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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Aquakultur von Wattwürmern und
insbesondere auf die Steuerung der sexuellen Reifung von Wattwürmern.
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Wattwürmer sind
Tiere der Klasse Polychaeta der Phylum Annelida oder der Phylum
Sipunculida. Derartige Würmer
sind das natürliche
Nahrungsmittel für
Fische, Krebstiere und andere Meeresorganismen und werden folglich
von Anglern und anderen Fischern als Köder benutzt. Darüber hinaus
sind bestimmte Wattwürmer
umfangreich studiert worden und werden für das Toxizitätstesten
und andere wissenschaftliche Zwecke als sachdienlich angesehen.
Wattwürmer
werden entweder in frischer oder in gefrorener Form auch als Ernährungsgröße für die Aquakultur
benutzt oder werden in einer Vielfalt an Formulierungen in Nahrungsmittelprodukten
berücksichtigt.
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Der
natürliche
Bestand an Wattwürmern
ist Jedoch begrenzt und es sind in Bezug auf den potentiellen Umweltschaden,
der durch nicht nachhaltige Übererntung
verursacht wird, ernsthafte Bedenken erhoben worden. Eine umweltfreundliche
Alternative zu dem Sammeln von Wattwürmern in freier Wildbahn ist
ihre Aquakultur, um einen nachhaltigen Bestand bereitzustellen.
Die Aquakultur von Wattwürmern
stellt den zusätzlichen Vorteil
des bekannten und quantifizierten Gehalts an spezifiziertem biochemischem
Gehalt und die feststellbare Abwesenheit von spezifischen pathogenen
Organismen bereit, was Aquakulturfutter bereitstellt, das so bezeichnet
wird, dass es den Status spezifisch-pathogen-frei aufweist.
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Das
Dokument
WO-A-98/06255 offenbart
ein Verfahrung zur Induktion der sexuellen Reifung von Polychaeta-Würmern durch
das Aussetzen der Würmer über eine
verlängerte
Dauer (bis zu 6 Monaten) gegenüber
einer niedrigen Temperatur (5 bis 12 °C).
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Die
Aquakultur der Polychaeta-Würmer
Arenicolidae (gemeinhin als „Sandpierwurm" bekannt) hat etwas
Beachtung gefunden (siehe Gambi et al., 1994; Olive 1993), insbesondere
seit das Ködergraben
für diese Tiere
als eine Ursache von Umweltschaden angesehen wurde (siehe Olive,
1993).
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Arenicola
marin (Sandpierwurm) ist ein iteroparer Polychaeta, wobei er sich
im Leben mehrere Male fortpflanzt, jedoch in jährlichen Intervallen (Clark
und Olive, 1973). A. marin ist ein mariner Depositfresser (Jumars,
1993; Fauchald und Jumars, 1979) und nimmt an dem Kopf des horizontalen
Abschnitts einer J-förmigen Wohnröhre, in
der das Tier haust, Sandkörner
oder anderes Substrat auf.
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Ein
Versuch, A. cristata zu züchten,
wurde von D'Asaro
et al., 1976 beschrieben, führte
jedoch nicht zu kommerzieller Aquakultur einer beliebigen Art des
Sandpierwurms unter Verwendung der beschriebenen Verfahren. Eine
erfolgreichere Methodik für
die Aquakultur von depositfressenden Wattwürmern ist seither in unserer
veröffentlichten
Internationalen Patentanmeldung Nr.
WO-A-03/007701 beschrieben
worden. Die beschriebene Methodik bezieht sich auf ein Verfahren
der erfolgreichen Aufzucht der Würmer
oder ihrer Larven, so dass das Körpergewicht
der Würmer
ansteigt. Die Methodik, die in
WO-A-03/007701 beschrieben wird, bietet jedoch
kein Mittel, um die Dauer der Fortpflanzung der Würmer zu
steuern.
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D'Asaro beschreibt
ein Verfahren, um das Laichen bei dem Sandpierwurm Arenicola cristata
zu induzieren, indem der Brutbestand bei Temperaturen von 18 bis
32 °C gehalten
wird. In freier Wildbahn produzieren weibliche Arenicola-cristata-Würmer in
häufigen
Intervallen über
das Jahr hinweg Eimengen und D'Asaro
beschreibt die Verwendung von Temperaturen von 16-18 °C oder darüber, um
bei gezüchteten
weiblichen Würmern
die Abgabe von bis zu 4 Eimengen pro Monat zu stimulieren.
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Im
Gegensatz dazu laichen die Populationen der Arenicola marin und
der Arenicola defodiens jährlich in
einer einzelnen Dauer, die sich über
4 bis 5 Tage erstreckt. Gleichzeitiges Laichen der lokalen Population einer
einzigen Art auf diese Art und Weise wird als „sich epidemisch vermehrend" bezeichnet. Das
Laichen der einzelnen Population an benachbarten Standorten kann
um mehrere Tage oder sogar Wochen variieren, während das Datum des Laichens – selbst
bei einem einzigen Standort – in
nachfolgenden Jahren um so viel wie 4 bis 5 Wochen variieren kann.
Da sich Arenicola marin epidemisch vermehren, ist postuliert worden,
dass externe Faktoren das Datum des Laichens innerhalb einer einzigen
Population bestimmen oder zumindest beeinflussen könnten.
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Eine
Studie von Watson et al., 2000, untersuchte verschiedene externe
Faktoren (insbesondere Umweltfaktoren) und beurteilte ihren Einfluss
auf das Datum des Laichens innerhalb einer schottischen Population von
Arenicola marina. Die externen Faktoren, die geprüft wurden,
waren die Meer- und die Lufttemperatur, der Gezeitenzyklus, der
Luftdruck, der Regenfall und die Windgeschwindigkeit/-richtung.
Die Studie vermerkte, dass die Population, die studiert wurde, immer
bei den Springtiden laichte und deutete an, dass das Laichen mit
dem Gezeitenzyklus mit einer Halbmond-Periodizität zusammentrifft. Es wurde
auch angedeutet, dass ein Temperaturabfall einen Auslösereiz zum
Laichen bewirken könnte,
allerdings kamen Watson et al., 2000 zu dem Schluss, dass ihre Daten
auf keine Schwellentemperatur oder eine Reduzierung der Temperatur
hinwiesen, die nötig
sind, um das Laichen zu induzieren.
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Schließlich ist
es aus der Literatur klar, dass sich die Sandpierwürmer Arenicola
marina und Arenicola defodiens nur während einer sehr kurzen Dauer
des Jahres reproduzieren und dass das Datum des Laichens nicht leicht
prognostizierbar ist. In Bezug auf die Aquakultur der Sandpierwürmer, wie
etwa Arenicola marina oder Arenicola defodiens, die normalerweise
in gemäßigten oder
borealen Gebieten zu finden sind, wäre es von großem Vorteil,
fähig zu
sein, das Laichen der Würmer
zu induzieren, um die aufgezüchtete
Population auf den nötigen
Niveaus zu halten.
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Es
wurde nun herausgefunden, dass die vorsichtige Manipulation der
Temperatur das Laichen sowohl bei männlichen als auch bei weiblichen
Arenicola-marina-Wattwürmern
und Arenicola-defodiens-Wattwürmern induzieren
kann, so dass erreicht werden kann, dass die Reproduktion zu allen
Zeitpunkten des Jahres auftritt und diese Fähigkeit, die sexuelle Reifung
zu induzieren, stellt einen bedeutenden Fortschritt bei der Aquakultur dieser
Würmer
dar.
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Die
vorliegende Erfindung stellt folglich ein Verfahren zur Induktion
der Reifung von Geschlechtszellen in Wattwürmern der Familie der Arenicolidae,
die sich epidemisch vermehren, zu dem Punkt, um zur Befruchtung
fähig zu
sein, dar, wobei das Verfahren Folgendes beinhaltet:
Bereitstellen
reifender männlicher
Würmer
und/oder reifender weiblicher Würmer,
wobei die Würmer
in einem Unterbringungssubstrat in Meerwasser über einen Zeitraum von 14 bis
24 Tagen bei einer Temperatur von 4 bis 8 °C bereitgestellt sind.
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Der
Begriff „sich
epidemisch vermehren",
wie hierin verwendet, wird in Watson et al., 2000 als das synchronisierte
Laichen einer lokalen Population einer einzigen Art definiert. „Sich epidemisch
vermehren" ist somit
von „sich
massenhaft vermehren" abgegrenzt,
was verwendet wird, um das synchronisierte Laichen der Population
von mehreren Arten an einem gegebenen Ort zu beschreiben (siehe
Babcock et al., 1986).
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Bei
einer Ausführungsform
werden die Würmer über 14 bis
24 Tage bei einer Temperatur von in etwa 6 °C (z. B. 5 bis 7 °C) gehalten.
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Bei
einer Ausführungsform
werden die Würmer über mindestens
18 Tage und typischerweise 20 bis 22 Tage bei einer Temperatur von
4 bis 8 °C
(zum Beispiel 5 bis 7 °C)
gehalten.
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Bezug
genommen wird oben auf die Würmer,
die über
eine Dauer von 14 bis 24 Tagen bei einer Temperatur von 4 bis 8 °C (vorzugsweise
5 bis 7 °C)
behalten werden. Der genaue Zeitraum hängt von dem Zustand der Würmer zum
Laichen ab, wie für
weibliche Würmer
durch das Messen des Durchmessers der cölomischen Oozyten (Eier), oder
bei männlichen
Würmern
durch das Messen des Anteils der Gruppen an männlichen Samenzellen (Thrombozyten)
beurteilt wird, wobei sich die Spermienschwänze (Morula) in Proben von cölomischem
Fluid, die durch Biopsie erhalten wurden, differenziert haben. Die
Biopsie kann durchgeführt
werden, indem eine Nadel zur subkutanen Injektion in den Schwanzbereich
des Körpers
parallel zu der Längsachse
des Körpers
eingeführt
wird, um möglichen
Schaden an den Blutgefäßen und
lebenswichtigen Organen, die in dem Nicht-Schwanz-Bereich des Körpers des
Tieres vorhanden sind, zu vermeiden.
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Bei
einer Ausführungsform
induziert die vorliegende Erfindung das Laichen (d. h. die Abgabe
von Geschlechtszellen) der Würmer.
Es ist jedoch herausgefunden worden, dass die Wirkung der Temperatur
von 4 bis 8 °C
die Geschlechtszellenreifung unterstützt, so dass die Geschlechtszellen
bereit sind zur Abgabe beim Laichen unter passender hormoneller
Steuerung. Diese reifen Geschlechtszellen könnten von dem Elternwurm geerntet
werden, so dass die Befruchtung in vitro auftreten kann. Die Abgabe
von Geschlechtszellen kann durch die natürliche Abgabe eines Hormons
erzielt werden, oder, falls bevorzugt, durch die Injektion eines Homogenats
des Prostomiums in sterilem gefiltertem Meerwasser mit einer Konzentration
von 1 Prostomiumäquivalent
pro Wurm (für
Weibchen) erzielt werden. Im Falle von männlichen Würmern kann die Abgabe von Geschlechtszellen
durch die Injektion von 8,11,14-Elcosatriensäure (normalerweise
in Methanol aufgelöst
und mit Meerwasser verdünnt)
induziert werden, um eine endgültige
Konzentration in der Körperhöhle von
in etwa 1 × 10-4 M. zu ergeben. Ähnliche Vorgänge sind
in der Literatur beschrieben (Bentley et al. 1990 und Bentley et
al. 1996), um die Abgabe von Geschlechtszellen aus Tieren zu induzieren,
die bereit sind, während
der natürlichen Fortpflanzungssaison
zu laichen.
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Die
vorliegende Erfindung ist für
reifende weibliche Würmer
und für
reifende männliche
Würmer
der Familie der Arenicolidae geeignet. Reifende weibliche Würmer werden
als weibliche Würmer
definiert, bei denen beobachtet wird, dass sie cölomische Eier mit einem modalen
Durchmesser von mindestens 160 Mikrometer aufweisen. In der Regel
wird die Beobachtung durch cölomische
Biopsie gemacht, einer Arbeitstechnik, die auf dem Stand der Technik üblich ist.
In wenigen Worten involviert eine cölomische Biopsie das Entfernen einer
Probe von cölomischem
Fluid mittels einer Injektionsspritze (geeignet ist eine 25g-Nadel
zur subkutanen Injektion) und das Untersuchen der Probe, die durch
ein Lichtmikroskop genommen wurde. Reifende männliche Würmer werden als männliche
Würmer
definiert, bei denen beobachtet wird, dass sie ein Verhältnis von Morula
zu Spermatozyten von 80% oder mehr besitzen. Diese Beobachtung wird
normalerweise durch das Untersuchen einer kleinen Probe von cölomischem
Fluid, die, wie oben beschrieben, unter der Verwendung einer 10x-Objektivlinse
auf einem Objektträger
erhalten wird, und durch das Untersuchen von in etwa 100 Gruppen an
männlichen
Keimzellen (Spermatozyten in der Form von Thrombozyten oder Morula,
wie oben erwähnt
wurde) gemacht. Reifende Würmer
sind in Proben von Würmern
vorhanden, die über
eine Dauer von 3 bis 5 Monaten bei einer Temperatur von in etwa
16 °C (z.
B. 14 bis 18 °C)
gezüchtet
worden sind. Diese reifenden Würmer
können
zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung ausgewählt werden.
Es ist herausgefunden worden, dass, wenn den reifenden Würmern erlaubt
wird, bei einer Zuchttemperatur (von in etwa 16 °C) zu verbleiben, es einen Verfall
der reifenden Geschlechtszellen ohne Laichen zur Folge hat, bevor
die Würmer
den Reifungszyklus erneut beginnen.
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Das
Substrat, das die Würmer
unterbringt, kann jedes partikuläre
Material sein, das für
einen depositfressenden Wurm geeignet ist. Typischerweise kann ein
sandiges Substrat verwendet werden, aber andere partikuläre Materialien
(z. B. Glasperlen), die Partikel von einer ähnlichen Größe aufweisen, könnten ebenfalls verwendet
werden. Sand wird auf Grund seiner großen Verfügbarkeit und seinen niedrigen
Kosten bevorzugt.
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Es
ist eine geeignete Tiefe des Substrats bereitgestellt, um die Würmer unterzubringen.
Eine Tiefe von in etwa 5 cm reicht aus, damit die Würmer ihre
gewöhnlichen
Unterbringungstunnel bilden. Während
größere Tiefen
des Substrats (zum Beispiel bis zu 10 cm, sogar 20 bis 40 cm) möglich sind,
lässt dies
die damit verbundenen Kosten des Vorgangs ansteigen. Zur Vereinfachung
des Erntens der Würmer
ist eine minimale Tiefe des Substrats wünschenswert.
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Das
Meerwasser, das in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, kann
gefiltertes Meerwasser (z. B. zweimal durch einen Filter gefiltert,
der eine Porengröße von 0,34 μm aufweist)
von einem Durchflusssystem, das natürliches Meerwasser empfängt, oder
wieder in ein Aquakultursystem zugeführtes Meerwasser sein, wobei
eine Tropfkörperbehandlung,
ein Proteinabschäumer
und/oder Vorrichtungen zur Wasseraufbereitung inkorporiert sind,
die aus handelsüblichen
Quellen leicht verfügbar
sind.
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Zu
dem Zweck des Hygienemanagements ist herausgefunden worden, dass
es günstig
ist, wenn das Substrat, das die Würmer unterbringt, wenig oder
kein Nahrungsmittelmaterial enthält,
wobei während
des Zeitraums von 14 bis 24 Tagen kein zusätzliches Nahrungsmittelmaterial
bereitgestellt wird. Das Vorhandensein von wenig oder keinem Nahrungsmittel
ermöglicht
es, dass die Sauberkeit des Wassers leicht auf einem hohen Standard
gehalten wird, ohne dass es sich nachteilig auf die Würmer auswirkt,
da der betroffene Zeitraum kurz ist.
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Das
Verfahren, das hierin beschrieben ist, kann verwendet werden, um
das Laichen in jeder Art von Würmern,
die zu der Familie der Arenicolidae gehören, zu induzieren. Die Arten,
die von besonderem Interesse sind, umfassen Arenicola marin und
Arenicola defodiens.
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Das
Verfahren ist für
reifende Weibchen und/oder reifende Männchen (wie oben definiert)
geeignet, die aus natürlichen
Populationen in freier Wildbahn gesammelt wurden, oder noch bevorzugter,
gemäß der Methodik
von
WO-A-03/007701 gezüchtet wurden.
Wo die Würmer
gezüchtet
worden sind, ist herausgefunden worden, dass die besten Ergebnisse
unter der Verwendung von Würmern
erhalten werden, die über
3 bis 5 Monate bei einer Temperatur von 16 °C gehalten wurden (mit adäquater Nahrungsmittelversorgung).
Es können
auch gute Ergebnisse erhalten werden, falls die Zuchttemperatur über eine
Dauer von mindestens einem Monat 14 °C oder mehr beträgt.
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Für handelsübliche Zwecke
kann es wünschenswert
sein, den männlichen
und den weiblichen Würmern
zu erlauben, in Isolation in kleinen Behältern mit Meerwasser zu laichen,
und die Oozyten und die Spermatozoen selektiv zu vermischen und
die befruchteten Eier nach dem induzierten Laichen nach den Verfahren, die
oben beschrieben wurden, auszuwählen.
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Es
ist herausgefunden worden, dass, falls irgendwelche nicht gelaichten
Würmer
nach dem Ende der Zeitdauer von 14 bis 24 Tagen, auf die oben verwiesen
wurde, während
der die Würmer
bei einer Temperatur von 4 bis 8 °C
behalten werden, verbleiben, dann können diese nicht gelaichten
Würmer
induziert werden, zu laichen, indem die Temperatur des Meerwassers
auf 12 bis 14 °C
angepasst wird. im Allgemeinen wird es bevorzugt, die Temperatur
Schritt für
Schritt ansteigen zu lassen und es ist herausgefunden worden, dass
es geeignet ist, über
eine Dauer von 6 bis 8 Stunden, die Temperatur mit einer Rate von
1 °C pro
Stunde stufenweise ansteigen zu lassen, obwohl die exakte Rate des
Temperaturanstiegs nicht entscheidend ist. Der Anstieg der Temperatur
kann bequem erzielt werden durch den Transfer der Würmer in
Meerwasser (zum Beispiel gefiltertes Meerwasser oder wieder zugeführtes Meerwasser)
bei einer Temperatur von 4 bis 8 °C
und wobei die umgebende Lufttemperatur 12 bis 14 °C beträgt. Der
Bequemlichkeit halber können
die Würmer
in tragbaren Behältern
mit Meerwasser bei einer geeigneten Temperatur (4 bis 6 °C) platziert
werden, wobei der Behälter, der
die Kombination aus Meerwasser und Würmer enthält, in einem Raum/Inkubator
mit gesteuerter Temperatur platziert wird, soweit angemessen. Unter
diesen Zuständen
wird die Temperatur des Meerwassers Schritt für Schritt auf 12 bis 14 °C, zum Beispiel
13 °C, erhöht. Während es
für die
Würmer
von Vorzug ist, in dieser Phase einzeln untergebracht zu sein (zum
Beispiel in 400 ml Meerwasser), ist es für die Würmer auch möglich, in kleinen Gruppen von
bis zu 20 (vorzugsweise von 10 oder weniger, noch bevorzugter von
6 oder weniger, zum Beispiel 2, 3, 4 oder 5) Würmern untergebracht zu sein.
Wünschenswerterweise
werden die Würmer
in gleichgeschlechtlichen Gruppen untergebracht. Die Würmer, die
auf diese Art und Weise untergebracht werden, werden in annähernd gleichen
Intervallen untersucht (es ist herausgefunden worden, dass eine
stündliche Untersuchung
geeignet ist).
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Falls
beobachtet wird, dass die weiblichen Würmer laichen, werden die Eier
erhalten, indem die Weibchen in einem Tank platziert werden, der
1 bis 3 Liter an Meerwasser enthält,
und den Würmern
erlaubt wird, das Laichen fortzusetzen. Nachdem die Mehrheit der
Eier abgegeben worden ist (wie durch den Bedarf an Larven bestimmt
werden kann), kann das Weibchen entfernt und neu untergebracht werden.
Zweckmäßigerweise wird
eine Menge an Meerwasser, die ausreichend ist, eine Konzentration
von 100 000 Eier pro Liter bereitzustellen, vor der Zugabe des Sperma
hinzugegeben. (Es ist im Allgemeinen herausgefunden worden, dass
typischerweise eine Menge an 2 bis 4 Liter Meerwasser erforderlich
ist, abhängig
von der Fekundität
des Weibchens.)
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Falls
beobachtet wird, dass die männlichen
Würmer
laichen, wird das Sperma in eine Pipette oder eine Spritze aufgenommen,
bevor es sich vollständig
mit Meerwasser vermischt. Dies reduziert die spontane Aktivierung
der Spermatozoen. Eine konzentrierte Spermamischung, die auf diese
Art und Weise erhalten wird, kann für bis zu 48 Stunden bei 5 °C gehalten
werden, ohne dass die Lebensfähigkeit
verloren geht, und je nach Bedarf verwendet werden. Das Sperma kann
in die Eier-/Meerwassermischung, die oben beschrieben wurde, eingesetzt
werden, um eine Spermakonzentration von 105 bis
106 Spermen pro Milliliter bereitzustellen.
Die Spermakonzentration kann durch die Verwendung eines Hämatozytometer
bestimmt werden, was ein Objektträger mit geätzten Unterteilungen und Einteilungen
ist, die eine bekannte Menge in dem Raum unter dem Deckglas definieren.
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Typischerweise
wird die Konzentration an Sperma aus der Beobachtung des durchschnittlichen
Kerns des Spermas berechnet, der in einer Überprüfung von 30 definierten Mengen
gesehen wurde. Die Spermakonzentration könnte auch von einem gewöhnlichen
Fachmann geschätzt
werden, indem in etwa das Sperma, das von einem Männchen abgegeben
wurde, zu 50 ml Meerwasser hinzugegeben wird, dann 1 ml dieser Mischung
zu einem Liter der Ei/Meerwassermischung hinzugefügt wird.
In dem Fall, dass die weiblichen Würmer laichen, die männlichen
Würmer
jedoch nicht, kann es wünschenswert
sein, das sofortige Laichen der männlichen Würmer zu induzieren, da die
nicht befruchteten Eier der weiblichen Würmer eine begrenzte Lebensfähigkeit
aufweisen. Das sofortige Laichen der männlichen Würmer, die wie oben beschrieben
behandelt wurden, kann erzielt werden, indem die Fettsäure 8, 11,
14-Eicosatriensäure in die
männlichen
Würmer
injiziert wird, um eine endgültige
cölomische
Konzentration von 13 μg/g
Körpermasse
zu ergeben, oder indem eine in vitro Konzentration von 4,5 × 10-5 M, die durch die verdünnte Lösung einer Methanollösung mit
feingefiltertem (z. B. 0,2 μm)
Meerwasser oder sterilem Wasser oder destilliertem Wasser hergestellt
wird und injiziert wird, um eine endgültige Methanolkonzentration
in den Körpergeweben
von 1 % v/v zu ergeben.
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Sobald
das Sperma und die Eier für
eine Dauer von in etwa 15 Minuten miteinander vermischt worden sind,
können
die Eier gezählt
werden (zum Beispiel durch randomisierte Probenteilung) und zu geeigneten
Behältern
transferiert werden (wie etwa flache Ablagen aus Kunststoff) mit
einer Konzentration von in etwa 10 000 befruchtete Eier/Liter. Die
Larven können
dann, sobald sie geschlüpft
sind, dementsprechend gezüchtet werden,
zum Beispiel wie in
WO-A-03/007701 beschrieben
wurde.
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Die
Elternwürmer
können
bei einer Temperatur von 16 bis 20 °C gehalten werden, jedoch mit
geeigneter Substratunterbringung und organischen Materialien als
Nahrungsmittel versehen.
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Wahlweise
können
die Würmer über 2 bis
3 Tage bei einer reduzierten Temperatur von 6 bis 8 °C behalten
werden, bevor sie zu Zuchtzuständen
zurückgebracht
werden. Unter Verwendung der Methodik, die oben beschrieben wurde,
ist es möglich,
die sexuelle Reifung sowohl in den männlichen als auch in den weiblichen
Würmern
der Familie der Arenicolidae lediglich ein paar Monate nach vorherigem
Laichen dieser Würmer
zu induzieren. Eine derartige Induktion der sexuellen Reifung dieser
Tiere weist keinen bekannten Beispielsfall auf, da die Tiere in
freier Wildbahn lediglich einmal pro Jahr laichen.
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Unter
der Verwendung der Methodik, die oben beschrieben wurde, ist es
nun möglich,
Sandpierwürmer über das
gesamte Jahr hinweg fortzupflanzen.
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Die
vorliegende Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf die folgenden,
nicht einschränkenden
Beispiele weiter beschrieben.
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Beispiel 1
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Induktion der sexuellen Reifung
in dem Sandpierwurm Arenicola marin
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Männliche
und weibliche Arenicola sp. wurden im Sommer 2002 an dem Strand
in Hauxley in Northumberland gesammelt. Männliche und weibliche Arenicola
sp. wurden ebenso aus Wachstumsversuchen, die bei Seabait Ltd.,
Northumberland, Vereinigtes Königreich,
durchgeführt
wurden, gesammelt.
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Die
Tiere wurden in Zuchtbetten (Brutbetten) aus Beton, die zersetzte
organische Nahrungsmittel und Sand, wie in
WO-A-03/007701 beschrieben
wurde, enthalten, eingesetzt. Die Tiere wurden über mehrere Monate so belassen,
bis sie benötigt
wurden. Zu einem spezifizierten Zeitpunkt während November/Dezember 2002
wurde eine Gruppe von in etwa 50 der Tiere entfernt und es wurde
eine cölomische
Biopsie durchgeführt und
der Reifestatus wurde bestimmt. Die ausgewählten Tiere wurden dann in
ein kleines Behältnis
transferiert, das den Sand enthielt, der zuvor in den Brutbetten
für Arenicola
sp. verwendet wurde, und das kleine Behältnis wurde in einem Raum mit
gesteuerter Temperatur, die bei 6 °C ± 1 °C gehalten wurde, platziert.
Nach 21 Tagen bei dieser Temperatur wurden die Tiere aus dem Substrat
entfernt und in separaten Gefäßen platziert,
die gefiltertes Meerwasser enthielten. Jegliches Abfallmaterial,
das gereinigt wurde, wurde mit einer Pipette entfernt und ausgesondert.
Sobald die Tiere wieder in separaten Gefäßen untergebracht wurden, wurde
von allen eine erneute Probe gemacht und ihnen wurde eine Nummer/ein
Code gegeben. Die Tiere wurden dann Schritt für Schritt auf 13 °C konditioniert.
Das Sperma wurde von den laichenden Männchen in konzentrierter Form
gesammelt und wurde in beschrifteten Glasfläschchen bei in etwa 4 °C in einer
Kühlmaschine
gelagert. Die Weibchen, die gelaicht haben, wurden aus den kleinen
Unterbringungsgefäßen entfernt
und in einzelnen beschrifteten Aquariumtanks und dem Meerwasser,
aus dem unter Verwendung von gefiltertem Meerwasser 2 Liter hergestellt
wurden, platziert. Jedem Weibchen wurde erlaubt, in dem Aquariumtank
weiterhin zu laichen, bis das Ereignis des schubweisen Laichens
als vollständig
erachtet wurde. Bei dem Ende des Laichereignisses wurde das Weibchen
aus dem Aquariumtank entfernt und in das zuvor beschriftete Gefäß, das mit
frischem Meerwasser versehen war, zurückgebracht. (Das Gewicht des
Tiers wurde erfasst, falls das Tier vor dem Zeitpunkt der Probennahme
nicht mit dem Laichen angefangen hatten.)
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Das
Wasser und die Eier in dem Tank wurden vermischt, um eine homogene
Mischung zu ergeben, aus der fünf
bis zehn Proben von 0,5 ml entfernt wurden, und eine Schätzung der
gesamten Anzahl an Eiern wurde bestimmt (Tabelle 1). Alle Details
der Herkunft und der Verwendung wurden ebenfalls in dieser Tabelle erfasst.
Das Sperma von zwei unterschiedlichen Männchen (L29♂.8 und L23♂.1; Tabelle 1) wurde in das Aquarium
hinzugefügt
und die Eier wurden für
10 Minuten zum Befruchten so belassen. Mengen an Wasser aus dem
Aquariumtank, das befruchtete Eier enthielt, wurden dann in weiße, flache
Ablagen transferiert und es wurden bis zu 5 Liter hergestellt, was
eine endgültige
Konzentration von zwischen 7 bis 10 000 Eier pro Liter zur Folge
hatte. Die Ablagen wurden beschriftet und bei 13 °C ± 1 °C behalten.
Nach 7 bis 8 Tagen wurde der gesamte Inhalt der Ablagen in einen
Aquariumtank geschüttet,
was eine homogene Mischung aus Eiern und Wasser zur Folge hatte.
Sechs replizierte Proben von einem Milliliter wurden aus dem Tank
entfernt und die Larvenanzahl wurde beurteilt. Für jede Ablage wurde die gesamte
Larvenanzahl und die allgemeine Überlebensrate
bestimmt. Tabelle 1. Beispiel an Datenblatt und
der Probennahme von Eiern beim Laichen
| Weibchen
Ref. | L29♀.4 | L29♀.5 | L29♀.6 | L29♀.7 |
| Zustände/Temp. °C | Kaltt./6-8 | Kaltt./6-8 | Kaltt./6-8 | Kaltt./6-8 |
| Dauer
der Kaltbehandlung (Tage) | 21 | 21 | 21 | 21 |
| Anfängliches
Gew. (9) | 3,7 | 3,9 | | |
| hinzugefügtes Sperma
(ml) | 6 | 6 | 6 | 8 |
| Zeit
der Befruchtung (Min.) | 10 | 10 | 10 | 10 |
| Auszählung/1
ml oder 0,5 ml | 20
44
19
29
44 | 40
46
47
57
42 | 35
31
29
29
32 | 97
112
134
129
141 |
| Σ | 156 | 232 | 156 | 613 |
| Durchschnitt | 31,2 | 46,4 | 31,2 | 122,6 |
| Standardabweichung | 12,3 | 6,6 | 2,5 | 17,9 |
| Mg.
der Probe (ml) | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 |
| Gesamtmenge (ml) | 2000 | 2000 | 2000 | 2000 |
| verwendetes
Wasser (W. z./G.) | W.
z. | W.
z. | W.
z. | W.
z. |
| Gesamt(N) | 124800 | 185600 | 124800 | 490400 |
| Ablagen | 3 | 4 | 3 | 10 |
| Anz./Ablage | 41600 | 46400 | 41600 | 49040 |
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Larvenauszählungen
sind in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle
2. Ergebnisse aus den Larvenauszählungen
| Larvenauszählungen
(Durchschnitt aus sechs replizierten Proben von 1 ml) |
| Weibchen | L29♀.4 | L29♀.5 | L29♀.6 | L29♀.7 |
| Datum | 7.1.03 | 7.1.03 | 7.1.03 | 7.1.03 |
| Ablage
Nr. | 7 | 9 | 5 | 14 |
| 1 | | | | |
| 2 | 2 | 14 | 9 | 15 |
| 3 | 13 | 14 | 9 | 13 |
| 4 | | 13 | | 15 |
| 5 | | | | 7 |
| 6 | | | | 6 |
| 7 | | | | 8 |
| 8 | | | | 7 |
| 9 | | | | 12 |
| Σ | 22 | 50 | 23 | 97 |
| μ | 7 | 13 | 8 | 11 |
| Gesamtzahl
in allen Ablagen | 36667 | 62500 | 38333 | 53889 |
| Gesamte
nominale Überlebensrate
(%) | 88,1 | 134,7 | 92,1 | 109,9 |
| Gesamtzahl
Larven | 110000 | 250000 | 115000 | 538889 |
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Beispiel 2
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Erneute Initiierung der Reifung
bei dem Sandpierwurm Arenicola marina
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Eine
Probe von Würmern,
die, wie in Beispiel 1 beschrieben wurde, im November und Dezember
2002 der vorgeschriebenen Behandlung der kalt und erfolgreich produzierten
und gelaichten Eiern und Sperma unterzogen wurden, wurden nach dem
Laichen im Dezember 2002 wieder in angereicherte Brutbetten, die
Algen enthielten (wie in
WO-A-03/007701 beschrieben
ist) konditioniert. Nach zwei Monaten in den angereicherten Brutbetten
wurden die Tiere aus dem Bett entfernt und in einem Gefäß mit gefiltertem
Meerwasser platziert und über
48 Stunden bei einer Temperatur von 6 °C behalten. Nach dieser Kaltbehandlung
wurden die Tiere für
weitere 2 Monate wieder Schritt für Schritt in Warmwasserzuständen konditioniert.
Die Tiere wurden unter der Verwendung der Verfahren der cölomischen
Biopsie zur Beurteilung der Reife periodisch getestet.
-
In
einer späten
Phase der Reifung wurden die Tier aus dem Brutbett entfernt und
in einzelne Gefäße mit Meerwasser
getrennt, wie in Beispiel 1 beschrieben wurde. Es wurden Proben
von den Tieren genommen und dann über 21 Tage in Kaltzustände (6 °C) platziert.
Die folgenden Methodiken wurden ausgeführt, um das Laichen und die
gesteuerte Befruchtung der Eier und die Produktion der Larven zu
initiieren. Das Laichen wurde sowohl in den Männchen als auch den Weibchen
erfolgreich initiiert. Die Ergebnisse von einigen der Weibchen sind
in Tabelle 3 aufgezeigt. Die Larvenzählungen aus den Proben sind
in Tabelle 4 aufgezeigt. Tabelle 3. Details des Laichens der Arenicola
sp. außerhalb
der Saison nach der erneuten Initiierung der Reifung mittels Kaltbehandlung
und Wachstum in erweiterten Substraten.
| Weibchen
Ref. | L26.♀1 | L26.♀2 | L26.♀3 | L26.♀4 |
| Temp. °C | 6-8 | 6-8 | 6-8 | 6-8 |
| Dauer
der Kaltbehandlung (Tage) | 21 | 21 | 21 | 21 |
| hinzugefügtes Sperma
(ml) | 8 | 8 | 8 | 8 |
| Zeit
der Befruchtung (Min.) | 10 | 10 | 10 | 10 |
| Auszählung /1
ml oder 0,5 ml | 36
25
29
68
25 | 79
67
73
92
55 | 21
19
34
35
25 | 8
12
8
5
8 |
| Σ | 183 | 366 | 134 | 41 |
| Durchschnitt | 36,6 | 73,0 | 26,8 | 8,2 |
| Standardabweichung | 18,1 | 13,8 | 7,4 | 2,5 |
| Mg.
der Probe (ml) | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 |
| Gesamtmenge (ml) | 2000 | 2000 | 2000 | 2000 |
| verwendetes
Wasser (W. z./G.) | W.
z. | W.
z. | W.
z.: G. | W.
Z. |
| Gesamt
(N) | 146400 | 292800 | 107200 | 32800 |
| Ablagen | 3 | 6 | 3 | 1 |
| Anz./Ablage | 478800 | 48800 | 35733 | 32800 |
- W. z. = wieder zugeführtes Meerwasser,
- G. = gefiltertes Meerwasser.
Tabelle 4. Larvenauszählung/Überlebensrate der Larven 7
bis 8 Tage nach der Befruchtung (auf Tabelle 3 anwendbar) | Larvenauszählungen
(Durchschnitt aus sechs replizierten Proben von 1 ml) |
| Weibchen | L26.♀1 | L26.♀2 | L26.♀3 | L26.♀4 |
| Datum | | | | |
| Ablage
Nr. | 5 | 6 | 5 | 4 |
| 1 | | | | |
| 2 | 7 | 6 | 2 | |
| 3 | 4 | 4 | 3 | |
| 4 | | 6 | | |
| 5 | | 4 | | |
| 6 | | 5 | | |
| Σ | 16 | 31 | 10 | 4 |
| μ | 5 | 5 | 3 | 4 |
| Gesamtzahl
in allen Ablagen | 26667 | 25833 | 16333 | 22000 |
| Gesamte Überlebensrate
(%) | 55 | 53 | 46 | 67 |
| Gesamtzahl
Larven | 80000 | 155000 | 49000 | 22000 |
-
Die Überlebensrate
der Larven war geringer als die, die während der Dauer der Fortpflanzung
erhalten wurde.
-
Beispiel 3
-
Verwendung
der Manipulation der Temperatur, um die Dauer des Laichens in den
gezüchteten
Populationen der Arenicola marina zu verlängern, was das Laichen von
bis zu 6 Monaten nach der natürlichen
Fortpflanzungssaison zur Folge hat
-
Es
ist möglich,
die Fortpflanzungssaison von A. marina zu verlängern, indem die Wassertemperatur der
Betten, die verwendet werden, um die Tiere unterzubringen, manipuliert
wird. Die endgültigen
Phasen der Reifung, die zum Laichen von A. marin führen, können gesteuert
werden, indem die Wassertemperatur über 13 °C gehalten wird. Der Abfall
der Temperatur auf unter 13 °C
initiiert die endgültige
Reifung und hat folglich das Laichen von sowohl männlichen
als auch weiblichen A. marina zu Zeitpunkten zur Folge, die sich
wesentlich von der natürlichen
Fortpflanzungssaison unterscheiden. Dies verbessert im Wesentlichen
die Effizienz des Systems der Sandpierwurmzüchtung.
-
Wenn
die Weibchen, die in geeigneten Substraten untergebracht sind, über ausgedehnte
Zeiträume (über 2 Monate
hinaus) bei erhöhten
Temperaturen (Temperaturen über
13 °C) gehalten
werden, tritt eine gewisse Degradation der Eier innerhalb der cölomischen
Höhle ein.
Innerhalb und zwischen den Weibchen gibt es Variationen bei dem
Zustand der Eier. Nichtsdestotrotz gibt es eine signifikante Produktion
an befruchteten Eiern und Sperma außerhalb der Fortpflanzungssaison
und die Embryonen und die Larven, die so produziert werden, können in
den Standardzuchtzuständen
aufgezogen werden, wie zuvor beschrieben (siehe
WO-A-03/007701 ).
-
Der
beobachtete Zeitpunkt des Laichens für Arenicola marin in freier
Wildbahn in Northumberland, UK, wurde zwischen dem 30. Oktober 2002
und dem 4. November 2002 erfasst.
-
Mehr
als zweihundert Tiere wurden während
des Sommers (Mai bis September 2002) jeweils in den Betten L29,
L28, L26, L25, L24 und L23 untergebracht und danach über mehrere
Zeiträume
wie unten beschrieben gehalten. Die Wassertemperatur, die in den
Betten bereitgestellt wurde, wurde über 13 °C gehalten. Die Änderung
des Reifestatus von A. marin in jedem Bett wurde mittels der Probennahme
der Würmer
unter der Verwendung des Verfahrens der cölomischen Biopsie, wie zuvor
beschrieben wurde, überwacht.
Die Tiere wurden beurteilt und, wenn sie als ausreichend reif (siehe
oben) erachtet wurden, wurden die Würmer entfernt und einer Kaltbehandlung
ausgesetzt, was das Aussetzen über
eine Dauer von bis zu 21 Tagen bei 6 bis 8 °C beinhaltete.
-
Die
Würmer
wurden zu den Zeitpunkten, die in Tabelle 5 aufgezeigt sind, aus
den Betten entfernt.
-
Tabelle
5. Die Zeitwahl, bei der die Würmer
aus den Betten entfernt und in der Kaltbehandlung platziert wurden.
| Monat | Bett
(Würmer
für die
Kaltbehandlung entfernt) |
| November | L25,
L29, L26 |
| Dezember | L23,
L24 |
| Januar | L28,
L29 |
| Februar | L24 |
| März | Reife
Tiere waren aus L23 verfügbar,
Larven wurden jedoch nicht produziert. |
| April | Reife
Tiere waren aus L23 verfügbar,
Larven wurden jedoch nicht produziert. |
| Mai | L23 |
-
Durch
die beschriebenen Methoden war es möglich, einen Befruchtungserfolg
in Eiern zu erzielen, die von diesen Würmern in allen Monaten von
November 2002 bis Mai 2003 (reife Tiere waren im März und im April
vorhanden) stammten. Die Überlebensraten
für die
Larven im Mai waren niedriger als sie zu anderen Zeitpunkten hätten erzielt
werden können,
bei in etwa 20-30 %, angesichts der hohen Fekundität von Sandpierwürmern stellt
dies dennoch ein Mittel bereit, durch das wesentliche Anzahlen oder
Larven außerhalb
der natürlichen
Fortpflanzungssaison erhalten werden. Die Technologien der Standardkaltbehandlung
hatten das Laichen nach den spezifizierten 14 bis 21 Tagen zur Folge.
-
Tabellen
6a-c stellen spezifische Beispiele der Behandlungen bereit, die
laichende Tiere und wachstumsfähige
Larven außerhalb
der normalen Fortpflanzungssaison produzieren.
-
Die
Effektivität
dieser Behandlungen kann weiter verbessert werden, indem die Larven
einbehalten werden, bevor sie in das Produktionssystem gelassen
werden. Die Larven von A. marin können über mehr als 6 Monate mit einer
beobachteten minimalen Mortalität
(< 20 %) in Ablagen
mit Sand und statischem oder wieder zugeführtem Meerwasser behalten werden.
Indem diese Ansätze
kombiniert werden, können
die Larven über
das gesamte Jahr hinweg in Produktionsbetten gelassen werden. Tabelle 6a. Schub 1 – Beispiele von Weibchen und
Männchen,
die 2002/2003 für
Befruchtungsvorgänge
verwendet wurden
| Schub | Schub 1 |
| Datum | 08.11.2002 | 08.11.2002 | 08.11.2002 |
| Weibchen
Ref. | L26♀14 | L26♀15 | L26♀16 |
| Ursprung | L26 | L26 | L26 |
| Temp. °C | 6-8 | 6-8 | 6-8 |
| Dauer
der Kaltbehandlung (Tage) | 14 | 14 | 14 |
| Anfängliches
Gew. (g) | 6,3 | 3,4 | 4,1 |
| hinzugefügtes Sperma (ml) | 5 | 5 | 5 |
| Männchen | H.♂1a | H.♂B.4 | H.♂B.5 |
| | ♂♂♂ mischen
H | H.♂B.5 | L26.♂9 |
| Zeit
der Befruchtung (Min.) | 10 | 10 | 10 |
| Auszählung /1 ml oder 0,5 ml | 11
8
18
28
8 | 23
24
24
16
10 | 38
45
49
44
37 |
| Σ | 73 | 97 | 213 |
| Durchschnitt | 14,6 | 19,4 | 42,6 |
| Standardabweich ung | 8,5 | 6,2 | 5,0 |
| Mg. der Probe (ml) | 1,0 | 1,0 | 0,5 |
| Gesamtmenge (ml) | 5000 | 5000 | 2000 |
| verwendetes Wasser (W.
z./G.) | W. z. | W. z. | W. z. |
| Gesamt(N) | 73000 | 97000 | 170400 |
| Ablagen | 2 | 2 | 5 |
| Anz./Ablage | 36500 | 48500 | 34080 |
Tabelle 6b. Schübe
3 und 4; Beispiele von Weibchen und Männchen, die 2002/2003 für Befruchtungsvorgänge verwendet wurden
| Schub | Schub 3 | Schub 4 |
| Datum | 07.01.2003 | 08.01.2003 | 08.01.2003 | 15.02.2003 | 16.02.2003 | 16.02.2003 |
| Weibchen Ref. | L23♀.9 | L24♀.8 | L24♀.10 | L28♀2 | L29♀10 | L28♀2 |
| Ursprung | L23 | L24 | L24 | | | |
| Temp. °C | 6-8 | 6-8 | 6-8 | 6-8 | 6-8 | 6-8 |
| Dauer
der Kaltbehandlung (Tage) | 21 | 21 | 21 | 21 | 21 | 21 |
| Anfängliches
Gew. (g) | 5,3 | 12,1 | 8,5 | n.
bek. | n.
bek. | n.
bek. |
| hinzugefügtes Sperma (ml) | 6 | 5 | 5 | 6 | 4 | 3 |
| Männchen | L23♂.3 | L24♂.5 | L24♂.5 | L28♂.9 | L28♂.9 | L28.♂9 |
| | L24♂.1,7 | | | L28♂.3 | L28♂.11 | L28♂.11 |
| Zeit
der Befruchtung (Min.) | 10 | 10 | 10 | 15 | 15 | 15 |
| Auszählung /1
ml oder 0,5 ml | 44 | 17 | 42 | 30 | 70 | 5 |
| 52 | 17 | 71 | 41 | 56 | 7 |
| 43 | 10 | 56 | 39 | 39 | 10 |
| 52 | 23 | 41 | 30 | 44 | 8 |
| 50 | 13 | 54 | 31 | 39 | 14 |
| Σ | 241 | 80 | 264 | 171 | 248 | 44 |
| Durchschnitt | 48,2 | 16 | 52,8 | 34,2 | 49,6 | 8,8 |
| Standardabwei
chung | 4,4 | 4,9 | 12,2 | 5,4 | 13,4 | 3,4 |
| Mg.
der Probe (ml) | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 |
| Gesamtmenge
(ml) | 2000 | 2000 | 2000 | 4300 | 2000 | 2000 |
| verwendetes
Wasser (W.z./G.) | W.
z. | W.
z. | W.
z. | G. | G. | G. |
| Gesamt
(N) | 192800 | 64000 | 211200 | 294120 | 198400 | 35200 |
| Ablagen | 2 | 1 | 3 | 6 | 4 | 1 |
| Anz./Ablage | 96400 | 64000 | 70400 | 49020 | 49600 | 35200 |
Tabelle 6c. Schub 6; Beispiele von Weibchen und Männchen,
die 2002/2003 für
Befruchtungsvorgänge
verwendet wurden
| Schub | Schub 6 |
| Datum | 13.05.2003 | 13.05.2003 | 13.05.2003 |
| Weibchen
Ref. | L23♀1 | L23♀2 | L23♀9 |
| Ursprung | L23 | L23 | L23 |
| Temp. °C | 6-8 | 6-8 | 6-8 |
| Dauer der Kaltbehandlung
(Tage) | 21 | 21 | 21 |
| Anfängliches
Gew. (g) | n. bek. | n. bek. | n. bek. |
| hinzugefügtes Sperma (ml) | 7 | 7 | 7 |
| Männchen | L23♂.3 | L23.♂3 | L23♂.3 |
| | Raum
mit gesteuerter Temperatur; 6 °C | | |
| Zeit
der Befruchtung (Min.) | 20 | 20 | 20 |
| Auszählung
/1 ml oder 0,5 ml | 192 | 122 | 165 |
| 109 | 101 | 112 |
| 117 | 111 | 152 |
| 139 | 105 | 133 |
| 171 | 85 | 141 |
| Σ | 728 | 524 | 703 |
| Durchschnitt | 145,6 | 104,8 | 140,6 |
| Standardabweich
ung | 35,4 | 13,6 | 20,0 |
| Mg.
der Probe (ml) | 0,5 | 0,5 | 0,5 |
| Gesamtmenge
(ml) | 2000 | 3000 | 2000 |
| verwendetes
Wasser (W. z./G.) | W.
z. | W.
z. | W.
z. |
| Gesamt
(N) | 582400 | 628800 | 562400 |
| Ablagen | 1 | 4 | 1 |
| Anz./Ablage | 150000 | 157200 | 150000 |
- Legende: L = Bettcode; n. bek. = nicht
bekannt; W. z. = wieder zugeführtes
gefiltertes Meerwasser; G. = gefiltertes Meerwasser
-
Literaturnachweis
-
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of mud: diet selection in marine deposit feeders." Diet Selection:
An inter-disciplinary Approach to Foraging Behaviour, R. N. Hughes,
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of the exploitation of the Lugworm Arenicola marina and the Ragworm Nereis
virens (Polychaeta) in conservation areas." Aquatic Conservation: Marine and Freshwater
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