DE68918091T2 - STORAGE-STABLE COMPOSITIONS OF HOMOGENIC DIMEREM M-CSF. - Google Patents
STORAGE-STABLE COMPOSITIONS OF HOMOGENIC DIMEREM M-CSF.Info
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Abstract
Description
Der Macrophagenkolonien stimulierende Faktor (Macrophage colony stmulating factor, M-CSF) ist ein regulatorisches Glycoprotein, das die hämopoetische Zellproliferation und -differenzierung stimuliert. Wenn man M-CSF in einem in vitro Test auf Koloniestimulation einsetzt, führt dies zur Bildung von Kolonien mit überwiegend monocytärem Abstammungstypus.Macrophage colony stimulating factor (M-CSF) is a regulatory glycoprotein that stimulates hematopoietic cell proliferation and differentiation. When used in an in vitro colony stimulation assay, M-CSF results in the formation of colonies with a predominantly monocyte lineage.
M-CSF findet bedeutende therapeutische Verwendung. M-CSF kann beispielsweise in Fällen ernsthafter Infektionen zur Aktivierung reifer weißer Zellen oder als Therapeutikum für natürlich auftretende oder strahlenbedingte Leukopenie eingesetzt werden. Er kann außerdem entweder allein oder gemeinsam mit bestimmten, gegen tumorbegleitende Antigene gerichteten Antikörpern zur Abtötung von Tumorzellen verabreicht werden, wie es in der am 7. September 1988 als WO 88/06452 veröffentlichten PCT/US88/00618 beschrieben wird. M-CSF kann verabreicht werden, um den Cholesterinspiegel günstig zu verändern.M-CSF has important therapeutic uses. For example, M-CSF can be used in cases of serious infections to activate mature white cells or as a therapeutic agent for naturally occurring or radiation-induced leukopenia. It can also be administered either alone or in conjunction with certain antibodies directed against tumor-associated antigens to kill tumor cells, as described in PCT/US88/00618, published September 7, 1988 as WO 88/06452. M-CSF can be administered to beneficially alter cholesterol levels.
M-CSF voller Länge wird bei Wong et al., Science, 235:1504-1508 (1987), beschrieben. Die Herstellung von M-CSF voller Länge mit DNA- Rekombinationstechniken wird bei Clark et al. in der am 19. November 1987 als WO 87/06954 veröffentlichten PCT/US87/00835 beschrieben. Eine cDNA-Sequenz für eine verkürzte M-CSF-Variante wurde bei Kawasaki et al., Science, 230:291-296 (1985), beschrieben. Die rekombinante Herstellung dieser verkürzten M-CSF-Version wird in der am 14. August 1986 als WO 86/04607 veröffentlichten PCT/US86/00238, beschrieben. Variationen dieser verkürzten Version, die Deletionen oder Substitutionen hydrophober, für Transmembranregionen charakteristischer Aminosäuren aufweisen, werden in der am 16. Dezember 1987 veröffentlichten EP 249 477 beschrieben. Andere rekombinant hergestellte "kurze" und "lange" Formen von M-CSF und diesen entsprechende mutierte Proteine werden bei Koths et al., PCT/US87/02679, veröffentlicht am 5. Mai 1988 als WO 88/03173, beschrieben. Es ist vorauszusehen, daß die vorhergehenden M-CSF-Polypeptide in dieser Erfindung verwendet werden können.Full-length M-CSF is described in Wong et al., Science, 235:1504-1508 (1987). The production of full-length M-CSF using recombinant DNA techniques is described in Clark et al., PCT/US87/00835, published November 19, 1987 as WO 87/06954. A cDNA sequence for a truncated M-CSF variant was described in Kawasaki et al., Science, 230:291-296 (1985). The recombinant production of this truncated M-CSF version is described in PCT/US86/00238, published August 14, 1986 as WO 86/04607. Variations of this truncated version, which contain deletions or substitutions of hydrophobic amino acids characteristic of transmembrane regions, are described in EP 249 477, published on December 16, 1987. Other recombinantly produced "short" and "long" forms of M-CSF and corresponding mutant proteins are described in Koths et al., PCT/US87/02679, published on May 5, 1988 as WO 88/03173. It is anticipated that that the foregoing M-CSF polypeptides can be used in this invention.
Zellen oder Zellinien, die zur Verwendung bei der rekombinanten Herstellung von M-CSF geeignet sind, umfassen Säugerzellen wie Ovarienzellen vom Chinesischen Hamster (CHO-Zellen), die in der WO 87/06954 beschriebene Affenzellinie COS-1 und die Zelllinie CV-1. Bakterienzellen, beispielsweise E. coli und B. subtilis, können ebenfalls als Expressionssysteme verwendet werden. Zusätzlich stehen viele Stämme von Hefezellen als Wirtszellen zur Verfügung.Cells or cell lines suitable for use in the recombinant production of M-CSF include mammalian cells such as Chinese hamster ovary (CHO) cells, the monkey cell line COS-1 described in WO 87/06954, and the cell line CV-1. Bacterial cells, such as E. coli and B. subtilis, can also be used as expression systems. In addition, many strains of yeast cells are available as host cells.
Es besteht allgemein Einigkeit, daß das native M-CSF-Protein aus zwei identischen, stark glycosylierten Untereinheiten besteht. Dieses dimere Polypeptid hat eine komplexe Quartär-Struktur, die sowohl durch kovalente als auch durch nichtkovalente Bindung aufrechterhalten wird.It is generally agreed that the native M-CSF protein consists of two identical, highly glycosylated subunits. This dimeric polypeptide has a complex quaternary structure that is maintained by both covalent and noncovalent binding.
Die Anmelder haben gefunden, daß die Integrität dieser Quartärstruktur durch überraschend mäßige pH- und Lösungsmitteleffekte gefährdet wird, die zur Bildung von multimeren Molekülaggregaten führen. Der Begriff "Multimere Molekülaggregate" wird hier zur Bezeichnung hochmolekularer Spezies verwendet, die aus drei oder mehr ganzen M-CSF-Untereinheiten bestehen. Außerdem entstehen hochmolekulare Spezies auch bei M-CSF, der nach dem Verfahren von Clark et al., Internationale Veröffentlichungsnummer WO 87/06954, hergestellt wird.Applicants have found that the integrity of this quaternary structure is compromised by surprisingly modest pH and solvent effects, resulting in the formation of multimeric molecular aggregates. The term "multimeric molecular aggregates" is used herein to refer to high molecular weight species consisting of three or more entire M-CSF subunits. In addition, high molecular weight species are also formed with M-CSF prepared by the method of Clark et al., International Publication Number WO 87/06954.
Die Anmelder haben auch gefunden, daß die Lyophilisierung und anschließende Aufbewahrung von M-CSF die Bildung und Proliferation multimerer Molekülaggregate verursachen kann. Diese Aggregate können kovalent oder nichtkovalent aneinander gebunden sein. Es wurde gezeigt, daß die nichtkovalenten, durch Lyophilisierung bedingten Aggregate praktisch keine biologische Aktivität in dem bei Wong, Science, 235, a.a.O, beschriebenen Maus-Knochenmarkstest nach Wong (Wong Mouse Bone Marrow Assay) besitzen.Applicants have also found that lyophilization and subsequent storage of M-CSF can cause the formation and proliferation of multimeric molecular aggregates. These aggregates can be covalently or non-covalently bound to one another. The non-covalent aggregates resulting from lyophilization have been shown to have virtually no biological activity in the Wong Mouse Bone Marrow Assay described in Wong, Science, 235, supra.
Die Anmelder haben beobachtet, daß multimere Molekülaggregate von M- CSF durch ernsthaft gefährdete biologische Aktivität und folglich therapeutische Wirksamkeit und durch eine höhere Immunogenität und voraussichtlich Toxizität gekennzeichnet sind. Wenn Mäusen diese hochmolekularen Spezies Mäusen injiziert wurden, bildeten sie einen höheren Antikörpertiter gegen M-CSF als Mäuse, denen der erfindungsgemäße homogene dimere M-CSF injiziert wurde. Dies legt nahe, daß die hochmolekularen Spezies eine höhere Toxizität als der homogene dimere M-CSF besitzen. Außerdem zeigten hochmolekulare M-CSF-Spezies eine biologische Aktivität, gemessen im Maus-Knochenmarkstest nach Wong, die im Vergleich mit homogenem dimeren M-CSF bis um das Zehnfache niedriger lag.The applicants have observed that multimeric molecular aggregates of M-CSF are characterized by severely compromised biological activity and consequently therapeutic efficacy and are characterized by higher immunogenicity and, presumably, toxicity. When mice were injected with these high molecular weight species, they produced a higher antibody titer against M-CSF than mice injected with the homogeneous dimeric M-CSF of the invention. This suggests that the high molecular weight species have a higher toxicity than the homogeneous dimeric M-CSF. In addition, high molecular weight M-CSF species showed a biological activity, measured in the mouse bone marrow test according to Wong, which was up to ten times lower than that of homogeneous dimeric M-CSF.
Um Stabilität, Aktivität und therapeutische Wirksamkeit zu erhalten und, am wichtigsten, um das Risiko möglicher toxischer Nebenwirkungen zu vermindern, ist es wesentlich, daß pharmazeutische M-CSF-Formulierungen frei von derartigen hochmolekularen Spezies sind. Außerdem führt die Aggregation in Proteinlösungen häufig zur Präzipitation, was nachteilig ist, da dies zu anerkannten Gefahren wie Thrombosen, Unhomogenität der Dosis und zu verstopften Spritzen führen kann.To maintain stability, activity and therapeutic efficacy and, most importantly, to reduce the risk of possible toxic side effects, it is essential that pharmaceutical M-CSF formulations are free of such high molecular weight species. Furthermore, aggregation in protein solutions often leads to precipitation, which is disadvantageous as it can lead to recognized hazards such as thrombosis, dose inhomogeneity and blocked syringes.
Die vorliegende Erfindung löst auch diese Probleme, indem sie Formulierungen von homogenem dimeren M-CSF bereitstellt, die bei der Lyophilisierung und einer anschließenden längeren Aufbewahrung stabil sind. M-CSF besitzt eine größere therapeutische Wirksamkeit, wenn die hochmolekularen Spezies (die eine geringere biologische Aktivität besitzen) entfernt sind. Die Erzeugnisse der vorliegenden Erfindung stellen ein geringeres Risiko für eine Imunantwort dar.The present invention also solves these problems by providing formulations of homogeneous dimeric M-CSF that are stable upon lyophilization and subsequent prolonged storage. M-CSF has greater therapeutic efficacy when the high molecular weight species (which have less biological activity) are removed. The products of the present invention present a lower risk of immune response.
Der Begriff "homogener dimerer M-CSF", wie er in dieser Anmeldung verwendet wird, definiert ein Protein, das (a) durch eine DNA-Sequenz codiert wird, die unter stringenten Bedingungen mit der in Fig. 2 bei Wong et al. gezeigten DNA-Sequenz hybridisiert, (b) im bei Wong et al., Science, 235, a.a.O., beschriebenen Maus-Knochenmarkstest nach Wong eine Aktivität von wenigstens ungefähr 0,4 x 10&sup6; Verdünnungseinheiten (Dilution Units) pro Milligramm (DU/mg) zeigt, und (c) im wesentlichen frei von multimeren Molekülaggregaten mit drei oder mehr M-CSF-Untereinheiten ist. Umfaßt hiervon sind natürlich nicht nur die Sequenz, die dem natürlichen Protein entspricht und spezifisch in Fig. 2 bei Wong et al. gezeigt ist, sondern auch verwandte Sequenzen mit Punktmutationen, allelischen Variationen, Additionen und Deletionen, die ebenfalls die zuvor genannten Erfordernisse erfüllen.The term "homogeneous dimeric M-CSF" as used in this application defines a protein which (a) is encoded by a DNA sequence which hybridizes under stringent conditions with the DNA sequence shown in Figure 2 in Wong et al., (b) exhibits an activity of at least about 0.4 x 106 dilution units per milligram (DU/mg) in the Wong mouse bone marrow assay described in Wong et al., Science, 235, supra, and (c) is substantially free of multimeric molecular aggregates containing three or more M-CSF subunits. This includes, of course, not only the sequence which corresponds to the natural protein and is specifically encoded in Fig. 2 in Wong et al., but also related sequences with point mutations, allelic variations, additions and deletions that also fulfill the aforementioned requirements.
Der homogene dimere M-CSF kann aus teilweise gereinigten, rohen Präparationen mittels Gelfiltrationschromatographie erhalten werden. Selbstverständlich wird man weitere Schritte zur Aufreinigung der rohen Präparationen von dimerem M-CSF aus dem Überstand durchführen, ihre Natur und Reihenfolge sind jedoch nicht zwingend. Einem weiteren Aspekt unserer Erfindung zufolge wird der homogene dimere M-CSF präpariert, indem eine teilweise gereinigte M-CSF-Präparation über eine Gelfiltrationssäule gegeben wird.The homogeneous dimeric M-CSF can be obtained from partially purified crude preparations by gel filtration chromatography. Of course, further steps will be performed to purify the crude preparations of dimeric M-CSF from the supernatant, but their nature and order are not mandatory. According to another aspect of our invention, the homogeneous dimeric M-CSF is prepared by passing a partially purified M-CSF preparation over a gel filtration column.
Bei der Gelfiltrationschromatographie wird das Bett mit einem Gelmedium oder einer Matrix aus Harzkorn gepackt, die für Moleküle eines bestimmten Größenbereichs durchlässig sind. Dieser Bereich wird als Auftrennungsbereich bezeichnet. Es kann eine Gelfiltrationsmatrix mit einem Auftrennungsbereich (Molekulargewicht) von ungefähr 10 - 1500 kD verwendet werden. Eine derartige Matrix ist Sephacryl 5-300 (Pharmacia Biotechnology Products Catalog 86, 1986, Catalog Nr. 17-0438- 01) und diese Matrix wird als im Handel erhältliche Gelfiltrationsmatrix für die Zwecke dieser Erfindung augenblicklich bevorzugt. Andere funktionell ähnliche Gelmatrizes, beispielsweise Sephacryl S- 200 (Pharmacia Catalog-Nr. 17-0871-01), BioSil TSK-250 (Bio-Rad, Cat.-Nr 125-0066) und TSK G-3000 SW (LKB, Cat.-Nr. 2135-360) können ebenfalls verwendet werden.In gel filtration chromatography, the bed is packed with a gel medium or matrix of resin grains that are permeable to molecules of a certain size range. This region is called the separation region. A gel filtration matrix with a separation range (molecular weight) of approximately 10 - 1500 kD can be used. One such matrix is Sephacryl 5-300 (Pharmacia Biotechnology Products Catalog 86, 1986, Catalog No. 17-0438- 01) and this matrix is currently preferred as a commercially available gel filtration matrix for the purposes of this invention. Other functionally similar gel matrices, such as Sephacryl S- 200 (Pharmacia Catalog No. 17-0871-01), BioSil TSK-250 (Bio-Rad, Cat. No. 125-0066) and TSK G-3000 SW (LKB, Cat. No. 2135-360) can also be used.
Homogener dimerer M-CSF ist, wenn er mit Gelfiltrationschromatographie unter Verwendung einer Gelfiltrationsmatrix mit einem Auftrennungsbereich (Molekulargewicht) von ungefähr 10-1500 kD getestet wird, durch einen einzigen Peak gekennzeichnet. Diese erfinderische Substanz hat im Maus-Knochenmarkstest nach Wong eine spezifische Aktivität von wenigstens ungefähr 0,4 x 10&sup6; DU/mg. In einer bevorzugten besonderen Ausführungsform beträgt die spezifische Aktivität wenigstens ungefähr 0,7 x 106 DU/mg. Der in der als WO 87/06954 veröffentlichten PCT/US87/00835 beschriebene M-CSF zeigt beispielsweise bei der nichtreduzierenden Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid- Gelelektrophorese (SDS PAGE) aufgrund von Variationen in der Glycosylierung eine breite Bande, die einen apparenten Molekulargewichtsbereich von 70-90 kD anzeigt. Unter den beschriebenen Versionen von M-CSF kommt dieser M-CSF von 70-90 kD der Charakteristik von natürlichem humanen M-CSF am nächsten. Dieses dimere Protein besitzt, wenn es entsprechend der vorliegenden Erfindung zur Homogenität aufgereinigt wird, im Test nach Wong eine spezifische Aktivität von durchschnittlich 0,8 x 10&sup6; DU/mg.Homogeneous dimeric M-CSF is characterized by a single peak when assayed by gel filtration chromatography using a gel filtration matrix with a separation range (molecular weight) of about 10-1500 kD. This inventive substance has a specific activity of at least about 0.4 x 106 DU/mg in the mouse bone marrow assay according to Wong. In a preferred particular embodiment, the specific activity is at least about 0.7 x 106 DU/mg. For example, the M-CSF described in PCT/US87/00835 published as WO 87/06954 shows no significant activity in non-reducing sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS PAGE) due to variations in glycosylation. a broad band indicating an apparent molecular weight range of 70-90 kD. Among the versions of M-CSF described, this M-CSF of 70-90 kD comes closest to the characteristics of natural human M-CSF. This dimeric protein, when purified to homogeneity according to the present invention, has a specific activity of on average 0.8 x 10⁶ DU/mg in the Wong assay.
Die erfindungsgemäßen Erzeugnisse werden in lyophilisierten Zusammensetzungen formuliert, die ungefähr 0,1-10% M-CSF, ungefähr 0,5- 20% eines pharmazeutisch annehmbaren polyoxyethylenischen nichtionischen oberflächenaktiven Mittels, ungefähr 40-75% Glycin, ungefähr 15-40% Sucrose und bis zu ungefähr 25% eines pharmazeutisch annehmbaren Pufferungsmittels umfassen. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die erfindungsgemäßen Erzeugnisse in lyophilisierten Zusammensetzungen formuliert, die ungefähr 0,1-2% M-CSF, ungefähr 0,1-9% eines pharmazeutisch annehmbaren polyoxyethylenischen nichtionischen oberflächenaktiven Mittels, ungefähr 65-75% Glycin, ungefähr 17-21% Sucrose und ungefähr 4-7% eines pharmazeutisch annehmbaren Pufferungsmittels umfassen. Soweit nicht anders angegeben, beziehen sich die Prozentangaben auf das Gewicht. Nach ihrer Rekonstitution haben diese Formulierungen einen pH von ungefähr 6. Die Proteinanalyse der Formulierungen zeigt bei der Analyse durch Gelfiltration nur einen einzigen Peak und bei der nichtreduzierenden SDS PAGE eine einzige Molekulargewichtsbande.The articles of the invention are formulated in lyophilized compositions comprising about 0.1-10% M-CSF, about 0.5-20% of a pharmaceutically acceptable polyoxyethylenic nonionic surfactant, about 40-75% glycine, about 15-40% sucrose, and up to about 25% of a pharmaceutically acceptable buffering agent. In a preferred embodiment, the articles of the invention are formulated in lyophilized compositions comprising about 0.1-2% M-CSF, about 0.1-9% of a pharmaceutically acceptable polyoxyethylenic nonionic surfactant, about 65-75% glycine, about 17-21% sucrose, and about 4-7% of a pharmaceutically acceptable buffering agent. Unless otherwise stated, percentages are by weight. After reconstitution, these formulations have a pH of approximately 6. Protein analysis of the formulations shows only a single peak by gel filtration analysis and a single molecular weight band by non-reducing SDS PAGE.
Diese Formulierungen behalten M-CSF als lagerstabiles homogenes Dimer frei von M-CSF-Aggregaten bei. Der Begriff "stabil" betrifft den wesentlichen Erhalt des Grades an biologischer Aktivität, wie er durch die Produktion überwiegend Makrophagen enthaltender Kolonien im bei Wong et al., Science, 235, a.a.O., beschriebenen Mause-Knochenmarkstest nach Wong bestimmt wurde.These formulations maintain M-CSF as a storage-stable homogeneous dimer free of M-CSF aggregates. The term "stable" refers to substantial maintenance of the level of biological activity as determined by the production of colonies containing predominantly macrophages in the Wong mouse bone marrow assay described in Wong et al., Science, 235, supra.
Die Anwesenheit nichtkovalent gebundener M-CSF-Aggregate wird durch einen Gelfiltrationspeak angezeigt, der nicht zu dem Peak für den dimeren M-CSF in dem hier beschriebenen Gelfiltrationsverfahren gehört. Die kovalent gebundenen Aggregate zeigen sich bei der nichtreduzierenden SDS PAGE durch eine Bande hohen Molekulargewichts.The presence of non-covalently bound M-CSF aggregates is indicated by a gel filtration peak that is not associated with the peak for dimeric M-CSF in the gel filtration procedure described here. The covalently bound aggregates are evident in the non-reducing SDS PAGE through a high molecular weight band.
Die bevorzugte Klasse polyoxyethylenischer nichtionischer oberflächenaktiver Mittel zur Verwendung in den vorangehenden Zusammensetzungen sind die Polysorbate (Polyoxyethylensorbitanester). Bevorzugtes Polysorbat ist Polysorbat 80. Die bevorzugte Zusammensetzung enthält vor der Lyophilisierung 0,005% Polysorbat 80. Poloxamere sind eine weitere Gruppe im Handel erhältlicher polyoxyethylenischer nichtionischer oberflächenaktiver Mittel, die für diese Erfindung brauchbar sind, insbesondere Poloxamer 338. Eine bevorzugte Poloxamer-Formulierung enthält vor der Lyophilisierung 0,05% Poloxamer 338.The preferred class of polyoxyethylenic nonionic surfactants for use in the foregoing compositions are the polysorbates (polyoxyethylene sorbitan esters). The preferred polysorbate is polysorbate 80. The preferred composition contains 0.005% polysorbate 80 prior to lyophilization. Poloxamers are another group of commercially available polyoxyethylenic nonionic surfactants useful in this invention, particularly Poloxamer 338. A preferred poloxamer formulation contains 0.05% Poloxamer 338 prior to lyophilization.
Die erfindungsgemäßen Formulierungen umfassen außerdem Glycin und Sucrose und können mit einem pharmazeutisch annehmbaren Pufferungsmittel wie Natriumcitrat auf einen pH von ungefähr 6 gepuffert sein. Beispielhaft für die Formulierungen vor der Lyophilisierung sind Bereiche von 0,25-0,75 M Glycin, 0,5-3% Sucrose und 0-50 mM Natriumcitrat. Eine beispielhafte bevorzugte Formulierung enthält vor der Lyophilisierung 0,5 M Glycin, 1% Sucrose und 10 mM Natriumcitrat.The formulations of the invention also comprise glycine and sucrose and may be buffered to a pH of about 6 with a pharmaceutically acceptable buffering agent such as sodium citrate. Illustrative formulations prior to lyophilization include ranges of 0.25-0.75 M glycine, 0.5-3% sucrose and 0-50 mM sodium citrate. An exemplary preferred formulation prior to lyophilization contains 0.5 M glycine, 1% sucrose and 10 mM sodium citrate.
Das Verfahren zur Lyophilisierung ist in der Technik gut bekannt (s. Remington's Pharmaceutical Sciences, S. 1538; 17. Aufl., 1985).The process for lyophilization is well known in the art (see Remington's Pharmaceutical Sciences, p. 1538; 17th ed., 1985).
Homogener dimerer M-CSF und seine lagerstabilen, lyophilisierten bevorzugten Formulierungen sind besonders für eine Verwendung in pharmazeutischen Formulierungen zur parenteralen Verabreichung geeignet. Solche pharmazeutischen Formulierungen können-eine therapeutisch wirksame Menge homogenen dimeren M-CSF in einem parenteral annehmbaren Träger umfassen. Bei parenteraler Verabreichung liegt die therapeutische Zusammensetzung zur Verwendung in dieser Erfindung in Form einer pyrogenfreien, vorzugsweise wäßrigen isotonischen Lösung vor. Bezüglich lyophilisierter Formulierungen kann die parenterale Verabreichung nach Rekonstitution, bevorzugt mit Wasser für die Injektion (Water For Injection, WFI), erfolgen.Homogeneous dimeric M-CSF and its storage-stable, lyophilized preferred formulations are particularly suitable for use in pharmaceutical formulations for parenteral administration. Such pharmaceutical formulations may comprise a therapeutically effective amount of homogeneous dimeric M-CSF in a parenterally acceptable carrier. When administered parenterally, the therapeutic composition for use in this invention is in the form of a pyrogen-free, preferably aqueous, isotonic solution. With respect to lyophilized formulations, parenteral administration may be after reconstitution, preferably with Water For Injection (WFI).
Die therapeutisch wirksame Menge an M-CSF sollte nicht genügen, um eine systemische toxische Reaktion zu verursachen, sie sollte aber ausreichen, um die gewünschte therapeutische Reaktion auszulösen. Das tatsächliche Dosierschema für solche Formulierungen wird vom behandelnden Arzt unter Berücksichtigung verschiedener Faktoren bestimmt, die die Wirkung von Medikamenten beeinflussen, beispielsweise körperliche Verfassung, Körpergewicht, Geschlecht und Ernährung des Patienten, Verabreichungszeit und Grad des Ausbruchs der Krankheit.The therapeutically effective amount of M-CSF should not be sufficient to cause a systemic toxic reaction, but it should sufficient to induce the desired therapeutic response. The actual dosing regimen for such formulations is determined by the attending physician, taking into account various factors affecting the action of drugs, such as physical condition, body weight, gender and diet of the patient, time of administration and degree of onset of the disease.
Es folgt ein Beispiel, das eines der Verfahren erläutert, nach dem homogener dimerer M-CSF erhalten werden kann.The following is an example illustrating one of the methods by which homogeneous dimeric M-CSF can be obtained.
M-CSF voller Länge wurde in CHO-Zellen nach dem Verfahren von Clark et al., Internationale Veröffentlichungs-Nr. WO 87/06954, erzeugt. Rohes Protein wurde aus konditioniertem Medium geerntet und auf eine Anionenaustauschsäule vom Membrantypus (QAE Zeta Prep Anionen Exchange Disk [LKB Produkter AB]) aufgebracht. Der M-CSF band an diese Disk ebenso wie eine Menge anderer negativ geladener Proteine. Die Säule wurde gewaschen und der M-CSF mit einem Puffer, der 0,5 M NaCl enthielt, eluiert.Full-length M-CSF was produced in CHO cells according to the method of Clark et al., International Publication No. WO 87/06954. Crude protein was harvested from conditioned medium and applied to a membrane-type anion exchange column (QAE Zeta Prep Anion Exchange Disk [LKB Produkter AB]). The M-CSF bound to this disk as did a number of other negatively charged proteins. The column was washed and the M-CSF eluted with a buffer containing 0.5 M NaCl.
Das Eluat der QAE Zeta Prep-Disk wurde zur Chromatograpie an immobilisiertem Lektin von Linsen (Linsenlektin Sepharose [Pharmacia]) durch Zugabe von Polysorbat 20 auf eine Konzentration von 0,05% (V/V) vorbereitet. Das Produkt eluierte aus der Säule mit einem Puffer, der Methyl-α, D-mannopyranosid enthielt.The eluate from the QAE Zeta Prep disk was prepared for chromatography on immobilized lens lectin (Lentil Lectin Sepharose [Pharmacia]) by adding polysorbate 20 to a concentration of 0.05% (v/v). The product eluted from the column with a buffer containing methyl-α, D-mannopyranoside.
Das Eluat der Säule mit immobilisiertem Linsenlektin wurde dann zum Auftragen auf eine hochauflösende Anionenaustauschsäule vorbereitet (Mono Q-Harz [Pharmacia]). Die Produktfraktion aus der Linsenlectin- Schritt wurde mit 200 mM MES-Puffer auf einen pH von 5,8 angesäuert und auf die Mono Q-Säule geladen. Der M-CSF eluierte aus der Säule mit einem linearen Gradienten von 0,05 M NaCI bis 0,3 M NaCl. In den späteren Elutionsfraktionen traten gewisse hochmolekulare M-CSF- Spezies auf, die vom M-CSF-Pool ausgeschlossen wurden.The eluate from the immobilized lentil lectin column was then prepared for application to a high-resolution anion exchange column (Mono Q resin [Pharmacia]). The product fraction from the lentil lectin step was acidified to pH 5.8 with 200 mM MES buffer and loaded onto the Mono Q column. The M-CSF eluted from the column with a linear gradient from 0.05 M NaCl to 0.3 M NaCl. Certain high molecular weight M-CSF species appeared in the later elution fractions and were excluded from the M-CSF pool.
Die gesammelten Produktfraktionen aus der Stufe der Mono Q-Chromatographie wurden vor dem Auftragen auf eine C&sub4; (Vydac)-Umkehrphasen-HPLC-Säule angesäuert. Die C&sub4;-Säule wurde mit einem Puffer aus 27%igem wäßrigen Acetonitril und 0,1% TFA äquilibriert. Dann wurde die Säule gewaschen und der M-CSF mit einem linearen Gradienten aus 40,5%igem bis 58,5%igem wäßrigen Acetonitril/0,1% TFA eluiert. Die Fraktionen, die M-CSF enthielten, wurden gesammelt.The pooled product fractions from the Mono Q chromatography step were acidified prior to application to a C4 (Vydac) reverse phase HPLC column. The C4 column was equilibrated with a buffer of 27% aqueous acetonitrile and 0.1% TFA. The column was then washed and the M-CSF was eluted with a linear gradient of 40.5% to 58.5% aqueous acetonitrile/0.1% TFA. Fractions containing M-CSF were pooled.
Nach dem Schritt der C&sub4;-Umkehrphasen-HPLC wurden die M-CSF enthaltenden Fraktionen auf einer DEAE-Sepharose-Anionenaustauschsäule aufkonzentriert. Der M-CSF-Pool wurde fünf fach mit DEAE-Äquilibrierpuffer verdünnt und auf die DEAE-Säule geladen. M-CSF eluierte mit einem Puffer mit 0,5 M NaCl.After the C4 reversed-phase HPLC step, the M-CSF-containing fractions were concentrated on a DEAE-Sepharose anion exchange column. The M-CSF pool was diluted five-fold with DEAE equilibration buffer and loaded onto the DEAE column. M-CSF eluted with a buffer containing 0.5 M NaCl.
Das DEAE-Sepharose-Eluat wurde direkt auf eine Sephacryl S-300 [Pharmacia] Gelfiltrationssäule mit einer Säulengröße von 90 cm x 9 cm geladen und eluierte mit 20 mM Natriumcitrat, 50 mM Nacl, pH 6,0 bei einer Durchflußmenge von 2 ml/Minute. M-CSF wurde in isokratischem Betriebsmodus mit dem Äquilibrierpuffer eluiert. Das resultierende Chromatogramm zeigte zwei gut aufgelöste Peaks. Der dem homogenen dimeren M-CSF (70-90 kD) entsprechende Peak trat hinter dem Peak für die schneller wandernden hochmolekularen Spezies auf. Die dem homogenen dimeren M-CSF entsprechenden Fraktionen wurden gesammelt und zu Analysezwecken über eine Bio-Rad BioSil 250-Säule von 600 mm x 7,5 mm chromatographiert, wobei mit einem Puffer aus 50 mM Na&sub2;SO&sub4;, 20 mM Na&sub2;HPO&sub4;, pH 6,8, und 0,02% Natriumazid bei einer Durchflußmenge von 1 ml/min eluiert wurde, was zu einem Chromatogramm mit einem einzigen Peak führte. Der gesammelte homogene dimere M-CSF wurde eingefroren und bei -80ºC aufbewahrt.The DEAE-Sepharose eluate was loaded directly onto a Sephacryl S-300 [Pharmacia] gel filtration column with a column size of 90 cm x 9 cm and eluted with 20 mM sodium citrate, 50 mM NaCl, pH 6.0 at a flow rate of 2 ml/minute. M-CSF was eluted in isocratic mode with the equilibration buffer. The resulting chromatogram showed two well-resolved peaks. The peak corresponding to the homogeneous dimeric M-CSF (70-90 kD) occurred behind the peak for the faster migrating high molecular weight species. Fractions corresponding to homogeneous dimeric M-CSF were collected and chromatographed for analysis on a 600 mm x 7.5 mm Bio-Rad BioSil 250 column eluting with a buffer containing 50 mM Na₂SO₄, 20 mM Na₂HPO₄, pH 6.8, and 0.02% sodium azide at a flow rate of 1 ml/min, resulting in a chromatogram with a single peak. The collected homogeneous dimeric M-CSF was frozen and stored at -80ºC.
Obwohl die Bestimmung der effektiven Säulenbedingungen und Elutionspuffer für die Gelfiltration im allgemeinen Fachwissen darstellt, werden die oben beschriebenen Bedingungen von den Anmeldern zur Zeit für die Zwecke dieser Erfindung bevorzugt.Although the determination of effective column conditions and elution buffers for gel filtration is within the general skill in the art, the conditions described above are presently preferred by applicants for the purposes of this invention.
Ein Beispiel für eine lagerstabile, lyophilisierte M-CSF-Formulierung wird nachstehend gegeben:An example of a storage-stable, lyophilized M-CSF formulation is given below:
M-CSF voller Länge wurde in CHO-Zellen nach dem Verfahren von Clark et al., Internationale Veröffentlichungs-Nr. WO 87/06954, hergestellt. Homogener dimerer M-CSF wurde nach dem Verfahren von Beispiel 1 erhalten.Full-length M-CSF was produced in CHO cells according to the method of Clark et al., International Publication No. WO 87/06954. Homogeneous dimeric M-CSF was obtained according to the method of Example 1.
200 ml einer Lösung von 0,125 mg M-CSF/ml, 10 mM Natriumcitrat, 0,5 M Glycin, 1% Sucrose und 0,005% Polysorbat 80 mit pH 6 wurde durch ein 0,2 um-Filter (Durapore) filtriert. Die filtrierte Lösung wurde in 2ml-Aliquoten auf 100 zur Lyophilisierung geeignete 10 ml-Ampullen verteilt. Die Ampullen wurden in den Gefriertrockner eingefüllt und bei -40ºC eine Stunde gefroren. Der Kühler wurde auf -70ºC gekühlt, die Produkttemperatur 1/2 Stunde auf -37ºC erhöht und der Kammerdruck auf 50 mTorr reduziert. Der Druck wurde unter einem trockenen Stickstoffstrom beibehalten. Die Ablagetemperatur wurde so erhöht, daß die Produkttemperatur zum Beginn der Primärtrocknung auf -35ºC erhöht wurde. Die Primärtrocknung wurde als abgeschlossen betrachtet, sobald die Produkttemperatur und die Ablagetemperatur Gleichgewicht erreichten. Die Oberflächentemperatur der Ablage wurde dann mit einer solchen Geschwindigkeit auf +20ºC erhöht, daß sich die Oberflächentemperatur der Ablage und die Produkttemperatur um nicht mehr als 10ºC unterschieden. Sobald der Partialdruck des Wasserdampfs weniger als 5 mTorr betrug wurde das System wieder mit trockenem Stickstoff gefüllt und die Ampullen mit dem Produkt wurden verschlossen.200 ml of a solution of 0.125 mg M-CSF/ml, 10 mM sodium citrate, 0.5 M glycine, 1% sucrose and 0.005% polysorbate 80 at pH 6 was filtered through a 0.2 µm filter (Durapore). The filtered solution was aliquoted into 100 10 ml vials suitable for lyophilization. The vials were placed in the freeze dryer and frozen at -40ºC for 1 hour. The condenser was cooled to -70ºC, the product temperature was raised to -37ºC for 1/2 hour and the chamber pressure was reduced to 50 mTorr. The pressure was maintained under a dry nitrogen stream. The storage temperature was increased so that the product temperature was raised to -35ºC at the start of primary drying. Primary drying was considered complete when the product temperature and the tray temperature reached equilibrium. The tray surface temperature was then increased to +20ºC at a rate such that the tray surface temperature and the product temperature did not differ by more than 10ºC. When the partial pressure of water vapor was less than 5 mTorr, the system was refilled with dry nitrogen and the vials containing the product were sealed.
Eine repräsentative lyophilisierte Probe, die 0,2% M-CSF, 0,1% Polysorbat 80, 74,1% Glycin, 19,7% Sucrose und 5,8% Natriumcitrat enthielt, wurde dann mit WFI auf 2ml rekonstituiert und durch Gelfiltration und nichtreduzierende SDS PAGE analysiert. Das Chromatogramm der Gelfiltration zeigte einen einzigen Peak und die SDS PAGE-Analyse zeigte eine einzige Molekulargewichtsbande bei ungefähr 80 kD.A representative lyophilized sample containing 0.2% M-CSF, 0.1% polysorbate 80, 74.1% glycine, 19.7% sucrose, and 5.8% sodium citrate was then reconstituted to 2 ml with WFI and analyzed by gel filtration and non-reducing SDS PAGE. The gel filtration chromatogram showed a single peak and SDS PAGE analysis showed a single molecular weight band at approximately 80 kD.
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