömung begrenzenden Öffnung, die die Strömung innerhalb jeder Kammer steuert, ein Druckabfall vorhanden sein. Um dies zu erreichen, sind die Abmessungen der die Strömung steuernden Begrenzungsöffnungen so gewählt, daß die Summe der Querschnittsflächen der engsten Abschnitte dieser Begrenzungsöffnungen gleich oder vorzugsweise kleiner ist, als die Querschnittsfläche des Einlaßkanals. Vorzugsweise ist die Summe dieser Querschnittsflächen auch gleich oder kleiner, als die Querschnittsfläche des Auslaßkanals. Wenn diese Bedingungen erfüllt sind, wird keine Wachstumskammer aufgrund ihrer Lage bevorzugt. Alle Wachstumskammern erhalten vielmehr grundsätzlich das Flüssigkeitsmedium auf der Basis der besonderen Abmessung der Flüssigkeits-Begrenzungsöffnung, die die Strömung in dieser Kammer steuert. Die Flüssigkeits-Begrenzungsöffnungen sind vorzugsweise gleichförmig dimensioniert, so daß jede Wachstumskammer das flüssige Medium mit einer identischen Strömungsrate erhält.
• Bei den dargestellten Ausführungsformen befinden sich Strömungs-Begrenzungsöffnungen sowohl an dem Einlaßals auch an dem Auslaßende der Wachstumskammern. Die kleinere dieser beiden Begrenzungsöffnungen steuert die Strömung durch eine betreffende Wachstumskammer, unabhängig von ihrer Lage an dem Einlaß- oder Auslaßende. Somit sollte die Summe der Querschnittsflächen der kleineren (Einlaß- und Auslaß-) Begrenzungsöffnungen jeder Kammer kleiner sein, als die Querschnittsfläche der Kanäle. Wenn ein Paar von Einlaß- und Auslaß-Begrenzungsöffnungen gleichförmig dimensioniert ist und an ihren engsten Abschnitten die gleiche Querschnittsfläche vorhanden ist, so ist bei der Berechnung der Summe der Querschnittsflächen gemäß obiger Beschreibung nur eine Querschnittsfläche enthalten.
• Die Platten 26 sind so aneinandergeschichtet, daß sie die Wachstumskammern bilden. Die Platten sind vorzugsweise mit 1 mm oder mehr beabstandet. Die Platten können zwar auch einen geringeren Abstand voneinander aufweisen, in diesem Fall besteht jedoch die Gefahr, daß zwischen den Platten Luftblasen eingefangen werden, die die gleichförmige Strömung des Mediums (bei einem Abstand von weniger als 1 mm) unterbrechen. Die Oberflächen der Platten können aufgerauht, gewellt, gefaltet oder in anderer Weise unregelmäßig sein, um ihre Fläche und damit auch die Anzahl der Zellen, die auf der Platte wachsen können, zu vergrößern. Wenn die Platten unregelmäßig geformt sind, sollte der Abstand von 1 mm zwischen den gegenüberliegenden Spitzen der unregelmäßigen Flächen gegeben sein. Die Oberflächen der Platten können auch auf verschiedene Weisen behandelt sein, um das Zellwachstum zu fördern. Typische Behandlungen dieser Art sind solche mit Karboxylgruppen, ferner Kollagenbehandlungen, Fibronectinbehandlungen oder Versorgungs-Zellbeschich- tungen.
• Die Platten der erfindungsgemäßen Ausführungsform wurden aus K-Harz, einem Block-Kopolymer aus Polystyren und Butadien, lieferbar von der Phillips Chemical Co., Bartlesville, OK, 74004 geformt ("K-Harz" ist ein eingetragene Warenzeichen). Geeignete Plattenmaterialien enthalten Styren-Verbindungen oder Materialien, wie zum Beispiel Polymethyl-Pentene. Die Platten können jedoch auch aus nahezu jedem anderen Material gefertigt sein, welches eine genügende Festigkeit aufweist und nicht toxisch, bioverträglich und in jeder anderen Weise für eine Gewebekultur geeignet ist.
• Die Platten gemäß der bevorzugten Ausführungsformen haben eine neuartige Konstruktion, die die Strömungsverteilung verbessert und die Herstellung erleichtert. Jede Platte 26 hat eine obere Fläche 30, die durch eine entlang des Umfangs verlaufende Wand 32 (Figur 3) begrenzt ist. Die nach innen gerichtete Oberfläche 34 der Wand 32 bildet zusammen mit der oberen Fläche 30 der Platte die Seitenwände und den Boden einer Wachstumskammer 24. Wenn die Platten 26 in der zusammengebauten Vorrichtung aneinandergeschichtet sind, fügt sich die obere Kante 35 der Wand 32 mit der unteren Fläche 36 einer benachbarten Platte abdichtend zusammen und grenzt eine Wachstumskammer ab, wobei die obere Fläche der Kammer durch die untere Fläche 36 der benachbarten Platte gebildet wird. Zur Verbesserung der sich meinanderfügenden Anordnung der aneinandergeschichteten Platte ist die Wand 32 an ihrer oberen Kante 35 mit einer Rille (Nut) 33 zur Aufnahme eines angepaßten Steges 37 an der Bodenfläche der benachbarten Platte versehen. Der angepaßte Steg 37 und die Nut 33 dienen zur Ausrichtung der aneinandergeschichteten Platten.
• Die vier Ecken 38, 40 jeder Platte 26 sind fest bis auf eine Dicke ausgefüllt, die gleich der Höhe der entlang des Umfangs verlaufenden Wand 32 ist. Die ausgefüllten Ecken tragen zur Abstützung der zusammengesetzten Struktur bei. Die ausgefüllten Ecken reduzieren ferner die Möglichkeit einer Strömungsturbulenz sowie von "toten Punkten", was weiter unten im Detail erläutert werden soll.
• Jede Platte 26 weist an diagonal gegenüberliegenden, ausgefüllten Ecken 40 eine Bohrung auf. In zusammengebautem Zustand sind die Bohrungen 42, 44 der aneinandergeschichteten Platten 26 axial ausgerichtet und bilden die Ansaug- bzw. Auslaßrohre 20, 28. Von jeder Bohrung 42, 44 erstreckt sich durch die ausgefüllte Ecke 40 ein Durchgang 48 zu dem inneren Raum, der durch die Seitenwände und den Boden jeder Platte 26 abgegrenzt wird. Diese Durchgänge bilden in zusammengebautem Zustand die Flüssigkeits-Begrenzungsöffnungen 22, 23 und schaffen einen Flüssigkeitszugang zwischen den Rohren 20, 28 und den Wachstumskammern 24. Jeder Durchgang hat einen Boden, der durch einen Teil der oberen Fläche 30 der Platte 26 abgegrenzt ist, sowie Seitenwände 49, die integral als Teil der Ecken 40 ausgebildet sind und eine Höhe haben, die gleich der des entlang des Umfangs verlaufenden Steges 32 ist. Die Flüssigkeits-Begrenzungsöffnungen 22, 23 entstehen, wenn die flache Bodenfläche einer gegenüberliegenden Platte 26 zur Abdichtung des offenen oberen Endes des Durchgangs 48 daraufgeschichtet wird.
• Die besondere Gestalt der Strömungs-Begrenzungsöffnung bei der bevorzugten Ausführungsform umfaßt einen verengten inneren Abschnitt in Form einer Einschnürung 50. Der Durchmesser der Strömungs-Begrenzungsöffnung 22 wächst danach kontinuierlich und im wesentlichen in Richtung auf die Wachstumskammer 24 an. Diese Anordnung führt dazu, daß sich das in eine Wachstumskammer eintretene Medium ausbreitet und gleichförmig in radialer Form in dem Innenraum der Wachstumskammer verteilt, wodurch die Nährstoffversorgung und eine gleichförmige Strömung über die gesamte Wachstumsfläche gefördert wird. Diese Anordnung reduziert ferner Turbulenzen, und zwar insbesondere an und in der Umgebung der Begrenzungsöffnungen 22. Bei der dargestellten Ausführungsform wächst der Durchmesser der Strömungs- Begrenzungsöffnung linear an. Eine Öffnung, die wie eine Venturi-Öffnung zweiter oder dritter Ordnung geformt ist, würde darüberhinaus eine kontinuierliche, allmähliche Änderung der Geschwindigkeit bewirken, wodurch die nichtturbulente Strömung weiter verbessert werden würde.
• Die nichtturbulente und gerichtete Strömungsform wird ferner durch die ausgefüllten Ecken 38 sowie durch strömungsführende Rippen 46 unterstützt. Die Ecken würden in dem Falle, in dem sie nicht ausgefüllt wären, eine Wand senkrecht zur Richtung der Strömung darstellen, die wiederum zu Turbulenzen und "toten Punkten" und somit zu Bereichen innerhalb der Wachstumskammer führen würde, die nicht einer kontinuierlichen und gerichteten Strömung von frischem Medium ausgesetzt sind. Dies kann zur Vernichtung der betreffenden Zellen führen. Die ausgefüllten Ecken schaffen eine gekrümmte Fläche, die eine kontinuierliche strömung in Richtung der Auslaßöffnungen bewirkt. Die Rippen 46 haben eine zweifache Funktion. Sie dienen einerseits zur Schaffung einer strukturellen Verfestigung jeder Platte und halten die Platten mit dem geeigneten Abstand auseinander, auch wenn die Einrichtung unter Vakuum gelehrt wird, und können andererseits so positioniert sein, daß sie die Strömung kontinuierlich in Richtung der Auslaßöffnungen kanalisieren.
• Zum Zusammenbau der Vorrichtung müssen die Platten aneinandergeschichtet und in der Weise gesichert werden, daß die entlang des Umfangs verlaufenden Wände und Ecken der Platten abdichtend mit den Bodenflächen der gegenüberliegenden Platten verbunden sind. Gegenwärtig wird jede Platte an ihrer benachbarten Platte durch Ultraschallschweißen befestigt. Es ist jedoch auch jedes andere Fertigungsverfahren, wie zum Beispiel Schweißen mit Lösungsmitteln, HF-Schweißen, Vergießen, Verkleben oder eine Verbindung mit Dichtungen möglich, solange die Vorrichtung eine ausreichende Stärke aufweist und für die Zellkulturen nicht toxisch ist.
• Zum Betrieb werden in die Vorrichtung zunächst die Zellen eingesetzt (gesäht). Anschließend wird das flüssige Medium in der folgenden Weise den Zellen zugeführt. Das flüssige Medium wird über den Einlaßkanal 16 zu dem Einlaßrohr 20 geführt. Das flüssige Medium gelangt dann durch die verschiedenen Strömungs-Begrenzungsöffnungen 22 in die zugeordneten Wachstumskammern 24. Aufgrund der Gesamtkonstruktion der Strömungs-Begrenzungsöffnungen und der Wachstumskammern wird die Strömung kontinuierlich und vollständig auf alle Flächen der Wachstumskammer 24 verteilt, wobei sich das flüssige Medium ständig im wesentlichen in eine Richtung zu den Auslaß-Strömungsbegrenzern 23 bewegt. Das Medium fließt dann durch die Auslaß Strömungsbegrenzer 23 in das Auslaßrohr 28 und anschließend über den Auslaßkanal 18 aus der Vorrichtung heraus.
• Eine andere Ausführungsform der Erfindung weist ein zylindrisches Gehäuse auf, welches eine Anordnung von in Längsrichtung ausgerichteten Kulturkammern enthält. Wie in Figur 5 gezeigt ist, umschließt ein zylindrisches Gehäuse 56 die äußere Oberfläche einer zylindrischen Kultivierungskammer 57 abdichtend. Das Gehäuse 56 ist an jedem Ende mit zwei kreisrunden Abschlußplatten, Einlaß-Endplatten 58 und Auslaß-Endplatten 59, die jeweils geringfügig von den gegenüberliegenden Enden der Kultivierungskammer 57 beabstandet sind, abgedichtet. Den Raum zwischen der Einlaß-Endplatte 58 und dem Einlaßende der Kultivierungskammer 57 grenzt ein Ansaugrohr (Einlaßrohr) 60 ab. Den Raum zwischen der Auslaß-Endplatte 59 und dem Auslaßende der Kultivierungskammer 57 grenzt ein Auslaßrohr 62 ab. Die Flüssigkeit tritt in der Einlaßrohr 60 über einen Einlaßkanal 64 ein, der flüssigkeitsdurchgängig an der Einlaß-Endplatte 58 befestigt ist und sich axial von dieser wegerstreckt. Die Flüssigkeit verläßt das Auslaßrohr 62 über einen Auslaßkanal 66, der flüssigkeitsdurchgängig an der Auslaß-Endplatte 59 befestigt ist und sich axial von dieser wegerstreckt.
• Die sich längserstreckenden Wachstumskanäle der Kultivierungskammer 57 werden durch Aufrollen eines rechteckigen flexiblen Bogens 72 gebildet, der eine Mehrzahl von in Längsrichtung ausgerichteten, hervorstehenden Stegen 74 aufweist. Durch das Aufrollen des Bogens von einer parallel zu den hervorstehenden Stegen 74 verlaufenden Seite nimmt dieser die Gestalt eines spiralförmigen Zylinders (Figur 6) an. Die hervorstehenden Stege 74 bilden zusammen mit den sich überlappenden Windungen des aufgerollten Bogens 72 eine in Längsrichtung verlaufende Anordnung von Kanälen 76, wobei die Höhe der Stege 79 die Höhe jedes Kanals 76 abgrenzt. Die offenen Enden der Kanäle 76 sind mit einem Pfropfen oder einer Kappe abgeschlossen, um Begrenzungsöffnungen 22 zu schaffen, die den Flüssigkeitszugang zu jedem Kanal 76 begrenzen.
• Die Arbeitsweise dieser Ausführungsform ist ähnlich der oben beschriebenen Arbeitsweise. Die Vorrichtung wird zunächst mit Zellen besetzt, die sich auf den Oberflächen der Kanäle 76 festsetzen. Anschließend wird das flüssige Medium über den Einlaßkanal 64 in das Einlaßrohr 60 geführt. Das flüssige Medium läuft dann von dem Rohr über die Einlaß-Begrenzungsöffnungen 22 in die sich in Längsrichtung erstreckenden Wachstumskammern 76. Das flüssige Medium läuft kontinuierlich entlang der Länge der Wachstumskanäle 76, tritt durch die Auslaß-Begrenzungs-öffnungen (nicht gezeigt) und verläßt die Vorrichtung über das Auslaßrohr 62 und den Auslaßkanal 66.
• Unter einem Gesichtspunkt der Erfingung ist die erfindungsgemäße Zellkultureinrichtung als Teil einer Anordnung 80 vorgesehen, die schematisch in Figur 7 dargestellt ist. Die Anordnung 80 ist für eine kontinuierliche Arbeitsweise konstruiert und zusammengestellt. Die Anordnung 80 stellt ein System in Form einer geschlossenen Schleife da, in dem das erfindungsgemäße Kulturgefäß 10 mit einem Flüssigkeitsreservoir 82 verbunden ist. Eine Auslaßöffnung 84 des Reservoirs 82 ist über eine Flüssigkeits-Zuführungsleitung 88 mit der Einlaßöffnung 86 des Kulturgefäßes 10 verbunden. Das Auslaßende 90 des Kulturgefäßes 10 steht über eine Flüssigkeits-Rückführungsleitung 94 in Flüssigkeitsverbindung mit einer Einlaßöffnung 92 des Reservoirs 82. Entlang der Flüssigkeits-Zuführungsleitung 88 ist eine Pumpe 96 zur kontinuierlichen Förderung des flüssigen Mediums von dem Reservoir durch das Kulturgefäß 10 angeordnet. Eine Nährstoff-Versorgungsleitung 98 ist zwischen der Pumpe 96 und dem Gefäß 10 mit der Flüssigkeits-Versorgungsleitung 88 verbunden, so daß Nährstoffe der Flüssigkeits-Versorgungsleitung 88 zugesetzt werden können. Zum Pumpen der Nährstoffe in die Flüssigkeits-Versorgungsleitung 88 ist eine Pumpe 100 vorgesehen. Das Reservoir 82 ist auch mit einer Leitung 102 zum Ableiten eines Produktes versehen, die mit einer Absaugpumpe 104 zur vorzugsweise kontinuierlichen Entferung von Flüssigkeit stromabwärts des Kulturgefäßes verbunden ist. Die Anordnung ist schließlich an der Flüssigkeits-Zuführungsleitung 88 und der Flüssigkeits-Ablaßleitung 94 mit Sonden 106 versehen. Diese Sonden 106 dienen zur Erfassung des Zustandes des Mediums. Die Sonden können mit einer Steuer- einrichtung 108 verbunden sein, die widerum mit den verschiedenen Pumpen zur Steuerung der Zuführung von Nährstoffen und zum Entzug von Produkten aus dem Reservoir auf der Basis des Zustandes des Mediums verbunden ist. Optional können auch Sauerstoff-Austauscheinrichtungen 110 vorgesehen sein, mit denen eine kontinuierliche Rückführung von Sauerstoff in das Kulturmedium möglich ist. Die Nährstoff-Versorgungspumpe 100 und die Produkt-Absaugpumpe 104 werden vorzugsweise kontinuierlich mit der gleichen Rate betrieben, so daß das zurückgeführte Medium kontinuierlich zugeführt und das Produkt kontinuierlich dem System entzogen wird, wobei die Pumprate durch die Steuereinrichtung bestimmt wird.
• Wie oben bereits erläutert wurde, ist es nicht notwendig, daß die Strömungs-Begrenzungsöffnungen gleiche Größe aufweisen. Wenn eine gleichmäßige Strömung durch jede Kammer gewünscht wird, so ist es - allgemein ausgedrückt - erforderlich, daß die Strömungs-Begrenzungsöffnungen die gleichen Abmessungen aufweisen. Für einen Fachmann ist es jedoch klar, daß die Strömung nicht nur von der Größe der Störmungs-Begrenzungsöffnung abhängt, sondern auch von den besonderen Abmessungen der Wachstumskammer. Folglich können die relativen Abmessungen der Strömungs-Begrenzungsöffnung und der Wachstumskammer zusammen variiert werden, während gleichzeitig eine bestimmte Strömungsrate beibehalten wird.
• Im Zusammenhang mit der bevorzugten Ausführungsform ist nur ein Paar von Begrenzungsöffnungen pro Wachstumskammer beschrieben worden. Natürlich ist es auch möglich, viele Strömungs-Begrenzungen an der Einlaßoder der Auslaßseite anzuordnen. Die Erfinder bevorzugen gegenwärtig jedoch eine Begrenzungsöffnung am Einlaß und am Auslaß, da dies die Herstellung vereinfacht, die Turbulenzen verringert und den Verlust von Zellwachstum, der normalerweise an und in der unmittelbaren Umgebung der Strömungs-Begrenzungsöffnungen auftritt, reduziert.
• Ferner ist es für einen Fachmann offensichtlich, daß es möglich ist, Strömungs-Begrenzungsöffnungen nur an der Einlaßseite vorzusehen. Ein Gefäß mit einem solchen Aufbau kann bei Anwendungen bevorzugt werden, die eine Wiedergewinnung von Zellen aus dem Gefäß erfordern, da herkömmliche Verfahren zur Entfernung von Zellen aus Kulturgefäßen die Gefahr beinhalten, daß Zellklumpen entstehen, die einen verengten Auslaß verstopfen können. Es ist auch möglich, Begrenzungsöffnungen nur an der Auslaßseite vorzusehen. Es wird jedoch vorgezogen, Begrenzungsöffnungen für die Strömung sowohl an der Einlaß- als auch an der Auslaßseite anzuordnen.
• Ferner ist die Summe der Querschnittsflächen der Strömungs-Begrenzungsöffnungen vorzugsweise kleiner oder genauso groß, wie die Querschnittsfläche der Auslaßleitung. Andernfalls wird sich in der Auslaßleitung ein Gegendruck aufbauen, der zu einer verstärkten Strömung durch eine oder mehrere Wachstumskammern führen kann.
• Bei einer anderen Ausführungsform kann ein Zellkulturgefäß ähnlich dem in den Figuren 1 bis 4 gezeigten aus einer Reihe von flachen Platten mit zwischen diesen eingesetzten Dichtungen gebildet werden, wobei die Dichtungen die Seitenwände und die Begrenzungsöffnungen der Wachstumskammer (Figur 8) bilden. Bei dieser Ausführungsform haben die Platten 126 im wesentlichen ebene obere und untere Oberflächen. An jedem Paar gegenüberliegender Ecken jeder Platte ist eine transversale Bohrung 128 angeordnet. Die Dichtung 130 hat einen Umfang, der in Größe und Gestalt dem Umfang der Platten 126 entspricht. Die nach innen gerichteten Wände 132 der Dichtung 130 grenzen einen hohlen Raum ab. Wenn ein Paar von Platten 126 eine Dichtung 130 einschließt, bilden die einander gegenüberliegenden Flächen der Platten 126 die oberen und unteren Begrenzungen einer Wachstumskammer, während die nach innen gerichteten Wände 132 der Dichtung die Seitenwände der Wachstumskammer darstellen.
• Die Ecken 134 der Dichtung sind ausgefüllt. Ein Paar gegenüberliegender Ecken ist jeweils mit einer sich durch die Dichtung hindurch erstreckenden Bohrung 136 versehen, wobei diese Dichtungs-Bohrungen 136 in ihrer Abmessung und ihrer Form den Bohrungen 128 an den gegenüberliegenden Ecken der Platten 126 entsprechen. Ein Durchgang 138 erstreckt sich von der Dichtungs-Bohrung 136 nach innen durch die Ecke in den inneren Raum, der durch die nach innen gerichteten, gegenüberliegenden Wände 132 der Dichtung 130 abgegrenzt ist. Wenn ein Plattenpaar eine Dichtung 130 zwischen sich einschließt, sind die Bohrungen 128 der Platten 126 und die Dichtungs-Bohrungen 136 zueinander ausgerichtet und bilden Rohre. Der Durchgang 138 ist an seiner oberen und unteren Ausdehnung durch die aneinandergeschichteten Platten abgeschlossen, um die Begrenzungsöffnungen zu bilden.
• Eine Zusammenstellung solcher aneinandergeschichteter Platten und Dichtungen kann mit einer Druckkraft, wie sie zum Beispiel durch Klemmen ausgeübt wird, zusammengehalten werden. Ein Vorteil dieser besonderen Ausführungsform der Erfindung besteht in der Möglichkeit, die Platten nach dem Zellwachstum voneinander zu trennen. Dadurch kann eine Zellen-Monoschicht oder "Haut" von der Oberfläche der Platten abgeschält werden. Ferner wird der Zugriff auf die Zellen auf der Oberfläche einer Platte erleichtert.
• Die in diesem Beispiel verwendete Zellkulturanordnung wurde im wesentlichen wie in Figur 7 gezeigt konstruiert (ausschließlich der Sonden und der Sauerstoff- Austauscheinrichtungen).
• Das in dieser Anordnung verwendete Zellkulturgefäß hatte die folgenden Merkmale: Zehn Platten wurden aneinandergeschichtet und miteinander durch Ultraschallschweißen verbunden. Die Bodenplatte bildete den Boden des Gefäßes. Eine obere Platte mit Befestigungsseiten für Einlaß- und Auslaßkanäle wurde abdichtend an der am weitesten oben liegenden Platte befestigt, um die am weitesten oben liegende Wachstumskammer abzugrenzen. Die obere Platte wurde in ihrer Lage festgeklemmt und durch Vergießen an allen vier Seiten der geschichteten Anordnung gesichert. Jede Platte hatte eine Dicke von etwa 1,5 mm sowie eine etwa 1 mm hohe Wand mit ausgefüllten Ecken. In aneinandergeschichtetem Zustand bildeten die Platten Wachstumskammern mit einer Höhe von etwa 1 mm sowie einer Länge und Breite von 22 mm. Die Begrenzungsöffnungen hatten an ihrem engsten Abschnitt näherungsweise eine Höhe von 1 mm und eine Breite von 2 mm und grenzten eine Querschnittsfläche von etwa 2 mm² ab. Die zylindrische Einlaßleitung hatte einen Durchmesser von 7,9 mm und eine Querschnittsfläche von etwa 49 mm². Die Querschnittsfläche der Einlaßleitung (49 mm²) war folglich größer, als die Summe der Querschnittsflächen der engsten Abschnitte der Be-
• grenzungsöffnungen (20 mm²).
• Die in diesem Beispiel verwendeten Zellen waren VERO- Zellen, die von der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland unter der ATCC-Nr. CCL 81 erhältlich sind. Die VERO-Zellen wurden in einer Rollflasche (900 cm² von der Firma CoStar Corporation, Cambridge, Mass.) bis zu einer Dichte von 5,0 x10&sup8; Zellen gezüchtet. Die Zellen wurden dann aseptisch trypsiniert, so daß sie sich von der Oberfläche der Flasche lösten. Die Zellen wurden dann in 15 ml MEM (Gibco, Grand Island, New York) und 5 ml FBS (Fetal Bobvin Serum, Sigma, St. Louis, Missouri) erneut suspendiert.
• Die Anordnung wurde dann mit 1.250 ml flüssigem Medium (MEM in 5 % FBS) gefüllt. Das Gefäß wurde dann durch Injektion der Zellen durch ein in der Flüssigkeits- Versorgungsleitung liegendes steriles Septum am Tag 0 mit Zellen besetzt, während das flüssige Medium mit einer Pumpe in das Gefäß eingeleitet wurde. Das Zuführen der Zellen wurde ausgeführt, während sich das Gefäß in seiner normalen Betriebsstellung befand (in einer vertikalen Position auf seiner Seite stehend, wobei sich die Einlaßleitung am Boden und die Auslaßleitung an der Oberseite befand). In dieser Position steigen die in das Gefäß eintretenden Blasen auf und verlassen das Gefäß wieder. Die Pumpe wurde kontinuierlich betrieben, während die Zellen langsam in den Strom des flüssigen Mediums injeziert wurden, wobei die Pumpe und die Zellinjektion zu einem Zeitpunkt unterbrochen wurde, der bei näherungsweise 90 % der Zeit lag, die erforderlich ist, um das Medium von der Stelle der Injektion zu der Auslaßöffnung des Gefäßes zu fördern. Mit diesem Verfahren zur Zuführung der Zellen wurde eine konstante Verdünnung der Injektion und eine gleichförmige Verteilung in allen Wachstumskammern des Gefäßes erreicht. Das Gefäß wurde dann für vier Stunden auf seine Bodenfläche gesetzt, damit sich die Zellen an dieser Fläche anheften konnten. Der Vorgang der Zellbesetzung wurde dann wiederholt, wobei das Gefäß auf seiner oberen Seite in eine horizontale Stellung gebracht wurde, damit sich die Zellen an dieser Fläche ansiedeln konnten.
• Nachdem das Gefäß mit Zellen besetzt worden war und sich die Zellen ansiedeln konnten, wurde die Pumpe 88 eingeschaltet und kontinuierlich mit einer Rate von 75 ml pro Minute während der ersten 24 Stunden betrieben. Zu Beginn des zweiten Tages und während der Dauer der nächsten 24 Stunden wurde zusätzliches flüssiges Medium dem System zugesetzt, um ein Gesamtvolumen von 1.750 ml zu erreichen. Ferner wurde am zweiten Tag die Pumprate von 75 ml pro Minute auf 150 ml pro Minute erhöht. Am dritten Tage wurde die Pumprate dann auf 300 ml pro Minute erhöht. Die Pumpe wurde mit dieser Rate kontinuierlich bis zum 5. Tage betrieben. Während der fünf Tage, in denen die Pumpe arbeitete, wurde 5 % CO&sub2; über die Oberfläche des flüssigen Mediums innerhalb des Reservoirs zirkuliert (dies sind näherungsweise 25 ml pro Minute). Nach fünf Tagen des Wachstums wurde das Gefäß von der Anordnung getrennt und mit Salzlösung gespült. Diesem Vorgang folgte eine Zuführung von Gluteraldehyd (in Salzlösung) in das Gefäß, um die Zellen zu fixieren. Die Zellen wurden dann mit einem Wright-Färbemittel markiert. Nach der Markierung wurde das Gefäß aufgeschnitten, um die markierten Zellen zu untersuchen. Die Oberflächen der Platten waren vollständig mit einer gleichmäßigen Zellenschicht bedeckt.
• Während der fünftägigen Wachstumsperiode wurde die Menge des Glucoseverbrauches überwacht. Der Glucoseverbrauch ergab sich wie folgt:
• Während der fünftägigen Wachstumsperiode wurde frisches Medium durch die Nährmittel-Zuführungsleitung mit einer der Veränderung des Glucoseverbrauches entsprechenden zunehmenden Menge zugeführt. Eine entsprechende Menge gebrauchten Mediums wurde über eine Überschußleitung aus dem Reservoir entfernt. Da das System eine Kapazität von 1.750 ml aufweist, führte jede Vergrößerung über diese Menge hinaus zu einem Überlauf. Nachdem das System einmal vollständig gefüllt war, führte folglich jeder Zusatz neuen flüssigen Mediums zu einer entsprechenden Entfernung einer gleichen Menge von gebrauchten Medium aus dem Flüssigkeits-Reservoir.
• Der Glucoseverbrauch wurde durch Einführen einer Spritze in das Septum und Entfernen einer kleinen Probe des flüssigen Mediums überwacht. Der Glucosewert dieser Probe wurde dann in einer von der Zellkulturanordnung getrennten Einrichtung untersucht. Wie oben bereits beschrieben wurde, ist es jedoch auch möglich, die Anordnung mit Sonden zur kontinuierlichen Überwachung der Glucose und anderer Stoffe zu versehen.

Claims (14)

1. Gewebekulturanlage, gekennzeichnet durch:

eine Mehrzahl von Zell-Wachstumskammern (24), deren innere Flächen zur Züchtung und zum Wachstum von Zellen angepaßt sind;

einen Einlaßkanal (16) zur Schaffung einer Quelle einer Strömung in die Kammern (24);

einen Auslaßkanal (18) zur Kanalisierung von Flüssigkeit aus den Kammern (24); und

Flüssigkeits-Begrenzungseinrichtungen (22, 23, 48, 50) zur Schaffung einer Flüssigkeitsverbindung zwischen mindestens einem der Kanäle (16, 18) und jeder Wachs- tumskammer (24), wobei die Summe der Querschnittsflächen des engsten Abschnittes der Flüssigkeits-Begrenzungseinrichtungen (22, 23, 48, 50) gleich oder kleiner ist, als die Querschnittsfläche des Einlaßkanals (16).

2. Gewebekulturanlage nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Zell-Wachstumskammern (24) durch den Raum zwischen einer Mehrzahl von aneinandergeschichteten Platten (26) abgegrenzt sind.

3. Gewebekulturanlage nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Platten (26) einen Abstand von mindestens 1 mm aufweisen.

4. Gewebekulturanlage nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Platten (26) im wesentlichen quadratisch sind und daß die Flüssigkeits-Begrenzungseinrichtung (22, 23, 48, 50) Flüssigkeits Begrenzungsöffnungen (22, 23) an einem Paar gegenüberliegender Ecken der Platten (26) aufweist.

5. Gewebekulturanlage nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß ferner Stützrippen (46) vorgesehen sind, die die Platten (26) voneinander trennen.

6. Gewebekulturplatte (26), die mit ähnlichen Platten (26) zur Bildung einer Gewebekulturanlage nach Anspruch 2 aneinandergeschichtet werden kann, gekennzeichnet durch:

eine geformte rechteckige Plattform, die eine im wesentlichen flache obere (30) und untere (36) Oberfläche aufweist, wobei mindestens eine der Oberflächen (30, 36) mit einem entlang des Umfangs verlaufenden Steg (32) versehen ist und die Platte (26) ferner ein Paar von diagonal gegenüberliegenden Ecken (40) aufweist, die bis zur Höhe des entlang des Umfangs verlaufenden Steges (32) ausgefüllt sind,

eine Bohrung (42, 44) durch jede der gefüllten Ecken (40), wobei die Bohrung (42, 44) eine senkrecht zu der durch die Plattform gebildeten Ebene verlaufende Achse aufweist, und

einen zweiten Durchgang (48), der eine Verbindung zwischen der Bohrung (42, 44) und dem inneren Raum schafft, der durch die Stege (32) und die Plattform abgegrenzt wird.

7. Gewebekulturplatte nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Platte (26) eine Stützrippe (46) aufweist, die integral mit der oberen Fläche (30) der Platte (26) ausgebildet ist.

8. Gewebekulturanlage nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Einlaßöffnungen (22) einen verengten Zwischenabschnitt (50) und einen sich in Richtung auf die Wachstumskammer (24) vergrößernden Durchmesser aufweisen, wodurch die durch die Einlaßöffnung (22) in die Wachstumskammer (24) eintretende Flüssigkeit mit einem großen Winkel und in radialer Form verteilt wird.

9. Gewebekulturanlage nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Zell-Wachstumskammern (24) durch die Räume zwischen einer Mehrzahl von aneinandergeschichteten Platten (126), die durch Dichtungen (130) getrennt sind, abgegrenzt sind.

10. Gewebekulturanlage nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Dichtungen (130) und die Platten (126) eine aneinandergeschichtete Anordnung bilden, und daß die Gewebekulturanlage so konstruiert und angeordnet ist, daß die Platten (126) von der aneinandergeschichteten Anordnung getrennt werden können.

11. Gewebekulturanlage nach Anspruch 9, gekennzeichnet durch Einrichtungen zur lösbaren Sicherung der Platten (126) und der Dichtungen (130) an der aneinandergeschichteten Anordnung.

12. Gewebekulturanlage nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch ein Einlaßrohr (20), welches zwischen dem Einlaßkanal (16) und der Mehrzahl der Zell- Wachstumskammern (24) angeordnet ist, wobei die Flüssigkeits-Begrenzungseinrichtung (22, 23, 48, 50) zwischen dem Einlaßrohr (20) und jeder Zell- Wachstumskammer (24) angeordnet ist.

13. Gewebekulturanlage nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Flüssigkeits-Begrenzungseinrichtung (22, 23, 48, 50) einen verengten Zwischenabschnitt (50) und einen sich in Richtung auf jede Wachstumskammer (24) vergrößernden Durchmesser aufweist, wodurch die durch die Einlaßöffnung (22) in die Wachstumskammer (24) eintretende Flüssigkeit mit einem großen Winkel und in radialer Form verteilt wird.

14. Gewebekulturanlage nach mindestens einem der Ansprüche 1, 12 oder 13, gekennzeichnet durch ein Auslaßrohr (28), welches zwischen dem Auslaßkanal (18) und den Zell-Wachstumskammern (24) angeordnet ist, wobei die Begrenzungseinrichtung (22, 23, 48, 50) zwischen dem Auslaßrohr (28) und den Wachstumskammern (24) liegt.