DE60309620T2

DE60309620T2 - Verfahren zur Bestimmung der Syntheseaktivität von Hydrolasen

Info

Publication number: DE60309620T2
Application number: DE2003609620
Authority: DE
Inventors: Uwe T. Prof. Dr. Bornscheuer; Monika Kanarzycka; Dr. Geoffrey Hills
Original assignee: Degussa GmbH
Current assignee: Evonik Operations GmbH
Priority date: 2002-04-08
Filing date: 2003-03-12
Publication date: 2007-11-22
Anticipated expiration: 2023-03-13
Also published as: ATE345395T1; DE60309620D1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Weg zum Nachweis der Eignung einer speziellen Familie von Enzymen für die Produktion chemischer Verbindungen. Insbesondere richtet sich die Erfindung auf einen Test und ein Verfahren zum Screening von Bibliotheken von Hydrolasen, insbesondere Esterasen, Lipasen, Proteasen, Amidasen und Acylasen hinsichtlich der Leichtigkeit, mit der sie Ver- bzw. Umesterungen in nichtwäßrigen, organischen Medien katalysieren.
Bei den Hydrolasen, insbesondere den Lipasen und Esterasen, handelt es sich um vielseitige Biokatalysatoren, die zunehmend bei organischen Synthesen zur Anwendung kommen (U.T. Bornscheuer, R.J. Kazlauskas, Hydrolases in organic synthesis – regio- and stereoselective biotransformations, Wiley-VCH, Weinheim, 1999; K. Faber, Biotransformations in Organic Chemistry, 4. Aufl., Springer, Berlin, 2000, K. Drauz, H. Waldmann (Hrsg.), Enzymes in Organic Synthesis, Wiley-VCH, Weinheim, 2002). Das Hauptinteresse richtet sich dabei auf ihre gute bis ausgezeichnete Stereoselektivität sowie ihre außergewöhnlich hohe Aktivität und Stabilität in organischen Systemen. Somit kann man nicht nur die Verseifung von Estern untersuchen, sondern auch Synthesereaktionen durchführen. Tatsächlich werden gegenwärtig Reaktionen in ihrer Mehrzahl in organischen Medien und selbst im großtechnischen Maßstab durchgeführt (A. Liese et al. Industrial Biotransformations, Wiley-VCH, Weinheim, 2000; U.T. Bornscheuer, in Biotechnology, Bd. 8b (Hrsg.: H.J. Rehm, G. Reed, A. Pühler, P.J.W. Stadler, D.R. Kelly), Wiley-VCH, Weinheim, 2000, S. 277–294; F. Balkenhohl et al., J. Prakt. Chem. 1997, 339, 381–384). Dazu zählen die Synthese optisch reiner Bausteine, Geschmacks- und Duftstoffe, die Lipidmodifikation sowie die Synthese einfacher Ester, wie beispielsweise Myristylmyristat, für kosmetische Anwendungen.
Die Identifizierung geeigneter Biokatalysatoren erfolgt in der Regel mittels Veresterungsreaktionen im kleinen Maßstab, die sich über GC- oder HPLC-Analyse zur Bestimmung des Umsatzes und – gegebenenfalls – optischer Reinheiten verfolgen lassen. Daher sind breit angelegte Untersuchungen einer großen Anzahl von Enzymen – vor allem enormer, durch gerichtete Evolution zugänglicher Mutantenbibliotheken (F.H. Arnold, A.A. Volkov, Curr. Opin. Chem. Biol. 1999, 3, 54–59; F.H. Arnold, Acc. Chem. Res. 1998, 31, 125–131; U.T. Bornscheuer, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1998, 37, 3105–3108; M.T. Reetz, K.-E. Jaeger, Topic Curr. Chem. 1999, 200, 31–57) – sowie die Optimierung von Reaktionsbedingungen (unterschiedliche Alkohole oder Acyldonoren, Lösungsmittel, Temperaturschwankung usw.) sehr zeitaufwendig.
Als Alternative werden aktive (und stereoselektive) Biokatalysatoren überlicherweise mittels hydrolytischer Tests identifiziert, für die in letzter Zeit eine beträchtliche Anzahl geeigneter Verfahren mit hohem Durchsatz entwickelt wurde (M.T. Reetz, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2001, 40, 284–310; D. Wahler et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2001, 40, 4457–4460; D. Wahler, J.L. Reymond, Curr. Opin. Biotechnol. 2001 12, 535–544 M. Baumann et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2001, 40, 4201–4204 L.E. Janes, R.J. Kazlauskas, J. Org. Chem. 1997, 62, 4560–4561). Unglücklicherweise lassen sich die oben erwähnten Optimierungen nicht in wäßrigen Systemen untersuchen, falls eine Reaktion in organischen Lösungsmitteln vorgesehen ist, wobei es sich häufig herausstellt, daß Ergebnisse aus Hydrolysereaktionen nicht auf die Synthese in organischen Lösungsmitteln oder lösungsmittelfreien Systemen übertragen werden können.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung bestand daher im Auffinden eines Tests, der die Sondierung einer großen Anzahl an Hydrolasen hinsichtlich ihrer Anwendbarkeit bei der Katalyse von Ver- bzw. Umesterungen in nichtwäßrigen, organischen Systemen auf einem hohen Durchsatzniveau gestattet.
Mit der Anwendung eines Ein-Topf-Tests zum Nachweis der Syntheseaktivität von Hydrolasen, bei dem man:

(i) einen Ester einer Carbonsäure und eines vinylogen Alkohols mit einen weiteren Alkohol oder Ester in Gegenwart oder Abwesenheit eines nichtwäßrigen Lösungsmittels und des jeweiligen Enzyms umestert,
(ii) die so hergestellte Carbonylverbindung mit einem weiteren, gegenüber der Umsetzung unter (i) indifferenten Molekül umsetzt, wodurch man
(iii) ein leicht nachweisbares Reaktionsprodukt erhält, bekommt der Fachmann die Möglichkeit, eine enorme Menge an Analysen solcher Synthesereaktionen innerhalb eines kurzen Zeitraums automatisch zu bewerkstelligen, wobei er Informationen nicht nur über qualitative, sondern auch über quantitative Umsätze erhält, die bei der Auswahl der am besten geeigneten Enzyme und/oder Reaktionsbedingungen und/oder Substrate für die betreffende Transformation helfen.

Wie bereits erwähnt, läßt sich das Screening automatisch von Robotern oder dergleichen durchführen. Dem Fachmann sind Gefäße bekannt, in denen Hunderte von Reaktionen parallel durchgeführt und analysiert werden können. Zu diesem Zweck eignen sich sogenannte Mikrotiterplatten (MTP). Ebenso können andere, dem Fachmann bekannte Geräte für enzymatische Reaktionen, wie beispielsweise Küvetten, Eppendorfröhrchen oder auch Agarplatten, verwendet werden.
Bei den Hydrolasen handelt es sich um eine eigene Enzymklasse (E.C. 3). Sie sind in der Lage, chemische Bindungen hydrolytisch zu spalten. Sie umfassen Unterklassen von Enzymen, wie etwa Esterasen, Lipasen, Proteasen, Amidasen oder Acylasen, die ebenso in vorteilhafter Weise einem Screening mit dem erfindungsgemäßen Test unterzogen werden.
Ein entscheidendes Merkmal des vorliegenden Tests besteht darin, daß bei der Umesterung eine Carbonylverbindung als reaktive Zwischenstufe produziert wird, die sich indirekt nachweisen läßt. Dabei muß die reaktive Zwischenstufe für ihre vorteilhafte Anwendung in diesem Test besondere Anforderungen erfüllen. Erstens muß sie durch die Reaktion der betreffenden Hydrolase mit dem Enolester freigesetzt werden. Zweitens soll sie mit einem weiteren vorhandenen Molekül reagieren, womit die Eigenschaften dieser Verbindung leicht nachweisbar gemacht werden. Diese Anforderungen erfüllen solche Alkohole, die irreversibel aus der Säuregruppierung freigesetzt werden können, wie etwa vinyloge Alkohole mit einer neben der Alkoholfunktion liegenden C=C-Doppelbindung. Nach der Freisetzung durchlaufen solche Alkohole eine Keto-Enol-Tautomerisierung unter Erhalt der entsprechenden Carbonylverbindung.
Dem Fachmann sind unterschiedliche Arten von Reagentien geläufig, die in der vorgeschlagenen Weise reagieren können. Ganz besonders bevorzugt wird Vinylalkohol bzw. 1-Propen-ol eingesetzt, wobei Acetaldehyd bzw. Aceton erhalten wird.
Wie bereits erwähnt, reagiert die Carbonylverbindung, wie etwa Acetaldehyd oder Aceton, wiederum mit einem weiteren Molekül und macht es damit leicht nachweisbar. Erfindungsgemäß sind dem Fachmann unterschiedliche Nachweisverfahren allgemein geläufig. Diese müssen gemäß dem zu messenden nachweisbaren Reaktionsprodukt angewandt werden. Zu entsprechenden Verfahren zählen beispielsweise spektrophotometrische und fluorimetrische Messungen (D. Wahler et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2001, 40, 4457–4460; E. Henke, U.T. Bornscheuer, Biol. Chem. 1999, 380, 1029–1033; M. Baumann et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2001, 40, 4201–4204; L.E. Janes, R.J. Kazlauskas, J. Org. Chem. 1997, 62, 4560–4561). Dabei sind Nachweisverfahren bevorzugt, mit denen Informationen sowohl über den qualitativen als auch den quantitativen Verlauf der Umesterung erhalten werden. Besonders bevorzugt sind solche Verfahren, die leicht handhabbar sind und am besten in automatisierten Prozessabläufen realisiert werden. Diesbezüglich ist der spektrophotometrische Nachweis gut geeignet. Ganz besonders bevorzugt kommt eine fluorimetrische Analyse zur Anwendung.
Das zu modifizierende weitere Molekül muß für seine erfolgreiche Amwendung im erfindungsgemäßen Test besondere Merkmale aufweisen. Einerseits muß es im Hinblick auf die enzymatische Umesterung indifferent agieren, indem es letztere weder hemmt noch sonstwie negativ beeinflußt. Andererseits soll es leicht und quantitativ mit der durch die enzymatische Umesterung freigesetzten Carbonylverbindung unter den eingesetzten Bedingungen umgesetzt werden. Zudem werden die Eigenschaften des weiteren Moleküls relativ zum angewandten Nachweisverfahren dadurch so verändert, daß sie mit einer angemessenen Empfindlichkeit verfolgt werden können. Für die Derivatisierung von Carbonylverbindungen sind zahlreiche Reagentien bekannt (hinsichtlich einer Übersicht, siehe M. Vogel et al., Fresenius J. Anal. Chem. 2000, 366, 781–791), die meistens z.B. in der Umweltanalyse verwendet werden. Allerdings können die verwendeten Derivatisierungsbedingungen mit enzymatischen Reaktionen unvereinbar sein, und das Derivat der Carbonylverbindung muß vom Derivatisierungsreagens getrennt werden (z.B. mit HPLC), da ihr Gemisch nicht direkt analysiert werden kann. Dabei sind für den Fachmann besondere weitere Moleküle, wie etwa Dansylderivate (S. Houdier et al., Anal. Chim. Acta 1999, 382, 253–263) oder Perylene (H. Langhals, W. Jona, Chem. Eur. J. 1998, 4, 2110–2116), denkbar. Vorteilhafterweise wird im Hinblick auf die Freisetzung einer Carbonylverbindung das indifferente Reagens aus der Gruppe der aromatischen Hydrazine ausgewählt. Ganz besonders bevorzugt wird das Reagens 4-(7-Nitro-2,1,3-benzoxadiazol)-hydrazin (oder die wie bei S. Uzu et al. Analyst 1990, 115, 1477–1482 genannten Derivate) eingesetzt. Das kommerziell erhältliche 4-(7-Nitro-2,1,3-benzoxadiazol)-hydrazin (NBD-H) ist diesbezüglich ein vielversprechendes Reagens, da es fast keine Fluoreszenz zeigt, wohingegen das entsprechende Hydrazon eine sehr starke Fluoreszenz zeigt. Zudem läßt sich die Derivatisierung in organischen Lösungsmitteln bei variablen Temperaturen durchführen.
Die dem Screening zu unterziehenden Hydrolasen sollen für Ver- bzw. Umesterungen zur Produktion im großtechnischen Maßstab eingesetzt werden. Diesen Reaktionen ist eigen, daß sie sich nicht in wäßriger Lösung durchführen lassen. Wie bereits erwähnt, sind auf die Verseifung von Estern in wäßrigem Medium getestete Hydrolasen selten so wirksam, wenn sie in nichtwäßrigen Systemen eingesetzt werden. Daher wird der erfindungsgemäße Test vorteilhafterweise auch in nichtwäßriger Lösung oder ohne Zugabe eines weiteren Lösungsmittels, z.B. in reiner Form oder in dem zu transformierenden Alkohol, durchgeführt. Dabei sollen verwendbare nichtwäßrige Lösungsmittel in der Lage sein, alle eingesetzten Reaktanten zu lösen, wobei die Reaktionen zwischen diesen nicht gestört werden dürfen. zudem gehören zu den mögliche Medien solche, die sich nicht negativ auf das angewandte Nachweisverfahren auswirken. Vorzugsweise werden die Lösungsmittel, in denen der Test ausgeführt wird, aus der Gruppe der Alkane, Cycloalkane, aromatischen Kohlenwasserstoffe, Ether, tertiären Alkohole oder anderen, dem Fachmann bekannten Lösungsmitteln, die als organische Medien in enzymatischen Synthesereaktionen verwendet werden, ausgewählt (U.T. Bornscheuer, R.J. Kazlauskas, Hydrolases in organic synthesis – regio- and stereoselective biotransformations, Wiley-VCH, Weinheim, 1999; K. Faber, Biotransformations in Organic Chemistry, 4. Aufl., Springer, Berlin, 2000, K. Drauz, H. Waldmann (Hrsg.), Enzymes in Organic Synthesis, Wiley-VCH, Weinheim, 2002). Ganz besonders bevorzugt sind lineares oder verzweigtes Pentan, Hexan, Heptan, Toluol, Octan, Cyclopentan, Cyclohexan, Methylcyclohexan, Petrolether, Methyl-t-butylether, Diethylether, Diisopropylether, tertiäres Butanol, 2-Methyl-2-Butanol, DMF, DMSO, THF, Methylenchlorid, Chloroform oder deren Gemische.
Der erfindungsgemäße Test wird am besten bei einer Temperatur gefahren, bei der die getestete Hydrolase günstig arbeitet. So liegt die Temperatur in einem Bereich von –15°C bis zu über 100°C beispielsweise für Enzyme thermophiler Organismen. Im Normalfall variiert die angewandte Temperatur von 0°C bis 60°C, ganz besonders bevorzugt von 15°C bis 50°C.
In einer weiteren Ausführungsform richtet sich die Erfindung auf ein Verfahren zum Nachweis der Syntheseaktivität von Hydrolasen unter Verwendung eines erfindungsgemäßen Tests. Weiterhin läßt sich die Substratspezifität und Stereoselektivität eines bestimmten Hydrolase-Enzyms bzw. bestimmter Hydrolase-Enzyme in effizienter Weise bestimmen, indem die Carbonsäure- und Alkoholgruppierungen der im Test zu testenden Verbindungen variiert werden.
Das Testformat läßt sich im Prinzip auch auf die Bestimmung von Enantioselektivitäten besonderer Substrate anwenden. Im Falle chiraler Carbonsäuren können die entsprechenden Vinylester verwendet werden. Diese Verbindungen lassen sich leicht aus der chiralen Carbonsäure synthetisieren, beispielsweise mit Essigsäurevinylester in Gegenwart von Palladium(II)acetat (E. Henke et al., Chem. Month. 2000, 131, 633–638). Bei der Trennung beispielsweise chiraler Alkohole kann Essigsäurevinylester als Acyldonor dienen.
Ein weiterer Aspekt des vorliegenden Tests besteht in dessen Verwendung als Sonde für besondere Carbonsäuren oder Alkohole in organischen Medien, insofern spezifisch wirkende Enzyme eingesetzt werden.
Beispielhaft wird das neue Testformat auf der Grundlage durch Hydrolase katalysierter Umesterungen zwischen Laurylsäurevinylester und 1-Propanol beschrieben. Dabei wird stöchiometrisch freigesetztes Acetaldehyd in situ mit einem Hydrazin umgesetzt, wobei ein fluorogenes Derivat entsteht, das sich durch Fluoreszenzmessungen quantifizieren läßt (Schema 1).
Schema 1:
R¹ kann für den Rest der Carbonsäure, wie im Text definiert, oder für (C₁-C₈)-Alkyl, (C₂-C₈)-Alkoxyalkyl, (C₆-C₁₈)-Aryl, (C₇-C₁₉)-Aralkyl, (C₃-C₁₈)-Heteroaryl, (C₄-C₁₉)-Heteroaralkyl, (C₁-C₈)-Alkyl-(C₆-C₁₈)-aryl, (C₁-C₈)-Alkyl-(C₃-C₁₈)-heteroaryl, (C₃-C₈)-Cycloalkyl, (C₁-C₈)-Alkyl-(C₃-C₈)-cycloalkyl, (C₃-C₈)-Cycloalkyl-(C₁-C₈)-alkyl stehen.
R² bzw. R³ stehen jeweils unabhängig für (C₁-C₈)-Alkyl, (C₂-C₈)-Alkoxyalkyl, (C₆-C₁₈)-Aryl, (C₇-C₁₉)-Aralkyl, (C₃-C₁₈)-Heteroaryl, (C₄-C₁₉)-Heteroaralkyl, (C₁-C₈)-Alkyl-(C₆-C₁₈)-aryl, (C₁-C₈)-Alkyl-(C₃-C₁₈)-heteroaryl, (C₃-C₈)-Cycloalkyl, (C₁-C₈)-Alkyl-(C₃-C₈)-cycloalkyl, (C₃-C₈)-Cycloalkyl-(C₁-C₈)-alkyl.
R⁴ steht für (C₁-C₈)-Alkyl, (C₂-C₈)-Alkoxyalkyl, (C₆-C₁₈)-Aryl, (C₇-C₁₉)-Aralkyl, (C₃-C₁₈)-Heteroaryl, (C₄-C₁₉)-Heteroaralkyl, (C₁-C₈)-Alkyl-(C₆-C₁₈)-aryl, (C₁-C₈)-Alkyl-(C₃-C₁₈)-heteroaryl, (C₃-C₈)-Cycloalkyl, (C₁-C₈)-Alkyl-(C₃-C₈)-cycloalkyl, (C₃-C₈)-Cycloalkyl-(C₁-C₈)-alkyl.
Diese durch Lipase B aus Candida antarctica (CAL-B) katalysierte Modellreaktion wurde ausführlicher untersucht. Als Kontrolle wurde der Reaktionsverlauf mittels GC-Analyse verfolgt, wobei sich zeigte, daß > 93% Umsetzung in ca. 45 Minuten in Isooctan oder n-Hexan (bei einem Substratverhältnis von 1:1 mit 0,5 Gew.-% CAL-B) erzielt werden kann. Als nächstes wurde die Modellreaktion in Mikrotiterplatten (MTP) in Gegenwart von NBD-H durchgeführt. 1 zeigt einen typischen zeitlichen Verlauf dieser Reaktion, wie er mit Fluoreszenzmessungen beobachtet wird. Dies zeigt eindeutig, daß sich der Reaktionsverlauf leicht verfolgen läßt. Allerdings wird die Verwendung mit Klebeband verschlossener MTP empfohlen, um das Verdampfen des hochflüchtigen Acetaldehyds zu vermeiden, wobei die Messung der Fluoreszenz hier vorzugsweise vom Boden der MTP her erfolgt. Zudem läßt sich in den meisten Fällen eine gute Korrelation zwischen dem Anstieg der Fluoreszenz und der durch GC-Analyse von Proben des Reaktionsansatzes bestimmten Umsetzung erkennen. Somit ist dieses Testformat äußerst vielseitig bei der Bestimmung der Syntheseaktivität von Hydrolasen in einem Format mit hohem Durchsatz und ermöglicht daher eine schnelle Identifizierung aktiver Enzyme oder geeigneter Reaktionsbedingungen.
Es liegt ein breites Spektrum an Carbonsäuren vor, die sich in dem Synthese-Screening-Test anwenden lassen. Dazu gehören beispielsweise Essigsäure, Propionsäure usw., Acrylsäure, Fettsäuren wie Ölsäure, aromatische Säuren wie Benzoesäure, Milchsäure, natürliche und nicht natürliche Aminosäuren, Zimtsäure, 2- Methylbutansäure, 2-Ethylhexansäure, 2-Chlorpropionsäure oder Zuckersäuren.
Als Alkohol können Verbindungen wie n-Alkohole, 2-Ethylhexanol, 2-Alkohole wie etwa Isopropanol oder 2-Butanol, Diole wie etwa 1,2-Butandiol, Polyole wie etwa Kohlenhydrate oder Glycerin oder Polyglycerin, Polyether wie etwa Polyethylenglykol, Phenol, halogenhaltige Alkohole wie etwa 2-Chlorethanol, 2-Chlorpropanol verwendet werden.
Die aufgeführten Verbindungen sollen keineswegs eine Einschränkung der vorliegenden Erfindung darstellen. Im Prinzip sind alle Arten von Carbonsäuren und Alkoholen innerhalb der eingestellten Grenzen möglich.
(C₁-C₈)-Alkyl kann als Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl, Isobutyl, sek.-Butyl, tert.-Butyl, Pentyl, Hexyl, Heptyl oder Octyl, einschließlich aller gegebenenfalls gesättigter Isomere, betrachtet werden. Diese können ein- oder mehrfach mit (C₁-C₈)-Alkoxy, (C₁-C₈)-Halogenalkyl, OH, Halogen, NH₂, NO₂, SH, S-(C₁-C₈)-Alkyl, (C₁-C₈)-Acyl substituiert sein. Die gerade beschriebenen Reste können ein- oder mehrfach mit Halogenen und/oder mit N-, O-, P-, S-, Si-Atome enthaltenden Resten substituiert sein. Dabei handelt es sich insbesondere um Alkylreste der oben genannten Art, deren Kette eines oder mehrere jener Heteroatome enthalten oder die an das Molekül über eines jener Heteroatome gebunden sind.
Unter (C₃-C₈)-Cycloalkyl sind Cyclopropyl-, Cyclobutyl-, Cyclopentyl-, Cyclohexyl- und Cycloheptylreste usw. zu verstehen, die gegebenenfalls gesättigt sind. Diese können mit einem oder mehreren Halogenen und/oder mit ein N-, O-, P-, S-Atom enthaltenden Resten substituiert sein und/oder im Ring ein N-, O-, P-, S-Atom enthaltende Reste aufweisen, wie beispielsweise 1-, 2-, 3-, 4-Piperidyl, 1-, 2-, 3-Pyrrolidinyl, 2-, 3- Tetrahydrofuryl, 2-, 3-, 4-Morpholinyl. Sie können auch ein- oder mehrfach mit (C₁-C₈)-Alkoxy, (C₁-C₈)-Halogenalkyl, OH, Cl, NH₂, NO₂, (C₁-C₈)-Acyl substituiert sein.
Unter einem (C₆-C₁₈)-Arylrest ist ein aromatischer Rest mit 6 bis 18 Kohlenstoffatomen zu verstehen. Zu derartigen Resten zählen vor allem Verbindungen wie etwa Phenyl-, Naphtyl-, Anthryl-, Phenanthryl-, Biphenylreste. Er kann ein- oder mehrfach mit (C₁-C₈)-Alkoxy, (C₁-C₈)-Halogenalkyl, OH, Halogen, NH₂, NO₂, SH, S-(C₁-C₈)-Alkyl, (C₁-C₈)-Acyl substituiert sein.
Bei einem (C₇-C₁₉)-Aralkylrest handelt es sich um einen über einen (C₁-C₈)-Alkylrest an das Molekül gebundenen (C₆-C₁₈)-Arylrest.
Bei (C₁-C₈)-Alkoxy handelt es sich um einen an das betreffende Molekül über ein Sauerstoffatom gebundenen (C₁-C₈)-Alkylrest.
Bei (C₁-C₈)-Halogenalkyl handelt es sich um einen mit einem oder mehreren Halogenatomen substituierten (C₁-C₈)-Alkylrest.
Im Rahmen der Erfindung steht ein (C₃-C₁₈)-Heteroarylrest für ein fünf-, sechs- oder siebengliedriges aromatisches Ringsystem mit 3 bis 18 Kohlenstoffatomen, das im Ring Heteroatome, wie beispielsweise Stickstoff-, Sauerstoff- oder Schwefelatome, enthält. Als solche heteroaromatischen Reste sollen vor allem Reste wie etwa 1-, 2-, 3-Furyl, wie etwa 1-, 2-, 3-Pyrrolyl, 1-, 2-, 3-Thienyl, 2-, 3-, 4-Pyridyl, 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7-Indolyl, 3-, 4-, 5-Pyrazolyl, 2-, 4-, 5-Imidazolyl, Acridinyl, Chinolinyl, Phenanthridinyl, 2-, 4-, 5-, 6-Pyrimidinyl betrachtet werden. Dabei kann der Rest ein- oder mehrfach mit (C₁-C₈)-Alkoxy, (C₁-C₈)-Halogenalkyl, OH, Halogen, NH₂, NO₂, SH, S-(C₁-C₈)-Alkyl, (C₁-C₈)-Acyl substituiert sein.
Unter einem (C₄-C₁₉)-Heteroaralkyl ist ein dem (C₇-C₁₉)-Aralkylrest entsprechendes heteroaromatisches System zu verstehen.
Unter (C₁-C₈)-Acyl ist ein an das Molekül über eine (-C=O-)-Funktion gebundener (C₁-C₈)-Alkylrest zu verstehen.
Als Halogene sind Fluor, Chlor, Brom und Iod geeignet.
Im Rahmen der Erfindung ist unter dem Ausdruck enantiomerisch konzentriert der Anteil eines Enantiomers im Gemisch mit seinen optischen Antipoden im Bereich > 50% und < 100% zu verstehen.
Experimenteller Teil
Material: 4-Hydrazino-7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol (NBD-H) wurde von Fluka erworben. Alle anderen Chemikalien wurden in der höchsten erhältlichen Reinheitsstufe von den üblichen Lieferfirmen bezogen.
Die fluorimetrische Analyse wurde am FLUOstar Galaxy der Firma BMG Labtechnologies GmbH (Offenburg, Deutschland) unter Verwendung einer Exzitationswellenlänge von 485 nm und einer Emissionswellenlänge von 520 nm oder 590 nm bei Verstärkungsstufe 0 durchgeführt. Das Gesamtreaktionsvolumen pro Vertiefung betrug jeweils 200–220 μl.
Gaschromatographische Analyse: Diese wurde an einem mit einer Permabond-FFAP-Säule (Macherey & Nagel, Düren, Deutschland), 25 m × 0,25 mm, bestückten GC der Firma Hewlett Packard (5890 Series II mit ChemStation HP 3365 Series II) durchgeführt. Die Proben wurden unter den folgenden Bedingungen analysiert: isothermisch (140°C), Nachweistemperatur: 250°C, Injektionstemperatur: 230°C. Als Trägergas diente Wasserstoff.
Lipase-katalysierte Synthese von 1-Propyllaurat: lösungsmittelfreies System, Laurinsäurevinylester:1-Propanol-Verhältnis 1:1: 260 μl (1 mmol) Laurinsäurevinylester und 60 μl (1 mmol) 1-Propanol wurden zusammen in ein Eppendorfröhrchen (1,5 ml) gegeben und mit CAL-B (1–10 mg) versetzt. Der Ansatz wurde bei 900 UpM und 60°C geschüttelt. Die Proben wurden mit Chloroform verdünnt, verwirbelt, zentrifugiert und mittels GC analysiert. Auf ähnliche Weise wurden Reaktionen bei einem Verhältnis von 1:10 durchgeführt. Reaktionen mit Lösungsmitteln: 77,5 μl (0,3 mmol) Laurinsäurevinylester, 22,5 μl (0,3 mmol) 1-Propanol und 900 μl Lösungsmittel (n-Hexan, Isooctan, Petrolether) wurden zusammen in ein Eppendorfröhrchen (1,5 ml) gegeben. Die Reaktionen wurden durchgeführt und wie oben beschrieben analysiert.
NBD-H-Fluoreszenz: Im allgemeinen wurden 200 μl einer Lösung von NBD-H (0,1, 0,25, 0,5 und 1 mM) in verschiedenen Lösungsmitteln (Methanol, 1-Propanol, n-Hexane, Isooctan, Petrolether (Siedebereich 100–140°C), DMSO) in eine Mikrotiterplatte überführt. Anschließend wurde die Fluoreszenz bei 20°C, 25°C oder 45°C 30–50 Minuten bei den oben angegebenen Wellenlängen gemessen. Auf ähnliche Weise wurde die Derivatisierung von Acetaldehyd untersucht, indem 10 μl im organischen Lösungsmittel gelöstes Acetaldehyd (0,1 nmol) unter Verwendung einer Mikropumpe im Fluorimeter zugegeben wurden. Die Reaktionsansätze wurden mit dem im Fluorimeter vorhandenen Schüttler bei 170 UpM gemischt.
Typische Vorgehensweise zur Bestimmung von Syntheseaktivität in einer Mikrotiterplatte: Es wurde ein Gemisch (210 μl) aus Laurinsäurevinylester (200 nmol), 1-Propanol (2 μmol) (Verhältnis 1:10) sowie NBD-H (200 nmol) in 210 μl Isooctan hergestellt. Nach Zugabe von ca. 0,02 mg CAL-B wurden die Platten mit Klebeband verschlossen, in das Fluorimeter eingesetzt und bei 45°C und 170 UpM geschüttelt. Die Fluoreszenzänderung wurden über Messung von unten 20 Minuten lang verfolgt. Da das Auswiegen dieser geringen Enzymmengen das Erzielen reproduzierbarer Ergebnisse sehr schwierig gestaltet, wurde eine bekannte Menge an Enzym in Phosphatpuffer gelöst und anschließend auf die Vertiefungen einer MTP verteilt. Danach wurde die Lösung gefriergetrocknet, um eine genaue Menge an Biokatalysatoren pro Reaktion zu gewährleisten. Schließlich wurden Substrate, organisches Lösungsmittel und NBD-H wie oben beschrieben zugegeben. Enzymatische Reaktion:

a) Reaktionen im Verhältnis von 1:10 im DMF/TBME-Gemisch bei 60°C, 10% Edukte im Lösungsmittel, 1% Enzymmenge (CAL-B und CAL-A).

Diese Reaktionen wurden in 3 unterschiedlichen Lösungsmittelsystemen getestet:

A – 10% DMF in TBME
B – 5% DMF in TBME
C – 1% DMF in TBME

Verfahren
25,6 μl Laurinsäurevinylester und 74,3 μl 1-Propanol sowie 900 μl Lösungsmittel (A, B oder C) werden zusammen in ein Eppendorfröhrchen (1,5 ml) gegeben. Nach Entnahme von 20 μl des Gemischs als Standard werden 10 mg Enzym zugegeben.
Der Ansatz wird bei 900 UpM und 60°C geschüttelt. Während der Reaktion werden in regelmäßigen Zeitabständen Proben entnommen.
Den Ansätzen werden jeweils Proben von 70 μl organischer Phase entnommen und zu 150–200 μl Lösungsmittel (Chloroform) gegeben, verwirbelt und zentrifugiert (2 min, 13000 UpM). Die organische Phase wird in ein neues Fläschchen überführt und mittels GC analysiert.
Über einen Zeitraum von 2 h wurden alle 30 Minuten Proben entnommen.
Ergebnisse:

CAL-A, System A
gar keine Umsetzung
CAL-B, System A; CAL-B, System B; CAL-B, System C

Die Reaktionen mit 1% CAL-B laufen sehr schnell ab. Nach 30 Minuten beträgt der Umsatz bereits mehr als 98%.
Versuchsvorschrift für den Test

10% Substrate im Reaktionsansatz, 0,2% Enzym (Gewichtsprozent)

Laurinsäurevinylester
Für die enzymatischen Reaktionen wurden zehn verschiedene, nicht immobilisierte Enzyme ausgewählt: Chirazyme L5 (CAL-A), Chirazyme L2 (CAL-B), Amano PS (PCL), Chirazyme L9 (RML), Amano A (ANL), Amano AK (PFL), Amano AY (CRL), Chirazyme L6 (PSL), Chirazyme L3 (CRL) und SDE.
Die Lösungen der Enzyme wurden jeweils in Natriumphosphatpuffer (pH 7,5, 50 mM NaH₂PO₄) angesetzt. Anschließend wurden bestimmte Volumen der enzymatischen Lösungen in MTP überführt (so daß die Vertiefungen jeweils 0,22 mg eines Enzyms erhielten, was 1 Gew.-% der Substrate bzw. 0,1% des Reaktionsgemischs entspricht) und danach gefriergetrocknet.
200 μl einer NBD-H-Lösung (1 mM, 200 nmol) wurden in eine MTP in separate Vertiefungen, die die Enzyme enthielten, überführt. Die Lösungen wurden jeweils viermal verwendet. Jeweils 22 μl des Reaktionsansatzes (21,7 μmol Laurinsäurevinylester und 217 μmol 1-Propanol) wurden zu jeder der 1mM NBD-H-Lösungen mit Enzym gepumpt. Nach der Zugabe wurde die MTP mit Klebeband verschlossen, in das Fluorimeter eingesetzt und bei 45°C und 170 UpM geschüttelt. Die Fluoreszenz wurde über 15 min in Zeitabständen von jeweils 94 s gemessen. Als Leerwerte dienten 1 mM NBD-H in Isooctan, der Reaktionsansatz ohne Enzym in Isooctan, der Reaktionsansatz ohne Enzym in 1 mM NBD-H in Isooctan sowie jeweils 1 mM NBD-H mit Enzymsuspension (jeweils vier Kontrollen).
Die Fluoreszenz wurde von oben gemessen.
Die Ergebnisse sind der Fluoreszenzanalyse entnommen:
Leerwerte:

A1–A4 – Isooctan
A5–A8 – 1 mM NBD-H in Isooctan
A9–A12 – Reaktionsansatz in Isooctan
B1–B4 – Reaktionsansatz in 1 mM NBD-H in Isooctan
B5–B8 – 1 mM NBD-H in Isooctan + Amano PS
B9–B12 – 1 mM NBD-H in Isooctan + Amano AK
C1–C4 – 1 mM NBD-H in Isooctan + Chirazyme L6
C5–C8 – 1 mM NBD-H in Isooctan + Chirazyme L3
C9–C12 – 1 mM NBD-H in Isooctan + Chirazyme L2
D1–D4 – 1 mM NBD-H in Isooctan + SDE
D5–D8 – 1 mM NBD-H in Isooctan + Amano AY
D9–D12 – 1 mM NBD-H in Isooctan + Chirazyme L5
E1–E4 – 1 mM NBD-H in Isooctan + Amano A
E5–E8 – 1 mM NBD-H in Isooctan + Chirazyme L9

Reaktionen:

E9–E12 – mit Amano PS
F1–F4 – mit Amano AK
F5–F8 – mit Chirazyme L6
F9–F12 – mit Chirazyme L3
G1–G4 – mit Chirazyme L2
G5–G8 – mit SDE
G9–G12 – mit Amano AY
H1–H4 – mit Chirazyme L5
H5–H8 – mit Amano A
H9–H12 – mit Chirazyme L9

Ergebnisse, siehe 2 bzw. 3

R – Reaktion (vereinte enzymatische und Derivatisierungsreaktionen) auf der MTP
PS – Amano PS = Lipase aus Pseudomonas cepacia
AK – Amano AK = Lipase aus Pseudomonas fluorescens
L6 – Chirazyme L6 = Lipase einer Pseudomonas-Spezies
L3 – Chirazyme L3 = Lipase aus Candida rugosa
L2 – Chirazyme L2 = Lipase B aus Candida antarctica
SDE = Esterase aus Streptomyces diastatochromogenes
AY – Amano AY = Lipase aus Candida rugosa
L5 – Chirazyme L5 = Lipase A aus Candida antarctica
A – Amano A = Lipase aus Aspergillus niger
L9 – Chirazyme L9 = Lipase aus Rhizomucor miehei

Die Chirazyme-Enzyme wurden von Roche Diagnostics, Penzberg, Deutschland, bezogen; die Amano-Enzyme wurden von Amano, Nagoya, Japan, bezogen; SDE wurde durch Expression in E. coli nach einer veröffentlichten Verfahrensweise (Khalameyzer, V. und Bornscheuer, U.T. (1999), Biotechnol. Lett. 21, 101–104) produziert.

Claims

Test zum Nachweis der Syntheseaktivität von Hydrolasen, bei dem man: (i) einen Ester einer Carbonsäure und eines vinylogen Alkohols mit einem weiteren Alkohol oder Ester in nichtwäßrigen Medien in Gegenwart oder Abwesenheit eines nichtwäßrigen Lösungsmittels sowie des entsprechenden Enzyms transesterifiziert, (ii) die so gebildete Carbonylverbindung mit einem weiteren, gegenüber der Umsetzung unter (i) indifferenten Molekül umsetzt, wodurch man (iii) ein leicht nachweisbares Reaktionsprodukt erhält.
Test nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Hydrolasen um Esterasen, Lipasen, Proteasen, Amidasen oder Acylasen handelt.
Test nach Anspruch 1 und/oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die α,β-ungesättigte Gruppierung des Esters aus Vinylalkohol oder 1-Propen-2-ol stammt.
Test nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das indifferente Reagens ausgewählt ist aus der Gruppe der aromatischen Hydrazine.
Test nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Reagens um 4-(7-Nitro-2,1,3-benzoxadiazol)hydrazin handelt.
Test nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das organische Lösungsmittel ausgewählt ist aus der Gruppe der Alkane oder Cycloalkane, aromatischen Kohlenwasserstoffe, Ether, tertiären Alkohole.
Test nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die angewandte Temperatur von –15°C bis 100°C, vorzugsweise von 0°C bis 60°C, stärker bevorzugt von 15°C bis 50°C variiert.
Verfahren zum Nachweis der Syntheseaktivität von Hydrolasen unter Verwendung eines Synthesetests nach einem der vorhergehenden Ansprüche.
Verfahren zur Bestimmung der Substratspezifität von Hydrolasen unter Verwendung eines Synthesetests nach einem der vorhergehenden Ansprüche.
Verfahren zur Bestimmung der Stereoselektivität von Hydrolasen unter Verwendung eines Synthesetests nach einem der vorhergehenden Ansprüche.
Verfahren zur Bestimmung einer Alkohol- oder Carbonsäureverbindung unter Verwendung eines Synthesetests nach einem der vorhergehenden Ansprüche in Verbindung mit einer alkohol- oder carbonsäurespezifischen Hydrolase.
Verfahren zur Bestimmung der Enantioselektivität chiraler Alkohole und chiraler Carbonsäuren unter Verwendung eines Synthesetests nach einem der vorhergehenden Ansprüche.