DE60317687T2 - Verfahren und zusammensetzungen zur implantation von funktionalen schleifen in ein protein - Google Patents

Verfahren und zusammensetzungen zur implantation von funktionalen schleifen in ein protein Download PDF

Info

Publication number
DE60317687T2
DE60317687T2 DE60317687T DE60317687T DE60317687T2 DE 60317687 T2 DE60317687 T2 DE 60317687T2 DE 60317687 T DE60317687 T DE 60317687T DE 60317687 T DE60317687 T DE 60317687T DE 60317687 T2 DE60317687 T2 DE 60317687T2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
enzyme
targeted
peptide
protein
target
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
DE60317687T
Other languages
English (en)
Other versions
DE60317687D1 (de
Inventor
Christopher J. Soquel MURRAY
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Danisco US Inc
Original Assignee
Genencor International Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Genencor International Inc filed Critical Genencor International Inc
Application granted granted Critical
Publication of DE60317687D1 publication Critical patent/DE60317687D1/de
Publication of DE60317687T2 publication Critical patent/DE60317687T2/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1044—Preparation or screening of libraries displayed on scaffold proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/6415—Toxins or lectins, e.g. clostridial toxins or Pseudomonas exotoxins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/66—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid the modifying agent being a pre-targeting system involving a peptide or protein for targeting specific cells
    • A61K47/67—Enzyme prodrug therapy, e.g. gene directed enzyme drug therapy [GDEPT] or VDEPT
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6891—Pre-targeting systems involving an antibody for targeting specific cells
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C12N9/86—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in cyclic amides, e.g. penicillinase (3.5.2)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2318/00—Antibody mimetics or scaffolds
    • C07K2318/10—Immunoglobulin or domain(s) thereof as scaffolds for inserted non-Ig peptide sequences, e.g. for vaccination purposes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/55—Fusion polypeptide containing a fusion with a toxin, e.g. diphteria toxin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung sieht zielgerichtete Enzyme, welche besser an Ziele binden, als die entsprechenden nicht-zielgerichteten Enzyme unter ähnlichen Bedingungen an das Ziel binden, Verfahren zur Herstellung von zielgerichteten Enzymen und pharmazeutische Zusammensetzungen, welche zielgerichtete Enzyme umfassen, vor.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Enzyme, welche an eine Targeting-Struktureinheit konjugiert oder fusioniert sind, besitzen viele diagnostische und therapeutische Anwendungen. Zum Beispiel verwenden die meisten homogenen Arzneistoffnachweis-Immunoassays ein Enzym, das an einen Arzneistoff-Metabolit konjugiert ist; siehe z. B. Rubinstein et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 47: 846 (1972). Vor noch kürzerer Zeit beschrieben Legendre et al., eine aktualisierte Version des homogenen Immunoassays; Legendre et al., 1999, Nat. Biotechnol. 17: 67–72; Yamada et al., 1995, J. Biol. Chem. 270: 5687.
  • Ross-MacDonald beschreiben die Verwendung eines Transposon-Systems zum Epitop-Tagging von Proteinen in Hefe. Ross-MacDonald et al., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 190–195.
  • Auf dem therapeutischen Gebiet sind Antikörper-Enzym-Konjugate untersucht und beschrieben worden. Allerdings sind aus diesen Untersuchungen mehrere Mängel offensichtlich geworden. Einige dieser Mängel beinhalten: langsame Diffusion in Tumore, langsame Entfernung bzw. Clearance aus dem Kreislauf; nicht-spezifische Bindung an andere Gewebe; Hervorrufung einer Immunantwort; Schwierigkeiten bei der Herstellung, Konjugation oder Expression; und die erforderliche Kopplung zwischen zielrichtender und katalytischer Funktion.
  • Ein Typ von Vorgehensweise, welcher angewandt worden ist, ist die Antikörper-gerichtete Enzym-Proarzneistoff-Therapie (ADEPT, antibody-directed enzyme prodrug therapy). ADEPT und ähnliche Vorgehensweisen sind Mehrstufen-Verfahren, welche ausgelegt sind, um die Selektivität von Antitumormitteln zu erhöhen. Siehe z. B., Philpott et al., J. Immunol. 111: 921 (1973), Bagshawe et al., Curr. Opin. Immunol. 11: 579 (1999), Niculescu-Duvaz et al., Anticancer Drug Des. 14: 517 (1999), Chari, Adv. Drug Deliv. Rev. 31: 89 (1998), Syrigos & Epenetos Anticancer Res. 19: 605 (1999), Sherwood, Advanced Drug Del. Rev. 22: 269 (1996), und Niculescu-Duvaz & Springer, Advanced Drug Del. Rev. 26: 151 (1997). Die Immunogenizität des Antikörper-Enzym-Konjugats ist jedoch eine Schlüssel-Beschränkung von existierenden ADEPT-Vorgehensweisen.
  • Eine andere Beschränkung von existierenden ADEPT-Verfahren ist die lange Halbwertszeit des Antikörper-Enzym-Konjugats im Kreislauf. Im allgemeinen besitzen Antikörper lange Halbwertszeiten im Kreislauf, und diese Eigenschaft wird den Antikörper-Enzym-Konjugaten vermittelt. Das Antikörper-Enzym-Konjugat muss von Nicht-Tumor-Stellen des Körpers entfernt werden, bevor der Proarzneistoff verabreicht werden kann, um eine Arzneistoff-Aktivierung in anderen Geweben zu verhindern. Ein Verfahren zur Entfernung von überschüssigem Antikörper-Enzym-Konjugat erfordert die Verabreichung eines zweiten Antikörpers, welcher typischerweise gegen den Enzym-Anteil des Antikörper-Enzym-Konjugats gerichtet ist; siehe Kerr et al., Bioconjug. Chem. 4: 353 (1993). Ein anderes Verfahren zum Beschleunigen der Clearance von überschüssigem Enzym besteht darin, ein Fusionsprotein zwischen einem Einzelketten-Antikörperfragment (scFV) und einem Enzym zu konstruieren, welches aufgrund seines relativ geringen Molekulargewichtes, und weil ihm der Fc-Bindungsbereich des entsprechenden Antikörpers fehlt, rasch über die Niere geklärt bzw. entfernt werden kann; siehe Siemers et al., 1997, Bioconjug. Chem. 8: 510–9.
  • In Antwort auf die Mängel von ADEPT sind andere Strategien zum spezifischen Aktivieren eines Proarzneistoffs an einem Zielort in einem Subjekt entwickelt worden. In der Gen-gerichteten Enzym-Proarzneistoff-Therapie (GDEPT) wird das Gen, welches das Proarzneistoff-aktivierende Enzym codiert, an den Tumor zugeführt. Für einen jüngeren Übersichtsartikel, siehe Niculescu-Duvaz et al., Anticancer Drug Des. 14: 517 (1999). Allerdings ist die Anwendbarkeit von GDEPT durch das Erfordernis strikt eingeschränkt, dass ein sicheres und effektives Verfahren zur Einbringung des erforderten Gens in den zu behandelnden Tumor entwickelt werden muss. In einer anderen Vorgehensweise werden Antitumormittel terminal an ein Targeting- bzw. Zielrichtungs-Mittel gekoppelt. Für Übersichtsartikel dieser Technologie siehe Torchilin, Eur. J. Pharm. Sci. 11 Suppl. 2: S81 (2000), und Frankel et al., Clin. Cancer Res. 6: 326 (2000). Diese Vorgehensweisen leiden unter einigen der gleichen Mängel wie ADEPT. Insbesondere können diese Therapeutika immunogen sein, und die kombinierte Größe der Targeting-Einheit, des Enzyms und des Linkers (falls einer verwendet wird) können verursachen, dass diese eine ungünstig lange Halbwertszeit im Kreislauf des Subjekts aufweisen.
  • Somit bleibt im Fachgebiet ein Bedarf nach zielgerichteten Enzymen bestehten, welche relativ leicht zu erzeugen sind, mit hoher Affinität an ein Ziel binden, katalytische Aktivität aufzeigen, wenn sie an das Ziel gebunden sind, und, wenn sie in einem Subjekt verwendet werden, die phy sikochemischen Eigenschaften einer raschen Diffusion, geringen Immunogenizität und einer raschen Clearance aufweisen. Die Erfindung erfüllt diese und andere Anforderungen.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung beschreibt die überraschende Erzeugung eines zielgerichteten Enzyms, welches katalytische Aktivität aufweist, während es an ein Ziel gebunden ist, an welches das nicht-zielgerichtete Enzym mit einer niedrigeren Affinität bindet, sowie Verfahren zur Herstellung derartiger zielgerichteter Enzyme. Es ist unerwartet festgestellt worden, dass ein oder mehrere Peptide in ein Protein eingefügt werden können, ohne das Protein zu inaktivieren. Zum Beispiel können ein oder mehrere Peptide in eine oder mehrere Stellen eines Enzyms so eingefügt werden, dass das modifizierte Enzym besser an ein Ziel bindet, als das nicht modifizierte Enzym an das Ziel bindet, und eine signifikante enzymatische Aktivität beibehält. Die Enzyme der vorliegenden Erfindung können in Therapie oder Diagnose verwendet werden.
  • In einem Aspekt sieht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Vermittlung einer Funktion an ein Protein vor, umfassend
    • a) Einfügen eines Peptids in ein Protein mit einer messbaren Eigenschaft,
    • b) Selektieren des Proteins mit dem eingefügten bzw. inserierten Peptid, wenn es die messbare Eigenschaft aufweist,
    • c) Ersetzen des eingefügten Peptids in dem selektierten Protein mit einem funktionellen Peptid, welches die Funktion aufweist, wobei das Protein mit dem funktionellen Peptid die messbare Eigenschaft und die detektierbare Funktion aufweist.
  • In einem anderen Aspekt sieht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Vermittlung einer Funktion an ein Protein vor, umfassend
    • a) Einführen eines Peptids in das Protein an einer statistischen Position, wobei das Protein eine messbare Eigenschaft besitzt,
    • b) Selektieren des Proteins mit dem eingefügten Peptid, wenn es die messbare Eigenschaft besitzt,
    • c) Ersetzen des inserierten Peptids in dem Protein mit einem funktionellen Peptid, welches die Funktion aufweist, wobei das Protein mit dem funktionellen Peptid die messbare Eigenschaft und die Funktion aufweist.
  • In einem anderen Aspekt sieht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Vermittlung einer Funktion an ein Protein vor, umfassend
    • a) Selektieren eines Proteins, aufweisend ein inseriertes Peptid und eine messbare Eigenschaft, aus einer Bibliothek von Proteinen, wobei die Bibliothek Proteine umfasst, welche ein inseriertes Peptid aufweisen, das ein entsprechendes unmodifiziertes Protein nicht aufweist, und wobei das unmodifizierte Protein die messbare Eigenschaft aufweist, und
    • b) Ersetzen des inserierten Peptids in dem selektierten Protein mit einem Peptid, welches eine Funktion aufweist, wobei das Protein mit dem funktionellen Peptid die messbare Eigenschaft und die Funktion aufweist.
  • In einem anderen Aspekt sieht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Vermittlung einer neuen Funktion an ein Protein vor, umfassend
    • a) Selektieren eines Proteins, aufweisend ein inseriertes Peptid und eine messbare Eigenschaft, aus einer Bibliothek von Proteinen, wobei die Bibliothek Proteine umfasst, welche ein inseriertes Peptid aufweisen, das ein entsprechendes unmodifiziertes Protein nicht aufweist, und das unmodifizierte Protein die messbare Eigenschaft aufweist,
    • b) Identifizieren des Punktes der Insertion des Peptids in dem selektierten Protein, und
    • c) Inserieren eines Peptids, welches eine Funktion aufweist, in das unmodifizierte Protein an dem Punkt der Insertion, der in (b) identifiziert wurde, wobei das Protein mit dem funktionellen Peptid die messbare Eigenschaft und die Funktion aufweist.
  • In einem anderen Aspekt sieht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Proteins mit einer Funktion vor, umfassend
    • a) Inserieren eines Peptids in ein Protein mit einer messbaren Eigenschaft,
    • b) Selektieren des Proteins mit dem inserierten Peptid, wenn es die messbare Eigenschaft aufweist,
    • c) Identifizieren des Punktes der Insertion des Peptids in dem Protein von Schritt (b), und
    • d) Inserieren eines funktionellen Peptids in das Protein am Punkt der Insertion, welcher in Schritt
    • (c) identifiziert wurde, wobei das Protein mit dem funktionellen Peptid die messbare Eigenschaft und die Funktion aufweist
  • In einem anderen Aspekt sieht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Proteins mit einer Funktion vor, umfassend
    • a) Inserieren eines Fremdpeptids in ein Protein mit einer messbaren Eigenschaft,
    • b) Selektieren des Proteins mit dem inserierten Fremdpeptid, wenn es die messbare Eigenschaft aufweist,
    • c) Identifizieren des Punktes der Insertion des Fremdpeptids in dem Protein von Schritt (b),
    • d) Wiederholen der Schritte (a)–(c), wie notwendig, um eine Vielzahl von Insertionspunkten zu identifizieren, und
    • e) Inserieren mindestens eines funktionellen Peptids in das Protein an mindestens einem der in den Schritten (a)–(d) identifizierten Insertionspunkte, wobei das Protein mit dem einen oder mehreren inserierten funktionellen Peptid(en) die messbare Eigenschaft und die Funktion aufweist.
  • In einem anderen Aspekt sieht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines zielgerichteten Enzyms vor, umfassend
    • a) Herstellen eines modifizierten Enzyms durch Inserieren eines Peptids in ein nicht modifiziertes Enzym, wobei das nicht modifizierte Enzym eine messbare enzymatische Aktivität aufweist,
    • b) Selektieren des modifizierten Enzyms, wenn es die messbare enzymatische Aktivität aufweist, und
    • c) Ersetzen des inserierten Peptids in dem modifizierten Enzym mit einem Targetingpeptid, welches ein Ziel bindet, wobei das Enzym mit dem Targeting-Peptid die messbare enzymatische Aktivität aufweist und das Ziel bindet.
  • In einem anderen Aspekt sieht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines zielgerichteten Enzyms vor, umfassend
    • a) Herstellen eines modifizierten Enzyms durch Inserieren eines Peptids in ein nicht modifiziertes Enzym, an einer statistisch bestimmten Position, wobei das nicht modifizierte Enzym eine messbare enzymatische Aktivität aufweist,
    • b) Selektieren des modifizierten Enzyms, wenn es die messbare enzymatische Aktivität aufweist, und
    • c) Ersetzen des inserierten Peptids in dem modifizierten Enzym mit einem Targetingpeptid, welches ein Ziel bindet, wobei das Enzym mit dem Targeting-Peptid die messbare enzymatische Aktivität aufweist und das Ziel bindet.
  • In einem anderen Aspekt sieht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines zielgerichteten Enzyms vor, umfassend
    • a) Selektieren eines Enzyms, aufweisend ein inseriertes Peptid und eine messbare enzymatische Aktivität, aus einer Bibliothek von Enzymen, wobei die Bibliothek Enzyme umfasst, welche ein inseriertes Peptid aufweisen, das ein entsprechendes nicht modifiziertes Enzym nicht aufweist, und wobei das nicht modifizierte Enzym die messbare enzymatische Aktivität aufweist, und
    • b) Ersetzen des inserierten Peptids in dem selektierten modifizierten Enzym mit einem Bindungspeptid, welches ein Ziel bindet, wobei das Enzym mit dem Bindungspeptid die messbare enzymatische Aktivität aufweist und das Ziel bindet.
  • In einem anderen Aspekt sieht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines zielgerichteten Enzyms vor, umfassend
    • a) Selektieren eines Enzyms, aufweisend ein inseriertes Peptid und eine messbare enzymatische Aktivität, aus einer Bibliothek von Enzymen, wobei die Bibliothek Enzyme umfasst, welche ein inseriertes Peptid aufweisen, das ein entsprechendes nicht modifiziertes Enzym nicht aufweist, und wobei das nicht modifizierte Enzym die messbare enzymatische Aktivität aufweist,
    • b) Identifizieren des Punktes der Insertion des Peptids in dem selektierten modifizierten Enzym, und
    • c) Inserieren eines Bindungspeptids, welches ein Ziel bindet, in das nicht modifizierte Enzym am in (b) identifizierten Insertionspunkt, wobei das Enzym mit dem Bindungspeptid die messbare enzymatische Aktivität und die Funktion aufweist.
  • In einem anderen Aspekt sieht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines zielgerichteten Enzyms vor, umfassend
    • a) Inserieren eines Fremdpeptids in ein nicht modifiziertes Enzym, das eine messbare enzymatische Aktivität aufweist,
    • b) Selektieren des Enzyms mit dem inserierten Fremdpeptid, wenn es die messbare enzymatische Aktivität aufweist,
    • c) Identifizieren des Punktes der Insertion des Fremdpeptids im Enzym von Schritt (b), und
    • d) Inserieren eines Bindungspeptids in das nicht modifizierte Enzym am in Schritt (c) identifizierten Insertionspunkt, wobei das Bindungspeptid ein Ziel bindet, und das Enzym mit dem funktionellen Peptid die messbare enzymatische Aktivität aufweist und das Ziel bindet.
  • In einem anderen Aspekt sieht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines zielgerichteten Enzyms vor, umfassend
    • a) Inserieren eines Fremdpeptids in ein Enzym, das eine messbare enzymatische Aktivität aufweist,
    • b) Selektieren des Enzyms mit dem inserierten Fremdpeptid, wenn es die messbare enzymatische Aktivität aufweist,
    • c) Identifizieren des Insertionspunktes des Fremdpeptids im Enzym von Schritt (b),
    • d) Wiederholen der Schritte (a)–(c), falls notwendig, um eine Vielzahl von Insertionspunkten zu identifizieren, und
    • e) Inserieren mindestens eines Bindungspeptids in das Enzym an mindestens einem der in den Schritten (a)–(d) identifizierten Insertionspunkte, wobei das Enzym mit den/dem einen oder mehreren inserierten Bindungspeptid(en) die messbare Eigenschaft aufweist und das Ziel bindet.
  • In einem anderen Aspekt sieht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines zielgerichteten Enzyms vor, umfassend
    • a) Erzeugen einer Bibliothek von modifizierten Enzymen durch Inserieren einer Bibliothek von Peptiden in ein Enzyme, wobei das Enzym eine enzymatische Aktivität aufweist, und
    • b) Selektieren eines modifizierten Enzyms aus der Bibliothek von modifizierten Enzymen, welches die enzymatische Aktivität aufweist und besser an ein Ziel bindet, als das nicht modifizierte Enzym an das Ziel bindet,
    wobei das in (b) selektierte, modifizierte Enzym das zielgerichtete Enzym ist.
  • In einer Ausführungsform wird das Peptid, Fremdpeptid oder die Bibliothek von Peptiden in eine vor-selektierte Stelle im Protein oder Enzym inseriert. In einer anderen Ausführungsform wird das Peptid, Fremdpeptid oder die Bibliothek von Peptiden an einer zufälligen Stelle im Enzym inseriert.
  • In einer anderen Ausführungsform ist das modifizierte Enzym ein zielgerichtetes Enzym. In einer genauer definierten Ausführungsform ist das zielgerichtete Enzym nützlich in einer Therapie mit zielgerichtetem Enzym und Proarzneistoff.
  • Die Zusammensetzungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung bieten mehrere Vorteile gegenüber früher verfügbaren Zusammensetzungen und Verfahren. Die zielgerichteten Enzyme der Erfindung können kleiner als ähnliche Enzyme sein, welche an einen Antikörper oder ein Antikörperfragment konjugiert oder funsioniert sind, wodurch, bei Verabreichung an ein Subjekt, zielgerichtete Enzyme, welche nicht an ihre Ziele gebunden sind, rascher aus dem System des Subjekts eliminiert werden. Ihre verminderte Größe macht sie des Weiteren weniger immunogen und erlaubt ihnen einen besseren Zugang zu ihren Zielorten. Die Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Herstellung von zielgerichteten Enzymen sind früher bekannten Verfahren überlegen, weil sie, in einem Aspekt, die Selektion eines modifizierten Enzyms gestatten, welches etwa die gleiche Größe aufweist wie, aber an ein Ziel besser bindet als, das nicht modifizierte Enzym, ohne dass man die dreidimensionale Struktur des Enzyms kennt.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
  • 1 präsentiert die Sequenz der p99-β-Lactamase von E-cloacae.
  • 2 präsentiert ein Schema für die Erzeugung einer zielgerichteten Schleifen-Bibliothek.
  • 3 präsentiert ein Schema zur Erzeugung von zielgerichteten Enzymen unter Anwendung von Phoenix-Mutagenese.
  • 4 präsentiert ein Schema zum Erzeugen eines zielgerichteten Enzyms unter Verwendung eines iterativen Zusammenbaus.
  • 5 präsentiert ein Diagramm des Plasmids pTDS004.
  • 6 veranschaulicht ein Schema zum Modifizieren einer variationstoleranten Sequenz eines nicht-zielgerichteten Enzyms.
  • 7 veranschaulicht ein Schema für die statistische Rekombination von im Voraus selektierten Repertoirs.
  • 8 präsentiert ein Diagramm des Plasmides pCBO4WT.
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Es sei denn es ist anderweitig definiert, besitzen alle technischen und wissenschaftlichen Ausdrücke, die hierin verwendet werden, die gleiche Bedeutung, wie sie üblicherweise vom Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet, welchem diese Erfindung angehört, verstanden wird. Auf alle Literaturbezugsstellen wird hierin für alle Zwecke ausdrücklich Bezug genommen. Obwohl beliebige Verfahren und Materialien, die ähnlich oder gleichwertig zu denjenigen, welche hierin beschrieben sind, in der Ausführung oder Erprobung der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, werden die bevorzugten Verfahren und Materialien beschrieben. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung werden die nachfolgenden Begriffe untenstehend definiert.
  • Alle einzelsträngigen Nukleinsäuresequenzen sind von 5' nach 3' geschrieben, es sei denn es ist anderweitig angegeben. Der obere Strang von jeder doppelsträngigen Nukleinsäuresequenz wird von 5' nach 3' geschrieben, und der untere Strang von 3' nach 5', es sei denn es ist anderweitig angegeben. Alle Peptidsequenzen werden vom N-Terminus zum C-Terminus geschrieben, es sei denn es ist anderweitig angegeben. Standardmäßige Ein-Buchstaben-Aminosäure- und -Nukleinsäure-Abkürzungen werden überall verwendet, es sei denn es ist anderweitig angegeben. In einer Aminosäuresequenz gibt "X" eine Position an, welche von jedwedem Aminosäurerest eingenommen werden kann, vorzugsweise einem natürlich vorkommenden Aminosäurerest.
  • Der Ausdruck "zielgerichtetes Enzym" bezieht sich auf ein Enzym, welches katalytische Aktivität aufzeigt, das eine Substraterkennungsstelle umfasst und von einem nicht-zielgerichteten Enzym modifiziert worden ist, um eine oder mehrere Targeting-Stellen zu umfassen, wobei jede Targeting-Stelle eine oder mehrere variante Sequenzen umfasst, und um an ein Ziel mit höherer Affinität zu binden, als das entsprechende nicht-zielgerichtete Enzym das Ziel unter ähnlichen Bedingungen bindet. Zielgerichtete Enzyme der Erfindung schließen modifizierte Enzyme ein, welche an ein Ziel binden, welches das entsprechende nicht-zielgerichtete Enzym unter gleichen Bedingungen nicht bindet. Zielgerichtete Enzyme der Erfindung schließen auch modifizierte Enzyme ein, welche mit etwa der 10-fachen, 102-fachen, 103-fachen, 104-fachen, 105-fachen oder höherer Affinität als das entsprechende nicht-zielgerichtete Enzym unter ähnlichen Bedingungen an ein Ziel binden. Zielgerichtete Enzyme der Erfindung schließen nicht Enzyme mit einer Targeting-Stelle, welche vollständig aus einem Polypeptid oder einem anderen Ziel-Bindungs-Molekül besteht, welches an den N- oder C-Terminus des nicht-zielgerichteten Enzyms (z. B. wie in einem Histidin-getaggten Protein oder einem Funsionsprotein) angeheftet ist, ein zielgerichtetes Enzym, dessen einziges Ziel ein monoklonaler Antikörper ist, oder ein zielgerichtetes Enzym, welches hergestellt wurde durch Erhöhen oder Optimieren der Bindung eines nicht-zielgerichteten Enzyms an ein Substrat einer Reaktion, welche von dem nicht-zielgerichteten Enzym katalysiert wird, ein. Allerdings kann ein zielgerichtetes Enzym der Erfindung weiter modifiziert sein, um ein Polypeptid oder ein anderes Targeting-Molekül einzuschließen, welches an dem N- oder C-Terminus angeheftet ist. Ein zielgerichtetes Enzym kann des Weiteren modifiziert sein, um die Bindung an ein Substrat einer Reaktion zu ändern oder zu optimieren, welche von dem zielgerichteten Enzym katalysiert wird.
  • Der Begriff "nicht-zielgerichtetes Enzym" bezieht sich auf ein Protein, welches eine katalytische Aktivität aufweist und eine Substraterkennungsstelle und eine variationstolerante Sequenz umfasst. Das Protein kann z. B. ein natürlich vorkommendes, modifiziertes, künstliches, chimäres oder Fusions-Protein sein.
  • Der Begriff "Ziel" bezieht sich auf jedwede Struktureinheit, an welche man ein Protein binden lassen kann.
  • Der Ausdruck "Targeting-Stelle" bezieht sich auf einen Bereich eines zielgerichteten Enzyms, welcher ein Ziel bindet. Eine Targeting-Stelle umfasst eine oder mehrere variante bzw. variable Sequenzen. Sie besteht nicht lediglich aus einer Proteinbindungsdomäne, welche aus einem anderen Protein kopiert und in das zielgerichtete Enzym eingebracht worden ist, besteht nicht vollständig aus einer varianten Sequenz in einer Proteinbindungsdomäne des nicht-zielgerichteten Enzyms und besteht nicht vollständig aus einer Substraterkennungsstelle.
  • Der Begriff "variante Sequenz" bezieht sich auf einen oder mehrere fortlaufende Aminosäurereste, abgeleitet von, aber nicht identisch zu, einer variationstoleranten Sequenz eines nicht-zielgerichteten Enzyms. Eine variante Sequenz ist aus einer variationstoleranten Sequenz dahingehend abgeleitet, dass die variante Sequenz sich von ihrer entsprechenden variationstoleranten Sequenz durch die Insertion, Deletion, Substitution oder Ersetzung von einem oder mehreren Aminosäureresten der variationstoleranten Sequenz unterscheidet. Somit besitzt eine variante Sequenz 0% oder mehr, aber weniger als 100%, Sequenzidentität zu der entsprechenden variationstoleranten Sequenz, und kann eine kürzere, die gleiche oder größere Länge als die variationstolerante Sequenz aufweisen.
  • Der Begriff "variationstolerante Sequenz" bezieht sich auf einen oder mehrere fortlaufende Aminosäurereste in einem Enzym, welche zu einer unterschiedlichen Sequenz modifiziert werden können, ohne die katalytische Aktivität des Enzyms zu inaktivieren. Eine variationstolerante Sequenz kann zum Beispiel ein oder mehrere Aminosäurereste sein, welche durch einen oder mehrere unterschiedliche Aminosäurereste ersetzt werden können, oder zwei Aminosäurereste, welche durch die Insertion von einem oder mehreren Aminosäureresten getrennt werden können.
  • Der Begriff "Substraterkennungsstelle" bezieht sich auf die Aminosäurereste eines Enzyms, welche ein Substrat einer Reaktion kontaktieren, die von dem Enzym katalysiert wird.
  • Der Begriff "Proteinbindungsdomäne" bezieht sich auf die Aminosäurereste eines Proteins, welche einen oder mehrere Aminosäurereste eines zweiten Proteins kontaktieren, wobei die Proteinbindungsdomäne nicht eine Substraterkennungsstelle ist.
  • Ein "Repertoire an varianten Sequenzen" ist eine Vielzahl von varianten Sequenzen, von denen jede verwendet werden kann, um die gleiche variante Sequenz eines nicht-zielgerichteten Enzyms zu modifizieren.
  • Eine "rekombinante Bibliothek" ist eine Vielzahl von Proteinen, welche aus demselben nicht-zielgerichteten Enzym abgeleitet sind. Die Mitglieder einer rekombinanten Bibliothek haben die gleichen konstanten Segmente gemeinsam, aber sie enthalten unterschiedliche Kombinationen von varianten Sequenzen.
  • Eine "messbare enzymatische Aktivität" ist eine enzymatische Aktivität, welche unter Anwendung jedwedes im Fachgebiet bekannten Verfahrens detektiert werden kann. Ein Protein mit einer messbaren enzymatischen Aktivität ist ein solches, welches die enzymatische Aktivität bei einem Spiegel aufweist, welcher unter Anwendung von im Fachgebiet bekannten Verfahren nachgewiesen werden kann.
  • Es sei denn, es ist anderslautend angegeben, wird der Ausdruck "Protein" hier auswechselbar mit den Begriffen "Peptid" und "Polypeptid" verwendet und bezieht sich auf ein Molekül, welches zwei oder mehr Aminosäurereste, die durch eine Peptidbindung verknüpft sind, umfasst.
  • Die Begriffe "Zelle", "Zelllinie" und "Zellkultur" können austauschbar verwendet werden, und alle solche Bezeichnungen schließen die Nachkommenschaft ein. Somit schließen die Worte "Transformanten" oder "transformierte Zellen" die primäre transformierte Zelle und aus dieser Zelle abgeleitete Kulturen ein, ungeachtet der Anzahl von Transfers bzw. Passagierungen. Sämtliche Nachkommenschaft muss hinsichtlich des DNA-Gehalts, aufgrund beabsichtigter oder unbeabsichtigter Mutationen, nicht exakt identisch sein. Mutanten-Nachkommen, welche die gleiche Funktionalität aufweisen, hinsichtlich der in der ursprünglich transformierten Zelle gescreent wurde, sind in der Definition von Transformanten eingeschlossen. Die Zellen können prokaryotisch oder eukaryotisch sein.
  • Der Begriff "Steuerungssequenzen" bezieht sich auf DNA-Sequenzen, welche für die Expression einer funktionsfähig verknüpften codierenden Sequenz in einem jeweiligen Wirtsorganismus notwendig sind. Die Steuerungssequenzen, welche für Prokaryoten geeignet sind, schließen zum Beispiel einen Promotor, gegebenenfalls eine Operatorsequenz, eine Ribosomenbindungsstelle, positive retroregulatorische Elemente (sehe z. B. U.S.-Patent Nr. 4 666 848 , auf welches hierin ausdrücklich Bezug genommen wird) und möglicherweise andere Sequenzen ein. Von eukaryotischen Zellen weiß man, dass sie Promotoren, Polyadenylierungssignale und Enhancer verwenden.
  • Der Begriff "Expressionsklon" bezieht sich auf DNA-Sequenzen, welche eine gewünschte codierende Sequenz und Steuerungssequenzen in funktionsfähiger Verknüpfung enthalten, so dass mit diesen Sequenzen transformierte Wirte in der Lage sind, die codierten Proteine zu produzieren. Der Begriff "Expressionssystem" bezieht sich auf einen mit einem Expressionsklon transformierten Wirt. Um die Transformation zu bewirken, kann der Expressionsklon auf einem Vektor beinhaltet sein; allerdings kann die relevante DNA auch in das Wirtschromosom integriert werden.
  • Der Begriff "Gen" bezieht sich auf eine DNA-Sequenz, welche Steuerungs- und Codierungs-Sequenzen umfasst, die für die Herstellung eines Proteins oder Polypeptids notwendig sind.
  • Der Begriff "funktionsfähig verknüpft" bezieht sich auf die Positionierung der codierenden Sequenz, so dass Steuerungssequenzen fungieren bzw. wirken werden, um die Expression des von der codierenden Sequenz codierten Proteins anzutreiben. Somit bezieht sich eine an Steuerungssequenzen "funktionsfähig verknüpfte" codierende Sequenz auf eine Konfiguration, worin die codierenden Sequenzen unter der Steuerung einer Steuerungssequenz exprimiert werden können.
  • Der Begriff "Oligonukleotid", wie hierin verwendet, ist als ein Molekül definiert, aufgebaut aus zwei oder mehreren Desoxyribonukleotiden oder Ribonukleotiden. Die genaue Größe wird von vielen Faktoren abhängen, welche ihrerseits von der letztendlichen Funktion oder Verwendung des Oligonukleotids abhängen. Oligonukleotide können durch jedwedes geeignete Verfahren hergestellt werden, einschließlich beispielsweise Klonierung und Restriktion von geeigneten Sequenzen und direkter chemischer Synthese durch ein Verfahren, wie das Phosphotriesterverfahren von Narang et al., 1979, Meth. Enzymol. 68: 90–99; dem Phosphodiester-Verfahren von Brown et al., 1979, Meth. Enzymol. 68: 109–151; dem Diethylphosphoramidit-Verfahren von Beaucage et al., 1981, Tetrahedron Lett. 22: 1859–1862; und dem Fest-Träger-Verfahren von U.S.-Patent Nr. 4 458 066 , auf welche hierin jeweils ausdrücklich Bezug genommen wird. Ein Übersichtsartikel über Syntheseverfahren ist bereitgestellt in Goodchild, 1990, Bioconjugate Chemistry 1(3): 165–187, worauf hierin Bezug genommen wird.
  • Der Begriff "Primer", wie hierin verwendet, bezieht sich auf ein Oligonukleotid, welches fähig zum Wirken als ein Initiationspunkt der Synthese ist, wenn er unter Bedingungen gebracht wird, unter denen eine Primerverlängerung initiiert wird. Die Synthese eines Primerverlängerungsproduktes, welches komplementär zu einem Nukleinsäurestrang ist, wird in Gegenwart der erforderlichen vier verschiedenen Nukleosidtriphosphate und einer DNA-Polymerase in einem passenden Puffer bei einer geeigneten Temperatur initiiert. Ein "Puffer" schließt Cofaktoren (wie zweiwertige Metallionen) und Salz (zur Bereitstellung der geeigneten Ionenstärke) ein, eingestellt auf den gewünschten pH-Wert.
  • Ein Primer, der an den nicht-codierenden Strang einer Gensequenz hybridisiert (in äquivalenter Weise, eine Teilsequenz des codierenden Strangs ist) wird hierin als ein "Stromaufwärts"- oder "Vorwärts"-Primer bezeichnet. Ein Primer, welcher an den codierenden Strang einer Gensequenz hybridisiert, wird hierin als ein "Stromabwärts"- oder "Rückwärts"-Primer bezeichnet.
  • Die Begriffe "Restriktionsendonukleasen" und "Restriktionsenzyme" beziehen sich auf Enzyme, typischerweise von bakteriellem Ursprung, welche doppelsträngige DNA an oder nahe einer spezifischen Nukleotidsequenz schneiden.
  • Familien von Aminosäureresten, welche ähnliche Seitenketten aufweisen, sind im Fachgebiet identifiziert worden. Diese Familien schließen Aminosäuren mit basischen Seitenketten (z. B. Lysin, Arginin, Histidin), sauren Seitenketten (z. B. Asparaginsäure, Glutaminsäure), ungeladenen polaren Seitenketten (z. B. Asparagin, Glutamin, Serin, Threonin, Tyrosin), nicht-polaren Seitenketten (z. B. Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Phenylalanin, Methionin, Tryptophan, Cystein, Glycin), beta-verzweigten Seitenketten (z. B. Threonin, Valin, Isoleucin) und aromatischen Seitenketten (z. B. Thyrosin, Phenylalanin, Tryptophan, Histidin) ein. Standardmäßige Drei-Buchstaben- oder Ein-Buchstaben-Aminosäure-Abkürzungen werden hierin verwendet.
  • Die Peptide, Polypeptide und Proteine der Erfindung schließen diejenigen ein, welche ein oder mehrere nicht-klassische Aminosäuren umfassen. Nicht-klassische Aminosäuren schließen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, die D-Isomere der üblichen Aminosäuren, α-Aminoisobutyrsäure, 4-Aminobutyrsäure (4-Abu), 2-Aminobutyrsäure (2-Abu), 6-Aminohexansäure (Ahx), 2-Aminoisobutyrsäure (2-Aib), 3-Aminopropionsäure, Ornithin, Norleucin, Norvalin, Hydroxyprolin, Sarcosin, Citrullin, Cysteinsäure, t-Butylglycin, t-Butylalanin, Phenylglycin, Cyclohexylalanin, β-Alanin, Fluor-Aminosäuren, Designer-Aminosäuren, wie β-Methylaminosäuren, Cα-Methylaminosäuren, Nα-Mehylaminosäuren und Aminosäureanaloga im allgemeinen ein.
  • Wie hierin verwendet bezieht sich eine "Punktmutation" in einer Aminosäuresequenz entweder auf eine Einzelaminosäure-Substitution, eine einzelne Aminosäure-Insertion oder eine einzelne Aminosäure-Deletion. Eine Punktmutation wird vorzugsweise in eine Aminosäuresequenz durch eine geeignete Codon-Veränderung in der codierenden DNA eingeführt. Einzelne Aminosäuren in einer Sequenz werden hierin als AN repräsentiert, wobei A das standardmäßige Ein-Buchstaben-Symbol für die Aminosäure in der Sequenz ist, und N die Position in der Sequenz ist. Mutationen innerhalb einer Aminosäuresequenz werden hierin als A1NA2 repräsentiert, wobei A1 das standardmäßige Ein-Buchstaben-Symbol für die Aminosäure in der unmutierten Pro teinsequenz ist, A2 das standardmäßige Ein-Buchstaben-Symbol für die Aminosäure in der mutierten Proteinsequenz ist, und N die Position in der Aminosäuresequenz ist. Zum Beispiel repräsentiert eine G46D-Mutation eine Änderung von Glycin zu Asparaginsäure an der Aminosäure-Position 46. Die Aminosäurepositionen sind basierend auf der Volllängensequenz des Proteins nummeriert, aus welchem die Region, welche die Mutation beinhaltet, abgeleitet ist. Repräsentationen von Nukleotiden und Punktmutationen in DNA-Sequenzen sind analog.
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich ein "chimäres" Protein auf ein Protein, dessen Aminosäuresequenz ein Fusionsprodukt von Teilsequenzen der Aminosäuresequenzen aus mindestens zwei verschiedenen Proteinen repräsentiert. Ein chimäres Protein wird vorzugsweise nicht durch direkte Manipulierung von Aminosäuresequenzen produziert, sondern wird eher von einem "chimären" Gen exprimiert, welches die chimäre Aminosäuresequenz codiert.
  • Der Begriff "Wirtsimmunantwort" bezieht sich auf eine Antwort des Immunsystems eines Wirtsorganismus auf den Kontakt mit einer immunogenen Substanz. Spezifische Aspekte einer Wirtsimmunantwort können z. B. Antikörperherstellung oder -bildung, T-Zell-Aktivierung, Monozyten-Aktivierung oder Granulozyten-Aktivierung einschließen. Jeder dieser Aspekte kann unter Anwendung von standardmäßigen in vivo- oder in vitro-Verfahren nachgewiesen und/oder gemessen werden.
  • Der Begriff "Ab" oder "Antikörper" bezieht sich auf polyklonale und monoklonale Antikörper, ein vollständiges Immunglobulin oder Antikörper oder jedwedes funktionstüchtige Fragment eines Immunglobulinmoleküls, welches an das Zielantigen bindet. Beispiele derartiger funktioneller Einheiten schließen vollständige Antikörpermoleküle, Antikörperfragmente, wie Fv, Einzelketten-Fv, Komplementaritäts-bestimmende Regionen (CDRs), VL (variable Leichtketten-Region), VH (variable Schwerketten-Region) und jedwede Kombination von diesen oder jedwedem anderen funktionellen Bereich eines Immunglobulin-Peptids, der fähig zur Bindung an Zielantigen ist, ein.
  • Die Begriffe "Dox" und "Doxorubicin" beziehen sich auf den Arzneistoff, welcher üblicherweise mit diesem Namen bekannt ist, und jedwedes Derivat davon. Derivate können für eine Vielzahl von Zwecken hergestellt sein, einschließlich, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, Konjugieren an einen Linker oder Pro-Anteil eines Proarzneistoffs, erhöhte Effektivität, erhöhte Bindung, verringerte Toxizität etc. Die CAS-Registrierungsnummer für Doxorubicin lautet 25316409. Die Molekülformel ist C27H29NO11AHCl, und sein Molekulargewicht beträgt 580 Dalton.
  • Der Begriff "PEG" und "Polyethylenglycol" beziehen sich auf die Verbindungen, welche üblicherweise mit diesem Namen bekannt sind und die allgemeine chemische Formel (C2H4O)nAH2O umfassen. Die CAS-Nummer für PEG lautet 25322-68-3. Wie es im Fachgebiet bekannt ist, wird PEG typischerweise in Mischungen von unterschiedlichen Molekulargewichten bereitgestellt. Zum Beispiel ist PEG-8000 eine Mischung von Polyethylenglycolen, welche ein durchschnittliches Molekulargewicht von 8000 Dalton aufweisen.
  • Der Begriff "Proarzneistoff bezieht sich auf eine Verbindung, welche durch einen oder mehrere enzymatisch katalysierte Schritte zu einer aktiven Verbindung umgewandelt wird, welche eine erhöhte pharmakologische Aktivität relativ zu dem Proarzneistoff aufweist. Ein Proarzneistoff kann einen Pro-Anteil oder inaktiven Strukturteil und einen Arzneistoff oder aktiven Arzneistoff umfassen. Gegebenenfalls enthält der Proarzneistoff ebenfalls einen Linker. Zum Beispiel kann der Proarzneistoff von einem Enzym gespalten werden, um einen aktiven Arzneistoff freizusetzen. In einem spezifischeren Beispiel setzt die Proarzneistoff-Spaltung durch das zielgerichtete Enzym den aktiven Arzneistoff in die Nachbarschaft des Ziels frei, welches an das zielgerichtete Enzym gebunden ist. "Pro-Anteil" und "inaktiver Strukturteil" beziehen sich auf den inaktiven Bereich des Proarzneistoffs, nachdem er umgewandelt worden ist. Wenn zum Beispiel ein Proarzneistoff ein über ein Peptid an einen aktiven Arzneistoff verknüpftes PEG-Molekül umfasst, ist der Pro-Anteil die PEG-Struktureinheit mit oder ohne einem Bereich des Peptid-Linkers. "Linker" bezieht sich auf das Mittel, welches den Pro-Anteil eines Proarzneistoffs an den aktiven Arzneistoff eines Proarzneistoffs verknüpft. Typischerweise, aber nicht wesentlich, ist der Linker ein Peptid, welches durch das zielgerichtete Enzym spaltbar ist, wobei es jedoch jedwede Struktureinheit sein kann, welche den Arzneistoff an den Pro-Anteil verknüpft. Der Begriff "Arzneistoff' und "aktiver Arzneistoff' bezieht sich auf die aktiven Struktureinheiten eines Proarzneistoffs. Nach der Spaltung durch ein zielgerichtetes Enzym wirkt der aktive Arzneistoff in therapeutischer Weise auf den/die Tumor, Zelle, das infektiöse Agens oder ein anderes Krankheits-Agens, auf welche abgezielt wird, ein. In einem anderen Beispiel wird der Proarzneistoff von dem aktivierenden Enzym chemisch modifiziert, zum Beispiel durch Oxidation, Reduktion, Phosphorylierung, Dephosphorylierung, Addition einer Struktureinheit oder dergleichen. In einem anderen Beispiel wird der Proarzneistoff durch das Enzym zu einer Zwischenverbindung umgewandelt. Die Zwischenverbindung wird entweder spontan, durch Kontakt mit anderen Proteinen oder Molekülen im Subjekt, durch Kontakt mit einem oder mehreren Enzymen, welche(s) im Subjekt natürlich vorkommen, oder durch Kontakt mit einem oder mehreren zusätzlichen aktivierenden Enzymen, welche(s) dem Subjekt verabreicht werden, zu der aktiven Verbindung umgewandelt.
  • Der Begriff" Serumalbumin" bezieht sich auf das üblicherweise bekannte Blutprotein desselben Namens. "BSA" bezieht sich auf Rinderserumalbumin und "HSA" bezieht sich auf humanes Serumalbumin.
  • Der Begriff "konstantes Segment" bezieht auf einen Teil der Sequenz des nicht-zielgerichteten Enzyms, welcher eine hohe Homologie (> 80% Homologie) unter allen Vertretern der rekombinanten Bibliothek gemeinsam hat.
  • Der Begriff "% Sequenzhomologie" wird hierin austauschbar mit den Begriffen "% Homologie", "% Sequenzidentität" und "% Identität" verwendet und bezieht sich auf den Grad an Aminosäure-Sequenzidentität zwischen zwei oder mehreren Peptidsequenzen, bei Alignierung unter Verwendung eines Sequenz-Alignment-Programms. Wie hierin verwendet, bedeutet zum Beispiel 80 % Homologie das gleiche wie 80% Sequenzidentität, was bestimmt wird durch einen definierten Algorithmus, und folglich besitzt ein Homolog einer gegebenen Sequenz mehr als 80% Sequenzidentität über eine Länge der gegebenen Sequenz. Beispielhafte Spiegel an Sequenzidentität schließen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 98% oder mehr Sequenzidentität zu einer gegebenen Sequenz ein.
  • Beispielhafte Computerprogramme, welche verwendet werden können, um Identität zwischen zwei Sequenzen zu bestimmen, schließen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, die Reihe der BLAST-Programme, z. B. BLASTN, BLASTX und TBLASTX, BLASTP und TBLASTN, öffentlich erhältlich im Internet unter http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/" ein; siehe ebenfalls Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215: 403–10 (unter spezieller Bezugnahme auf die veröffentlichte Standard-Einstellung, d. h. Parameter w = 4, t = 17) und Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res., 25: 3389–3402. Sequenzsuchen werden typischerweise unter Verwendung des BLASTP-Programms ausgeführt, wenn eine gegebene Aminosäuresequenz relativ zu Aminosäuresequenzen in den GenBank-Proteinsequenzen und anderen öffentlichen Datenbanken ausgewertet wird. Das BLASTX-Programm wird bevorzugt für die Durchsuchung von Nukleinsäuresequenzen, welche in allen Leserastern translatiert worden sind, gegenüber Aminosäuresequenzen in den "GenBank Protein Sequences" und anderen öffentlichen Datenbanken. Sowohl BLASTP als auch BLASTX werden unter Standardparametern eines offenen Lücken-Strafwerts (open gap penalty) von 11,0, und eines Strafwerts für erweiterte Lücken von 1,0 laufen gelassen und verwenden die Matrix BLOSUM-62; siehe Altschul et al., 1997.
  • Ein bevorzugtes Alignment von ausgewählten Sequenzen, um die "% Identität" zwischen zwei oder mehreren Sequenzen zu bestimmen, wird zum Beispiel durchgeführt unter Verwendung des Programms CLUSTAL-W in der MacVector-Version 6.5, betrieben mit Standardparametern, einschließlich eines offenen Lücken-Strafwertes von 10,0, eines Strafwertes für erweiterte Lücken von 0,1, und einer BLOSUM 30-Ähnlichkeitsmatrix.
  • "Trefferdichte" ist die Fraktion von nützlichen Klonen in der Bibliothek.
  • "Hapaxomer" ist eine Restriktionsendonuklease, welche einzigartige Enden erzeugt; siehe Berger, S. L. Anal. Biochem. 222: 1 (1994).
  • ZIELGERICHTETE ENZYME
  • In einem Aspekt sieht die vorliegende Erfindung zielgerichtete Enzyme vor, welche eine katalytische Aktivität aufzeigen, eine Substraterkennungsstelle umfassen und aus einem nicht-zielgerichteten Enzym modifiziert worden sind, um eine oder mehrere Targeting-Stellen zu umfassen, wobei jede Targeting-Stelle eine oder mehrere variante Sequenzen umfasst, und um an ein Ziel mit höherer Affinität zu binden, als das entsprechende nicht-zielgerichtete Enzym das Ziel unter gleichen Bedingungen bindet. In einer Ausführungsform unterscheidet sich das zielgerichtete Enzym der Erfindung von dem entsprechenden nicht-zielgerichteten Enzym nur an der Stelle der variationstoleranten Sequenz oder Sequenzen des nicht-zielgerichteten Enzyms.
  • Zielgerichtete Enzyme der Erfindung schließen modifizierte Enzyme ein, welche an ein Ziel binden, an das das entsprechende nicht-zielgerichtete Enzym unter gleichen Bedingungen nicht bindet. Zum Beispiel sieht die vorliegende Erfindung ein zielgerichtetes β-Lactamase-Enzym vor, welches unter Bedingungen an Streptavidin bindet, bei welchen die entsprechende nicht-zielgerichtete β-Lactamase nicht an Streptavidin bindet. Zielgerichtete Enzyme der Erfindung schließen ebenfalls modifizierte Enzyme ein, welche mit etwa 2-facher, 3-facher, 5-facher, 10-facher, 102-facher, 103-facher, 104-facher, 105-facher, 106-facher oder höherer Affinität an ein Ziel binden, als das entsprechende nicht-zielgerichtete Enzym unter gleichen Bedingungen. Zielgerichtete Enzyme der Erfindung schließen Enzyme mit nur einer Targeting-Stelle, welche lediglich aus einem Polypeptid oder einem anderen Ziel-Bindungs-Molekül besteht, welches an den N- oder C-Terminus des nicht-zielgerichteten Enzyms angeheftet ist (z. B. wie in einem mit Histidin-Tag versehenen Protein oder einem Fusionsprotein), ein zielgerichtetes Enzym, dessen einziges Ziel ein monoklonaler Antikörper ist, oder ein zielgerichtetes Enzym, welches hergestellt wurde durch Erhöhung oder Optimierung der Bindung eines nicht-zielgerichteten Enzyms an ein Substrat einer Reaktion, welche von dem nicht-zielgerichteten Enzym katalysiert wird, nicht ein. Allerdings kann ein zielgerichtetes Enzym der Erfindung weiter modifiziert werden, um ein Polypeptid oder ein anderes Targeting-Molekül einzuschließen, welches an den N- oder C-Terminus angeheftet ist. Ein zielgerichtetes Enzym kann des Weiteren ferner modifiziert sein, um die Bindung an ein Substrat einer Reaktion, welche von dem zielgerichteten Enzym katalysiert wird, zu ändern oder optimieren.
  • In einem Aspekt umfassen die zielgerichteten Enzyme der Erfindung eine oder mehrere Targeting-Stellen, z. B. eine, zwei, drei, vier, fünf, sechs, sieben, acht, neun, zehn oder mehr Targeting-Stellen, von denen jede eine oder mehrere variante Sequenzen, z. B. eine, zwei, drei, vier, fünf, sechs, sieben, acht, neun, zehn oder mehr variante Sequenzen umfasst. Das Vorhandensein der Targeting-Stelle oder -Stellen im zielgerichteten Enzym gestattet dem zielgerichteten Enzym an ein Ziel mit höherer Affinität zu binden, als das entsprechende nicht-zielgerichtete Enzym unter gleichen Bedingungen das Ziel bindet.
  • Das zielgerichtete Enzym kann zum Beispiel an Ziel mit einer Kd von etwa 100 μM oder weniger, 10 μM oder weniger, 1 μM oder weniger, 100 nM oder weniger, etwa 90 nM oder weniger, etwa 80 nM oder weniger, etwa 70 nM oder weniger, etwa 60 nM oder weniger, etwa 50 nM oder weniger, etwa 40 nM oder weniger, etwa 30 nM oder weniger, etwa 20 nM oder weniger, etwa 10 nM oder weniger, etwa 5 nM oder weniger, etwa 1 nM oder weniger oder etwa 0,1 nM oder weniger binden.
  • In einer Ausführungsform ist jede der varianten Sequenzen von ihren benachbarten varianten Sequenzen durch ein oder mehrere konstante Segmente in der Primärsequenz des Enzyms getrennt, aber ist, im gefalteten Protein, nahe zu jeder der anderen varianten Sequenzen. Diese Anordnung vereinfacht die Rekombination, da man Rekombinationsstellen in die konstanten Segmente einführen kann. Darüber hinanus verringert eine derartige Anordnung die Möglichkeit einer direkten Wechselwirkung zwischen den unterschiedlichen variablen Segmenten.
  • Variationstolerante Sequenzen können zum Beispiel einzelne Aminosäuren sein, oder können Sequenzen sein, welche eine geringere Länge als etwa 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10 oder 5 Aminosäurereste aufweisen. Eine variationstolerante Sequenz kann eine Schleife bzw. Loop des gefalteten Proteins, z. B. eine Lösungsmittel-zugängliche Schleife sein.
  • Variante Sequenzen können zum Beispiel zwischen Null und etwa 50 Aminosäureresten lang sein. In einer Ausführungsform liegt eine variante Sequenz im Bereich von etwa null bis etwa 20, null bis etwa 14, null bis zehn, oder drei bis 20 Aminosäureresten Länge. "Null" Aminosäurereste bezieht sich auf eine Situation, in welcher eine variationstolerante Sequenz deletiert worden ist.
  • Die Targeting-Stelle des zielgerichteten Enzyms besteht nicht lediglich aus der Substraterkennungsstelle des nicht-zielgerichteten Enzyms. Vorzugsweise überlappt die Targeting-Stelle nicht mit einer katalytischen Stelle in der Tertiärstruktur des nicht-zielgerichteten Enzyms. Als solches ist die Targeting-Stelle, in einer Ausführungsform, mindestens etwa 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 oder 9 Angström von der katalytischen Stelle des nicht-zielgerichteten Enzyms entfernt.
  • Wie oben erörtert, zeigen die zielgerichteten Enzyme der Erfindung katalytische Aktivität auf. Im Allgemeinen entspricht die katalytische Aktivität des zielgerichteten Enzyms der katalytischen Aktivität des entsprechenden nicht-zielgerichteten Enzyms. Daher ist die katalytische Aktivität des zielgerichteten Enzyms qualitativ diejenige des entsprechenden nicht-zielgerichteten Enzyms. Sobald jedoch ein zielgerichtetes Enzym erzeugt wird, kann seine katalytische Aktivität weiter modifiziert (z. B. optimiert oder verändert) werden.
  • Jedwedes Enzym kann als das nicht-zielgerichtete Enzym für die Zwecke der vorliegenden Erfindung dienen. In einer Ausführungsform wird ein entsprechendes nicht-zielgerichtetes Enzym ausgewählt, das eine katalytische Aktivität besitzt, von welcher man wünscht, dass sie in einem zielgerichteten Enzym vorhanden ist. In einer anderen Ausführungsform wird ein nicht-zielgerichtetes Enzym gewählt, welches ein Substrat zu einem gewünschten Produkt umwandelt. In einer anderen Ausführungsform fehlt dem Substrat eine Eigenschaft, welche das Produkt besitzt. In einer anderen Ausführungsform ist die Eigenschaft eine chemische oder physikalische Eigenschaft. In einer anderen Ausführungsform verursacht das Substrat keinen Effekt in einem Subjekt, welchen das Produkt verursacht. In einer anderen Ausführungsform ist das Substrat ein Nährstoff für ein(e) erkrankte(s) Zelle, Gewebe oder Organ. In einer anderen Ausführungsform ist der Effekt ein physiologischer Effekt. In einer weiteren Ausführungsform ist der physiologische Effekt der Tod einer Zelle. In einer anderen Ausführungsform ist das Substrat ein Proarzneistoff, und das Produkt ist ein aktiver Arzneistoff.
  • Zielgerichtete Enzyme können zur therapeutischen Verabreichung verwendet werden, z. B. als Teil von Therapieanwendungen mit zielgerichtetem Enzym und Proarzneistoff. Es ist bekannt, dass Makromoleküle mit Molekulargewichten unter etwa 45000 Dalton rasch aus dem Kreislauf durch die glomeruläre Filtration der Niere geklärt werden; siehe auch Greenwald et al., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 17: 101 (2000). Ein zielgerichtets Enzym kann ein Molekulargewicht aufweisen, welches seine Entfernung aus dem Kreislauf eines Säugetierwirtes mittels glomerulärer Filtration zuläßt. Es wird angemerkt, dass zusätzlich dazu, dass sie eine kürzere Halbwertszeit im Kreislauf aufweisen, kleinere zielgerichtete Enzyme rascher als Antikörper-Enzym-Konjugate in gewisse Typen von Zielen, z. B. eine Tumormasse, hinein diffundieren. Für in vivo-Anwendungen werden ebenfalls zielgerichtete Enzyme bevorzugt, welche eine verhältnismäßig geringe Größe aufweisen, vorzugsweise kleiner als etwa 45 kD, eine hohe spezifische Aktivität aufweisen, unter physiologisch relevanten Bedingungen (z. B. zwischen etwa 25–40°C, und bei einem pH von etwa 5,5 bis etwa 7,5) in hohem Maße aktiv sind, und welche einer minimalen Störung im behandelten Subjekt durch Inhibitoren, Enzymsubstrate oder endogene Enzymsysteme unterliegen.
  • In anderen Aspekten besitzt das zielgerichtete Enzyme ein größeres Molekulargewicht als 5 kD, jedoch geringer als 10 kD, 15 kD, 20 kD, 25 kD, 30 kD, 35 kD, 40 kD, 45 kD, 50 kD, 55 kD, 60 kD, 75 kD, 100 kD, 150 kD, 200 kD, 250 kD, 300 kD, 350 kD, 400 kD, 450 kD oder 500 kD.
  • Für manche Ausführungsformen werden Enzyme bevorzugt, welche in erkrankten Zellen mit veränderten physiologischen Zuständen, zum Beispiel in Krebszellen mit erniedrigtem pH, hochaktiv sind. Von besonderem Interesse sind Enzyme, welche verwendet werden können, um einen Proarzneistoff in einer therapeutischen Situation zu aktivieren. Eine große Anzahl von Enzymen mit unterschiedlichen katalytischen Wirkungsweisen ist verwendet worden, um Proarzneistoffe zu aktivieren; siehe z. B. Melton & Knox Enzyme-prodrug strategies for cancer therapy (1999), und Bagshawe et al., Curr. Opin. Immunol. 11: 579 (1999). Diese Enzyme können zum Beispiel unter Anwendung der Verfahren der vorliegenden Erfindung modifiziert werden, um eine Targeting-Fähigkeit in das Protein einzubinden, während die Fähigkeit dieser Enzyme, einen Proarzneistoff zu aktivieren, beibehalten wird. In einer anderen Ausführungsform werden Enzyme, welche ein toxisches Mittel aus einem Metabolit erzeugen, modifiziert, um eine Targeting-Stelle einzuschließen. Obgleich es kein zielgerichtetes Enzym ist, wie der Begriff hierin verwendet wird, beschreibt Christofidou-Solomidou et al., Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 278: L794 (2000), zum Beispiel die Verwendung von Glucoseoxidase, welche Wasserstoffperoxid aus Glucose erzeugt, als ein Immun-zielgerichtetes Enzym.
  • Beispiele von Typen von nicht-zielgerichtetem Enzym, welche verwendet werden können, um die zielgerichteten Enzyme der vorliegenden Erfindung herzustellen, schließen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, Proteasen, Carboxypeptidasen, β-Lactamasen, Asparaginasen, Oxidasen, Hydrolasen, Lyasen, Lipasen, Cellulasen, Amylasen, Aldolasen, Phosphatasen, Kinasen, Transferasen, Polymerasen, Nukleasen, Nukleotidasen, Laccasen, Reductasen und dergleichen ein; siehe z. B. gleichzeitig anhängige U.S.-Patentanmeldung Serien-Nr. 09/954 385, eingereicht am 12. September 2001, auf welche hierin in ihrer Gesamtheit ausdrücklich Bezug genommen wird. Als solches können zielgerichtete Enzyme der Erfindung beispielsweise Protease-, Carboxypeptidase-, β-Lactamase-, Asparaginase-, Oxidase-, Hydrolase-, Lyase-, Lipase-, Cellulase-, Amylase-, Aldolase-, Phosphatase-, Kinase-, Transferase-, Polymerase-, Nuklease-, Nukleotidase-, Laccase- oder Reductase-Aktivität oder dergleichen aufzeigen. Ein besonderes Beispiel eines Typs von Enzym, der verwendet werden kann, sind Enzyme, welche einen Proarzneistoff aktivieren können, wie es nachstehend erörtert wird.
  • Beispiele von spezifischen nicht-zielgerichteten Enzymen, welche verwendet werden können, um die zielgerichteten Enzyme der vorliegenden Erfindung herzustellen, schließen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, Klasse A-, B-, C- oder D-β-Lactamase, β-Galactosidase, siehe Benito et al., FEMS Microbiol. Lett. 123: 107 (1994), Fibronectin, Glucoseoxidase, Glutathion-S-Transferase, siehe Napolitano et al., Chem. Biol. 3: 359 (1996), und Gewebe-Plasminogen-Aktivator, siehe Smith et al., J. Biol. Chem. 270: 30486 (1995) ein.
  • In einer Ausführungsform ist das zielgerichtete Enzym nicht eine Laccase. In einer anderen Ausführungsform ist das zielgerichtete Enzym nicht eine Bilirubin-Oxidase. In einer anderen Ausführungsform ist das zielgerichtete Enzym nicht eine Phenoloxidase. In einer anderen Ausführungsform ist das zielgerichtete Enzym nicht eine Catechol-Oxidase. In einer anderen Ausführungsform ist das zielgerichtete Enzym nicht fähig zum Katalysieren von Redox-Reaktionen, worin der Elektronendonor eine phenolische Verbindung ist, und der Elektronenakzeptor molekularer Sauerstoff oder Wasserstoffperoxid ist.
  • In einer weiteren Ausführungsform ist die katalytische Aktivität des zielgerichteten Enzyms nicht signifikant verschieden von der katalytischen Aktivität des nicht-zielgerichteten Enzyms. Das heißt, die variante Sequenz oder Sequenzen erhöhen oder verringern nicht signifikant die katalytische Aktivität des Enzyms. In einer anderen Ausführungsform beträgt die katalytische Aktivität des zielgerichteten Enzyms zwischen etwa 1% und etwa 100% der katalytischen Aktivität des nicht-zielgerichteten Enzyms. Es wird in Betracht gezogen, dass die variante Sequenz oder Sequenzen tatsächlich zu einem zielgerichteten Enzym führen können, welches mehr als 100% der katalytischen Aktivität des nicht-zielgerichteten Enzyms aufzeigt, zum Beispiel bis zu etwa 125%, 150%, 175%, 200%, 250%, 300%, 400% oder 500%. In einer anderen Ausführungsform beträgt die katalytische Aktivität des zielgerichtetn Enzyms zwischen etwa 10% und etwa 100% der katalytischen Aktivität des nicht-zielgerichteten Enzyms. In einer anderen Ausführungsform beträgt die katalytische Aktivität des zielgerichteten Enzyms zwischen etwa 20% und etwa 100% der katalytischen Aktivität des nicht-zielgerichteten Enzyms. In einer anderen Ausführungsform beläuft sich die katalytische Aktivität des zielgerichteten Enzyms auf zwischen etwa 30% und etwa 100% der katalytischen Aktivität des nicht-zielgerichteten Enzyms. In einer weiteren Ausführungsform beträgt die katalytische Aktivität des zielgerichteten Enzyms zwischen etwa 40% und etwa 100% der katalytischen Aktivität des nicht-zielgerichteten Enzyms. In einer anderen Ausführungsform ist die katalytische Aktivität des zielgerichteten Enzyms zwischen etwa 50% und etwa 100% der katalytischen Aktivität des nicht-zielgerichteten Enzyms. In einer anderen Ausführungsform beträgt die katalytische Aktivität des zielgerichteten Enzyms zwischen etwa 60% und etwa 100% der katalytischen Aktivität des nicht-zielgerichteten Enzyms. In einer anderen Ausführungsform beträgt die katalytische Aktivität des zielgerichteten Enzyms zwischen etwa 70% und etwa 100% der katalytischen Aktivität des nicht-zielgerichteten Enzyms. In einer weiteren Ausführungsform beträgt die katalytische Aktivität des zielgerichteten Enzyms zwischen etwa 80% und etwa 100% der katalytischen Aktivität des nicht-zielgerichteten Enzyms. In einer weiteren Ausführungsform beläuft sich die katalytische Aktivität des zielgerichteten Enzyms auf zwischen etwa 90% und etwa 100% der katalytischen Aktivität des nicht-zielgerichteten Enzyms.
  • In einer anderen Ausführungsform wird die katalytische Aktivität des zielgerichteten Enzyms von der Bindung des Ziels nicht signifikant beeinflußt. D. h., das an das Ziel gebundene, zielgerichtete Enzym weist etwa die gleiche katalytische Aktivität auf, wie das zielgerichtete Enzym, welches nicht an das Ziel gebunden ist. In einer weiteren Ausführungsform beträgt die katalytische Aktivität des zielgerichteten Enzyms, welches an das Ziel gebunden ist, zwischen etwa 10% und etwa 500% der katalytischen Aktivität des zielgerichteten Enzyms, das nicht an das Ziel gebunden ist. In einer anderen Ausführungsform beläuft sich die katalytische Aktivität des an das Ziel gebundenen, zielgerichteten Enzyms auf zwischen etwa 20% und etwa 450% der katalytischen Aktivität des zielgerichteten Enzyms, welches nicht an das Ziel gebunden ist. In einer anderen Ausführungsform ist die katalytische Aktivität des zielgerichteten Enzyms, gebunden an das Ziel, zwischen etwa 30% und etwa 400% der katalytischen Aktivität des zielgerichteten Enzyms, welches nicht an das Ziel gebunden ist. In einer anderen Ausführungsform beläuft sich die katalytische Aktivität des an das Ziel gebundenen, zielgerichteten Enzyms auf zwischen etwa 40% und etwa 350% der katalytischen Aktivität des zielgerichteten Enzyms, welches nicht an das Ziel gebunden ist. In einer anderen Ausführungsform beläuft sich die katalytische Aktivität des an das Ziel gebundenen, zielgerichteten Enzyms auf zwischen etwa 50% und etwa 300% der katalytischen Aktivität des zielgerichteten Enzyms, welches nicht an das Ziel gebunden ist. In einer anderen Ausführungsform beläuft sich die katalytische Aktivität des an das Ziel gebundenen, zielgerichteten Enzyms auf zwischen etwa 60% und etwa 250% der katalytischen Aktivität des zielgerichteten Enzyms, welches nicht an das Ziel gebunden ist. In einer anderen Ausführungsform beläuft sich die katalytische Aktivität des an das Ziel gebundenen, zielgerichteten Enzyms auf zwischen etwa 70% und etwa 200% der katalytischen Aktivität des zielgerichteten Enzyms, welches nicht an das Ziel gebunden ist. In einer anderen Ausführungsform beläuft sich die katalytische Aktivität des an das Ziel gebundenen, zielgerichteten Enzyms auf zwischen etwa 80% und etwa 150% der katalytischen Aktivität des zielgerichteten Enzyms, welches nicht an das Ziel gebunden ist. In einer anderen Ausführungsform beläuft sich die katalytische Aktivität des an das Ziel gebundenen, zielgerichteten Enzyms auf zwischen etwa 90% und etwa 125% der katalytischen Aktivität des zielgerichteten Enzyms, welches nicht an das Ziel gebunden ist. In einer anderen Ausführungsform beläuft sich die katalytische Aktivität des an das Ziel gebundenen, zielgerichteten Enzyms auf zwischen etwa 95% und etwa 110% der katalytischen Aktivität des zielgerichteten Enzyms, welches nicht an das Ziel gebunden ist. In einer anderen Ausführungsform beläuft sich die katalytische Aktivität des an das Ziel gebundenen, zielgerichteten Enzyms auf zwischen etwa 60% und etwa 165% der katalytischen Aktivität des zielgerichteten Enzyms, welches nicht an das Ziel gebunden ist. In einer anderen Ausführungsform beträgt die katalytische Aktivität des zielgerichteten Enzyms, gebunden an das Ziel, etwa 100% der katalytischen Aktivität des zielgerichteten Enzyms, das nicht an das Ziel gebunden ist.
  • In einem anderen Aspekt sieht die vorliegende Erfindung ein zielgerichtetes Enzym vor, das, während es an ein Ziel gebunden ist, eine katalytische Aktivität größer als etwa z. B. 1%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200%, 250%, 500%, 750%, 1000%, 1500%, 2000%, 2500% oder 5000% relativ zu der katalytischen Aktivität des nicht-zielgerichteten Enzyms aufzeigt.
  • In einem anderen Aspekt sieht die vorliegende Erfindung ein zielgerichtetes Enzym vor, welches ein Milieu-unabhängiges zielgerichtetes Enzym ist.
  • In einem anderen Aspekt sieht die vorliegende Erfindung ein zielgerichtetes Enzym vor, welches ein multifunktionelles Polypeptid ist.
  • NICHT-ZIELGERICHTETE ENZYME
  • Das nicht-zielgerichtete Enzym, verwendet zur Herstellung des zielgerichteten Enzyms, kann jedwedes Enzym, Fragment von einem Enzym oder Derivat von einem Enzym sein, welches eine katalytische Aktivität und eine oder mehrere variationstolerante Sequenzen aufweist und wel ches, unter gleichen Bedingungen, nicht spezifisch an ein Ziel bindet, welches von dem zielgerichteten Enzym gebunden wird. Verfahren zur Identifizierung von variationstoleranten Sequenzen in einem Enzym werden nachstehend angegeben. Das nicht-zielgerichtete Enzym kann z. B. mehr als eine Aktivität aufweisen. Zum Beispiel kann das nicht-zielgerichtete Enzym mehr als eine katalytische Aktivität, oder eine oder mehrere katalytische Aktivitäten und eine oder mehrere Bindungsaktivitäten aufweisen. In einer anderen Ausführungsform ist das nicht-zielgerichtete Enzym ein natürlich vorkommendes Enzym. In einer anderen Ausführungsform ist es ein mutiertes oder anderweitig genetisch verändertes Protein. In einer anderen Ausführungsform ist es ein chimäres oder Fusionsprotein. In einer weiteren Ausführungsform ist es ein künstlich erzeugtes Enzym.
  • In einer Ausführungsform wird ein nicht-zielgerichtetes Enzym selektiert, welches modifiziert oder weiterentwickelt wurde, um in Antwort auf einen Stimulus mehr oder weniger aktiv zu sein, welcher dann verwendet werden kann, um die Aktivität eines zielgerichteten Enzyms, das aus ihm abgeleitet ist, zu beeinflussen. In einer anderen Ausführungsform ist der Stimulus ein solcher, welcher gesteuert werden kann, wodurch gestattet wird, dass die Aktivität des Enzyms gesteuert wird. In einer anderen Ausführungsform ist der Stimulus der pH-Wert. Viele feste Tumoren besitzen einen reduzierten internen pH im Vergleich zu gesundem Gewebe, und dieser Unterschied könnte ausgenutzt werden, um ein aus dem nicht-zielgerichteten Enzym abgeleitetes zielgerichtetes Enzym selektiv an der Tumorstelle zu aktivieren. In einer anderen Ausführungsform wird das Enzym durch erhöhte oder verringerte Temperatur aktiviert. Derartige Temperaturunterschiede zwischen verschiedenen Geweben können natürlich auftreten oder sie können induziert werden, zum Beispiel mit Mikrowellen. Temperatur und pH-Wert dienen lediglich als Beispiele für Stimuli, welche verwendet werden können, um ein nicht-zielgerichtetes Enzym selektiv zu aktivieren.
  • In einer anderen [Ausführungsform] ist das nicht-zielgerichtete Enzym ein Milieu-abhängiges zielgerichtetes Enzym.
  • In einer anderen Ausführungsform ist das nicht-zielgerichtete Enzym ein multifunktionelles Peptid.
  • Quelle von nicht-zielgerichtetem Enzym
  • In einer Ausführungsform ist das nicht-zielgerichtete Enzym aus einer natürlichen Quelle eines Enzyms abgeleitet, einschließlich, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, Bakterien, Archaea, Pflanzen, Pilzen oder Tieren. In einer anderen Ausführungsform ist das nicht-zielgerichtete Enzym ein Enzym aus einer Spezies, in welcher das zielgerichtete Enzym verwendet werden wird. In einer weiteren Ausführungsform ist das nicht-zielgerichtete Enzym ein Sängerenzym oder ein katalytisch aktives Fragment eines Säugerenzyms. In einer anderen Ausführungsform ist das nicht-zielgerichtete Enzym ein Primaten-Enzym oder ein katalytisch aktives Fragment eines Primaten-Enzyms. In einer anderen Ausführungsform ist das nicht-zielgerichtete Enzym ein humanes Enzym oder ein katalytisch aktives Fragment eines humanen Enzyms. In einer anderen Ausführungsform ist das nicht-zielgerichtete Enzym ein humanes Enzym oder ein katalytisch aktives Fragment eines humanen Enzyms, welches gentechnisch konstruiert oder modifiziert worden ist. In einer anderen Ausführungsform ist das nicht-zielgerichtete Enzym ein Fusions- oder Chimären-Protein, welches die Gesamtheit oder einen Abschnitt eines humanen Enzyms umfasst.
  • In einer anderen Ausführungsform ist das nicht-zielgerichtete Enzym nicht eine Laccase. Zum Beispiel ist, in einer Ausführungsform, das nicht-zielgerichtete Enzym nicht eine Bilirubin-Oxidase, eine Phenoloxidase, eine Catechol-Oxidase oder ein Enzym, das fähig zum Katalysieren von Redoxreaktionen ist, worin der Elektronendonor eine phenolische Verbindung ist und der Elektronenakzeptor molekularer Sauerstoff oder Wasserstoffperoxid ist.
  • Eine bedeutende Hürde für existierende chronische ADEPT-Protokolle besteht darin, dass Antikörper-Enzym-Konjugate eine Immunantwort in dem Subjekt hervorrufen. Eine derartige Antwortreaktion schließt eine wiederholte Behandlung aus, weil das Immunsystem paradoxerweise die Antikörper-Enzym-Konjugate aus dem Kreislauf entfernt, bevor die Konjugate ihre Ziele erreichen können. Kürzlich ist ein signifikanter Fortschritt bei der Erzeugung von humanen oder humanisierten Antikörpern erreicht worden. Allerdings überwindet dies nicht das Problem der Immunogenizität des an den Antikörper angehefteten Enzyms in dem Antikörper-Enzym-Konjugat.
  • In einer anderen Ausführungsform ist das Proarzneimittel so entworfen, dass es nicht aktiviert wird oder langsam aktiviert wird von dem nativen humanen Enzym, jedoch günstige pharmakologische Eigenschaften besitzt, z. B. Gewebeverteilung, Halbwertszeit oder Toxizität. In einer anderen Ausführungsform ist ein humanes nicht-zielgerichtetes Enzym modifiziert, um den Proarzneistoff selektiv zu aktivieren. Diese Modifikation kann bewirkt werden unter Verwendung einer Kombination aus Struktur-basierter technischer Veränderung, gerichteter Evolution und chemischer Modifikation. Wie es der Fachmann auf dem Gebiet richtig einschätzen wird, sollte die Modifikation in einer Weise erfolgen, welche das Risiko der Einbringung neuer immunologischer Epitope in das zielgerichtete Enzym minimiert. Es sind Verfahren verfügbar, um das modifizierte Enzym hinsichtlich des Vorhandenseins von Epitopen zu testen, wodurch man in die Lage versetzt wird, Modifikationen auszuwählen, welche die Einführung von Epitopen vermeiden, jedoch zu den gewünschten katalytischen Eigenschaften des Enzyms führen; siehe zum Beispiel das U.S.-Patent 5 750 356 , WO 99/53038 , WO 98/5296 und WO 99/61916 .
  • In einer anderen Ausführungsform ist ein zielgerichtetes Enzym zur Verwendung in einem menschlichen Subjekt von einem nicht-zielgerichteten Enzym aus einer nicht-humanen Quelle abgeleitet. In einer weiteren Ausführungsform ist das nicht-zielgerichtete Enzym in einem humanen Subjekt nicht-immunogen.
  • Wie nachstehend ausführlicher beschrieben wird, wird hierin ein Verfahren zur Behandlung eines Subjekts offenbart, welches das Verabreichen eines zielgerichteten Enzyms und eines Proarzneistoffs, welcher ein Substrat des zielgerichteten Enzyms ist, an ein Subjekt umfasst. Nicht-zielgerichtete Enzyme, welche in diesem Aspekt nützlich sind, schließen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, alkalische Phosphatase, nützlich zur Umwandlung von Phosphat-enthaltenden Proarzneistoffen zu freien Arzneistoffen, Arylsulfatase, nützlich zur Umwandlung von Sulfat-enthaltenden Proarzneistoffen zu freien Arzneistoffen, Cytosin-Desaminase, nützlich zum Umwandeln von nicht-toxischem 5-Fluorcytosin zu dem Anti-Krebs-Arzneistoff 5-Fluorouracil, Proteasen, wie Serinproteasen, Thermolysine, Subtilisine, Carboxypeptidasen und Cathepsine (wie etwa die Cathepsine B und L), welche nützlich zum Umwandeln von Peptid-enthaltenden Proarzneistoffen zu freien Arzneistoffen sind, D-Alanylcarboxypeptidasen, nützlich zum Umwandeln von Proarzneistoffen, welche D-Aminosäure-Substituenten enthalten, Kohlenhydrat-spaltende Enzyme, wie β-Galactosidase und Neuraminidase, nützlich zum Umwandeln von glycosylierten Proarzneistoffen zu freien Arzneistoffen, β-Lactamase, nützlich zum Umwandeln von Arzneistoffen, die mit β-Lactamen derivatisiert sind, zu freien Arzneistoffen, und Penicillin-Amidasen, wie Penicillin-V-Amidase oder Penicillin-G-Amidase, nützlich zum Umwandeln von Arzneistoffen, die an ihren Amin-Stickstoffatomen mit Phenoxyacetyl- bzw. Phenylacetyl-Gruppen derivatisiert sind, zu freien Arzneistoffen, ein. Alternativ dazu können Antikörper mit enzymatischer Aktivität, welche im Fachgebiet auch als Abzyme bekannt sind, verwendet werden, um die Proarzneistoffe der Erfindung in freie aktive Arzneistoffe umzuwandeln (siehe z. B. R. J. Massety, Nature, 328, S. 457–458 (1987)).
  • Nachstehend werden ausführlich besondere repräsentative, nicht-einschränkende Klassen von zielgerichteten Enzymen der Erfindung beschrieben. Unter Befolgung der hierin angegebenen Lehren kann auch jedwede(s) andere(s) Enzym oder Enzymklasse von Interesse in einer ähnlichen Weise verwendet werden, um zielgerichtete Enzyme herzustellen, wie diejenigen, die nachstehend beschrieben werden:
  • β-Lactamasen
  • In einer Ausführungsform sieht die vorliegende Erfindung ein zielgerichtetes β-Lactamase-(BLA)-Enzym vor. In einer anderen Ausführungsform umfasst das zielgerichtete BLA-Enzym eine Substraterkennungsstelle und eine Targeting-Stelle, welche ein Ziel bindet, wobei die Targeting-Stelle eine oder mehrere variante Sequenzen umfasst, die von einer oder mehreren variationstoleranten Sequenzen abgeleitet sind.
  • In einer anderen Ausführungsform wird die variationstolerante Sequenz aus der Gruppe gewählt, bestehend aus Loop A, Loop B, Loop C, Loop D und Loop E, wie sie nachstehend definiert werden.
  • In einer weiteren Ausführungsform besitzt das zielgerichtete BLA-Enzym eine spezifische Aktivität, die größer ist als etwa 0,01 U/pmol gegenüber Nitrocefin unter Anwendung des nachstehend in den Beispielen beschriebenen Assays. In einer weiteren Ausführungsform ist die spezifische Aktivität größer als etwa 0,1 U/pmol. In einer weiteren Ausführungsform ist die spezifische Aktivität größer als etwa 1 U/pmol. Vorzugsweise beziehen sich diese spezifischen Aktivitäten auf die spezifische Aktivität der zielgerichteten BLA, wenn sie an ein Ziel gebunden ist.
  • BLA-Enzyme sind sowohl in gramnegativen als auch grampositiven Bakterien weit verbreitet. Die BLA-Sequenzen sind allgemein bekannt. Ein repräsentatives Beispiel einer BLA-Sequenz ist in der 1 abgebildet. BLA-Enzyme variieren hinsichtlich der Spezifität, haben jedoch gemeinsam, dass sie β-Lactame hydrolysieren, wobei substituierte β-Aminosäuren produziert werden. Somit verleihen sie Resistenz gegen Antibiotika, welche β-Lactame enthalten. Weil BLA-Enzyme für Säugetiere nicht endogen sind, unterliegen sie einer minimalen Störeinwirkung durch Inhibitoren, Enzymsubstrate oder endogene Enzymsysteme (anders als Proteasen; siehe nachstehend), und sie sind deshalb besonders gut für eine therapeutische Verabreichung geeignet. BLA-Enzyme sind ferner für die therapeutischen Verfahren der vorliegenden Erfindung wegen ihrer geringen Größe (BLA aus E. cloacae ist ein Monomer von 43 kD; BLA von E. coli ist ein Monomer von 30 kD), und weil sie eine hohe spezifische Aktivität gegen ihre Substrate aufweisen und eine optimale Aktivität bei neutralem pH-Wert und 37°C besitzen, gut geeignet; siehe Melton et al., Enzym-Prodrug Strategies for Cancer Therapy, Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York (1999).
  • Die β-Lactamasen sind, basierend auf ihren Sequenzen, in vier Klassen eingeteilt worden; siehe Thomson et al., 2000, Microbes and Infection 2: 1225–35. Die Serin-β-Lactamasen werden in drei Klassen eingeteilt: A (Penicillinasen), C (Cephalosporinasen) und D (Oxacillinasen). Klasse-B-β-Lactamasen sind die Zink enthaltenden oder Metallo-β-Lactamasen. Jedwede Klasse von BLA kann verwendet werden, um ein zielgerichtetes Enzym der Erfindung zu erzeugen.
  • In einer Ausführungsform sieht die vorliegende Erfindung eine zielgerichtete β-Lactamase vor, welche die Sequenz YXN an ihrer Substraterkennungsstelle umfasst ("X" bezieht sich überall auf einen beliebigen Aminosäurerest). In einer anderen Ausführungsform umfasst die zielgerichtete β-Lactamase die Sequenz RLYANASI an ihrer aktiven Stelle. In einer anderen Ausführungsform umfasst die zielgerichtete β-Lactamase eine Sequenz an ihrer aktiven Stelle, welche sich von der Sequenz RLYANASI um einen, zwei oder drei Aminosäurereste unterscheidet. Vorzugsweise handelt es sich bei den Unterschieden um die Substitution von konservativen Aminosäureresten. Allerdings sind ebenfalls Insertionen, Deletionen und nicht-konservative Aminosäuresubstitutionen eingeschlossen.
  • In einer Ausführungsform sieht die vorliegende Erfindung eine zielgerichtete β-Lactamase vor, welche die Sequenz KTXS an ihrer Substraterkennungsstelle umfasst. In einer anderen Ausführungsform umfasst die zielgerichtete β-Lactamase die Sequenz VHKTGSTG an ihrer aktiven Stelle. In einer weiteren Ausführungsform umfasst die zielgerichtete β-Lactamase eine Sequenz an ihrer aktiven Stelle, welche sich von der Sequenz VHKTGSTG um einen, zwei oder drei Aminosäurereste unterscheidet. Vorzugsweise handelt es sich bei den Unterschieden um die Substitution von konservativen Aminosäureresten. Allerdings sind Insertionen, Deletionen und nicht-konservative Aminosäuresubstitutionen ebenfalls eingeschlossen.
  • In einer Ausführungsform sieht die vorliegende Erfindung eine zielgerichtete β-Lactamase vor, welche die Sequenzen YXN und KTXS an ihrer Substraterkennungsstelle umfasst. In einer anderen Ausführungsform umfasst die zielgerichtete β-Lactamase die Sequenzen VHKTGSTG und RLYANASI an ihrer aktiven Stelle. In einer weiteren Ausführungsform umfasst die zielgerichtete β-Lactamase Sequenzen an ihrer aktiven Stelle, welche sich von den Sequenzen RLYANASI und VHKTGSTG um einen, zwei oder drei Aminosäurereste unterscheiden. Vorzugsweise handelt es sich bei den Unterschieden um die Substitution von konservativen Aminosäureresten. Allerdings sind Insertionen, Deletionen und nicht-konservative Aminosäuresubstitutionen ebenfalls eingeschlossen.
  • In einer Ausführungsform ist das nicht-zielgerichtete Enzym, entsprechend einem zielgerichteten Enzym der vorliegenden Erfindung, eine β-Lactamase, welche die Aminosäuresequenz von 1 umfasst. In einer solchen Ausführungsform kann die zielgerichtete β-Lactamase der Erfindung 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% oder mehr (aber nicht 100%) identisch zu der in 1 abgebildeten Sequenz sein. In bestimmten Ausführungsformen unterscheidet sich die Aminosäuresequenz des zielgerichteten β-Lactamase-Enzyms von der in 1 abgebildeten Aminosäuresequenz lediglich innerhalb der/den variationstoleranten Sequenz oder Sequenzen des Enzyms.
  • In anderen Ausführungsformen ist die Aminosäuresequenz des nicht-zielgerichteten β-Lactamase-Enzyms 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% oder mehr identisch zu der Sequenz von 1, und das zielgerichtete Enzym der Erfindung ist von dieser Sequenz abgeleitet, aber nicht zur ihr identisch. In einer solchen Ausführungsform unterscheidet sich das zielgerichtete Enzym von dem nicht-zielgerichteten β-Lacatamase-Enzym lediglich innerhalb der/den variationstoleranten Sequenz oder Sequenzen des Enzyms.
  • In einer anderen Ausführungsform hybridisiert eine Nukleinsäure, welche das nicht-zielgerichtete Enzym codiert, an eine Nukleinsäure, die zu einer, die Aminosäuresequenz von 1 codierenden Nukleinsäure komplementär ist, unter hochstringenten Bedingungen. Die hochstringenten Bedingungen können zum Beispiel bestehen in Hybridisierung an Filter-gebundene DNA in 0,5 M NaHPO4, 7% Natriumdodecylsulfat (SDS), 1 mM EDTA bei 65°C, und Waschen in 0,1 × SSC/0,1% SDS bei 68°C (Ausubel et al., Hrsg., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Band I, Green Publishing Associates, Inc., and John Wiley & Sons, Inc., New York, auf S. 2.10.3). Andere in hohem Maße stringente Bedingungen kann man zum Beispiel finden in Current Protocols in Molecuar Biology, auf den Seiten 2.10.1–16, und Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Sambrook et al., (Hrsg.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Seite 9.47–57. In einer weiteren Ausführungsform hybridisiert eine das nicht-zielgerichtete Enzym codierende Nukleinsäure an eine Nukleinsäure, komplementär zu einer Nukleinsäure, codierend die Aminosäuresequenz von 1, unter mäßig stringenten Bedingungen. Bei den mäßig stringenten Bedingungen kann es sich zum Beispiel handeln um Waschen in 0,2 × SSC/0,1% SDS bei 42°C (Ausubel et al., 1989, siehe oben). Weitere mäßig stringente Bedingungen kann man zum Beispiel finden in Current Protocols in Molecular Biology, Band I, Ausubel et al., (Hrsg.), Green Publishing Associates, Inc., and John Wiley & Sons, Inc., 1989, Seiten 2.10.1–16, und Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Sambrook et al., (Hrsg.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Seiten 9.47–57.
  • In einer weiteren Ausführungsform sieht die Erfindung ein Verfahren zur Behandlung eines Subjekts durch Verabreichen einer zielgerichteten BLA-Enzyms und eines Proarzneistoffs, welcher durch die BLA zu einem aktiven Arzneistoff umgewandelt wird, an das Subjekt vor. Beispiele von geeigneten Proarzneistoffen für diese Ausführungsform werden z. B. angegeben in Melton et al., Enzyme-Prodrug Strategies for Cancer Therapy, Kluwer Academic/Plenums Publishers, New York (1999), Bagshaw et al., Current Opinion in Immunology 11: 579–83 (1999) und Kerr et al., Bioconjugate Chem. 9: 255–59 (1998).
  • ZIELE
  • Bei den von den zielgerichteten Enzymen der vorliegenden Erfindung gebundenen Zielen kann es sich um jedwede Substanz oder Zusammensetzung handelt, an welcher man ein Molekül binden lassen kann.
  • In einem Aspekt ist das Ziel eine Oberfläche. In einer Ausführungsform ist die Oberfläche eine biologische Oberfläche. In einer anderen Ausführungsform ist die biologische Oberfläche eine Oberfläche eines Organs. In einer weiteren Ausführungsform ist die biologische Oberfläche die Oberfläche eines Gewebes. In einer anderen Ausführungsform ist die biologische Oberfläche eine Oberfläche einer Zelle. In einer weiteren Ausführungsform ist die biologische Oberfläche eine Oberfläche eines erkrankten Organs, Gewebes oder Zelle. In einer anderen Ausführungsform ist die biologische Oberfläche eine Oberfläche von einer/einem normalen oder gesunden Organ, Gewebe oder Zelle. In einer anderen Ausführungsform ist die Oberfläche ein Makromolekül im interstitiellen Raum eines Gewebes. In einer anderen Ausführungsform ist die biologische Oberfläche die Oberfläche eines Virus oder Pathogens. In einer weiteren Ausführungsform ist die Oberfläche eine nicht-biologische Oberfläche. In einer anderen Ausführungsform ist die nicht-biologische Oberfläche eine Oberfläche einer medizinischen Vorrichtung. In einer anderen Ausführungsform ist die medizinische Vorrichtung eine therapeutische Vorrichtung. In einer anderen Ausführungsform ist die therapeutische Vorrichtung eine implantierte therapeutische Vorrichtung. In einer anderen Ausführungsform ist die medizinische Vorrichtung eine diagnostische Vorrichtung. In einer anderen Ausführungsform ist die diagnostische Vorrichtung eine Vertiefung oder Schale.
  • Quellen von Zellen oder Geweben schließen Menschen, Tiere, Bakterien, Pilze, Viren und Pflanzen ein. Gewebe sind komplexe Ziele und beziehen sich auf einen einzelnen Zelltyp, eine Ansammlung von Zelltypen oder ein Aggregat von Zellen, im Allgemeinen von einer besonderen Art. Gewebe können intakt oder modifiziert sein. Allgemeine Klassen von Gewebe in Menschen schließen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, Epithelgewebe, Bindegewebe, Nervengewebe und Muskelgewebe ein.
  • In einem anderen Aspekt ist das Ziel ein mit Krebs zusammenhängendes Ziel. Das mit Krebs zusammenhängende Ziel kann jedwedes Ziel sein, an das eine Zusammensetzung der Erfindung als Teil der Diagnose, Detektion oder Behandlung einer Krebsart oder eines mit Krebs zusammenhängenden Zustands in einem Subjekt bindet, zum Beispiel eine krebsartige Zelle, Gewebe oder Organ, ein Molekül, das mit einer/einem krebsartigen Zelle, Gewebe oder Organ assoziiert ist, oder ein Molekül, eine Zelle, ein Gewebe oder ein Organ, welches mit einer krebsartigen Zelle, Gewebe oder Organ assoziiert ist (z. B. ein Tumor-gebundenes diagnostisches oder therapeutisches Molekül, verabreicht an ein Subjekt oder an eine Biopsie, welche aus einem Subjekt entnommen wurde, oder ein gesundes Gewebe, wie Gefäßsystem, welches mit kanzerösem Gewebe assoziiert ist). Beispiele für mit Krebs zusammenhängende Ziele sind im U. S.-Patent Nr. 6 261 535 angegeben.
  • Das mit Krebs zusammenhängende Ziel kann mit jedwedem Krebs oder Krebs-assoziiertem Zustand verwandt sein. Beispiele für Typen von Krebsarten schließen Karzinome, Sarkome, Myelome, Leukämien, Lymphome und Krebsarten vom gemischten Typ ein.
  • In einer Ausführungsform ist der Krebs ein Knochenkrebs, zum Beispiel Ewing-Sarkom, Osteosarkom und Rhabdomyosarkom sowie andere Weichgewebe-Sarkome. In einer weiteren Ausführungsform ist der Krebs ein Hirntumor, zum Beispiel ein Oligodendrogliom, Ependymom, Menengiom, Lymphom, Schwannom oder Medulloblastom. In einer weiteren Ausführungsform ist der Krebs ein Brustkrebs, zum Beispiel ein in situ Ductal-Karzinom der Brust. In einer anderen Ausführungsform ist der Krebs ein Krebs des endokrinen Systems, zum Beispiel Nebennieren-, Pankreas-, Parathyroid-, Hypophysen- und Schilddrüsen-Krebse. In einer weiteren Ausführungsform ist der Krebs ein gastrointestinaler Krebs, wie zum Beispiel Anal-, Colorektal-, Speisenröhren-, Gallenblasen-, Magen-, Leber-, Pankreas- und Dünndarmkrebse. In einer anderen Ausfüh rungsform ist der Krebs ein gynäkologischer Krebs, zum Beispiel Cervix-, Endometrium-, Uterus-, Eileiter-, Schwangerschaftstrophoblasten-Krankheit-, Choriokarzinom-, Eierstock-, Vaginal- und Vulva-Krebsarten. In einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei dem Krebs um einen Kopf- und Halskrebs, beispielsweise Larynx-, Oropharyngeal-, Parathyroid- oder Schilddrüsenkrebs. In einer anderen Ausführungsform ist der Krebs ein leukämischer Krebs, zum Beispiel akute lymphozytische Leukämie, akute myelogenische Leukämie, chronische lymphozytische Leukämie, chronische myelogene Leukämie, Haarzellen-Leukämie oder eine myeloproliferative Erkrankung. In einer anderen Ausführungsform ist der Krebs ein Lungenkrebs, zum Beispiel ein Mesotheliom, nicht-kleinzelliger [und] kleinzelliger Lungenkrebs. In einer anderen Ausführungsform ist der Krebs ein Lymphom, zum Beispiel ein AIDS-verwandtes Lymphom, kutanes T-Zell-Lymphom/Mucosis fungoides, Hodgkin-Erkrankung oder Nicht-Hodgkin-Erkrankung. In einer weiteren Ausführungsform ist der Krebs ein metastatischer Krebs. In einer anderen Ausführungsform ist der Krebs ein Myelom, zum Beispiel ein multiples Myelom. In einer weiteren Ausführungsform ist der Krebs ein pädiatrischer Krebs, zum Beispiel ein Hirntumor, Ewing-Sarkom, Leukämie (z. B. akute lymphozytische Leukämie oder akute myelogene Leukämie), Leberkrebs, ein Lymphom (z. B. Hodgkin-Lymphom oder Nicht-Hodgkin-Lymphom), Neuroblastom, Retinoblastom, ein Sarkom (z. B. Osteosarkom oder Rhabdomyosarkom) oder Wilms-Tumor. In einer weiteren Ausführungsform ist der Krebs Penis-Krebs. In einer anderen Ausführungsform handelt es sich bei dem Krebs um Prostatakrebs. In einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei dem Krebs um ein Sarkom, zum Beispiel Ewing-Sarkom, Osteosarkom, Rhabdomyosarkom und andere Weichgewebesarkome. In einer anderen Ausführungsform ist der Krebs ein Hautkrebs, zum Beispiel kutanes T-Zell-Lymphom, Mycosis fungoides, Kaposi-Sarkom oder Melanom. In einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei dem Krebs um Hodenkrebs. In einer anderen Ausführungsform ist der Krebs Schilddrüsenkrebs, zum Beispiel papilläres, follikuläres, medulläres oder anaplastisches oder undifferenziertes Schilddrüsenkarzinom. In einer anderen Ausführungsform handelt es sich bei dem Krebs um Harnwegskrebse, zum Beispiel Blasen-, Nieren- oder Harnröhren-Krebse. In einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei dem Krebs- oder krebsverwandten Zustand um Ataxie-Telangiectasie, Karzinom von unbekannten Primärursprung, Li-Fraumeni-Syndrom oder Thymom.
  • In einem anderen Aspekt ist das mit Krebs zusammenhängende Ziel ein Molekül, das mit einer kanzerösen Zelle oder Gewebe assoziiert ist. In einer Ausführungsform ist das Molekül ein Tumor- oder Tumorstroma-Antigen, zum Beispiel GD2, Lewis-Y, 72-kd-Glycoprotein (gp72, zerfallsbeschleunigender Faktor, CD55, DAF, C3/C5-Konvertasen), CO17-1A (EpCAM, 17-1A, EGP-40), TAG-72, CSAg-P (CSAp), 45-kd-Glycoprotein, HT-29 ag, NG2, A33 (43 kd gp), 38 kd gp, MUC-1, CEA, EGFR (HERZ), HER2, HER3, HER4, HN-1-Ligand, CA125, Syndecan-1, Lewis X, PgP, FAP-Stromal-AG (Fibroblasten-Aktivations-Protein), EDG-Rezeptoren (Endoklin-Rezeptoren), ED-B, Laminin-5 (gamma2), cox-2 (+LN-5), PgP (P-Glycoprotein), alphaVbeta3-Integrin, alphaVbeta5, Integrin, uPAR (Urokinase-Plasminogen-Aktivator-Rezeptor), Endoglin (CD105), Folat-Rezeptor-Osteopontin (EDG 1,3), p97 (Melanotransferrin), Farnesyltransferase oder ein Molekül in einem apoptotischen Weg (z. B. ein Death Rezeptor, fas, Caspase oder bcl-2) oder ein Lectin.
  • In einem anderen Aspekt ist das Ziel eine hämatopoetische Zelle. Hämatopoetische Zellen umfassen hämatopoetische Stammzellen (HSCs), Erythrocyten, Neutrophile, Monocyten, Blutplättchen, Mastzellen, Eosinophile, Basophile, B- und T-Zellen, Macrophagen und natürliche Killerzellen. In einer Ausführungsform besitzt die HSC ein Oberflächenantigen-Expressionsprofil von CD34+ Thy-1+, und vorzugsweise CD34+ Thy-1+ Lin–. Lin– bezieht sich auf eine Zellpopulation, gewählt auf der Basis des Fehlens von Expression von mindestens einem Abstammungslinienspezifischen Marker. Verfahren zur Isolierung und Selektionierung von HSCs sind im Fachgebiet gut bekannt und es wird Bezug auf die U.S.-Patente Nr. 5 061 620 , 5 677 136 und 5 750 397 genommen.
  • In einem anderen Aspekt ist das Ziel ein Molekül. In einer Ausführungsform ist das Molekül ein organisches Molekül. In einer anderen Ausführungsform ist das Molekül ein biologisches Molekül. In einer anderen Ausführungsform ist das biologische Molekül ein zellassoziiertes Molekül. In einer anderen Ausführungsform ist das zellassoziierte Molekül mit der Außenoberfläche einer Zelle assoziiert. In einer anderen Ausführungsform ist das zellassoziierte Molekül ein Teil der extrazellulären Matrix. In einer anderen Ausführungsform ist das zellassoziierte Molekül, welches mit der Außenoberfläche einer Zelle assoziiert ist, ein Protein. In einer anderen Ausführungsform ist das Protein ein Rezeptor. In einer anderen Ausführungsform ist das zellassoziierte Molekül spezifisch für einen Typ von Zelle in einem Subjekt. In einer anderen Ausführungsform ist der Typ von Zelle eine erkrankte Zelle. In einer anderen Ausführungsform ist die erkrankte Zelle eine Krebszelle. In einer anderen Ausführungsform ist die erkrankte Zelle eine infizierte Zelle. Andere Moleküle, welche als Ziele gemäß der Erfindung dienen können, schließen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, Proteine, Peptide, Nukleinsäuren, Kohlenhydrate, Lipide, Polysaccharide, Glycoproteine, Hormone, Rezeptoren, Antigene, Antikörper, toxische Substanzen, Metabolite, Inhibitoren, Arzneistoffe, Farbstoffe, Nährstoffe und Wachstumsfaktoren ein.
  • Nicht-einschränkende Beispiele von Protein- und Chemikalien-Zielen, welche von der Erfindung eingeschlossen sind, beinhalten Chemokine und Cytokine und ihre Rezeptoren. Cytokine, wie hierin verwendet, beziehen sich auf einen beliebigen der zahlreichen Faktoren, welche eine Vielzahl von Effekten auf Zellen ausüben, zum Beispiel die Induzierung von Wachstum oder Proliferation. Nicht-einschränkende Beispiele schließen die Interleukine(IL) IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, IL-13, IL-14 und IL-16; löslichen IL-2-Rezeptor, löslichen IL-6-Rezeptor; Erythropoietin (EPO); Thrombopoietin (TPO); Granulocyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (GM-CSF); Stammzellen-Faktor (SCF); Leukämie-inhibierenden Faktor (LIF); Interferone, Oncostatin M (OM); die Immunglobulin-Superfamilie; Tumor-Necrose-Faktor (TNF-Familie, insbesondere TNF-α; TGFβ und IL-1a; und die vaskuläre endotheliale Wachstumsfaktor(VEGF)-Familie, insbesondere VEGF (ebenfalls im Fachgebiet bezeichnet als VEGF-A), VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D und Plazenta-Wachstumsfaktor (PLGF), ein. Cytokine sind kommerziell von mehreren Herstellern erhältlich, einschließlich Amgen (Thousand Oaks, CA), Immunex (Seattle, WA) und Genentech (South San Francisco, CA). Besonders bevorzugt sind VEGF und TNF-α. Antikörper gegen TNF-α zeigen, dass die Blockierung von Wechselwirkung des TNF-α mit seinem Rezeptor nützlich bei der Modulierung der Überexpression von TNF-α in mehreren Krankheitszuständen ist, wie septischem Schock, rheumatoider Arthritis oder anderen Entzündungsprozessen. VEGF ist ein angiogener Induktor, ein Mediator von vaskulärer Permeabilität und ein Endothelzell-spezifisches Mitogen. VEGF ist auch in Tumoren impliziert worden. Targeting-Vertreter der VEGF-Familie und ihre Rezeptoren können signifikante therapeutische Anwendungen besitzen, zum Beispiel kann das Blockieren von VEGF therapeutischen Wert beim Eierstock-Hyperstimulations-Syndrom (OHSS) aufweisen. Es wird Bezug genommen auf N. Ferrara et al., (1999) Nat. Med. 5: 1359 und Gerber et al., (1999) Nat. Med. 5: 623. Andere bevorzugte Ziele schließen Zelloberflächenrezeptoren, wie T-Zellrezeptoren, ein.
  • Chemokine sind eine Familie von kleinen Molekülen, welche eine bedeutende Rolle beim Zell-Trafficking und bei der Entzündung spielen. Mitglieder der Chemokinfamilie schließen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, IL-8, Stroms-abgeleiteten Faktor-1 (SDF-1), Blutplättchenfaktor 4, Neutrophilen-aktivierendes Protein-2 (NAP-2) und Monocyte Chemoattractant Protein-1 (MCP-1) ein.
  • Andere Protein- und Chemikalien-Ziele schließen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, folgende ein: die Immunregulation modulierende Proteine, wie lösliches humanes Leukocyten-Antigen (HLA, Klasse I und/oder Klasse II, und nicht-klassisches Klasse-I-HLA (E, F und G)); Oberflächenproteine, wie lösliche T- oder B-Zelloberflächenproteine; humanes Serumalbumin; Arachadonsäure-Metaboliten, wie Prostaglandine, Leukotriene, Thromboxan und Prostacyclin; IgE, Auto- oder Alloantikörper für Autoimmunität oder Allo- oder Xenoimmunität, Ig-Fc-Rezeptoren oder Fc-Rezeptor-Bindungsfaktoren, G-Protein-gekoppelte Rezeptoren; Zelloberflächen-Kohlenhydrate; Angiogenese-Faktoren; Adhäsionsmoleküle, Ionen, wie Calcium, Kalium, Magnesium, Aluminium und Eisen; Fibrillenproteine wie Prionen und Tubulin; Enzyme wie Proteasen, Aminopeptidasen, Kinasen, Phosphatasen, DNAsen, RNAasen, Lipasen, Esterasen, Dehydrogenasen, Oxidasen, Hydrolasen, Sulphatasen, Cyclasen, Transferasen, Transaminasen, Carboxylasen, Decarboxylasen, Superoxiddismutase, und ihre natürlichen Substrate oder Analoge; Hormone und ihre entsprechenden Rezeptoren, wie Follikel-stimulierendes Hormon (FSH), luteinisierendes Hormon (LH), Thyroxin (T4 und T3), Apolipoproteine, Lipoprotein niedriger Dichte (LDL), Lipoprotein sehr niedriger Dichte (VLDL), Cortisol, Aldosteron, Östriol, Östradiol, Progesteron, Testosteron, Dehydroepiandrosteron (DHBA) und sein Sulfat (DHEA-S); Peptidhormone, wie Renin, Insulin, Calcitonin, Parathyroidhormon (PTH), menschliches Wachstumshormon (hGH), Vasopressin und antidiuretisches Hormon (AD), Prolactin, adrenocorticotropes Hormon (ACTH), LHRH, Thyrotropin-Releasing-Hormon (THRH), vasoaktives intestinales Peptid (VIP), Bradykinin und entsprechende Prohormone; Catecholamine, wie Adrena lin und Metabolite; Co-Faktoren, einschließlich atrionatriuretischen Faktor (AdF), Vitamine A, B, C, D, E und K, und Serotonin; Gerinnungsfaktoren, wie Prothrombin, Thrombin, Fibrin, Fibrinogen, Faktor VIII, Faktor IX, Faktor XI und von-Willebrand-Faktor; Plasminogenfaktoren, wie Plasmin, Komplement-Aktivierungs-Faktoren, LDL und Liganden davon, und Harnsäure; Verbindungen, welche die Gerinnung regulieren, wie Hirudin, Hirulog, Hementin, Hepurin und Gewebeplasminigen-Aktivator (TPA); Nukleinsäuren für die Gentherapie; Verbindungen, welche Enzymantagonisten sind; und Verbindungen, welche Liganden binden, wie Entzündungsfaktoren; und Rezeptoren und andere Proteine, welche an eines oder mehrere der vorgenannten Moleküle binden.
  • Nicht vom Menschen abgeleitete Ziele schließen, ohne Einschränkung, Arzneistoffe, insbesondere Arzneistoffe, welche einem Missbrauch unterliegen können, wie Cannabis, Heroin und andere Opiate, Phencyclidin (PCP), Barbiturate, Kokain und seine Derivate, und Benzadiazepin; Toxine, wie Schwermetalle, wie Quecksilber und Blei, Arsenik und radioaktive Verbindungen; chemotherapeutische Mittel, wie Paracetamol, Digoxin und freie Radikale; bakterielle Toxine, wie Lipopolysaccharide (LPS) und andere gramnegative Toxine, Staphylococcus-Toxine, Toxin A, Tetanus-Toxine, Diphtherie-Toxin und Pertussis-Toxine; Pflanzen- und Meeres-Toxine; Schlangen- und andere Gifte, Virulenzfaktoren, wie Aerobactine oder pathogene Mikroben; infektiöse Viren, wie Hepatitis, Cytomegalovirus (CMV), Herpes simplex-Virus (HSV-Typen 1, 2 und 6), Epstein-Barr-Virus (EBV), Varicella-Zoster-Virus (VZV), humanes Immundefizienz-Virus (HIV-1, -2) und andere Retroviren, Adenovirus, Rotavirus, Influenzae, Rhinovirus, Parvovirus, Röteln, Masern, Polio, Pararyxovirus, Papovavirus, Pockenvirus und Picornavirus, Prionen, Plasmodien-Gewebefaktoren, Protozoen, wie Entamoeba histolitica, Filaria, Giardia, Kalaazar und Toxoplasma; Bakterien, gramnegative Bakterien, die verantwortlich sind für Sepsis und nosocomiale Infektionen, wie E. coli, Acynetobacter, Pseudomonas, Proteus und Klebsiella, ebenfalls grampositive Bakterien, wie Staphylococcus, Streptococcus, Meningococcus und Llycobacteria, Chlamydiae Legionnella und Anaerobes; Pilze wie Candida, Pneumocystis, Aspergillus, und Mycoplasma, ein.
  • In einem Aspekt schließt des Ziel ein Enzym ein, wie Proteasen, Aminopeptidasen, Kinasen, Phosphatasen, DNAsen, RNAsen, Lipasen, Esterasen, Dehydrogenasen, Oxidasen, Hydrolasen, Sulfatasen, Zellulasen, Cyclasen, Transferasen, Transaminasen, Carboxylasen, Decarboxylasen, Superoxiddismutase und ihre natürlichen Substrate oder Analoge. Besonders bevorzugte Enzyme schließen Hydrolasen, insbesondere alpha/beta-Hydrolasen; Serinproteasen, wie Subtilisine, und Chymotrypsin-Serinproteasen; Cellulasen und Lipasen ein.
  • In einer anderen Ausführungsform ist das Ziel ein nicht-biologisches Material. In einer anderen Ausführungsform ist das nicht-biologische Material ein Textil bzw. Gewebe. In einer anderen Ausführungsform ist das Textil ein natürliches Gewebe. In einer weiteren Ausführungsform ist das Textil Baumwolle. In einer anderen Ausführungsform handelt es sich bei dem Textil um Sei de. In einer anderen Ausführungsform ist das Textil Wolle. In einer weiteren Ausführungsform ist das Textil ein nicht-natürliches Gewebe. In einer anderen Ausführungsform ist das Textil Nylon. In einer anderen Ausführungsform ist das Textil Rayon. In einer anderen Ausführungsform ist das Textil Polyester. In einer anderen Ausführungsform ist das nicht-biologische Material ein Kunststoff. In einer anderen Ausführungsform ist das nicht-biologische Material eine Keramik. In einer anderen Ausführungsform ist das nicht-biologische Material ein Metall. In einer anderen Ausführungsform ist das nicht-biologische Material Kautschuk bzw. Gummi.
  • In einer anderen Ausführungsform ist das Ziel ein Mikroschaltkreis. Dieser Schaltkreis kann in seiner fertiggestellten Form oder in einem beliebigen Stadium der Schaltkreis-Herstellung vorliegen. Das zielgerichtete Enzym kann verwendet werden, um eine Ablagerung einer Verbindung auf dem Schaltkreis zu entfernen, zum Beispiel ein n-Typ-Dotierungsmittel (z. B. Arsen-, Phosphor-, Antimon-, Titan- oder andere Donor-Atomspezies) oder ein p-Typ-Dotierungsmittel (z. B. Bor-, Aluminium-, Gallium-, Indium- oder sonstige Akzeptor-Atomspezies); siehe z. B. van Zant, 2000, Microchip Fabrication, McGraw-Hill, New York, worauf hierin in seiner Gesamtheit Bezug genommen wird.
  • In einer anderen Ausführungsform ist das Ziel nicht ein Antikörper (z. B. ein polyklonaler Antikörper, ein monoklonaler Antikörper, ein scFv oder ein anderes antigenbindendes Fragment eines Antikörpers).
  • THERAPIE MIT ZIELGERICHTETEM ENZYM UND PROARZNEISTOFF
  • Hier wird ein Verfahren zur Behandlung eines Subjekts durch Verabreichen eines zielgerichteten Enzyms und eines Proarzneistoffs offenbart, wobei das zielgerichtete Enzym spezifisch auf einen Bereich des Körpers des Subjekts lokalisiert wird, in welchem es den Proarzneistoff in einen aktiven Arzneistoff umwandelt. Beispiele für Kombinationen von Enzym/Proarzneistoff/aktiver Arzneistoff finden sich z. B. in Bagshawe et al., Current Opinions in Immunology, 11: 579–83 (1999); Wilman, "Prodrugs In Cancer Chemotherapy", Biochemical Society Transactions, 14. S. 375–82 (615. Tagung, Belfast 1986) und V. J. Stella et al., "Prodrugs: A Chemical Approach To Targeted Drug Delivery", Directed Drug Delivery, R. Borchardt et al. (Hrsg.) S. 247–67 (Humana Press 1985). In einer Ausführungsform ist der Proarzneistoff ein Peptid. Beispiele von Peptiden als Proarzneistoffe kann man finden in Trouet et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79: 626 (1982), und Umemoto et al., Int. J. Cancer 43: 677 (1989). Diese und andere Berichte zeigen, dass Peptide in Blut ausreichend stabil sind. Ein anderer Vorteil von Peptid-abgeleiteten Proarzneistoffen besteht darin, dass ihre Aminosäuresequenzen ausgewählt werden können, um geeignete pharmakologische Eigenschaften zu vermitteln, wie Halbwertszeit, Gewebeverteilung und geringe Toxizität gegenüber den aktiven Arzneistoffen. Die meisten Berichte von peptid-abgeleiteten Proarzneistoffen beruhten auf einer relativ nicht-spezifischen Aktivierung des Proarzneistoffs, beispielsweise durch lysosomale Enzyme. Kürzlich wurde es berichtet, dass ein Peptid-Arzneistoff-Konjugat spezifisch durch Prostata-spezifisches Antigen (PSA) an einer Tumorstelle gespalten wurde; siehe DeFeo-Jones et al., Nat. Med. 6: 1248 (2000). Dieser Bericht zeigt, dass die Aktivierung von Peptid-Proarzneistoffen an der Tumorstelle ein wirkungsvoller Weg ist, um die Selektivität eines Antikrebsmittels zu erhöhen.
  • Der Proarzneistoff kann ein solcher sein, welcher in mehr als einem Schritt zu einem aktiven Arzneistoff umgewandelt wird. Zum Beispiel kann der Proarzneistoff durch das zielgerichtete Enzym in einen Vorläufer eines aktiven Arzneistoffs umgewandelt werden. Der Vorläufer kann in den aktiven Arzneistoff umgewandelt werden, beispielsweise durch die katalytische Aktivität von einem oder mehreren zusätzlichen zielgerichteten Enzymen, die katalytischen Aktivitäten von einem oder mehreren nicht-zielgerichteten Enzymen, welche dem Subjekt verabreicht werden, die katalytische Aktivität von einem oder mehreren Enzymen, die natürlicherweise in dem Subjekt oder an der Zielstelle im Subjekt vorhanden sind (z. B. ein Protease, eine Phosphatase, eine Kinase oder eine Polymerase), durch einen Arzneistoff, welcher an das Subjekt verabreicht wird, oder durch einen chemischen Prozess, der nicht enzymatisch katalysiert wird (z. B. Oxidation, Hydrolyse, Isomerisierung, Epimerisierung).
  • Arzneistoffe
  • Die meisten Studien, welche Proarzneistoffe beinhalten, werden erstellt, nachdem Programme mit existierenden Arzneistoffen als problematisch befunden wurden. Insbesondere wurden Antikrebs-Arzneistoffe im Allgemeinen durch einen sehr niedrigen therapeutischen Index gekennzeichnet. Durch Umwandeln dieser Arzneistoffe zu Proarzneistoffen mit verringerter Toxizität und danach selektives Aktivieren derselben im erkrankten Gewebe wurde der therapeutische Index des Arzneistoffs signifikant reduziert; siehe z. B. Melton et al., Enzyme-prodrug strategies for cancer therapy (1999), und Niculescu-Duvaz et al., Anticancer Drug Des. 14: 517 (1999).
  • Die Erfindung gestattet es dem Fachmann auf dem Gebiet, die Spezifität eines Enzyms weiter zu entwickeln, um sogar Strukturen aufzunehmen, welche schlechte Substrate für natürlich vorkommende Enzyme sein würden. Somit können Proarzneistoffe entworfen werden, selbst obwohl die Arzneistoffe anderweitig nicht einer Proarzneistoff-Strategie zugänglich waren.
  • Curnis et al., Nat. Biotechnol. 18: 1185 (2000) zeigten, dass das Cytokin TNFα, wenn es selektiv gegen Tumor-Gefäßsysteme zielgerichtet wurde, einen starken Antitumor-Effekt aufzeigte. Ansonsten wird die systemische Zuführung von TNFα durch seine Toxizität beeinträchtigt. Andere Cytokine weisen der Wahrscheinlichkeit nach ähnliche Einschränkungen auf. Die vorliegende Erfindung ermöglicht den Entwurf von Cytokin-basierenden Proarzneistoffen, welche selektiv im erkrankten Gewebe durch ein zielgerichtetes Enzym aktiviert werden.
  • Eine Reihe von Untersuchungen ist mit Toxinen durchgeführt worden, welche an Targeting-Agenzien (üblicherweise Antikörper oder Antikörperfragmente) gekoppelt waren; siehe z. B. Torchilin, Eur. J. Pharm. Sci. 11 Suppl. 2: S81 (2000) und Frankel et al., Clin. Cancer. Res. 6: 326 (2000). Eine Alternative zum oben Genannten besteht darin, diese Toxine in Proarzneistoffe umzuwandeln und sie dann selektiv im erkrankten Gewebe freizusetzen.
  • Proarzneistoffe
  • Die Proarzneistoffe dieser Erfindung schließen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, Phosphat enthaltende Proarzneistoffe, Thiophosphat enthaltende Proarzneistoffe, Sulfat enthaltende Proarzneistoffe, Peptid enthaltende Proarzneistoffe, D-Aminosäure-modifizierte Proarzneistoffe, glycosylierte Proarzneistoffe, β-Lactam enthaltene Proarzneistoffe, wahlfrei substituierte Phenoxyacetamid enthaltene Proarzneistoffe oder wahlfrei substituierte Phenylacetamid enthaltende Proarzneistoffe, 5-Fluorcytosin- und andere 5-Fluoridin-Proarzneistoffe, welche durch das Enzym des Konjugats in den aktiveren cytotoxischen freien Arzneistoff umgewandelt werden können, ein. Beispiele für cytotoxische Arzneistoffe, welche zur Verwendung in dieser Erfindung in eine Proarzneistoff-Form abgewandelt werden können, schließen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, Etoposid, Temposid, Adriamycin, Daunomycin, Carminomycin, Aminopterin, Dactinomycin, Mitomycine, Cis-Platinum- und Cis-Platinum-Analoga, Bleomycine, Esperamicine (siehe U. S.-Patent Nr. 4 675 187 ), 5-Fluorouracil, Melphalan, andere verwandte Stickstofflost-Substanzen, und Derivate davon ein; sehe z. B. U.S.-Patent Nr. 4 975 278 .
  • In einer Ausführungsform der Erfindung ist das nicht-zielgerichtete Enzym eine alkalische Phosphatase (AP), welche ein 4'-Phosphatderivat der Epipodophyl-Lotoxin-Glucoside in einen aktiven Antikrebs-Arzneistoff umwandelt. Derartige Derivate schließen Etoposid-4'-Phosphat, Etoposid-4'-thiophosphat und Teniposid-4'-phosphat ein. Andere Ausführungsformen der Erfindung können Phosphatderivate dieser Glucoside einschließen, worin die Phosphatgruppe an anderen Hydroxylgruppen auf den Glucosiden platziert ist. In einer weiteren Ausführungsform jedoch ist das als ein Proarzneistoff in dieser Erfindung verwendete Phosphatderivat Etoposid-4'-phosphat oder Etoposid-4'-thiophosphat. Die zielgerichtete AP entfernt die Phosphatgruppe von dem Proarzneistoff, wobei ein aktives Antitumormittel freigesetzt wird. Das Mitomycin-Phosphat-Proarzneimittel dieser Ausführungsform kann ein N7-C1-8-Alkylphosphatderivat von Mitomycin C oder Porfiromycin, oder pharmazeutisch annehmbaren Salzen davon, sein. N7 bezieht sich auf das Stickstoffatom, angeheftet an die 7-Position des Mitosan-Kerns des Stammform-Arnzeistoffs. Gemäß einer anderen Ausführungsform ist das verwendete Derivat 7-(2'-Aminoethylphosphat)mitomycin ("MOP"). In alternativer Weise kann die MOP-Verbindung als 9a-Methoxy-7-[[(phosphonooxy)ethyl]amino]mitosan-dinatriumsalz bezeichnet werden. Andere Ausführungsformen der Erfindung können die Verwendung von N7-Alkylmitomycin-Phosphorthioaten als Proarzneistoffe einschließen.
  • In einer noch anderen Ausführungsform der Erfindung kann ein Penicillinamidase-Enzym als das nicht-zielgerichtete Enzym verwendet werden, welches einen neuen Adriamycin-Proarzneistoff zu dem aktiven Antitumor-Arzneistoff Adriamycin umwandelt. In einer weiteren Ausführungsform ist die Penicillinamidase eine aus Fusarium oxysporum isolierte Penicillin V-Amidase ("PVA"), welche Phenoxyacetyl-Amidbindungen hydrolysiert. Der verwendete Proarzneistoff kann N-(p-Hydroxyphenoxyacetyl)adriamycin ("APO") sein, welches durch die Amidase hydrolysiert wird, um das wirkungsvolle Antitumormittel Adriamycin freizusetzen.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst des Weiteren beispielsweise die Verwendung des Adriamycin-Proarzneistoffs N-(p-Hydroxyphenoxyacetyl)adriamycin und anderer verwandtere Adriamycin-Proarzneistoffe, welche im Wesentlichen auf die gleiche Weise derivatisiert sein können. Zum Beispiel liegt auch die Verwendung des Proarzneistoffs N-(Phenoxyacetyl)-Adriamycin innerhalb des Umfangs der Erfindung. Darüber hinaus versteht es sich, dass die Adriamycin-Proarzneistoffe dieser Erfindung andere N-Hydroxyphenoxyacetyl-Derivate von Adriamycin einschließen, z. B. substituiert an anderen Positionen des Phenylrings, sowie N-Phenoxyacetyl-Derivate, enthaltend Substituenten auf dem Phenylring, verschieden von der hierin beschriebenen Hydroxylgruppe.
  • Weiterhin umfasst die vorliegende Ausführungsform die Verwendung von anderen Amidasen, wie Penicillin-G-Amidase, als dem nicht-zielgerichteten Enzym, sowie anderer Proarzneistoffe, die entsprechend so derivatisiert sind, dass die jeweilige Amidase diesen Proarzneistoff zu einer aktiven Antitumor-Form hydrolysieren kann. Wenn zum Beispiel eine Penicillin-G-Amidase als das nicht-zielgerichtete Enzym verwendet wird, sollte der Proarzneistoff eine Phenylacetylamid-Gruppe (im Gegensatz zu der Phenoxyacetylamid-Gruppe von APO) enthalten, weil Penicillin-G-Amidasen diesen Typ von Amidbindung hydrolysieren (siehe z. B. A. L. Margolin et al., Biochim. Biophys. Acta. 616, S. 283–89 (1980)). Somit schließen andere Proarzneistoffe der Erfindung N-(p-Hydroxyphenylacetyl)adriamycin, N-(Phenylacetyl)adriamycin und andere wahlfrei substituierte N-Phenylacetyl-Derivate von Adriamycin ein.
  • Es versteht sich ebenfalls, dass die vorliegende Erfindung, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, einen beliebigen Proarzneistoff einschließt, abgewandelt durch Umsetzen der Amingruppe des Stammformarzneistoffs mit der Carboxylgruppe von Phenoxyessigsäure, Phenylessigsäure oder anderen verwandten Säuren. Daher liegen Proarzneistoffe von anderen Anthracyclinen als Adriamycin, welche in der Lage sind, derivatisiert zu werden und im Wesentlichen in der gleichen Weise wie die hierin beschriebenen Adriamycin-Proarzneistoffe zu wirken, innerhalb des Umfangs dieser Erfindung. Zum Beispiel schließen andere Proarzneistoffe, welche gemäß dieser Erfindung hergestellt und verwendet werden können, Hydroxyphenoxyacetylamid-Derivate, Hydroxyphenylacetylamid-Derivate, Phenoxyacetylamid-Derivate und Phenylacetylamid-Derivate von Anthracyclinen, wie Daunomycin und Carminomycin, ein. Andere aminhaltige Arzneistoffe, wie Melphalan, Mitomycin, Aminopterin, Bleomycin und Dactinomycin können ebenfalls, wie hierin beschrieben, modifiziert werden, um Proarzneistoffe der Erfindung zu erhalten.
  • Noch eine andere Ausführungsform der Erfindung beinhaltet eine zielgerichtete Enzymform des Enzyms Cytosindesaminase ("CD"). Das Desaminase-Enzym katalysiert die Umwandlung von 5-Fluorcytosin ("5-FC"), einer Verbindung, der antineoplastische Aktivität fehlt, in das wirkungsvolle Antitumor-Arzneimittel 5-Fluoruracil ("5-FU").
  • Hier wird ein Verfahren zur Kombinations-Chemotherapie unter Verwendung mehrerer Proarzneistoffe und eines einzelnen zielgerichteten Enzyms offenbart. Gemäß dieser Ausführungsform wird eine Reihe von Proarzneistoffen verwendet, welche alle Substrate für dasselbe zielgerichtete Enzym sind. Somit wandelt ein jeweiliges zielgerichtetes Enzym eine Anzahl von Proarzneistoffen in eine cytotoxische Form um, was zu einer erhöhten Antitumor-Aktivität an der Tumorstelle führt.
  • Gemäß einer anderen Ausführungsform wird eine Reihe von unterschiedlichen zielgerichteten Enzymen verwendet. Jedes zielgerichtete Enzym kann verwendet werden, um seinen jeweiligen Proarzneistoff oder Proarzneistoffe an der Ziel-Tumorstelle in die aktive Form umzuwandeln.
  • Hier offenbart wird die Verwendung einer Anzahl von zielgerichteten Enzymen, wobei das von den Enzymen gebundene Ziel variiert, d. h. eine Anzahl von zielgerichteten Enzymen wird verwendet, wobei jedes Einzelne spezifisch an ein anderes Ziel von Interesse bindet. Die katalytischen Aktivitäten der zielgerichteten Enzyme können gleich sein oder können variieren. Diese Ausführungsform kann besonders nützlich in Situationen sein, worin beispielsweise die Mengen der verschiedenen Ziele auf der Oberfläche eines Tumors unbekannt sind, und es gewünscht wird, sicherzugehen, dass ausreichend Enzym zur Tumorstelle zielgelenkt wird. Die Verwendung einer Anzahl von zielgerichteten Enzymen, welche unterschiedliche Ziele auf dem Tumor erkennen, erhöht die Wahrscheinlichkeit des Erhaltens von ausreichend Enzym an der Tumorstelle für die Umwandlung eines Proarzneistoffs oder einer Reihe von Proarzneistoffen. Darüber hinaus ist diese Ausführungsform bedeutsam zur Erzielung eines hohen Ausmaßes an Spezifität für den Tumor, weil die Wahrscheinlichkeit, dass normales Gewebe alle der gleichen Tumorassoziierten Antigene besitzen wird, gering ist (vgl. I. Hellstrom et al., "Monoclonal Antibodies To Two Determinants Of Melanoma-Antigen p97 Act Synergistically In Complement-Dependent Cytotoxicity", J. Immunol., 127 (Nr. 1), S. 157–160 (1981)).
  • In einer anderen Ausführungsform wird ein zielgerichtetes Enzym verwendet, welches an eine Vielzahl von Zielen auf einer erkrankten Zelle bindet. In einer weiteren Ausführungsform umfasst das zielgerichtete Enzym eine Vielzahl von Targeting-Stellen, von denen jede an ein unterschiedliches Ziel auf der erkrankten Zelle bindet. Das zielgerichtete Enzym bindet relativ schwach an Zellen, welche weniger als alle der Ziele aufweisen, aber relativ stark an Zellen, welche alle der Ziele aufweisen.
  • Es besteht häufig eine Anforderung zur Verlängerung der Blutkreislauf-Halbwertszeiten von pharmazeutischen Peptiden, Proteinen oder kleinen Molekülen. Typischerweise erfordern kurze Halbwertszeiten, welche Minuten bis Stunden dauern, nicht nur häufige, sondern auch hohe, Dosen für den therapeutischen Effekt, oftmals so hoch, dass die anfänglichen Peak-Dosen Nebenwirkungen verursachen. Die Verlängerung der Halbwertszeit derartiger Therapeutika gestattet geringere, weniger häufige und dadurch potenziell sicherere Dosierungen, welche kostengünstiger herzustellen sind. Früher haben Wissenschaftler die Proteinhalbwertszeit erhöht, indem sie selbige kovalent an PEG, siehe U. S.-Patent Nr. 5 711 944 , humanes Blutserumalbumin, siehe U. S.-Patent Nr. 5 766 883 , oder Fc-Fragmente, siehe WO 00/24782 , fusionierten. Weiterhin ist ein nicht-spezifisches Targeting von Arnzeistoffen an humanes Serumalbumin durch chemisches Koppeln von Arzneistoffen in vivo bewirkt worden; siehe U. S.-Patent 5 843 440 . Darüber hinaus, im Fall von Krebsarzneistoffen, ist es vorgeschlagen worden, dass Arzneistoffe von hohem Molekulargewicht sich aufgrund gesteigerter Permeabilität und Retention in Tumoren lokalisieren können. Deshalb kann eine Verbesserung hinsichtlich des therapeutischen Index eines Arzneistoffs erhalten werden, indem der Arzneistoff an ein Protein oder sonstiges Polymer von hohem Molekulargewicht verknüpft wird.
  • Allerdings weisen die Verfahren des Stands der Technik zum Stabilisieren von Protein- und Peptid-Therapeutika oder zum Erhöhen der Größe von Krebs-Therapeutika mehrere Einschränkungen auf. Diese Verfahren leiden unter einem Mangel an Spezifität, welcher bei der chemischen Kopplung beteiligt ist. Es besteht auch eine inhärente Einschränkung von C- und N-terminalen Fusionen im Fall von Fusionspeptiden, da nur zwei Anknüpfungs-Stellen möglich sind. Darüber hinaus kann die Proteinproduktion von HSA-Konjugaten im großen Maßstab problematisch sein. Es besteht eine geringe oder gar keine Freisetzung von kovalent fusionierten Therapeutika, sodass die pharmakodynamischen Eigenschaften des therapeutischen Konstrukts nicht ohne Weiteres gesteuert werden können. Darüber hinaus erhöhen alle dieser Verfahren die Zeit und die Anstrengungen, welche erforderlich sind, um stabile Therapeutika zu identifizieren, beträchtlich, da sie nicht von modularer Natur sind.
  • In einer Ausführungsform sieht die vorliegende Erfindung ein Verfahren vor, um ein therapeutisches Peptid, Protein oder kleines Molekül selektiv zu stabilisieren durch nicht-kovalentes Targeting des Therapeutikums in ortsspezifischer Weise zu humanem Serumalbumin (HSA). Unter Verwendung selektiver Targetingverfahren konnten Peptidsequenzen, welche selektiv mit hoher Affinität und hoher Selektivität an Serumalbumin binden, identifiziert werden. Kurz gesagt, wird HSA-abgereichertes Blut mit einer Bibliothek von Molekülen, vorzugsweise Peptiden, inkubiert. Peptide, welche nicht an HSA-abgereichertes Blut binden, werden dann mit immobilisiertem HSA inkubiert, gründlich gewaschen, und HSA-bindende Peptide werden dann identifiziert. Die Peptide werden zur Verwendung als ein Therapeutikum weiter optimiert, z. B. um ihre immunologische Antwortreaktion, proteolytische Empfindlichkeit in Blut zu beschränken, oder für die Leichtigkeit der Herstellung. Eine Fusion dieser kleinen Peptide an Therapeutika von Interesse erhöht die Halbwertszeit oder den therapeutischen Index des Arzneistoffs beträchtlich. Darüber hinaus kann das Peptid-Arzneistoff-Konjugat viel einfacher zu verabreichen sein. Protease-Spaltungsstellen können zwischen dem HSA-Targeting-Peptid und dem Arzneistoff oder Therapeutikum eingebracht werden. Wenn diese HSA-zielgerichteten Arzneistoffe in das Blut verabreicht werden, bindet das Arzneistoffkonjugat selektiv an HSA und könnte basierend auf den physikalisch entworfenen Eigenschaften des Bindungsmittels (kon & koff im Blut) oder durch enzymatische Spaltung oder Aktivierung freigesetzt werden. Diese Vorgehensweise kann auf das Targeting von anderen langlebigen Blutproteinen erweitert werden, einschließlich zum Beispiel Fc-Fragmenten, α2-Makroglobulin, Steroiden und Erythrocyten.
  • Das Gefäßsystem in Krebsgewebe zeigt eine höhere Diffusivität bzw. Diffusionsfähigkeit als normal; siehe Yuan et al., Cancer Res. 55: 3752 (1995). Darüber hinaus ist die Diffusivität von Makromolekülen im interstitiellen Raum von Tumoren relativ hoch im Vergleich zu normalen Geweben; siehe Jain, Cancer Res. 47: 3039 (1987).
  • Ein jüngerer Übersichtsartikel fasst experimentelle Ergebnisse zusammen, welche demonstrieren, dass die erhöhte Diffusivität von Tumoren durch Entwerfen von makromolekularen Proarzneistoffen ausgebeutet werden kann, insbesondere basierend auf einer Kopplung an PEG; siehe Greenwald et al., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 17: 101 (2000). Allerdings beruhen diese Proarzneistoffe für ihre Aktivierung entweder auf der chemischen Labilität des Linkers oder auf ziemlich nicht-spezifischen Enzymen in der Tumorstelle. Diese Vorgehensweise kann signifikant verbessert werden durch Zielrichten eines selektiven Enzyms zu der Tumorstelle, welche den makromolekularen Teil des Proarzneistoffs abspalten und diesen somit freisetzen kann. Diese Vorgehensweise ermöglicht Proarzneistoffe mit sehr niedriger Toxizität aufgrund ihres makromolekularen Pro-Anteils, welcher den Proarzneistoff aus den meisten Geweben heraushält und den Eintritt des Proarzneistoffs in die meisten Zellen verhindert. Darüber hinaus kann man den Linker-Teil so entwerfen, dass er sehr stabil ist, um eine Arzneistoffaktivierung in nichtzutreffenden Geweben zu verhindern.
  • Hierin wird ein Verfahren zur Behandlung eines Zustands in einem Subjekt offenbart, umfassend das Verabreichen eines zielgerichteten Enzyms mit β-Lactamase-Aktivität und eines Proarzneistoffs an das Subjekt. In einer anderen Ausführungsform ist das zielgerichtete Enzym auf eine Krebszelle, -Gewebe, einen Tumor oder Organ zielgerichtet. In einer anderen Ausführungsform handelt es sich bei dem Krebs um ein Melanom oder ein Karzinom. In einer anderen Ausführungsform wird der Proarzneistoff von dem zielgerichteten Enzym in einen aktiven Arzneistoff umgewandelt. In einer anderen Ausführungsform ist der aktive Arzneistoff ein Alkylierungsmittel. In einer anderen Ausführungsform ist der Proarzneistoff ein Antikrebs-Stickstofflost- Proarzneistoff. In einer anderen Ausführungsform ist der aktive Arzneistoff Melphalan. In einer anderen Ausführungsform ist der Proarzneistoff C-Mel; siehe Kerr et al., Bioconjugate Chem. 9: 255–59 (1998). In einer anderen Ausführungsform handelt es sich bei dem Proarzneistoff um Vinca-Cephalosporin oder Doxorubicin-Cephalosporin; siehe Bagshawe et al., Current Opinion in Immunology, 11: 579–83 (1999). Andere Proarzneistoffe/Enzym-Kombinationen, welche in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, schließen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, diejenigen ein, welche man findet in U.S.-Patent Nr. 4 975 278 und Melton et al., Enzyme-Prodrug Strategies for Cancer Therapy Kluwer Aceademic/Plenum Publishers, New York (1999).
  • Die Liste von Kandidaten für den Pro-Anteil der Proarzneistoffe ist umfangreich und vielfältig, und viele sind dem Fachmann auf dem Gebiet durchaus bekannt.
  • NUKLEINSÄUREN UND VERFAHREN ZUR EXPRESSION VON ZIELGERICHTETEN ENZYMEN
  • In einem anderen Aspekt sieht die vorliegende Erfindung eine Nukleinsäure vor, codierend ein zielgerichtetes Enzym. Die Nukleinsäure kann beispielsweise eine DNA oder eine RNA sein. Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls ein Plasmid bereit, welches eine Nukleinsäure umfasst, die ein zielgerichtetes Enzym codiert. Das Plasmid kann zum Beispiel ein Expressionsplasmid sein, welches die Expression des zielgerichteten Enzyms in einer Wirtszelle oder einem Wirtsorganismus oder in vitro erlaubt. Der Expressionsvektor kann die Expression des zielgerichteten Enzyms zum Beispiel in einer Bakterienzelle gestatten. Die Bakterienzelle kann zum Beispiel eine E. coli-Zelle sein.
  • Aufgrund der Redundanz im genetischen Code codiert typischerweise eine große Zahl von DNA-Sequenzen jedwede gegebene Aminosäuresequenz, und ist/sind in diesem Sinne, äquivalent. Wie nachstehend beschrieben, kann es wünschenswert sein, eine oder eine andere äquivalente DNA-Sequenz(en) zur Verwendung in einem Expressionsvektor auszuwählen, basierend auf der bevorzugten Codon-Verwendung der Wirtszelle, in welche der Expressionsvektor eingeführt werden wird. Mit der vorliegenden Erfindung wird beabsichtigt, alle DNA-Sequenzen einzuschließen, welche das zielgerichtete Enzym codieren.
  • Die Herstellung des zielgerichteten Enzyms der Erfindung kann unter Verwendung eines rekombinanten Expressionsklons durchgeführt werden. Die Konstruktion des rekombinanten Expressionsklons, die Transformation einer Wirtszelle mit dem Expressionsklon und die Kultivierung der transformierten Wirtszellen unter Bedingungen, welche die Expression fördern, können in einer Vielzahl von Weisen unter Anwendung von im Fachgebiet gut verstandenen Techniken der Molekularbiologie ausgeführt werden. Verfahren für jeden dieser Schritte sind im Allgemeinen nachstehend beschrieben. Bevorzugte Verfahren werden ausführlich in den Beispielen beschrieben.
  • Ein funktionsfähiger Expressionsklon wird konstruiert, indem die codierende Sequenz in funktionstüchtiger Verknüpfung mit geeigneten Steuerungssequenzen in einem Expressionsvektor angeordnet wird. Der Vektor kann ausgelegt sein, um autonom in der Wirtszelle zu replizieren oder in die chromosomale DNA der Wirtszelle zu integrieren. Der resultierende Klon wird verwendet, um einen geeigneten Wirt zu transformieren, und der transformierte Wirt wird unter Bedingungen kultiviert, welche zur Expression der codierenden Sequenz geeignet sind. Das exprimierte zielgerichtete Enzym wird aus dem Medium oder aus den Zellen isoliert, obwohl eine Gewinnung und Reinigung des zielgerichteten Enzyms in manchen Fällen nicht notwendig sein muss.
  • Die Konstruktion von geeigneten Klonen, enthaltend die codierende Sequenz und eine geeignete Steuerungssequenz, wendet standardmäßige Ligations- und Restriktionstechniken an, welche im Fachgebiet allgemein verstanden werden. Im Allgemeinen werden isolierte Plasmide, DNA-Sequenzen oder synthetisierte Oligonukleotide gespalten, modifiziert und in der gewünschten Form religiert. Geeignete Restriktionsstellen können, falls normalerweise nicht verfügbar, an den Enden der codierenden Sequenz so angeregt werden, dass die Konstruktion eines Expressionsklons erleichtert wird.
  • Eine stellenspezifische DNA-Spaltung wird durch Behandlung mit einem geeigneten Restriktionsenzym (oder -enzymen) unter Bedingungen durchgeführt, welche im Fachgebiet allgemein verstanden und von den Herstellern vom im Handel erhältlichen Restriktionsenzymen angegeben werden; siehe z. B. die Produktkataloge von Amersham (Arlington Heights, IL), Roche Molecular Biochemicals (Indianapolis, In) und New England Biolabs (Beverly, MA). Im Allgemeinen wird etwa 1 μg Plasmid oder andere DNA von einer Unit Enzym in etwa 20 μl Pufferlösung gespalten; in den nachstehenden Beispielen wird im Allgemeinen ein Überschuss an Restriktionsenzym verwendet, um einen vollständigen Verdau der DNA zu gewährleisten. Inkubationszeiten von etwa einer bis zwei Stunden bei einer Temperatur, welche für das jeweilige Enzym optimal ist, sind typisch. Nach jeder Inkubation wird Protein durch Extraktion mit Phenol und Chloroform entfernt; dieser Extraktion kann eine Ether-Extraktion und Gewinnung der DNA aus wässrigen Fraktionen durch Fällung mit Ethanol folgen. Falls gewünscht, kann eine Größen-Trennung der gespaltenen Fragmente durch Polyacrylamidgel- oder Agarosegel-Elektrophorese unter Anwendung von Standardtechniken durchgeführt werden; sehe z. B. Maxam et al., 1980, Methods in Enzymology 65: 499–560.
  • Restriktionsenzym-gespaltene DNA-Fragmente mit einzelsträngigen "überhängenden" Termini bzw. Enden können glattendig (doppelsträngige Enden) gemacht werden, zum Beispiel durch Behandlung mit dem großen Fragment von E. coli-DNA-Polymerase I (Klenow) in Gegenwart der vier Desoxynukleosidtriphosphate (dNTPs) unter Anwenden von Inkubationszeiten von etwa 15 bis 25 Minuten bei 20°C bis 25°C in 50 mM Tris, pH 7,6, 50 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT und 5 bis 10 μM dNTPs. Das Klenow-Fragment füllt an 5'-hervorstehenden Enden auf, baut aber hervorstehende 3'-Einzelstränge ab, selbst, obwohl die vier dNTPs vorhanden sind. Falls gewünscht, kann eine selektive Reparatur durchgeführt werden durch Bereitstellen von einem oder mehreren ausgewählten dNTPs innerhalb der Beschränkungen, welche von der Natur der hervorstehenden Enden diktiert werden. Nach Behandlung mit Klenow wird die Mischung mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit Ethanol gefällt. Ähnliche Ergebnisse können unter Verwendung von S1-Nuklease erzielt werden, weil die Behandlung unter passenden Bedingungen mit S1-Nuklease zur Hydrolyse von jedwedem einzelsträngigen Abschnitt einer Nukleinsäure führt.
  • Ligationen können ausgeführt werden, zum Beispiel, in 15–30 μl großen Volumina unter den folgenden standardmäßigen Bedingungen und Temperaturen: 20 mM Tris-Cl, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 33 μg/ml BSA, 10–50 mM NaCl und entweder 40 μM ATP und 0,01–0,02 (Weiss-)Units T4-DNA-Ligase bei 0°C (für die Ligation von Fragmenten mit komplementären einzelsträngigen Enden) oder 1 mM ATP und 0,3–0,6 Units T4-DNA-Ligase bei 14°C (für "glattendige" Ligation). Intermolekulare Ligationen von Fragmenten mit komplementären Enden werden üblicherweise bei Gesamt-DNA-Konzentrationen von 33–100 μg/ml (5–100 nM Gesamt-Endenkonzentration) durchgeführt. Intermolekulare Glattenden-Ligationen (üblicherweise unter Verwendung eines 20- bis 30-fachen molaren Überschusses an Linker, wahlfrei) werden bei einer Gesamt-Endenkonzentration von 1 μM durchgeführt.
  • Bei der Vektorkonstruktion wird das Vektorfragment üblicherweise mit bakterieller oder Kälberdarm-Alkalischer-Phosphatase (BAP oder CIAP) behandelt, um das 5'-Phosphat zu entfernen und eine Religation und Rekonstruktion des Vektors zu verhindern. BAP- und CIAP-Verdau-Bedingungen sind im Fachgebiet allgemein bekannt, und üblicherweise begleiten veröffentlichte Protokolle die im Handel erhältlichen BAP- und CIAP-Enzyme. Um die Nukleinsäurefragmente zurückzugewinnen, wird die Präparation mit Phenol-Chloroform extrahiert und mit Ethanol gefällt, um die Phosphatase zu entfernen und die DNA zu reinigen. Alternativ dazu kann eine Religation von unerwünschten Vektorfragmenten verhindert werden durch Restriktionsenzym-Verdau vor oder nach der Ligation, falls geeignete Restriktionsstellen verfügbar sind.
  • Korrekte Ligationen für die Plasmidkonstruktion können unter Verwendung jedwedes geeigneten, im Fachgebiet bekannten, Verfahrens bestätigt werden. Zum Beispiel können korrekte Ligationen für die Plasmidkonstruktion bestätigt werden, zuerst durch Transformieren eines geeigneten Wirtes, wie des E. coli-Stamms DG101 (ATCC 47043) oder des E. coli-Stamms DG116 (ATCC 53606) mit der Ligationsmischung. Erfolgreiche Transformanten werden durch Ampicillin-, Tetracyclin- oder sonstige Antibiotikum-Resistenz oder -Empfindlichkeit oder unter Verwendung anderer Marker selektiert, abhängig vom Modus der Plasmidkonstruktion, wie es im Fachgebiet verstanden wird. Plasmide aus den Transformanten werden dann gemäß des Verfah rens von Clewell et al., 1969, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 62: 1159, hergestellt, ggf. im Anschluss an eine Chloramphenicol-Amplifikation; siehe Clewell, 1972, J. Bacteriol. 110: 667. Alternativ dazu kann Plasmid-DNA hergestellt werden unter Verwendung des "Base-Säure"-Extraktionsverfahrens auf Seite 11 der "Bethesda Research Laboratories"-Veröffentlichung Focus 5 (2), und sehr reine Plasmid-DNA kann erhalten werden durch Ersetzen der Schritte 12 bis 17 des Protokolls durch CsCl/Ethidiumbromid-Ultrazentrifugation der DNA. Als eine andere Alternative kann ein handelsüblich erhältliches Plasmid-DNA-Isolierungskit, z. B. HISPEED-, QIAFILTER- und QIAGEN-Plasmid-DNA-Isolierungskits (Qiagen, Valencia CA), unter Befolgung der vom Verkäufer mitgelieferten Protokolle angewandt werden. Die isolierte DNA kann zum Beispiel durch Restriktionsenzymverdau analysiert und/oder mittels des Didesoxy-Verfahrens von Sanger et al. 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74: 5463, wie ferner beschrieben von Messing et al. 1981, Nuc. Acids Res. 9: 309, oder durch das Verfahren von Maxam et al., 1980, Methods in Enzymology 65: 499, sequenziert werden.
  • Die Steuerungssequenzen, Expressionsvektoren und Transformationsverfahren sind abhängig von dem zur Expression des Gens verwendeten Typ von Wirtszelle. Im Allgemeinen werden prokaryotische, Hefe-, Insekten- oder Säugerzellen als Wirte verwendet. Prokaryotische Wirte sind im Allgemeinen die wirkungsvollsten und zweckmäßigsten für die Herstellung von rekombinanten Proteinen, und werden deshalb für die Expression des Proteins bevorzugt.
  • Der am häufigsten zur Expression von rekombinanten Proteinen verwendete Prokaryot ist E. coli. Allerdings können auch von E. coli verschiedene Mikrobenstämme verwendet werden, wie Bacilli, zum Beispiel Bacillus subtilis, verschiedene Arten von Pseudomonas und Salmonella, und andere Bakterienstämme. In derartigen prokaryotischen Systemen werden typischerweise Plasmidvektoren verwendet, welche Replikationsstellen und Steuerungssequenzen enthalten, die aus dem Wirt oder einer mit dem Wirt kompatiblen Spezies abgeleitet sind.
  • Zur Expression von Konstruktionen unter der Steuerung der meisten bakteriellen Promotoren kann E. coli-K12-Stamm MM294, erhalten von dem E. coli-"Genetic Stock Center" unter GCSC #6135, als der Wirt verwendet werden. Für Expressionsvektoren mit der PLNRBS- oder PL T7RBS-Steuerungssequenz kann der E. coli-K12-Stamm MC1000 lambda lysogen, N7N53cI857 SusP80, ATCC 39531, verwendet werden. E. coli DG116, welches bei der ATCC (ATCC 53606) am 7. April 1987 hinterlegt worden ist, und E. coli KB2, welches bei der ATCC (ATCC 53075) am 29. März 1985 hinterlegt worden ist, sind ebenfalls nützliche Wirtszellen. Für M13-Phagen-Rekombinanten werden E. coli-Stämme, welche für eine Phageninfektion anfällig sind, wie der E. coli-K12-Stamm DG98 (ATCC 39768), verwendet. Der DG98-Stamm wurde bei der ATCC am 13. Juli 1984 hinterlegt.
  • Zum Beispiel wird E. coli typischerweise unter Verwendung der Derivate von pBR322 transformiert, welche beschrieben wurden von Bolivar et al., 1977, Gene 2: 95. Das Plasmid pBR322 enthält Gene für Ampicillin- und Tetracyclin-Resistenz. Diese Arneistoffresistenz-Marker können bei der Konstruktion des gewünschten Vektors entweder beibehalten oder zerstört werden und somit dabei helfen, die Gegenwart einer gewünschten Rekombinante nachzuweisen. Üblicherweise verwendete prokaryotische Steuerungssequenzen, d. h. ein Promotor für die Transkriptions-Initiation, gegebenenfalls mit einem Operator, zusammen mit einer Ribosomenbindungsstellen-Sequenz, schließen die β-Lactamase(Penicillinase)- und Lactose(lac)-Promotorsysteme, siehe Chang et al., 1977, Nature 198: 1056, das Tryptophan(trp)-Promotorsystem, siehe Goeddel et al., 1980, Nuc. Acids Res. 8: 4057, und den Lambda-abgeleiteten PL-Promotor, siehe Shimatake et al., 1981, Nature 292: 128, und eine Gen-N-Ribosomenbindungsstelle (NRBS), ein. Eine portable Steuerungssystem-Kassette ist im U.S.-Patent Nr. 4 711 845 , welches am 8. Dezember 1987 erteilt wurde, dargestellt. Diese Kassette umfasst einen PL-Promotor, der funktionstüchtig verknüpft ist mit der NRBS, die ihrerseits stromaufwärts einer dritten DNA-Sequenz positioniert ist, welche wenigstens eine Restriktionsstelle aufweist, die eine Spaltung innerhalb von 6 Basenpaaren 3' zur NRBS-Sequenz gestattet. Ebenfalls verwendbar ist das Phosphatase A(phoA)-System, welches beschrieben wurde von Chang et al., in der europäischen Patentveröffentlichung Nr. 196 864 , die am 8. Oktober 1986 veröffentlicht wurde. Allerdings kann jedwedes mit Prokaryoten verträgliche, verfügbare Promotorsystem verwendet werden, um einen Expressionsvektor der Erfindung zu konstruieren.
  • Zusätzlich zu Bakterien können auch eukaryotische Mikroben, wie Hefe, als rekombinante Wirtszellen verwendet werden. Laboratoriumsstämme von Saccharomyces cerevisiae, der Bäckerhefe, werden am häufigsten verwendet, obwohl eine Anzahl von anderen Stämmen üblicherweise verfügbar ist. Während Vektoren, die den "Zwei Mikron"-Replikationsursprung verwenden, üblich sind, siehe Broach, 1983, Meth. Enz. 101: 307, sind andere für Hefeexpression geeignete Plasmidvektoren bekannt; siehe z. B. Stinchcomb et al., 1979, Nature 282: 39; Tschempe et al., 1980, Gene 10: 157; und Clarke et al., 1983, Meth. Enz. 101: 300. Steuerungssequenzen für Hefevektoren schließen Promotoren für die Synthese von glycolytischen Enzymen ein; siehe Hess et al., 1968, J. Adv. Enzyme Reg. 7: 149; Holland et al., 1978, Biotechnology 17: 4900 und Holland et al., 1981, J. Biol. Chem. 256: 1385. Zusätzliche Promotoren, welche im Fachgebiet bekannt sind, schließen den Promotor für 3-Phosphoglyceratkinase, siehe Hitzeman et al., 1980, J. Biol. Chem. 255: 2073, und diejenigen für andere glycolytische Enzyme, wie Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase, Hexokinase, Pyruvatdecarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6-phosphat-Isomerase, 3-Phosphoglycerat-Mutase, Pyruvatkinase, Triosephosphat-Isomerase, Phoshoglucose-Isomerase und Glucokinase, ein. Andere Promotoren, welche den zusätzlichen Vorteil aufweisen, dass die Transkription von Wachstumsbedingungen gesteuert wird, sind die Promotorregionen für Alkoholdehydrogenase 2, Isocytochrom C, saure Phosphatase, Abbauenzyme, die mit dem Stickstoffstoffwechsel zusammenhängen, und Enzyme, welche für Maltose- und Galactose-Verwertung verantwortlich sind (Holland, siehe oben).
  • Terminatorsequenzen können ebenfalls verwendet werden, um die Expression zu fördern, wenn sie am 3'-Ende der codierenden Sequenz platziert sind. Derartige Terminatoren werden in der 3'-untranslatierten Region im Anschluss an die codierenden Sequenzen in von Hefe abgeleiteten Genen gefunden. Jedweder Vektor, welcher einen Hefe-kompatiblen Promotor, Replikationsursprung und sonstige Steuerungssequenzen enthält, ist für die Verwendung bei der Konstruktion von Hefeexpressionsvektoren geeignet.
  • Die codierende Sequenz kann auch in eukaryotischen Wirtszellkulturen exprimiert werden, die aus vielzelligen Organismen abgeleitet sind; siehe z. B. Tissue Culture, Academic Press, Cruz und Patterson, Herausgeber (1973). Nützliche Wirtszelllinien schließen COS-7, COS-A2, CV-1, Mauszellen, wie murine Myelome N51 und VERO, HeLa-Zellen und chinesische Hamster-Eierstock(CHO)-Zellen ein. Expressionsvektoren für derartige Zellen schließen üblicherweise Promotoren und Steuerungssequenzen ein, welche mit Säugerzellen kompatibel sind, wie zum Beispiel die häufig verwendeten "Early"- und "Late"-Promotoren aus Simian Virus 40 (SV 40), siehe Fiers et al., 1978, Nature 273: 113, oder andere virale Promotoren, wie diejenigen, welche abgeleitet sind aus Polyoma, Adenovirus 2, Rinderpapillomvirus (BPV) oder Vogel-Sarkomviren, oder Immunglobulin-Promotoren und Hitzeschock-Promotoren. Ein System zum Exprimieren von DNA in Säugersystemen unter Verwendung eines BPV-Vektorsystems wird offenbart im U.S.-Patent Nr. 4 419 446 . Eine Modifikation dieses Systems wird beschrieben im U.S.-Patent Nr. 4 601 978 . Allgemeine Aspekte von Säugerzell-Wirtssystem-Transformationen sind beschrieben worden von Axel, U.S.-Patent Nr. 4 399 216 . "Enhancer"-Regionen sind auch wichtig zur Optimierung der Expression; dieses sind im Allgemeinen Sequenzen, welche sich stromaufwärts der Promotorregion finden. Replikationsursprünge können, falls notwendig, aus viralen Quellen erhalten werden. Allerdings ist die Integration in das Chromosom ein häufiger Mechanismus für DNA-Replikation in Eukaryoten.
  • Pflanzenzellen können ebenfalls als Wirte verwendet werden, und mit Pflanzenzellen kompatible Steuerungssequenzen, wie der Nopalinsynthase-Promotor, und Polyadenylierungs-Signalsequenzen, siehe Depicker et al., 1982, J. Mol. Appl. Gen. 1: 561, sind verfügbar. Expressionssysteme unter Verwendung von Insektenzellen, welche die von Baculovirus-Vektoren vorgesehenen Steuerungssysteme nutzen, sind ebenfalls beschrieben worden; siehe Miller et al., in Genetic Engineering (1986), Hrsg.: Setlow et al., Plenum Publishing, Band 8, S. 277–97. Insektenzellen-basierte Expression kann in Spodoptera frugipeida bewerkstelligt werden. Diese Systeme sind ebenfalls erfolgreich zur Herstellung von rekombinanten Enzymen.
  • Abhängig von der verwendeten Wirtszelle erfolgt die Transformation unter Anwendung von Standardtechniken, welche für derartige Zellen geeignet sind. Die Calciumbehandlung unter Verwendung von Calciumchlorid, wie beschrieben von Cohen, 1972, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69: 2110, wird für Prokaryoten oder andere Zellen, welche wesentliche Zellwand-Barrieren enthalten, angewandt. Die Infektion mit Agrobacterium tumefaciens, siehe Shaw et al., 1983, Gene 23: 315, wird für bestimmte Pflanzenzellen angewandt. Für Säugerzellen wird das Verfahren der Calciumphosphat-Präzipitation von Graham et al., 1978, Virology 52: 546, bevorzugt. Transformationen in Hefe werden gemäß des Verfahrens von Van Solingen et al., 1977, J. Bact. 130: 946, und Hsiao et al., 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 3829, ausgeführt.
  • Es kann wünschenswert sein, die Sequenz der DNA, die das zielgerichtete Enzym der Erfindung codiert, zu modifizieren, um zum Beispiel eine Sequenz bereitzustellen, die mit der Codonverwendung der Wirtszelle kompatibler ist, ohne die Aminosäuresequenz des codierten Proteins zu modifizieren. Derartige Modifikationen an den anfänglichen 5–6 Codons können die Expressionseffizienz verbessern. DNA-Sequenzen, welche zur Verbesserung der Expressionseffizienz modifiziert worden sind, aber welche die gleiche Aminosäuresequenz codieren, werden als Äquivalent angesehen, und werden von der vorliegenden Erfindung eingeschlossen.
  • Eine Vielzahl an Verfahren zur ortsspezifischen, Primer-gerichteten Mutagenese steht zur Verfügung und ist im Fachgebiet allgemein bekannt; sehe z. B. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1989, zweite Ausgabe, Kapitel 15.51, "Oligonucleotide-mediated mutagenesis", worauf hierin Bezug genommen wird. Die Polymerasekettenreaktion (PCR) kann angewandt werden, um eine ortsspezifische Mutagenese durchzuführen. In einer anderen Technik, welche nun Standard im Fachgebiet ist, wird ein synthetisches Oligonukleotid, codierend die gewünschte Mutation, als ein Primer verwendet, um die Synthese einer komplementären Nukleinsäuresequenz zu lenken, die enthalten ist in einem einzelsträngigen Vektor, wie pBSM13+-Derivaten, welcher als eine Matrize für die Konstruktion des Verlängerungsprodukts des mutagenisierenden Primers dient. Die mutagenisierte DNA wird in ein Wirtsbakterium transformiert, und Kulturen der transformierten Bakterien werden ausplattiert und identifiziert. Die Identifizierung von modifizierten Vektoren kann den Transfer der DNA von selektierten Transformanten auf einen Nitrozellulosefilter oder eine andere Membran beinhalten, und die "Abdrücke" (lifts) werden mit einem kinasierten synthetischen mutagenen Primer bei einer Temperatur hybridisiert, welche die Hybridisierung einer exakten Entsprechung bzw. Paarung an die modifizierte Sequenz zulässt, aber die Hybridisierung mit dem ursprünglichen nicht-mutagenisierten Strang verhindert. Transformanten, welche DNA enthalten, die mit der Sonde hybridisiert, werden dann kultiviert (die Sequenz der DNA wird im Allgemeinen durch Sequenzanalyse bestätigt) und dienen als ein Reservoir der modifizierten DNA.
  • Sobald das Protein in einer rekombinanten Wirtszelle exprimiert worden ist, kann die Reinigung des Proteins gewünscht werden. Eine Vielzahl von Reinigungsvorgehensweisen kann angewandt werden, um die zielgerichteten Enzyme der Erfindung zu reinigen.
  • Für die Langzeit-Stabilität muss das gereinigte, zielgerichtete Enzym in einem Puffer aufbewahrt werden, welcher ein oder mehrere nicht-ionische polymere Detergenzien enthält. Derartige Detergenzien sind im Allgemeinen diejenigen, welche ein Molekulargewicht im Bereich von unge führ 100 bis 25 000, vorzugsweise etwa 4 000 bis 200 000 Dalton aufweisen und das Enzym bei einem pH-Wert von etwa 3,5 bis etwa 9,5, vorzugsweise etwa 4 bis 8,5, stabilisieren. Beispiele solcher Detergenzien schließen diejenigen ein, welche auf den Seiten 295–298 von McCutcheons Emulsifiers & Detergents, nordamerikanische Ausgabe (1983), veröffentlicht von der McCutcheon Division of MC Publishing Co., 175 Rock Road, Glen Rock, NJ (USA), angegeben werden, wobei auf die gesamte Offenbarung davon hierin ausdrücklich Bezug genommen wird. Vorzugsweise werden die Detergenzien aus der Gruppe gewählt, umfassend ethoxylierte Fettalkoholether und -laurylether, ethoxylierte Alkylphenole, Octylphenoxy-Polyethoxy-Ethanol-Verbindungen, modifizierte geradkettige oxyethylierte und/oder oxypropylierte Alkohole, Polyethylenglycol-Monooleat-Verbindungen, Polysorbat-Verbindungen und phenolische Fettalkoholether. Im Genaueren werden Tween 20TM, ein polyoxyethyliertes (20) Sorbitanmonolaurat von ICI Americas Inc. (Wilmington, DE), und IconolTM NP-40, ein ethoxyliertes Alkylphenol (Nonyl) von BASF Wyandotte Corp. (Parsippany, NJ), bevorzugt.
  • VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG VON ZIELGERICHTETEN ENZYMEN
  • In einem Aspekt sieht die vorliegende Erfindung Verfahren zur Herstellung der zielgerichteten Enzyme der Erfindung vor. Jedwedes geeignete Verfahren kann angewandt werden.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung wird ein zielgerichtetes Enzym hergestellt durch Modifizieren einer variationstoleranten Sequenz eines nicht-zielgerichteten Enzyms und Selektieren des modifizierten Enzyms, wenn es an ein Ziel bindet und katalytische Aktivität aufweist, während es an das Ziel gebunden ist. In einer anderen Ausführungsform wird ein iteratives Vorgehen verwendet, worin ein modifiziertes Enzym, welches katalytische Aktivität aufweist, während es an Ziel gebunden ist, weiter in der varianten Sequenz modifiziert wird und weiter selektiert wird, wenn es eine erhöhte Bindung an das Ziel, erhöhte katalytische Aktivität aufweist oder eine Verbesserung in einer anderen Eigenschaft zeigt. Der Zyklus wird wiederholt, bis ein Enzym mit einem gewünschten Satz an Merkmalen erhalten wird. In einer anderen Ausführungsform besitzt das nicht-zielgerichtete Enzym zwei oder mehrere variationstolerante Sequenzen, die modifiziert werden. In einer anderen Ausführungsform besitzt das nicht-zielgerichtete Enzym drei oder mehr variationstolerante Sequenzen, die modifiziert werden. In einer anderen Ausführungsform besitzt das nicht-zielgerichtete Enzym vier oder mehr variationstolerante Sequenzen, die modifiziert werden.
  • In einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird eine variationstolerante Sequenz eines nicht-zielgerichteten Enzyms mit einem Repertoire von varianten Sequenzen ersetzt, unter Bildung eines Repertoires von modifizierten Enzymen, und ein modifiziertes Enzym wird aus dem Repertoire von modifizierten Enzymen selektiert, wenn es katalytische Aktivität aufweist, während es an ein Ziel gebunden ist. In einer anderen Ausführungsform wird ein iteratives Vorgehen angewandt, wobei ein modifiziertes Enzym, welches katalytische Aktivität aufweist, während es an Ziel gebunden ist, weiter in seiner varianten Sequenz modifiziert wird und weiter selektiert wird, wenn es eine erhöhte Bindung an das Ziel, erhöhte katalytische Aktivität aufweist oder eine Verbesserung in einer anderen Eigenschaft zeigt. Der Zyklus wird wiederholt, bis ein Enzym mit einem gewünschten Satz an Merkmalen erhalten wird.
  • In einer anderen Ausführungsform wird eine erste variante Sequenz entsprechend einer ersten variationstoleranten Sequenz eines nicht-zielgerichteten Enzyms, mit einer zweiten varianten Sequenz, entsprechend einer zweiten variationstoleranten Sequenz des nicht-zielgerichteten Enzyms, kombiniert, um ein modifiziertes Enzym zu erzeugen, das die erste variante Sequenz und die zweite variante Sequenz umfasst, und das modifizierte Enzym wird selektiert, wenn es katalytische Aktivität aufweist, während es an ein Ziel gebunden ist. In einer anderen Ausführungsform wird ein iteratives Vorgehen angewandt, wobei ein modifiziertes Enzym, welches katalytische Aktivität aufweist, während es an das Ziel gebunden ist, weiter in seiner ersten und/oder seiner zweiten varianten Sequenz modifiziert wird und weiter selektiert wird, wenn es eine erhöhte Bindung an das Ziel oder eine erhöhte katalytische Aktivität aufweist oder eine Verbesserung in einer anderen Eigenschaft zeigt. Der Zyklus wird wiederholt, bis ein Enzym mit einem gewünschten Satz an Merkmalen erhalten wird.
  • In einer anderen Ausführungsform wird ein erstes Repertoire von varianten Sequenzen entsprechend einer ersten variationstoleranten Sequenz in einem nicht-zielgerichteten Enzym, mit einem zweiten Repertoire an varianten Sequenzen, entsprechend einer zweiten variationstoleranten Sequenz des nicht-zielgerichteten Enzyms, kombiniert, um ein Repertoire an modifizierten Enzymen herzustellen, umfassend eine variante Sequenz aus dem ersten Repertoire und eine variante Sequenz aus dem zweiten Repertoire, und ein modifiziertes Enzym wird aus dem Repertoire von modifizierten Enzymen selektiert, wenn es katalytische Aktivität aufweist, während es an ein Ziel gebunden ist. In einer anderen Ausführungsform wird ein iteratives Vorgehen angewandt, wobei ein modifiziertes Enzym, welches katalytische Aktivität aufweist, während es an das Ziel gebunden ist, weiter in seiner ersten und/oder seiner zweiten varianten Sequenz modifiziert wird und weiter selektiert wird, wenn es eine erhöhte Bindung an das Ziel aufweist, erhöhte katalytische Aktivität aufweist oder eine Verbesserung in einer anderen Eigenschaft zeigt. Der Zyklus wird wiederholt, bis ein Enzym mit einem gewünschten Satz an Merkmalen erhalten wird.
  • In einer anderen Ausführungsform wird ein erstes Repertoire von varianten Sequenzen entsprechend einer ersten variationstoleranten Sequenz in einem nicht-zielgerichteten Enzym, mit einem zweiten Repertoire an varianten Sequenz, entsprechend einer zweiten variationstoleranten Sequenz des nicht-zielgerichteten Enzyms, und einem dritten Repertoire an varianten Sequenzen, entsprechend einer dritten variationstoleranten Sequenz des nicht-zielgerichteten Enzyms, kombiniert, um ein Repertoire an modifizierten Enzymen herzustellen, umfassend eine variante Sequenz aus dem ersten Repertoire, eine variante Sequenz aus dem zweiten Repertoire, und eine variante Sequenz aus dem dritten Repertoire, und ein modifiziertes Enzym wird aus dem Reper toire von modifizierten Enzymen selektiert, wenn es katalytische Aktivität aufweist, während es an ein Ziel gebunden ist. In einer anderen Ausführungsform wird ein iteratives Vorgehen angewandt, wobei ein modifiziertes Enzym, welches katalytische Aktivität aufweist, während es an das Ziel gebunden ist, weiter in einer oder mehreren von seinen varianten Sequenzen modifiziert wird und weiter selektiert wird, wenn es erhöhte Bindung an das Ziel aufweist, erhöhte katalytische Aktivität aufweist oder eine Verbesserung in einer anderen Eigenschaft zeigt. Der Zyklus wird wiederholt, bis ein Enzym mit einem gewünschten Satz an Merkmalen erhalten wird.
  • In einer anderen Ausführungsform wird ein erstes Repertoire von varianten Sequenzen entsprechend einer ersten variationstoleranten Sequenz in einem nicht-zielgerichteten Enzym, mit einem zweiten Repertoire an varianten Sequenzen, entsprechend einer zweiten variationstoleranten Sequenz des nicht-zielgerichteten Enzyms, einem dritten Repertoire an varianten Sequenzen, entsprechend einer dritten variationstoleranten Sequenz des nicht-zielgerichteten Enzyms, und einem vierten Repertoire an varianten Sequenzen, entsprechend einer vierten variationstoleranten Sequenz des nicht-zielgerichteten Enzyms, kombiniert, um ein Repertoire an modifizierten Enzymen herzustellen, umfassend eine variante Sequenz aus dem ersten Repertoire, eine variante Sequenz aus dem zweiten Repertoire, eine variante Sequenz aus dem dritten Repertoire und eine variante Sequenz aus dem vierten Repertoire, und ein modifiziertes Enzym wird aus dem Repertoire von modifizierten Enzymen selektiert, wenn es katalytische Aktivität aufweist, während es an ein Ziel gebunden ist. In einer anderen Ausführungsform wird ein iteratives Vorgehen angewandt, wobei ein modifiziertes Enzym, welches katalytische Aktivität aufweist, während es an das Ziel gebunden ist, weiter in einer oder mehreren von seinen varianten Sequenzen modifiziert und weiter selektiert wird, wenn es eine erhöhte Bindung an das Ziel aufweist, erhöhte katalytische Aktivität aufweist oder eine Verbesserung in einer anderen Eigenschaft zeigt. Der Zyklus wird wiederholt, bis ein Enzym mit einem gewünschten Satz an Merkmalen erhalten wird.
  • Die Anzahl an varianten Sequenzen, welche in einem modifizierten Enzym kombiniert werden, wird nur von der Anzahl von variationstoleranten Sequenzen eingeschränkt, welche das entsprechende nicht-zielgerichtete Enzym besitzt.
  • In einer Ausführungsform wird die enzymatische Aktivität des nicht-zielgerichteten Enzyms verwendet, um modifizierte Enzyme zu selektieren, welche wenigstens teilweise funktionell sind und deshalb von der Modifikation strukturell verhältnismäßig nicht beeinträchtigt werden. Zum Beispiel können modifizierte nicht-zielgerichtete Enzyme, welche Antibiotikum-Resistenz an einer Zelle vermitteln, in der Zelle exprimiert werden, und die Zelle kann dem Antibiotikum ausgesetzt werden. Resistenz gegen das Antibiotikum weist darauf hin, dass die Modifikation das Enzym nicht inaktiviert. In ähnlicher Weise kann ein modifiziertes nicht-zielgerichtetes Enzym, welches einen notwendigen Nährstoff metabolisiert, in einer Zelle exprimiert werden, welche dieses Nährstoffs bedarf. Das Wachstum in Abwesenheit des Nährstoffs zeigt an, dass das modifizierte Enzym das Enzym nicht inaktiviert. Noch allgemeiner kann jedwedes nicht- zielgerichtete Enzym, welches einen nachweisbaren oder selektierbaren Phänotyp an eine Zelle vermittelt, verwendet werden, um modifizierte nicht-zielgerichtete Enzyme zu selektieren, welche von der Modifikation nicht inaktiviert worden sind. Zell-freie oder in vitro-Selektions- oder Detektionssysteme können ebenfalls eingesetzt werden, wobei zum Beispiel ein fluorogenes oder chromogenes Substrat durch das modifizierte nicht-zielgerichtete Enzym umgesetzt wird.
  • In einer Ausführungsform wird ein Zwei-Schritt-Vorgehen angewandt, um das zielgerichtete Enzym zu erzeugen. Im ersten Schritt wird eine Peptidsequenz in ein Enzym inseriert. Eine Bibliothek von modifizierten Enzymen kann erzeugt werden, wobei jedes die Peptidsequenz, inseriert in eine unterschiedliche Stelle des Enzyms, aufweist, wobei beispielsweise Transposon-Mutagenese angewandt wird. Die Bibliothek von modifizierten Enzymen wird gescreent, um modifizierte Enzyme zu identifizieren, welche enzymatische Aktivität beibehalten. Dies gestattet die Identifizierung von einer oder mehreren Stellen in dem Enzym, welche die Insertion einer Peptidsequenz tolerieren werden. Im zweiten Schritt wird die inserierte Peptidsequenz eines modifizierten Enzyms, welches im ersten Schritt als enzymatische Aktivität beibehaltend identifiziert wurde, durch ein Peptid ersetzt, welches an ein Ziel bindet. Eine zweite, kleinere Bibliothek von modifizierten Enzymen kann somit gebildet werden, wobei jedes modifizierte Enzym in dieser Bibliothek ein Bindungspeptid in einer Position aufweist, die bekanntermaßen die Insertion eines Peptids toleriert. In einer anderen Ausführungsform werden Bindungspeptide in eine Vielzahl von Stellen inseriert, welche im nicht modifizierten Enzym als eine Insertion tolerierend identifiziert wurden. Die inserierten Peptide können die gleichen sein, oder sie können verschieden sein. In einer anderen Ausführungsform bilden die inserierten Peptide gemeinsam eine Bindungsdomäne aus. In einer anderen Ausführungsform umfassen die inserierten Peptide jeweils ihre eigene Bindungsdomäne, wodurch dem modifizierten Enzym Bindungsstellen für eine Vielzahl von Zielen verliehen werden.
  • In einer anderen Ausführungsform sieht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines zielgerichteten Enzyms vor, welches ein Milieu-abhängiges zielgerichtetes Enzym ist.
  • In einer anderen Ausführungsform sieht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines zielgerichteten Enzyms vor, welches ein multifunktionelles Polypeptid ist.
  • In einer anderen Ausführungsform sieht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines zielgerichteten Enzyms vor, umfassend einen Affinitäts-Reifungsschritt oder -schritte.
  • Mehrere Arbeitsgruppen haben die Transplantation bzw. Verpflanzung von Erkennungselementen von einem Proteinenzym auf einem anderen Enzym für eine verbesserte (oder modifizierte) Funktion vorgeschlagen; siehe Smith et al., J. Biol. Chem. 270: 30486 (1995). Allerdings wird es oft nahegelegt, dass ein wirkungsvolles in vivo-Targeting nicht mit signifikanter Wirkung durch Proteine bewerkstelligt werden kann, die so klein sind wie einzelne rekombinante V-Domänen mit einem Molekulargewicht von etwa 15 kD. Statistische Bibliotheken von Peptiden sind auf verschiedenen Protein-Grundgerüsten erzeugt worden, einschließlich Proteaseinhibitoren, siehe Roberts et al., Gene 121: 9 (1992), und GFP. Darüber hinaus wird es allgemein angenommen, dass die Stellen für derartige Loop-Bibliotheken ziemlich eingeschränkt sind, basierend auf der Gesamtfaltung des Proteins, und es häufig erforderlich ist, ein dreidimensionales Modell eines derartigen Proteins zur Verfügung zu haben, um nützliche Bibliotheken zu konstruieren und zu screenen; siehe U.S.-Patent 6 025 485 . Die Regeln für die Lokalisierung derartiger Ersetzungs-Schleifen sind nicht gut definiert. Darüber hinaus wird es häufig vermutet, dass große Bindungsfragmente, wie Fab-Fragmente, für eine feste Bindung in Tumor-Targeting-Anwendungen erforderlich sind; siehe Hudson, Curr. Opin. Biotechnol. 9 (4): 395 (1998). Das Phagendisplay von gefalteten Proteinen ist oftmals schwierig, und die Erzeugung großer Bibliotheken für Phagendisplay-Proteine kann problematisch sein. Die vorliegende Erfindung liefert Verfahren zur raschen Erzeugung von zielgerichteten Enzymen ohne das Erfordernis nach dreidimensionalen Strukturinformationen, und die durch Phagen erzeugten Bibliotheken können rasch in eine Vielzahl von unterschiedlichen Enzymsystemen kloniert werden, ohne die Notwendigkeit, die Bibliotheks-Erzeugung für jedes Enzym zu optimieren.
  • In einer Ausführungsform sieht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Erzeugung, auf einem Einzelenzym-Grundgerüst, für feste Bindung mit einem therapeutischen Effekt, von zielgerichteten und wirkungsvollen Enzymen vor, die kleiner als 60 kD und vorzugsweise kleiner als 30 kD sind. Die Flexibilität des vorliegenden therapeutischen Systems kann formatiert werden, um bei nanomolaren Dosen oder weniger effektiv zu sein, aufgrund der katalytischen Natur des zielgerichteten Enzyms. Darüber hinaus kann die Kreislauf-Halbwertszeit für eine rasche Klärung zum Beispiel in ADEPT- oder TEPT-Strategien maßgeschneidert werden. Die geringere Größe derartiger Mittel wird neue Verfahren zur Zuführung bereitstellen, wie Inhalation, welche für größere Moleküle problematisch sind.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung beinhaltet die Herstellung von zielgerichteten Enzymen die folgenden Schritte
    • 1) Screening einer Bibliothek von Peptiden (welche zum Beispiel auf Phagen präsentiert werden) hinsichtlich Affinität an zellspezifische Ziele, einschließlich Tumorantigenen oder anderen Zelloberflächenmarkern, unter Anwendung von selektiven Targeting-Verfahren.
    • 2) PCR-Amplifikation von fest bindenden Phagenpeptiden und unter Verwendung von Typ-II-Restriktionsenzymen, um diese Teil-Bibliotheken in jedwedes Protein von Interesse zu klonieren.
    • 3) Screening dieser viel kleineren Bibliotheken für das zielgerichtete Enzym auf Einzelklon-Ebene (102 bis 104) hinsichtlich der Funktion, wie etwa Proarzneistoff-Aktivierung in einem zellbasierenden Assay.
  • Es kann angenommen werden, dass Peptidsequenzen, welche an ein Ziel im Kontext von pIII-Phagendisplay-Peptiden binden, auch an das Ziel im Kontext von Loops bzw. Schleifen in dem Enzym binden werden. Obwohl dies eine radikale Annahme ist, da das Peptid einen freien Aminoterminus in dem Phagen aufweist und seine Konformation deshalb vermutlich in der Lage ist, viel mehr Konformationen anzunehmen, kann die Bindungsfreudigkeit im Kontext des Mehrkopien-pIII-Systems gestatten, dass feste Binder, z. B. Peptide, durch in vivo-Phagendisplay identifiziert werden; siehe Arap et al., Science 279: 377 (1998). Klonierungsstrategien können entwickelt werden, welche die Konstruktion von Teil-Bibliotheken mit geeigneten Restriktionsstellen gestatten, sodass nur 4–5 Bibliotheken in dem Enzym konstruiert werden müssen, um hinsichtlich Funktion zu screenen. Dieses Vorgehen erfordert die Verwendung von Typ-II-Restriktionsenzym-Klonierung, um geeignete Bibliotheken einzubringen (2). Die Erfinder postulieren, dass die Einführung von zusätzlicher Mutationsvariabilität beim Oligo-Entwurf die Expression von Loop-zielgerichteten Varianten verbessern kann. Dieses Verfahren zieht einen Vorteil aus der Tatsache, dass ein Schlüsselschritt beim selektiven Targeting unter Verwendung von Phagenpeptid-Bibliotheken auf einem PCR-Schritt beruht, um den Ziel-gebundenen Phagen zu amplifizieren, sodass PCR-Primer als Teil der Targeting-Strategie zur direkten Klonierung in einem Protein von Interesse entworfen werden können. Somit werden Probleme zum direkten Konstruieren von Phagen-Proteinbibliotheken abgemildert.
  • Flexible Loops zur Insertion und Ersetzung können auf Kriterien basieren, die im Fachgebiet allgemein bekannt sind. Zum Beispiel können in Subtilisin aus Bacillus lentus Loop-Insertionen identifiziert werden, z. B. aus:
    • 1. Alignierung der Sequenz mit thermischen B-Faktoren
    • 2. Konservierungsindizes quer über eine Familie
    • 3. 15N-1H-NOE-Korrelationszeiten
    • 4. Substratbindungsfurchen/spalten nahe Resten einer aktiven Stelle (sodass die Substratbindung nicht vollständig ausgeschlossen bzw. verdeckt wird).
  • Alternativ dazu könnte die Enzymbibliothek durch standardmäßige Molekularbiologie-Protokolle entweder direkt oder unter Anwendung von Display-Technologien erzeugt und hinsichtlich Bindungsaffinität an das Ziel von Interesse unter Verwendung selektiver Targeting-Verfahren gescreent werden. Sobald fest bindende Sequenzen identifiziert sind, kann das Enzym hinsichtlich der Funktion und Bindung in einer iterativen Weise optimiert werden.
  • Variante Sequenz-Repertoires
  • In einer Ausführungsform werden die varianten Sequenzen in dem Repertoire ausgewählt, um eine oder mehrere gewünschte Merkmale aufzuweisen, z. B.: A
    • – ein zielgerichtetes Enzym, welches die variante Sequenz umfasst, nimmt eine Konformation an, die homolog zu derjenigen des nicht-zielgerichteten Enzyms A ist
    • – ein zielgerichtetes Enzym, welches die variante Sequenz umfasst, behält die katalytische Aktivität bei
    • – ein zielgerichtetes Enzym, welches die variante Sequenz umfasst, behält Stabilität, z. B. Proteasestabilität, [von] A, bei
    • – die varianten Sequenzen in dem Repertoire weisen diverse chemische Eigenschaften und/oder Gestalten [als] A auf
    • – die varianten Sequenzen besitzen eine niedrige Immunogenizität A,
    • – die varianten Sequenzen besitzen bekannte Flüssigkeitschromatographie/Massenspektroskopie(LC/MS)-Profile, was die Identifizierung und/oder Charakterisierung von einzelnen varianten Sequenzen in einer rekombinanten Bibliothek oder in Untergruppen von Bibliotheksmitgliedern vereinfacht.
  • Eine Bibliothek von Proteinmutanten sollte wenigstens einen Vertreter mit wünschenswerten und identifizierbaren Eigenschaften enthalten. Man kann die Chancen zum Auffinden eines gewünschten Klons durch Erhöhen der Größe der Bibliothek steigern. Allerdings kann die Größe einer Bibliothek durch eine Vielzahl von Faktoren beschränkt sein, wie Transformationseffizienz oder der Fähigkeit, zu screenen oder selektieren. Ein effizienterer Weg zur Erhöhung der Wahrscheinlichkeit des Auffindens eines gewünschten Klons besteht darin, die Trefferdichte einer Bibliothek zu erhöhen, d. h. die Fraktion von nützlichen Klonen in der Bibliothek.
  • Das Rekombinieren von Repertoires von varianten Sequenzen, welche vor-selektiert worden sind, verringert die Fraktion an instabilen Varianten in einer rekombinanten Bibliothek. Im Allgemeinen variieren Proteine hinsichtlich ihrer Toleranz gegenüber Substitutionen, wobei Reste nahe der aktiven Stelle oder im konservierten Zentrum eines Proteins weniger toleriert werden als Reste in außenliegenden Schleifen. Allerdings können sogar Außenseiten-Reste eines Proteins, welche eine geringe evolutionäre Konservierung aufzeigen, nicht frei, ohne einen gewissen Verlust an Proteinstabilität substituiert werden. Wenn man gleichzeitig mehrere Reste eines Proteins ersetzt, kann eine signifikante Fraktion der Mutanten eine beeinträchtigte Expression, Sekretion, Stabilität oder katalytische Aktivität im Vergleich zum Wildtypprotein aufweisen; siehe Axe, J. Mol. Biol. 301: 585 (2000). Wenn von dem Rekombinieren einer Vielzahl von Segmenten, jedes von ihnen in einem ansonsten wildtypmäßigen Protein, festgestellt wurde, zu einem vollständig funktionellen oder nahezu vollständig funktionellen Protein zu führen, verringert man danach die Fraktion an instabilen, nicht-exprimierenden oder inaktiven Mutanten in einer Bibliothek signifikant. Dies ist insbesondere dann der Fall, wenn die verschiedenen rekombinierten Segmente in dem korrekt gefalteten Protein nicht direkt miteinander Wechselwirken.
  • Fernerhin gewinnt man, durch Rekombinieren varianter Sequenzrepertoires, die Kontrolle über die strukturelle und chemische Diversität in der rekombinanten Bibliothek. Zum Beispiel ist es beobachtet worden, dass bestimmte Aminosäuren, wie Tyr und Asn, in den variablen Schleifen von natürlichen Antikörpern häufiger sind, im Vergleich zu ihrer Häufigkeit in anderen Proteinen. Es ist spekuliert worden, dass diese und einige andere Aminosäuren besonders geeignet für die Erkennung und Unterscheidung sind. In ähnlicher Weise kann man die Häufigkeit von geladenen und hydrophoben Resten in den variablen Segmenten beeinflussen durch Erhöhen der Anzahl an geladenen oder hydrophoben Resten in einem Segment, um die chemische und strukturelle Diversität zu erhöhen.
  • Typische statistische Bibliotheken enthalten viele sehr ähnliche Klone. Folglich, wenn eine Bibliothek einen Klon mit einer gewünschten Eigenschaft enthält, ist es dann wahrscheinlich, dass sie viele andere Klone mit ähnlichen funktionellen und strukturellen Eigenschaften enthält. Dies kann die Identifizierung von wünschenswerten Klonen tatsächlich verwirrend machen. Eine ideale Bibliothek enthält gerade eine hinreichende Anzahl an Klonen mit gewünschten Eigenschaften und wenige ähnliche Klone, d. h. sie weist eine steile Entsprechungs- bzw. Treffer-Verteilung auf. In einer derartigen Bibliothek kann man häufig wünschenswerte Klone durch Vereinigen von Teilbibliotheken und Messung ihrer Eigenschaften identifizieren. Durch Verwendung von vor-selektierten variablen Segmenten, welche sich hinsichtlich ihrer Eigenschaften in weitem Maße unterscheiden, kann man derartige Bibliotheken mit "nicht-gleichmäßigen" Treffer-Verteilungen erzeugen.
  • Erzeugung von varianten Sequenzrepertoires
  • In einer Ausführungsform der Erfindung werden die Repertoires aus humanen Sequenzen abgeleitet. Dies verringert das Potenzial, eine Immunantwort auszulösen. Darüber hinaus kann man bekannte dreidimensionale Strukturen inspizieren und alle varianten Sequenzen synthetisieren, welche scheinbar von einer variationstoleranten Sequenz eines nicht-zielgerichteten Enzyms aufgenommen werden können. In einer anderen Ausführungsform kann man eine variationstolerante Sequenz in einem nicht-zielgerichteten Enzym mit einer vollständig randomisierten oder teilweise randomisierten Sequenz ersetzen. Anschließend kann man hinsichtlich der Beibehaltung der Enzymfunktion und -stabilität und jedweder anderen Eigenschaft von Bedeutung screenen und selektieren.
  • Alternativ dazu kann man die funktionellen Mutanten sequenzieren und variante Sequenzen des Repertoires basierend auf ihrer Sequenz auswählen, wobei ein oder mehrere Kriterien berücksichtigt werden, wie obenstehend erörtert. Hierdurch würde man in die Lage versetzt, Reper toires zu erzeugen und sich nicht auf rein statistische Sequenzen zu verlassen. Zum Beispiel könnte man die Duplikation von varianten Sequenzen vermeiden, variante Sequenzen vermeiden, welche gleiche Masse aber unterschiedliche Struktur aufweisen, welche schwierig durch Massenspektroskopie zu identifizieren wären, oder variante Sequenzen wählen, welche sich hinsichtlich der Aminosäurezusammensetzung in weitem Maße unterscheiden, um die Diversität in der Bibliothek zu maximieren.
  • Lokalisierung von varianten Sequenzen im Enzym
  • Die varianten Sequenzen können irgendwo in der Struktur des nicht-zielgerichteten Enzyms platziert werden. Von besonderem Interesse sind Regionen, welche eine Modifikation, und/oder die Bindung eines Ziels an die modifizierte Region, tolerieren können, ohne die katalytische Aktivität des Enzyms in unerwünschter Weise zu beeinflussen.
  • Eine Targeting-Stelle kann eine oder mehrere variante Sequenzen umfassen. In einer anderen Ausführungsform umfasst die Targeting-Stelle mehrere variante Sequenzen. In einer anderen Ausführungsform ist jede der varianten Sequenzen von ihren benachbarten varianten Sequenzen durch ein oder mehrere konstante Segmente in der Primärsequenz des Enzyms getrennt, aber ist nahe zu jeder der anderen varianten Sequenzen im gefalteten Protein. Diese Anordnung wird die Rekombination vereinfachen, da man Rekombinationsstellen in die konstanten Segmente einführen kann. Darüber hinaus verringert eine derartige Anordnung die Wahrscheinlichkeit einer direkten Wechselwirkung zwischen den verschiedenen variablen Segmenten.
  • Variationstolerante Sequenzen können zum Beispiel einzelne Aminosäuren sein, oder können Sequenzen sein, welche eine Länge von weniger als etwa 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10 oder 5 Aminosäureresten aufweisen. Variante Sequenzen können zum Beispiel zwischen null und etwa 50 Aminosäureresten lang sein. In einer anderen Ausführungsform liegt die Länge einer varianten Sequenzen im Bereich von etwa null bis etwa 20, null bis zehn oder drei bis 20 Aminosäureresten. "Null" Aminosäurereste bezieht sich auf eine Situation, in welcher eine variationstolerante Sequenz deletiert worden ist.
  • Potenzielle variationstolerante Sequenzen und Targeting-Stellen können identifiziert werden z. B. durch Vergleichen von Sequenz-Alignierungen von homologen Genen. Sequenzregionen, welche ein geringes Ausmaß der Konservierung zeigen, nehmen mit größerer Wahrscheinlichkeit eine Vielzahl von unterschiedlichen Segmenten auf, im Vergleich zu hoch konservierten Regionen der Sequenz. Von besonderem Interesse sind Regionen, an welchen natürliche Homologe eines Proteins Insertionen oder Deletionen relativ zueinander aufweisen.
  • Potenzielle variationstolerante Sequenzen und Targeting-Stellen können ebenfalls gewählt werden, z. B. basierend auf der bekannten oder vorhergesagten dreidimensionalen Struktur des nicht-zielgerichteten Enzyms oder seines Homologs. Zum Beispiel kann man die dreidimensionalen Strukturen von mehreren homologen Proteinen alignieren und Regionen in der Struktur identifizieren, welche eine signifikante Variabilität hinsichtlich der Seitenketten oder der Konformation des Peptidgrundgerüsts zeigen. Alternativ dazu kann man Regionen der Struktur identifizieren, welche eine Furche bilden, die ein Ziel aufnehmen kann oder könnte (d. h. eine konkave Targeting-Stelle). In anderen Fällen kann es vorteilhaft sein, eine Region oder Regionen zu identifizieren, welche von dem Protein weg hervorstehen (d. h. konvexe Targeting-Stellen).
  • Lösungsmittel-zugängliche Loops sind ebenfalls potenzielle variationstolerante Sequenzen in einem nicht-zielgerichteten Enzym. Lösungsmittel-zugängliche Schleifen können beispielsweise basierend auf ihrer Sequenz und ihrer Anordnung in der Sequenz eines nicht-zielgerichteten Enzyms oder durch Untersuchung der bekannten oder vorhergesagten dreidimensionalen Struktur des nicht-zielgerichteten Enzyms identifiziert werden.
  • Platzierung von varianten Sequenzen in β-Lactamase: In einer anderen Ausführungsform sieht die vorliegende Erfindung eine zielgerichtetes β-Lactamase(BLA)-Enzym und Verfahren zur Herstellung und Verwendung von zielgerichteten BLA-Enzymen, insbesondere in Kombination mit einem Proarzneistoff, vor. BLA und tumorspezifische Antikörperfragmente haben vielversprechende Ergebnisse in Experimenten gezeigt, welche die zielgerichtete Abgabe von Krebsarzneistoffen testeten; siehe Siemers et al., Bioconjug. Chem. 8: 510 (1997). Die Inspektion der verfügbaren Kristallstruktur enthüllt eine Anzahl von Loops, welche Kandidaten für variationstolerante Sequenzen sind. Von besonderem Interesse, aber keinesfalls von alleinigem Interesse, sind die folgenden Bereiche des Proteins, welche oberflächenzugänglich und nicht Teil von Sekundärstruktur-Elementen sind: Q23-P26, A50-P56, G81-R105, G116-A127, P140-T146, L184-K193, Y203-S212, E241-D245, N275-A280, A294-K309.
  • Konstruktion von varianten Sequenz-Repertoires
  • Die 7 zeigt das Gesamtverfahren zum Erzeugen von varianten Sequenz-Repertoires, Rekombinieren derselben und Erzeugen einer großen Vielzahl von Enzymvarianten, die sich hinsichtlich der Aminosäuresequenzen, welche die Targeting-Stelle des Enzyms aufbauen, unterscheiden. Die resultierende Mischung von Enzymvarianten muss durchsucht werden, um Varianten zu identifizieren, welche das Ziel von Interesse binden. Dies kann beispielsweise durch Screening, Massenspektroskopie oder Phagendisplay erfolgen. Der Fachmann auf dem Gebiet kennt viele Verfahren zur Erzeugung von Bibliotheken von rekombinierten varianten Sequenzen, einschließlich, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, diejenigen Verfahren, welche nachstehend beschrieben sind.
  • Zusammenfügen von mehreren Restriktions- oder PCR-Fragmenten: Man isoliert Mischungen von Nukleinsäuren, welche für jedes variante Sequenz-Repertoire codieren. Diese Nukleinsäuren können z. B. durch PCR oder durch Verdau von Plasmidmischungen mit Restriktionsenzymen hergestellt werden. In einer anderen Ausführungsform werden die Nukleinsäuren durch Verdau von Plasmiden mit Hapaxomeren erzeugt. Dann kann man die varianten Sequenz-Repertoires mischen und Volllängen-Plasmide mittels Ligation zusammenbauen. Alternativ dazu kann man die individuellen varianten Sequenzen aus jedem Klon in den varianten Sequenz-Repertoires isolieren und sie dann zur Erzeugung der Bibliothek mischen. Dieses Verfahren erfordert den Umgang mit vielen DNA-Proben, wobei man jedoch in die Lage versetzt wird, die relative Häufigkeit jeder varianten Sequenz in der Bibliothek zu steuern.
  • Phoenix-Mutagenese: Phoenix-Mutagenese ist als ein Vorgehen zum Einbringen von Mutationen in ein Plasmid beschrieben worden; sehe Berger et al., Anal. Biochem. 214: 571 (1993). Man kann ein Plasmid mit hoher Effizienz verdauen und erneut zusammenfügen, wenn Endonukleasen, die nicht-palindromische Überhänge erzeugen, d. h. Hapaxomere, verwendet werden. In der vorliegenden Erfindung wird die Vorgehensweise modifiziert, um die effiziente Rekombination von varianten Sequenz-Repertoires zu gestatten, wie es in der 3 veranschaulicht ist. Das Ausgangsplasmid wird so entworfen, dass die konstanten Segmente, welche die variationstoleranten Sequenzen trennen, mindestens eine Rekombinationsstelle enthalten, welche von einem Hapaxomer gespalten werden kann (angezeigt durch eine vertikale Linie), und jede variationstolerante Sequenz enthält mindestens eine einmalige Restriktionsstelle (Selektionsstellen, angezeigt durch einen Kreis). Alle Rekombinationsstellen können von dem gleichen Hapaxomer erkannt werden, solange die resultierenden Überhänge sich zwischen allen Rekombinationsstellen unterscheiden. Sobald die varianten Sequenz-Repertoires erzeugt worden sind, werden die Plasmide, die für die unterschiedlichen Repertoires codieren, gemischt und an ihren Rekombinationsstellen verdaut. Die resultierenden Fragmente können ligiert werden. Weil alle Rekombinationsstellen unterschiedliche Überhänge aufweisen, werden die meisten der religierten Plasmide, die jeweiligen Sequenzen in der gleichen Reihenfolge wie das Ausgangsplasmid enthalten. Anschließend können die Ligationsprodukte an den Selektionsstellen gespalten werden. Als ein Ergebnis werden alle Ligationsprodukte, welche eine Wildtypversion von einer oder mehreren variationstoleranten Sequenzen tragen, in eine oder mehrere lineare Fragmente zerschnitten werden. Lineare DNA-Moleküle transformieren E. coli mit einer stark verringerten Effizienz. Nur Ligationsprodukte, in welchen jede variationstolerante Sequenz aus einem der varianten Sequenz-Repertoires abstammt, werden kreisförmig bleiben und werden E. coli mit hoher Effizienz transformieren.
  • Bibliotheks-Erzeugung unter Anwendung herkömmlicher Restriktionsenzym-Klonierung: Nachdem die varianten Sequenz-Repertoires erzeugt worden sind, können Regionen, welche die varianten Sequenzen einschließen, unter Anwendung herkömmlicher Klonierungsverfahren aus einem Repertoire in ein anderes kloniert werden. Das Rekombinieren von drei oder mehr Repertoires erfordert die Ligation von drei oder mehr Fragmenten. Dies ist ineffizient, wenn herkömmliche Restriktionsenzyme verwendet werden, da die Fragmente in verschiedenen Reihenfolgen und in beiden Orientierungen ligeren können. Jedoch kann man die Fraktion von korrekt zusammengefügten Plasmiden durch Rekombinieren der variablen Segmente in einem iterativen Verfahren, das mehrere Zwei-Teile-Ligationen beinhaltet, erhöhen. Dieses Verfahren ist in der 4 veranschaulicht.
  • Andere Rekombinationsverfahren: Die einzelnen varianten Sequenz-Repertoires können unter Anwendung jedweder der verfügbaren statistischen Rekombinationsverfahren rekombiniert werden. Ein anderer Weg besteht darin, die Plasmide, welche die verschiedenen varianten Sequenz-Repertoires codieren, zu mischen und die Mischung einer PCR unter Verwendung von Primern zu unterziehen, welche außerhalb aller variablen Segmente sitzen. Es ist bekannt, dass Rekombination während herkömmlicher PCR auftritt. Die Häufigkeit der Rekombination kann erhöht werden durch Anwenden sehr kurzer Verlängerungszeiten, wie beschrieben in Meyerhans et al., Nucleic Acids Res. 18: 1687 (1990).
  • Identifizierung von modifizierten Enzymen, welche ein Ziel binden
  • Aus der Bibliothek kann man eine Mischung des Proteins von Interesse produzieren, enthaltend verschiedene Kombinationen von varianten Sequenzen. Wahlweise kann die Mischung gereinigt werden. Varianten des Proteins, welche an das Ziel binden, können angereichert werden, indem die Mischung über eine Säule oder eine andere Vorrichtung, welche das immobilisierte Ziel trägt, geleitet wird. Alternativ dazu kann die Mischung mit dem Ziel inkubiert werden, um Varianten von Interesse zu binden. In einer anderen Ausführungsform wird die Mischung über eine Affinitätssäule mit dem immobiliserten Ziel geleitet, und anschließend wird die Säule gewaschen, um Varianten mit schwacher oder moderater Affinität für das Ziel zu entfernen. Um das Verfahren zu überwachen, kann die Säule mit einer Lösung gewaschen werden, welche ein chromogenes oder fluorogenes Substrat und gegebenenfalls einen reversiblen Inhibitor enthält, um die Menge an gebundenem Enzym zu verfolgen. Hierduch wird man in die Lage versetzt, eine geeignete Waschdauer zu wählen.
  • Es ist möglich, Mitglieder der Bibliothek mit unerwünschten Affinitäten für Anti-Ziele zu entfernen. Anti-Ziele sind Moleküle oder Strukturen, an welche das letztendliche Protein nicht binden soll. Dies gestattet, Varianten zu identifizieren, welche an das Ziel mit hoher Selektivität binden. Die Entfernung von [einer] Variante, welche an Anti-Ziele bindet, kann durch Inkubieren der Bibliothek oder einer angereicherten Teil-Bibliothek mit dem Anti-Ziel bewerkstelligt werden. Das Anti-Ziel kann immobilisiert sein, um den Vorgang zu erleichtern. Wenn das Ziel an einen Träger (z. B. Harz, Säule, Kunststoff oder Kügelchen) während der Affinitätsanreicherung von Binder gebunden ist, dann ist es wahrscheinlich, dass dieser Träger ein Anti-Ziel darstellt bzw. konstituiert.
  • Die Identität der angereicherten Varianten kann unter Anwendung jedes bekannten Verfahrens bestimmt werden. Zm Beispiel kann die Identität unter Anwendung von Massenspektrometrie bestimmt werden. Dies kann die Elution des gebundenen Proteins erfordern, oder man kann das gebundene Material direkt analysieren. Die Identität des gebundenen Proteins kann auch unter Verwendung einer Kombination von Flüssigkeitschromatographie und Massenspektrometrie bestimmt werden. Um die letztgenannte Analyse zu vereinfachen, kann man das LC/MS-Profil der Mitglieder der variablen Segment-Repertoires bestimmen. Der MS- oder LC/MS-Analyse kann ein proteolytischer oder chemischer Abbauschritt vorangehen, und die Identität der gebundenen Varianten wird dann aus der Identität der Fragmentierungs-Produkte abgeleitet werden.
  • Screening nach Binder durch statistisches Vereinigen: Die Bibliothek kann in eine Anzahl von Vereinigungen bzw. Pools aufgeteilt werden. Alle diese Pools können hinsichtlich ihres Gehaltes an bindenden Varianten getestet werden. Diese Messung kann ähnlich zu ELISA unter Anwendung von Mikrotiter-Platten, welche mit dem Zielprotein beschichtet worden sind, durchgeführt werden. Als ein Ergebnis bestimmt man die Population oder die Populationen, welche die stärksten Binder enthalten. Anschließend können die positiven Populationen weiter unterteilt und gescreent werden, bis einzelne Klone identifiziert werden können, welche dann sequenziert werden können.
  • Ein alternatives Verfahren zur Erzeugung von Subpopulationen besteht darin, die Subpopulation individuell so zu konstruieren, dass alle Mitglieder einer Subpopulation ein variables Segment gemeinsam haben. Durch Identifizieren der Subpopulation, welche den besten Binder enthält, wird man automatisch die Natur eines variablen Fragmentes der am besten bindenden Variante bestimmt haben. Dieser Entwirrungs- bzw. Dekonvolutions-Prozess kann wiederholt werden, bis die Natur aller variablen Segmente bestimmt worden ist. Diese Dekonvolutions-Strategie kann besonders nützlich sein, wenn der Bindungs-Assay einen relativ geringen Durchsatz aufweist.
  • Phagen- oder sonstiger Display:
  • Eine Vielzahl von Verfahren ist beschrieben worden, in welchen Proteinbibliotheken auf der Oberfläche von Phagen, Zellen oder Ribosomen exprimiert werden können. Diesen Verfahren ist gemeinsam, dass alle Bibliotheksmitglieder die codierende DNA mit sich tragen, was die anschließende Identifizierung von bindenden Varianten erleichtern kann.
  • In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine zielgerichtete β-Lactamase erzeugt durch Klonieren einer großen Population von β-Lactamase-Mutanten in den Phagemid-Vektor pCB04. Die Plasmide können dann durch Elektroporation in die XL-1-Blue-Zellen eingebracht werden. Nach Superinfektion mit Helferphage, wie M13K07, werden die XL-1-Blue-Zellen infektiöse Phagenpartikel mit dem Fusionsprotein β-Lactamse-pIII (kleineres Phagen- Hüllprotein) auf der Oberfläche und dem entsprechenden pCB04-Plasmid innerhalb des Phagenpartikels produzieren.
  • Die Phagenbibliothek kann dann verwendet, um spezifische Binder für die Ziele zu selektieren.
  • Das Verfahren des Bio-Panning ist früher in der Literatur beschrieben worden (Barbas et al., Phage Display: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)). Kurz gesagt, wird die Phagenbibliothek zuerst mit Anti-Zielen (irgend etwas anderes als dem beabsichtigten Ziel) inkubiert, um Binder an die Anti-Ziele abzureichern. Nach dem Abreicherungs-Schritt wird die resultierende Bibliothek mit den Zielen inkubiert. Die ungebundenen Phagenpartikel werden mit Puffer abgewaschen, und die gebundenen Phagenpartikel werden entweder durch Säureelution oder Proteaseverdau gewonnen (Ward et al., J. Immunol. Methods, 1996, 189: 73–82, Smith, Science, 1985, 228: S. 1315–7, Smith et al., J. Biol. Chem., 1994, 269: 32788–95, Clackson, et al., Nature, 1991, 352: 624–28). Die Phagenelution wird dann verwendet, um frische XL-1-Blue-Zellen zu infizieren, woran sich die Helferphagen-Superinfektion anschließt, um die Bibliothek zu amplifizieren. Die sekundäre Bibliothek wird für eine zweite Runde des Bio-Panning verwendet. Das gleiche Verfahren kann mehrmalig wiederholt werden, bis ein spezifisch bindender Phagenklon identifiziert ist.
  • Sobald eine Bibliothek hinsichtlich Binder angereichert worden ist, kann sie (durch Transformation oder Transfektion) in einen nicht-permissiven Wirt, wie TOP 10-Zellen (Invitrogen), überführt werden. In nicht-permissiven Wirten wird die Translation der Lactamase nach der His6-Sequenz aufhören. Die resultierende angereicherte Bibliothek kann einem Hochdurchsatz-Screening unterzogen werden, um individuelle Klone mit Affinität für das Ziel von Interesse zu identifizieren.
  • VERFAHREN ZUR ANWENDUNG VON ZIELGERICHTETEN ENZYMEN
  • Aus dem Folgenden wird es dem Fachmann auf dem Gebiet klar werden, dass die zielgerichteten Enzyme dieser Erfindung viele Anwendungen besitzen. Zum Beispiel können die Enzyme in der zielgerichteten Freistzung von Proarzneistoffen in Gewebe, welche einen besonderen Marker (z. B. ein Antigen oder einen Rezeptor) tragen, eingesetzt werden. Alternativ dazu können die Enzyme in ein analytisches Reagenz eingeschlossen werden, ähnlich zu Enzym-Antikörper-Konjugaten, jedoch mit erhöhter Stabilität und Diffusion und mit geringeren Kosten. Die Enzyme können auch als Oberflächenkatalysatoren verwendet werden, zum Beispiel eine zielgerichtete Laccase. Andere Anwendungen schließen z. B. die zielgerichtete Erzeugung einer Verbindung (z. B. H2O2 aus Glucose) und die zielgerichtete Zerstörung von Verbindungen (z. B. eines Metaboliten oder Signalleitungs-Moleküls aus einem besonderen Gewebe) ein.
  • PHARMAZEUTISCHE ZUSAMMENSETZUNGEN
  • Die zielgerichteten Enzyme, dafür codierende Nukleinsäuren, und Proarzneistoffe (hierin ebenfalls bezeichnet als "aktive Verbindungen"), welche hierin beschrieben sind, können in pharmazeutische Zusammensetzungen eingebracht werden, die zur Verabreichung geeignet sind. Derartige Zusammensetzungen umfassen typischerweise die aktive Verbindung und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger. Wie hierin verwendet wird mit dem Ausdruck "pharmazeutisch annehmbarer Träger" beabsichtigt, jegliche und alle Lösungsmittel, Dispersionsmedien, Beschichtungen, antibakteriellen und antifungalen Mittel, isotonischen und Absorptions-verzögernde Mittel und dergleichen, welche mit einer pharmazeutischen Verabreichung verträglich sind, einzuschließen. Die Verwendung solcher Medien und Mittel für pharmazeutisch aktive Substanzen ist im Fachgebiet allgemein bekannt. Mit der Ausnahme dahingehend, dass irgendein herkömmliches Medium oder Mittel mit der aktiven Verbindung unverträglich ist, wird die Verwendung davon in den Zusammensetzungen in Betracht gezogen. Ergänzende aktive Verbindungen können auch in die Zusammensetzungen eingebracht werden.
  • Hierin werden Verfahren zur Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen zum Modulieren der Expression oder Aktivität eines zielgerichteten Enzyms, Proarzneistoffs (oder dessen entsprechendem aktiven Arzneistoff) oder einer Nukleinsäure von Interesse beschrieben. Derartige Verfahren umfassen die Formulierung eines pharmazeutisch annehmbaren Trägers mit einem Mittel, welches die Expression oder Aktivität einer aktiven Verbindung von Interesse moduliert. Derartige Zusammensetzungen können ferner zusätzliche aktive Mittel einschließen. Daher werden hier Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung durch Formulieren eines pharmazeutisch annehmbaren Trägers mit einem Mittel, welches Expression oder Aktivität eines zielgerichteten Enzyms, Proarzneistoffs (oder dessen entsprechendem aktiven Arzneistoff) oder einer Nukleinsäure von Interesse moduliert, und einer oder mehreren zusätzlichen aktiven Verbindungen beschrieben.
  • Eine pharmazeutische Zusammensetzung ist formuliert, um mit ihrem beabsichtigten Verabreichungsweg kompatibel zu sein. Beispiele von Verabreichungswegen schließen die parenterale, z. B. intravenöse, intradermale, subkutane, orale (z. B. Inhalation), transdermale (topische), transmucosale und rektale Verabreichung ein. Lösungen oder Suspensionen, die für parenterale, intradermale oder subkutane Anwendung verwendet werden, können die folgenden Komponenten einschließen: ein steriles Verdünnungsmittel, wie Wasser zur Injektion, Kochsalzlösung, fixierte Öle, Polyethylenglycole, Glycerin, Propylenglycol oder andere synthetische Lösungsmittel; antibakterielle Mittel, wie Benzylalkohol oder Methylparabene; Antioxidationsmittel, wie Ascorbinsäure oder Natriumbisulfit; Chelatierungsmittel, wie Ethylendiamintetraessigsäure; Puffer, wie Acetate, Citrate oder Phosphate, und Mittel zur Einstellung der Tonizität, wie Natriumchlorid oder Dextrose. Der pH-Wert kann mit Säuren oder Basen, wie Chlorwasserstoffsäure oder Natriumhydroxid, eingestellt werden. Die parenterale Präparation kann in Ampullen, Ein weg-Spritzen oder Mehrfach-Dosen-Gefäßen, welche aus Glas oder Kunststoff hergestellt sind, eingeschlossen werden.
  • Zur Injektions-Verwendung geeignete pharmazeutische Zusammensetzungen schließen sterile wässrige Lösungen (falls wasserlöslich) oder Dispersionen und sterile Pulver für die improvisierte Herstellung von sterilen injizierbaren Lösungen oder Dispersionen ein. Für die intravenöse Verabreichung schließen geeignete Träger physiologische Kochsalzlösung, bakteriostatisches Wasser, Cremophor ELTM (BASF; Parsippany, NJ) oder Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS), ein. In allen Fällen muß die Zusammensetzung steril sein und sollte zu dem Ausmaß fluide sein, dass eine einfache Spritzbarkeit vorliegt. Sie muss unter den Bedingungen der Herstellung und Lagerung stabil sein und muss gegen die kontaminierende Wirkung von Mikroorganismen, wie Bakterien und Pilzen, konserviert werden. Der Träger kann ein Lösungsmittel oder Dispersionsmedium sein, enthaltend zum Beispiel Wasser, Ethanol, Polyol (zum Beispiel Glycerol, Propylenglycol und flüssiges Polyethylenglycol und dergleichen), und geeignete Mischungen davon. Die richtige Fluidität kann zum Beispiel durch die Verwendung einer Beschichtung, wie Lecithin, durch Beibehalten der erforderlichen Teilchengröße im Falle einer Dispersion und durch die Verwendung von Tensiden aufrecht erhalten werden. Die Verhinderung der Wirkung von Mikroorganismen kann durch verschiedene antibakterielle und antifungale Mittel erzielt werden, zum Beispiel Parabene, Chlorbutanol, Phenol, Ascorbinsäure, Thimerosal und dergleichen. In vielen Fällen wird es bevorzugt, isotonische Mittel, zum Beispiel Zucker, Polyalkohole, wie Mannitol, Sorbitol, Natriumchlorid, in der Zusammensetzung einzuschließen. Die verlängerte Absorption der injizierbaren Zusammensetzungen kann durch Einschließen eines Mittels in die Zusammensetzung herbeigeführt werden, welches die Absorption verzögert, zum Beispiel Aluminiummonostearat und Gelatine.
  • Sterile injizierbare Lösungen können hergestellt werden durch Einbringen der aktiven Verbindung in der erforderlichen Menge in einem geeigneten Lösungsmittel mit einem oder einer Kombination der oben aufgezählten Bestandteile, nach Bedarf, woran sich das Sterilfiltrieren anschließt. Im Allgemeinen werden Dispersionen durch Einbringen der aktiven Verbindung in ein steriles Vehikel hergestellt, welches ein Grund-Dispersionsmedium und die erforderlichen anderen Bestandteile aus denjenigen, welche oben aufgezählt wurden, enthält. Im Fall von sterilen Pulvern für die Herstellung von steril injizierbaren Lösungen sind die bevorzugten Herstellungsverfahren das Vakuumtrocknen und Gefriertrocknen, welches ein Pulver des aktiven Bestandteils plus irgendeinem zusätzlichen gewünschten Bestandteil aus einer zuvor sterilfiltrierten Lösung davon ergibt.
  • Orale Zusammensetzungen schließen im allgemeinen ein inertes Verdünnungsmittel oder einen eßbaren Träger ein. Sie können in Gelatinekapseln eingeschlossen oder zu Tabletten komprimiert werden. Für die Zwecke einer oralen therapeutischen Verabreichung kann die aktive Verbindung mit Exzipienten eingebunden und in der Form von Tabletten, Pastillen oder Kapseln verwendet werden. Orale Zusammensetzungen können des Weiteren unter Verwendung eines fluiden Trägers zur Anwendung als Mundspülung hergestellt werden, wobei die Verbindung in dem fluiden Träger oral angewandt und gegurgelt und expektoriert oder geschluckt wird.
  • Pharmazeutisch verträgliche Bindungsmittel und/oder Hilfsmaterialien können als Teil der Zusammensetzung eingeschlossen werden. Die Tabletten, Pillen, Kapseln, Pastillen und dergleichen können jedweden der folgenden Bestandteile, oder Verbindungen einer ähnlichen Natur, enthalten: ein Bindemittel, wie mikrokristalline Cellulose, Gummi-Tragant oder Gelatine; einen Exzipienten, wie Stärke oder Lactose, ein Zerfallsmittel, wie Alginsäure, Primogel oder Maisstärke; ein Schmiermittel wie Magnesiumstearat oder Sterotes; ein Gleitmittel wie colloidales Siliciumdioxid; einen Süßstoff, wie Saccharose oder Saccharin; oder ein Geschmacksmittel, wie Pfefferminze, Methylsalicylat oder Orangen-Aroma.
  • Zur Verabreichung durch Inhalation werden die Verbindungen in der Form eines Aerosol-Sprays aus einem druckbeaufschlagten Behälter oder Spender abgegeben, welcher ein geeignetes Treibmittel, z. B. ein Gas, wie Kohlendioxid, oder einen Zerstäuber enthält.
  • Die systemische Verabreichung kann auch auf transmucosalem oder transdermalem Wege erfolgen. Für transmucosale oder transdermale Verabreichung werden Penetrationsmittel, die geeignet für die zu durchdringenden Barriere sind, in der Formulierung verwendet. Solche Penetrationsmittel sind im Fachgebiet allgemein bekannt und schließen zum Beispiel, für transmucosale Verabreichung, Detergenzien, Gallensalze und Fusidinsäure-Derivate ein. Eine transmucosale Verabreichung kann durch die Verwendung von Nasensprays oder Suppositorien bewerkstelligt werden. Für die transdermale Verabreichung werden die aktiven Verbindungen zu Balsam, Salben, Gelen oder Crems formuliert, wie es allgemein im Fachgebiet bekannt ist.
  • Die Verbindungen können auch in der Form von Suppositorien (z. B. mit herkömmlichen Suppositorien-Grundlagen, wie Kakaobutter und anderen Glyceriden) oder als Retentions-Klistiere für rektale Zuführung hergestellt werden.
  • In einer Ausführungsform werden die aktiven Verbindungen mit Trägern hergestellt, welche die Verbindung gegen die rasche Eliminierung aus dem Körper schützen werden, wie einer Formulierung mit regulierter Freisetzung, einschließlich Implantaten und mikroverkapselten Zuführungssystemen. Biologisch abbaubare, biokompatible Polymere können verwendet werden, wie Ethylenvinylacetat, Polyanhydride, Polyglycolsäure, Collagen, Polyorthoester und Polymilchsäure. Verfahren zur Herstellung solcher Formulierungen werden dem Fachmann auf dem Gebiet offensichtlich sein. Die Materialien können auch kommerziell von Alza Corporation und Nova Pharmaceuticals, Inc., erhalten werden. Liposomale Suspensionen (einschließlich Liposomen, zielgerichtet auf infizierte Zellen, mit monoklonalen Antikörpern gegen virale Antigene) können ebenfalls als pharmazeutisch annehmbare Träger verwendet werden. Diese können gemäß dem Fachmann auf dem Gebiet bekannten Verfahren hergestellt werden, zum Beispiel wie beschrieben im U.S.-Patent Nr. 4 522 811 .
  • Es ist besonders vorteilhaft, orale oder parenterale Zusammensetzungen in Dosierungseinheitsform für die Leichtigkeit der Verabreichung und die Gleichmäßigkeit der Dosierung zu formulieren. Dosierungseinheitsform wie hierin verwendet, bezieht sich auf physikalisch diskrete Einheiten, geeignet als Einheits-Dosierungen für das zu behandelnde Subjekt; wobei jede Einheit eine vorbestimmte Menge an aktiver Verbindung, berechnet zur Hervorbringung des gewünschten therapeutischen Effekts, in Assoziation mit dem erforderlichen pharmazeutischen Träger enthält. Die Spezifikation für die Dosierungseinheitsformen der Erfindung wird diktiert von und ist direkt abhängig von den einzigartigen Merkmalen der aktiven Verbindung und dem zu erzielenden jeweiligen therapeutischen Effekt, und den eigenen Beschränkungen auf dem Fachgebiet der Compoundierung einer derartigen aktiven Verbindung für die Behandlung von Individuen.
  • Wie hierin definiert ist eine therapeutisch wirksame Menge eines zielgerichteten Enzyms (d. h. eine effektive Dosierung) die Menge des zielgerichteten Enzyms, welche an ein Subjekt verabreicht wird, um einen gewünschten therapeutischen Effekt in dem Subjekt hervorzurufen. Im Falle von zielgerichteten Enzymen, welche als Teil von Therapieanwendungen mit zielgerichtetem Enzym und Proarzneistoff verwendet werden sollen, ist eine therapeutisch wirksame Menge des zielgerichteten Enzyms eine Menge, die ausreicht, um genug Proarzneistoff in aktiven Arzneistoff umzuwandeln, damit ein Symptom der behandelten Krankheit gelindert wird.
  • Typischerweise wird die an ein Subjekt zuzuführende Menge an zielgerichtetem Enzym von einer Reihe von Faktoren abhängen, einschließlich zum Beispiel dem Weg der Verabreichung, der Aktivität des zielgerichteten Enzyms, dem Ausmaß, zu welchem es spezifisch zu den gewünschten Zellen, Geweben oder Organen des Subjekts zielgerichtet wird, der erforderlichen Zeitdauer, um das nicht-spezifisch gebundene zielgerichtete Enzym aus dem Subjekt zu entfernen, dem gewünschten therapeutischen Effekt, der Körpermasse des Subjekts, dem Alter des Subjekts, dem allgemeinen Gesundheitszustand des Subjekts, dem Geschlecht des Subjekts, der Ernährung des Subjekts, der Immunantwort des Subjekts auf das zielgerichtete Enzym, anderen Medikamenten oder Behandlungen, welche dem Subjekt verabreicht werden, der Schwere der Krankheit und dem vorhergehenden oder zukünftig antizipierten Verlauf der Behandlung.
  • Für Anwendungen, in welchen ebenfalls ein Proarzneistoff verabreicht wird, werden andere Faktoren, welche die Bestimmung einer therapeutisch wirksamen Dosis beeinflussen, zum Beispiel die Menge an verabreichten Proarzneistoff, die Aktivität des Proarzneistoffs und seines entsprechenden aktiven Arzneistoffs, und die Nebenwirkungen oder Toxizitäten des Proarzneistoffs und des aktiven Arzneistoffs einschließen.
  • Beispiele von Massenbereichen an zielgerichtetem Enzym/Masse des Subjekts schließen, zum Beispiel, etwa 0,001 bis 30 mg/kg Körpergewicht, etwa 0,01 bis 25 mg/kg Körpergewicht, etwa 0,1 bis 20 mg/kg Körpergewicht und etwa 1 bis 10 mg/kg, 2 bis 9 mg/kg, 3 bis 8 mg/kg, 4 bis 7 mg/kg oder 5 bis 6 mg/kg Körpergewicht ein.
  • In einem besonderen Beispiel wird ein Subjekt mit einem zielgerichteten Enzym im Bereich zwischen etwa 0,1 und 20 mg/kg Körpergewicht einmal wöchentlich während etwa 1 bis 10 Wochen, vorzugsweise zwischen 2 bis 8 Wochen, weiter bevorzugt zwischen etwa 3 bis 7 Wochen und noch weiter bevorzugt während etwa 4, 5 oder 6 Wochen behandelt. Es wird ebenfalls richtig eingeschätzt werden, dass die effektive Dosierung an zielgerichtetem Enzym über den Verlauf einer jeweiligen Behandlung steigen oder sinken kann. Änderungen hinsichtlich der Dosierung können aus den Ergebnissen von diagnostischen Assays, wie hierin beschrieben, resultieren und offensichtlich werden.
  • Eine Verabreichung von zielgerichtetem Enzym kann systemisch sein. Die Verabreichung von zielgerichtetem Enzym kann bei oder nahe dem zu bindenden Ziel erfolgen.
  • Ein Proarzneistoff kann ebenfalls an das Subjekt verabreicht werden. Es versteht sich, dass geeignete Dosen an Proarzneistoffen von einer Anzahl von Faktoren innerhalb des Kenntnisstandes des Durchschnitts-Arztes, -Tierarztes oder -Wissenschaftlers abhängen. Die Dosierung(en) des Proarzneistoffs werden zum Beispiel von denselben Faktoren abhängen, welche obenstehend als Faktoren angegeben wurden, die die effektive Dosis des zielgerichteten Enzyms beeinflussen. Beispielhafte Dosen schließen Milligramm- oder Mikrogramm-Mengen des Proarzneistoffs pro Kilogramm des Subjekts oder Probengewichts ein (z. B. etwa 1 Mikrogramm pro Kilogramm bis etwa 500 Milligramm pro Kilogramm, etwa 100 Mikrogramm pro Kilogramm bis etwa 5 Milligramm pro Kilogramm, oder etwa 1 Mikrogramm pro Kilogramm bis etwa 50 Mikrogramm pro Kilogramm). Es versteht sich darüber hinaus, dass geeignete Dosen eines Proarzneistoffs von der Wirkungskraft des Proarzneistoffs in Bezug auf den gewünschten therapeutischen Effekt abhängen. Wenn einer oder mehrere dieser Proarzneistoffe an ein Tier (z. B. einen Menschen) verabreicht werden sollen, kann ein Arzt, Tierarzt oder Wissenschaftler beispielsweise zuerst eine relativ niedrige Dosis verschreiben, wobei die Dosis anschließend erhöht wird, bis eine angemessene Antwort erhalten wird.
  • Die Zeitgebung der Verabreichung des Proarzneistoffs ist ein anderer wichtiger Faktor, der zu berücksichtigen ist. Vorzugsweise wird das zielgerichtete Enzym an das Sujekt verabreicht, wonach der Proarzneistoff verabreicht wird. Weiter bevorzugt ist die Zeit zwischen der Verabreichung des zielgerichteten Enzyms und der Verabreichung des Proarzneistoffs ausreichend, um zu gestatten, dass sich der Proarzneistoff an seiner Zielstelle durch Bindung an sein Ziel anreichert, und um zu gestatten, dass nicht-gebundenes zielgerichtetes Enzym aus den nicht-angezielten Bereichen des Körpers des Subjekts geklärt bzw. entfernt wird. Am stärksten bevor zugt wird das Verhältnis von Ziel-gebundenem zielgerichteten Enzym zu nicht-gebundenem zielgerichteten Enzym im Körper des Subjekts bei oder nahe seinem Maximum sein, wenn der Proarzneistoff verabreicht wird. Die nach Verabreichung des zielgerichteten Enzyms notwendige Zeit zum Erreichen dieses Punktes wird die "Clearing"- bzw. Klärungszeit genannt. Die Klärungszeit kann bestimmt oder abgeschätzt werden in einem experimentellen System zum Beispiel durch Verabreichen eines detektierbaren zielgerichteten Enzyms (z. B. eines radioaktiv markierten oder fluoreszent markierten zielgerichteten Enzyms) an ein Subjekt und gleichzeitiges Messen der Menge an Enzym an der Zielstelle und an einer nicht-angezielten Kontrollstelle in zeitlichen Abständen. Für einige Proarzneistoffe, insbesondere diejenigen, deren aktive Arzneistoff-Gegenstücke hoch toxisch sind, kann es wichtiger sein, zu gewährleisten, dass die Spiegel an nicht-gebundenem zielgerichteten Enzym in dem System des Subjekts unterhalb einer gewissen Schwelle liegen. Dies kann ebenfalls experimentell bestimmt werden, wie oben beschrieben.
  • Die Verabreichung des Proarzneistoffs kann systemisch erfolgen. Die Verabreichung des Proarzneistoffs kann am oder nahe zum zu bindenden Ziel stattfinden.
  • Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können in einem Behälter, einer Packung, einem Spender oder einem Kit, zusammen mit Anweisungen zur Verabreichung, enthalten sein.
  • BEISPIELE
  • Die folgenden Beispiele sind lediglich zu veranschaulichenden Zwecken angegeben und sollten nicht als die Erfindung in irgendeiner Weise einschränkend interpretiert werden.
  • Beispiel 1: Selektion von variablen Loops in β-Lactamase (BLA)
  • Dieses Beispiel demonstriert, das variationstolerante Sequenzen in einer β-Lactamase identifiziert und mit Repertoires von varianten Sequenzen ersetzt werden können.
  • Die p99-β-Lactamase von E. cloacae (pdb-Zugangs-Nr. 1BLS) besitzt die Sequenz, wie in 1 veranschaulicht, wobei die 20 Aminosäurereste Pro-Sequenz deletiert sind. Diese Struktur wurde von Hand inspiziert, um Reste zu identifizieren, welche auf der Oberfläche zu liegen und nicht an einer definierten Sekundärstruktur beteiligt zu sein schienen, und diese Reste sind im Fettdruck dargestellt. Reste der aktiven Stelle sind mit * markiert. Loops an den Aminosäurereste 116–127 und 295–306 sind in der Nachbarschaft der aktiven Stelle. Die Struktur wurde zu einem nahen Homolog 1GCE (69% Homologie) verglichen und es gab keine Strukturabweichung bei 1,5 Ǻ. Die Struktur wurde ebenfalls zu einem entfernten Homolog, 1PTE (20% Homologie) verglichen. Die Regionen, welche strukturell nicht-konserviert waren, sind in Kursivdruck markiert. Verschiedene Insertionen und Deletionen sind, basierend auf dieser Homologie, erlaubt.
  • Loop-Modellierung: Die variablen Loops eines Antikörpers (1SM3) gegen ein Tumorantigen-Peptid wurden auf p99 modelliert. Dies war aufgrund der abweichenden Topologie der zwei Moleküle nicht erfolgreich. P99 wurde dann hinsichtlich potentieller Loop-variabler und Loop-Insertions-Stellen, basierend auf den ungefähren Abständen dazwischen und strukturellen Motiven der 1SM3-Schwerkette, inspiziert. Die Antikörper-CDRs bilden alle verbindende Stränge zwischen β-Blättern. Die Distanz zwischen den 3 Loops in 1SM3.H beträgt 4–9 Ǻ und 6–10 Ǻ, abhängig davon, wo die Messungen vorgenommen wurden.
  • Die folgenden Loops wurden als mögliche variationstolerante Sequenzen in P99 herausgesucht (siehe 1):
    • Loop A: Zwischen Rest Y34 und K37. Zwölf Reste der 14 aus CDR2 von 1SM3 wurden hineinmodelliert. Die Modellierung zeigte an, dass 5 B 12-Reste in diese Region konstruiert werden [können].
    • Loop B: Zwischen N302 und S311. Neun Reste der 10 aus der erweiterten CDR1 von 1SM3 wurden hineinmodelliert. Die Modellierung zeigte an, dass 7–10 Reste in diese Region einkonstruiert werden können (d. h. minimale resultierende Schleifenlängen-Änderung). Es gab Hinweise, dass die Reste 297–302 (mit Ausnahme von 298, welcher eine versenkte Seitenkette aufweist) ebenfalls einer Änderung zugänglich sind.
    • Loop C: Zwischen den Resten P330 und Q333. Sechs Reste der 7 aus CDR3 von 1SM3 wurden hineinmodelliert. Die Modellierung zeigte an, dass 5–8 Reste in diese Region einkonstruiert werden können.
  • Zwei andere erweiterte bzw. herausreichende Regionen sind auf der gleichen Fläche wie die Loops A, B und C, welche einer Änderung zugänglich sind: Loop D, zwischen Rest E241 und L248, und Loop E zwischen den Resten M273 und A280. Es gab Hinweise, dass 6–10 Reste in diese Regionen technisch eingebracht werden [können].
  • Die Schleifen A, B und C Wechselwirken (~8–10 Ǻ), A, C und D Wechselwirken (14 Ǻ ohne Insertion in D), und B, C und E Wechselwirken (10 Ǻ ohne Insertion in D). Die Reste 279–309 sind in der homologen (Dipeptidase) Struktur 1PTE deletiert.
  • Konstruktion eines synthetischen BLA-Gens: Das Plasmid pK1841 wurde aus pK184 (siehe Jobling et al., (1990) Nucleic Acids Res. 18: 5315–6) konstruiert durch Deletieren seines lacZ-Gens und Einführen von EcoRI- und SalI-Restriktionsstellen unter Verwendung eines PCR-basierenden Verfahrens. Ein Abschnitt von pK184 wurde unter Verwendung folgender Primer amplifiziert:
    Figure 00680001
  • Zwei μl jedes Primers (25 μM) wurden mit 10 μl 10 × pfu-Puffer, 3 μl dNTP (10 mM), 2 μl pK 184, 2 μl pfu TURBOTM und 80 μl H2O vereinigt (alle Reagenzien und Enzyme von Stratagene, La Jolla, CA). Die Reaktion wurde über 16 Zyklen laufen gelassen, wobei jeder Zyklus aus 30 s bei 95°C, 1 min bei 55°C und 6 min bei 68°C bestand. Dann wurde 1 μl DpnI (Roche, Indianapolis, IN) zu den PCR-Produkten zugegeben, um Matrizen-DNA zu verdauen. Fünf μl der resultierenden Mischung wurden verwendet, um 50 μl chemisch kompetente TOP10-Zellen (Invitrogen, Carlsbad, CA) zu transformieren, und die Transformation wurde auf Platten mit LA + 50 ppm Kan ausplattiert. Die Platten wurden über Nacht bei 37°C inkubiert. Acht Kolonien wurden herausgesucht bzw. gepickt, und Plasmide wurden unter Anwendung eines Qiagen-Miniprep-Kits (Qiagen, Valencia, CA) isoliert. Die isolierten Plasmide wurden auf 1,2%igem Agarose-e-Gel (Invitrogen) parallel mit pK184 laufen gelassen, und zwei von ihnen wurden durch Sequenzierung bestätigt. Diese erhielten den Namen pK1841.
  • pTDS004 (5) wurde durch Subklonieren eines synthetischen AmpC-Gens aus pPCRSCRIPTTM (Aptagen, Herndon, VA) in pK1841 konstruiert. Das synthetische AmpC-Gen codiert die Aminosäuresequenz des E. cloacae-P99-AmpC-Gens, besitzt aber einzigartige Restriktionsstellen zwischen den variablen Loops. Im Besonderen wurden Typ-IIS-Enzyme gewählt, welche nicht-palindromische Überhänge erzeugen. Es wurden keine Aminosäureänderungen eingeführt.
  • In separaten Reaktionen wurden jeweils 2 μg von pK1841 und pPCRSCRIPTTM-AmpC mit 20 Units EcoRI und SalI (Roche) in 50 μl bei 37°C während zwei Stunden verdaut. Die Verdaus wurden auf einem 1,2%igen e-Gel laufen gelassen, und ein 2,1 kb großes Fragment aus pK1841 und ein 1,2 kb großes Fragment aus dem pPCRSCRIPTTM-AmpC-Gen wurden unter Verwendung des Qiagen-Gelreinigungs-Kits über ein Gel gereinigt. Einhundert μg verdauter Vektor pK1841 wurde mit 120 ng Insert aus pPCRSCRIPTTM-AmpC unter Verwendung von Takara-Ligase (Panvera, Madison, WI) bei 16°C über Nacht ligiert. Fünf μl Ligationsmischung wurden verwendet, um 50 μl chemisch kompetente TOP10-Zellen (Invitrogen) zu transformieren, und es wurde auf LA + 50 ppm Kan und LA + 50 ppm Kan + 0,5 ppm Cefotaxime (CTX, Sigma, St. Louis, MO) ausplattiert. Die Platten wurden bei 37°C über Nacht inkubiert. Sechs Kolonien wurden von LA + 50 ppm Kan-Platten ausgesucht bzw. abgepickt, und Plasmide wurden unter Verwendung eines Qiagen-Miniprep-Kits isoliert. HindIII und BamHI wurden verwendet, um Plasmid zu verdauen, um zu bestimmen, welche Kolonien die korrekte Plasmidkonstuktion aufwiesen. Ein typi scher Verdau wurde unter Verwendung von 0,2 μg Plasmid und 2,5 Units jedes Enzyms in einem Volumen von 20 μl und durch Inkubieren bei 37°C während 1 Stunde durchgeführt. Korrekte Plasmide ergaben Banden von 2,3 kb und 1 kb Fragment auf einem e-Gel. Zwei scheinbar korrekte Plasmide wurden durch Sequenzierung bestätigt und erhielten den Namen pTDS004.
  • pTDS004 enthält einen Plac-Promotor und den nativen ampC-Promotor vor der ampC codierenden Sequenz. Als eine Kontrolle wurde ein äquivalentes Plasmid konstruiert, welches die Wildtyp-Nukleotidsequenz von E. cloacae-ampC trägt. Bei Aufzucht in LB-Medium erzeugten Stämme, welche beide Plasmide tragen, ähnliche Mengen an Nitrocefin-Aktivität, was darauf hinweist, dass das synthetische Gen vollständig funktionell ist.
  • Eine Zwei-Schritt-Klonierungsstrategie wurde entwickelt, welche die Randomisierung von individuellen Loops erlaubt, während die Fraktion von nicht-mutierten Vektor in den resultierenden Populationen minimiert wird. Im ersten Schritt wurde eine Ausstopf- bzw. "Stuffer"-Sequenz eingebracht, welche mindestens ein Stop-Codon und zwei Bbs I-Stellen enthielt. Die verwendete Stuffer-Sequenz sollte Restriktionsstellen bereitstellen und zur Inaktivierung des Gens zum Beispiel durch Rasterverschiebungen oder Stop-Codons führen. Im zweiten Schritt wurde der Stuffer mit Bbs I geschnitten, und eine synthetische Cassette, welche partiell randomisierte Oligonukleotide enthielt, wurde inseriert. Das Verfahren ist in der 6 veranschaulicht, und dieses Schema wurde angewandt, um die Schleifen bzw. Loops A, B, C und D zu modifizieren. In allen Fällen wurden zwischen 104 und 107 Transformanten erhalten.
  • Oligonukleotide: Die folgenden Oligonukleotide wurden verwendet, um jeden Loop zu modifizieren. Zusätzlich zu den standardmäßigen Nukleotidabkürzungen bezeichnet N eine äquimolare Mischung von A, C, G und T; D bezeichnet eine äquimolare Mischung von A, G und T; H bezeichnet eine äquimolare Mischung von A, C und T; S bezeichnet eine äquimolare Mischung von C und G.
  • Loop A
  • Mutagene Primer zum Konstruieren von pME20P (A8):
    Figure 00690001
  • Loop B
  • LoopB-Stuffer:
    Figure 00700001
  • Mutagene Primer zum Konstruieren von pAL14P (B8):
    Figure 00700002
  • Mutagene Primer zum Konstruieren von pAL16P (B14):
    Figure 00700003
  • Mutagene Primer zum Konstruieren von pAL18P (B14 fokussiert):
    Figure 00700004
  • Loop D
  • LoopD-Stuffer:
    Figure 00710001
  • Mutagene Primer zum Konstruieren von pME28P (D6):
    Figure 00710002
  • Mutagene Primer zum Konstruieren von pME29P (D10):
    Figure 00710003
  • Bibliotheken wurden wie folgend konstruiert:
  • Konstruktion von pME20P (Primäre Bibliothek)
  • Das Plasmid pTDS004 wurde mit den Enzymen DraIII und EcoRV geschnitten, und das Vektorfragment (3266 bp) wurde aus einem 1%igen Agarosegel Gel-gereinigt. Zwei komplementäre Oligos (LA_Stuf1 und LA_Stuf2, nachstehend) wurden aneinander annealed bzw. angelagert, welche BbsI-Stellen für die Klonierung enthalten. Sobald die Oligos aneinandergelagert sind, besitzen sie Enden, die mit DraIII- und EcoRV(glatten)-Enden kompatibel sind. 12,5 μg jedes Oligos wurden kombiniert, und das Volumen wurde mit Tris, pH 8,5, auf 50 μl gebracht. Die Mischung wurde 5 Minuten lang bei 95°C in einem Heizblock erwärmt, danach wurde der Heizblock ausgeschaltet, und die Mischung wurde auf Raumtemperatur abkühlen gelassen.
  • Oligonukleotidsequenzen:
  • LA Stuf1/LA Stuft2:
    Figure 00720001
  • Der Gel-gereinigte Vektor (3,2 kb) wurde an das annealte Insert (ungefähr 84 bp) in einem Molverhältnis von Vektor:Insert von 1:5 ligiert. 90 ng Vektor und 9,5 ng Insert wurden verwendet (insgesamt 99,5 ng). Die Vektor- und Insert-Mischung wurde unter Verwendung von Tris, pH 8,5, auf 10 μl gebracht, 10 μl Takara-Lösung I (Panvera, Madison, WI) wurden zugesetzt, und die Mischung wurde vier Stunden lang bei 16°C in einer MJ-Research-PCR-Maschine (Waltham, MA) annealed. Eine Nur-Vektor-Kontrolle wurde auf die gleiche Weise unter Verwendung des 3,2 kb großen Fragments und von Tris, pH 8,5, bis zu zehn μl, und Zugeben von 10 μl Takara-Lösung I angesetzt. Ligationsreaktionen wurden unter Verwendung des "DNA Clean & Concentrator"-Kit (Zymo Research, Orange, CA) gereinigt. DNA wurde aus Säulen in zwei Zentrifugationen eluiert, wobei jedesmal sechs μl Wasser verwendet wurden (10–12 μl insgesamt). Fünf μl der gereinigten Ligation wurden in 50 μl elektrokompetente Top 10-Zellen (Invitrogen, Carlsbad, CA) transformiert, und sich eine Stunde lang in 250 μl SOC erholen gelassen. Für die Kontrolle wurde in gleicher Weise verfahren. Die Hälfte der Transformation wurde auf einer großen LA + 50 ppm-Kan-Platte ausplattiert, die andere Hälfte auf LA + 0,5 ppm CTX. Es wurde erwartet, dass keine Kolonien auf CTX wachsen, weil das Insert das Gen unterbrechen sollte. Die Platten wurden über Nacht bei 37°C inkubiert. Vier Kolonien wurden von den Platten mit LA + 50 ppm Kan ausgesucht bzw. abgepickt und über Nacht in fünf ml LB + 50 ppm Kan wachsen gelassen. Miniprep-DNA wurde aus den Kulturen hergestellt. Reine DNA aus jedem Klon wurde mit BbsI (2 Stellen sind im Insert enthalten) verdaut, um das korrekte Konstrukt zu identifizieren. Alle acht Klone enthielten das Insert von Interesse, einer wurde durch Sequenzieren bestätigt, und dieses Konstrukt erhielt den Namen pME17.
  • Bibliotheks-Konstruktion:
  • 2,5 μg pME17 wurden 20fach mit zehn μl BbsI in einer 100-μl-Reaktion überverdaut, wodurch ein 3267 bp großes Fragment und ein 75 bp großes Fragment erzeugt wurden. Das 3,2 kb große Fragment wurde Gel-gereinigt aus einem 1%igen Agarosegel, wobei das Qiagen-Reinigungs-Kit verwendet wurde. Das Bibliotheks-Insert von annealten Oligonukleotiden wurde exakt wie oben beschrieben hergestellt.
  • Oligonukleotid-Sequenzen:
    Figure 00720002
  • Figure 00730001
  • Eine 100-ng-Ligation wurde bei einem Molverhältnis von Vektor:Insert von 1:5 angesetzt, wobei 96 ng Vektor (3,2 kb) und 12 ng Insert (ungefähr 90 bp) verwendet wurden. Die DNA wurde miteinander vermischt und unter Verwendung von Tris pH 8,5 auf 10 μl ert-Volumen substituiert wurde. 10 μl Takara-Lösung I wurden zugegeben, und die Reaktionen wurden über Nacht bei 16°C in einer MJ-Research-Maschine inkubiert. Übernacht-Ligationen wurden mit dem "DNA Clean & Concentrator"-Kit gereinigt, und die DNA wurde in zwei Zentrifugationen eluiert, jeweils mit 6 μl Wasser (10–12). Fünf μl (ungefähr 27 ng) jeder gereinigten Ligation wurde in 50 μl elektrokompetente Top 10-Zellen transformiert, und sich 1 Stunde lang in 250 μl SOC erholen gelassen. Transformationen sowohl für Bibliothek als auch Kontrolle wurden unverdünnt (50 μl, oder 1/6 des Transformationsvolumens), 1/10 verdünnt und 1/100 verdünnt sowohl auf großen Platten von LA + 50 ppm Kan als auch LA + 0,5 ppm CTX ausplattiert. Die Transformationsmischung wurde unter Verwendung von 10–15 Glaskügelchen pro Platte ausgebreitet. Die Platten wurden über Nacht bei 37°C inkubiert. Die Gesamtanzahl von Kolonie-bildenden Einheiten, welche erhalten wurde, belief sich auf 2,6 × 104 für LA(50 ppm kan) und 2,5 × 104 für LA(0,5 ppm CTX). Da eine Transformation ungefähr 30000 aktive Kolonien ergab (auf Platten mit LA + 50 ppm Kan + 0,5 ppm CTX), wurde der Maßstab dieses Verfahrens vergrößert, so dass vier Transformationen durchgeführt wurden, um ungefähr 100000 Kolonien auf Platten mit Kan + CTX zu ergeben. Die 22 resultierenden Platten mit LA + 50 ppm Kan + 0,5 ppm CTX aus den vier Transformationen wurden unter Verwendung von 2 ml LB + 50 ppm Kan je Platte und eines Zell-Schabers abgeschabt. Die gesamte Diversität betrug 2,0 × 105 bzw. 2,0 E + 05. Abgeschabte Kolonien von jeder Platte wurden miteinander vereinigt, und ein Gesamtvolumen von 36 ml wurde gewonnen. Die optische Dichte wurde bei OD600 gemessen, und 15 ml 50% Glycerol wurde zu den vereinigten Kolonien für eine Endkonzentration von 15% Glycerol zugegeben. Zwei-ml-Aliquots wurden bei –80°C eingefroren.
  • Konstruktion von pAL16P (Primärbibliothek):
    • Konstruktion von pTDS004BS, B-Loop-Stuffer-Plasmid:
    • pTDS004BS wurde unter Anwendung des gleichen Verfahrens wie für pME17, den A-Loop-Stuffer mit den folgenden Modifikationen konstruiert:
    • NheI und BamHI wurden verwendet, um pTDS004 zu schneiden, und ein 3246 bp großes Fragment wurde über ein Gel gereinigt.
  • Die zwei komplementären Stuffer-Oligos sind (jeweils 74 bp): LB_stuft/LB_stuf2:
    Figure 00740001
  • Konstruktion von pAL16P (B-Loop-Bibliothek):
  • Das Verfahren zur Konstruktion von pAL16P unter Verwendung von zwei Oligonukleotiden war das gleiche wie bei der Konstruktion von pME20P, außer dass die für das Insert verwendeten, komplementären zwei Oligonukleotide die folgenden waren:
    Figure 00740002
  • Die Gesamtzahl an erhaltenen koloniebildenden Einheiten betrug 4,7 × 105 für LA(50 ppm kan) und 3,1 × 105 für LA(0,5 ppm CTX).
  • Für die Konstruktion von pAL16P testeten wir auch ein Verfahren, in welchem die inserierte Region aus drei Oligos besteht. Die 3 Oligos sind:
    Figure 00740003
  • Die Oligos LB_anneal1 und LB_anneal2 können mit den Enden des Oligos LB_All6-1 annealen. In der Annealing-Reaktion wurden 1,5 mal mehr LB_anneal1 und LB_anneal2 im Verhältnis zu LB_All6-1 verwendet.
  • Nach der Ligation wurden Klenow-Fragment und dNTPs zu der Ligationsmischung zugesetzt, um die 42 bp große Lücke auf dem Plasmid zwei Stunden lang bei 37°C aufzufüllen. Dieses Vorgehen führte zu etwa zweimal mehr Transformanten im Vergleich zu dem Protokoll, in welchem lediglich zwei Oligos für die Insertion verwendet wurden.
  • Die resultierende Bibliothek wurde auf LA-Platten, welche 0,5 ppm CTX enthielten, um Varianten zu selektieren, die BLA-Aktivität aufzeigten, wachsen gelassen. Sechsundneunzig Klone wurden zufällig ausgewählt und zur DNA-Sequenzierung weitergegeben. Neunundachtzig Klone ergaben interpretierbare Sequenzen. Siebenundachtzig Klone zeigten Sequenzen, von denen erwartet wurde, in der Bibliothek vorzuliegen. Zwei Klone wiesen Rasterverschiebungen auf, welche wahrscheinlich das Ergebnis von Sequenzierungsfehlern waren.
  • Die nachstehenden Sequenzen repräsentierten ein Beispiel von 10 Sequenzen, welche aus der Bibliothek pAL16P erhalten wurden. Die 14 statistischen Positionen des B-Loops sind hervorgehoben. Die erste Zeile der Alignierung zeigt die Sequenz der Wildtyp-BLA.
  • Figure 00750001
  • Konstruktion von pAL18P (fokusierte B-Loop-Bibliothek):
  • pAL18P ist eine B-Loop-Bibliothek mit 14 Aminosäuren XZXZXZKZXZXZXZ, worin X für F, I, V, S, T, A, Y, N oder D steht, und Z für V, A, E, G, L, P, Q oder R steht. Die Konstruktion von pAL18P war ähnlich wie bei pAL16P, indem mit demselben Stuffer-Plasmid pTDS004BS begonnen wurde. Allerdings wurde das synthetische Insert von den folgenden drei Oligonukleotiden aufgebaut bzw. beinhaltet:
    Figure 00750002
  • Während der Ligation wurde das Oligonukleotid LB_6K7 in 5 fachem Überschuß relativ zum geschnittenen Vektor verwendet, und die Oligonukleotide LB_anneal1 und LB_anneal2 wurden in 7,5 fachem Überschuß relativ zum geschnittenen Vektor verwendet.
  • Nach der Ligation wurden Klenow (Roche, Indianapolis, IN) und dNTPs (Roche, Indianapolis, IN) in vom Hersteller empfohlenen Konzentrationen zugesetzt, um die 42 bp große Lücke im Plasmid zwei Stunden lang bei 37°C aufzufüllen. Anschließend wurde die DNA gereinigt und in TOP10-Zellen transformiert, wie für die Bibliothek pME20P beschrieben. Die Gesamtanzahl von aktiven Klonen belief sich auf 2,4 × 105 auf LA + 0,5 ppm CTX.
  • Konstruktion von pME27P (rekombinierte Bibliothek):
  • Zwei ml gefrorene pME20P-Bibliothek wurden in 100 ml LB + 50 ppm Kan in einem 1-Liter-Kolben wachsen gelassen und bei 37°C vier Stunden lang geschüttelt. Das gleiche wurde für die pAL16P-Bibliothek durchgeführt. DNA wurde unter Verwendung des Qiagen-Miniprep-Kits gereinigt, und fünf μg jeder Bibliothek wurden gleichzeitig mit BglI und DraIII über Nacht bei 37°C verdaut. Der Verdau erzeugte zwei Banden, eine 2,6 kb und die andere 660 bp. Das 2,6 kb große Stück war aus Loop B-Bibliothek entnommen, und das 660 bp große Stück war aus der Loop A-Bibliothek entnommen.
  • Ein zweiter Verdau wurde an der Loop-B-Bibliothek mit Enzymen durchgeführt, welche innerhalb des 660 bp großen Stücks lagen, im Falle eines unvollständigen Verdaus, wodurch ein möglicher Hintergrund von linearer DNA eliminiert wurde. Sowohl MluI als auch SphI wurden zu dem Verdau zugegeben und über Nacht bei 37°C inkubiert. Die Verdaus wurden auf einem 1%igen Gel [aus]laufen gelassen, und das 660-bp-Fragment aus der Loop-A-Bibliothek und das 2,6 kb große Fragment aus der Loop-B-Bibliothek wurden unter Verwendung eines Qiagen-Gel-Reinigungs-Kits gelgereinigt. DNA wurde in 50 μl Wasser eluiert. Unter Verwendung der 660 bp großen Bande aus der Loop-A-Bibliothek und der 2,6 kb großen Bande aus der Loop-B-Bibliothek wurden die zwei Fragmente zusammenligiert, und zwar bei einem Vektor:Insert-Verhältnis von 1:4. 145 ng des 2640-bp-Fragmentes und 36,25 ng des 660-bp-Fragmentes wurden vereinigt, und das Volumen wurde mit Tris pH 8,5 auf 10 μl gebracht. Eine Kontrolle mit Vektor (2,6 kb-Fragment) allein wurde auf die gleiche Weise angesetzt, wobei Tris für das Insertvolumen substituiert wurde. 10 μl Takara-Lösung eins wurden zu jeder Mischung zugegeben, und die Ligationen wurden über Nacht bei 16°C in einer MJ-PCR-Maschine inkubiert. Übernacht-Ligationen wurden unter Verwendung des "DNA Clean & Concentrator"-Kits gereinigt. DNA wurde in zwei Zentrifugationen eluiert, jeweils acht μl pro Zentrifugation (14–16 μl). Fünf μl (30 ng) sowohl von Bibliothek- als auch Kontroll-Ligationen wurden in 50 μl elektrokompetente TOP 10-Zellen transformiert, sich in 250 μl SOC erholen gelassen bzw. aufgenommen, wobei eine Stunde bei 37°C geschüttelt wurde. Beide Transformationen wurden direkt mit 50 μl (1/6 Transformation) ausplattiert, 10-1, und 10-2, auf großen Platten mit LA + 10 ppm Kan und LA + 0,5 ppm CTX, und über Nacht bei 37°C inkubiert. Die Gesamtzahl an erhaltenen koloniebildenden Einheiten belief sich auf 6 × 105 für LA (50 ppm kan) und 6,6 × 104 für LA (0,5 ppm CTX).
  • Konstruktion von pME30P (re-rekombinierte Bibliothek):
  • Die Rekombination, wie beschrieben für pME27P führte zu einer signifikanten Anzahl von Klonen, welche nicht gegen CTX resistent waren, was anzeigt, dass einige der Rekombinanten nicht ein vollständig funktionelles Enzym ergaben. Deshalb wurde die Plasmidmischung, welche pME27P codierte, gespalten und neu ligiert, um neue Kombinationen zwischen den in pME27 enthaltenen varianten Sequenzen zu erzeugen. Das Verfahren der Re-Rekombination ist sehr effektiv, weil es keine Notwendigkeit gab, die Plasmidfragmente nach dem Verdau zu reinigen, was einen Verlust vermeidet, und das Molverhältnis zwischen den Restriktionsfragmenten beträgt exakt eins zu eins, was eine vollständige Religation begünstigt. Dieses Beispiel rerekombinierte zwei Repertoires von varianten Segmenten, aber das Verfahren kann für eine größere Anzahl von varianten Segmenten angewandt werden.
  • Ein ml gefrorene pME27P-Bibliothek wurde aufgetaut und zwischen zwei 250 ml Kulturen mit LB + 10 ppm Kan in 1-Liter-Schüttelkolben bei 37°C während 4–5 Stunden wachsen gelassen. Die Kulturen wurden abzentrifugiert, und Pellets wurden für Qiagen-Maxiprep verwendet, um reine Bibliothek-DNA zu erhalten. 250 ng Bibliothek-DNA wurden DraIII und BglI (die gleichen Enzyme, die zur Erzeugung von pME27P verwendet wurden) in einer 20 μl-Reaktion verdaut. Eine Kontrolle wurde ebenfalls angesetzt, wobei die gleiche Menge an DNA verwendet wurde, zu der jedoch keine Ligase zugegeben wurde. Beide Verdaus wurden über Nacht bei 37°C inkubiert. 5 μl der Reaktionen wurden auf einem 1,2%igen Agarose-e-Gel laufen gelassen, um den Verdau zu bestätigen, wonach die Enzyme 20 Minuten lang bei 65°C hitzeinaktiviert wurden. Zu den verbleibenden 15 μl der Verdaus wurde 15 μl Takara-Ligase-Lösung I zu einem Verdau zugegeben, und 15 μl Tris pH 8,5 zur Kontrolle zugegeben. Die Reaktionen wurden über Nacht in einer MJ-PCR-Maschine bei 16°C inkubiert. Übernacht-Ligationen wurden wiederum durch Verdau mit NheI und EcoRV selektiert, weil diese Stellen zerstört werden sollten, wenn entweder A- oder B-Bibliotheks-Fragment beide im Vektor vorhanden sind. Dieser Schritt eliminiert Wildtyp-Hintergund. Die Ligationen wurden bei 37°C während 3,5 Stunden verdaut. Die Ligationen wurden unter Verwendung des DNA Clean & Concentrator-Kits gereinigt. DNA wurde in zwei Zentrifugationen eluiert, jeweils 8 μl pro Zentrifugation (14–16 μl). Die Bibliothek und die Kontrolle wurden beide transformiert durch Zugeben von 5 μl (22 ng) zu 50 μl elektrokompetenten Top 10-Zellen. [Nach] Erholung in 250 μl SOC während einer Stunde wurden 100 μl (1/6 Transformation) von 10-1- und 10-2-Verdünnungen auf große Platten von LA + 0,2 ppm CTX ausplattiert. 20 μl (1/30) wurden auf kleinen Platten mit LA + 10 ppm Kan ausplattiert. Alle Platten wurden über Nacht bei 37°C inkubiert. Die restliche Transformation wurde bei –80°C mit 50% Glycerol eingefroren. Die Gesamtanzahl von erhaltenen koloniebildenden Einheiten belief sich auf 1,5 × 106 für LA (50 ppm kan) und 1,6 × 106 für LA (0,5 ppm CTX).
  • Die Modifikationen der Loops A, B oder D führte zu einer großen Fraktion von Varianten, welche noch Resistenz gegen Cefotaxim vermittelten (5–50%). Die Modifikation von Loop C führte zu inaktiven Varianten. Die Tabelle 2 listet einige der konstruierten Loop-Bibliotheken auf. TABELLE 2
    Name Randomisierung n (d) Stammform % funktional (c) Zahl an funktionellen Transformanten
    PAL14P B8 pTDS004 ca. 70
    pAL16P B14 pTDS004 ca. 30 3 × 105
    pAL18P B14, fokussiert (a) pTDS004 ca. 70 3 × 105
    pME20P A8 pTDS004 5–10 1 × 105
    pME27P A8 + B14 (b) pTDS004 11–33 1,2 × 105
    pME28P D6 pTDS004 37 2 × 105
    pME29P D10 pTDS004 40
    pCB04-AL8 A8 pCB04 6 1 × 105
    pME30 A8 + B14 (e) pTDS004 99 1,6 × 105
    • a) Diese Bibliothek enthält begrenzte Diversität. Einige Positionen gestatten nur 8 verschiedene Aminosäuren, und andere Positionen erlauben 9 Aminosäuren. Die Position 7 ist lediglich Lysin. Diese Bibliothek erleichtert die Sequenzierung von angereicherten Klonen durch Massenspektrometrie.
    • b) Zwei Bibliotheken, pAL16P und pME20P, wurden rekombiniert. Diese Bibliothek enthält Varaianten, welche sich voreinander in 22 Positionen unterscheiden
    • c) Der Prozentsatz an Gesamtklonen, welche ein funktionelles β-Lactamase-Gen aufweisen, wurde bestimmt, entweder durch Isolieren von zufälligen Klonen und Testen des Wachstums auf ctx-Agar, oder durch Plattieren von Bibliotheken auf Agar, welcher ein Antibiotikum enthielt, das hinsichtlich des Vorliegen des Vektors selektiert, und parallel auf Agar, welcher das gleiche Antibiotikum und ctx enthielt.
    • d) Diese Spalte zeigt die randomisierte variationstolerante Sequenz (Loop A, B, D), und wie viele Positionen randomisiert wurden (angezeigt durch die Zahl im Anschluß an die Loop-Bezeichnung).
    • e) Diese Bibliothek wurde durch Re-Rekombinieren der Loops A und B aus pME27P hergestellt.
  • Sechsundneunzig Klone aus den meisten Bibliotheken wurden sequenziert, um das Mutagenese-Vorgehen zu bestätigen, und ein Ungleichgewicht zu identifizieren, welches aus der Oligonukleotid-Synthese, dem Klonierungs-Vorgehen und der Antibiotikum-Selektion folgen könnte. Mehr als 500 Klone aus verschiedenen Bibliotheken wurden sequenziert, und es wurde beobachtet, dass zwischen 50–95% der Sequenzen mit dem erwarteten Randomisierungs-Schema übereinstimmten.
  • Das Rekombinieren der variationstoleranten Sequenz-Repertoires A und B ergab zwischen 6 und 33% funktionelle Gene. Zehn Varianten wurden statistisch aus dieser Population isoliert, und es wurde bestätigt, dass 9 der 10 Varianten variante Sequenzen in beiden, den A- und B-Positionen, enthielten. Dies ist der Beweis, dass die Erzeugung von Bibliotheken von Varianten, welche mehrere variante Sequenzen enthalten, erzielt werden kann.
  • Beispiel 2 – Expression und Reinigung von BLA.
  • Dieses Beispiel zeigt, dass Milligramm-Mengen von zielgerichteten β-Lactamase(BLA)-Molekülen, welche gemäß der Erfindung hergestellt wurden, exprimiert und gereinigt werden können.
  • Die Enzymproduktion wurde aus 10 BLA-Varianten getestet, welche aus den Bibliotheken pAL14P und pME20P gewählt wurden. Einige der Varianten führen zu einer niedrigen BLA-Produktion bei 37°C. Dies kann durch proteolytischen Abbau verarscht werden. Alle Klone produzierten mindestens 50% Aktivität im Vergleich zum Wildtyp-Stamm, als die Varianten bei 25°C wachsen gelassen wurden. Deshalb können die meisten Mutanten, welche ctx-Resistenz vermitteln, ausreichend Enzym für eine weitere Analyse, sowie für die Identifizierung der gewünschten Targeting-Merkmale, produzieren.
  • Beispiel 3: Affinitäts-Anreicherung von Streptavidin-bindenden BLA-Varianten
  • Dieses Beispiel zeigt, dass die Verfahren der Erfindung angewandt werden können, um zielgerichtete β-Lactamase-Enzyme, welche katalytische Aktivität beibehalten, zu erzeugen.
  • Herstellung von Proben
  • Bibliothek-Herstellung: Ein 250 ml großer Kolben, gefüllt mit Terrific-Kulturbrühe (12 g/l Bactotrypton, 24 g/l Bacto-Hefeextrakt, 4 ml Glycerol, 17 mM KH2PO4 und 72 mM K2HPO4) + 50 ppm Kanamycin, wurde mit einer Abschabung einer gefrorenen Stammlösung der pAL16P1-Bibliothek inokuliert, seriell verdünnt bei 1/26 und 1/676, und bei 25°C unter Schütteln bei 280 U/min wachsen gelassen. Mehrere Verdünnungen wurden durchgeführt, um eine korrekte Erntezeit beim Anfang der stationären Phase zu gewährleisten. Die optische Dichte wurde bei 600 nm bei 18 Stunden gemessen (gemessen 23,8). Das restliche Volumen (~21 ml) wurde durch Zentrifugieren bei 7000 U/min (~4k Schwerkraft) während 20 Minuten abgeerntet, und die Überstandfraktion wurde dekantiert. Das Pellet wurde in 4 ml Puffer A (20% Saccharose (m/v), 200 mM Triethanolamin, 100 mM EDTA, pH = 7) resuspendiert und 20 Minuten bei 4°C rotiert, um den osmotischen Schock des periplasmatischen Raums zu beginnen. Die Probe wurde erneut bei 7000 U/min zentrifugiert, und die Überstandfraktion dekantiert. Das Pellet wurde in 4 ml Puffer B (20 mM Triethanolamin, 0,5 M NaCl, pH = 7) resuspendiert und 20 Minuten lang rotiert. Die Überstandfraktion wurde aufgefangen.
  • Die Wildtyp-β-Lactamase wurde unter Anwendung des gleichen Protokolls produziert.
  • Bibliothekreinigung: Es wurde eine Affinitäts-basierende Reinigung angewandt. Das gewählte Harz ist spezifisch für die aktive Stelle von β-Lactamasen.
  • [Man verwendete] eine fünf ml große Säule von p-Aminophenylboronsäure, die an ein Agarose-Harz (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, Kat.-Nr. A 8530) verknüpft war, unter Anwendung einer 14 cm, 20 ml großen "max bed polypropylen"-BIO-RADTM-Säule (Bio-Rad, Hercules, CA, Kat. Nr. 732–1010).
  • Die Säule wurde mit der gelieferten porösen Fritte auf ~3,5 ml befüllt und gepackt. Die Säule wurde konditioniert mit 10 ml 1 M NaCl, 0,5 M Sorbitol, pH = 7, dann 10 ml 0,5 M Borat, pH = 7, und schließlich 10 ml 20 mM Triethanolamin, 0,5 M NaCl, pH = 7. Die Säule wurde in diesem Puffer aufbewahrt. Das Fluidreservoir wurde vor der Reinigung abgelassen bzw. entleert.
  • 3,5 ml des periplasmatischen Produkts wurden auf die Säule aufgetragen, welche man dann vollständig abfließen ließ. Die Säule wurde mit 3,5 ml an 20 mM Triethanolamin, 0,5 M NaCl, pH = 7, gewaschen, wobei der Auftragpuffer vollständig abfließen gelassen wurde. Gebundenes Protein wurde mit 3,5 ml 0,5 M Borat eluiert, und Fraktionen wurden aufgefangen. Die Säule wurde mit einen zusätzlichen Volumen desselben Puffers rekonditioniert. Schließlich wurde > 5 ml 20 mM Triethanolamin, 0,5 M NaCl, pH = 7, Auftragpuffer durch die Säule fließen gelassen, welche dann aufbewahrt wurde.
  • Die Konzentration von jeder der aufgefangen Fraktionen wurde in der Elutionsfraktion bestimmt, und die β-Lactamase-Aktivität unter Verwendung des Nitrocefin-Substrats (Oxoid BR0063A) im Standardprotokoll gemessen: Eine Substratlösung, die PBS (Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung); 1,25 g/l n-Octyl-β-D-glucopyranosid, 100 mg/l Nitrocefin und 1 g/l DMSO (Dimethylsulfoxid) enthielt, wurde verwendet. Die Reaktion wurde bei 25°C in Mikrotiter-Platten, enthaltend ein Gesamtvolumen von 210 μl pro Vertiefung, verfolgt. Die Absorption bei 486 nm wurde unter Verwendung eines Platten-Lesegeräts von Molecular Devices (Sunnyvale, CA) verfolgt. Der Assay wurde unter Verwendung einer gereinigten Probe von BLA und basie rend auf ihrer Absorption bei 280 nm kalibriert. In diesem Assay wird eine Unit Aktivität als die Menge an BLA-Aktivität definiert, welche eine Rate von 1 mO.D.280/min erzeugt. Wildtyp-BLA aus E. cloacae hat eine spezifische Aktivität von 3,6 U/ng Protein.
  • Die Bibliothek und die gereinigte Wildtyp-β-Lactamase-Stammlösung wurden auf einem PAGE-Gel laufen gelassen, um die Reinheit sichtbar zu machen. Die Gesamtausbeute war ~100 μg gereinigte Bibliothek.
  • Die Bibliothek wurde dann hinsichtlich Bindung an Streptavidin getestet, ein Molekül, das nicht von Wildtyp-β-Lactamase gebunden wird.
  • Ausrüstung: Zwei Amersham-Pharmacia-HiTrap Streptavidin HP, 1 ml-Säulen (Kat.-Nr.: 17-5112-01) mit den enthaltenen Fittings wurden verwendet. Eine peristaltische Pumpe Rainin DYNAMAX (RP-1) (Rainin, Emeryville, CA) mit einem Mehrkanal-Kopf wurde verwendet, um beide Säulen mit geeigneten Rainin-Überdruck-Schläuchen (gauge tubing) für die gewünschte Fliessrate anzutreiben. Zwei kreisförmige Pharmacia-Fraktionssammler (Frac-100) wurden für das Auffangen der Proben verwendet.
  • Methode: Die Chromatographievorrichtung war so konstruiert, dass es eine minimale Verzögerung zwischen der Probeninjektion und dem Auftragen auf die Säule geben wird, sowie mit einem vernachlässigbaren Nachsäulen-Totvolumen. Ein Ventil wurde eingebracht, um zwischen dem Probenauftrag und dem Fluss umzuschalten. 500 μl einer 21-mg/l-Stammlösung von beidem, der gereinigten pAL16P1-Bibliothek und der WT-β-Lactamase, wurden in die Flussleitung bei etwa 1 ml/min für eine Gesamt-Auftragsmenge von 10,5 μg injiziert, gefolgt von der Probe mit 500 μl des Laufpuffers aus der gleichen Spritze. Das Ventil wurde neu eingestellt auf Systemlauf bei ~1 ml/h (1,89 U/min in diesem System). Eine 1-ml-Fraktion wurde jede Stunde aufgefangen. Die Fraktionen wurden hinsichtlich β-Lactamase-Aktivität unter Verwendung des Nitrocefinsubstrats getestet. 300 μl der ersten zehn Fraktionen wurden seriell verdünnt bei 0,4 × von 1 zu 1,7e–5. Ein Probe von 180 μl wurde mit 20 μl Substrat (1,8 mg/ml (3,5 mM) in 0,125% n-Octyl-beta-D-glucopyranosid in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung) geassayt. Proben nach der Fraktion neun wiesen keine nachweisbare Aktivität auf.
  • Ergebnisse: Die Aktivitätswerte wurde relativ zur Aktivität der Proben berechnet, welche auf die Säule aufgetragen worden waren, und sind in der Tabelle 3 angegeben. TABELLE 3
    Fraktion WT pAL16P1
    1 4,18% 1,87%
    2 36,56% 17,83%
    3 21,31% 18,88%
    4 1,49% 8,85%
    5 0,04% 6,44%
    6 0,00% 1,14%
    7 0,00% 0,43%
    8 0,00% 0,02%
    9 0,00% 0,00%
  • Diese Ergebnisse zeigen, dass die Bibliothek von modifizierten β-Lactamase-Enzymen, codiert von pAL16P1, zielgerichtete Enzyme umfasst, die, anders als Wildtyp-β-Lactamase, an ein Ziel, Streptavidin, binden und so in späteren Fraktionen als die Wildtyp-β-Lactamase eluieren, aber dennoch ihre katalytische Aktivität beibehalten.
  • Konstruktion einer β-Lactamase-Phagenbibliothek:
  • Das folgende Beispiel beschreibt die erfolgreiche Erzeugung einer BLA-Phagenbibliothek, umfassend BLA-Enzyme, die innerhalb der variationstoleranten Sequenzen modifiziert sind.
  • Ein Gen, das die p99 β-Lactamase codiert, wurde in den Phagemid-Vektor pCBO4 subkloniert, um pCB04WT zu erzeugen; siehe 8. pCBO4 wurde wie folgend zur Herstellung der PCB04-BL14-Bibliothek verwendet:
    Ein synthetisches BLA-Gen, das das B-Loop-Stuffer-Fragment enthielt, wurde in pCB04 zwischen die SpeI- und AvaI-Stellen kloniert. Der Klon wurde mit BbsI verdaut, und das Vektorfragment wurde durch Gelelektrophorese gereinigt. Die Bibliothek wurde wie oben für die pAL16P-Bibliothek beschrieben hergestellt. Die ligierte DNA wurde dann gereinigt und zum Transformieren von XL-1F'-Blue-Zellen verwendet,
    Eine Fraktion der transformierten Zellen wurde auf Agarplatten ausplattiert, welche entweder fünf mg/ml CMP oder 5 mg/ml CMP + 0,1 mg/ml CTX enthielten. Der Prozentsatz an aktiven Klonen war ähnlich zu jenem der pAL16P-Bibliothek. Die Diversität der Bibliothek wurde basierend auf der Gesamtzahl von aktiven Klonen auf der Platte mit 5 mg/ml CMP + 0,1 mg/ml CTX berechnet.
  • Der Rest der transformierten Zellen wurde 6 h lang bei 37°C in Gegenwart von fünf mg/ml CMP, 10 mg/ml Tetracyclin und 0,1 mg/ml CTX unter Schütteln kultiviert. Die Zelldichte wurde durch ein Spektrometer (OD600) bestimmt. Die Zellen wurden dann mit 10-mal mehr M13K07-Helferphage (Invitrogen) infiziert und 30 min bei 37°C ohne Schütteln inkubiert. Das Gesamt-Kulturvolumen wurde dann mit frischem LB-Medium auf 250 ml gebracht. Die Antibiotikum-Endkonzentration wurde auch auf 5 mg/ml CMP, 10 mg/ml Tetracyclin und 0,1 mg/ml CTX eingestellt. Die Kultur wurde bei 23°C während 48 h unter Schütteln inkubiert. Die Phagenpräparation und anschließende Titrierung wurden unter Verwendung des Protokolls von Barbas et al., Phage Display: A Laboratory Manual, 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ausgeführt.
  • SEQUENZAUFLISTUNG
    Figure 00840001
  • Figure 00850001
  • Figure 00860001
  • Figure 00870001
  • Figure 00880001
  • Figure 00890001
  • Figure 00900001
  • Figure 00910001
  • Figure 00920001
  • Figure 00930001
  • Figure 00940001

Claims (17)

  1. Verfahren zur Herstellung eines zielgerichteten Enzyms, umfassend: a) das Selektieren eines Polynukleotids, das ein modifiziertes Enzym codiert, wobei in das modifizierte Enzym im Vergleich zu einem entsprechenden nicht modifizierten Enzyms ein Peptid eingefügt ist, wobei das nicht modifizierte Enzym und das selektierte modifizierte Enzym eine messbare enzymatische Aktivität aufweisen, und b) das Ersetzen der Nukleotide, die das in das Polynukleotid inserierte Peptid codieren, mit einem Oligonukleotid, welches ein Targeting-Peptid codiert, das ein Ziel bindet, wobei das Enzym mit dem Targeting-Peptid die messbare enzymatische Aktivität besitzt und das Ziel bindet, c) das Exprimieren des zielgerichteten Enzyms von dem Polynukleotid in einem Protein-Expressionssystem.
  2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Ziel ein Molekül ist, welches mit der Außenoberfläche einer Zelle assoziiert ist.
  3. Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei das Molekül aus der Gruppe gewählt ist, die aus einem Protein, einem Peptid, einer Nukleinsäure, einem Kohlenhydrat, einem Lipid, einem Polysaccharid, einem Glykoprotein, einem Hormon, einem Rezeptor, einem Antigen, einem Antikörper, einer toxischen Substanz, einem Metabolit, einem Inhibitor, einem Arzneistoff, einem Farbstoff, einem Nährstoff, einem Wachstumsfaktor und einem Molekül, das Teil der extrazellulären Matrix ist, besteht.
  4. Verfahren gemäß Anspruch 2 oder Anspruch 3, wobei die Zelle eine erkrankte Zelle ist.
  5. Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei die erkrankte Zelle einer Krebszelle oder eine infizierte Zelle ist.
  6. Verfahren gemäß mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, ferner umfassend die Herstellung des Polynukleotids von Schritt (a) durch Einfügen eines Oligonukleotids, das das Peptid codiert, in ein Polynukleotid, das das entsprechende nicht modifizierte Enzym codiert.
  7. Verfahren gemäß Anspruch 6, wobei das Oligonukleotid, das das Peptid codiert, in das Polynukleotid, das das entsprechende nicht modifizierte Enzym codiert, an einer zufälligen Position eingefügt wird.
  8. Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 5, wobei das Polynukleotid, das das modifizierte Enzym mit einer messbaren enzymatischen Aktivität codiert, aus einer Bibliothek von Polynukleotiden, die modifizierte Enzyme codieren, gewählt wird, wobei die Bibliothek Polynukleotide umfasst, welche modifizierte Enzyme codieren, die ein eingefügtes Peptid aufweisen, das ein entsprechendes nicht modifiziertes Enzym nicht hat, und wobei das nicht modifizierte Enzym die messbare enzymatische Aktivität besitzt.
  9. Verfahren gemäß Anspruch 8, ferner umfassend die Herstellung der Bibliothek von Polynukleotiden, welche die modifizierten Enzyme codieren, durch Einfügen eines Oligonukleotids, das ein Peptid codiert, in das Polynukleotid, welches das nicht modifizierte Enzym codiert.
  10. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 5, ferner umfassend die Wiederholung der Schritte (a) und (b) dergestalt, das ein Enzym hergestellt wird, welches die messbare Enzymaktivität aufweist und eine Vielzahl von Targeting-Peptiden besitzt.
  11. Verfahren gemäß Anspruch 10, wobei zwei oder mehrere der Vielzahl von Targeting-Peptiden das gleiche Ziel binden.
  12. Verfahren gemäß Anspruch 10, wobei zwei oder mehrere der Vielzahl von Targeting-Peptiden unterschiedliche Ziele binden.
  13. Verfahren zur Herstellung eines Polynukleotids, das ein zielgerichtetes Enzym codiert, wobei das Verfahren folgendes umfasst: a) das Selektieren eines Polynukleotids, das ein modifiziertes Enzym codiert, wobei in das modifizierte Enzym im Vergleich zu einem entsprechenden nicht modifizierten Enzyms ein Peptid eingefügt ist, wobei das nicht modifizierte Enzym und das selektierte modifizierte Enzym eine messbare enzymatische Aktivität aufweisen, und b) das Ersetzen der Nukleotide, die das in das Polynukleotid inserierte Peptid codieren, mit einem Oligonukleotid, welches ein Targeting-Peptid codiert, das ein Ziel bindet, wobei das Enzym mit dem Targeting-Peptid die messbare enzymatische Aktivität besitzt und das Ziel bindet
  14. Verfahren gemäß Anspruch 13, wobei das Ziel ein Molekül ist, welches mit der Außenoberfläche einer Zelle assoziiert ist.
  15. Verfahren gemäß Anspruch 14, wobei das Molekül aus der Gruppe gewählt ist, die aus einem Protein, einem Peptid, einer Nukleinsäure, einem Kohlenhydrat, einem Lipid, einem Polysaccharid, einem Glykoprotein, einem Hormon, einem Rezeptor, einem Antigen, einem Antikörper, einer toxischen Substanz, einem Metabolit, einem Inhibitor, einem Arzneistoff, einem Farbstoff, einem Nährstoff, einem Wachstumsfaktor und einem Molekül, das Teil der extrazellulären Matrix ist, besteht.
  16. Verfahren gemäß Anspruch 14 oder Anspruch 15, wobei die Zelle eine erkrankte Zelle ist.
  17. Verfahren gemäß Anspruch 16, wobei die erkrankte Zelle einer Krebszelle oder eine infizierte Zelle ist.
DE60317687T 2002-06-12 2003-05-12 Verfahren und zusammensetzungen zur implantation von funktionalen schleifen in ein protein Expired - Lifetime DE60317687T2 (de)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US170387 1998-10-13
US10/170,387 US20030104591A1 (en) 2000-12-14 2002-06-12 Methods and compositions for grafting functional loops into a protein
PCT/US2003/015017 WO2003105753A2 (en) 2002-06-12 2003-05-12 Methods and compositions for grafting functional loops into a protein

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE60317687D1 DE60317687D1 (de) 2008-01-03
DE60317687T2 true DE60317687T2 (de) 2008-10-30

Family

ID=29732482

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE60317687T Expired - Lifetime DE60317687T2 (de) 2002-06-12 2003-05-12 Verfahren und zusammensetzungen zur implantation von funktionalen schleifen in ein protein

Country Status (7)

Country Link
US (2) US20030104591A1 (de)
EP (1) EP1543324B1 (de)
AU (1) AU2003235506A1 (de)
CA (1) CA2488821C (de)
DE (1) DE60317687T2 (de)
DK (1) DK1543324T3 (de)
WO (1) WO2003105753A2 (de)

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4336771B2 (ja) * 2001-03-09 2009-09-30 モルフォシス アーゲー 血清アルブミン結合部分
CA2489596A1 (en) * 2002-06-14 2003-12-24 Dyax Corporation Protein analysis
WO2004001064A2 (en) * 2002-06-21 2003-12-31 Dyax Corporation Serum protein-associated target-specific ligands and identification method therefor
EP1608947A4 (de) * 2002-10-02 2009-06-17 Catalyst Biosciences Inc VERFAHREN ZUR ERZEUGUNG UND PR FUNG AUF PROTEASEN MIT VERûNDERTER SPEZIFIZITûT
EP1564286A1 (de) 2004-02-11 2005-08-17 Université de Liège Hybride Proteine der beta-Lactamase Klasse A
JP5330826B2 (ja) * 2005-04-28 2013-10-30 ジェネンコー・インターナショナル・インク Ｔａｂ分子
WO2009006473A2 (en) * 2007-07-05 2009-01-08 Trustees Of Tufts College Pro-soft polypeptide proteasome inhibitors, and methods of use thereof
AU2010290077C1 (en) 2009-08-24 2015-12-03 Bioverativ Therapeutics Inc. Coagulation factor IX compositions and methods of making and using same
EP3549953A1 (de) 2012-02-15 2019-10-09 Bioverativ Therapeutics Inc. Rekombinante faktor-viii-proteine
ES2771208T3 (es) 2012-02-15 2020-07-06 Bioverativ Therapeutics Inc Composiciones de factor VIII y métodos de preparación y uso de las mismas
WO2015023891A2 (en) 2013-08-14 2015-02-19 Biogen Idec Ma Inc. Factor viii-xten fusions and uses thereof
EA201890423A1 (ru) 2015-08-03 2018-07-31 Биовератив Терапьютикс Инк. Слитые белки фактора ix, способы их получения и применения

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5834247A (en) * 1992-12-09 1998-11-10 New England Biolabs, Inc. Modified proteins comprising controllable intervening protein sequences or their elements methods of producing same and methods for purification of a target protein comprised by a modified protein
US5750356A (en) * 1996-05-31 1998-05-12 Anergen, Inc. Method for monitoring T cell reactivity
US6303573B1 (en) * 1999-06-07 2001-10-16 The Burnham Institute Heart homing peptides and methods of using same
AU2001282949A1 (en) * 2000-07-24 2002-02-05 New York Air Brake Corporation A method of determining train location and track characteristics using navigational data

Also Published As

Publication number Publication date
US20030104591A1 (en) 2003-06-05
CA2488821A1 (en) 2003-12-24
AU2003235506A1 (en) 2003-12-31
AU2003235506A8 (en) 2003-12-31
US20040203107A1 (en) 2004-10-14
DE60317687D1 (de) 2008-01-03
WO2003105753A2 (en) 2003-12-24
CA2488821C (en) 2013-04-16
WO2003105753A3 (en) 2005-04-21
EP1543324B1 (de) 2007-11-21
EP1543324A4 (de) 2005-12-14
EP1543324A2 (de) 2005-06-22
DK1543324T3 (da) 2008-04-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20060141456A1 (en) Methods and compositions for milieu-dependent binding of a targeted agent to a target
DE60317687T2 (de) Verfahren und zusammensetzungen zur implantation von funktionalen schleifen in ein protein
JPH07506338A (ja) 細胞毒性剤治療
CN107073135B (zh) 用于将分子递送至细胞的细胞质中的构建体
CA2488896A1 (en) Multifunctional polypeptides
JPH08509460A (ja) ターゲッティング用化合物
US20060134086A1 (en) Targeted enzymes
US8188240B2 (en) Tab molecules
US20080233100A1 (en) Targeted enzymes
US8728470B2 (en) CAB molecules
US20030147874A1 (en) Targeted enzyme prodrug therapy
US20080248544A1 (en) Methods And Compositions For Grafting Functional Loops Into A Protein
US20110160440A1 (en) Cab Molecules
WO2002047717A2 (en) Targeted enzyme prodrug therapy
CA2431716A1 (en) Targeted enzyme prodrug therapy
US20080044400A1 (en) Targeted enzyme prodrug therapy
JP2003528156A (ja) 標的化のための化合物

Legal Events

Date Code Title Description
8364 No opposition during term of opposition