DE4235718A1 - New HIV-type immune deficiency virus ECACC V 92092318 - Google Patents
New HIV-type immune deficiency virus ECACC V 92092318Info
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Abstract
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Retrovirus aus der HIV-Gruppe sowie Varianten oder Teile davon, welche die wesentlichen Eigenschaften des Virus enthalten. Beschrieben wird ein Verfahren zur Züchtung des Retrovirus. Die Erfindung betrifft weiterhin die Gewinnung dieses Retrovirus sowie die Verwendung des Virus, seiner Teile oder Extrakte für medizinische Zwecke, für die Diagnostik und bei der Herstellung von Impfstoffen.The present invention relates to a new retrovirus the HIV group as well as variants or parts thereof which the essential properties of the virus included. Described becomes a method of growing the retrovirus. The The invention further relates to the extraction of this retrovirus and the use of the virus, its parts or extracts for medical purposes, for diagnostics and for Vaccine production.
Retroviren, die zur sogenannten HIV-Gruppe gehören, führen bei damit infizierten Menschen zu Krankheitserscheinungen, die unter dem Sammelbegriff Immunschwäche bzw. AIDS (Acquired Immune Deficiency Syndrome) zusammengefaßt werden.Retroviruses, which belong to the so-called HIV group, lead in people infected with it to symptoms of illness, those under the collective term immunodeficiency or AIDS (Acquired Immune Deficiency Syndrome).
Epidemiologische Studien belegen, daß das Humane Immunschwäche Virus (HIV) das aetiologische Agens für die überwiegende Mehrheit der AIDS (Acquired Immune Deficiency Syndrome)-Fälle darstellt. Ein 1983 aus einem Patienten isoliertes und charakterisiertes Retrovirus erhielt die Bezeichnung HIV-1 (Barre-Sinoussi, F. et al., Science 220, 868-871 [1983]). Eine Variante von HIV-1 wird in WO 86/02383 beschrieben. Epidemiological studies show that the human Immunodeficiency Virus (HIV) the aetiological agent for the vast majority of AIDS (Acquired Immune Deficiency Represents syndrome) cases. A 1983 from a patient isolated and characterized retrovirus received the Name HIV-1 (Barre-Sinoussi, F. et al., Science 220, 868-871 [1983]). A variant of HIV-1 is described in WO 86/02383 described.
Eine zweite Gruppe von Humanen Immunschwäche Viren wurde 1985 in Westafrika identifiziert (Clavel, F. et al., Science 233, 343-346 [1986]) und als Humanes Immunschwäche Virus Typ 2 (HIV-2) bezeichnet (EP-A-0 239 425). HIV-2 Retroviren unterscheiden sich deutlich von HIV-1, weisen jedoch auch eine Verwandtschaft zu Affen Immunschwäche Viren (SIV-2) auf. Wie HIV-1 führt auch HIV-2 zu einer AIDS-Symptomatik.A second group of human immunodeficiency viruses was developed 1985 identified in West Africa (Clavel, F. et al., Science 233, 343-346 [1986]) and as a human immunodeficiency virus type 2 (HIV-2) denotes (EP-A-0 239 425). HIV-2 retroviruses differ significantly from HIV-1, but also show a relationship to monkeys immunodeficiency virus (SIV-2) on. Like HIV-1, HIV-2 leads to symptoms of AIDS.
Eine weitere Variante eines Immunschwäche Retrovirus wird in der EP-A-0 345 375 beschrieben und dort als HIV-3 Retrovirus bezeichnet (ANT 70).Another variant of an immune deficiency retrovirus is in EP-A-0 345 375 and there as HIV-3 retrovirus designated (ANT 70).
Auch in Lancet Vol. 340, Sept. 1992, S. 681-682 wird die Isolierung eines weiteren, varianten Immunschwächevirus beschrieben.Also in Lancet Vol. 340, Sept. 1992, pp. 681-682 the Isolation of another variant immunodeficiency virus described.
Es ist ein Charakteristikum der Humanen Immunschwäche Viren, daß sie eine hohe Variabilität aufweisen, die die Vergleichbarkeit der verschiedenen Isolate deutlich kompliziert. Beim Vergleich diverser HIV-1-Isolate treten z. B. in einigen Regionen des Genoms hohe Variabilitäten auf, während andere Genombereiche vergleichsweise konserviert vorliegen (Benn, S. et al. Science 230, 949-951 [1985]). Ein wesentlich größerer Polymorphismus konnte auch für HIV-2 beobachtet werden (Clavel, F. et al., Nature 324, 691-695 [1986]). Die größte genetische Stabilität besitzen Bereiche in den gag und pol Genen, die für strukturell und enzymatisch essentielle Proteine codieren; einige Regionen im env-Gen sowie die Gene (vif, vpr, tat, rev, nef), die für regulatorische Proteine codieren, zeigen einen hohen Grad an Variabilität. Es konnte weiterhin gezeigt werden, daß Antisera gegen HIV-1 auch mit gag und pol Genprodukten von HIV-2 kreuzreagieren, obwohl nur geringe Sequenzhomologie vorlag. Ebenfalls war die Hybridisierung zwischen diesen beiden Viren wenig signifikant, wenn nicht sehr wenig stringente Konditionen verwandt wurden (Clavel, F. et al., Nature 324, 691-695 [1986]). It is a characteristic of the human immunodeficiency virus, that they have a high variability that the Comparability of the different isolates clearly complicated. When comparing various HIV-1 isolates occur e.g. B. high variability in some regions of the genome, while other genome areas are comparatively conserved are available (Benn, S. et al. Science 230, 949-951 [1985]). A HIV-2 could also have a much larger polymorphism can be observed (Clavel, F. et al., Nature 324, 691-695 [1986]). Areas have the greatest genetic stability in the gag and pol genes that are structural and encode enzymatically essential proteins; some regions in the env gene as well as the genes (vif, vpr, tat, rev, nef) that are for encoding regulatory proteins indicate a high level Variability. It could also be shown that Antisera against HIV-1 also with gag and pol gene products from HIV-2 cross-reacts, although only little sequence homology Template. The hybridization between these was also of the two viruses little significant, if not very little stringent conditions were used (Clavel, F. et al., Nature 324, 691-695 [1986]).
Aufgrund der weiten Verbreitung der Retroviren aus der HIV- Gruppe und der Tatsache, daß zwischen dem Zeitpunkt der Infektion und dem Zeitpunkt, zu dem eindeutige Symptome für pathologische Veränderungen erkennbar sind, ein Zeitraum von einigen bis vielen Jahren (2-20) liegt, ist es epidemiologisch von großer Bedeutung, die Infektion mit Retroviren der HIV-Gruppe möglichst frühzeitig und vor allem zuverlässig zu bestimmen. Dies spielt nicht nur eine Rolle bei der Diagnose von Patienten, die Zeichen von Immunschwäche aufweisen, sondern auch bei der Überprüfung von Blutspendern. Es hat sich herausgestellt, daß bei der Verwendung von Retroviren oder Bestandteilen davon des Types HIV-1 oder HIV-2 in Nachweissystemen bei manchen Seren kein oder nur ein schwacher Nachweis von Antikörpern geführt werden kann, obwohl bei den Patienten, von denen die Seren stammen, Zeichen von Immunschwäche auftreten. Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Retrovirus aus der HIV-Gruppe ist in bestimmten Fällen ein derartiger Nachweis möglich.Due to the wide spread of retroviruses from HIV Group and the fact that between the time of the Infection and the time when clear symptoms of pathological changes are recognizable, a period of a few to many years (2-20), it is epidemiologically of great importance, the infection with Retroviruses from the HIV group as early as possible and above all to determine reliably. This doesn't just matter in diagnosing patients who show signs of Have immunodeficiency, but also when checking from blood donors. It has been found that the Use of retroviruses or components thereof of the type HIV-1 or HIV-2 in detection systems none for some sera or only weak detection of antibodies can be, although in the patients of whom the sera originate, signs of immune deficiency occur. With the help of retrovirus according to the invention from the HIV group is in Such evidence is possible in certain cases.
Beschrieben wird die Isolation und Charakterisierung eines neuen Humanen Immunschwäche Virus, im folgenden als MVP- 5180/91 bezeichnet, das aus peripheren Lymphozyten einer 1991 34-jährigen Patientin aus Kamerun isoliert wurde, die Zeichen von Immunschwäche aufwies. Geographisch stammt dieses Retrovirus aus einer Region in Afrika, die zwischen Westafrika mit endemischer HIV-2 und HIV-1 Virusinfektion und Ostzentralafrika mit fast ausschließlicher HIV-1- Verbreitung lokalisiert ist. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist also ein neues Retrovirus der HIV-Gruppe, welches als MVP-5180/91 bezeichnet wird und dessen Varianten. Das Retrovirus MVP-5180/91 wurde bei der European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC) unter der Nummer V 920 92 318 gemäß den Bedingungen des Budapester Vertrages hinterlegt.The isolation and characterization of a new human immunodeficiency virus, hereinafter referred to as MVP 5180/91, that of peripheral lymphocytes one In 1991, 34-year-old female patient from Cameroon was isolated Showed signs of immune deficiency. Geographically this retrovirus from a region in Africa that between West Africa with endemic HIV-2 and HIV-1 virus infection and East Central Africa with almost exclusive HIV-1 Spread is localized. Subject of the present So invention is a new HIV group retrovirus, which is designated as MVP-5180/91 and its Variants. The retrovirus MVP-5180/91 was developed by the European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC) under number V 920 92 318 according to the terms of the Budapest Treaty deposited.
Ebenso wie HIV-1 und HIV-2 wächst das erfindungsgemäße MVP- 5180/91 in folgenden Zellinien HUT 78, Jurkat-Zellen, C8166- Zellen und MT-2-Zellen. Die Isolierung und Vermehrung von Viren wird in dem Buch "Viral Quantitation in HIV Infection, Editor Jean-Marie Andrieu, John Libbey Eurotext, 1991" ausführlich beschrieben. Die dort beschriebenen Arbeitsmethoden werden durch Bezugnahme zum Gegenstand der Offenbarung der vorliegenden Anmeldung gemacht.Like HIV-1 and HIV-2, the MVP- according to the invention grows 5180/91 in the following cell lines HUT 78, Jurkat cells, C8166- Cells and MT-2 cells. Isolation and propagation of Viruses are described in the book "Viral Quantitation in HIV Infection, Editor Jean-Marie Andrieu, John Libbey Eurotext, 1991 " described in detail. The ones described there Working methods become the subject of reference by reference Disclosure of the present application made.
Weiterhin besitzt das erfindungsgemäße Virus eine magnesiumabhängige Reverse Transkriptase, die aber nicht manganabhängig ist. Dies stellt eine weitere Gemeinsamkeit zu den Viren HIV-1 und HIV-2 dar.Furthermore, the virus according to the invention has one magnesium-dependent reverse transcriptase, but not is dependent on manganese. This represents another commonality to the viruses HIV-1 and HIV-2.
Zum besseren Verständnis der Unterschiede des erfindungsgemäßen MVP-5180/91 Virus zu den Retroviren HIV-1 und HIV-2 soll zunächst kurz der Aufbau der Immunschwäche verursachenden Retroviren erläutert werden. Im Inneren des Virus befindet sich die RNA in einem kegelförmigen Core, das aus Proteinuntereinheiten zusammengesetzt ist, die die Bezeichnung p 24 (p für Protein) tragen. Dieses innere Core wird von einer Proteinhülle umgeben, die aus dem Protein p 17 aufgebaut ist (äußeres Core) und von einer Glykoproteinhülle umgeben ist, die neben Lipiden, die aus der Wirtszelle stammen, das Transmembranprotein gp 41, und das Hüllprotein 120 (gp 120) enthält. Dieses gp 120 kann dann mit den CD-4-Rezeptoren der Wirtszellen eine Bindung eingehen.To better understand the differences of the MVP-5180/91 virus according to the invention for the retroviruses HIV-1 and HIV-2 should initially briefly build the immune deficiency causing retroviruses. Inside the The RNA is located in a cone-shaped core, the virus is composed of protein subunits that the Name p 24 (p for protein). This inner core is surrounded by a protein shell that consists of the protein p 17 is built (outer core) and one Glycoprotein envelope is surrounded by lipids that are made up of of the host cell, the transmembrane protein gp 41, and contains the coat protein 120 (gp 120). This gp 120 can then binding to the CD-4 receptors of the host cells come in.
Soweit bekannt, weist die RNA der HIV-Viren - vereinfacht dargestellt - folgende Genbereiche auf: An den beiden Enden sogenannte long terminal repeats (LTR), und die folgenden Genbereiche gag, pol, env und nef. Das Gen gag codiert unter anderem für die Kern(Core)-Proteine, p 24 und p 17, das Gen Pol codiert u. a. für die Reverse Transkriptase, die RNAse H und die Integrase und das Gen env codiert für die Glykoproteine gp 41 und gp 120 der Virushülle. Das Gen nef codiert für ein Protein mit Regulatorfunktion. Eine schematische Anordnung des Genomes von Retroviren des HIV- Typs ist in Fig. 1 gezeigt. As far as is known, the RNA of the HIV virus has the following gene regions - to put it simply - at what is termed long terminal repeats (LTR), and the following gene regions gag, pol, env and nef. The gene gag codes, inter alia, for the core proteins p 24 and p 17, the gene Pol codes, inter alia, for reverse transcriptase, RNAse H and integrase, and the gene env codes for glycoproteins gp 41 and gp 120 the virus envelope. The gene nef codes for a protein with a regulatory function. A schematic arrangement of the genome of retroviruses of the HIV type is shown in FIG. 1.
Eine Unterscheidung zwischen den Retroviren HIV-1 und HIV-2 ist u. a. dadurch möglich, daß virales Antigen ausgetestet wird mit einem monoklonalen Antikörper, der kommerziell als Testkit von Abbott (HIVAG-1 Monoclonal) erhältlich ist, und gegen das (HIV-1) p 24 gerichtet ist. Es ist bekannt, daß der Gehalt an Reverser Transkriptase in den Virustypen HIV-1 und HIV-2 etwa gleich ist. Wenn man deshalb in Verdünnungen der aufgeschlossenen Viren die Extinktion (E 490 nm), erhalten durch die Antigen-Antikörper-Reaktion, auf trägt gegen den Gehalt an Reverser Transkriptase, dann erhält man eine Graphik, die etwa der Fig. 2 entspricht. Hierbei stellt man fest, daß im Verhältnis zu dem Gehalt an Reverser Transkriptase bei HIV-1 eine sehr hohe Bindungsaffinität für p 24 mit dem eingesetzten monoklonalen Antikörper vorhanden ist. Für HIV-2 tritt dagegen nur eine sehr geringe Bindungsaffinität für p 24 bei Einsatz des monoklonalen Antikörpers wiederum bezogen auf den Gehalt an Reverser Transkriptase auf. Werden diese Messungen durchgeführt für MVP-5180/91, dann befindet sich die Kurve ziemlich genau in der Mitte zwischen der Kurve von HIV-1 und HIV-2, d. h. die Bindungsaffinität des monoklonalen Antikörpers gegen MVP- 5180/91 p 24 ist gegenüber HIV-1 reduziert. Fig. 2 zeigt schematisch diesen Sachverhalt, wobei RT Reverse Transkriptase bedeutet und als Antigen (Ag) das Protein p 24 eingesetzt wird, gegen das der monoklonale Antikörper, der in dem von Abbott käuflich erwerblichen Testkit vorhanden ist, gerichtet ist.A distinction between the retroviruses HIV-1 and HIV-2 is possible, inter alia, by testing viral antigen with a monoclonal antibody, which is commercially available as a test kit from Abbott (HIVAG-1 monoclonal), and against (HIV-1) p 24 is directed. It is known that the reverse transcriptase content is approximately the same in the HIV-1 and HIV-2 virus types. If, therefore, the absorbance (E 490 nm), obtained by the antigen-antibody reaction, is plotted against the content of reverse transcriptase in dilutions of the digested viruses, a graphic is obtained which corresponds approximately to FIG. 2. It is found that, in relation to the reverse transcriptase content in HIV-1, there is a very high binding affinity for p 24 with the monoclonal antibody used. For HIV-2, on the other hand, there is only a very low binding affinity for p 24 when using the monoclonal antibody, again based on the content of reverse transcriptase. If these measurements are carried out for MVP-5180/91, the curve is pretty much midway between the curve of HIV-1 and HIV-2, ie the binding affinity of the monoclonal antibody against MVP-5180/91 p 24 is against HIV -1 reduced. FIG. 2 shows this situation schematically, where RT means reverse transcriptase and the protein p 24 is used as antigen (Ag) against which the monoclonal antibody which is present in the test kit commercially available from Abbott is directed.
Ein sehr vielseitig verwendbares System der Gentechnologie ist die sogenannte PCR (polymerase chain reaction) geworden, wobei die zur Durchführung des Verfahrens benötigten Komponenten käuflich erworben werden können. Mit diesem Verfahren ist es möglich, DNA-Sequenzen zu amplifizieren, wenn DNA-Bereiche der zu amplifizierenden Sequenz bekannt sind. Es müssen dann kurze komplementäre DNA-Fragmente (Oligonucleotide = Primer) synthetisiert werden, die sich an einen kurzen Bereich der zu amplifizierenden Nukleinsäuresequenz anlagern. Für die Testdurchführung werden HIV-Nukleinsäuren mit den Primern zusammengebracht in einer Reaktionsmischung, die zusätzlich eine Polymerase und Nukleotidtriphosphate enthält. Die Polymerisation (DNA- Synthese) wird für eine bestimmte Zeit durchgeführt und dann werden die Nukleinsäurestränge durch Erwärmen getrennt. Nach Abkühlen läuft dann die Polymerisation erneut an. Wenn es sich also bei dem erfindungsgemäßen Retrovirus um ein HIV-1 oder HIV-2 Virus handelt, dann müßte die Nukleinsäure amplifiziert werden können, indem Primer verwendet werden, die konserviert sind innerhalb der bekannten Sequenzen der Viren HIV-1 und HIV-2. Derartige Primer sind zum Teil vorbeschrieben (Laure, F. et al., Lancet ii, (1988) 538-541 für pol 3 und pol 4 bzw. Ou C.Y. et al., Science 239 (1988) 295-297 für sk 38/39, sk 68/69).A very versatile system of genetic engineering has become the so-called PCR (polymerase chain reaction), the ones required to carry out the method Components can be purchased. With this Method it is possible to amplify DNA sequences if DNA regions of the sequence to be amplified are known are. Short complementary DNA fragments are then required (Oligonucleotides = primer) can be synthesized a short range of the ones to be amplified Attach nucleic acid sequence. For carrying out the test HIV nucleic acids are brought together with the primers in a reaction mixture which additionally contains a polymerase and Contains nucleotide triphosphates. The polymerization (DNA Synthesis) is carried out for a certain time and then the nucleic acid strands are separated by heating. To Cooling then starts the polymerization again. If it So the retrovirus according to the invention is an HIV-1 or HIV-2 virus, then the nucleic acid would have to can be amplified using primers which are conserved within the known sequences of the Viruses HIV-1 and HIV-2. Such primers are in part previously described (Laure, F. et al., Lancet ii, (1988) 538-541 for pol 3 and pol 4 or Ou C.Y. et al., Science 239 (1988) 295-297 for sk 38/39, sk 68/69).
Es wurde nun herausgefunden, daß bei Verwendung von bestimmten Primerpaaren, die folgende Sequenz aufweisen:It has now been found that when using certain primer pairs which have the following sequence:
oder eine Kombination von pol3 und pol4 mitor a combination of pol3 and pol4 with
(Donehower L. A. et al. [1990], J. Virol. Methods 28, 33-46) und mit der PCR mit nested primer Amplifikate der MVP- 5180/91-DNA erhalten wurden.(Donehower L.A. et al. [1990], J. Virol. Methods 28, 33-46) and with the PCR with nested primer amplificates of the MVP 5180/91 DNA were obtained.
Keine oder nur schwache Amplifikate im Vergleich zum HIV-1, die evtl. auf Verunreinigungen zurückzuführen sind, wurden erhalten mit folgenden Primer-Sequenzen:No or only weak amplicons compared to HIV-1, which may be due to contamination obtained with the following primer sequences:
Im Vergleich zum HIV-1 schwache Amplifikate, die jedoch die gleiche Intensität wie das verwendete HIV-2 Isolat (MVP-11971/87) aufwiesen, wurden erhalten mitCompared to HIV-1 weak amplicons, which, however, the same intensity as the HIV-2 isolate used (MVP-11971/87) were obtained with
Eine weitverbreitete Methode zum Nachweis von HIV- Antikörpern ist der sogenannte Western Blot (Immunoblot). Dabei werden die viralen Proteine gelelektrophoretisch aufgetrennt und dann auf eine Membran überführt. Die mit den überführten Proteinen versehenen Membranen werden dann mit Seren der zu untersuchenden Patienten in Verbindung gebracht. Sofern Antikörper gegen die viralen Proteine vorhanden sind, binden diese an die Proteine. Nach Waschen verbleiben lediglich spezifische Antikörper gegen virale Proteine. Die Antikörper werden dann mit Antiantikörpern sichtbar gemacht, die regelmäßig mit einem Enzym gekoppelt sind, das eine Farbreaktion katalysiert. Auf diese Weise können die Banden der viralen Proteine sichtbar gemacht werden.A widespread method of detecting HIV Antibodies are the so-called Western blot (immunoblot). The viral proteins become gel electrophoretic separated and then transferred to a membrane. The one with the Proteins are then transferred to proteins Sera related to the patient to be examined brought. Provided antibodies against the viral proteins are present, they bind to the proteins. After washing only specific antibodies against viral remain Proteins. The antibodies are then combined with anti-antibodies visualized that are regularly coupled with an enzyme that catalyzes a color reaction. In this way can visualize the bands of viral proteins become.
Das erfindungsgemäße Virus MVP-5180/91 weist gegenüber den Viren HIV-1 und HIV-2 im Western Blot zwei signifikante wesentliche Unterschiede auf. Das HIV-1 zeigt regelmäßig eine starke Bande, die dem Protein p 24 zuzuordnen ist und eine sehr schwache, oft kaum sichtbare Bande, die dem Protein p 23 zuzuordnen ist. HIV-2 weist eine kräftige Bande auf, die dem Protein p 25 zuzuordnen ist und manchmal eine schwache Bande, die dem Protein p 23 zuzuordnen ist. Im Unterschied dazu weist das erfindungsgemäße MVP-5180/91 Virus zwei etwa gleich starke Banden auf, die den Proteinen p 24 und p 25 entsprechen. The virus MVP-5180/91 according to the invention shows the Viruses HIV-1 and HIV-2 two significant in Western blot significant differences. The HIV-1 shows regularly a strong band which can be assigned to the protein p 24 and a very weak, often barely visible gang, that the Protein p 23 is assigned. HIV-2 has a strong band that is assigned to the protein p 25 and sometimes one weak band attributable to protein p 23. in the The MVP-5180/91 according to the invention differs from this Virus two approximately equally strong bands on the proteins correspond to p 24 and p 25.
Ein weiterer signifikanter Unterschied besteht bei den Banden, die der Reversen Transkriptase zuzuordnen sind. HIV- 1 zeigt eine Bande (p 53), die der Reversen Transkriptase entspricht und eine Bande (p 66), die der Reversen Transkriptase verbunden mit der RNAse H entspricht. Bei HIV- 2 entspricht die Reverse Transkriptase dem Protein p 55 und, wenn sie mit der RNAse H verbunden ist, dem Protein p 68. Das erfindungsgemäße MPV-5180/91 weist dagegen eine Bande auf bei dem Protein p 48, die der Reversen Transkriptase entspricht, und eine Bande, bei dem Protein p 60, die der Reversen Transkriptase in Verbindung mit RNAse H entspricht.Another significant difference is in the Bands that are assigned to the reverse transcriptase. HIV 1 shows a band (p 53) that of the reverse transcriptase corresponds and a band (p 66) that of the reverse Transcriptase associated with the RNAse H corresponds. With HIV 2 the reverse transcriptase corresponds to the protein p 55 and, when linked to RNAse H, protein p 68. In contrast, the MPV-5180/91 according to the invention has a band on the protein p 48, that of the reverse transcriptase and a band at the protein p 60, which is the Reverse transcriptase in conjunction with RNAse H corresponds.
Aus diesen Ergebnissen kann geschlossen werden, daß die Reverse Transkriptase des MVP-5180/91 ein Molekulargewicht hat, das zwischen etwa 3 und etwa 7 Kilodalton kleiner ist als das der Reversen Transkriptase von HIV-1 bzw. HIV-2. Die Reverse Transkriptase von MPV-5180 weist also ein Molekulargewicht auf, das zwischen etwa 4500 Dalton und etwa 5500 Dalton kleiner ist als die Reverse Transkriptase von HIV-1 bzw. HIV-2.From these results it can be concluded that the Reverse transcriptase of the MVP-5180/91 a molecular weight that is between about 3 and about 7 kilodaltons smaller than that of reverse transcriptase from HIV-1 or HIV-2. The Reverse transcriptase from MPV-5180 thus shows Molecular weight that is between about 4500 daltons and is about 5500 daltons smaller than reverse transcriptase of HIV-1 or HIV-2.
Es wurde herausgefunden, daß mit Hilfe des erfindungsgemäßen Virus MVP-5180/91 anti-env-Antikörper in Seren von deutschen Patienten, die Zeichen von Immunschwäche zeigen, nur schwach nachgewiesen werden können, wobei die Seren aber stark reagieren, wenn anstelle des erfindungsgemäßen Virus ein HIV-1 Virus verwendet wird. Diese stärkere Nachweisreaktion wurde vor allem lokalisiert in dem gp 41 Protein. Bei den Versuchen wurden Serumpanels gegenübergestellt, die einmal von deutschen Patienten stammen und zum anderen von afrikanischen Patienten mit Zeichen von Immunschwäche stammen.It was found that with the help of the invention Virus MVP-5180/91 anti-env antibodies in sera from German Patients who show signs of immunodeficiency are weak can be detected, but the sera are strong react if instead of the virus of the invention HIV-1 virus is used. This stronger detection reaction was mainly localized in the gp 41 protein. Both Trials were juxtaposed with serum panels once come from German patients and from African patient with signs of immunodeficiency come.
Die oben angegebenen Charakteristika kennzeichnen solche Virus-Varianten, die dem erfindungsgemäßen MVP-5180/91 entsprechen. Wenn also aus heparinisiertem Spenderblut, das von Personen stammt, die Immunschwächeanzeichen aufweisen und vorzugsweise aus Afrika stammen, Immunschwächeviren isoliert werden, dann kann auf diese Weise das erfindungsgemäße Virus oder Varianten davon erhalten werden.The characteristics indicated above characterize such Virus variants, the MVP-5180/91 according to the invention correspond. So if from heparinized donor blood, that comes from people who show signs of immunodeficiency and preferably come from Africa, immunodeficiency viruses can be isolated, then this way virus according to the invention or variants thereof are obtained.
Da das Virus isoliert wurde, welches die oben erwähnten Eigenschaften aufweist, kann die Klonierung einer cDNA auf folgendem Weg durchgeführt werden: Das Virus wird aus einer entsprechend großen Kulturmenge (etwa 1 l) präzipitiert und in phosphatgepufferter Kochsalzlösung aufgenommen. Dann erfolgt eine Pelletierung durch ein (20%iges) Saccharose- Kissen. Das Viruspellet kann in 6 M Guanidiniumchlorid in 20 mM Dithiothreitol und 0,5% Nonidet P 40 suspendiert werden. CsCl wird bis auf eine Konzentration von 2 molar zugegeben und die das aufgebrochene Virus enthaltende Lösung wird auf ein Cäsiumchlorid-Kissen aufgebracht. Dann wird die virale RNA durch Zentrifugation pelletiert, gelöst, mit Phenol extrahiert und mit Ethanol und Lithiumchlorid präzipitiert. Mit Hilfe eines Oligo(dT)-Primers wird die Synthese des ersten cDNA-Stranges an der viralen RNA oder Teilen davon durchgeführt. Die Synthese unter Zugabe von Reverser Transkriptase kann durchgeführt werden unter Verwendung eines käuflich erhältlichen Kits. Für die Synthese des zweiten Stranges wird der RNA-Strang des RNA/DNA-Hybrids mit RNase H verdaut und der zweite Strang unter Einsatz von E.coli DNA Polymerase I synthetisiert. Mit Hilfe von T4 DNA Polymerase können dann stumpfe Enden erzeugt werden und diese mit geeigneten Linkern für Restriktionsschnittstellen verbunden werden. Nach Restriktionsverdau mit der geeigneten Restriktionsendonuklease wird das cDNA-Fragment aus einem Agarosegel isoliert und mit einem vorher in geeigneter Weise geschnittenen Vektor ligiert. Der Vektor mit dem cDNA-Insert kann dann zur Transformation von kompetenten E.coli-Zellen verwendet werden. Die erhaltenen Kolonien werden dann auf Membranen übertragen, lysiert und denaturiert und schließlich durch Hybridisierung mit Digoxigenin oder Biotin markierter Nukleinsäure aufgefunden. Nach gentechnologischer Herstellung der entsprechenden cDNA ist eine Isolierung der gewünschten DNA-Fragmente, die aus dem Retrovirus stammen, möglich. Durch Einbau dieser Fragmente in geeignete Expressionsvektoren kann dann das gewünschte Protein bzw. Proteinfragment exprimiert werden und für die diagnostischen Tests eingesetzt werden.Since the virus was isolated, which mentioned the above Has properties, the cloning of a cDNA the following way: The virus is made from a correspondingly large amount of culture (about 1 l) precipitated and taken up in phosphate buffered saline. Then pelleting is carried out using a (20%) sucrose Pillow. The virus pellet can be in 6 M guanidinium chloride 20 mM dithiothreitol and 0.5% Nonidet P 40 suspended become. CsCl becomes up to a concentration of 2 molar added and the solution containing the broken virus is applied to a cesium chloride cushion. Then the viral RNA pelleted by centrifugation, dissolved, with Phenol extracted and with ethanol and lithium chloride precipitated. With the help of an oligo (dT) primer, the Synthesis of the first strand of cDNA on the viral RNA or Parts of it done. The synthesis with the addition of Reverse transcriptase can be done at Using a commercially available kit. For the Synthesis of the second strand becomes the RNA strand of the RNA / DNA hybrids digested with RNase H and the second strand synthesized using E. coli DNA polymerase I. With Using T4 DNA polymerase can then blunt ends generated and these with suitable linkers for Restriction interfaces are connected. To Restriction digestion with the appropriate Restriction endonuclease is the cDNA fragment from a Agarose gel isolated and with a previously appropriate cut vector ligated. The vector with the cDNA insert can then be used to transform competent E. coli cells be used. The colonies obtained are then expanded Membranes transferred, lysed and denatured and finally by hybridization with digoxigenin or biotin labeled nucleic acid found. After genetic engineering Preparation of the corresponding cDNA is an isolation of the desired DNA fragments that originate from the retrovirus, possible. By incorporating these fragments into suitable ones Expression vectors can then be the desired protein or Protein fragment can be expressed and used for diagnostic Tests are used.
Alternativ zu der angegebenen Methode kann das Immunschwächevirus mit Hilfe der PCR-Technologie kloniert werden, wobei die oben angegebenen Primer Verwendung finden können.As an alternative to the specified method, this can Immunodeficiency virus cloned using PCR technology using the primers given above can.
Zwischen verschiedenen Virusisolaten kann die Ähnlichkeit ausgedrückt werden durch den Grad der Homologie der Nucleinsäure- oder Proteinsequenzen. Eine 50%ige Homologie bedeutet beispielsweise, daß 50 von 100 Nucleotid- oder Aminosäure-Positionen in den Sequenzen übereinstimmen. Die Homologie von Proteinen wird durch Sequenzanalyse bestimmt. Homologe DNA-Sequenzen lassen sich auch durch die Hybridisierungs-Technik ermitteln.The similarity can exist between different virus isolates are expressed by the degree of homology of the Nucleic acid or protein sequences. A 50% homology means, for example, that 50 out of 100 nucleotide or Amino acid positions in the sequences match. The Homology of proteins is determined by sequence analysis. Homologous DNA sequences can also be identified by the Determine hybridization technique.
Erfindungsgemäß wurde nun ein Teil aus dem Hüllprotein sequenziert und festgestellt, daß diese Sequenz nur eine verhältnismäßig geringe Homologie zu den entsprechenden Sequenzen von Viren vom HIV-Typ aufweist. Insbesondere bezogen auf den gp 41-Bereich wurde durch einen Vergleich mit HIV-Sequenzen, der mit Hilfe von Datenbanken durchgeführt wurde, eine Homologie von höchstens 66% (Nucleotidsequenz) ermittelt.According to the invention, part of the coat protein has now become sequenced and found that this sequence is only one relatively low homology to the corresponding Has sequences of HIV-type viruses. Especially based on the gp 41 range was by comparison with HIV sequences using databases homology of at most 66% (Nucleotide sequence) determined.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher solche Viren, die eine Homologie von mehr als 66%, bevorzugt 75% und besonders bevorzugt 85% aufweisen zu dem erfindungsgemäßen HIV-Virus, MVP 5180/91, bezogen auf die Nucleotidsequenz der Tabelle 1.The present invention therefore relates to such Viruses that have a homology of more than 66%, preferably 75% and particularly preferably have 85% of that HIV virus according to the invention, MVP 5180/91, based on the Nucleotide sequence of Table 1.
Anhand der isolierten Sequenz können immundominante Epitope (Peptide) konfektioniert und synthetisiert werden. Using the isolated sequence, immunodominant epitopes (Peptides) are assembled and synthesized.
Bei den diagnostischen Tests wird eine Serumprobe der zu untersuchenden Person zusammengebracht mit den Proteinketten von einem oder mehreren Proteinen oder Glykoproteinen (die in eukaryontischen Zellinien exprimiert werden können) oder Teilen davon, die von MVP-5180/91 stammen. Bevorzugte Testverfahren schließen die Immunfluoreszenz oder immunenzymatische Testverfahren (z. B. Elisa, Immunoblot) ein.In the diagnostic tests, a serum sample is taken of the investigator brought together with the protein chains of one or more proteins or glycoproteins (the can be expressed in eukaryotic cell lines) or Parts of it that come from MVP-5180/91. Preferred Test procedures include immunofluorescence or immuno-enzymatic test methods (e.g. Elisa, immunoblot) a.
Bei den immunenzymatischen Tests (ELISA) kann beispielsweise Antigen, das von MVP-5180/91 oder einer Variante davon stammt, an den Wänden von Mikrotiterplatten gebunden werden. Die dabei verwendete Dosierung hängt von dem Testsystem und der Behandlung der Mikrotiterplatten wesentlich ab. Dann wird Serum bzw. Serumverdünnungen, die von der zu untersuchenden Person stammen, in die Löcher der Mikrotiterplatten gegeben. Nach einer bestimmten Inkubationszeit wird die Platte gewaschen und spezifische Immunkomplexe werden nachgewiesen durch Antikörper, die spezifisch an menschliche Immunglobuline binden und die vorher mit einem Enzym, beispielsweise Meerrettichperoxidase, alkalischer Phosphatase usw. verbunden wurden oder mit enzymmarkiertem Antigen. Diese Enzyme können ein farbloses Substrat in ein stark gefärbtes Produkt umwandeln und an der Stärke der Färbung kann dann das Vorhandensein von spezifischen Anti-HIV-Antikörpern abgelesen werden. Eine weitere Möglichkeit der Verwendung des erfindungsgemäßen Virus in Testsystemen ist die Verwendung in Western Blots.In the case of immunoenzymatic tests (ELISA), for example Antigen from MVP-5180/91 or a variant thereof is bound to the walls of microtiter plates. The dosage used depends on the test system and the treatment of the microtiter plates. Then will be serum or serum dilutions that depend on the investigating person come into the holes of the Given microtiter plates. After a certain Incubation period, the plate is washed and specific Immune complexes are detected by antibodies that bind specifically to human immunoglobulins and the beforehand with an enzyme, for example Horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, etc. linked or with enzyme labeled antigen. This Enzymes can turn a colorless substrate into a highly colored one The product can then transform and change in color strength the presence of specific anti-HIV antibodies be read. Another way of using of the virus according to the invention in test systems is the Use in Western blots.
Auch wenn die Herstellung von Impfstoffen gegen Immunschwächeerkrankungen sich als äußerst schwierig erweist, kann doch auch dieses Virus bzw. Teile davon, d. h. immundominante Epitope und Induktoren der zellulären Immunität, oder gentechnologisch hergestellte Antigene zur Entwicklung und Herstellung von Impfstoffen verwendet werden.Even if the production of vaccines against Immunodeficiency disorders prove to be extremely difficult proves, this virus or parts of it, d. H. immunodominant epitopes and inducers of cellular Immunity, or genetically engineered antigens to Development and manufacture of vaccines used become.
Das erfindungsgemäße Immunschwäche-Virus MVP-5180/91 wurde aus dem Blut einer Patientin mit Zeichen von Immunschwäche isoliert. Hierzu wurden periphere mononukleäre Zellen (peripheral blood lymphocytes, PBL) und periphere Lymphozyten aus dem Blut (PBL) eines nicht HIV-infizierten Spenders mit Phytohämaglutinin stimuliert und in Kultur gehalten. Verwendet wurde hierzu das übliche Medium RPMI 1640 mit 10% fötalem Kälberserum. Die Kulturbedingungen sind beschrieben in Landäy A. et al., J. Inf. Dis., 161 (1990) S. 706-710: Beobachtet wurde dann die Bildung von Riesenzellen unter dem Mikroskop. Die Produktion von HIV- Viren wurde über die Bestimmung des p 24-Antigens mit Hilfe des käuflich erwerbbaren Tests von Abbot bestimmt. Ein weiterer Test zur Bestimmung des Wachstums der Viren war der Test unter Verwendung von partikelgebundener Reverser Transkriptase (Eberle J., Seibl R., J. Virol. Methods in press). Das Wachstum der Viren wurde also anhand der enzymatischen Aktivitäten im Kulturüberstand ein- bis zweimal pro Woche bestimmt, um die Virusproduktion zu überwachen. Wöchentlich einmal wurden neue Spenderlymphozyten zugegeben.The immunodeficiency virus MVP-5180/91 according to the invention was from the blood of a patient with signs of immunodeficiency isolated. Peripheral mononuclear cells were used for this purpose (peripheral blood lymphocytes, PBL) and peripheral Lymphocytes from the blood (PBL) of a non-HIV-infected Donors stimulated with phytohemaglutinin and in culture held. The usual medium RPMI was used for this 1640 with 10% fetal calf serum. The cultural conditions are described in Landäy A. et al., J. Inf. Dis., 161 (1990) pp. 706-710: The formation of Giant cells under the microscope. The production of HIV Viruses were detected using the p 24 antigen of Abbot's commercially available test. A another test to determine the growth of the virus was the Test using particle-bound reverser Transcriptase (Eberle J., Seibl R., J. Virol. Methods in press). The growth of the viruses was therefore based on the enzymatic activities in the culture supernatant one to determined twice a week to increase virus production monitor. Once a week there were new ones Donor lymphocytes added.
Nachdem eine HIV-Virenvermehrung festgestellt werden konnte, wurden frische periphere Lymphozyten aus dem Blut (PBL) nicht HIV-infizierter, gesunder Spender mit dem Überstand der ersten Kultur infiziert. Dieser Schritt wurde wiederholt und dann wurden mit dem Überstand H 9 bzw. HUT 78 Zellen infiziert. Auf diese Weise war eine permanente Produktion des Immunschwäche-Virus möglich. Das Virus wurde bei der ECACC unter der Nr. V 920 92 318 hinterlegt.After HIV virus replication was found, fresh peripheral blood lymphocytes (PBL) healthy donor not infected with HIV with the supernatant the first culture infected. This step was repeated and then with the supernatant H 9 and HUT became 78 cells infected. In this way it was a permanent production of the immunodeficiency virus possible. The virus was found in the ECACC deposited under number V 920 92 318.
Zum Nachweis von HIV-Infektionen ist derzeit der sogenannte Western Blot oder Immunoblot ein Standardverfahren. Gemäß der in J. Virol. Meth. 15 (1987) S. 11-23 von Gürtler et al. beschriebenen Vorgehensweise wurden verschiedene Seren untersucht. Hierbei wurden Seren von deutschen Patienten solchen Seren gegenübergestellt, die von afrikanischen Patienten erhalten wurden. Es wurden hierbei folgende Ergebnisse erhalten:The so-called is currently used to detect HIV infections Western blot or immunoblot is a standard procedure. According to the one in J. Virol. Meth. 15 (1987) pp. 11-23 by Gürtler et al. The procedure described was different sera examined. Here sera from German patients compared to those sera from African Patients were obtained. Here were the following Get results:
Die oben dargestellten Ergebnisse zeigen, daß ein aus deutschen Patienten isoliertes Virus vom HIV-1 Typ, wenn es zum Nachweis von HIV-Infektionen verwendet wird, möglicherweise keine eindeutigen Ergebnisse liefert, wenn der Patient infiziert wurde mit einem Virus, das dem erfindungsgemäßen MVP-5180/91 entspricht. Es wird dabei davon ausgegangen, daß mit Hilfe des erfindungsgemäßen Virus solche Viren nachgewiesen werden können, die wenigstens etwa 85% Homologie, bezogen auf das Gesamtgenom, zu dem erfindungsgemäßen Virus aufweisen.The results presented above show that an out German patients isolated HIV-1 type virus if it is used to detect HIV infections, may not produce clear results if the patient has been infected with a virus that MVP-5180/91 according to the invention corresponds. It will be there assumed that with the help of the virus according to the invention such viruses can be detected that at least approximately 85% homology, based on the total genome, to the exhibit virus according to the invention.
Gemäß der in Beispiel 2 angegebenen Vorgehensweise wurden weitere Western Blots durchgeführt. Die Ergebnisse sind in der anliegenden Fig. 3 dargestellt. Bei diesem Test wurde einmal das virale Protein des erfindungsgemäßen Immunschwäche-Virus MVP-5180/91 und einmal das virale Protein eines HIV-1-Typ Virus (MVP-899) gelelektrophoretisch aufgetrennt und dann auf Zellulosefilter transferiert. Diese Filterstreifen wurden mit den Seren von verschiedenen Patienten inkubiert und dann wurden die spezifischen Antikörper durch eine Farbreaktion sichtbar gemacht. Die linke Hälfte der Figur mit der Überschrift MVP-5180 zeigt das erfindungsgemäße Immunschwäche-Virus. Die rechte Hälfte der Figur zeigt ein aus deutschem Spender isoliertes Virus (MVP-899), bei dem es sich um ein HIV-1-Virus handelt.Further Western blots were carried out in accordance with the procedure given in Example 2. The results are shown in the attached FIG. 3. In this test, the viral protein of the immunodeficiency virus MVP-5180/91 according to the invention and once the viral protein of an HIV-1 type virus (MVP-899) were separated by gel electrophoresis and then transferred to cellulose filters. These filter strips were incubated with the sera from different patients and then the specific antibodies were visualized by a color reaction. The left half of the figure with the heading MVP-5180 shows the immunodeficiency virus according to the invention. The right half of the figure shows a virus isolated from a German donor (MVP-899), which is an HIV-1 virus.
Die einzelnen Filterstreifen wurden nun mit den Seren von verschiedenen Patienten inkubiert. Betrachtet man die Fig. 3, so wurden jeweils dieselben Seren (von deutschen Patienten) umgesetzt mit je zwei Filterstreifen, wobei die Nummern 8 und 26; 9 und 27; 10 und 28; 11 und 29; 12 und 30; 13 und 31; 14 und 32; 15 und 33 sowie 16 und 34 die gleichen Seren bezeichnen. Bei den Western Blots mit den Nummern 17 und 18 wurden Seren von afrikanischen Patienten eingesetzt. Die Zahlen an den rechten Seitenrändern geben die annähernden Molekulargewichte in Tausend (KD) an.The individual filter strips were then incubated with the sera from different patients. Looking at FIG. 3, the same sera (from German patients) were implemented with two filter strips, the numbers 8 and 26; 9 and 27; 10 and 28; 11 and 29; 12 and 30; 13 and 31; 14 and 32; 15 and 33 and 16 and 34 denote the same sera. Sera from African patients were used in the Western blots with the numbers 17 and 18. The numbers on the right hand side indicate the approximate molecular weights in thousands (KD).
Die Fig. 3 zeigt deutlich, daß Seren von deutschen Patienten mit dem erfindungsgemäßen Immunschwäche-Virus im Western Blot mit dem gp 41 nur sehr schwach reagieren. Seren von afrikanischen Patienten dagegen reagieren mit dem erfindungsgemäßen Immunschwäche-Virus sehr stark. Fig. 3 macht daher deutlich, daß unter Verwendung des erfindungsgemäßen Immunschwäche-Virus solche Immunschwäche- Infektionen nachgewiesen werden können, die bei Verwendung eines HIV-1 oder HIV-2-Virus nur fragliche, also nicht eindeutig positive Ergebnisse liefern. Diese Nachweismöglichkeit kann weitreichende diagnostische Bedeutung haben, da in den Fällen, in denen nur fragliche Ergebnisse im Western Blot erzielt werden, nicht mit eindeutiger Sicherheit festgestellt werden kann, ob es sich um eine Infektion mit einem Immunschwäche-Virus handelt. Wenn aber mit Hilfe des erfindungsgemäßen Immunschwäche- Virus derartige fragliche Ergebnisse einer Infektion mit einem Virus des erfindungsgemäßen Typs zugeordnet werden können, dann stellt dies einen erheblichen diagnostischen Fortschritt dar. FIG. 3 clearly shows that sera from German patients with the immunodeficiency virus according to the invention react in the Western blot with the gp 41 only very weakly. In contrast, sera from African patients react very strongly with the immunodeficiency virus according to the invention. Fig. 3 therefore makes clear that such immunodeficiency infections can be detected using the immunodeficiency virus according to the invention, which provide for use of an HIV-1 or HIV-2 virus only in question, that is not clearly positive results. This possibility of detection can have far-reaching diagnostic significance, since in cases in which only questionable results are obtained in the Western blot, it cannot be determined with certainty whether it is an infection with an immunodeficiency virus. However, if such questionable results of an infection with a virus of the type according to the invention can be assigned with the help of the immunodeficiency virus according to the invention, then this represents a significant diagnostic advance.
Genomische DNA aus MVP-5180/91-infizierten HUT 78-Zellen wurden nach Standardmethoden isoliert.Genomic DNA from MVP-5180/91 infected HUT 78 cells were isolated using standard methods.
Zur Charakterisierung von Genombereichen des Isolates MVP-5180/91 wurden PCR (Polymerase Chain Reaction)- Experimente mit einem Primerpaar aus dem Hüllproteinbereich gp 41 durchgeführt. Die Durchführung der PCR-Experimente erfolgte nach der Methode von Saiki et al. (Saiki et al., Science 239: 487-491, 1988) mit folgenden Modifikationen:For the characterization of genome areas of the isolate MVP-5180/91 were PCR (Polymerase Chain Reaction) - Experiments with a primer pair from the coat protein area GP 41 performed. Carrying out the PCR experiments was carried out according to the method of Saiki et al. (Saiki et al., Science 239: 487-491, 1988) with the following modifications:
Für die Amplifikation HIV-spezifischer DNA-Bereiche wurden 5 µl genomische DNA aus MVP-5180/91 infizierten HUT 78- Zellen in einem 100 µl Reaktionsansatz (0,25 mM dNTP, je 1 µM Primer 1 und Primer 2, 10 mM Tris HCl pH 8,3, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl₂, 0,001% Gelatine, 2,5 units Taq Polymerase (Perkin Elmer) pipettiert und nach folgendem Temperatur-Programm amplifiziert: 1. Initiale Denaturierung: 3′ 95°C, 2. Amplifikation: 90′′ 94°C, 60′′ 56°C, 90′′ 72°C (30 Cyclen).For the amplification of HIV-specific DNA areas 5 µl genomic DNA from MVP-5180/91 infected HUT 78- Cells in a 100 µl reaction mixture (0.25 mM dNTP, each 1 µM Primer 1 and Primer 2, 10 mM Tris HCl pH 8.3, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl₂, 0.001% gelatin, 2.5 units Taq Pipette polymerase (Perkin Elmer) and after the following Temperature program amplified: 1. Initial denaturation: 3 ′ 95 ° C, 2nd amplification: 90 ′ ′ 94 ° C, 60 ′ ′ 56 ° C, 90 ′ ′ 72 ° C (30 cycles).
Die für die PCR und die Nucleotidsequenzierung verwendeten Primer wurden auf dem Oligonucletidsynthesizer 8750 der Firma Biosearch synthetisiert.Those used for PCR and nucleotide sequencing Primers were made on the 8750 oligonucleotide synthesizer Biosearch synthesized.
Die amplifizierte DNA wurde über ein 3% "Nusieve"- Agarosegel (Fa. Biozyme) aufgetrennt, das amplifizierte Fragement ausgeschnitten und mit dem gleichen Volumen an Puffer (1×TBE (0,09 M TrisBorat, 0,002 M EDTA pH8,0) versetzt. Nach Inkubation des DNA-Agarosegemisches für 10 Minuten bei 70°C und nachfolgender Phenolextraktion wurde die DNA aus der wäßrigen Phase durch Zugabe von 1/10 Vol 3M NaAc pH 5,5 und 2 Vol Ethanol bei -20°C 15′ gefällt und anschließend in einer Zentrifuge (Eppendorf) pelletiert (13000 rpm, 10′, 4°C). Die pelletierte DNA wurde getrocknet, in Wasser aufgenommen und nach der photometrischen Bestimmung der DNA-Konzentration bei 260 nm im Spektralphotometer (Beckman) nach der Methode von Sanger (F. Sanger, Proc. Natl. Adac. Sci., 74: 5463, 1977) sequenziert. Anstelle der Sequenzierung mit Klenow DNA Polymerase, wurde die Sequenzierungsreaktion mit einem Kit von Applied Biosystems ("Taq Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing", Best.-Nr.: 401150) durchgeführt. Als Primer wurden in getrennten Sequenzierungsreaktionen Primer 1 oder Primer 2 (jeweils 1 µM) eingesetzt. Die Analyse der Sequenzierungsreaktion erfolgte auf dem DNA-Sequenziergerät 373A (Applied Biosystems) nach den Vorgaben des Geräteherstellers.The amplified DNA was over a 3% "Nusieve" - Agarose gel (Biozyme) separated, the amplified Cut out the frustration and apply the same volume Buffer (1 × TBE (0.09 M TrisBorat, 0.002 M EDTA pH8.0) transferred. After incubation of the DNA agarose mixture for 10 minutes at 70 ° C and subsequent phenol extraction the DNA from the aqueous phase by adding 1/10 vol 3M NaAc pH 5.5 and 2 vol ethanol at -20 ° C 15 ′ and then pelleted in a centrifuge (Eppendorf) (13000 rpm, 10 ′, 4 ° C). The pelleted DNA was dried taken up in water and after the photometric Determination of the DNA concentration at 260 nm in Spectrophotometer (Beckman) using the Sanger method (F. Sanger, Proc. Natl. Adac. Sci., 74: 5463, 1977) sequenced. Instead of sequencing with Klenow DNA Polymerase, the sequencing reaction was performed using a kit by Applied Biosystems ("Taq Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing ", order no .: 401150). As a primer were in separate sequencing reactions primer 1 or Primer 2 (1 µM each) used. The analysis of the Sequencing reaction was done on the DNA sequencer 373A (Applied Biosystems) according to the specifications of Device manufacturer.
Die Nucleotidsequenz des amplifizierten DNA-Bereichs und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz ist in der Tabelle 1 dargestellt. The nucleotide sequence of the amplified DNA region and the the amino acid sequence derived therefrom is in Table 1 shown.
Die gefundene Nucleotidsequenz aus Tabelle 1 wurde auf homologe Sequenzen in der GENEBANK-Datenbank (Release 72, Juni 1992) mit Hilfe des GCG-Computerprogramms (Genetic Computer Group, Inc., Wisconsin USA, Version 7.1, März 1992) untersucht. In dieser Datenbank sind die meisten der bis Juli 1992 bekannten Nucleotidsequenzen von Immundefizienzviren humanen Ursprungs und von Isolaten aus Primaten enthalten.The nucleotide sequence found from Table 1 was found on homologous sequences in the GENEBANK database (release 72, June 1992) with the help of the GCG computer program (Genetic Computer Group, Inc., Wisconsin USA, version 7.1, March 1992) examined. In this database most of the are up July 1992 known nucleotide sequences from Immunodeficiency viruses of human origin and isolates Primates included.
Die Nucleotidsequenz aus Tabelle 1 weist im besten Fall eine 66%ige Homologie zu einem Schimpansen-Isolat auf (Tabelle 2a). Zu HIV 1-Isolaten ist MVP 5180/91 in der untersuchten DNA-Sequenz im besten Fall zu 64% homolog (Tabelle 2b). Zu HIV 2-Isolaten ist die DNA aus Tabelle 1 zu 56% homolog (Tabelle 2c). Außer der Sequenz des Schimpansenisolates (Tabelle 2a) besteht die beste Homologie zwischen der Nucleotidsequenz aus Tabelle 1 und DNA- Abschnitten aus Primatenisolaten (SIV: Simian Immunodeficiency Virus) in einer DNA-Sequenz, die für einen Teilbereich des Hüllproteins des Isolates SIV (Afrikanische Meerkatze) TYO-1 kodiert. Die Homologie beträgt 61,5% (Tabelle 2d).At best, the nucleotide sequence from Table 1 has one 66% homology to a chimpanzee isolate (Table 2a). For HIV 1 isolates, MVP 5180/91 is in the examined DNA sequence at best 64% homologous (Table 2b). For HIV 2 isolates, the DNA from Table 1 is too 56% homologous (Table 2c). Except for the sequence of the Chimpanzee isolates (Table 2a) have the best homology between the nucleotide sequence from Table 1 and DNA Sections from primate isolates (SIV: Simian Immunodeficiency Virus) in a DNA sequence that is essential for a Part of the coat protein of isolate SIV (African Vervet monkey) TYO-1 coded. The homology is 61.5% (Table 2d).
Die gefundene Aminosäuresequenz aus Tabelle 1 wurde auf homologe Sequenzen in der SWISSPROT Protein-Datenbank (Release 22, Juni 1992) mit Hilfe des GCG-Computerprogramms untersucht. In dieser Datenbank sind die meisten der bis Juni 1992 bekannten Proteinsequenzen von Immundefizienz- Viren humanen Ursprungs und von Isolaten aus Primaten enthalten.The amino acid sequence found from Table 1 was found on homologous sequences in the SWISSPROT protein database (Release 22, June 1992) using the GCG computer program examined. In this database most of the are up June 1992 known protein sequences of immunodeficiency Viruses of human origin and isolates from primates contain.
Die Aminosäuresequenz aus Tabelle 1 ist im besten Fall mit 62,5% zu einem Hüllproteinabschnitt des oben genannten Schimpansenisolates homolog (Tabelle 3a). Unter HIV 1- Hüllproteinen findet man die beste Homologie mit der Aminosäuresequenz aus Tabelle 1, in dem Isolat HIV 1 Mal. Die Homologie beträgt 59% (Tabelle 3b). Zu HIV 2- Hüllproteinen beträgt die Homologie mit der Aminosäuresequenz aus Tabelle 1 im besten Fall 52% (Tabelle 3c, Isolat HIV 2 Rod). Da auch HIV 1 und HIV 2- Isolate im besten Fall im korrespondierenden Proteinabschnitt nur zu 64% identisch sind, scheint es sich bei dem Isolat MVP-5180/9 1 um eine HIV-Variante zu handeln, die sich deutlich von HIV 1 und von HIV 2 strukturell abgrenzt und somit einen Vertreter einer davon unabhängigen Gruppe von HIV-Viren repräsentiert.The amino acid sequence from Table 1 is at best 62.5% homologous to a coat protein section of the above-mentioned chimpanzee isolate (Table 3a). Among HIV 1 envelope proteins, the best homology with the amino acid sequence from Table 1 is found, in the isolate HIV 1 time. The homology is 59% (Table 3b). The homology to the HIV 2 envelope proteins with the amino acid sequence from Table 1 is in the best case 52% (Table 3c, isolate HIV 2 Rod). Since HIV 1 and HIV 2 isolates are at best only 64% identical in the corresponding protein segment, the isolate MVP-5180/9 1 seems to be an HIV variant that clearly differs from HIV 1 and from Structurally delimits HIV 2 and thus represents a representative of an independent group of HIV viruses.
Die Aminosäuresequenz des amplifizierten DNA-Bereiches (Tabelle 1) des HIV-Isolates MVP 5180/91 überlappt mit einem immundiagnostisch wichtigen Bereich aus dem Hüllprotein gp 41 von HIV 1 (Aminosäure 584-618*) (Tabelle 4) (Gnann et al., J. Inf. Dis. 156: 261-267, 1987; Norrby et al., Nature, 329: 248-250, 1987).The amino acid sequence of the amplified DNA region (Table 1) of the HIV isolate MVP 5180/91 overlaps with an immunodiagnostically important region from the envelope protein gp 41 of HIV 1 (amino acid 584-618 *) (Table 4) (Gnann et al., J. Inf. Dis. 156: 261-267, 1987; Norrby et al., Nature, 329: 248-250, 1987).
Korrespondierende Aminosäurebereiche aus den Hüllproteinen von HIV 2 und SIV sind ebenfalls immundiagnostisch konserviert (Gnann et al., Science, S. 1346-1349, 1987). So werden Peptide aus diesem Hüllproteinbereich von HIV 1 und HIV 2 in vielen kommerziell erhältlichen HIV 1/2 Antikörper- Screeningtests als Festphasenantigene eingesetzt. Ungefähr 99% der anti HIV 1 und anti HIV 2 positiven Seren können damit erfaßt werden.Corresponding amino acid regions from the coat proteins HIV 2 and SIV are also immunodiagnostic conserved (Gnann et al., Science, pp. 1346-1349, 1987). So are peptides from this coat protein region of HIV 1 and HIV 2 in many commercially available HIV 1/2 antibodies Screening tests used as solid phase antigens. Approximately 99% of anti HIV 1 and anti HIV 2 positive sera can thus be grasped.
Der Aminosäurebereich des MVP-5180/91-Hüllproteins (Tabelle 1) könnte aufgrund der Überlappung mit dem immundiagnostisch wichtigen Bereich aus gp 41 serodiagnostisch von Bedeutung sein. Dies wäre insbesondere dann der Fall, wenn Antiseren von HIV-infizierten Patienten mit keinem der kommerziell erhältlichen Antikörper- Screeningtests positiv reagieren würden. In diesen Fällen könnte eine Infektion mit einem MVP-5180/91 eng verwandten Virus vorliegen.The amino acid region of the MVP-5180/91 coat protein (Table 1) could be due to the overlap with the immunodiagnostically important area from gp 41 be of serodiagnostic importance. This would be particular then the case when antisera from HIV-infected patients with none of the commercially available antibody Screening tests would respond positively. In these cases could be an infection with an MVP-5180/91 closely related Virus present.
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