DE68929467T2 - HIV-2 variants - Google Patents

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Abstract

HIV-2 virus variants, namely virus HIV D205, which can be cloned from the corresponding virus isolate HIV D205 (ECACC V 87122304) and its RNA or RNA-fragments and DNA and DNA-fragments derived therefrom and/or proteins and the use thereof for diagnostics and therapy. <IMAGE>

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft HIV D205, eine HIV-2-Virusvariante, die vom entsprechenden Virusisolat HIV D205 (ECACC V 87122304) geklont werden kann.The present invention relates to HIV D205, an HIV-2 virus variant derived from the corresponding virus isolate HIV D205 (ECACC V 87122304) can be cloned.

"Molecular cloning of two West African human immunodeficiency virus type 2 isolates which replicate well on macrophages: a Gambian isolate from a case of neurologic aquired immunodeficiency syndrome, and a highly divergent Ghanesian isolate" (N. Kühnel, H. v. Briesen, U. Dietrich, M. Adamski, D. Mix, L. Biesert, R. Kreutz, A. Immelmann, K. Henco, Ch. Meichsner, R. Andreesen, H. Gelderblom, und N. Rübsamen-Waigmann, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. 86, 4, 2383– 2387."Molecular cloning of two West African human immunodeficiency virus type 2 isolates which replicate well on macrophages: a Gambian isolate from a case of neurologic aquired immunodeficiency syndrome, and a highly divergent Ghanesian isolate "(N. Kühnel, H. v. Briesen, U. Dietrich, M. Adamski, D. Mix, L. Biesert, R. Kreutz, A. Immelmann, K. Henco, Ch. Meichsner, R. Andreesen, H. Gelderblom, and N. Rübsamen-Waigmann, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. 86, 4, 2383-2387.

In der Diagnostik müssen zwei Kriterien erfüllt werden, nämlich die Spezifität und die Empfindlichkeit für das nachzuweisende Antigen. Bei der AIDS-Diagnose kann der Bedarf an einer Spezifität sicherlich der Verwendung der Isolate HTLV-IIIB und LAV-2 (M. Guyader et al., "Nature" 326, 1987, 662–669) entsprechen, um HIV-Infektionen von andere Infektionen abzugrenzen und somit eine grobe Zuordnung zu den Klassen der "HIV-2-verwandten Infektionen" oder der "HIV-1-verwandten Infektionen" vorzunehmen. Ein Problem besteht jedoch in der Empfindlichkeit der Diagnose. Im Bereich der sogenannten Serokonversion, d. h. dem anfänglichen Auftreten des Antikörpers in der infizierten Person, impliziert eine Verminderung der Empfindlichkeit eine Erhöhung der Zahl "falsch negativer" Testergebnisse. Folglich besteht ein Hauptziel in einer möglichst großen Verkürzung des Zeitraums zwischen einer Infektion und der Nachweisbarkeit dieser Infektion durch eine Verbesserung der Testempfindlichkeit.Two criteria must be met in diagnostics, namely the specificity and the sensitivity to the antigen to be detected. In AIDS diagnosis, the need for specificity can certainly meet the use of isolates HTLV-III B and LAV-2 (Guyader et al., "Nature" 326, 1987, 662-669) to treat HIV infections differentiate other infections and thus make a rough assignment to the classes of "HIV-2-related infections" or "HIV-1-related infections". One problem, however, is the sensitivity of the diagnosis. In the area of so-called seroconversion, ie the initial appearance of the antibody in the infected person, a decrease in sensitivity implies an increase in the number of "false negative" test results. Consequently, a main goal is to shorten the time between an infection and the detectability of this infection as much as possible by improving the sensitivity of the test.

Eine verminderte Überkreuz-Reaktivität manifestiert sich in der Praxis der häufig eingesetzten ELISA-Diagnostik zum Beispiel durch eine verminderte Empfindlichkeit. Somit bedeutet die Verwendung des beschriebenen HIV-1-Isolat etwa eine mittlere Verminderung der Testempfindlichkeit gegenüber HIV-2-Seren um den Faktor von 100 bis 1000, während das Isolat HTLV-IIIB dazu führt, dass fast kein Nachweis mehr bewerkstelligt werden kann.A reduced cross-reactivity manifests itself in the practice of the frequently used ELISA diagnostics, for example by a reduced sensitivity. Thus, the use of the HIV-1 isolate described means an average reduction in test sensitivity to HIV-2 sera by a factor of 100 to 1000, while the isolate HTLV-III B means that almost no detection can be carried out.

Ein verhängnisvolles Prinzip der durch HIV verursachten Krankheiten besteht in der Tatsache, dass es nicht nur einen Typ an Phänotypen und Genotypen jeweils des HIV-1- und des HIV-2-Virus gibt. Statt dessen ist eine große Gruppe verwandter Viren, möglicherweise sogar Populationen, zu postulieren, die keinesfalls strikt voneinander getrennt sind, sondern kontinuierlich ineinander eindringen und eine evolutionäre Entwicklung zu einer immer mehr ansteigenden Divergenz erfahren, während sie gleichzeitig durch Rekombinationsereignisse damit beginnen, Teile des Genoms untereinander auszutauschen. Somit bilden die existierenden HIV-Spezies ein breites, kontinuierliches Populationsniveau, in dem es keine eng abgegrenzten Unterpopulationen einer Virusvariante gibt. Statt dessen ist anzunehmen, dass ein Kontinuum existiert, das im Laufe der Zeit permanenten Schwankungen unterliegt.A fateful principle of through HIV-caused diseases consist in the fact that it is not just one type of phenotype and genotypes of the HIV-1 and HIV-2 viruses, respectively. Instead of that's a big one Group of related viruses, possibly even to postulate populations that are by no means strictly apart are separated, but continuously penetrate into each other and an evolutionary Experience the development of an ever increasing divergence, while they start by recombination events at the same time Exchange parts of the genome with each other. Thus, the existing ones HIV species have a broad, continuous population level in which there are no narrowly defined subpopulations of a virus variant gives. Instead, assume that there is a continuum that is subject to permanent fluctuations over time.

Die klassifizierten Virusvarianten HIV-1 und HIV-2 sind Repräsentanten der diffus voneinander abgegrenzten Unterpopulationen mit einem relativ niedrigen Grad an Beziehungen, was sich durch eine nur teilweise Überkreuzreaktivität zeigt. Andererseits gibt es Varianten der HIV-1-Gruppe (H. Rübsamen-Waigmann et al., "AIDS-Forschung" 10, 1987, 572–575; H. Rübsamen-Waigmann et al., J. Med. Virol. 19, 1986, 335–344; H. v. Briesen et al., J. Med Virol. 23, 1987, 51– 66), die mit HIV-2 signifikant stärkere Überkreuzreaktionen eingehen als das zuerst charakterisierte HIV-1-Isolat selbst (B. Hahn et al., "Nature" 312, 1984, 166–169). Ein aus einem solchen Isolat bestehendes kommerzielles Produkt ermöglicht die Diagnose von deutlich mehr Seren als HIV-2-positiv als das beschriebene Standardisolat HTLV-IIIB.The classified virus variants HIV-1 and HIV-2 are representatives of the diffusely demarcated subpopulations with a relatively low degree of relationships, which is shown by only partially cross-reactivity. On the other hand, there are variants of the HIV-1 group (H. Rübsamen-Waigmann et al., "AIDS Research" 10, 1987, 572-575; H. Rübsamen-Waigmann et al., J. Med. Virol. 19, 1986, 335-344; H. v. Briesen et al., J. Med Virol. 23, 1987, 51-66) who cross-react significantly more strongly with HIV-2 than the first characterized HIV-1 isolate itself (B Hahn et al., "Nature" 312, 1984, 166-169). A commercial product consisting of such an isolate enables the diagnosis of significantly more sera than HIV-2 positive than the standard isolate HTLV-III B described .

Ein ideales Diagnostikum oder Therapeutikum sollte wenigstens einen Repräsentanten aus den Populationen als biologisch signifikant voneinander unterschieden enthalten.An ideal diagnostic or therapeutic agent should have at least one representative distinguished from the populations as biologically significant contain.

HIV-1-Viren in einer Mehrzahl hoch polymorpher genetischer Mutanten können verschiedene Krankheiten wie ARC, LAS, AIDS und Enzephalopathien (ARC: AIDS-bezogene Krankheitszustände, LAS: Lymphadenopathie-Syndrom, AIDS: erworbenes Immunschwäche-Syndrom) verursachen. Geklonte Virusvarianten unterscheiden sich durch die Sequenz und das Restriktionsmuster sogar dann, wenn sie gleichzeitig, am selben Ort und sogar vom selben Patienten isoliert wurden (N. Rübsamen et all, 1986). Es konnte gezeigt werden, dass Virusvarianten vom HIV-1-Typ sich in einigen Virusantigenen um bis zu etwa 15% unterscheiden. Bei HIV-2 sind sogar mehr als 40% der Aminosäuren mancher Antigene verschieden, wobei Substitutionen, Insertionen und Deletionen in Betracht gezogen worden sind (M. Guyader et al., 1987, A. B. Rabson und M. A. Martin, "Cell" 40, 1985, 477–480).HIV-1 viruses are high in a majority Polymorphic genetic mutants can cause various diseases such as ARC, LAS, AIDS and encephalopathies (ARC: AIDS-related disease states, LAS: Lymphadenopathy Syndrome, AIDS: Acquired Immune Deficiency Syndrome) cause. Cloned virus variants differ in the sequence and the restriction pattern even if they coexist on in the same place and even from the same patient (N. Rübsamen et all, 1986). It could be shown that virus variants of the HIV-1 type differ by up to about 15% in some virus antigens. With HIV-2, even more than 40% of the amino acids of some antigens are different, taking substitutions, insertions and deletions into account (M. Guyader et al., 1987, A.B. Rabson and M.A. Martin, "Cell" 40, 1985, 477-480).

Die vorliegende Erfindung macht eine Variante des HIV-2-Virus verfügbar. Die Variante HIV-2 D205 wurde aus einem klinisch asymptomatischen Patienten isoliert. Das Virusisolat erwies sich als Diagnostikum in Bezug auf DNA/RNA sowie in Bezug auf die Virus-Antigene zur serologischen und direkten Identifizierung von Infektionen durch den Typ HIV-2 in der Pre-AIDS- und der AIDS-Stufe.The present invention makes one Variant of the HIV-2 virus available. The variant HIV-2 D205 was derived from a clinically asymptomatic patient isolated. The virus isolate proved to be a diagnostic in relation on DNA / RNA as well as in relation to the virus antigens for serological and direct identification of infections by the HIV-2 type at the pre-AIDS and AIDS levels.

Das erfindungsgemäße Virusisolat umfasst Viren und Proviren, deren Merkmale mit denjenigen der offenbarten Restriktionskarte und der Sequenz der geklonten Teilbereiche identisch sind (1–4). Darüber hinaus umfasst das Virusisolat Varianten, die sich von den oben beschriebenen Viren und Proviren dahingehend unterscheiden, dass ihre Nucleotidsequenzen sich von den oben beschriebenen Viren nur um bis zu 5% und vorzugsweise 2%, besonders bevorzugt um 1% unterscheiden.The virus isolate according to the invention comprises viruses and proviruses whose characteristics are identical to those of the restriction map disclosed and the sequence of the cloned partial areas ( 1 - 4 ). In addition, the virus isolate comprises variants which differ from the viruses and proviruses described above in that their nucleotide sequences differ from the viruses described above only by up to 5% and preferably 2%, particularly preferably 1%.

Die erfindungsgemäße Virusvariante kann Lymphadenopathien (weiterhin als LAS/AIDS bezeichnet) verursachen. Erfindungsgemäß beansprucht sind auch Expressionsprodukte der Virusvariante und insbesondere Antigene, vorzugsweise in akkumulierter oder reiner Form, und Verfahren zur Herstellung der Expressionsprodukte. Die Expressionsprodukte sollen alle Polypeptide in glycosylierten und/oder meristylierten Formen einschließen, die am positiven oder negativen Strang der geklonten RNA oder DNA kodiert wurden.The virus variant according to the invention can lymphadenopathies (still referred to as LAS / AIDS). Claimed according to the invention are also expression products of the virus variant and in particular Antigens, preferably in accumulated or pure form, and methods for the production of the expression products. The expression products all polypeptides are said to be in glycosylated and / or meristylated Include shapes, those on the positive or negative strand of the cloned RNA or DNA were encoded.

Eine weitere bevorzugte Ausführungsform besteht aus geklonten DNA-Sequenzen, die dazu fähig sind, mit genomischer RNA und DNA der Virusvariante zu hybridisieren. Erfindungsgemäß beansprucht sind stabile Gensonden, die DNA-Sequenzen enthalten, die zum Nachweis der Hybridisierung dieser und anderer HIV-Varianten oder verwandter Viren oder DNA-Proviren in zu untersuchenden Proben, insbesondere biologischen oder halbsynthetischen Proben, fähig sind.Another preferred embodiment exists from cloned DNA sequences capable of using genomic RNA and hybridize DNA of the virus variant. Claimed according to the invention are stable gene probes, the DNA sequences included to demonstrate the hybridization of this and others HIV variants or related viruses or DNA proviruses to be examined Samples, especially biological or semi-synthetic samples, are capable.

Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung besteht aus einer Virusvariante der RNA/DNA, die oder deren jeweilige Fragmente, insbesondere c-DNA, genomische DNA, rekombinante DNA, synthetische DNA oder Fragmente davon unter strengen Bedingungen an erfindungsgemäßen Virusvarianten hybridisieren. Es gilt als vereinbart, dass diese Varianten oder Fragmente einschließen, die im Vergleich zur erfindungsgemäßen Virusvariante Deletionen und Insertionen aufweisen.Another preferred embodiment of the Invention consists of a virus variant of RNA / DNA, the or their respective fragments, in particular c-DNA, genomic DNA, recombinant DNA, synthetic DNA or fragments thereof under strict conditions on virus variants according to the invention hybridize. It is agreed that these variants or Include fragments, the deletions compared to the virus variant according to the invention and have insertions.

Als strenge Hybridisierungs- und Waschbedingungen sind diejenigen Bedingungen zu verstehen, aus denen experimentell oder durch Berechnungen abgeleitet werden kann, dass der Schmelzpunkt der zu 100% homologen Nucleinsäurekomplexe unter den Hybridisierungs- und Waschbedingungen unter den eingesetzten Pufferbedingungen um nicht mehr als 5°C abnimmt.As a strict hybridization and Washing conditions are understood to be those conditions from which that can be derived experimentally or by calculations the melting point of the 100% homologous nucleic acid complexes among the hybridization and washing conditions under the buffer conditions used not more than 5 ° C decreases.

Ebenfalls erfindungsgemäß beansprucht sind geklonte synthetische Gensonden, die von den oben beschriebenen Virusvarianten stammen können und in Vektorsystemen in Eukaryonten oder Prokaryonten vermehrt werden können. Die beschriebenen geklonten DNA-Fragmente sind zur Hybridisierung mit komplementären Nucleinsäuren (DNA/RNA) zum Zweck des diagnostischen Nachweises der Virusvarianten geeignet. Die erfindungsgemäßen Diagnosetests werden mittels DNA- oder RNA-Sonden durchgeführt. Die Sonden sind radioaktiv oder sind mit fluoreszenten bio- oder chemilumineszenten Gruppen oder Enzymen markiert oder sind mit Enzymen über gekoppelte Reaktionssysteme spezifisch nachweisbar. Die Hybridisierungen können in einer homogenen Phase einer Lösung oder in einer heterogenen Phase mit an Feststoff immobilisierten Nucleinsäuren erfolgen, während es sich beim Feststoff um eine Membran, ein Teilchen, eine Zelle oder ein Gewebe handeln kann, so dass die Hybridisierung auch in situ erfolgen kann.Are also claimed according to the invention cloned synthetic gene probes from those described above Virus variants can originate and in vector systems in eukaryotes or prokaryotes can be. The cloned DNA fragments described are for hybridization with complementary nucleic acids (DNA / RNA) for the purpose of diagnostic detection of the virus variants suitable. The diagnostic tests according to the invention are performed using DNA or RNA probes. The probes are radioactive or are with fluorescent bio- or chemiluminescent groups or labeled enzymes or are coupled with enzymes via reaction systems specifically detectable. The hybridizations can be in a homogeneous phase a solution or in a heterogeneous phase with immobilized on solid nucleic acids done while the solid is a membrane, a particle, a cell or a tissue can act so that the hybridization also in can be done situ.

Die entsprechenden DNA-Sequenzen (1) aus den erfindungsgemäß beanspruchten Virusisolaten können in E. coli-Bakterien geklont werden, indem eine genomische Lambda-Genbank eingerichtet wird, wobei von der DNA der mit dem Virusisolat infizierten Lymphozyten ausgegangen wird. Die gewünschten Klone werden erhalten, indem ein Plaque-Screening mit STLV-III-Sequenzen des Gag-Pol-Bereichs durchgeführt wird. Noch spezifischer kann eine DNA, die von der veröffentlichten Sequenz HIV-2 ROD (M. Guyader et al., "Nature" 326, 1987, 6623–669) stammt, oder eine DNA-Sonde, die von den Teilsequenzen des erfindungsgemäßen Isolats HIV-2 D205 stammt, als Sonde verwendet werden.The corresponding DNA sequences ( 1 ) from the virus isolates claimed according to the invention can be cloned into E. coli bacteria by setting up a genomic lambda gene bank, starting from the DNA of the lymphocytes infected with the virus isolate. The desired clones are obtained by performing plaque screening with STLV III sequences from the Gag-Pol region. More specifically, a DNA derived from the published sequence HIV-2 ROD (M. Guyader et al., "Nature" 326, 1987, 6623-669) or a DNA probe derived from the partial sequences of the isolate HIV according to the invention -2 D205 is used as a probe.

Das Diagnoseverfahren, das auf der Verwendung der erfindungsgemäß beanspruchten Viren basiert, umfasst die folgenden Schritte: Extraktion der RNA oder DNA aus biologischen Proben, gegebenenfalls die enzymatische Verarbeitung durch Restriktionsenzyme, die Trennung durch Gelelektrophorese und/oder Direkt-Blotting-Verfahren für Nucleinsäure bindende Träger, und die anschließende Hybridisierung mit Teilen der geklonten Fragmente der beanspruchten Viren. Hybridisierungen können auch direkt in chemisch behandelten Zellen oder Geweben erfolgen. Dabei ist der Ursprung der Gewebe oder Flüssigkeiten unerheblich.The diagnostic procedure based on the Use of the claimed according to the invention Virus based includes the following steps: Extraction of the RNA or DNA from biological samples, optionally the enzymatic Processing by restriction enzymes, separation by gel electrophoresis and / or direct blotting methods for nucleic acid binding supports, and the subsequent one Hybridization with parts of the cloned fragments of the claimed Viruses. Hybridizations can also take place directly in chemically treated cells or tissues. The origin of the tissues or liquids is irrelevant.

Insbesondere ist ein Verfahren zum in-vitro-Nachweis von Antikörpern gegen Expressionsprodukte der Viren der vorliegenden Erfindung dadurch gekennzeichnet, dass die Expressionsprodukte der Viren oder Teile davon durch immunologische Methoden nachgewiesen werden. Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Expressionsprodukten um Proteine, Peptide oder Teile davon handelt, die innerhalb der Bedeutung eines offenen Leserasters auf der DNA der proviralen Teilsequenzen nach Anspruch 1 kodiert worden sind und durch synthetische oder biosynthetische Verfahren hergestellt werden.In particular, a method for in vitro detection of antibodies against expression products of the viruses of the present invention, that the expression products of the virus or parts thereof by immunological Methods are proven. The process is characterized by that the expression products are proteins, peptides or Parts of it are within the meaning of an open reading frame encoded on the DNA of the proviral partial sequences according to claim 1 have been and manufactured by synthetic or biosynthetic processes become.

Das Verfahren ist weiter dadurch gekennzeichnet, dass zuvor eine definierte Menge oder eine Kombination von Expressionsprodukten oder Teilen davon auf Mikrotiterplatten fixiert wird, wonach anschließend biologische Proben, verdünnt oder unverdünnt, mit den beschichteten Mikrotiterplatten in Kontakt gebracht werden und nach einer Inkubation und anschließenden Waschschritten mittels eines Nachweisreagenzes oder markierten Anti-HIV-Antikörpern identifiziert werden können.The process is further through this characterized that previously a defined amount or a combination expression products or parts thereof on microtiter plates is fixed, after which biological samples, diluted or undiluted, be brought into contact with the coated microtiter plates and after an incubation and subsequent washing steps using a detection reagent or labeled anti-HIV antibodies can be.

Alternativ werden Filterstreifen und Kunststoffstreifen oder -stäbe statt Mikrotiterplatten verwendet, wobei die Expressionsprodukte der Viren durch die isolierte Auftragung der verschiedenen Antigene an jeweils spezifischen Positionen fixiert worden sind.Alternatively, filter strips and plastic strips or bars used instead of microtiter plates, the expression products the viruses through the isolated application of the different antigens have been fixed at specific positions.

Die Expressionsprodukte können auch durch Gelelektrophorese getrennt und dann durch Blotting übertragen werden, wonach die Inkubation mit Anti-HIV-Antikörpern und deren Nachweis erfolgen. Der Nachweis erfolgt auf Festphasenträgern, an denen die Antigen-Determinanten gebunden wurden, wobei die Festphasenträger aus Teilchen bestehen.The expression products can also be separated by gel electrophoresis and then transferred by blotting, after which the incubation with An ti-HIV antibodies and their detection. Detection is carried out on solid phase supports to which the antigen determinants have been bound, the solid phase supports consisting of particles.

Bei Expressionsprodukten kann es sich um Virusantigene handeln, die von in vitro infizierten Zellen stammen, wobei die Antigene mit biologischen Testmaterialien als an fixierte Zellen gebundene Antigene in Kontakt gebracht werden und die anschließende Bindung des Antikörpers mit immunologischen Nachweisreagenzien zum Beispiel mittels eines Cytofluorimeters oder visuell bestimmt werden kann.With expression products it can are virus antigens derived from cells infected in vitro originate, the antigens with biological test materials as antigens bound to fixed cells are brought into contact and the subsequent one Antibody binding with immunological detection reagents, for example by means of a Cytofluorimeters or can be determined visually.

Die Antigene können durch kompetitive ELISA bestimmt werden. HIV-verwandte Nucleinsäuren (DNA und RNA) können unter Bildung der erfindungsgemäßen Nucleinsäuren in biologischen Proben, Zellen und in isolierter Form nachgewiesen werden.The antigens can be determined by competitive ELISA be determined. HIV-related nucleic acids (DNA and RNA) can be found at Formation of the nucleic acids according to the invention in biological samples, cells and in isolated form become.

Expressionsprodukte können durch Materialien unterstützt werden, die einen Bezug zu anderen HIV-Varianten aufweisen, sich jedoch hinsichtlich ihrer biologischen Eigenschaften von den Materialien der Isolate der vorliegenden Erfindung unterscheiden.Expression products can by Materials supported who are related to other HIV variants however, in terms of their biological properties from the materials of the Distinguish isolates of the present invention.

Für diagnostische und therapeutische Aufgaben können die beschriebenen DNA-Segmente auch zur Exprimierung kodierter Antigene verwendet werden. Dabei werden die DNA-Segment unter der gezielten Steuerung von Regulationssequenzen in pro- oder eukaryontische Zielzellen, -gewebe oder aus mehreren Zellen bestehende Zielorganismen eingeführt, um diese zur Produktion der entsprechend kodierten Antigene, Teilen davon oder Kombinationen davon mit fremden Antigenen zu stimulieren. Antigene können über die Reaktion mit Anti-HIV-2-Antikörpern, insbesondere aus den Seren der betreffenden Patienten, nachgewiesen werden. Antigene mit längeren offenen Leserastern (> 50 Aminosäuren) eignen sich dafür genauso wie diejenigen, die auf RNA-Ebene Spleißvorgängen unterworfen sind und somit so zusammengesetzt sind, dass sie die längeren offenen Leseraster bilden.For The described DNA segments can also be used for diagnostic and therapeutic purposes Expression of encoded antigens can be used. The DNA segment under the targeted control of regulatory sequences in pro- or eukaryotic target cells, tissues or from several Cells existing target organisms are introduced to these for production the correspondingly encoded antigens, parts thereof or combinations thereof stimulate with foreign antigens. Antigens can, in particular, react with anti-HIV-2 antibodies from the sera of the patients concerned. antigens with longer ones open reading frames (> 50 Amino acids) are suitable for this just like those that are subject to splicing at the RNA level and thus are composed in such a way that they form the longer open reading frames.

Gemäß der Erfindung werden weiterhin Polypeptide beansprucht, die von der erfindungsgemäßen geklonten Virusvariante stammen, um solche Antigene in einem zu untersuchenden Material nachzuweisen, das ähnliche Antigen-Determinanten enthält und deswegen eine immunologische Überkreuzreaktion eingeht. Dies ist zur Diagnose von AIDS und Pre-AIDS von Virenträgern oder asymptomatischen Virenträgern bzw. von Blut stammenden Virusprodukten besonders geeignet. Auch der serologische Nachweis der Antikörper, die gegen diese antigenen Polypeptide als Expressionsprodukte des erfindungsgemäß beanspruchten Virus gerichtet sind, werden durch die Verwendung herkömmlicher Systeme wie ELISA möglich. Die immunogenen Polypeptide können als schützende Polypeptide als Vakzine verwendet werden, um einen Schutz gegen AIDS-Infektionen zu bewirken.According to the invention will continue Polypeptides claimed by the cloned invention Virus variant are derived to examine such antigens in one Evidence of material that is similar Contains antigenic determinants and therefore an immunological cross reaction occurs. This is used to diagnose AIDS and pre-AIDS from virus carriers or asymptomatic virus carriers or virus-derived blood products are particularly suitable. Also the serological detection of antibodies against these antigenic polypeptides directed as expression products of the virus claimed according to the invention through the use of conventional systems such as ELISA possible. The immunogenic polypeptides can as a protective Polypeptides are used as vaccines to protect against To cause AIDS infections.

Die efindungsgemäßen Virusisolate und die davon stammenden Produkte können mit anderen Isolaten der Teilpopulation HIV-2 in Testsystemen kombiniert werden, d. h. mit denjenigen, die sich so weit wie möglich im beschriebenen Populationsniveau entfernt befinden, wie zum Beispiel das Isolat HIV-2 ROD (M. Guyader et al., 1987). Dadurch wird es möglich, auch Populationen entfernter Verwandtschaft in einem Test empfindlich nachzuweisen.The virus isolates according to the invention and those thereof originating products can combined with other isolates of the subpopulation HIV-2 in test systems become, d. H. with those who are as far as possible in described population level are removed, such as the isolate HIV-2 ROD (M. Guyader et al., 1987). It will possible, populations of distant relatives are also sensitive in one test demonstrated.

Die erfindungsgemäße Virusvariante ist vom Spektrum der HIV-1-Varianten hochgradig verschieden und weist eine engere molekulare Verwandtschaft zu dem von Guyader beschriebenen HIV-2-Virus auf, obwohl sie sich davon beträchtlich unterscheidet (1). Auch die biologischen Eigenschaften unterscheiden sich deutlich vom beschriebenen HIV-2-Isolat. Somit bevorzugt die erfindungsgemäße Variante für eine wirksame in-vitro-Replikation Zellen, die von myeloischen Linien stammen. Im Gegensatz dazu reproduziert das Virus sich in lymphozyten Linien schlecht.The virus variant according to the invention is highly different from the spectrum of the HIV-1 variants and has a closer molecular relationship to the HIV-2 virus described by Guyader, although it differs considerably from it ( 1 ). The biological properties also differ significantly from the HIV-2 isolate described. Thus, the variant according to the invention prefers cells that come from myeloid lines for an effective in vitro replication. In contrast, the virus reproduces poorly in lymphocyte lines.

Eine Probe des erfindungsgemäß beanspruchten Virus ist in Form seines Isolats am European Collection of Animal Cell Cultures unter der Bezeichnung HIV D205 (V 87122304) gemäß dem Budapester Vertrag hinterlegt worden.A sample of the claimed in the invention Virus is in the form of its isolate at the European Collection of Animal Cell Cultures under the designation HIV D205 (V 87122304) according to the Budapest Contract has been deposited.

1 zeigt die Restriktionskarten des erfindungsgemäßen Virusisolats im Vergleich zu bekannten HIV-Sequenzen. 1 shows the restriction maps of the virus isolate according to the invention in comparison to known HIV sequences.

2 zeigt die partiellen Nucleotidsequenzen von HIV-D205 (entsprechend dem Klon HIV-2 A7.1 von 2). 2 shows the partial nucleotide sequences of HIV-D205 (corresponding to clone HIV-2 A7.1 of 2 ).

3 zeigt die Sequenzhomologie von HIV-2 D205, 7 im Vergleich zur HIV/SIV-Gruppe (Genniveau; nt/aa). 3 shows the sequence homology of HIV-2 D205, 7 compared to the HIV / SIV group (gene level; nt / aa).

4 zeigt einen Vergleich der Nucleotidsequenz zwischen HIV-2 D205 und HIV- und SIV-Stämmen (in % der Homologie). 4 shows a comparison of the nucleotide sequence between HIV-2 D205 and HIV and SIV strains (in% of homology).

Experimentelle Ergebnisse und Merkmale von HIV-D205 sind in H. Kühnel et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. 86, 4, 2383–2387, beschrieben.Experimental results and characteristics of HIV-D205 are in H. Kühnel et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. 86, 4, 2383-2387.

Die Sequenz von HIV-D205 zeigt viele sogenannte "offene Leseraster". Die meisten dieser Leseraster können durch einen Vergleich von Homologien mit zuvor beschriebenen HIV-Viren mittels eines Vergleichs von Western-Blots, die mit HIV-D2-5-Antigenen durchgeführt wurden, die von infizierten HUT78- oder U937-Zellen stammen, und durch Untersuchungen mit Seren von den entsprechenden Patienten und Bezugsseren mit in vivo exprimierten Proteinen/Antigenen in Beziehung gesetzt werden.The sequence of HIV-D205 shows many so called "open Reading Frame ". The most of these reading frames can by comparing homologies with previously described HIV viruses by comparing Western blots with HIV-D2-5 antigens carried out derived from infected HUT78 or U937 cells, and by examinations with sera from the corresponding patients and Reference sera related to proteins / antigens expressed in vivo be set.

Andere offene Leseraster werden nicht auf dem Niveau ihrer exprimierten Antigene, die durch die Funktion oder die auf Western-Blots erfolgenden Färbung von Antikörpern definiert sind, identifiziert. Sie können unter bestimmten Umständen jedoch in vivo exprimiert werden. Andere Leseraster, sogar kurze, können gut auf eine Weise exprimiert werden, die auf Grund von Spleißvorgängen allein auf der Grundlage der Nucleinsäure-Sequenzdaten schwierig vorhersagbar ist.Other open reading frames are not identified at the level of their expressed antigens, which are defined by the function or staining of antibodies by Western blots. However, under certain circumstances they can be expressed in vivo. Other reading frames, even short ones, can be expressed well in a way that is due to splicing alone Based on the nucleic acid sequence data is difficult to predict.

Antigen-Determinanten auf exprimierten Proteinen, die für die biologische Funktion, für Zielantigene in der Diagnostik oder für die Immunisierung wichtig sind, sind über die gesamte exprimierte lineare Proteinstruktur verteilt. Teile dieser Sequenzen können allgemeinere antigene Eigenschaften als andere haben, wie durch ein Peptid-Screening/eine Peptid-Kartierung für antigene Stellen gezeigt werden kann. Diese Stellen können als einzelne Epitope oder kontinuierliches Polypeptid oder in einer Version von in vitro oder synthetisch gespleißten Antigenen exprimiert werden. Die Antigenität der exprimierten Produkte kann durch eine Fixierung und ein Blotting des Antigens im Western-Blot-Assay gezeigt werden. Konstruktionen zur Antigen-Expression in E. coli können erfolgen, indem herkömmliche Techniken unter Verwendung von synthetischen Genen, Restriktionsfragmenten von geklonten viralen Genomsegmenten, unter Verwendung von mit Exonuclease oder DNase I getrimmten Produkte davon oder unter Verwendung von sequenzspezifischen synthetischen Primern, die das gewünschte gewünschte 5'- und 3'-Ende des zu exprimierenden Fragments zusammen mit geeigneten Restriktionsorten definieren, verwendet werden. Diese Restriktionsorte können leicht zur Ligation in ein Feld von mehrfach klonierende Orte (pEX) aufweisenden Expressionsvektoren verschiedener Organismen wie denjenigen, die von PLc24 (Remault et al., 1981 Gene 15, 81–83) stammen, verwendet werden.Antigen determinants on expressed proteins, the for the biological function, for Target antigens important in diagnostics or for immunization are, are about the entire expressed linear protein structure is distributed. parts of these sequences can have more general antigenic properties than others, such as through peptide screening / mapping for antigenic sites can be. These places can as a single epitope or continuous polypeptide or in one Version of in vitro or synthetically spliced antigens can be expressed. The antigenicity the expressed products can be fixed and blotted Antigen can be shown in the Western blot assay. Constructions for Antigen expression in E. coli can be done by conventional Techniques using synthetic genes, restriction fragments of cloned viral genome segments using exonuclease or DNase I trimmed products thereof or using sequence-specific synthetic primers which have the desired desired 5 'and 3' end of the expression Define fragments together with suitable restriction sites, be used. These restriction sites can easily be ligated in an array of multiple cloning site (pEX) expression vectors various organisms such as those of PLc24 (Remault et al., 1981 Gene 15, 81-83) originate, are used.

Es wurde gezeigt, dass die exprimierten Antigene mit Seren von Patienten spezifisch reagieren. Das p27(24) des gag von HIV-D205 reagiert sehr empfindlich mit sowohl typischen HIV-1-Seren als auch mit typischen HIV-2-Seren (siehe Kühnel et al.).It was shown that the expressed Antigens react specifically with patient sera. The p27 (24) The gag of HIV-D205 is very sensitive to both typical HIV-1 sera as well as with typical HIV-2 sera (see Kühnel et al.).

Claims (24)

Virusisolat HIV-2 D205 (ECACC V 87122304), das zur in-vitro-Replikation von Knochenmarkzellen stammende Zellen bevorzugt.Virus isolate HIV-2 D205 (ECACC V 87122304), the for in vitro replication of cells derived from bone marrow cells prefers. DNA der proviralen Teilsequenz des Virusisolats von Anspruch 1 gemäß der Merkmale des Endonuclease-Restriktionsorts von 1.DNA of the proviral partial sequence of the virus isolate of claim 1 according to the characteristics of the endonuclease restriction site of 1 , cDNA, die sich um bis zu 5% von der Nucleotidsequenz der Virusisolate gemäß Anspruch 1 unterscheidet.cDNA that is up to 5% of the nucleotide sequence the virus isolates according to claim 1 differs. Virus-RNA, die sich um bis zu 5% von der Nucleotidsequenz der Virusisolate gemäß Anspruch 1 unterscheidet.Virus RNA that is up to 5% of the nucleotide sequence the virus isolates according to claim 1 differs. Rekombinante DNA, die DNA gemäß der Definition in den Ansprüchen 2 und 3 enthält.Recombinant DNA, the DNA as defined in claims 2 and 3 contains. DNA oder RNA nach einem der Ansprüche 2 bis 5, wobei die DNA oder RNA als Hybrid mit komplementär markierte DNA- oder RNA-Stränge vorliegt.DNA or RNA according to any one of claims 2 to 5, wherein the DNA or RNA is present as a hybrid with complementarily labeled DNA or RNA strands. DNA nach einem der Ansprüche 2, 3, 5 und/oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass sie zu viraler DNA komplementär ist.DNA according to one of claims 2, 3, 5 and / or 6, characterized characterized that it is complementary to viral DNA. Expressionsprodukte des Virusisolats nach Anspruch 1.Expression products of the virus isolate according to claim 1. Expressionsprodukte nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Proteine oder Peptide durch ein offenes Leseraster auf der DNA nach Anspruch 2 codiert wurden.Expression products according to claim 8, characterized in that the proteins or peptides are indicated by an open reading frame the DNA was encoded according to claim 2. Ein Verfahren zum in-vitro-Nachweis von Antikörpern gegen Expressionsprodukte der Viren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Expressionsprodukte der Viren mittels immunologischer Verfahren nachgewiesen werden.A method for the in vitro detection of antibodies against Expression products of the viruses according to claim 8, characterized in that that the expression products of the virus using immunological methods be detected. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Expressionsprodukte Proteine oder Peptide sind, die durch ein offenes Leseraster der DNA nach Anspruch 2 codiert werden und durch synthetische oder biosynthetische Verfahren hergestellt werden.A method according to claim 10, characterized in that the expression products are proteins or peptides that are produced by an open reading frame of the DNA according to claim 2 are encoded and by synthetic or biosynthetic processes are produced. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, dass zuvor eine bestimmte Menge einer Kombination von Expressionsprodukten auf Mikrotiterplatten fixiert wird, woraufhin nacheinander biologische Proben, verdünnt oder unverdünnt, mit den beschichteten Mikrotiterplatten in Kontakt gebracht werden und nach einer Inkubation und nacheinander erfolgenden Waschschritten mittels eines Nachweisreagenz oder mittels markierter Anti-HIV-Antikörper identifiziert werden können.A method according to claim 10 or 11, characterized in that previously a certain amount of a combination of expression products Microtiter plates is fixed, whereupon biological one after the other Samples, diluted or undiluted, be brought into contact with the coated microtiter plates and after incubation and sequential washing steps identified by means of a detection reagent or by means of labeled anti-HIV antibodies can be. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass Filterstreifen und Kunststoffstreifen oder -stäbe statt Mikrotiterplatten verwendet werden, wobei die Expressionsprodukte der Viren an jeweilig spezifischen Positionen durch isolierte Aufbringung der verschiedenen Antigene fixiert worden sind.Method according to one of claims 10 to 12, characterized in that that filter strips and plastic strips or rods instead Microtiter plates are used, the expression products of Viruses at specific positions through isolated application of the various antigens have been fixed. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Expressionsprodukte durch Gelelektrophorese getrennt werden und dann durch Blotting transferiert werden, wonach eine Inkubation mit Anti-HIV-Antikörpern und deren Nachweis erfolgen.A method according to claim 13, characterized in that the expression products are separated by gel electrophoresis and then transferred by blotting, after which incubation with Anti-HIV antibodies and proof of this is provided. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass der Nachweis auf Festphasenträgern erfolgt, an die Antigen-Determinanten gebunden wurden, wobei der Festphasenträger aus Teilchen besteht.Method according to one of claims 10 to 14, characterized in that that the proof is made on solid phase carriers, to the antigen determinants were bound, the solid phase support consisting of particles. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Expressionsprodukten um Virus-Antigene handelt, die von in vitro infizierten Zellen stammen, wobei die Antigene als an fixierte Zellen gebundene Antigene mit biologischen Testmaterialien in Kontakt gebracht werden und wobei die anschließende Bindung von Antikörpern mittels einer Vorrichtung, zum Beispiel mit einem Cytofluorimeter, oder visuell mit einem immunologischen Nachweisreagenz bestimmt werden kann.Method according to one of claims 10 to 15, characterized in that that the expression products are virus antigens that originate from cells infected in vitro, the antigens being antigens bound to fixed cells with biological test materials be brought into contact and being the subsequent binding of antibodies by means of a device, for example with a cytofluorimeter, or determined visually with an immunological detection reagent can be. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Antigene mittels kompetitiver ELISA bestimmt werden.A method according to claim 16, characterized in that the antigens are determined using a competitive ELISA. Verfahren zum Nachweis von HIV-verwandten Nucleinsäuren (DNA und RNA) in biologischen Proben, Zellen und in isolierter Form durch Verwendung der Nucleinsäuren nach den Ansprüchen 2 bis 7.Method for the detection of HIV-related nucleic acids (DNA and RNA) in biological samples, cells and in isolated form Use of the nucleic acids according to the claims 2 to 7. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Expressionsprodukte durch Materialien unterstützt werden, die mit anderen HIV-Varianten verwandt sind, deren biologische Eigenschaften sich jedoch von den Expressionsprodukten des Isolats nach Anspruch 1 unterscheiden.Method according to one of claims 10 to 18, characterized in that that the expression products are supported by materials, that are related to other HIV variants, their biological properties however, from the expression products of the isolate according to claim 1 differentiate. Immunogene Zusammensetzung, enthaltend Expressionsprodukte nach Anspruch 8.Immunogenic composition containing expression products according to claim 8. Immunogene Zusammensetzung nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei einem Antigen um das gesamte Membranantigen handelt.Immunogenic composition according to claim 20, characterized characterized in that an antigen is the entire membrane antigen. Antikörper und insbesondere monoklonale Antikörper, die speziell gegen Expressionsprodukte des Virusisolats nach Anspruch 1 gerichtet sind.antibody and in particular monoclonal antibodies which are specifically against expression products of Virus isolates are directed according to claim 1. Isolierte Zellen, die mit Nucleinsäuren nach einem der Ansprüche 2 bis 7 transformiert worden sind.Isolated cells containing nucleic acids after a of claims 2 to 7 have been transformed. Isolierte Zellen, die mit dem Virusisolat nach Anspruch 1 infiziert worden sind.Isolated cells with the virus isolate according to claim 1 have been infected.
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