DE60035231T2

DE60035231T2 - Verfahren und Zusammensetzungen zur Diagnose von Tumoren

Info

Publication number: DE60035231T2
Application number: DE60035231T
Authority: DE
Inventors: Avi J. San Mateo Ashkenazi; Audrey San Francisco Goddard; Paul J. Burlingame Godowski; Austin L. San Francisco Gurney; Kenneth J. San Francisco Hillan; Scot A. San Carlos Masters; James Belmont PAN; Robert M. El Cerrito Pitti; Margaret Ann San Francisco Roy; Victoria Burlingame Smith; Donna M. Brisbane Stone; Colin K. Moraga Watanabe; William I. Cupertino Wood
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1999-03-08
Filing date: 2000-02-11
Publication date: 2008-02-21
Anticipated expiration: 2020-02-12
Also published as: DE60032395D1; DE60036969D1; DE60035077T2; DE60035231D1; DE60041561D1; DE60037349D1; DE60036969T2; DE60037349T2; DE60032395T2; DE60035077D1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Zusammensetzungen und Verfahren für die Tumordiagnose und Tumorbehandlung.
Hintergrund der Erfindung
Bösartige Tumoren (Krebsarten) sind nach Herzerkrankungen die zweithäufigste Todesursache in den Vereinigten Staaten (Boring et al., CA Cancel J. Clin. 43, 7 (1993)).
Krebs ist gekennzeichnet durch die Zunahme der Anzahl abnormaler oder neoplastischer Zellen, die von normalem Gewebe abgeleitet sind und die sich vermehren, um eine Tumormasse zu bilden, durch die Invasion benachbarter Gewebe durch diese neoplastischen Tumorzellen und durch die Bildung bösartiger Zellen, die sich letztlich über das Blut oder das lymphatische System auf lokale Lymphknoten und entferntere Stellen verbreiten (Metastasenbildung). In einem krebsartigen Zustand vermehrt sich eine Zelle unter Bedingungen, unter denen sich normale Zellen nicht vermehren würden. Krebs manifestiert sich in vielerlei Formen, die durch ein unterschiedliches Ausmaß an Invasivität und Aggressivität gekennzeichnet sind.
Die Änderung der Genexpression steht in enger Beziehung mit dem/der unkontrollierten Wachstum und Entdifferenzierung, die eine verbreitete Eigenschaft aller Krebsarten sind. Es hat sich gezeigt, dass die Genome bestimmter gut untersuchter Tumoren eine verminderte Expression rezessiver Gene aufweisen, die üblicherweise als Tumorsuppressorgene bezeichnet werden, die normalerweise in ihrer Funktion das bösartige Zellwachstum und/oder die Überexpression von bestimmten dominanten Genen, wie z.B. Onkogenen, deren Wirkung bösartiges Wachstum fördert, verhindern. Jede dieser genetischen Veränderungen scheint für die Einführung mancher Merkmale verantwortlich zu sein, die insgesamt den vollständigen neoplastischen Phänotyp darstellen (Hunter, Cell 64, 1129 (1991); Bishop, Cell 64, 235–248 (1991)).
Ein wohlbekannter Mechanismus der Gen- (z.B. Onkogen-) Überexpression in Krebszellen ist die Genamplifikation. Dies ist ein Prozess, bei dem im Chromosom der Stammzelle Vielfachkopien eines bestimmten Gens produziert werden. Der Prozess umfasst die nicht programmgemäße Replikation der das Gen umfassenden Chromosomenregion, gefolgt von der Rekombination der replizierten Segmente zurück in das Chromosom (Alitalo et al., Adv. Cancer Res. 47, 235–281 (1986)). Es wird angenommen, dass die Überexpression des Gens mit der Genamplifikation einhergeht, d.h. proportional zur Anzahl der hergestellten Kopien ist.
Es ist festgestellt worden, dass Proto-Onkogene, die für Wachstumsfaktoren und Wachstumsfaktorrezeptoren kodieren, wichtige Rollen bei der Pathogenese verschiedener menschlicher Malignitäten, einschließlich Brustkarzinome, spielen. Beispielsweise ist herausgefunden worden, dass das menschliche ErbB2-Gen (erbB2, auch als her2 oder c-erbB-2 bekannt), das für einen 185-kd-Transmembran-Glykoprotein-Rrezeptor (p185^HER2; HER2) kodiert, der mit dem Epidermis-Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGFR) verwandt ist, bei ungefähr 25 % bis 30 % der menschlichen Brustkarzinome überexprimiert wird (Slamon et al., Science 235, 177–1987); Slamon et al., Science 244, 707–712 (1989)).
Es ist berichtet worden, dass die Genamplifikation eines Proto-Onkogens ein Ereignis ist, das typischerweise an bösartigeren Krebsarten beteiligt ist und als Vorhersagemittel eines klinischen Ergebnisses dienen könnte (Schwab et al., Genes Chromosomes Cancer 1, 181–193 (1990); Alitalo et al., s.o.) Folglich wird die erbB2-Überexpression üblicherweise als Vorhersagemittel einer schlechten Prognose angesehen, insbesondere bei Patienten mit einer Primärerkrankung, die Achsellymphknoten umfasst (Slamon et al. (1987) und (1989), s.o.; Ravdin und Chamness, Gene 159, 19–27 (1995); und Hynes und Stern, Biochim. Biophys. Acta 1198, 165–184 (1994)), und ist mit Empfindlichkeit und/oder Resistenz gegen Hormontherapie und chemotherapeutische Regime, einschließlich CMF (Cyclophosphamid, Methotrexat und Fluoruracil) und Anthrazyklinen in Verbindung gebracht worden (Baselga et al., Oncology 11 (3 Suppl. 1), 43–48 (1997)). Jedoch waren trotz der Verbindung von erbB2-Überexpression mit schlechter Prognose die Unterschiede HER2-positiver Patienten, die auf Behandlung mit Taxanen klinisch reagierten, dreimal höher als jene HER2-negativer Patienten (ebenda). Ein rekombinanter humanisierter monoklonaler Anti-ErbB2- (Anti-HER2-) Antikörper (eine humanisierte Version des Maus-Anti-ErbBG2-Antikörpers 4D5, der als rhuMab HER2 oder Herceptin^® bezeichnet wird) war klinisch aktiv in Patienten mit ErbB2-überexprimierenden metastatischen Brustkarzinomen, die eine umfassende vorhergehende Antikrebstherapie erhalten haben (Baselga et al., J. Clin. Oncol. 14, 737–744 (1996)).
Im Lichte dessen besteht natürlich Interesse an der Identifikation neuer Verfahren und Zusammensetzungen, die zur Diagnose und Behandlung von Tumoren zweckdienlich sind, die mit Genamplifikation zusammenhängen.
Zusammenfassung der Erfindung
A. Ausführungsformen
Die vorliegende Erfindung betrifft Zusammensetzungen und Verfahren zur Diagnose und Behandlung von neoplastischem/r Zellwachstum und Vermehrung in Säugetieren, einschließlich Menschen. Die vorliegende Erfindung basiert auf der Identifizierung von Genen, die im Genom von Tumorzellen amplifiziert werden. Von einer derartigen Genamplifikation wird erwartet, dass sie mit der Überexpression des Genprodukts in Verbindung steht und zur Tumorgenese beiträgt. Demgemäß wird von den Proteinen, die von den amplifizierten Genen kodiert werden, angenommen, dass sie zweckdienliche Ziele zur Diagnose und/oder Behandlung (einschließlich Prävention) bestimmter Krebsarten sind und als Vorhersagemittel der Prognose der Tumorbehandlung dienen könnten.
In einer Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung einen isolierten Antikörper, der an ein Polypeptid bindet, das hierin als PRO- oder PRO7168-Polypeptid bezeichnet wird. In einem Aspekt bindet der isolierte Antikörper spezifisch an ein PRO7168-Polypeptid. In einem weiteren Aspekt induziert der Antikörper den Tod einer Zelle, die ein PRO7168-Polypeptid exprimiert. Oft ist die Zelle, die das PRO7168-Polypeptid exprimiert, eine Tumorzelle, die das Polypeptid im Vergleich zu einer normalen Zelle desselben Zelltyps überexprimiert. In einem weiteren Aspekt ist der Antikörper ein monoklonaler Antikörper, der vorzugsweise Reste einer nicht-menschlichen komplementaritätsbestimmenden Region (CDR) und Reste einer menschlichen Gerüstregion (FR) aufweist. Der Antikörper kann markiert und auf einem festen Träger immobilisiert sein. In einem weiteren Aspekt ist der Antikörper ein Antikörperfragment, ein einkettiger Antikörper oder ein humanisierter Antikörper, der vorzugsweise spezifisch an ein PRO7168-Polypeptid bindet.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung eine Materialzusammensetzung, die einen Antikörper umfasst, der vorzugsweise spezifisch an ein PRO7168-Polypeptid bindet, in einem Gemisch mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger. In einem Aspekt umfasst die Materialzusammensetzung eine therapeutisch wirksame Menge des Antikörpers. In einem weiteren Aspekt umfasst die Zusammensetzung einen weiteren aktiven Bestandteil, der beispielsweise ein weiterer Antikörper oder ein zytotoxisches oder chemotherapeutisches Mittel ist. Vorzugsweise ist die Zusammensetzung steril.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung isolierte Nucleinsäuremoleküle, die für Anti-PRO7168-Antikörper kodieren, sowie Vektoren und rekombinante Wirtszellen, die solche Nucleinsäuremoleküle umfassen.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Anti-PRO7168-Antikörpers bereit, wobei das Verfahren das Kultivieren einer Wirtszelle, die mit einem für den Antikörper kodierenden Nucleinsäuremolekül transformiert ist, und zwar unter Bedingungen, die ausreichen, um eine Expression des Antikörpers zu erlauben, und das Gewinnen des Antikörpers aus der Zellkultur umfasst.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung ein isoliertes Nucleinsäuremolekül, das an ein Nucleinsäuremolekül hybridisiert, welches für ein PRO7168-Polypeptid kodiert, oder das Komplement davon. Das isolierte Nucleinsäuremolekül ist vorzugsweise DNA, und die Hybridisierung findet vorzugsweise unter stringenten Hybridisierungs- und Waschbedingungen statt. Solche Nucleinsäuremoleküle können als Antisense-Moleküle der hierin identifizierten amplifizierten Gene dienen, die wiederum in der Modulation der Transkription und/oder Translation der jeweiligen amplifizierten Gene oder als Antisense-Primer in Amplifikationsreaktionen Anwendung finden können. Außerdem können solche Sequenzen als Teil eines Ribozyms und/oder einer Tripelhelix-Sequenz verwendet werden, die wiederum bei der Regulation der amplifizierten Gene eingesetzt werden können.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis der Gegenwart eines PRO7168-Polypeptids in einer Probe bereit, von der angenommen wird, dass sie ein PRO7168-Polypeptid enthält, worin das Verfahren das Aussetzen der Probe gegenüber einem Anti-PRO7168-Antikörper und das Bestimmen der Bindung des Antikörpers an ein PRO7168-Polypeptid in der Probe umfasst. In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis der Gegenwart eines PRO7168-Polypeptids in einer Zelle bereit, worin das Verfahren das Aussetzen der Zelle gegenüber einem Anti-PRO7168-Antikörper und das Bestimmen der Bindung des Antikörpers an die Zelle umfasst.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Diagnose eines Lungentumors in einem Säugetier, umfassend das Detektieren der Expressionswerts eines für PRO7168-Polypeptid kodierenden Gens (a) in einer Probe von Gewebezellen vom Säugetier und (b) einer Kontrollprobe von bekannten normalen Gewebezellen desselben Zelltyps, worin ein höherer Expressionswert in der Probe im Vergleich zur Kontrollprobe die Gegenwart eines Tumors im Säugetier anzeigt, von dem die Testgewebezellen erhalten wurden.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Diagnose eines Lungentumors in einem Säugetier, umfassend (a) das Kontaktieren eines Anti-PRO7168-Antikörpers mit einer Probe von Gewebezellen vom Säugetier und (b) das Detektieren der Bildung eines Komplexes aus dem Anti-PRO7168-Antikörper und einem PRO7168-Polypeptid in der Probe, worin die Bildung eines Komplexes die Gegenwart eines Tumors im Säugetier anzeigt. Die Detektion kann qualitativ oder quantitativ sein und kann im Vergleich mit der Überwachung der Komplexbildung in einer Kontrollprobe von bekannten normalen Gewebezellen vom gleichen Zelltyp erfolgen. Eine größere Menge von Komplexen, die sich in der Probe bildet, zeigt die Gegenwart eines Tumors im Säugetier an, von dem die Testgewebezellen erhalten wurden. Der Antikörper trägt vorzugsweise einen detektierbaren Marker. Die Komplexbildung kann beispielsweise durch Lichtmikroskopie, Durchflusszytometrie, Fluorimetrie oder andere auf dem Gebiet der Erfindung bekannte Verfahren überwacht werden.
Die Probe stammt üblicherweise von einem Individuum, von dem angenommen wird, das es neoplastische(s) Zellwachstum oder -proliferation (z.B. Krebszellen) aufweist.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Krebsdiagnoseset, umfassend einen Anti-PRO7168-Antikörper und einen Träger (z.B. einen Puffer) in einer geeigneten Verpackung. Das Set umfasst vorzugsweise Anleitungen zum Einsatz des Antikörpers zum Nachweis der Gegenwart eines PRO7168-Polypeptids in einer Probe, die dieses vermutlich enthält.
B. Zusätzliche Ausführungsformen
In anderen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung stellt die Erfindung ein isoliertes Nucleinsäuremolekül bereit, das eine Nucleotidsequenz umfasst, die für ein PRO7168-Polypeptid kodiert.
In einem Aspekt umfasst das isolierte Nucleinsäuremolekül eine Nucleotidsequenz mit zumindest etwa 80 % Sequenzidentität, vorzugsweise zumindest etwa 81 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 82 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 83 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 84 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 85 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 86 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 87 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 88 % Sequenz identität, noch bevorzugter zumindest etwa 89 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 90 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 91 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 92 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 93 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 94 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 95 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 96 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 97 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 98 % Sequenzidentität und noch bevorzugter zumindest etwa 99 % Sequenzidentität, mit (a) einem DNA-Molekül, das für ein PRO7168-Polypeptid mit einer Volllängen-Aminosäuresequenz, wie hierin offenbart, einer Aminosäuresequenz, der das Signalpeptid fehlt, wie hierin offenbart, einer extrazellulären Domäne eines Transmembranproteins, mit oder ohne Signalpeptid, wie hierin offenbart, oder einem anderen spezifisch definierten Fragment der Volllängen-Aminosäuresequenz, wie hierin offenbart, kodiert, oder (b) dem Komplement des DNA-Moleküls aus (a).
In anderen Aspekten umfasst das isolierte Nucleinsäuremolekül eine Nucleotidsequenz mit zumindest etwa 80 % Sequenzidentität, vorzugsweise zumindest etwa 81 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 82 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 83 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 84 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 85 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 86 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 87 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 88 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 89 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 90 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 91 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 92 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 93 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 94 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 95 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 96 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 97 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 98 % Sequenzidentität und noch bevorzugter zumindest etwa 99 % Sequenzidentität, mit (a) einem DNA-Molekül, das die für eine Vollängen-PRO7168-Polypeptid-cDNA kodierende Sequenz, wie hierin offenbart, die kodierende Sequenz eines PRO7168- Polypeptids, dem das Signalpeptid fehlt, wie hierin offenbart, die kodierende Sequenz einer extrazellulären Domäne eines Transmembran-PRO7168-Polypeptids, mit oder ohne Signalpeptid, wie hierin offenbart, oder die kodierende Sequenz eines anderen spezifische definierten Fragments der Volllängen-Aminosäuresequenz, wie hierin offenbart, umfasst, oder (b) dem Komplement des DNA-Moleküls gemäß (a).
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein isoliertes Nucleinsäuremolekül, das eine Nucleotidsequenz mit zumindest etwa 80 % Sequenzidentität, vorzugsweise zumindest etwa 81 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 82 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 83 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 84 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 85 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 86 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 87 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 88 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 89 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 90 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 91 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 92 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 93 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 94 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 95 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 96 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 97 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 98 % Sequenzidentität und noch bevorzugter zumindest etwa 99 % Sequenzidentität, mit (a) einem DNA-Molekül, das für das gleiche reife Polypeptid kodiert wie beliebige bei der ATCC hinterlegte menschliche Protein-cDNAs, wie sie hierin offenbart sind, oder (b) dem Komplement des DNA-Moleküls gemäß (a) umfasst.
Ein anderer Aspekt der Erfindung stellt ein isoliertes Nucleinsäuremolekül bereit, das eine Nucleotidsequenz umfasst, die für ein PRO7168-Polypeptid kodiert, das entweder Transmembrandomänen-deletiert oder Transmembrandomänen-inaktiviert ist oder das zu solch einer kodierenden Nucleotidsequenz komplementär ist, worin die Transmembrandomänen) solch eines Polypeptids hierin offenbart ist/sind. Deshalb kommen lösliche extrazelluläre Domänen der hierin beschriebenen PRO7168-Polypeptide ebenfalls in Frage.
Eine weitere Ausführungsform betrifft Fragmente einer für ein PRO7168-Polypeptid kodierenden Sequenz oder deren Komplement, die beispielsweise als Hybridisierungssonden zur Kodierung für Fragmente eines PRO7168-Polypeptids Anwendung finden können, die gegebenenfalls für ein Polypeptid mit einer Bindungsstelle für einen Anti-PRO7168-Antikörper kodieren können, oder als Antisense-Oligonucleotidsonden. Solche Nucleinsäurefragmente sind üblicherweise etwa 20 Nucleotide lang, vorzugsweise zumindest etwa 20 Nucleotide, noch bevorzugter zumindest etwa 40 Nucleotide, noch bevorzugter zumindest etwa 50 Nucleotide, noch bevorzugter zumindest etwa 60 Nucleotide, noch bevorzugter zumindest etwa 70 Nucleotide, noch bevorzugter zumindest etwa 80 Nucleotide, noch bevorzugter zumindest etwa 90 Nucleotide, noch bevorzugter zumindest etwa 100 Nucleotide, noch bevorzugter zumindest etwa 110 Nucleotide, noch bevorzugter etwa 120 Nucleotide, noch bevorzugter zumindest etwa 140 Nucleotide, noch bevorzugter zumindest etwa 140 Nucleotide, noch bevorzugter zumindest etwa 150 Nucleotide, noch bevorzugter zumindest etwa 160 Nucleotide, noch bevorzugter zumindest etwa 170 Nucleotide, noch bevorzugter zumindest etwa 180 Nucleotide, noch bevorzugter zumindest etwa 190 Nucleotide, noch bevorzugter zumindest etwa 200 Nucleotide, noch bevorzugter zumindest etwa 250 Nucleotide, noch bevorzugter zumindest etwa 300 Nucleotide, noch bevorzugter zumindest etwa 350 Nucleotide, noch bevorzugter zumindest etwa 400 Nucleotide, noch bevorzugter zumindest etwa 450 Nucleotide, noch bevorzugter zumindest etwa 500 Nucleotide, noch bevorzugter zumindest etwa 600 Nucleotide, noch bevorzugter zumindest etwa 700 Nucleotide, noch bevorzugter zumindest etwa 800 Nucleotide, noch bevorzugter zumindest etwa 900 Nucleotide und noch bevorzugter zumindest etwa 1000 Nucleotid lang, worin sich in diesem Zusammenhang der Begriff „etwa" auf die genannte Nucleotidsequenzlänge plus oder minus 10 % der genannten Länge bezieht. Es gilt anzumerken, dass neue Fragmente einer für ein PRO7168-Polypeptid kodierenden Nucleotidsequenz auf Routineweise durch eine vergleichende Anordnung der für ein PRO7168-Polypeptid kodierenden Nucleotidsequenz mit anderen bekannten Nucleotidsequenzen bestimmt werden können, wobei allgemein bekannte Sequenzanordnungsprogramme eingesetzt werden können und bestimmt wird, welche(s) für ein PRO7168-Polypeptid kodierende(n) Nucleotidsequenzfragment(e) neu ist/sind. Alle solche für ein PRO7168-Polypeptid kodierenden Nucleotidsequenzen kommen hierin in Frage. Auch in Frage kommen die PRO7168-Polypeptidfragmente, für welche diese Nucleotidmolekülfragmente kodieren, vorzugsweise jene Polypeptidfragmente, die eine Bindungsstelle für einen Anti-PRO7168-Antikörper umfassen.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein PRO7168-Polypeptid bereit, für das eine beliebige der oben identifizierten isolierten Nucleinsäuresequenzen kodiert.
In einem bestimmten Aspekt betrifft die Erfindung ein isoliertes PRO7168-Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz mit zumindest etwa 80 % Sequenzidentität, vorzugsweise zumindest etwa 81 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 82 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 83 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 84 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 85 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 86 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 87 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 88 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 89 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 90 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 91 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 92 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 93 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 94 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 95 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 96 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 97 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 98 % Sequenzidentität und noch bevorzugter zumindest etwa 99 % Sequenzidentität, mit einem PRO7168-Polypeptid mit einer Volllängen-Aminosäuresequenz, wie sie hierin offenbart ist, einer Aminosäuresequenz, der das Signalpeptid fehlt, wie hierin offenbart ist, einer extrazellulären Domäne eines Transmembranproteins, mit oder ohne Signalpeptid, wie hierin offenbart ist, oder einem anderen spezi fisch definierten Fragment der Vollängen-Aminosäuresequenz, wie es hierin offenbart ist, umfasst.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein isoliertes PRO7168-Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz mit zumindest etwa 80 % Sequenzidentität, vorzugsweise zumindest etwa 81 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 82 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 83 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 84 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 85 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 86 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 87 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 88 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 89 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 90 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 91 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 92 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 93 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 94 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 95 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 96 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 97 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 98 % Sequenzidentität und noch bevorzugter zumindest etwa 99 % Sequenzidentität, mit einer Aminosäuresequenz, für die eine beliebige der bei der ATCC hinterlegten menschlichen Protein-cDNAs kodiert, wie sie hierin offenbart sind, umfasst.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein isoliertes PRO7168-Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz umfasst, deren Vergleich mit der Aminosäuresequenz eines PRO7168-Polypeptids mit einer Volllängen-Aminosäuresequenz, wie hierin offenbart, einer Aminosäuresequenz, der das Signalpeptid fehlt, wie hierin offenbart, einer extrazellulären Domäne eines Transmembranproteins, mit oder ohne Signalpeptid, wie hierin offenbart, oder einem anderen spezifisch definierten Fragment der Volllängen-Aminosäuresequenz, wie sie hierin offenbart ist, zu zumindest etwa 80 % positiv, vorzugsweise zu zumindest etwa 81 % positiv, noch bevorzugter zu zumindest etwa 82 % positiv, noch bevorzugter zu zumindest etwa 83 % positiv, noch bevorzugter zu zumindest etwa 84 % positiv, noch bevorzugter zu zumindest etwa 85 % positiv, noch bevorzugter zu zumindest etwa 86 % positiv, noch bevorzugter zu zumindest etwa 87 % positiv, noch bevorzugter zu zumindest etwa 88 % positiv, noch bevorzugter zu zumindest etwa 89 % positiv, noch bevorzugter zu zumindest etwa 90 % positiv, noch bevorzugter zu zumindest etwa 91 % positiv, noch bevorzugter zu zumindest etwa 92 % positiv, noch bevorzugter zu zumindest etwa 93 % positiv, noch bevorzugter zu zumindest etwa 94 % positiv, noch bevorzugter zu zumindest etwa 95 % positiv, noch bevorzugter zu zumindest etwa 96 % positiv, noch bevorzugter zu zumindest etwa 97 % positiv, noch bevorzugter zu zumindest etwa 98 % positiv und noch bevorzugter zu zumindest etwa 99 % positiv ausfällt.
In einem spezifischen Aspekt stellt die Erfindung ein isoliertes PRO7168-Polypeptid ohne N-terminale Signalsequenz und/oder initiierendes Methionin bereit, für das eine Nucleotidsequenz kodiert, die für eine Aminosäuresequenz kodiert, wie sie oben beschrieben wurde. Verfahren zur Herstellung derselben sind ebenfalls hierin beschrieben, worin diese Verfahren das Kultivieren einer Wirtszelle, die einen Vektor mit dem geeigneten kodierenden Nucleinsäuremolekül umfasst, unter zur Expression des PRO7168-Polypeptids geeigneten Bedingungen und das Gewinnen des PRO7168-Polypeptids aus der Zellkultur umfassen.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung stellt ein isoliertes PRO7168-Polypeptid bereit, das entweder Transmembrandomänen-deletiert oder Transmembrandomänen-inaktiviert ist. Verfahren zur Herstellung derselben sind ebenfalls hierin beschrieben, worin diese Verfahren das Kultivieren einer Wirtszelle, die einen Vektor mit dem geeigneten kodierenden Nucleinsäuremolekül umfasst, unter zur Expression des PRO7168-Polypeptids geeigneten Bedingungen und das Gewinnen des PRO7168-Polypeptids aus der Zellkultur umfassen.
In anderen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung stellt die Erfindung Vektoren bereit, die für eines der hierin beschriebenen Polypeptide kodierende DNA umfassen. Eine Wirtszelle, die einen beliebigen solchen Vektor umfasst, ist ebenfalls bereitgestellt. Die Wirtszellen können beispielsweise CHO-Zellen, E.-coli-Zellen, Hefezellen oder Baculovirus-infizierte Insektenzellen sein. Ein Verfahren zur Herstellung eines beliebigen der hierin beschriebenen Polypeptide wird ebenfalls bereitgestellt und umfasst das Kultivieren der Wirtszellen unter Bedingungen, die für die Expression des gewünschten Polypeptids geeignet sind, und das Gewinnen des gewünschten Polypeptids aus der Zellkultur.
In anderen Ausführungsformen stellt die Erfindung Hybridmoleküle bereit, die ein beliebiges der hierin beschriebenen Moleküle an ein heterologes Polypeptid oder eine Aminosäuresequenz fusioniert umfassen. Ein Beispiel für solche Hybridmoleküle umfasst ein beliebiges der hierin beschriebenen Polypeptide, fusioniert an eine Epitopmarkierungssequenz oder eine Fc-Region eines Immunglobulins.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung einen Antikörper bereit, der spezifisch an ein beliebiges der oben oder nachstehend beschriebenen Polypeptide bindet. Der Antikörper ist gegebenenfalls ein monoklonaler Antikörper, ein humanisierter Antikörper, ein Antikörperfragment oder ein einkettiger Antikörper.
In weiteren Ausführungsformen stellt die Erfindung Oligonucleotidsonden bereit, die für die Isolierung von genomischen und cDNA-Nucleotidsequenzen oder als Antisense-Sonden von Nutzen sind, worin diese Sonden von beliebigen der oben oder nachstehend beschriebenen Nucleotidsequenzen abgeleitet sein können.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
1 zeigt die Nucleotidsequenz (Seq.-ID Nr. 1) einer cDNA, die eine für Nativsequenz-PRO7168 kodierende Nucleotidsequenz enthält, worin es sich bei der Nucleotidsequenz (Seq.-ID Nr. 1) um einen Klon handelt, der hierin als DNA102846-2742 bezeichnet wird. Außerdem sind die Positionen der jeweiligen Start- und Stoppcodons fett gedruckt und unterstrichen.
2 zeigt die Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 2) eines Nativsequenz-PRO7168-Polypeptids, das von der in 1 gezeigten kodierenden Sequenz der Seq.-ID Nr. 1 abgeleitet ist.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
I. Definitionen
Die Ausdrücke „Genamplifikation" und „Genduplikation" werden austauschbar verwendet und beziehen sich auf einen Prozess, durch den Vielfachkopien eines Gens oder Genfragments in einer bestimmten Zelle oder Zelllinie gebildet werden. Die duplizierte Region (ein Abschnitt amplifizierter DNA) wird häufig als „Amplicon" bezeichnet. Üblicherweise steigt die Menge an produzierter Messenger-RNA (mRNA), d.h. das Ausmaß der Genexpression, ebenfalls im Verhältnis zur Anzahl der hergestellten Kopien des jeweiligen exprimierten Gens.
„Tumor" bezieht sich bei Verwendung hierin auf jegliches) neoplastische Zellwachstum und Vermehrung, ob bös- oder gutartig, und auf alle präkanzerösen und kanzerösen Zellen und Gewebe.
Die Begriffe „Krebs" und „kanzerös" beziehen sich auf oder beschreiben den physiologischen Zustand in Säugetieren, der typischerweise durch unkontrolliertes Zellwachstum gekennzeichnet ist. Beispiele für Krebs umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf Karzinome, Lymphome, Blastome, Sarkome und Leukämie. Speziellere Beispiele für derartige Krebsarten umfassen Brustkarzinome, Prostatakarzinome, Kolonkarzinome, Plattenepithelkarzinome, kleinzellige Lungenkarzinome, nicht-kleinzellige Lungenkarzinome, Magen-Darm-Karzinome, Pankreaskarzinome, Glioblastome, Zervixkarzinome, Ovarialkarzinome, Leberkarzinome, Blasenkarzinome, Hepatome, kolorektale Karzinome, Endometriumkarzinome, Speicheldrüsenkarzinome, Nierenkarzinome, Leberkarzinome, Vulvakarzinome, Schilddrüsenkarzinome und verschiedene Arten von Kopf- und Nackenkrebs.
„Behandlung" ist ein Eingriff, der mit der Absicht durchgeführt wird, die Entwicklung der Pathologie einer Störung zu verhindern oder diese zu verändern. Demgemäß bezieht sich „Behandlung" sowohl auf therapeutische Behandlung, als auch auf prophylaktische oder präventive Maßnahmen. Jene, die einer Behandlung bedürfen, umfas sen jene, welche die Störung bereits aufweisen, sowie jene, bei denen die Störung zu verhindern ist. Bei der Tumor- (z.B. Krebs-) Behandlung kann ein therapeutisches Mittel die Pathologie von Tumorzellen direkt vermindern oder kann die Tumorzellen empfänglicher für eine Behandlung mit anderen therapeutischen Mitteln, z.B. Bestrahlung und/oder Chemotherapie machen.
Die „Pathologie" von Krebs umfasst alle Phänomene, welche die Gesundheit des Patienten beeinträchtigen. Dies umfasst ohne Einschränkung abnormales oder unkontrollierbares Wachstum, Metastase, Störung der normalen Funktion von Nachbarzellen, Freisetzung von Cytokinen oder anderen Sekretionsprodukten in abnormalen Ausmaßen, Unterdrückung oder Verschlimmerung entzündlicher oder immunologischer Reaktionen usw.
„Säugetier" zum Zwecke der Behandlung bezieht sich auf jegliches als Säugetier klassifiziertes Tier, einschließlich Menschen, Haus- und Nutztiere und Zoo-, Sport- oder Haustiere, wie z.B. Hunde, Pferde, Katzen, Rinder, Schweine, Schafe usw. Vorzugsweise ist das Säugetier der Mensch.
Hierin verwendete „Träger" umfassen pharmazeutisch annehmbare Träger, Exzipienten oder Stabilisatoren, die für die/das ihnen ausgesetzte Zelle oder Säugetier in den eingesetzten Dosierungen und Konzentrationen nicht toxisch sind. Häufig ist der physiologisch annehmbare Träger eine wässrige, pH-gepufferte Lösung. Beispiele physiologisch annehmbarer Träger umfassen Puffer, wie z.B. Phosphat, Citrat und andere organische Säuren; Antioxidantien einschließlich Ascorbinsäure; niedermolekulare (weniger als etwa 10 Reste) Polypeptide; Proteine, wie z.B. Serumalbumin, Gelatine oder Immunglobuline; hydrophile Polymere, wie z.B. Polyvinylpyrrolidon; Aminosäuren, wie z.B. Glycin, Glutamin, Asparagin, Arginin oder Lysin; Monosaccharide, Disaccharide oder andere Kohlenhydrate, einschließlich Glucose, Mannose oder Dextrine; Chelatbildner, wie z.B. EDTA; Zuckeralkohole, wie z.B. Mannit oder Sorbit; salzbildende Gegenionen, wie z.B. Natrium; und/oder nichtionische Tenside, wie z.B. TWEEN^TM, Polyethylenglykol (PEG) und PLURONICS^TM.
Verabreichung „in Kombination mit" einem oder mehreren anderen therapeutischen Mitteln umfasst die simultane (gleichzeitige) und nacheinander erfolgende Verabreichung in beliebiger Reihenfolge.
Die Bezeichnung „zytotoxisches Mittel" wie hierin verwendet bezieht sich auf eine Substanz, die die Funktion von Zellen inhibiert oder unterbindet und/oder die Zerstörung von Zellen verursacht. Die Bezeichnung soll radioaktive Isotope (z.B. I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰ und Re¹⁸⁶), chemotherapeutische Mittel und Toxine wie z.B. enzymatisch aktive Toxine, die aus Bakterien, Pilzen, Pflanzen oder Tieren stammen, oder Fragmente davon umfassen.
Ein „chemotherapeutisches Mittel" ist eine bei der Behandlung von Krebs zweckdienliche Verbindung. Beispiele chemotherapeutischer Mittel umfassen Adriamycin, Doxorubicin, Epirubicin, 5-Fluorouracil, Cytosinarabinosid („Ara-C"), Cyclophosphamid, Thioetepa, Busulfan, Cytoxin, Taxoide, z.B. Paclitaxel (Taxol, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ) und Doxetaxel (Taxotere, Rhone-Poulenc Rorer, Antony, Rnace), Toxotere, Methotrexat, Cisplatin, Melphalan, Vinblastin, Bleomycin, Etoposid, Ifosamid, Mitotoxin C, Mitoxantron, Vincistrin, Vinorelbin, Carboplatin, Teniposid, Daunomycin, Carminomycin, Aminopterin, Dactinomycin, Mitomycine, Esperamicine (siehe US-Patent Nr. 4.675.187 ), 5-FU, 6-Thioguanin, 6-Mercatpopurin, Actinomycin D, VP-16, Chlorambucil, Melphalan und andere verwandte Stickstoff-Loste. Ebenfalls von dieser Definition umfasst sind hormonelle Mittel, deren Wirkung die Hormonwirkung auf Tumoren reguliert oder hemmt, wie z.B. Tamoxifen und Onapriston.
Ein „wachstumshemmendes Mittel" bezieht sich bei Verwendung hierin auf eine Verbindung oder Zusammensetzung, die das Wachstum einer Zelle, insbesondere einer Krebszelle hemmt, die ein beliebiges der hierin identifizierten Gene entweder in vitro oder in vivo überexprimiert. Folglich ist das wachstumshemmende Mittel eines, das den prozentuellen Anteil an Zellen, die derartige Gene in der S-Phase des Zellzyklus überexprimieren, signifikant vermindert. Beispiele wachstumshemmender Mittel umfassen Mittel, die das Fortschreiten des Zellzyklus (an einer Stelle, die nicht die S-Phase ist) blockiert, wie z.B. Mittel, die G1-Arretierung und M-Phasen-Arretierung auslösen. Klassische M-Phasen-Blocker umfassen Vincas (Vincristin und Vinblastin), Taxol und Topo-II-Hemmstoffe, wie z.B. Doxorubicin, Epirubicin, Daunorubicin, Etoposid und Bleomycin. Jene Mittel, welche die G1 arretieren, quellen auch in die S-Phasen-Arretierung über, beispielsweise DNA-alkylierende Mittel, wie z.B. Tamoxifen, Prednison, Dacarbazin, Mechlorethamin, Cisplatin, Methotrexat, 5-Fluoruracil und ara-C. Weitere Angaben finden sich in The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn und Israel (Hrsg.), Kapitel 1, mit dem Titel „Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplasmic drugs" von Murakami et al., WB Saunders, Philadelphia (1995), insbesondere S. 13.
„Doxorubicin" ist ein Anthracyclin-Antibiotikum. Der vollständige chemische Name von Doxorubicin lautet (8S-cis)-10-[(3-Amino-2,3,6-tridesoxy-α-L-lyxo-hexapyranosyl)oxy]-7,8,9,10-tetrahydro-6,8,11-trihydroxy-8-(hydroxyacetyl)-1-methoxy-5,12-naphthacendion.
Der Ausdruck „Cytokin" ist ein allgemeiner Ausdruck für Proteine, die von einer Zellpopulation freigesetzt werden, die auf eine andere Zelle als intrazelluläre Mediatoren wirken. Beispiele derartiger Cytokine sind Lymphokine, Monokine und herkömmliche Polypeptidhormone. Unter den Cytokinen mit umfasst sind Wachstumshormon, wie z.B. menschliches Wachstumshormon, menschliches N-Methionyl-Wachstumshormon und Rinderwachstumshormon; Parathyroidhormon; Thyroxin; Insulin; Proinsulin; Relaxin; Prorelaxin; Glykoproteinhormone, wie z.B. follikelstimulierendes Hormon (FSH); thyreotropes Hormon (TSH) und luteinisierendes Hormon (LH); Leberwachstumsfaktor; Fibroblastenwachstumsfaktor; Prolactin; Plazentalaktogen; Tumornekrosefaktor-α und -β; Müllerscher Hemmstoff; Maus-Gonadotropin-assoziiertes Peptid; Inhibin; Activin; Gefäßendothelwachstumsfaktor; Integrin; Thrombopoietin (TPO); Nervenwachstumsfaktoren, wie z.B. NGF-β; Blutplättchenwachstumsfaktor; transformierende Wachstumsfaktoren (TGFs), wie z.B. TGF-α und TGF-β; insulin-artiger Wachstumsfaktor-I und -II; Erythropoietin (EPO); knochenbildende Faktoren; Interferone, wie z.B. Interferon-α, -β und -γ; koloniestimulierende Faktoren (CSFs), wie z.B. Makrophagen-CSF (M-CSF); Granulozyten-Makrophagen-CSF (GM-CSF); und Gra nulocyten-CSF (G-CSF); Interleukine (ILs), wie z.B. IL-1, IL-1α; IL-2; IL-3; IL-4; IL-4; IL-6; IL-7; IL-8; IL-9; IL-11; IL-12; ein Tumornekrosefaktor, wie z.B. TNF-α oder TNF-β; und andere Polypeptidfaktoren, einschließlich LIF und Kit-Ligand (KL). Wie hierin verwendet, umfasst der Ausdruck Cytokin Proteine aus natürlichen Quellen oder aus rekombinanter Zellkultur und biologisch aktive Entsprechungen der Nativsequenz-Cytokine.
Die Bezeichnung „Prodrug" wie in dieser Anmeldung verwendet bezieht sich auf eine Vorläufer- oder Derivatform einer pharmazeutisch aktiven Substanz, die weniger zytotoxisch gegenüber Tumorzellen ist als der verwandte Wirkstoff und in der Lage ist, enzymatisch aktiviert oder zur aktiveren verwandten Form umgesetzt zu werden. Siehe z.B. Wilman, „Prodrugs in Cancer Chemotherapy", Biochemical Society Transactions 14, 375–382, 615^th Meeting Belfast (1986), und Stella et al., „Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery", Directed Drug Delivery, Borchardt et al. (Hrsg.), Humana Press, 247–267 (1985). Die Prodrugs dieser Erfindung umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf phosphathältige Prodrugs, thiophosphathältige Prodrugs, sulfathältige Prodrugs, peptidhältige Prodrugs, D-Aminosäure-modifizierte Prodrugs, glykosylierte Prodrugs, β-Lactam-hältige Prodrugs, gegebenenfalls substituierte Phenylacetamid-hältige Prodrugs und gegebenenfalls substituierte Phenylacetamid-hältige Prodrugs, 5-Fluorcytosin- und andere 5-Fluoruridin-Prodrugs, die in das aktivere zytotoxische freie Arzneimittel übergeführt werden können. Beispiele für zytotoxische Arzneimittel, die zu einer Prodrug-Form zur Verwendung in dieser Erfindung derivatisiert werden können, umfassen jene chemotherapeutischen Mittel, die zuvor beschrieben wurden, sind jedoch nicht beschränkt darauf.
Eine „wirksame Menge" eines hierin offenbarten Polypeptids oder eines Antagonisten davon in Bezug auf die Inhibierung von neoplastischem Zellwachstum, Tumorwachstum oder Krebszellenwachstum ist eine Menge, die in der Lage ist, das Wachstum von Target-Zellen in einem gewissen Ausmaß zu inhibieren. Die Bezeichnung umfasst eine Menge, die in der Lage ist, eine wachstumshemmende, zytostatische und/oder zytotoxische Wirkung und/oder Apoptose der Target-Zellen hervorzurufen. Eine „wirksame Menge" eines PRO-Polypeptid-Antagonisten für die Zwecke der Inhibierung von neoplastischem Zellwachstum, Tumorwachstum oder Krebszellenwachstum kann empirisch und routinemäßig bestimmt werden.
Eine „therapeutisch wirksame Menge" in Bezug auf die Behandlung eines Tumors bezieht sich auf eine Menge, die in der Lage ist, eine oder mehrere der folgenden Wirkungen hervorzurufen: (1) Inhibierung von Tumorwachstum in einem gewissen Ausmaß, einschließlich Verlangsamung und vollständige Arretierung von Tumorwachstum; (2) Reduktion der Anzahl an Tumorzellen; (3) Reduktion der Tumorgröße; (4) Inhibierung (d.h. Reduktion, Verlangsamung oder vollständiges Anhalten) von Tumorzellinfiltration in periphere Organe; (5) Inhibierung (d.h. Reduktion, Verlangsamung oder vollständiges Anhalten) von Metastasenbildung; (6) Förderung der Anti-Tumor-Immunantwort, die zur Regression oder Abstoßung des Tumors führen kann, jedoch nicht muss; und/oder (7) Erleichterung in einem gewissen Ausmaß von einem oder mehreren Symptomen, die mit der Erkrankung assoziiert sind. Eine "therapeutisch wirksame Menge" eines PRO-Polypeptid-Antagonisten kann für die Zwecke einer Tumorbehandlung empirisch und routinemäßig bestimmt werden.
Eine „wachstumshemmende Menge" eines PRO-Antagonisten ist eine Menge, die in der Lage ist, das Wachstum einer Zelle, insbesondere eines Tumors, z.B. einer Krebszelle, entweder in vitro oder in vivo, zu inhibieren. Eine „wachstumshemmende Menge" eines PRO-Antagonisten kann zur Inhibierung von neoplastischem Zellwachstum empirisch und routinemäßig bestimmt werden.
Eine „zytotoxische Menge" eines PRO-Antagonisten davon ist eine Menge, die in der Lage ist, die Zerstörung einer Zelle, insbesondere eines Tumors, z.B. einer Krebszelle, entweder in vitro oder in vivo, zu verursachen. Eine „zytotoxische Menge" eines PRO-Antagonisten kann zur Inhibierung von neoplastischem Zellwachstum empirisch und routinemäßig bestimmt werden.
Die Bezeichnungen „PRO-Polypeptid" und „PRO" wie hierin verwendet, und sofern ihr unmittelbar eine Nummernkennzeichnung folgt, beziehen sich auf verschiedene Polypeptide, wobei sich die vollständige Bezeichnung (d.h. PRO/Nummer) auf spezifische Polypeptidsequenzen wie hierin beschrieben beziehen. Die Bezeichnungen „PRO/Nummer-Polypeptid" und „PRO/Nummer", worin die Bezeichnung „Nummer" hierin als eine tatsächliche numerische Benennung bereitgestellt wird, umfassen Nativsequenzpolypeptide und Polypeptidvarianten (die hierin noch näher definiert werden). Die hierin beschriebenen PRO-Polypeptide können aus zahlreichen verschiedenen Quellen isoliert werden, wie z.B. aus menschlichen Gewebetypen oder aus einer anderen Quelle, oder können durch Rekombinations- oder Syntheseverfahren hergestellt werden.
Ein „Nativsequenz-PRO-Polypeptid" umfasst ein Polypeptid mit derselben Aminosäuresequenz wie das entsprechende, aus der Natur gewonnene PRO-Polypeptid. Solche Nativsequenz-PRO-Polypeptide können aus natürlichen Quellen isoliert werden oder können mittels Rekombinations- oder Syntheseverfahren hergestellt werden. Die Bezeichnung „Nativsequenz-PRO-Polypeptid" umfasst insbesondere natürlich vorkommende, trunkierte oder sekretierte Formen des spezifischen PRO-Polypeptids (z.B. eine extrazelluläre Domänensequenz), natürlich vorkommende Varianten (z.B. alternativ gespleißte Formen) und natürlich vorkommende Allelvarianten des Polypeptids. In verschiedenen Ausführungsformen der Erfindung sind die hierin offenbarten Nativsequenz-PRO-Polypeptide reife oder Volllängen-Nativsequenz-Polypeptide, welche die in den beiliegenden Figuren gezeigten Volllängen-Aminosäuresequenzen umfassen. Start- und Stoppcodons sind in den Figuren fettgedruckt und unterstrichen. Während jedoch die PRO-Polypeptide, die in den beiliegenden Figuren offenbart sind, als mit Methioninresten beginnend dargestellt sind, die hierin als Aminosäureposition 1 in den Figuren bezeichnet sind, ist es ebenso denkbar und möglich, dass andere Methioninreste entweder stromauf oder stromab von der Aminosäureposition 1 in den Figuren als die Start-Aminosäurereste für die PRO-Polypeptide verwendet werden.
Die „extrazelluläre Domäne" eines PRO-Polypeptids oder „ECD" bezieht sich auf eine Form des PRO-Polypeptids, das im Wesentlichen frei von den transmembranen und zytoplasmatischen Domänen ist. Normalerweise weist eine PRO-Polypeptid- ECD weniger als etwa 1 % solcher Transmembran- und/oder zytoplasmatischen Domänen und vorzugsweise weniger als 0,5 % solcher Domänen auf. Es gilt zu verstehen, dass jede transmembrane Domäne, die für die PRO-Polypeptide der vorliegenden Erfindung identifiziert werden, gemäß auf dem Gebiet der Erfindung routinemäßig eingesetzten Kriterien zur Identifikation dieses Typs hydrophober Domänen identifiziert werden. Die exakten Grenzen einer transmembranen Domäne können variieren, jedoch sehr wahrscheinlich nicht um mehr als etwa 5 Aminosäuren an jedem Ende der Domäne, wie anfangs hierin definiert wurde. Gegebenenfalls kann daher eine extrazelluläre Domäne eines PRO-Polypeptids etwa 5 oder weniger Aminosäuren an jeder Seite der Grenze zwischen Transmembrandomäne und extrazellulärer Domäne wie in den Beispielen oder der Beschreibung identifiziert enthalten, und solche Polypeptide, mit oder ohne das assoziierte Signalpeptid, und Nucleinsäuren, die für sie kodieren, werden in der vorliegenden Erfindung bedacht.
Der ungefähre Ort der „Signalpeptide" der verschiedenen hierin offenbarten PRO-Polypeptide ist in der vorliegenden Beschreibung und/oder den beiliegenden Figuren gezeigt. Es gilt jedoch anzumerken, dass die C-terminale Grenze eines Signalpeptids variieren kann, jedoch sehr wahrscheinlich um nicht mehr als etwa 5 Aminosäuren an jeder Seite der C-terminalen Signalpeptidgrenze, wie anfänglich hierin identifiziert, worin die C-terminale Grenze des Signalpeptids gemäß auf dem Gebiet der Erfindung zur Identifikation dieses Typs von Aminosäuresequenzelement routinemäßig eingesetzten Kriterien identifiziert werden kann (z.B. Nielsen et al., Prot. Eng. 10, 1–6 (1997), und von Heinje et al., Nucl. Acids. Res. 14, 4683–4690 (1986)). Darüber hinaus ist auch anerkannt, dass in manchen Fällen Spaltung einer Signalsequenz von einem sekretierten Polypeptid nicht gänzlich gleichförmig stattfindet, was zu mehr als einer sekretierten Spezies führt. Diese Polypeptide, bei denen das Signalpeptid innerhalb von nicht mehr als etwa 5 Aminosäuren an jeder Seite der C-terminalen Grenze des Signalpeptids wie hierin identifiziert gespaltet wird, und die für sie kodierenden Polynucleotide werden von der vorliegenden Erfindung behandelt.
„PRO-Polypeptidvariante" bezeichnet ein aktives PRO-Polypeptid wie zuvor oder nachstehend definiert mit zumindest etwa 80 % Aminosäuresequenzidentität mit ei ner Volllängen-Nativsequenz-PRO-Polypeptidsequenz wie hierin offenbart, einer PRO-Polypeptidsequenz, der das Signalpeptid fehlt, wie hierin offenbart, einer extrazellulären Domäne eines PRO-Polypeptids, mit oder ohne Signalpeptid, wie hierin offenbart oder jedem anderen Fragment einer Volllängen-PRO-Polypeptidsequenz wie hierin offenbart. Solche PRO-Polypeptidvarianten umfassen beispielsweise PRO-Polypeptide, worin ein oder mehrere Aminosäurereste am N- oder C-Terminus der nativen Volllängen-Aminosäuresequenz addiert oder deletiert werden. Üblicherweise hat eine PRO-Polypeptidvariante zumindest etwa 80 % Aminosäuresequenzidentität, vorzugsweise zumindest etwa 81 % Aminosäuresequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 82 % Aminosäuresequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 83 % Aminosäuresequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 84 % Aminosäuresequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 85 % Aminosäuresequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 86 % Aminosäuresequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 87 % Aminosäuresequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 88 % Aminosäuresequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 89 % Aminosäuresequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 90 % Aminosäuresequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 91 % Aminosäuresequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 92 % Aminosäuresequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 93 % Aminosäuresequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 94 % Aminosäuresequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 95 % Aminosäuresequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 96 % Aminosäuresequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 97 % Aminosäuresequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 98 % Aminosäuresequenzidentität und am meisten bevorzugt zumindest etwa 99 % Aminosäuresequenzidentität, mit einer Volllängen-Nativsequenz-PRO-Polypeptidsequenz wie _ hierin offenbart, einer PRO-Polypeptidsequenz, der das Signalpeptid fehlt, wie hierin offenbart, einer extrazellulären Domäne eines PRO-Polypeptids, mit oder ohne das Signalpeptid, wie hierin offenbart oder mit jedem anderen, spezifisch definierten Fragment einer Volllängen-PRO-Polypeptidsequenz wie hierin offenbart. Üblicherweise weisen PRO-Polypeptidvarianten eine Länge von zumindest etwa 10 Aminosäuren, oft zumindest eine Länge von etwa 20 Aminosäuren, noch häufiger eine Länge von zumindest etwa 30 Aminosäuren, noch häufiger eine Länge von zumin dest etwa 40 Aminosäuren, noch häufiger eine Länge von zumindest etwa 50 Aminosäuren, noch häufiger eine Länge von zumindest etwa 60 Aminosäuren, noch häufiger eine Länge von zumindest etwa 70 Aminosäuren, noch häufiger eine Länge von zumindest etwa 80 Aminosäuren, noch häufiger eine Länge von zumindest etwa 90 Aminosäuren, noch häufiger eine Länge von zumindest etwa 100 Aminosäuren, noch häufiger eine Länge von zumindest etwa 150 Aminosäuren, noch häufiger eine Länge von zumindest etwa 200 Aminosäuren, noch häufiger eine Länge von zumindest etwa 300 Aminosäuren oder mehr, auf.
Wie nachstehend gezeigt stellt Tabelle 1 den vollständigen Quellcode für das ALIGN-2-Computerprogramm zum Sequenzvergleich bereit. Dieser Quellcode kann routinemäßig zur Verwendung an einem UNIX-Betriebssystem kompiliert werden, um das ALIGN-2-Sequenzvergleich-Computerprogramm bereitzustellen.
Darüber hinaus zeigen die Tabellen 2A–2B hypothetische Beispiele für die Verwendung des nachstehend beschriebenen Verfahrens zur Bestimmung der prozentuellen Aminosäuresequenzidentität (Tabellen 2A–2B) und der prozentuellen Nucleinsäuresequenzidentität (Tabellen 2C–2D) unter Einsatz des ALIGN-2-Sequenzvergleich-Computerprogramms, worin „PRO" für die Aminosäuresequenz eines hypothetischen PRO-Polypeptids von Interesse steht, „Vergleichsprotein" für die Aminosäuresequenz eines Polypeptids steht, mit dem das „PRO"-Polypeptid von Interesse verglichen wird, „PRO-DNA" für eine hypothetische PRO-kodierende Nucleinsäuresequenz von Interesse steht, „Vergleichs-DNA" für die Nucleotidsequenz eines Nucleinsäuremoleküls steht, mit dem das „PRO-DNA"-Nucleinsäuremolekül von Interesse verglichen wird, „X", „Y" und „Z" jeweils für verschiedene hypothetische Aminosäurereste stehen und „N", „L" und „V" jeweils für verschiedene hypothetische Nucleotide stehen. Tabelle 1

Tabelle 2A

PRO XXXXXXXXXXXXXXX (Länge = 15 Aminosäuren)

Vergleichsprotein XXXXXYYYYYYY (Länge = 12 Aminosäuren)

% Aminosäuresequenzidentität = (Anzahl an identisch übereinstimmenden Aminosäureresten zwischen den zwei Polypeptidsequenzen, wie durch ALIGN-2 bestimmt) dividiert durch (Gesamtzahl an Aminosäureresten des PRO-Polypeptids) = 5 dividiert durch 15 = 33,3 %

PRO	XXXXXXXXXX	(Länge = 10 Aminosäuren)
Vergleichsprotein	XXXXXYYYYYYZZYZ	(Länge = 15 Aminosäuren)

% Aminosäuresequenzidentität = (Anzahl an identisch übereinstimmenden Aminosäureresten zwischen den zwei Polypeptidsequenzen, wie durch ALIGN-2 bestimmt) dividiert durch (Gesamtzahl an Aminosäureresten des PRO-Polypeptids) = 5 dividiert durch 10 = 50 %

PRO-DNA	NNNNNNNNNNNNNN	(Länge = 14 Nucleotide)
Vergleichs-DNA	NNNNNNLLLLLLLLLL	(Länge = 16 Nucleotide)

% Nucleinsäuresequenzidentität = (Anzahl an identisch übereinstimmenden Nucleotiden zwischen den zwei Nucleinsäuresequenzen, wie durch ALIGN-2 bestimmt) dividiert durch (Gesamtzahl an Nucleotiden der PRO-DNA-Nucleinsäuresequenz) = 6 dividiert durch 14 = 42,9 %

PRO-DNA	NNNNNNNNNNNN	(Länge = 12 Nucleotide)
Vergleichs-DNA	NNNNLLLVV	(Länge = 9 Nucleotide)

% Nucleinsäuresequenzidentität = (Anzahl an identisch übereinstimmenden Nucleotiden zwischen den zwei Nucleinsäuresequenzen, wie durch ALIGN-2 bestimmt) dividiert durch (Gesamtzahl an Nucleotiden der PRO-DNA-Nucleinsäuresequenz) = 4 dividiert durch 12 = 33,3 %

„Prozent ( %) Aminosäuresequenzidentität" in Bezug auf die hierin identifizierten PRO-Polypeptidsequenzen ist als Prozentsatz an Aminosäureresten in einer Kandidatensequenz definiert, die mit den Aminosäureresten in einer PRO-Sequenz nach Abgleichen der Sequenzen und Einführen von Lücken, sofern zur Erreichung maximaler prozentueller Sequenzidentität erforderlich, und ohne Berücksichtigung irgendwelcher konservativer Substitutionen als Teil der Sequenzidentität identisch sind. Abgleichen zum Zwecke der Bestimmung der prozentuellen Aminosäuresequenzidentität kann auf verschiedene Arten erreicht werden, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, beispielsweise unter Verwendung von allgemein erhältlichen Computerprogrammen wie z.B. BLAST-, BLAST-2-, ALIGN-, ALIGN-2- oder Megalign-Soft- Ware (DNASTAR). Fachleute können geeignete Parameter zur Messung von Abgleichung bestimmen, einschließlich sämtlicher Algorithmen, die erforderlich sind, um maximale Abgleichung über die volle Länge der zu vergleichenden Sequenzen zu erreichen. Für die vorliegenden Zwecke jedoch werden % Aminosäuresequenzidentitätswerte unter Verwendung des Computerprogramms zum Sequenzvergleich ALIGN-2 wie nachstehend beschrieben erhalten, worin der vollständige Quellcode für das ALIGN-2-Programm in Tabelle 1 bereitgestellt ist. Das ALIGN-2-Computerprogramm zum Sequenzvergleich wurde von Genentech, Inc., entworfen, und der in der nachstehenden Tabelle 1 gezeigte Quellcode wurde mit Benutzerunterlagen im U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559, eingereicht, wo er unter der U.S.-Copyright-Registrierungsnummer TXU510087 registriert ist. Das ALIGN-2-Programm ist über Genentech, Inc., South San Francisco, Kalifornien, öffentlich erhältlich oder kann aus dem in der nachstehenden Tabelle 1 bereitgestellten Quellcode kompiliert werden. Das ALIGN-2-Programm sollte zur Verwendung auf einem UNIX-Betriebssystem, vorzugsweise digital UNIX V4.0D, kompiliert werden. Alle Sequenzvergleichsparameter sind durch das ALIGN-2-Programm festgesetzt und variieren nicht.
Für die vorliegenden Zwecke wird die % Aminosäuresequenzidentität einer bestimmten Aminosäuresequenz A zu, mit oder gegen eine bestimmte Aminosäuresequenz B (was alternativ auch als eine bestimmte Aminosäuresequenz A beschrieben werden kann, die eine bestimmte % Aminosäuresequenzidentität zu, mit oder gegen eine bestimmte Aminosäuresequenz B hat oder umfasst) wie folgt berechnet:
100 mal den Bruch X/Y
worin X die Anzahl an Aminosäureresten ist, die durch das Sequenzabgleichungsprogramm ALIGN-2 in dieser Abgleichung des Programms von A und B als identische Übereinstimmungen verzeichnet wurden, und Y die Gesamtanzahl an Aminosäureresten in B ist. Es versteht sich, dass, sofern die Länge der Aminosäuresequenz A mit der Länge der Aminosäuresequenz B nicht übereinstimmt, die % Aminosäuresequenzidentität von A zu B nicht gleich der % Aminosäuresequenzidentität von B zu A ist. Als Beispiele für % Aminosäuresequenzidentität-Berechnungen zei gen Tabelle 2A und 2B, wie die % Aminosäuresequenzidentität der Aminosäuresequenz, die als „Vergleichsprotein" bezeichnet wird, zur Aminosäuresequenz, die als „PRO" bezeichnet wird, berechnet wird.
Außer spezifisch anders festgehalten, werden alle hierin verwendeten % Aminosäuresequenzidentitätswerte wie oben beschrieben unter Verwendung des ALIGN-2-Computerprogramms erhalten. % Aminosäuresequenzidentitätswerte können jedoch auch unter Verwendung des Sequenzvergleichprogramms NCBI-BLAST2 (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25, 3389–3402 (1997)) bestimmt werden. Das NCBI-BLAST2-Sequenzvergleichsprogramm kann unter der Adresse http://www.ncbi.nlm. nig.gov heruntergeladen werden. NCBI-BLAST2 verwendet mehrere Suchparameter, worin alle diese Suchparameter auf Standardwerte eingestellt sind, einschließlich beispielsweise unmask = yes, strand = all, expected occurrences = 10, minimum low complexity length = 15/5, multi-pass e-value = 0,01, constant for multi-pass = 25, dropoff for final gapped alignment = 25 und scoring matrix = BLOSUM62.
In Situationen, in denen NCBI-BLAST2 für Aminosäuresequenzvergleiche verwendet wird, wird die % Aminosäuresequenzidentität einer bestimmten Aminosäuresequenz A zu, mit oder gegen eine bestimmte Aminosäuresequenz B (was alternativ auch als eine bestimmte Aminosäuresequenz A beschrieben werden kann, die eine bestimmte % Aminosäuresequenzidentität zu, mit oder gegen eine bestimmte Aminosäuresequenz B hat oder umfasst) wie folgt berechnet:
100 mal den Bruch X/Y
worin X für die Anzahl an Aminosäureresten steht, die als identische Übereinstimmungen des Sequenzabgleichungsprogramms NCBI-BLAST2 in der Programmabgleichung von A und B verzeichnet werden, und worin Y für die Gesamtzahl an Aminosäureresten in B steht. Es wird verständlich sein, dass, sofern die Länge von Aminosäuresequenz A nicht der Länge von Aminosäuresequenz B entspricht, die % Aminosäuresequenzidentität von A zu B nicht gleich der % Aminosäuresequenzidentität von B zu A ist.
Darüber hinaus kann % Aminosäuresequenzidentität auch unter Verwendung des WU-BLAST-2-Computerprogramms (Altschul et al., Methods in Enzymology 266, 460–480 (1996)) erhalten werden. Die meisten der WU-BLAST-2-Suchparameter sind auf Standardwerte eingestellt. Jene, die nicht auf Standardwerte eingestellt sind, d.h. die veränderbaren Parameter, werden mit den folgenden Werten eingestellt: overlap span = 1, overlap fraction = 0,125, Word threshold (T) = 11 und scoring matrix = BLOSUM62. Für die vorliegenden Zwecke wird ein % Aminosäure-Sequenzidentitätswert durch Teilen (a) der Anzahl an übereinstimmenden identischen Aminosäureresten zwischen der Aminosäuresequenz des PRO-Polypeptids von Interesse mit einer Sequenz, die aus dem nativen PRO-Polypeptid abgeleitet ist, und der Vergleichs-Aminosäuresequenz von Interesse (d.h. die Sequenz, mit der das PRO-Polypeptid von Interesse verglichen wird, die eine PRO-Polypeptidvariante sein kann) wie durch WU-BLAST-2 bestimmt durch (b) die Gesamtzahl an Aminosäureresten des PRO-Polypeptids von Interesse bestimmt. Beispielsweise ist in der Feststellung „ein Polypeptid, das die Aminosäuresequenz A umfasst, die zumindest 80 % Aminosäuresequenzidentität mit der Aminosäuresequenz B aufweist" die Aminosäuresequenz A die Vergleichs-Aminosäuresequenz von Interesse, und die Aminosäuresequenz B ist die Aminosäuresequenz des PRO-Polypeptids von Interesse.
„PRO-Polypeptidvariante" oder „PRO-Nucleinsäuresequenzvariante" bezeichnet ein Nucleinsäuremolekül, das für ein aktives PRO-Polypeptid wie nachstehend definiert kodiert und das zumindest etwa 80 % Nucleinsäuresequenzidentität mit einer Nucleinsäuresequenz, die für eine Vollängen-Nativsequenz-PRO-Polypeptidsequenz wie hierin offenbart kodiert, einer Vollängen-Nativsequenz-PRO-Polypeptidsequenz, der das Signalpeptid fehlt, wie hierin offenbart, einer extrazellulären Domäne eines PRO-Polypeptids, mit oder ohne Signalpeptid, wie hierin offenbart, oder mit jedem anderen, spezifisch definierten Fragment einer Volllängen-PRO-Polypeptidsequenz wie hierin offenbart aufweist. Üblicherweise hat eine PRO-Polynucleotidvariante zumindest etwa 80 % Nucleinsäuresequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 81 % Nucleinsäuresequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 82 % Nucleinsäuresequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 83 % Nucleinsäuresequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 84 % Nucleinsäuresequenziden tität, noch bevorzugter zumindest etwa 85 % Nucleinsäuresequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 86 % Nucleinsäuresequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 87 % Nucleinsäuresequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 88 % Nucleinsäuresequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 89 % Nucleinsäuresequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 90 % Nucleinsäuresequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 91 % Nucleinsäuresequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 92 % Nucleinsäuresequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 93 % Nucleinsäuresequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 94 % Nucleinsäuresequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 95 % Nucleinsäuresequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 96 % Nucleinsäuresequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 97 % Nucleinsäuresequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 98 % Nucleinsäuresequenzidentität und noch bevorzugter zumindest etwa 99 % Nucleinsäuresequenzidentität, mit der Nucleinsäuresequenz, die für eine Volllängen-Nativsequenz-PRO-Polypeptidsequenz wie hierin offenbart, eine Volllängen-Nativsequenz-PRO-Polypeptidsequenz, der das Signalpeptid fehlt, wie hierin offenbart, eine extrazelluläre Domäne eines PRO-Polypeptids, mit oder ohne das Signalpeptid, wie hierin offenbart, oder jedes andere Fragment einer Volllängen-PRO-Polypeptidsequenz wie hierin offenbart kodiert. Varianten umfassen nicht die native Nucleotidsequenz.
Üblicherweise weisen PRO-Polynucleotidvarianten eine Länge von zumindest etwa 30 Nucleotiden, oft zumindest eine Länge von zumindest etwa 60 Nucleotiden, noch häufiger eine Länge von zumindest etwa 90 Nucleotiden, noch häufiger eine Länge von zumindest etwa 120 Nucleotiden, noch häufiger eine Länge von zumindest etwa 150 Nucleotiden, noch häufiger eine Länge von zumindest etwa 180 Nucleotiden, noch häufiger eine Länge von zumindest etwa 210 Nucleotiden, noch häufiger eine Länge von zumindest etwa 240 Nucleotiden, noch häufiger eine Länge von zumindest etwa 270 Nucleotiden, noch häufiger eine Länge von zumindest etwa 300 Nucleotiden, noch häufiger eine Länge von zumindest etwa 450 Nucleotiden, noch häufiger eine Länge von zumindest etwa 600 Nucleotiden, noch häufiger eine Länge von zumindest etwa 900 Nucleotiden, oder mehr auf.
„Prozent (%) Nucleinsäuresequenzidentität” in Bezug auf hierin identifizierte PRO-Polypeptid-kodierende Nucleinsäuresequenzen ist als der Prozentsatz an Nucleotiden in einer Kandidatensequenz definiert, die mit den Nucleotiden in der PRO-Polypeptid-kodierenden Nucleinsäuresequenz von Interesse, nach Abgleichen der Sequenzen und Einführen von Lücken, sofern zur Erreichung maximaler Prozent-Sequenzidentität erforderlich, identisch sind. Abgleichung zum Zweck der Bestimmung von Prozent-Nucleinsäuresequenzidentität kann auf verschiedene Weisen erreicht werden, die in den Bereich des Gebiets der Erfindung fallen, beispielsweise unter Verwendung öffentlich erhältlicher Computersoftware wie BLAST, BLAST-2, ALIGN oder Megalign-Software (DNASTAR). Fachleute können geeignete Parameter zur Messung von Abgleichung bestimmen, einschließlich sämtlicher Algorithmen, die erforderlich sind, um maximale Abgleichung über die volle Länge der zu vergleichenden Sequenzen zu erreichen. Für die Zwecke hierin jedoch werden % Nucleinsäuresequenzidentitätswerte wie nachstehend beschrieben unter Verwendung des Sequenzvergleich-Computerprogramm ALIGN-2 ermittelt, worin der vollständige Quellcode für das ALIGN-2-Programm nachstehend in Tabelle 1 bereitgestellt ist. Das ALIGN-2-Sequenzvergleich-Computerprogramm wurde von Genentech, Inc., entwickelt, und der nachstehend in Tabelle 1 gezeigte Quellcode wurde mit Benutzerunterlagen im U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559, eingereicht, wo er unter der U.S.-Copyright-Registrierungsnummer TXU510087 registriert ist. Das ALIGN-2-Programm ist über Genentech, Inc., South San Francisco, Kalifornien, öffentlich erhältlich oder kann aus dem in der nachstehenden Tabelle 1 bereitgestellten Quellcode kompiliert werden. Das ALIGN-2-Programm sollte zur Verwendung auf einem UNIX-Betriebssystem, vorzugsweise digital UNIX V4.0D, kompiliert werden. Alle Sequenzvergleichsparameter sind durch das ALIGN-2-Programm festgesetzt und variieren nicht.
Für die Zwecke hierin wird die % Nucleinsäuresequenzidentität einer bestimmten Nucleinsäuresequenz C zu, mit oder gegen eine bestimmte Nucleinsäuresequenz D (was alternativ auch als eine bestimmte Nucleinsäuresequenz C beschrieben werden kann, die eine bestimmte % Nucleinsäuresequenzidentität zu, mit oder gegen eine bestimmte Nucleinsäuresequenz D hat oder umfasst) wie folgt berechnet:
100 mal den Bruch W/Z
worin W die Anzahl an Nucleotiden ist, die als identische Übereinstimmungen durch das Sequenzabgleichungsprogramm ALIGN-2 in der Programmabgleichung von C und D verzeichnet sind, und worin Z die Gesamtzahl an Nucleotiden in D ist. Es versteht sich, dass, sofern die Länge von Nucleinsäuresequenz C nicht der Länge von Nucleinsäuresequenz D entspricht, die % Nucleinsäuresequenzidentität von C zu D nicht gleich der % Nucleinsäuresequenzidentität von D zu C ist. Als Beispiele für % Nucleinsäuresequenzidentitäts-Berechnungen zeigen die Tabellen 2C–2D, wie die % Nucleinsäuresequenzidentität der Nucleinsäuresequenz, die als „Vergleichs-DNA" bezeichnet wird, zur Nucleinsäuresequenz, die als „PRO-DNA" bezeichnet ist, berechnet wird.
Außer spezifisch anders festgehalten, werden alle hierin verwendeten % Nucleinsäuresequenzidentitätswerte wie oben beschrieben unter Verwendung des ALIGN-2-Computerprogramms erhalten. % Nucleinsäuresequenzidentitätswerte können jedoch auch unter Verwendung des Sequenzvergleichprogramms NCBI-BLAST2 (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25, 3389–3402 (1997)) bestimmt werden Das NCBI-BLAST2-Sequenzvergleichprogramm kann von der Adresse http://www.ncbi.nlm.nih. gov heruntergeladen werden. NCBI-BLAST2 verwendet mehrere Suchparameter, worin alle diese Suchparameter auf Standardwerte eingestellt sind, einschließlich beispielsweise unmask = yes, strand = all, expected occurrences = 10, minimum low complexity length = 15/5, multi-pass e-value = 0,01, constant for multi-pass = 25, dropoff for final gapped alignment = 25 und scoring matrix = BLOSUM62.
In Situationen, in denen NCBI-BLAST2 für Sequenzvergleiche verwendet wird, wird die % Nucleinsäuresequenzidentität einer bestimmten Nucleinsäuresequenz C zu, mit oder gegen eine bestimmte Nucleinsäuresequenz D (was alternativ auch als eine bestimmte Nucleinsäuresequenz C beschrieben werden kann, die eine bestimmte % Nucleinsäuresequenzidentität zu, mit oder gegen eine bestimmte Nucleinsäuresequenz D hat oder umfasst) wie folgt berechnet:
100 mal den Bruch W/Z
worin W für die Anzahl an Nucleotiden steht, die als identische Übereinstimmungen durch das Sequenzabgleichprogramm NCBI-BLAST2 in der Programmabgleichung von C und D verzeichnet wurden, und worin Z für die Gesamtzahl an Nucleotiden in D steht. Es versteht sich, dass, sofern die Länge von Nucleinsäuresequenz C nicht gleich der Länge von Nucleinsäuresequenz D ist, die % Nucleinsäuresequenzidentität von C zu D nicht der % Nucleinsäuresequenzidentität von D zu C entspricht.
Außerdem können % Nucleinsäuresequenzidentitätswerte auch unter Verwendung des WU-BLAST-2-Computerprogramms (Altschul et al., Methods in Enzymology 266, 460–480 (1996)) erhalten werden. Die meisten der WU-BLAST-2-Suchparameter sind auf Standardwerte eingestellt. Jene, die nicht auf Standardwerte eingestellt sind, d.h. die veränderbaren Parameter, werden mit den folgenden Werten eingestellt: overlap span = 1, overlap fraction = 0,125, Word threshold (T) = 11 und scoring matrix = BLOSUM62. Für die Zwecke hierin wird ein % Nucleinsäure-Sequenzidentitätswert durch Teilen (a) der Anzahl an übereinstimmenden identischen Nucleotiden zwischen der Nucleinsäuresequenz des PRO-Polypeptid-kodierenden Nucleinsäuremoleküls von Interesse mit einer Sequenz, die aus der Nativsequenz-PRO-Polypeptid-kodierenden Nucleinsäure abgeleitet ist, und dem Vergleichs-Nucleinsäuremolekül von Interesse (d.h. die Sequenz, mit der das PRO-Polypeptid-kodierende Nucleinsäuremolekül von Interesse verglichen wird, die eine PRO-Polynucleotidvariante sein kann) wie durch WU-BLAST-2 bestimmt durch (b) die Gesamtzahl an Nucleotiden des PRO-Polypeptid-kodierenden Nucleinsäuremoleküls von Interesse bestimmt. Beispielsweise ist in der Feststellung „ein isoliertes Nucleinsäuremolekül, das eine Nucleinsäuresequenz A umfasst, die zumindest 80 % Nucleinsäuresequenzidentität mit der Nucleinsäuresequenz B aufweist" die Nucleinsäuresequenz A das Vergleichs-Nucleinsäuremolekül von Interesse, und die Nucleinsäuresequenz B ist die Nucleinsäuresequenz des PRO-Polypeptid-kodierenden Nucleinsäuremoleküls von Interesse.
In anderen Ausführungsformen sind PRO-Polynucleotidvarianten Nucleinsäuremoleküle, die für ein aktives PRO-Polypeptid kodieren und die in der Lage sind, vorzugsweise unter stringenten Hybridisierungs- und Waschbedingungen, an Nucleotidsequenzen zu hybridisieren, die für das in 2 gezeigte Volllängen-PRO-Polypeptid (Seq.-ID Nr. 2) kodieren. PRO-Polypeptidvarianten können jene sein, für die eine PRO-Polynucleotidvariante kodiert.
Die Bezeichnung „Positive" im Zusammenhang mit den Aminosäuresequenzidentitätsvergleichen, die wie zuvor beschrieben durchgeführt werden, schließt nicht nur Aminosäurereste in den verglichenen Sequenzen ein, die identisch sind, sondern auch jene, die ähnliche Eigenschaften aufweisen. Aminosäurereste, die einen positiven Wert zu einem Aminosäurerest von Interesse erzielen, sind jene, die entweder mit dem Aminosäurerest von Interesse identisch sind, oder sind eine bevorzugte Substitution (wie in Tabelle 3 unten definiert) des Aminosäurerests von Interesse.
Für die vorliegenden Zwecke wird der %-Wert von Positiven einer bestimmten Aminosäuresequenz A zu, mit oder gegen eine bestimmte Aminosäuresequenz B (was alternativ auch als eine bestimmte Aminosäuresequenz A beschrieben werden kann, die einen bestimmten % Positive zu, mit oder gegen eine bestimmte Aminosäuresequenz B hat oder umfasst) wie folgt berechnet:
100 mal den Bruch X/Y
worin X für die Anzahl an Aminosäureresten steht, die einen positiven Wert wie zuvor definiert durch das Sequenzabgleichprogramm ALIGN-2 oder NCBI-BLAST2 in der Programmabgleichung von A und B verzeichnen, und worin Y für die Gesamtzahl an Aminosäureresten in B steht. Es versteht sich, dass, sofern die Länge von Aminosäuresequenz A nicht der Länge von Aminosäuresequenz B entspricht, die % Positive von A zu B nicht gleich den % Positiven von B zu A sind.
„Isoliert", sofern verwendet, um die verschiedenen, hierin offenbarten Polypeptide zu beschreiben, bezeichnet ein Polypeptid, das identifiziert und getrennt und/oder aus einer Komponente aus seiner natürlichen Umgebung gewonnen wurde. Vorzugsweise ist das isolierte Polypeptid frei von Verbindungen mit sämtlichen Komponenten, mit denen es in der Natur assoziiert ist. Verunreinigende Komponenten seiner natürlichen Umgebung sind Materialien, die typischerweise diagnostische oder therapeutische Verwendungen für das Polypeptid stören würden, und können Enzyme, Hormone und andere proteinartige oder nicht-proteinartige Gelöststoffe einbinden. In bevorzugten Ausführungsformen wird das Polypeptid (1) bis zu einem ausreichenden Grad durch Verwendung eines Zentrifugenröhrchensequenzierers gereinigt, um zumindest 15 Reste von N-terminaler oder innerer Aminosäuresequenz zu erhalten, oder (2) durch SDS-PAGE unter nicht-reduzierenden oder reduzierenden Bedingungen mittels Coomassie-Blau- oder, vorzugsweise, Silberfärbung bis zur Homogenität gereinigt. Isoliertes Polypeptid schließt Polypeptid in situ innerhalb rekombinanter Zellen ein, da zumindest eine Komponente der natürlichen Umgebung von PRO nicht vorhanden ist. Üblicherweise wird isoliertes Polypeptid durch zumindest einen Reinigungsschritt hergestellt.
Ein „isoliertes", für ein PRO-Polypeptid kodierendes Nucleinsäuremolekül oder ein „isoliertes", für einen Anti-PRO-Antikörper kodierendes Nucleinsäuremolekül ist ein Nucleinsäuremolekül, das identifiziert und von zumindest einem verunreinigenden Nucleinsäuremolekül getrennt ist, mit dem es normalerweise in der natürlichen Quelle der für PRO kodierenden Nucleinsäure oder für Anti-PRO kodierenden Nucleinsäure assoziiert ist. Vorzugsweise ist die isolierte Nucleinsäure frei von Verbindungen mit sämtlichen Komponenten, mit denen sie in der Natur assoziiert ist. Ein isoliertes, für PRO kodierendes Nucleinsäuremolekül oder ein isoliertes, für Anti-PRO kodierendes Nucleinsäuremolekül liegt in einer anderen Form oder Beschaffenheit vor als es in der Natur zu finden ist. Isolierte Nucleinsäuremoleküle werden daher vom für das PRO kodierenden Nucleinsäuremolekül oder vom für das Anti-PRO kodierenden Nucleinsäuremolekül, wie es in natürlichen Zellen existiert, unterschieden. Ein für ein PRO-Polypeptid kodierendes isoliertes Nucleinsäuremolekül oder ein für einen Anti-PRO-Antikörper kodierendes isoliertes Nucleinsäuremolekül schließt jedoch PRO-Nucleinsäuremoleküle oder Anti-PRO-Nucleinsäuremoleküle ein, die in Zellen enthalten sind, welche üblicherweise PRO-Polypeptide oder Anti-PRO-Anti körper exprimieren, wobei sich beispielsweise das Nucleinsäuremolekül an einer anderen chromosomalen Stelle befindet als in natürlichen Zellen.
Die Bezeichnung „Kontrollsequenzen" bezieht sich auf DNA-Sequenzen, die zur Expression einer operabel gebundenen Kodiersequenz in einem bestimmten Wirtsorganismus erforderlich sind. Die Kontrollsequenzen, die beispielsweise für Prokaryoten geeignet sind, schließen einen Promotor, gegebenenfalls eine Operatorsequenz, und eine Ribosombindungsstelle ein. Eukaryotische Zellen sind bekannt dafür, Promotoren, Polyadenylierungssignale und Enhancer zu verwenden.
Nucleinsäure ist „operabel gebunden", wenn sie in eine funktionelle Beziehung mit einer anderen Nucleinsäuresequenz gebracht wird. Beispielsweise ist DNA für eine Präsequenz oder einen Sekretionsleader operabel an DNA für ein Polypeptid gebunden, wenn sie als ein Präprotein exprimiert wird, das an der Sekretion des Polypeptids teilnimmt; ein Promotor oder ein Enhancer ist operabel an eine Kodiersequenz gebunden, wenn er die Transkription der Sequenz beeinflusst; oder eine Ribosomenbindungsstelle ist operabel an eine Kodiersequenz gebunden, wenn sie so positioniert ist, dass sie Translation unterstützt. Im Allgemeinen bedeutet „operabel gebunden", dass die DNA-Sequenzen, die verbunden sind, zusammenhängend sind und, im Fall eines Sekretionsleaders, zusammenhängend und in Lesephase sind. Enhancer müssen jedoch nicht zusammenhängend sein. Bindung erfolgt durch Ligation an passenden Restriktionsstellen. Bestehen solche Stellen nicht, so werden die synthetischen Oligonucleotidadaptoren oder -linker gemäß herkömmlichen Praktiken verwendet.
Die Bezeichnung „Antikörper" wird im weitesten Sinn verwendet und deckt insbesondere beispielsweise einzelne monoklonale Anti-PRO7168-Antikörper (einschließlich Antagonisten und neutralisierender Antikörper), Anti-PRO7168-Antikörperzusammensetzungen mit Polyepitopspezifität, einkettige Anti-PRO7168-Antikörper und Fragmente von Anti-PRO7168-Antikörpern ab (siehe unten). Die Bezeichnung „monoklonaler Antikörper" wie hierin verwendet bezieht sich auf einen Antikörper, der aus einer Population von im Wesentlichen homogenen Antikörpern gewonnen wur de, d.h. dass die einzelnen Antikörper, aus denen die Population besteht, identisch sind, unter Ausnahme möglicher, natürlich vorkommender Mutationen, die in geringen Mengen vorhanden sein können.
„Stringenz" von Hybridisierungsreaktionen können Fachleute leicht bestimmen und beruht im Allgemeinen auf einer empirischen Berechnung, die von Sondenlänge, Waschtemperatur und Salzkonzentration abhängt. Im Allgemeinen erfordern längere Sonden höhere Temperaturen für korrektes Anellieren, während kürzere Sonden niedrigere Temperaturen erfordern. Hybridisierung im Allgemeinen hängt von der Fähigkeit denaturierter DNA ab, neuerlich zu anellieren, wenn komplementäre Stränge in einer Umgebung unter ihrer Schmelztemperatur vorhanden sind. Je höher der Grad an erwünschter Homogenität zwischen der Sonde und der hybridisierbaren Sequenz ist, desto höher ist auch die relative Temperatur, die verwendet werden kann. Als Resultat folgt, dass höhere relative Temperaturen dazu neigen würden, die Reaktionsbedingungen stringenter zu gestalten, während niedrigere Temperaturen dies weniger verlangen würden. Für zusätzliche Details und Erklärungen zur Stringenz von Hybridisierungsreaktionen siehe Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers (1995).
„Stringente Bedingungen" oder „Bedingungen hoher Stringenz" wie hierin definiert können als jene Bedingungen identifiziert werden, die: (1) geringe Ionenstärke und hohe Temperaturen für das Waschen verwenden, beispielsweise 0,015 M Natriumchlorid/0,0015 M Natriumcitrat/0,1 % Natriumdodecylsulfat bei 50°C; (2) während der Hybridisierung ein denaturierendes Mittel verwenden, wie beispielsweise Formamid, z.B. 50 Vol.-% Formamid mit 0,1 % Rinderserumalbumin/0,1 % Ficoll/0,1 % Polyvinylpyrrolidon/50 mM Natriumphosphatpuffer bei pH 6,5 mit 750 mM Natriumchlorid, 75 mM Natriumcitrat bei 42°C; oder (3) 50 % Formamid, 5 × SSC (0,75 M NaCl, 0,075 M Natriumcitrat), 50 mM Natriumphosphat (pH 6,8), 0,1 % Natriumpyrophosphat, 5 × Denhardts Lösung, beschallte Lachssperma-DNA (50 μg/ml), 0,1 % SDS und 10 % Dextransulfat bei 42°C, mit Waschschritten bei 42°C in 0,2 × SSC (Natriumchlorid/Natriumcitrat) und 50 % Formamid bei 55°C, gefolgt von einem Waschschritt bei hoher Stringenz bestehend aus 0,1 × SSC, das EDTA enthält, bei 55°C, verwenden.
„Mäßig stringente Bedingungen" können wie von Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laborstory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press (1989), beschrieben definiert werden und schließen die Verwendung von Waschlösung und Hybridisierungsbedingungen (z.B. Temperatur, Ionenstärke und % SDS) ein, die weniger stringent sind als jene, die zuvor beschrieben wurden. Ein Beispiel für mäßig stringente Bedingungen ist Übernacht-Inkubation bei 37°C in einer Lösung, umfassend: 20 % Formamid, 5 × SSC (150 mM NaCl, 15 mM Trinatriumcitrat), 50 mM Natriumphosphat (pH 7,6), 5 × Denhardts Lösung, 10 % Dextransulfat und 20 mg/ml denaturierte gescherte Lachssperma-DNA; gefolgt von Waschen der Filter in 1 × SSC bei etwa 35–50°C. Fachleute werden erkennen, wie Temperatur, Ionenstärke usw. nach Erfordernis einzustellen sind, um Faktoren wie Sondenlänge und dergleichen anzupassen.
Der Ausdruck „epitopmarkiert" bezieht sich bei Verwendung hierin auf ein Hybridpolypeptid, das ein an ein „Marker-Polypeptid" fusioniertes PRO7168-Polypeptid umfasst. Das Marker-Polypeptid hat genügend Reste, um ein Epitop bereitzustellen, gegen das ein Antikörper hergestellt werden kann, ist jedoch kurz genug, so dass es die Aktivität des Polypeptids, an das es fusioniert ist, nicht stört. Das Marker-Polypeptid ist außerdem vorzugsweise ziemlich einzigartig, so dass der Antikörper im Wesentlichen nicht mit anderen Epitopen kreuzreagiert. Geeignete Marker-Polypeptide weisen im Allgemeinen zumindest sechs Aminosäurereste und üblicherweise zwischen etwa 8 und 50 Aminosäurereste auf (vorzugsweise zwischen etwa 10 und 20 Aminosäurereste).
„Aktiv" oder „Aktivität" für die Zwecke hierin bezieht sich auf Form(en) von PRO7168-Polypeptiden, die eine biologische und/oder eine immunologische Aktivität/Eigenschaft eines nativen oder natürlich auftretenden PRO7168-Polypeptids in sich trägt, worin sich „biologische" Aktivität auf eine Funktion (entweder inhibitorisch oder stimulatorisch) bezieht, die durch ein natives oder natürlich vorkommendes PRO7168-Polypeptid verursacht wird und nicht die Fähigkeit ist, die Produktion eines Antikör pers gegen ein antigenes Epitop zu induzieren, das von einem nativen oder natürlich vorkommenden PRO7168-Polypeptid aufgewiesen wird, und eine „immunologische" Aktivität bezieht sich auf die Fähigkeit, die Produktion eines Antikörpers gegen ein antigenes Epitop zu induzieren, das von einem nativen oder natürlich vorkommenden PRO7168-Polypeptid aufgewiesen wird.
Die Bezeichnung „biologische Aktivität" im Zusammenhang mit einem Antikörper oder einem anderen Antagonistenmolekül, das durch die hierin offenbarten Screeningverfahren identifiziert werden kann (z.B. ein organisches oder anorganisches kleines Molekül, Peptid usw.), wird verwendet, um sich auf die Fähigkeit derartiger Moleküle zu beziehen, an die von den hierin identifizierten amplifizierten Genen kodierten Polypeptide zu binden oder zu komplexieren oder anderweitig die Transkription oder Translation eines PRO7168-Polypeptids zu stören. Eine bevorzugte biologische Aktivität ist die Wachstumshemmung einer Target-Tumorzelle. Eine weitere bevorzugte biologische Aktivität ist zytotoxische Aktivität, die den Tod der Ziel-Tumorzelle bewirkt.
Die Bezeichnung „biologische Aktivität" im Zusammenhang mit einem PRO7168-Polypeptid bezieht sich auf die Fähigkeit eines PRO7168-Polypeptids, neoplastisches Zellwachstum oder unkontrolliertes Zellwachstum auszulösen.
Die Bezeichnung „immunologische Aktivität" bezieht sich auf immunologische Kreuzreaktivität mit zumindest einem Epitop eines PRO7168-Polypeptids.
„Immunologische Kreuzreaktivität" bedeutet bei Verwendung hierin, dass das Kandidaten-Polypeptid fähig ist, die qualitative biologische Aktivität eines PRO7168-Polypeptids, das diese Aktivität aufweist, mit polyklonalen, gegen das bekannte aktive PRO7168-Polypeptid hergestellten Antiseren kompetitiv zu hemmen. Derartige Antiseren werden auf herkömmliche Weise durch subkutane Injektion von beispielsweise Ziegen oder Kaninchen mit dem bekannten aktiven Analogon in komplettem Freund'schem Adjuvans, gefolgt von einer intraperitonealen oder subkutanen Booster-Injektion in inkomplettem Freundschem Adjuvans, gebildet. Die immunologische Kreuzreaktivität ist vorzugsweise „spezifisch", was bedeutet, dass die Bindungsaffinität des identifizierten, immunologisch kreuzreaktiven Moleküls (z.B. Antikörpers) gegenüber dem entsprechenden PRO7168-Polypeptid signifikant höher (vorzugsweise zumindest etwa zweimal, noch bevorzugter zumindest etwa viermal, noch bevorzugter zumindest etwa sechsmal, am meisten bevorzugt zumindest etwa achtmal, höher) als die Bindungsaffinität dieses Moleküls zu jedem anderen bekannten, nativen Polypeptid ist.
Ein „kleines Molekül" ist hierin mit einem Molekulargewicht von weniger als etwa 500 Dalton definiert.
„Antikörper" (Abs) und „Immunglobuline" (Igs) sind Glykoproteine, welche dieselben strukturellen Eigenschaften aufweisen. Während Antikörper eine Bindungsspezifität an ein spezifisches Antigen aufweisen, umfassen Immunglobuline sowohl Antikörper, als auch antikörperartige Moleküle, denen die Antigenspezifität fehlt. Polypeptide der letzteren Art werden beispielsweise in niedrigen Ausmaßen vom Lymphsystem produziert und in erhöhten Ausmaßen von Myelomen. Der Ausdruck „Antikörper" wird im weitesten Sinne verwendet und umfasst ohne Einschränkung intakte monoklonale Antikörper, polyklonale Antikörper, multispezifische Antikörper (z.B. bispezifische Antikörper), die aus zumindest zwei intakten Antikörpern gebildet werden, und Antikörperfragmente, solange sie die gewünschte biologische Aktivität aufweisen.
„Native Antikörper" und „native Immunglobuline" sind üblicherweise heterotetramere Glykoproteine von etwa 150.000 Dalton, die aus zwei identischen Leicht- (L-) Ketten und zwei identischen Schwer- (H-) Ketten zusammengesetzt sind. Jede Leichtkette ist durch eine kovalente Disulfidbindung an eine Schwerkette gebunden, während die Anzahl an Disulfidbindungen unter den Schwerketten verschiedener Immunglobulin-Isotypen variiert. Jede Schwer- und Leichtkette weist außerdem in regelmäßigen Abständen Zwischenketten-Disulfidbrücken auf. Jede Schwerkette weist an einem Ende eine variable Domäne (V_H), gefolgt von einer Anzahl konstanter Domänen auf. Jede Leichtkette weist an einem Ende eine variable Domäne (V_L) und eine konstante Domäne an ihrem anderen Ende auf; die konstante Domäne der Leichtkette ist an der ersten konstanten Domäne der Schwerkette ausgerichtet und die variable Domäne der Leichtkette ist an der variablen Domäne der Schwerkette ausgerichtet. Von bestimmten Aminosäureresten wird angenommen, dass sie eine Schnittstelle zwischen den variablen Domänen der Leicht- und Schwerkette bilden.
Der Ausdruck „variabel" bezieht sich auf die Tatsache, dass bestimmte Abschnitte der variablen Domäne sich unter Antikörpern in ihrer Sequenz stark unterscheiden und bei der Bindung und für die Spezifität jedes einzelnen Antikörpers für sein jeweiliges Antigen verwendet werden. Jedoch ist die Variabilität nicht gleichmäßig über die variablen Domänen von Antikörpern verteilt. Sie ist in drei Segmenten verdichtet, die komplementaritätsbestimmende Regionen (CDRs) oder hypervariable Regionen genannt werden, und zwar in den variablen Domänen sowohl der Leichtkette als auch der Schwerkette. Die stärker konservierten Abschnitte variabler Domänen werden Gerüstregionen (FR) genannt. Die variablen Domänen nativer Schwer- und Leichtketten umfassen jeweils vier FR-Regionen, die größtenteils eine β-Faltblattkonfiguration einnehmen, die durch drei CDRs verbunden sind, die Schleifen bilden, welche die β-Faltblattstruktur verbinden und in manchen Fällen einen Teil davon bilden. Die CDRs in jeder Kette werden durch die FR-Regionen nahe beieinander gehalten und tragen mit den CDRs der anderen Kette zur Ausbildung der Antigenbindungsstelle von Antikörpern bei (siehe Kabat et al., NIH-Veröffentlichung Nr. 91-3242, Bd. 1, Seiten 647-669 (1991)). Die konstanten Domänen sind nicht direkt an der Bindung eines Antikörpers an ein Antigen beteiligt, zeigen jedoch verschiedene Effektorfunktionen, wie z.B. Beteiligung des Antikörpers an antikörperabhängiger Zelltoxizität.
Die Bezeichnung „hypervariable Region", wenn hierin verwendet, bezieht sich auf die Aminosäurereste eines Antikörpers, der für Antigen-Bindung verantwortlich ist. Die hypervariable Region umfasst Aminosäurereste aus einer „komplementaritätsbestimmenden Region" oder „CDR" (d.h. Reste 24–34 (L1), 50–56 (L2) und 89–97 (L3) in der variablen Leichtkettendomäne und 31–35 (H1), 50–65 (H2) und 95–102 (H3) in der variablen Schwerkettendomäne; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. Auflage, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethes da, MD (1991)) und/oder Reste aus einer „hypervariablen Schleife" (d.h. Reste 26–32 (L1), 50–52 (L2) und 91–96 (L3) in der variablen Leichtkettendomäne und 26–32 (H1), 53–55 (H2) und 96–101 (H3) in der variablen Schwerkettendomäne; Chothia & Lesk, J. Mol. Biol. 196, 901–917 (1987)). „Gerüst"- oder „FR"-Reste sind jene Reste der variablen Domäne, die nicht die Reste der hypervariablen Region wie hierin definiert sind.
„Antikörperfragmente" umfassen einen Abschnitt eines intakten Antikörpers, vorzugsweise die antigenbindende oder variable Region des intakten Antikörpers. Beispiel von Antikörperfragmenten umfassen Fab-, Fab'-, F(ab')₂- und Fv-Fragmente; Diabodies; lineare Antikörper (Zapata et al., Protein Eng. 8(10), 1057–1062 (1995)); einkettige Antikörpermoleküle; und multispezifische Antikörper, die aus Antikörperfragmenten gebildet werden.
Papain-Verdau von Antikörpern produziert zwei identische antigenbindende Fragmente, die „Fab"-Fragmente genannt werden, wobei beide eine einzige Antigenbindungsstelle aufweisen, und ein verbleibendes „Fc"-Fragment, dessen Name seine Fähigkeit widerspiegelt, leicht zu kristallisieren. Pepsin-Behandlung liefert ein F(ab')₂-Fragment, das zwei antigenkombinierende Stellen aufweist und nach wie vor zur Vernetzung von Antigen fähig ist.
„Fv" ist das minimale Antikörperfragment, das eine vollständige Antigenerkennungs- und Antigenbindungsstelle enthält. Diese Region besteht aus einem Dimer einer variablen Schwer- und einer variablen Leichtkettendomäne in enger nicht-kovalenter Verbindung. Es ist diese Konfiguration, in der die drei CDRs jeder variablen Domäne Wechselwirken, um eine Antigenbindungsstelle an der Oberfläche des V_H-V_L-Dimers zu definieren. Zusammen verleihen die sechs CDRs dem Antikörper die Antigen-Bindungsspezifität. Jedoch hat sogar eine einzelne Domäne (oder die Hälfte eines Fv, das nur drei für ein Antigen spezifische CDRs umfasst) die Fähigkeit, Antigen zu erkennen und zu binden, obgleich bei einer niedrigeren Affinität als die gesamte Bindungsstelle.
Das Fab-Fragment enthält außerdem die konstante Domäne der Leichtkette und die erste konstante Domäne (CH1) der Schwerkette. Fab-Fragmente unterscheiden sich von Fab'-Fragmenten durch die Addition einiger weniger Reste am Carboxyterminus der Schwerketten-CH1-Domäne, einschließlich zweier Cysteine aus der Antikörper-Gelenksregion. Fab'-SH ist hierin die Bezeichnung für Fab', in dem der/die Cystein-Rest(e) der konstanten Domänen eine freie Thiolgruppe tragen. F(ab')₂-Antikörperfragmente wurden ursprünglich als Paare von Fab'-Fragmenten produziert, die Gelenks-Cysteine zwischen ihnen aufweisen. Andere chemische Kupplungen von Antikörperfragmenten sind ebenfalls bekannt.
Die „Leichtketten" von Antikörpern (Immunglobuline) aus jeglicher Wirbeltierspezies können einer von zwei klar unterscheidbaren Typen zugeordnet werden, die auf Basis der Aminosäuresequenzen ihrer konstanten Domänen Kappa (κ) und Lambda (λ) genannt werden.
In Abhängigkeit von der Aminosäuresequenz der konstanten Domäne ihrer Schwerketten können Immunglobuline verschiedenen Klassen zugeordnet werden. Es gibt fünf Hauptklassen von Immunglobulinen: IgA, IgD, IgE, IgG und IgM, und mehrere davon können weiter in Unterklassen (Isotypen) unterteilt werden, z.B. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA und IgA2. Die konstanten Domänen der Schwerketten, die den verschiedenen Immunglobulinklassen entsprechen, werden α, δ, ε, γ bzw. μ genannt. Die Untereinheitenstrukturen und dreidimensionalen Konfigurationen verschiedener Immunglobulinklassen sind allgemein bekannt.
Der Ausdruck „monoklonaler Antikörper" bezieht sich bei Verwendung hierin auf einen Antikörper, der aus einer Population von im wesentlichen homogenen Antikörpern erlangt wird, d.h. die einzelnen Antikörper, welche die Population umfassten, sind identisch mit Ausnahme von möglichen natürlich auftretenden Mutationen, die in geringen Mengen vorhanden sein können. Monoklonale Antikörper sind höchst spezifisch und richten sich gegen eine einzige antigene Stelle. Außerdem richtet sich jeder monoklonale Antikörper im Gegensatz zu herkömmlichen (polyklonalen) Antikör perpräparaten, die typischerweise verschiedene, gegen unterschiedliche Antigene (Epitope) gerichtete Antikörper umfassen, gegen eine einzige Determinante am Antigen. Zusätzlich zu ihrer Spezifität sind die monoklonalen Antikörper vorteilhaft, da sie nicht durch andere Immunglobuline verunreinigt von der Hybridomkultur synthetisiert werden. Der Modifikator „monoklonal" kennzeichnet den Charakter des Antikörpers dahingehend, dass er aus einer im Wesentlichen homogenen Population von Antikörpern erlangt wird, und ist nicht dahingehend auszulegen, dass die Herstellung des Antikörpers irgendein bestimmtes Verfahren erfordert. Beispielsweise können die gemäß der vorliegenden Erfindung zu verwendenden monoklonalen Antikörper mit dem erstmals von Kohler et al., Nature 256, 495 (1975) beschriebenen Hybridomverfahren hergestellt werden oder können mittels DNA-Rekombinationsverfahren hergestellt werden (siehe z.B. US-Patent Nr. 4.816.567 ). Die „monoklonalen Antikörper" können beispielsweise auch aus Phagen-Antikörper-Bibliotheken unter Verwendung der in Clackson et al., Nature 352, 624–628 (1991) und Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581–597 (1991) beschriebenen Techniken isoliert werden.
Die monoklonalen Antikörper hierin umfassen speziell „chimäre" Antikörper (Immunglobuline), bei denen ein Teil der Schwer- und/oder Leichtkette identisch mit oder homolog zu entsprechenden Sequenzen in Antikörpern ist, die sich von einer bestimmten Spezies herleiten oder einer bestimmten Antikörperklasse oder Unterklasse angehören, während der Rest der Kette(n) identisch mit oder homolog zu entsprechenden Sequenzen in Antikörpern ist, die sich von einer anderen Spezies herleiten oder einer anderen Antikörperklasse oder Unterklasse angehören, sowie Fragmente derartiger Antikörper, solange sie die gewünschte biologische Aktivität aufweisen ( US-Patent Nr. 4.816.567 ; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851–6855 (1984)).
„Humanisierte" Formen nicht-menschlicher (z.B. Maus-) Antikörper sind chimäre Immunglobuline, Immunglobulinketten oder Fragmente davon (wie z.B. Fv, Fab, Fab', F(ab')₂ oder andere antigenbindende Untersequenzen von Antikörpern), die eine vom nicht-menschlichen Immunglobulin hergeleitete Minimalsequenz enthalten. Größtenteils sind humanisierte Antikörper menschliche Immunglobuline (Empfänger- Antikörper), in denen Reste aus einer CDR des Empfängers durch Reste aus einer CDR einer nicht-menschlichen Spezies (Spender-Antikörper), wie z.B. Maus, Ratte oder Kaninchen mit der gewünschten Spezifität, Affinität und Kapazität ersetzt sind. In manchen Fällen werden Fv-FR-Reste des menschlichen Immunglobulins durch entsprechende nicht-menschliche Reste ersetzt. Außerdem können humanisierte Antikörper Reste umfassen, die sich weder im Empfänger-Antikörper, noch in den importierten CDR- oder Gerüstsequenzen finden. Diese Modifizierungen werden vorgenommen, um die Leistungsfähigkeit des Antikörpers weiter zu verfeinern und zu maximieren. Im Allgemeinen wird der humanisierte Antikörper im Wesentlichen alle von zumindest einer und typischerweise zwei variablen Domänen umfassen, in denen alle oder im Wesentlichen alle der CDR-Regionen jenen eines nicht-menschlichen Immunglobulins entsprechen und alle oder im Wesentlichen alle der FR-Regionen jene einer menschlichen Immunglobulinsequenz sind. Der humanisierte Antikörper wird gegebenenfalls auch zumindest einen Teil einer konstanten Immunglobulinregion (Fc), typischerweise jene eines menschlichen Immunglobulins umfassen. Für weitere Einzelheiten siehe Jones et al., Nature 321, 522–525 (1986); Reichmann et al., Nature 332, 323–329 (1988); und Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2, 593–596 (1992). Der humanisierte Antikörper umfasst einen PRIMATIZED^TM-Antikörper, worin die Antigenbindungsregion des Antikörpers aus einem Antikörper stammt, der durch Immunisierung von Makak-Affen mit dem Antigen von Interesse hergestellt wurde.
„Einkettige Fv-" oder „sFv"-Antikörperfragmente umfassen die V_H- und V_L-Antikörperdomänen, worin diese Domänen in einer einzelnen Polypeptidkette vorliegen. Vorzugsweise umfasst das Fv-Polypeptid weiters einen Polypeptidlinker zwischen den V_H. und V_L-Domänen, was es dem sFv ermöglicht, die gewünschte Struktur für die Antigenbindung auszubilden. Für einen Überblick siehe Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Bd. 113, Rosenberg und Moore (Hrsg.), Springer-Verlag, New York, S. 269–315 (1994).
Der Ausdruck „Diabodies" bezieht sich auf kleine Antikörperfragmente mit zwei Antigenbindungsstellen, wobei die Fragmente eine variable Schwerkettendomäne (V_H) umfassen, die mit einer variablen Leichtkettendomäne (V_L) in derselben Polypeptid kette (V_H–V_L) verbunden ist. Durch Verwendung eines Linkers, der zu kurz ist, um die Paarung zwischen den beiden Domänen an derselben Ketten zu erlauben, sind die Domänen gezwungen, sich mit den komplementären Domänen einer anderen Kette zu paaren und zwei Antigenbindungsstellen zu erzeugen. Diabodies werden ausführlicher beispielsweise in EP 404.097 ; WO 93/11161 ; und Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6444–6448 (1993) beschrieben.
Ein „isolierter" Antikörper ist einer, der identifiziert und aus einer Komponente seiner natürlichen Umgebung abgetrennt und/oder gewonnen worden ist. Verunreinigende Komponenten seiner natürlichen Umgebung sind Materialien, welche die diagnostischen und therapeutischen Verwendungen für den Antikörper stören würden und können Enzyme, Hormone und andere proteinische oder nicht-proteinische Gelöststoffe umfassen. In bevorzugten Ausführungsformen wird der Antikörper gereinigt, und zwar (1) zu mehr als 95 Gew.-% Antikörper, wie ermittelt mittels Lowry-Verfahren, und insbesondere bevorzugt zu mehr als 99 Gew.-%, (2) in einem Ausmaß, das ausreicht, um zumindest 15 Reste der N-terminalen oder internen Aminosäuresequenz durch Verwendung eines Zentrifugenröhrchen-Sequenzierers zu erlangen oder (3) zur Homogenität mittels SDS-PAGE unter reduzierenden und nichtreduzierenden Bedingungen unter Verwendung von Coomassie-Blau oder vorzugsweise Silberfärbung. Ein isolierter Antikörper umfasst den Antikörper in situ in rekombinanten Zellen, da zumindest eine Komponente der natürlichen Umgebung des Antikörper nicht vorhanden sein wird. Für gewöhnlich wird jedoch ein isolierter Antikörper durch zumindest einen Reinigungsschritt hergestellt.
Der Ausdruck „Marker" bezieht sich bei Verwendung hierin auf eine detektierbare Verbindung oder Zusammensetzung, die direkt oder indirekt an den Antikörper konjugiert ist, um einen „markierten" Antikörper zu erzeugen. Der Marker kann selbst detektierbar sein (z.B. Radioisotopmarker oder Fluoreszenzmarker) oder kann im Falle eines enzymatischen Markers eine chemische Veränderung einer Substratverbindung oder -zusammensetzung katalysieren, die detektierbar ist. Radionuklide, die als detektierbare Marker dienen können, umfassen beispielsweise I-131, I-123, I-125, Y- 90, Re-188, Re-186, At-211, Cu-67, Bi-212 und Pd-109. Der Marker kann auch eine nicht detektierbare Einheit, wie z.B. ein Toxin, sein.
Unter „Festphase" wird eine nichtwässrige Matrix verstanden, an der der Antikörper der vorliegenden Erfindung anhaften kann. Beispiele von hierin vorgesehenen Festphasen umfassen jene, die teilweise oder völlig aus Glas (z.B. Controlled-poreglass), Polysacchariden (z.B. Agarose), Polyacrylamiden, Polystyrol, Polyvinylalkohol und Siliconen gebildet werden. In manchen Ausführungsformen kann die Festphase in Abhängigkeit vom Zusammenhang den Well einer Testplatte umfassen; in anderen ist sie eine Reinigungssäule (z.B. eine Affinitätschromatographiesäule). Dieser Ausdruck umfasst außerdem eine diskontinuierliche Festphase getrennter Teilchen, wie z.B. jene im US-Patent Nr. 4.275.149 beschriebenen.
Ein „Liposom" ist ein kleines Vesikel, das aus verschiedenen Lipidtypen, Phospholipiden und/oder Tensiden zusammengesetzt ist, das zur Abgabe eines Medikaments (wie z.B. eines PRO7168-Polypeptids oder eines Antikörpers dagegen und gegebenenfalls eines therapeutischen Mittels) an ein Säugetier zweckdienlich ist. Die Komponenten des Liposoms sind üblicherweise ähnlich der Lipidanordnung biologischer Membranen in einer Doppelschicht angeordnet.
Wie hierin verwendet bezeichnet der Ausdruck „Immunoadhäsin" antikörperartige Moleküle, welche die Bindungsspezifität eines heterologen Proteins (ein „Adhäsin") mit den Effektorfunktionen von konstanten Immunglobulindomänen kombiniert. Strukturell umfassen die Immunoadhäsine eine Fusion einer Aminosäuresequenz mit der gewünschten Bindungsspezifität, die nicht jene der Antigenerkennungs- und Bindungsstelle eines Antikörpers ist (d.h., „heterolog" ist), mit der Sequenz einer konstanten Immunglobulindomäne. Der Adhäsin-Abschnitt eines Immunglobulinmoleküls ist typischerweise eine zusammenhängende Aminosäuresequenz, die zumindest die Bindungsstelle eines Rezeptors oder Liganden umfasst. Die Sequenz der konstanten Immunglobulindomäne im Immunoadhäsin kann aus jedem Immunglobulin, wie z.B. IgG-1, IgG-2, IgG-3, oder IgG-4-Subtypen, IgG (einschließlich IgA-1 und IgA-2), IgE, IgD oder IgM erlangt werden.
II. Zusammensetzungen und Verfahren der Erfindung
A. Volllängen-PRO7168-Polypeptide
Die vorliegende Erfindung stellt neu identifizierte und isolierte Nucleotidsequenzen bereit, die für Polypeptide kodieren, die in der vorliegenden Anmeldung als PRO7168 bezeichnet werden. Insbesondere wurde cDNA, die für PRO7168-Polypeptide kodiert, identifiziert und isoliert, wie in den in den nachstehenden Beispielen genauer offenbart ist. Es gilt anzumerken, dass Proteine, die in getrennten Expressionsdurchgängen produziert wurden, unterschiedliche PRO-Nummern verliehen bekommen können, dass jedoch die UNQ-Nummer für jede bestimmte DNA und das kodierte Protein einmalig ist und nicht geändert wird. Der Einfachkeit halber werden in der vorliegenden Beschreibung die Proteine, für welche die hierin offenbarten Nucleinsäuresequenzen kodieren, sowie weitere native Homologe und Varianten, die in der obigen Definition von PRO7168 eingebunden sind, als „PRO7168" bezeichnet, und zwar unabhängig von ihrem Ursprung oder der Art der Herstellung.
Wie in den Beispielen nachstehend offenbart, wurden cDNA-Klone bei der ATCC hinterlegt, mit der Ausnahme bekannter Klone: DNA30869, DNA34405, DNA36995, DNA43320, DNA38649, DNA56505, DNA48303, DNA50798, DNA66489, DNA80896, DNA96791 und DNA58725. Die tatsächlichen Nucleotidsequenzen dieser Klone können von Fachleuten durch Sequenzieren der hinterlegten Klone mittels Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung Standard sind, leicht bestimmt werden. Die vorhergesagte Aminosäuresequenz kann aus den Nucleotidsequenzen mittels Standardverfahren bestimmt werden. Für die hierin beschriebenen PRO7168-Polypeptide und die dafür kodierende Nucleinsäure konnten die Anmelder das identifizieren, was als der Leseraster angenommen wird, wie er am besten mit der zu dem Zeitpunkt zur Verfügung stehenden Sequenzinformation identifizierbar war.
B. PRO7168-Varianten
Zusätzlich zu den hierin beschriebenen Volllängen-Nativsequenz-PRO7168-Polypeptiden wird erwogen, dass PRO7168-Varianten hergestellt werden können. PRO7168-Varianten können durch Einführen geeigneter Nucleotidänderungen in die PRO7168-DNA und/oder durch Synthese des erwünschten PRO7168-Polypeptids hergestellt werden. Fachleuten wird bekannt sein, dass Aminosäureänderungen posttranslationale Prozesse des PRO7168 verändern können, beispielsweise Änderung der Anzahl oder Position von Glykosylierungsstellen oder Ändern der Membranverankerungs-Eigenschaften.
Variationen im nativen Volllängensequenz-PRO7168 oder in verschiedenen Domänen des hierin beschriebenen PRO7168 können gemacht werden, beispielsweise unter Verwendung aller Verfahren und Richtlinien für konservative und nicht-konservative Mutationen, die beispielsweise im US-Patent Nr. 5.364.934 beschrieben werden. Variationen können eine Substitution, Deletion oder Insertion von einem oder mehrerer Codons sein, die für das PRO7168 kodieren, die im Vergleich mit dem Nativsequenz-PRO7168 zu einer Änderung der Aminosäuresequenz des PRO7168 führen. Gegebenenfalls erfolgt diese Variation durch Substitution von zumindest einer Aminosäure mit jeder anderen Aminosäure in einer oder mehreren Domänen des PRO7168. Hilfestellung bei der Bestimmung, welcher Aminosäurerest insertiert, substituiert oder deletiert werden kann, ohne die erwünschte Aktivität negativ zu beeinflussen, kann durch Vergleichen der Sequenz des PRO7168 mit jener von homologen bekannten Proteinmolekülen und durch Minimieren der Anzahl an Aminosäuresequenzänderungen in Regionen hoher Homologie gefunden werden. Aminosäuresubstitutionen können durch Ersetzen einer Aminosäure durch eine andere Aminosäure mit ähnlichen strukturellen und/oder chemischen Eigenschaften, beispielsweise durch Ersetzen eines Leucins mit einem Serin, d.h. durch konservative Aminosäureersetzungen, entstehen. Insertionen oder Deletionen können gegebenenfalls im Bereich von etwa 1 bis 5 Aminosäuren liegen. Die zugelassene Variation kann durch systematisches Durchführen von Insertionen, Deletionen oder Substitutionen von Aminosäuren in die Sequenz und Testen der resultierenden Varianten auf Aktivität, die die Volllängen- oder reife native Sequenz zeigt, bestimmt werden.
PRO7168-Polypeptidfragmente werden hierin offenbart. Solche Fragmente können am N-Terminus oder C-Terminus trunkiert sein, oder ihnen können, beispielsweise im Vergleich zu einem Volllängennativprotein, innen gelegene Reste fehlen. Bestimmten Fragmenten fehlen Aminosäurereste, die für eine erwünschte biologische Aktivität des PRO7168-Polypeptids nicht essenziell sind.
PRO7168-Fragmente können durch jede beliebige Anzahl an herkömmlichen Verfahren hergestellt werden. Erwünschte Peptidfragmente können chemisch synthetisiert werden. Ein alternativer Ansatz umfasst die Bildung von PRO7168-Fragmenten durch enzymatischen Verdau, z.B. durch Behandlung des Proteins mit einem Enzym, das bekannt dafür ist, Proteine an Stellen zu spalten, die durch bestimmte Aminosäurereste definiert sind, oder durch Verdau der DNA mit geeigneten Restriktionsenzymen und Isolieren des erwünschten Fragments. Wiederum ein anderes nützliches Verfahren umfasst das Isolieren und Amplifizieren eines DNA-Fragments, das für ein erwünschtes Polypeptidfragment kodiert, durch Polymerasekettenreaktion (PCR). Oligonucleotide, die die erwünschten Termini des DNA-Fragments definieren, werden an den 5'- und 3'-Primern in der PCR verwendet. Vorzugsweise teilen PRO-7168-Polypeptidfragmente zumindest eine biologische und/oder immunologische Aktivität mit dem nativen PRO7168-Polypeptid.

In besonderen Ausführungsformen sind konservative Substitutionen von Interesse in Tabelle 3 unter der Überschrift „Bevorzugte Substitutionen" gezeigt. Resultieren solche Substitutionen in einer Veränderung der biologischen Aktivität, so werden substanziellere Veränderungen, die in Tabelle 3 als „Beispielhafte Substitutionen" bezeichnet sind oder wie nachstehend unter Verweis auf Aminosäureklassen noch näher beschrieben wird, eingeführt und die Produkte gescreent. Tabelle 3

Ursprünglicher Rest	Beispielhafte Substitutionen	Bevorzugte Substitutionen
Ala (A)	val; leu; ile	val
Arg (R)	lys; gln; asn	lys
Asn (N)	gln; his; lys; arg	gin
Asp (D)	glu	glu
Cys (C)	ser	ser
Gln (Q)	asn	asn
Glu (E)	asp	asp
Gly (G)	pro; ala	ala
His (H)	asn; gln; lys; arg	arg
Ile (I)	leu; val; met; ala; phe; Norleucin	leu
Leu (L)	Norleucin; ile; val; met; ala; phe	ile
Lys (K)	arg; gln; asn	arg
Met (M)	leu; phe; ile	leu
Phe (F)	leu; val; ile; ala; tyr	leu
Pro (P)	ala	ala
Ser (S)	thr	thr
Thr (T)	ser	ser
Trp (W)	tyr; phe	tyr
Tyr (Y)	trp; phe; thr; ser	phe
Val (V)	ile; leu; met; phe; ala; Norleucin	leu

Wesentliche Modifikationen in Funktion oder immunologischer Identität des Polypeptids erfolgen durch Selektieren von Substitutionen, die sich in ihrer Wirkung auf die Aufrechterhaltung (a) der Struktur der Polypeptidhauptkette im Bereich der Substitution, beispielsweise in Form einer Faltblatt- oder Helixkonformation, (b) der Ladung oder Hydrophobie des Moleküls an der Target-Stelle oder (c) des Volumens der Seitenkette signifikant unterscheiden. Natürlich vorkommende Reste werden auf Grundlage gemeinsamer Seitenketteneigenschaften in die folgenden Gruppen eingeteilt:

(1) hydrophob: Norleucin, met, ala, val, leu, ile;
(2) neutral hydrophil: cys, ser, thr;
(3) sauer: asp, glu;
(4) basisch: asn, gln, his, lys, arg;
(5) Reste, die Kettenausrichtung beeinflussen: gly, pro; und
(6) aromatisch: trp, tyr, phe.

Nicht-konservative Substitutionen erfordern den Austausch eine Mitglieds einer dieser Klassen gegen eine andere Klasse. Solche substituierten Reste können auch in die konservativen Substitutionsstellen oder, noch bevorzugter, in die verbleibenden (nicht-konservierten) Stellen eingeführt werden.
Die Variationen können unter Verwendung von auf dem Gebiet der Erfindung bekannten Verfahren, wie beispielsweise Oligonucleotid-vermittelte (ortsgerichtete) Mutagenese, Alaninscanning und PCR-Mutagenese, gebildet werden. Ortsgerichtete Mutagenese (Carter et al., Nucl. Acids Res. 13, 4331 (1986); Zoller et al., Nucl. Acids Res. 10, 6487 (1987)), Kassettenmutagenese (Wells et al., Gene 34, 315 (1985)), Restriktionsselektionsmutagenese (Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA 317, 415 (1986)) oder andere bekannte Verfahren können an der klonierten DNA durchgeführt werden, um die PRO7168-DNA-Variante zu bilden.
Scanning-Aminosäureanalyse kann auch verwendet werden, um eine oder mehrere Aminosäuren gemeinsam mit einer zusammenhängenden Sequenz zu identifizieren. Zu den bevorzugten Scanning-Aminosäuren zählen relativ kleine, neutrale Amino säuren. Solche Aminosäuren schließen Alanin, Glycin, Serin und Cystein ein. Alanin ist typischerweise eine bevorzugte Scanning-Aminosäure in dieser Gruppe, da es die Seitenkette über den β-Kohlenstoff hinaus eliminiert und weniger wahrscheinlich die Hauptkettenkonformation der Variante verändert (Cunningham & Wells, Science 244, 1081–1085 (1989)). Typischerweise wird ebenso Alanin bevorzugt, da es die häufigste Aminosäure ist. Weiters wird es häufig sowohl an verborgenen als auch an freiliegenden Positionen gefunden (Creighton, The Proteins (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol. 150, 1 (1976)). Ergibt Alaninsubstitution keine adäquaten Mengen an Varianten, so kann eine isoterische Aminosäure verwendet werden.
C. Modifikationen von PRO7168
Kovalente Modifikationen von PRO7168 sind in den Schutzumfang dieser Erfindung eingebunden. Ein Typ von kovalenter Modifikation umfasst das Umsetzen gerichteter Aminosäurereste eines PRO7168-Polypeptids mit einem organischen Derivatisierungsmittel, das in der Lage ist, mit ausgewählten Seitenketten oder den N- oder C-terminalen Resten des PRO7168 zu reagieren. Derivatisierung mit bifunktionellen Mitteln ist nützlich, beispielsweise zum Vernetzen von PRO7168 mit einer wasserunlöslichen Trägermatrix oder -oberfläche zur Verwendung im Verfahren zur Reinigung von Anti-PRO7168-Antikörpern und umgekehrt. Üblicherweise verwendete Vernetzer umfassen z.B. 1,1-Bis(diazoacetyl)-2-phenylethan, Glutaraldehyd, N-Hydroxysuccinimidester, beispielsweise Ester mit 4-Azidosalicylsäure, homobifunktionelle Imidoester, einschließlich Disuccinimidylester, wie z.B. 3,3'-Dithiobis(succinimidylpropionat), bifunktionelle Maleinimide, wie z.B. Bis-N-maleinimido-1,8-octan, und Mittel, wie z.B. Methyl-3-[(p-azidophenyl)dithio]propioimidat.
Andere Modifikationen umfassen Deamidierung von Glutaminyl- und Asparaginylresten zu den entsprechenden Glutamyl- bzw. Aspartylresten, Hydroxylierung von Prolin und Lysin, Phosphorylierung von Hydroxygruppen von Seryl- oder Threonylresten, Methylierung der α-Aminogruppen von Lysin-, Arginin- und Histidin-Seitenketten (T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, 79–86 (1983)), Acetylierung des N-terminalen Amins und Amidierung jeder beliebigen C-terminalen Carboxygruppe.
Eine andere Art kovalenter Modifikation des PRO7168-Polypeptids, die in den Schutzumfang dieser Erfindung fällt, umfasst das Ändern des nativen Glykosylierungsmusters des Polypeptids. „Ändern des nativen Glykosylierungsmusters" bedeutet für die vorliegenden Zwecke die Deletion von einer oder mehreren Kohlenhydratgruppierungen, die in Nativsequenz-PRO7168 zu finden sind (entweder durch Entfernen der zugrundeliegenden Glykosylierungsstelle oder durch Deletion der Glykosylierung durch chemische und/oder enzymatische Mittel), und/oder das Hinzufügen einer oder mehrerer Glykosylierungsstellen, die im Nativsequenz-PRO7168 nicht zu finden sind. Darüber hinaus bindet diese Bezeichnung auch qualitative Änderungen an der Glykosylierung der nativen Proteine ein, einschließlich einer Änderung der Beschaffenheit und der Anteile der verschiedenen vorhandenen Kohlenhydratgruppierungen.
Das Hinzufügen von Glykosylierungsstellen zum PRO7168-Polypeptid kann durch Ändern der Aminosäuresequenz erfolgen. Die Änderung kann beispielsweise durch die Addition von oder die Substitution durch einen oder mehrere Serin- oder Threoninreste zum oder am Nativsequenz-PRO7168 (für O-gebundene Glykosylierungsstellen) durchgeführt werden. Die PRO7168-Aminosäuresequenz kann gegebenenfalls durch Änderungen auf DNA-Niveau geändert werden, insbesondere durch Mutation der DNA, die für das PRO7168-Polypeptid kodiert, an präselektierten Basen, sodass Codons gebildet werden, die zu den erwünschten Aminosäuren translatieren.
Ein anderes Mittel zur Steigerung der Anzahl an Kohlenhydratgruppierungen am PRO7168-Polypeptid ist chemisches oder enzymatisches Binden von Glykosiden an das Polypeptid. Solche Verfahren werden auf dem Gebiet der Erfindung, z.B. in der WO 87/05330 , veröffentlicht am 11. September 1987, und in Aplin & Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., 259–306 (1981), beschrieben.
Das Entfernen von Kohlenhydratgruppierungen, die am PRO7168-Polypeptid vorhanden sind, kann chemisch oder enzymatisch oder durch Mutationssubstitutionen von Codons, die für Aminosäurereste kodieren, die als Targets für Glykosylierung dienen, durchgeführt werden. Chemische Deglykosylierungsverfahren sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und werden beispielsweise von Hakimuddin et al., Arch. Biochem. Biophys. 259, 52 (1987), und von Edge et al., Anal. Biochem. 118, 131 (1981), beschrieben. Enzymatische Spaltung von Kohlenhydratgruppierungen an Polypeptiden kann durch die Verwendung einer Vielzahl an Endo- und Exo-Glykosidasen erreicht werden, wie von Thotakura et al. in: Meth. Enzymol. 138, 350 (1987), beschrieben wird.
Eine andere Art von kovalenter Modifikation von PRO7168 umfasst das Binden des PRO7168-Polypeptids an eines einer Vielzahl nicht-proteinhältiger Polymere, z.B. Polyethylenglykol (PEG), Polypropylenglykol oder Polyoxyalkylene, auf die Art und Weise, die in den US-Patenten Nr. 4.640.835 ; 4.496.689 ; 4.301.144 ; 4.670.417 ; 4.791.192 oder 4.179.337 beschrieben wird.
Das PRO7168 der vorliegenden Erfindung kann auch auf eine Weise modifiziert werden, dass ein Hybridmolekül gebildet wird, das PRO7168, fusioniert an ein anderes, heterologes Polypeptid oder eine andere, heterologe Aminosäuresequenz, umfasst.
In einer Ausführungsform umfasst solch ein Hybridmolekül eine Fusion des PRO7168-Polypeptids mit einem Marker-Polypeptid, das ein Epitop bereitstellt, an das sich ein Anti-Marker-Antikörper selektiv binden kann. Der Epitopmarker wird im Allgemeinen an den Amino- oder Carboxyterminus des PRO7168-Polypeptids platziert. Die Gegenwart solcher epitopmarkierten Formen des PRO7168-Polypeptids kann unter Verwendung eines Antikörpers gegen das Marker-Polypeptid nachgewiesen werden. Die Bereitstellung der Epitopmarkierung ermöglicht es somit auch, dass das PRO7168 leicht mittels Affinitätsreinigung unter Verwendung eines Anti-Marker-Antikörpers oder eines anderen Typs von Affinitätsmatrize, die sich an den Epitopmarker bindet, gereinigt werden kann. Verschiedene Marker-Polypeptide und ihre jeweiligen Antikörper sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Beispiele umfassen Poly-Histidin- (poly-his-) oder Poly-Histidin-Glycin- (poly-his-gly-) Marker; das flu-HA-Marker-Polypeptid und seinen Antikörper 12CA5 (Field et al., Mol. Cell. Biol. 8, 2159–2165 (1988)); den c-myc-Marker und die Antikörper 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 und 9E10 hierzu (Evan et al., Molecular and Cellular Biology 5, 3610–3616 (1985)); und den Herpes-Simplex-Virus-Glykoprotein-D- (-gD-) Marker und seinen Antikörper (Paborsky et al., Protein Engineering 3(6), 547–553 (1990)). Andere Marker-Polypeptide umfassen das Flag-Peptid (Hopp et al., BioTechnology 6, 1204–1210 (1988)); das KT3-Epitoppeptid) Martin et al., Science 255, 192–194 (1992)); ein α-Tubulinepitoppeptid (Skinner et al., J. Biol. Chem. 266, 15163–15166 (1991)); und den T7-Gen-10-Proteinpeptidmarker (Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 6393–6397 (1990)).
In einer alternativen Ausführungsform kann das Hybridmolekül eine Fusion des PRO7168 mit einem Immunglobulin oder einer bestimmten Region eines Immunglobulins umfassen. Für eine zweiwertige Form des Hybridmoleküls (auch als ein „Immunoadhäsin" bezeichnet) könnte solch eine Fusion zur Fc-Region eines IgG-Moleküls gebildet sein. Die Ig-Fusionen umfassen vorzugsweise die Substitution einer löslichen Form (deletierte oder inaktivierte Transmembrandomäne) eines PRO7168-Polypeptids anstelle von zumindest einer variablen Region innerhalb eines Ig-Moleküls. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst die Immunglobulinfusion die Gelenks-, CH2- und CH3- oder die Gelenks-, CH1-, CH2- und CH3-Regionen eines IgG1-Moleküls. Für weitere Information zur Herstellung von Immunglobulinfusionen siehe auch US-Patent Nr. 5.428.130 , ausgegeben am 27. Juni 1995.
D. Herstellung von PRO7168-Polypeptiden
Die nachstehende Beschreibung betrifft vorrangig die Herstellung von PRO7168 durch Kultivieren von Zellen, die mit einem PRO7168-Nucleinsäure-hältigen Vektor transformiert oder transfiziert sind. Natürlich wird erwogen, dass alternative Verfah ren, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, zur Herstellung von PRO7168 verwendet werden können. Beispielsweise können die PRO7168-Sequenz oder Teile davon durch direkte Peptidsynthese unter Verwendung von Festphasenverfahren hergestellt werden (siehe z.B. Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85, 2149–2154 (1963)). In-vitro-Proteinsynthese kann unter Verwendung manueller oder automatisierter Verfahren durchgeführt werden. Automatisierte Synthese kann beispielsweise unter Verwendung eines Applied Biosystems Peptide Synthesizer (Foster City, CA) gemäß den Anweisungen des Herstellers erfolgen. Verschiedene Teile von PRO7168 können separat chemisch synthetisiert und mittels chemischer oder enzymatischer Verfahren kombiniert werden, um das Volllängen-PRO7168 zu bilden.
a. Isolierung von für ein PRO7168-Polypeptid kodierender DNA
DNA, die für PRO7168 kodiert, kann aus einer cDNA-Bibliothek gewonnen werden, die aus Gewebe hergestellt wird, von dem angenommen wird, dass es die PRO7168-mRNA aufweist und diese auf einem detektierbaren Niveau exprimiert. Demgemäß kann menschliche PRO7168-DNA leicht aus einer cDNA-Bibliothek gewonnen werden, die aus menschlichem Gewebe hergestellt wird, wie es auch in den Beispielen beschrieben ist. Das für PRO7168 kodierende Gen kann auch aus einer genomischen Bibliothek oder mittels Oligonucleotidsynthese erlangt werden.
Bibliotheken können mit Sonden (wie Antikörpern gegen das PRO7168-Polypeptid oder Oligonucleotiden mit zumindest etwa 20–80 Basen) gescreent werden, deren Zweck es ist, das Gen von Interesse oder das durch dieses Gen kodierte Protein zu identifizieren. Screening der cDNA oder der genomischen Bibliothek mit der ausgewählten Sonde kann unter Verwendung von Standardverfahren durchgeführt werden, die z.B. in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laborstory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laborstory Press (1989)), beschrieben sind. Ein alternatives Mittel zum Isolieren des für PRO7168 kodierenden Gens ist die Verwendung der PCR-Methode (Sambrook et al., s.o.; Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laborstory Manual (Cold Spring Harbor Laborstory Press (1995))).
Die nachstehenden Beispiele beschreiben Verfahren zum Screenen einer cDNA-Bibliothek. Die als Sonden ausgewählten Oligonucleotidsequenzen sollten eine ausreichende Länge aufweisen und ausreichend eindeutig sein, sodass falsche Positive minimiert werden. Das Oligonucleotid ist vorzugsweise so markiert, dass es durch Hybridisierung an DNA in der zu screenenden Bibliothek nachgewiesen werden kann. Markierungsverfahren sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und umfassen die Verwendung von radioaktiven Markern wie z.B. von ³²P-markiertem ATP, Biotinylierung oder Enzymmarkierung. Hybridisierungsbedingungen, einschließlich mäßiger Stringenz und hoher Stringenz, sind in Sambrook et al., s.o., beschrieben.
Sequenzen, die in solchen Bibliotheks-Screening-Verfahren identifiziert werden, können mit anderen bekannten Sequenzen, die in öffentlichen Datenbanken wie z.B. GenBank oder anderen privaten Sequenzdatenbanken hinterlegt und zugänglich sind, verglichen und abgeglichen werden. Sequenzidentität (entweder auf Aminosäure- oder Nucleotidebene) innerhalb definierter Regionen des Moleküls oder über die gesamte Volllängensequenz hinweg kann mittels auf dem Gebiet bekannter Verfahren und wie hierin beschrieben bestimmt werden.
Nucleinsäure mit Protein-kodierender Sequenz kann durch Screenen ausgewählter cDNA oder genomischer Bibliotheken unter Verwendung der hierin zum ersten Mal offenbarten, abgeleiteten Aminosäuresequenz und, sofern erforderlich, unter Verwendung herkömmlicher Primerextensionsverfahren wie in Sambrook et al., s.o., beschrieben, um Vorläufer und Verarbeitungs-Zwischenprodukte von mRNA zu detektieren, die eventuell nicht in cDNA revers-transkribiert worden sind, gewonnen werden.
b. Selektion und Transformation von Wirtszellen
Wirtszellen werden mit Expressions- oder Kloniervektoren, die hierin zur PRO7168-Produktion beschrieben werden, transfiziert oder transformiert und in herkömmlichem Nährmedium kultiviert, das zum Induzieren von Promotoren, zur Selektion von Transformanten oder Amplifikation der Gene, die für die erwünschten Sequenzen kodieren, geeignet modifiziert ist. Die Kulturbedingungen, wie z.B. Medium, Temperatur, pH und dergleichen, können von Fachleuten ohne übermäßiges Experimentieren ausgewählt werden. Im Allgemeinen können Prinzipien, Arbeitsvorschriften und praktische Techniken zur Maximierung der Produktivität von Zellkulturen in Mammalian Cell Biotechnology: A Practical Approach, M. Butler (Hrsg.), IRL Press (1991), und in Sambrook et al., s.o., gefunden werden.
Verfahren zur eukaryotischen Zelltransfektion und prokaryotischen Zelltransformation sind durchschnittlichen Fachleuten bekannt, z.B. CaCl₂-Verfahren, CaPO₄-Verfahren, Liposom-vermitteltes Verfahren und Elektroporation. Je nach verwendeten Wirtszellen erfolgt die Transformation unter Verwendung von Standardverfahren, die für die entsprechenden Zellen geeignet sind. Die Calciumbehandlung mit Calciumchlorid, wie in Sambrook et al., s.o., beschrieben, oder Elektroporation wird im Allgemeinen für Prokaryoten verwendet. Infektion mit Agrobacterium tumefaciens wird zur Transformation bestimmter Pflanzenzellen verwendet, wie Shaw et al., Gene 23, 315 (1983), und die WO 89/05859 , veröffentlicht am 29. Juni 1989, beschreiben. Für Säugetierzellen ohne solche Zellwände kann das Calciumphosphat-Präzipitationsverfahren von Graham & van der Eb, Virology 52, 456–457 (1978), verwendet werden. Allgemeine Aspekte von Säugetierzellen-Wirtssystemtransfektionen werden im US-Patent Nr. 4.399.216 beschrieben. Transformationen in Hefe werden typischerweise gemäß dem Verfahren von Van Solingen et al., J. Bact. 130, 946 (1977), und Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 76, 3829 (1979), durchgeführt. Es können jedoch auch andere Verfahren zum Einführen von DNA in Zellen, wie beispielsweise Kernmikroinjektion, Elektroporation, bakterielle Protoplastenfusion mit intakten Zellen, oder Polykationen, z.B. Polybren, Polyornithin, verwendet werden. Für verschiedene Verfahren zur Transformation von Säugetierzellen siehe Keown et al., Methods in Enzymology 185, 527–537 (1990), und Mansour et al., Nature 336, 348–352 (1988).
Geeignete Wirtszellen zum Klonieren oder Exprimieren der DNA in die bzw. den Vektoren hierin schließen Prokaryoten-, Hefe- oder höhere Eukaryotenzellen ein. Geeignete Prokaryoten umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf Eubakterien, wie z.B. gram-negative oder gram-positive Organismen, beispielsweise Enterobacteriaceae wie z.B. E. coli. Verschiedene E.-coli-Stämme sind öffentlich erhältlich, wie z.B. E.-coli-K12-Stamm MM294 (ATCC 31.446); E. coli X1776 (ATCC 31.537); E.-coli-Stamm W3110 (ATCC 27.325) und E.-coli-Stamm K5 772 (ATCC 53.635). Andere geeignete prokaryotische Wirtszellen umfassen Enterobacteriaceae wie Escherichia, z.B. E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, z.B. Salmonella typhimurium, Serratia, z.B. Serratia marcescans, und Shigella sowie Bacilli wie z.B. B. subtilis und B. licheniformis (z.B. B. licheniformis 41P, offenbart in DD 266.710 , veröffentlicht am 12. April 1989), Pseudomonas, wie z.B. P. aeruginosa, und Streptomyces. Diese Beispiele stellen eine Veranschaulichung und keine Einschränkung dar. Stamm W3110 ist ein besonders bevorzugter Wirt oder Ausgangswirt, da er ein üblicher Wirtstamm für Fermentationen von Rekombinations-DNA-Produkten ist. Vorzugsweise sekretiert die Wirtszelle minimale Mengen an proteolytischen Enzymen. Beispielsweise kann Stamm W3110 modifiziert werden, um in den Genen, die für die zum Wirt endogenen Proteine kodieren, eine genetische Mutation zu bewirken, wobei Beispiele für solche Wirte E. coli-W3110-Stamm 1A2, der den vollständigen Genotyp tonA aufweist; E.-coli-W3110-Stamm 9E4, der den vollständigen Genotyp tonA ptr3 aufweist; E.-coli-W3110-Stamm 27C7 (ATCC 55.244), der den vollständigen Genotyp tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT kan^r aufweist; E.-coli-W3110-Stamm 37D6, der den vollständigen Genotyp tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT rbs7ilvG kan^r aufweist; E.-coli-W3110-Stamm 4084, der Stamm 37D6 mit einer nicht Kanamycin-resistenten degP-Deletionsmutation ist; und ein E.-coli-Stamm mit mutierter periplasmatischer Protease, offenbart im US-Patent Nr. 4.946.783 , ausgegeben am 7. August 1990, sind. Alternativ dazu sind In-vitro-Klonierverfahren, z.B. PCR oder andere Nucleinsäure-Polymerasereaktionen, geeignet. Zusätzlich zu Prokaryoten sind eukaryotische Mikroben wie beispielsweise Fadenpilze oder Hefe geeignete Klonier- oder Expressionswirte für PRO7168-Vektoren. Saccharomyces cerevisiae ist ein üblicherweise verwendeter, nieder-eukaryotischer Wirtsmikroorganismus. Andere umfassen Schizosaccharomyces pombe (Beach & Nurse, Nature 290, 140 (1981); EP 139.383 , veröffentlicht am 2. Mai 1985); Kluyveromyces-Wirte ( US-Patent Nr. 4.943.529 ; Fleer et al., Bio/Technology 9, 968–975 (1991)) wie z.B. K. lactis (MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt et al., J. Bacteriol. 154(2), 737–742 (1983)), K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K. wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906; Van den Berg et al., Bio/Technology 8, 135 (1990)), K. thermotolerans und K. marxianus; yarrowia ( EP 402.226 ); Pichia pastoris ( EP 183.070 ; Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol. 28, 265–278 (1988)); Candida; Trichoderma reesia ( EP 244.234 ); Neurospora crassa (Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 5339–5363 (1979)); Schwanniomyces wie z.B. Schwanniomyces occidentalis ( EP 394.538 , veröffentlicht am 31. Oktober 1990); und Fadenpilze wie z.B. Neurospora, Penicillium, Tolypocladium ( WO 91/00357 , veröffentlicht am 10. Januar 1991) und Aspergillus-Wirte wie z.B. A. nidulans (Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 112, 284–289 (1983); Tilburn et al., Gene 26, 205–221 (1983); Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1470–1474 (1984)) und A. niger (Kelly & Hynes, EMBO J. 4, 475–479 (1985)). Methylotrophe Hefen sind hierin geeignet und umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf Hefe, die in der Lage ist, auf Methanol zu wachsen, ausgewählt aus den Gattungen von Hansenula, Candida, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces, Torulopsis und Rhodotorula. Eine Liste spezifischer Spezies, die für diese Klasse von Hefe beispielhaft sind, ist in C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982), zu finden.
Geeignete Wirtszellen für die Expression von glykosyliertem PRO7168 werden von mehrzelligen Organismen abgeleitet. Beispiele für Wirbellosenzellen umfassen Insektenzellen wie z.B. Drosophila S2 und Spodoptera Sf9 sowie Pflanzenzellen. Beispiele für nützliche Säugetierwirtszelllinien umfassen Chinahamster-Ovarial- (CHO-) und COS-Zellen. Spezifischere Beispiele umfassen Affennieren-CV1-Linie, transformiert mit SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); menschliche embryonale Nierenlinie (293 oder 293-Zellen, subkloniert zum Wachstum in Suspensionskultur, Graham et al., J. Gen Virol. 36, 59 (1977)); Chinahamster-Ovarialzellen/-DHFR (CHO, Urlaub & Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216 (1980)); Maus-Sertolizellen (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23, 243–251 (1980)); menschliche Lungenzellen (W138, ATCC CCL 75); menschliche Leberzellen (Hep G2, HB 8065); und Maus-Brusttumor (MMT 060562, ATCC CCL51). Es wird erachtet, dass die Auswahl der geeigneten Wirtszelle in den Bereich der Erfindung fällt.
c. Auswahl und Verwendung eines replizierbaren Vektors
Die Nucleinsäure (z.B. cDNA oder genomische DNA), die für PRO7168 kodiert, kann zum Klonieren (Amplifikation der DNA) oder zur Expression in einen replizierbaren Vektor insertiert werden. Verschiedene Vektoren sind öffentlich erhältlich. Der Vektor kann beispielsweise in Form eines Plasmids, Cosmids, viralen Partikels oder Phagen vorliegen. Die geeignete Nucleinsäuresequenz kann in den Vektor mittels zahlreicher verschiedener Verfahren insertiert werden. Im Allgemeinen wird DNA in (eine) geeignete Restriktionsendonucleasestelle(n) mittels auf dem Gebiet der Erfindung bekannter Verfahren insertiert. Vektorkomponenten umfassen im Allgemeinen, sind jedoch nicht beschränkt auf eine oder mehrere Signalsequenzen, einen Replikationsursprung, ein oder mehrere Markergene, ein Enhancer-Element, einen Promotor und eine Transkriptionsterminationssequenz. Bei der Konstruktion geeigneter Vektoren, die eine oder mehrere dieser Komponenten enthalten, werden herkömmliche Ligationsverfahren eingesetzt, die Fachleuten bekannt sind.
Das PRO7168 kann rekombinant nicht nur direkt, sondern auch als ein Fusionspolypeptid mit einem heterologen Polypeptid hergestellt werden, das eine Signalsequenz oder ein anderes Polypeptid mit einer spezifischen Spaltungsstelle am N-Terminus des reifen Proteins oder Polypeptids sein kann. Im Allgemeinen kann die Signalsequenz eine Komponente des Vektors oder kann ein Teil der für PRO7168 kodierenden DNA sein, die in den Vektor insertiert wird. Die Signalsequenz kann eine prokaryotische Signalsequenz, ausgewählt beispielsweise aus der aus alkalische-Phosphatase, Penicillinase, Ipp oder wärmestabilen Enterotoxin-II-Leadern bestehenden Gruppe, sein. Zur Hefesekretion kann die Signalsequenz z.B. der Hefe-Invertase-Leader, α-Faktorleader (einschließlich Saccharomyces- und Kluyveromyces-α-Faktor-Leader, wobei Letzterer im US-Patent Nr. 5.010.182 beschrieben wird) oder saure-Phosphatase-Leader, der C.-albicans-Glucoamylase-Leader ( EP 362.179 , veröf fentlicht am 4. April 1990) oder das in der WO 90/13646 , veröffentlicht am 15. November 1990, beschriebene Signal sein. Zur Säugetierzellexpression können Säugetiersignalsequenzen verwendet werden, um Sekretion des Proteins zu steuern, wie beispielsweise Signalsequenzen aus sekretierten Polypeptiden derselben oder einer verwandten Spezies sowie virale Sekretionsleader.
Sowohl Expressions- als auch Kloniervektoren enthalten eine Nucleinsäuresequenz, die es ermöglicht, dass sich der Vektor in einer oder mehreren der sekretierten Wirtszellen repliziert. Solche Sequenzen sind für zahlreiche verschiedene Bakterien, Hefen und Viren bekannt. Der Replikationsursprung aus dem Plasmid pBR322 ist für die meisten gram-negativen Bakterien geeignet, der 2μ-Plasmidursprung ist für Hefe geeignet, und verschiedene virale Ursprünge (SV40, Polyoma, Adenovirus, VSV oder BPV) sind für Kloniervektoren in Säugetierzellen nützlich.
Expressions- und Kloniervektoren enthalten typischerweise ein Selektionsgen, das auch als selektierbarer Marker bezeichnet wird. Typische Selektionsgene kodieren für Proteine, die (a) Resistenz gegenüber Antibiotika oder anderen Toxinen, z.B. Ampicillin, Neomycin, Methotrexat oder Tetracyclin, verleihen, (b) auxotrophe Mängel beheben oder (c) essenzielle Nährstoffe, die aus komplexem Medium nicht erhältlich sind, z.B. das für D-Alaninracemase für Bacilli kodierende Gen, zuführen.
Ein Beispiel für geeignete selektierbare Marker für Säugetierzellen sind jene, die die Identifikation von Zellen ermöglichen, die in der Lage sind, die für PRO7168 kodierende Nucleinsäure aufzunehmen, wie z.B. DHFR oder Thymidin-Kinase. Eine geeignete Wirtszelle ist, sofern Wildtyp-DHFR verwendet wird, die CHO-Zelllinie, der DHFR-Aktivität fehlt und die wie von Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216 (1980), beschrieben hergestellt und vermehrt wird. Ein geeignetes Selektionsgen zur Verwendung in Hefe ist das trp1-Gen, das im Hefeplasmid YRp7 vorhanden ist (Stinchcomb et al., Nature 282, 39 (1979); Kingsman et al., Gene 7, 141 (1979); Tschemper et al., Gene 10, 157 (1980)). Das trp1-Gen liefert einen Selektionsmarker für einen mutierten Hefestamm, dem die Fähigkeit fehlt, in Tryptophan zu wachsen, beispielsweise ATCC Nr. 44076 oder PEP4-1 (Jones, Genetics 85, 12 (1977)).
Expressions- und Kloniervektoren enthalten üblicherweise einen Promotor, der operabel an die PRO7168-Nucleinsäuresequenz gebunden ist, um die mRNA-Synthese zu steuern. Promotoren, die durch zahlreiche verschiedene potenzielle Wirtszellen erkannt werden, sind bekannt. Promotoren, die zur Verwendung mit prokaryotischen Wirten geeignet sind, umfassen die β-Lactamase- und Lactose-Promotorsysteme (Chang et al., Nature 275, 615 (1978); Goeddel et al., Nature 281, 544 (1979)), alkalische Phosphatase, ein Tryptophan- (trp-) Promotorsystem (Goeddel, Nucleic Acids Res. 8, 4057 (1980); EP 36.776 ) und Hybridpromotoren wie z.B. den tac-Promotor (deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 21–25 (1983)). Promotoren zur Verwendung in bakteriellen Systemen enthalten auch eine Shine-Dalgarno- (S.D.-) Sequenz, die operabel an die für PRO7168 kodierende DNA gebunden ist.
Beispiele für geeignete Promotorsequenzen zur Verwendung mit Hefewirten umfassen die Promotoren für 3-Phosphoglycerat-Kinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255, 2073 (1980)) oder andere glykolytische Enzyme (Ness et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7, 149 (1968); Holland, Biochemistry 17, 4900 (1978)) wie z.B. Enolase, Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase, Hexokinase, Pyruvat-Decarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6-phosphat-Isomerase, 3-Phosphoglycerat-Mutase, Pyruvat-Kinase, Triosephosphat-Isomerase, Phosphoglucose-Isomerase und Glucokinase.
Andere Hefepromotoren, die induzierbare Promotoren sind und den zusätzlichen Vorteil haben, dass ihre Transkription durch Wachstumsbedingungen gesteuert wird, sind die Promotorregionen für Alkoholdehydrogenase 2, Isocytochrom C, saure Phosphatase, Abbauenzyme, die mit Stickstoffmetabolismus assoziiert sind, Metallothionein, Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase und Enzyme, die für Maltose- und Galactoseverwertung verantwortlich sind. Geeignete Vektoren und Promotoren zur Verwendung bei der Hefeexpression werden näher in EP 73.657 beschrieben.
PRO7168-Transkription aus Vektoren in Säugetier-Wirtszellen wird beispielsweise durch Promotoren gesteuert, die aus den Genomen von Viren wie z.B. Polyomavirus, Geflügelpockenvirus ( UK 2.211.504 , veröffentlicht am 5. Juli 1989), Adenovirus (wie z.B. Adenovirus 2), Rinderpapillomavirus, Vogel-Sarkomvirus, Zytomegalie-Virus, einem Retrovirus, Hepatitis-B-Virus und Affenvirus 40 (SV40), aus heterologen Säugetierpromotoren, z.B. dem Actinpromotor oder einem Immunglobulinpromotor, und aus Hitzeschock-Promotoren gewonnen werden, vorausgesetzt, solche Promotoren sind mit den Wirtszellsystemen kompatibel.
Transkription einer DNA, die für das PRO7168 kodiert, durch höhere Eukaryoten kann durch Insertieren einer Enhancersequenz in den Vektor gesteigert werden. Enhancer sind cis-wirkende Elemente von DNA, üblicherweise etwa mit 10 bis 300 bp, die auf einen Promotor so wirken, dass seine Transkription gesteigert wird. Zahlreiche Enhancersequenzen sind aus Säugetiergenen bekannt (Globin, Elastase, Albumin, α-Fetoprotein und Insulin). Typischerweise wird jedoch ein Enhancer aus einem eukaryotischen Zellvirus verwendet. Beispiele umfassen den SV40-Enhancer an der späten Seite des Replikationsursprungs (bpp 100–270), den frühen Cytomegalie-Virus-Promotorenhancer, den Polyoma-Enhancer an der späten Seite des Replikationsursprungs und Adenovirus-Enhancer. Der Enhancer kann in den Vektor an einer Position 5' oder 3' zur PRO7168-Kodiersequenz gespleißt werden, wird jedoch vorzugsweise an einer Stelle 5' vom Promotor angeordnet.
Expressionsvektoren, die in eukaryotischen Wirtszellen (Hefe-, Pilz-, Insekten-, Pflanzen-, Tier-, Mensch- oder kernhaltige Zellen aus anderen mehrzelligen Organismen) verwendet werden, enthalten auch Sequenzen, die zum Abschluss von Transkription und zur Stabilisierung der mRNA erforderlich sind. Solche Sequenzen sind üblicherweise aus den untranslatierten 5'- und gegebenenfalls 3'- Regionen eukaryotischer oder viraler DNA oder cDNA erhältlich. Diese Regionen enthalten Nucleotidsegmente, die als polyadenylierte Fragmente im untranslatierten Abschnitt der für PRO7168 kodierenden mRNA transkribiert werden.
Weitere Verfahren, Vektoren und Wirtszellen, die zur Adaption an die Synthese von PRO7168 in rekombinanter Wirbeltierzellkultur geeignet sind, werden in Gething et al., Nature 293, 620–625 (1981); Mantei et al., Nature 281, 40–46 (1979); EP 117.060 ; und EP 117.058 beschrieben.
d. Detektion von Genamplifikation/-expression
Genamplifikation und/oder -expression kann basierend auf den hierin bereitgestellten Sequenzen in einer Probe direkt gemessen werden, z.B. durch herkömmliches Southern-Blotting, Northern-Blotting zur Quantifizierung der Transkription von mRNA (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 5201–5205 (1980)), Dot-Blotting (DNA-Analyse) oder In-situ-Hybridisierung unter Verwendung einer geeigneten markierten Sonde. Alternativ dazu können Antikörper verwendet werden, die spezifische Duplices, einschließlich DNA-Duplices, RNA-Duplices und DNA-RNA-Hybridduplices oder DNA-Proteinduplices, erkennen. Die Antikörper wiederum können markiert sein, und der Test kann durchgeführt werden, wenn der Duplex an eine Oberfläche gebunden ist, sodass bei Bildung von Duplex an der Oberfläche die Gegenwart von Antikörper, der an den Duplex gebunden ist, nachgewiesen werden kann.
Genexpression kann alternativ dazu durch immunologische Verfahren, wie beispielsweise immunhistochemisches Färben von Zellen oder Gewebeschnitten und Tests von Zellkultur oder Körperflüssigkeiten, gemessen werden, um die Expression von Genprodukt direkt zu quantifizieren. Antikörper, die für immunhistochemisches Färben und/oder Testen von Probenflüssigkeiten nützlich sind, können entweder monoklonal oder polyklonal sein und können in jedem beliebigen Säugetier hergestellt werden. Auf einfache Weise können die Antikörper gegen ein Nativsequenz-PRO7168-Polypeptid oder gegen ein synthetisches Peptid, basierend auf den hierin bereitgestellten DNA-Sequenzen, oder gegen exogene Sequenz, fusioniert an PRO7168-DNA und für ein spezifisches Antikörperepitop kodierend, hergestellt werden.
e. Reinigung eines Polypeptids
Formen von PRO7168 können aus einem Kulturmedium oder aus Wirtszelllysaten gewonnen werden. Sofern membrangebunden, kann es unter Verwendung einer ge eigneten Tensidlösung (z.B. Triton-X 100) oder durch enzymatische Spaltung aus der Membran freigesetzt werden. Zellen, die zur Expression von PRO7168 verwendet werden, können mittels verschiedener physikalischer oder chemischer Mittel, wie z.B. Gefrier-Auftau-Zyklieren, Beschallung, mechanischer Aufschluss oder Zelllysemittel, aufgeschlossen werden.
Es kann erwünscht sein, PRO7168 aus rekombinanten Zellproteinen oder Polypeptiden zu reinigen. Die folgenden Verfahren sind Beispiele für geeignete Reinigungsverfahren: Fraktionierung an einer Ionenaustauschsäule; Ethanolfällung; Umkehrphasen-HPLC; Chromatographie an Siliciumdioxid oder an einem Kationenaustauschharz wie z.B. DEAE; Chromatofokussierung; SDS-PAGE; Ammoniumsulfatfällung; Gelfiltration unter Verwendung von beispielsweise Sephadex G-75; Protein-A-Sepharose-Säulen zur Entfernung von Verunreinigungen wie IgG; und Metallchelator-Säulen zur Bindung von epitopmarkierten Formen des PRO7168. Verschiedene Verfahren von Proteinreinigung können verwendet werden, und solche Verfahren sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und beispielsweise in Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982), beschrieben. Der/Die ausgewählten) Reinigungsschritt(e) hängt/hängen beispielsweise von der Beschaffenheit des verwendeten Herstellungsverfahrens und dem bestimmten hergestellten PRO7168 ab.
E. Amplifikation von Genen, die für PRO7168-Polypeptide kodieren, in Tumorgewebe und Zelllinien
Die vorliegenden Erfindung basiert auf der Identifizierung und Charakterisierung von Genen, die in bestimmten Krebszellen amplifiziert werden.
Das Genom prokaryotischer und eukaryotischer Organismen ist zwei anscheinend widersprüchlichen Erfordernissen unterworfen. Eine davon ist die Erhaltung und Vermehrung von DNA als genetische Information in seiner ursprünglichen Form, um eine stabile Vererbung über mehrere Generationen zu gewährleisten. Andererseits müssen Zellen und Organismen in der Lage sein, sich nachhaltigen Umweltverände rungen anzupassen. Die Adaptierungsmechanismen können qualitative oder quantitative Modifizierungen des genetischen Materials umfassen. Qualitative Modifizierungen umfassen DNA-Mutationen, bei denen kodierende Sequenzen verändert werden, was in einem strukturell und/oder funktionell andersartigen Protein resultiert. Genamplifikation ist eine quantitative Veränderung, wodurch sich die tatsächliche Anzahl einer vollständigen kodierenden Sequenz, d.h., ein Gen, erhöht, was zu einer erhöhten Anzahl verfügbarer Template für die Transkription, einer erhöhten Anzahl translatierbarer Transkripte und letztlich zu einer erhöhten Menge des vom amplifizierten Gen kodierten Proteins führt.
Das Phänomen der Genamplifikation und dessen zugrunde liegenden Mechanismen sind in vitro in mehreren prokaryotischen und eukaryotischen Kultursystemen untersucht worden. Das am besten charakterisierte Beispiel der Genamplifikation umfasst die Kultur eukaryotischer Zellen in Medium, das variable Konzentrationen des zytotoxischen Medikaments Methotrexat (MTX) enthält. MTX ist ein Folsäure-Analogon und stört die DNA-Synthese durch Blockieren des Enzyms Dihydrofolatreduktase (DHFL). Während des anfänglichen Aussetzens gegenüber niedrigen Konzentrationen von MTX sterben die meisten Zellen (>99,9 %). Eine kleine Anzahl von Zellen überlebt und ist fähig, in ansteigenden MTX-Konzentrationen zu wachsen, indem sie große Mengen an DHFR-RNA und Protein produziert. Die Basis dieser Überproduktion ist die Amplifikation des einzelnen DHFR-Gens. Die zusätzlichen Kopien des Gens finden sich als extrachromosomale Kopien in Form kleiner, überzähliger Chromosomen (Minimalchromosomen) oder als integrierte chromosomale Kopien.
Die Genamplifikation wird am häufigsten bei der Entwicklung von Resistenz gegen zytotoxische Medikamente (Antibiotika für Bakterien und chemotherapeutische Mittel für eukaryotische Zellen) und neoplastischer Transformation angetroffen. Die Transformation einer eukaryotischen Zelle als spontanes Ereignis oder aufgrund viralen oder chemischen/umweltbedingten Insults ist typischerweise mit Veränderungen des genetischen Materials dieser Zelle verbunden. Eine der häufigsten genetischen Veränderungen, die bei menschlichen Malignitäten beobachtet wird, sind Mutationen des p53-Proteins. p53 kontrolliert den Übergang von Zellen von der stationären (G1-) in die replikative (S-) Phase und verhindert diesen Übergang in Gegenwart einer DNA-Schädigung. In anderen Worten ist eine der Hauptkonsequenzen deaktivierender p53-Mutationen die Anhäufung und Vermehrung der DNA-Schädigung, d.h. genetische Veränderungen. Übliche Typen genetischer Veränderungen in neoplastischen Zellen sind, zusätzlich zu Punktmutationen, Amplifikationen und starke strukturelle Veränderungen, wie z.B. Translokationen.
Die Amplifikation von DNA-Sequenzen kann eine spezifische funktionelle Voraussetzung anzeigen, wie sie am experimentellen DHFR-System illustriert wird. Daher weist die Amplifikation gewisser Onkogene bei Malignitäten auf eine ursächliche Rolle dieser Gene beim Vorgang der malignen Transformation und Erhaltung des transformierten Phänotyps hin. Diese Hypothese ist in neulichen Studien bestätigt worden. Beispielsweise hat sich erwiesen, dass das bcl-2-Protein in gewissen Typen des Non-Hodgkin-Lymphoms amplifiziert wird. Dieses Protein hemmt die Apoptose und führt zur fortschreitenden Anhäufung neoplastischer Zellen. Es hat sich gezeigt, dass Elemente der Genfamilie von Wachstumsfaktorrezeptoren in verschiedenen Krebsarten amplifiziert werden, was darauf hinweist, dass die Überexpression dieser Rezeptoren neoplastische Zellen weniger anfällig für limitierende Mengen an verfügbarem Wachstumsfaktor machen könnten. Beispiele umfassen die Amplifikation des Androgen-Rezeptors bei wiederkehrendem Prostatakarzinom während der Androgenmangeltherapie und die Amplifikation des Wachstumsfaktorrezeptorhomologs ERB2 bei Brustkarzinom. Schließlich können Gene, die an der intrazellulären Signalisierung und Kontrolle der Zellzyklusabfolge beteiligt sind, während der malignen Transformation eine Amplifikation erfahren. Dies wird durch die Amplifikation der bcl-I- und ras-Gene in verschiedenen Epithel- und Lymphoid-Neoplasmen illustriert.
Diese früheren Studien illustrieren die Durchführbarkeit der Identifizierung amplifizierter DNA-Sequenzen bei Neoplasmen, da dieser Ansatz Gene identifizieren kann, die für die maligne Transformation wichtig sind. Der Fall von ERB2 demonstriert außerdem die Durchführbarkeit vom therapeutischen Standpunkt, da transformierende Proteine neue und spezifische Ziele für die Tumortherapie darstellen könnten.
Es können mehrere verschiedene Techniken verwendet werden, um amplifizierte genomische Sequenzen nachzuweisen. Die klassische zytogenetische Analyse von Chromosomenbereichen, die aus Krebszellen hergestellt wurden, ist zur Identifizierung starker struktureller Veränderungen, wie z.B. Translokationen, Deletionen und Inversionen angemessen. Amplifizierte Genomregionen können nur dann sichtbar gemacht werden, wenn sie große Regionen mit hoher Kopieanzahl umfassen oder als extrachromosomales Material vorliegen. Obwohl die Zytogenetik die erste Technik war, um die folgerichtige Verbindung spezifischer chromosomaler Veränderungen mit bestimmten Neoplasmen nachzuweisen, ist sie für die Identifizierung und Isolierung handhabbarer DNA-Sequenzen ungeeignet. Die vor kurzem entwickelte Technik der vergleichenden genomischen Hybridisierung (CGH) hat das verbreitete Phänomen der genomischen Amplifikation in Neoplasmen illustriert. Tumor- und normale DNA werden gleichzeitig auf Metaphasen normaler Zellen hybridisiert und das gesamte Genom kann mittels Bildanalyse auf DNA-Sequenzen gescreent werden, die im Tumor mit erhöhter Häufigkeit vorliegen. ( WO 93/18.186 ; Gray et al., Radiation Res. 137, 275–289 (1994)). Als Screeningverfahren hat diese Analysenart eine große Anzahl an wiederkehrenden Amplicons (ein Abschnitt amplifizierter DNA) in einer Vielzahl von menschlichen Neoplasmen offenbart. Obgleich CGH bei der Identifizierung amplifizierter DNA-Abschnitte empfindlicher ist als die klassische zytogenetische Analyse, erlaubt sie keine schnelle Identifizierung und Isolierung kodierender Sequenzen innerhalb des Amplicons durch standardmäßige molekulare genetische Techniken.
Die empfindlichsten Verfahren zur Detektion einer Genamplifikation sind Tests auf Basis der Polymerasekettenreaktion (PCR). Diese Tests setzen sehr geringe Mengen an Tumor-DNA als Ausgangsmaterial ein, sind ausgesprochen empfindlich, stellen DNA bereit, die für eine weitere Analyse, wie z.B. Sequenzierung zugänglich ist und sind für die High-throughput-Analyse geeignet.
Die oben erwähnten Tests schließen sich nicht gegenseitig aus, sondern werden häufig in Kombination verwendet, um Amplifikationen in Neoplasmen zu identifizieren. Während zytogenetische Analyse und CGH Screeningverfahren darstellen, um das gesamte Genom auf amplifizierte Regionen zu untersuchen, sind auf PCR basierende Tests für die endgültige Identifizierung kodierenden Sequenzen, d.h. Genen in amplifizierten Regionen, höchst geeignet.
Gemäß der vorliegenden Erfindung sind derartige Gene mittels quantitativer PCR (S. Gelmini et al., Clin. Chem. 43, 752 (1997)), durch Vergleich von DNA aus einer Vielzahl von Primärtumoren, einschließlich Brust-, Lungen-, Kolon-, Prostata-, Hirn-, Nieren-, Pankreas-, Milz-, Thymus-, Hoden-, Ovarial-, Uterus- usw. Tumoren oder Tumorzelllinien, mit gepoolter DNA aus gesunden Spendern identifiziert worden. Quantitative PCR wurde unter Einsatz eines TagMan^TM-Instruments (ABI) durchgeführt. Genspezifische Primer und fluorogene Sonden wurden basierend auf den für die DNA kodierenden Sequenzen entworfen.
Menschliche Lungenkarzinom-Zelllinien umfassen A549 (SRCC768), Calu-1 (SRCC769), Calu-6 (SRCC770), H157 (SRCC771), H441 (SRCC772), H460 (SRCC773), SKMES-1 (SRCC774), SW900 (SRCC775), H522 (SRCC832) und H810 (SRCC833), die alle von ATCC erhältlich sind. Menschliche Primärlungentumorzellen stammen üblicherweise aus Adenokarzinomen, Plattenepithelkarzinomen, großzelligen Karzinomen, nicht kleinzelligen Karzinomen, kleinzelligen Karzinomen und bronchoalveolaren Karzinomen und umfassen beispielsweise SRCC724 (Adenokarzinom, abgekürzt als „AdenoCa") (LT1), SRCC725 (Plattenepithelkarzinom, abgekürzt als „SqCCa") (LT1a), SRCC726 (Adenokarzinom) (LT2), SRCC727 (Adenokarzinom) (LT3), SRCC728 (Adenokarzinom) (LT4), SRCC729 (Plattenepithelkarzinom) (LT6), SRCC730 (Adeno-/Plattenepithelkarzinom) (LT7), SRCC731 (Adenokarzinom) (LT9), SRCC732 (Plattenepithelkarzinom) (LT10), SRCC733 (Plattenepithelkarzinom) (LT11), SRCC734 (Adenokarzinom) (LT12), SRCC735 (Adeno-/Plattenepithelkarzinom) (LT13), SRCC736 (Plattenepithelkarzinom) (LT15), SRCC737 (Plattenepithelkarzinom) (LT16), SRCC738 (Plattenepithelkarzinom) (LT17), SRCC739 (Plattenepithelkarzinom) (LT18), SRCC740 (Plattenepithelkarzinom) (LT19), SRCC741 (Lungenzellenkarzinom, abgekürzt als „LCCa") (LT21), SRCC811 (Adenokarzinom) (LT22), SRCC825 (Adenokarzinom) (LT8), SRCC886 (Adenokarzinom) (LT25), SRCC887 (Plattenepithelkarzinom) (LT26), SRCC888 (Adeno-BAC-Karzinom) (LT27), SRCC 889 (Plattenepithelkarzinom) (LT28), SRCC890 (Plattenepithelkarzinom) (LT29), SRCC891 (Adenokarzinom) (LT30), SRCC892 (Plattenepithelkarzinom) (LT31), SRCC894 (Adenokarzinom) (LT33). Außerdem sind menschliche Lungentumoren eingeschlossen, die als SRCC1125 [HF-000631], SRCC1127 [HF-000641], SRCC1129 [HF-000643], SRCC1133 [HF-000840], SRCC1135 [HF-000842], SRCC1227 [HF-001291], SRCC1229 [HF-001293], SRCC1230 [HF-001294], SRCC1231 [HF-001295], SRCC1232 [HF-001296], SRCC1233 [HF-001297], SRCC1235 [HF-001299] und SRCC1236 [HF-001300] bezeichnet werden.
Kolonkrebszelllinien umfassen beispielsweise die ATCC-Zelllinien SW480 (Adenokarzinom, SRCC776), SW620 (Lymphknotenmetastase des Kolon-Adenokarzinoms, SRCC777), Colo320 (Karzinom, SRCC778), HT29 (Adenokarzinom, SRCC779), HM7 (eine stark Mucin produzierende Variante der ATCC-Kolon-Adenokarzinomzelllinie, SRCC780, erhalten von Dr. Robert Warren, UCSF), CaWiDr (Adenokarzinom, SRCC781), HCT116 (Karzinom, SRCC782), SKCO1 (Adenokarzinom, SRCC783), SW403 (Adenokarzinom, SRCC784), LS174T (Karzinom, SRCC785), Colo205 (Karzinom, SRCC828), HCT15 (Karzinom, SRCC829), HCC2998 (Karzinom, SRCC830) und KM12 (Karzinom, SRCC831). Kolon-Primärtumoren umfassen Kolon-Adenokarzinome, die mit CT2 (SRCC742), CT3 (SRCC743), CT8 (SRCC744), CT10 (SRCC745), CT12 (SRCC746), CT14 (SRCC747), CT15 (SRCC748), CT16 (SRCC749), CT17 (SRCC750), CT1 (SRCC751), CT4 (SRCC752), CT5 (SRCC753), CT6 (SRCC754), CT7 (SRCC755), CT9 (SRCC756), CT11 (SRCC757), CT18 (SRCC758), CT19 (Adenokarzinom, SRCC906), CT20 (Adenokarzinom, SRCC907), CT21 (Adenokarzinom, SRCC908), CT22 (Adenokarzinom, SRCC909), CT23 (Adenokarzinom, SRCC910), CT24 (Adenokarzinom, SRCC911), CT25 (Adenokarzinom, SRCC912), CT26 (Adenokarzinom, SRCC913), CT27 (Adenokarzinom, SRCC914), CT28 (Adenokarzinom, SRCC915), CT29 (Adenokarzinom, SRCC916), CT30 (Adenokarzinom, SRCC917), CT31 (Adenokarzinom, SRCC 918), CT32 (Adenokarzinom, SRCC919), CT33 (Adenokarzinom, SRCC920), CT35 (Adenokarzinom, SRCC921) und CT36 (Adenokarzinom, SRCC922) bezeichnet werden. Auch menschliche Kolontumorzentren, die als SRCC1051 [HF-000499], SRCC1052 [HF-000539], SRCC1053 [HF-000575], SRCC1054 [HF-000698], SRCC1059 [HF-000755], SRCC 1060 [HF-000756], SRCC1142 [HF-000762], SRCC1144 [HF-000789], SRCC1146 [HF-000795] und SRCC1148 [HF-000811] bezeichnet werden, sind eingeschlossen.
Menschliche Brustkarzinom-Zelllinien umfassen beispielsweise HBL100 (SRCC759), MB435s (SRCC760), T47D (SRCC761), MB468 (SRCC762), MB175 (SRCC763), MB361 (SRCC764), BT20 (SRCC765), MCF7 (SRCC766), SKBR3 (SRCC767) und menschliche Brusttumorzentren, die als SRCC1057 [HF-000545] bezeichnet werden, sind eingeschlossen. Weiters sind menschliche Brusttumoren, die als SRCC1094, SRCC1095, SRCC1096, SRCC1097, SRCC1098, SRCC1099, SRCC1100, SRCC1101 bezeichnet werden und ein menschlicher Brust-Met-Lungen-Nucleinsäure-Tumor, der als SRCC893 [LT 32] bezeichnet wird, eingeschlossen.
Menschliche Mastdarmtumoren umfassen SRCC981 [HF-000550] und SRCC982 [HP-000551].
Menschliche Nierentumorzentren umfassen SRCC989 [HF-000611] und SRCC1014 [HF-000613].
Menschliche Hodentumorzentren umfassen SRCC1001 [HF-000733] und Hodentumorrandgewebe SRCC999 [HF-000716].
Menschliche Nebenschilddrüsentumoren umfassen [HF-000831] und SRCC1003 [HF-000832].
Menschliche Lymphknotentumoren umfassen SRCC1004 [HF-000854], SRCC1005 [HF-000855] und SRCC1006 [HF-000856]
F. Gewebeverteilung
Die Ergebnisse der Genamplifikationsstests hierin können durch weitere Untersuchungen, wie z.B. durch Ermittlung der mRNA-Expression in verschiedenen menschlichen Geweben verifiziert werden.
Wie vorhin angemerkt, kann die Genamplifikation und/oder Genexpression in verschiedenen Geweben durch herkömmliches Southern-Blotting, Northern-Blotting zur Quantifizierung der Transkription von mRNA (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 5201–5205 (1980)), Dot-Blotting (DNA-Analyse) oder In-situ-Hybridisierung unter Verwendung einer geeignet markierten Sonde auf Basis der hierin bereitgestellten Sequenzen gemessen werden. Alternativ dazu können Antikörper eingesetzt werden, die spezifische Duplexe, einschließlich DNA-Duplexe, RNA-Duplexe und DNA-RNA-Hybridduplexe oder DNA-Protein-Duplexe erkennen können.
Die Genexpression in verschiedenen Geweben kann alternativ dazu mittels immunologischer Verfahren, wie z.B. immunohistochemische Färbung von Gewebeschnitten und Testen von Zellkultur- oder Körperflüssigkeiten gemessen werden, um die Expression des Genprodukts direkt zu quantifizieren. Für immunohistochemisches Färben und/oder Testen von Probenflüssigkeiten zweckdienlichen Antikörper können entweder monoklonal oder polyklonal sein und können in jeglichem Tier hergestellt werden. Zweckdienlicherweise können die Antikörper gegen ein Nativsequenz-PRO-7168-Polypeptid oder gegen ein synthetisches Peptid auf Basis der hierin bereitgestellten DNA-Sequenzen oder gegen eine exogene Sequenz, die an PRO7168-DNA fusioniert ist und für ein spezifisches Antikörperepitop kodiert, hergestellt werden. Allgemeine Techniken zur Erzeugung von Antikörpern und spezielle Protokolle für Northern-Blotting und In-situ-Hybridisierung werden hierin unten bereitgestellt.
G. Chromosomkartierung
Wenn die Amplifikation eines gegebenen Gens funktionell relevant ist, dann sollte dieses Gen stärker amplifiziert werden als benachbarte genomische Regionen, die für das Überleben des Tumors nicht wichtig sind. Um dies zu testen, kann das Gen gegen ein bestimmtes Chromosom, z.B. durch Bestrahlungs-Hybrid-Analyse kartiert werden. Das Amplifikationsausmaß wird dann an der identifizierten Stelle ermittelt, sowie an benachbarten genomischen Regionen. Die selektive oder bevorzugte Amplifikation an der genomischen Region, an die das Gen kartiert worden ist, steht im Einklang mit der Möglichkeit, dass die beobachtete Genamplifikation das Wachstum oder Überleben des Tumors fördert. Die Chromosomkartierung umfasst Gerüst- sowie Epizentrum-Kartierung. Für weitere Einzelheiten siehe z.B. Stewart et al., Genome Research 7, 422–433 (1997).
H. Antikörperbindungsuntersuchungen
Die Ergebnisse der Genamplifikationsuntersuchung können mittels Antikörperbindungsuntersuchungen weiter verifiziert werden, wobei die Fähigkeit von Anti-PRO-7168-Antikörpern getestet wird, die Expression von PRO7168-Polypeptiden an Tumor- (Krebs-) Zellen zu hemmen. Beispielhafte Antikörper umfassen polyklonale, monoklonale, humanisierte, bispezifische und heterokonjugierte Antikörper, deren Herstellung hierin unten beschrieben wird.
Antikörperbindungsuntersuchungen können in einem beliebigen bekannten Testverfahren durchgeführt werden, wie z.B. kompetitive Bindungstests, direkte und indirekte Sandwich-Tests und Immunopräzipitationstests. Zola, Monoclonal Antibodies: A Laborstory Manual of Techniques, CRC Press Inc., S. 147–158 (1987).
Kompetitive Bindungstests beruhen auf der Fähigkeit eines markierten Standards, mit dem Testprobenanalyten um die Bindung mit einer begrenzten Menge Antikörper zu konkurrieren. Die Menge an Zielprotein (kodiert von einem in einer Tumorzelle amplifizierten Gen) in der Testprobe ist umgekehrt proportional der Menge an Standard, die an die Antikörper gebunden wird. Um die Bestimmung der Menge an gebundenem Standard zu erleichtern, werden die Antikörper vor oder nach der Konkurrenzreaktion vorzugsweise insolubilisiert, so dass der Standard und Analyt, die an die Antikörper gebunden sind, leicht vom ungebunden verbliebenen Standard und Analyten getrennt werden können.
Sandwich-Tests umfassen die Verwendung von zwei Antikörpern, wobei beide fähig sind, an einen anderen immunogenen Abschnitt oder an ein anderes immunogenes Epitop des nachzuweisenden Proteins zu binden. In einem Sandwich-Test wird der Testprobenanalyt von einem ersten Antikörper gebunden, der an einem festen Trä ger immobilisiert ist, und danach bindet ein zweiter Antikörper an den Analyten, wodurch ein unlöslicher dreiteiliger Komplex gebildet wird. Siehe z.B. US-Patent Nr. 4.376.110 . Der zweite Antikörper kann selbst mit einer detektierbaren Gruppierung markiert sein (direkte Sandwich-Tests) oder kann unter Verwendung eines Anti-Immunglobulin-Antikörpers gemessen werden, der mit einer detektierbaren Gruppierung markiert ist (indirekter Sandwich-Test). Beispielsweise ist einer der Sandwich-Testtypen ein ELISA-Test, wobei in diesem Fall die detektierbare Gruppierung ein Enzym ist.
Für die Immunohistochemie kann die Tumorprobe frisch oder gefroren sein oder kann beispielsweise in Paraffin eingebettet und mit einem Konservierungsmittel, wie z.B. Formalin fixiert sein.
I. Auf Zellen basierende Tumortests
Auf Zellen basierende Tests und Tiermodelle für Tumoren (z.B. Karzinome) können verwendet werden, um die Befunde des Genamplifikationstests zu verifizieren und die Beziehung zwischen den hierin identifizierten Genen und der Entwicklung und Pathogenese des neoplastischen Zellwachstums besser zu verstehen. Die Rolle von hierin identifizierten Genprodukten bei der Entwicklung und Pathologie von Tumoren oder Karzinomen kann getestet werden, indem Primärtumorzellen oder Zelllinien verwendet werden, von denen erkannt worden ist, dass sie die Gene amplifizieren. Derartige Zellen umfassen beispielsweise Brust-, Kolon- und Lungenkarzinomzellen und Zelllinien, die oben aufgezählt sind.
In einem anderen Ansatz werden Zellen eines Zelltyps, der bekanntermaßen an einem bestimmten Tumor beteiligt ist, mit den cDNAs hierin transfiziert, und es wird die Fähigkeit dieser cDNAs analysiert, übermäßiges Wachstum auszulösen. Geeignete Zellen umfassen beispielsweise stabile Tumorzelllinien, wie z.B. die B104-1-1-Zelllinie (stabile NIH-3T3-Zelllinien, transfiziert mit dem neu-Protooncogen) und rastransfizierte NIH-3T3-Zellen, die mit dem gewünschten Gen transfiziert und auf tumorartiges Wachstums beobachtet werden können. Derartige transfizierte Zelllinien können dann verwendet werden, um die Fähigkeit von poly- oder monoklonalen Antikörpern oder Antikörperzusammensetzungen zu testen, das tumorartige Zellwachstum durch Ausüben zytostatischer oder zytotoxischer Aktivität auf das Wachstum transformierter Zellen oder durch Vermitteln von Antikörper-abhängiger Zelltoxizität (ADCC) zu hemmen. Mit den kodierenden Sequenzen der hierin identifizierten Gene transfizierte Zellen können weiter verwendet werden, um Medikament-Kandidaten für die Krebsbehandlung zu identifizieren.
Außerdem können Primärkulturen, die aus Tumoren in transgenen Tieren stammen (wie unten beschrieben), in den auf Zellen basierenden Tests hierin verwendet werden, obgleich stabile Zelllinien bevorzugt sind. Techniken zur Herleitung kontinuierlicher Zelllinien aus transgenen Tieren sind auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannt (siehe z.B. Small et al., Mol. Cell. Biol. 5, 642–648 (1985)).
J. Tiermodelle
Es kann eine Vielzahl wohlbekannter Tiermodelle verwendet werden, um die Rolle der hierin identifizierten Gene bei der Entwicklung und Pathogenese von Tumoren besser zu verstehen und die Wirksamkeit von therapeutischen Kandidat-Mitteln, einschließlich Antikörpern und anderen Antagonisten der nativen Polypeptide, einschließlich kleiner Antagonisten-Moleküle zu testen. Der In-vivo-Charakter derartiger Modelle macht diese besonders prognostisch für Reaktionen in menschlichen Patienten. Tiermodelle von Tumoren und Karzinomen (z.B. Brustkarzinom, Kolonkarzinom, Prostatakarzinom, Lungenkarzinom) umfassen nicht-rekombinante sowie rekombinante (transgene) Tiere. Nicht-rekombinante Tiermodelle umfassen beispielsweise Nager-, z.B. Mausmodelle. Derartige Modelle können durch Einführen von Tumorzellen in syngenetische Mäuse unter Verwendung von Standardtechniken, z.B. subkutane Injektion, Schwanzveneninjektion, Milzimplantation, intraperitoneale Implantation, Implantation unter die Nierenkapsel oder Orthopin-Implantation erzeugt werden, z.B. in Kolongewebe implantierte Kolonkarzinomzellen. (Siehe z.B. PCT-Veröffentlichung Nr. WO 97/33551 , veröffentlicht am 18. September 1997).
Die wahrscheinlich am häufigsten bei onkologischen Studien verwendete Tierspezies sind immunodefiziente Mäuse und insbesondere Nacktmäuse. Die Beobachtung, dass Nacktmäuse mit Hypo-/Aplasie erfolgreich als Wirte für menschliche Tumor-Xenotransplantate agieren können, hat zu ihrer weiten Verbreitung zu diesem Zweck geführt. Das autosomal rezessive nu-Gen ist in eine sehr große Zahl von unterschiedlichen kongenen Stämmen von Nacktmäusen eingeführt worden, beispielsweise in ASW, A/He, AKR, BALG/c, B10.LP, C17, C3H, C57BL, C57, CBA, DBA, DDD, I/st, NC, NFR, NFS, NFS/N, NZB, NZC, NZW, P, RIII und SJL. Außerdem ist eine breite Vielfalt anderer Tiere, die nicht Nacktmäuse sind, mit vererbten immunologischen Defekten gezüchtet und als Empfänger von Tumor-Xenoimplantaten verwendet worden. Für weitere Einzelheiten siehe z.B. The Nude Mouse in Oncology Research, E. Boven und B. Winograd (Hrsg.), CRC Press Inc. (1991).
Die in solche Tiere eingeführten Zellen können von bekannten Tumor/Karzinom-Zelllinien stammen, wie z.B. von jeglichen der oben aufgezählten Tumorzelllinien und beispielsweise von der B104-1-1-Zelllinie (stabile NIH-3T3-Zelllinien, transfiziert mit dem neu-Protoonkogen); ras-transfizierten NIH-3T3-Zellen; Caco-2 (ATCC HTB-37); einer mäßig gut differenzierten menschlichen Kolon-Adenokarzinom-Zelllinien des Grades II, HAT-29 (ATCC HTB-38); oder von Tumoren und Karzinomen. Proben von Tumor- oder Krebszellen können aus Patienten erhalten werden, die operiert werden, und zwar unter Anwendung von Standardbedingungen, die Einfrieren und Lagern in flüssigem Stickstoff umfassen (Karmali et al., Br. J. Cancer 48, 689–696 (1983)).
Tumorzellen können mittels einer Vielzahl von Verfahren in Tiere, wie z.B. Nacktmäuse, eingeführt werden. Der subkutane (s.c.) Raum eignet sich besonders für die Tumorimplantation. Tumoren können s.c. als massive Blöcke, als Nadelbiopsien durch Verwendung einer Hohlnadel oder als Zellsuspensionen transplantiert werden. Für die Massivblock- oder Hohlnadelimplantation werden Tumorgewebefragmente geeigneter Größe in den subkutanen Raum eingeführt. Zellsuspensionen werden aus Primärtumoren oder stabilen Tumorzelllinien frisch hergestellt und subkutan injiziert. Tumorzelllinien können auch als subdermale Implantate injiziert werden. An dieser Stelle wird das Inokulum zwischen dem unteren Teil des Hautbindegewebes und dem subkutanen Gewebe eingelagert. Boven und Winograd (1991), s.o.
Tiermodelle des Brustkarzinoms können beispielsweise durch Implantieren von Ratten-Neuroblastomzellen (aus denen das neu-Onkogen ursprünglich isoliert wurde) oder neu-transformierten NIH-3T3-Zellen in Nacktmäuse, im Wesentlichen wie von Drebin et al., PNAS USA 83, 9129–9133 (1986) beschrieben erzeugt werden.
Gleichermaßen können Tiermodelle des Dickdarbkarzinoms erzeugt werden, indem eine Passage von Kolonkarzinomzellen in Tieren, z.B. Nacktmäusen durchgeführt wird, was zum Auftreten von Tumoren in diesen Tieren führt. Ein orthotopisches Transplantatmodell von menschlichem Kolonkarzinom in Nacktmäusen ist beispielsweise von Wang et al., Cancer Research 54, 4726–4728 (1994) und Too et al., Cancer Research 55, 681–684 (1995) beschrieben worden. Dieses Modell basiert auf der so genannten „METAMOUSE^TM", die von Anticancer Inc. (San Diego, Kalifornien) verkauft wird.
Tumoren, die in Tieren entstehen, können entfernt und in vitro kultiviert werden. Zellen aus den In-vitro-Kulturen können dann an Tiere passagiert werden. Derartige Tumoren können als Ziele für weiteres Testen oder Arzneimittel-Screening dienen. Alternativ dazu können die aus der Passage resultierenden Tumoren isoliert und RNA aus Vor-Passage-Zellen und Zellen, die nach einem oder mehreren Passage-Umläufen isoliert wurden, auf differenzielle Expression von Genen von Interesse analysiert werden. Derartige Passage-Techniken können mit beliebigen bekannten Tumor- oder Krebszelllinien durchgeführt werden.
Beispielsweise sind Meth A, CMS4, CMS5, CMS21 und WEHT-164 chemisch induzierte Fibrosarkome weiblicher BALB/c-Mäuse (DeLeo et al., J. Exp. Med. 146, 720 (1977)), die ein sehr gut steuerbares Modellsystem zur Untersuchung der Antitumoraktivitäten verschiedener Mittel bereitstellen (Palladino et al., J. Immunol. 138, 4023–4032 (1987)). Zusammenfassend werden Tumorzellen in vitro in Zellkultur vermehrt. Vor der Injektion in die Tiere werden die Zelllinien gewaschen und in einer Zelldichte von etwa 10 × 10⁶ bis 10 × 10⁷ Zelle/ml in Puffer suspendiert. Die Tiere werden dann subkutan mit 10 bis 100 μl der Zellsuspension infiziert und das Auftreten eines Tumors für ein bis drei Wochen abgewartet.
Außerdem kann das Lewis-Lungen- (3LL-) Karzinom der Mäuse, das einer der am gründlichsten untersuchten experimentellen Tumoren ist, als Forschungs-Tumormodell verwendet werden. Die Wirksamkeit dieses Tumormodells ist mit vorteilhaften Wirkungen bei der Behandlung von menschlichen Patienten korreliert worden, die mit kleinzelligem Lungenkarzinom (SCCL) diagnostiziert worden sind. Dieser Tumor kann durch Injektion von Tumorfragmenten einer befallenen Maus oder von in Kultur gehaltenen Zellen in normale Mäuse eingeführt werden (Zupi et al., Br. J. Cancer 41, Nachtrag 4, 309 (1980)). Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass Tumoren sogar aus der Injektion einer einzigen Zelle ausgelöst werden können und dass ein sehr hoher Anteil infizierter Tumorzellen überlebt. Für weitere Informationen über diesen Tumor siehe Zacharski, Haemostasis 16, 300–320 (1986)).
Eine Art und Weise der Beurteilung der Wirksamkeit einer Testverbindung in einem Tiermodell auf einen implantierten Tumor ist die Messung der Größer des Tumors vor und nach der Behandlung. Herkömmlicherweise ist die Größe implantierter Tumoren mit einer Schublehre in zwei oder drei Dimensionen gemessen worden. Die auf zwei Dimensionen begrenzte Messung kann die Größe des Tumors nicht genau wiedergeben und daher wird sie üblicherweise durch Verwendung einer mathematischen Formel in das entsprechende Volumen umgewandelt. Jedoch ist die Messung der Tumorgröße sehr ungenau. Die therapeutischen Wirkungen eines Medikament-Kandidaten kann als eine durch die Behandlung ausgelöste Wachstumsverzögerung und spezifische Wachstumsverzögerung besser beschrieben werden. Eine weitere wichtige Variable bei der Beschreibung von Tumorwachstum ist die Tumorvolumen-Verdoppelungszeit. Computerprogramme zur Berechnung und Beschreibung von Tumorwachstum sind ebenfalls verfügbar, wie z.B. jenes, das von Rygaard und Spang-Thomsen, Proc. 6th Int. Workshop an Immune-Deficient Animals, Wu und Sheng (Hrsg.), Basel, 301 (1989) beschrieben wird. Es wird jedoch angemerkt, dass Nekrose und entzündliche Reaktionen nach der Behandlung zumindest anfänglich auch in einer Erhöhung der Tumorgröße resultieren können. Daher müssen diese Veränderungen sorgfältig beobachtet werden, und zwar durch eine Kombination eines morphometrischen Verfahrens und einer durchflusszytometrischen Analyse.
Rekombinante (transgene) Tiermodelle können unter Verwendung von Standardtechniken zur Herstellung transgener Tiere durch Einführen des kodierenden Abschnitts der hierin identifizierten Gene in das Genom der Tiere von Interesse konstruiert werden. Tiere, die als Ziel zur transgenen Manipulation dienen können, umfassen ohne Einschränkung Mäuse, Ratten, Kaninchen, Meerschweinchen, Schafe, Ziegen, Schweine und nicht-menschliche Primaten, z.B. Paviane, Schimpansen und Affen. Techniken zur Einführung eines Transgen in solche Tiere, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, umfassen Pronukleus-Mikroinjektion (Hoppe und Wanger, US-Patent Nr. 4.873.191 ); Retrovirus-vermittelten Gentransfer in Keimbahnen (z.B. Van der Putten et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 6148–615 (1985)); Gen-Targeting in embryonalen Stammzellen (Thompson et al., Cell 56, 313–321 (1989)); Elektroporation von Embryos (Lo, Mol. Cel. Biol. 3, 1803–1814 (1983)); Spermien-vermittelten Gentransfer (Lavitrano et al., Cell 57, 717–73 (1989)). Für einen Überblick siehe beispielsweise US-Patent Nr. 4.736.866 .
Zum Zwecke der vorliegenden Erfindung umfassen transgene Tiere jene, die das Transgen in nur einem Teil ihrer Zellen beherbergen („Mosaik-Tier"). Das Transgen kann entweder als einzelnes Transgen oder als Koncatemere, z.B. als Kopf-Kopf- oder Kopf-Schwanz-Tandems integriert sein. Die selektive Einführung eines Transgens in einen bestimmten Zelltyp ist außerdem möglich, indem beispielsweise die Technik von Lasko et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89, 6232–636 (1992) befolgt wird.
Die Expression des Transgens in transgenen Tieren kann mittels Standardtechniken beobachtet werden. Beispielsweise kann Southern-Blotting-Analyse oder PCR-Amplifikation verwendet werden, um die Integration des Transgens zu verifizieren. Das Ausmaß der mRNA-Expression kann dann unter Verwendung von Techniken, wie z.B. In-situ-Hybridisierung, Northern-Blot-Analyse, PCR oder Immunozytochemie a nalysiert werden. Die Tiere werden auf Anzeichen von Tumor- oder Karzinomentwicklung weiter untersucht.
Alternativ dazu können „Knockout"-Tiere konstruiert werden, die ein defektes oder verändertes, für ein hierin identifiziertes PRO7168-Polypeptid kodierendes Gen aufweisen, und zwar als Ergebnis der homologen Rekombination zwischen dem endogenen, für das Polypeptid kodierenden Gen und veränderter, für dasselbe Polypeptid kodierender genomischer DNA, die in eine embryonale Zelle des Tiers eingeführt wurde. Beispielsweise kann für ein PRO7168-Polypeptid kodierende cDNA verwendet werden, um nach etablierten Techniken für dieses Polypeptid kodierende genomische DNA zu klonieren. Ein Abschnitt der für ein bestimmtes PRO7168-Polypeptid kodierenden genomischen DNA kann deletiert oder durch ein anderes Gen, wie z.B. durch ein für einen selektierbaren Marker kodierendes Gen, ersetzt werden, das zur Feststellung der Integration verwendet werden kann. Typischerweise umfasst der Vektor mehrere Kilobasen unveränderter flankierender DNA (an den 5'- sowie 3'-Enden) (siehe z.B. Thomas und Capecchi, Cell 51, 503 (1987) für eine Beschreibung homologer Rekombinationsvektoren). Der Vektor wird in eine embryonale Stammzellenlinie (z.B. durch Elektroporation) eingeführt und es werden jene Zellen selektiert, in denen die eingeführte DNA homolog mit der endogenen DNA rekombiniert hat (siehe z.B. Li et al., Cell 69, 915 (1992)). Die selektierten Zellen werden dann in eine Blastozyste eines Tiers (z.B. einer Maus oder Ratte) injiziert, um Aggregations-Chimären zu bilden (siehe z.B. Bradley, in: Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E.J. Robertsen (Hrsg.), IRL, Oxford, S. 113–152 (1987)). Ein chimärer Embryo kann dann in ein geeignetes pseudoträchtiges weibliches Ziehtier implantiert und der Embryo geboren werden, um ein „Knockout"-Tier zu erzeugen. Nachkommen, die die homolog rekombinierte DNA in ihren Keimzellen tragen, können mittels Standardtechniken identifiziert und verwendet werden, um Tiere zu züchten, bei denen alle Zellen des Tiers die homolog rekombinierte DNA enthalten. Knockout-Tiere können beispielsweise durch ihre Fähigkeit charakterisiert werden, sich gegen bestimmte pathologische Zustände zu wehren und durch ihre Entwicklung pathologischer Zustände aufgrund der Abwesenheit des PRO7168-Polypeptids.
Die Wirksamkeit von Antikörpern, die spezifisch an die hierin identifizierten Polypeptide und andere Medikament-Kandidaten binden, können auch bei der Behandlung spontaner Tier-Tumoren getestet werden. Ein geeignetes Ziel für derartige Untersuchungen ist das orale Katzen-Plattenepithelkarzinom (SCC). Orale Katzen-SCC ist ein höchst invasiver, maligner Tumor, der die häufigste orale Malignität von Katzen und für über 60 % der berichteten oralen Tumoren dieser Spezies verantwortlich ist. Er metastasiert selten zu entfernten Stellen, obgleich die niedrige Metastasehäufigkeit lediglich die kurzen Überlabenszeiten für Katzen mit diesem Tumor widerspiegeln könnte. Diese Tumoren sind üblicherweise einer Operation nicht zugänglich, und zwar in erster Linie aufgrund der Anatomie der Katzen-Mundhöhle. Derzeit gibt es keine wirksame Behandlung für diesen Tumor. Vor dem Eintritt in die Studie wird jede Katze einer vollständigen klinischen Untersuchung und Biopsie unterzogen und wird mittels Computertomografie (CT) gescannt. Mit sublingualen oralen Plattenepithel-Tumoren diagnostizierte Katzen werden von der Studie ausgeschlossen. Die Zunge kann als Resultat eines derartigen Tumors paralysiert werden und sogar wenn die Behandlung den Tumor abtötet, wären die Tiere möglicherweise nicht in der Lage, sich selbst zu ernähren. Jede Katze wird wiederholt über einen längeren Zeitraum behandelt. Es werden Fotografien des Tumors täglich während des Behandlungszeitraums und bei jeder nachfolgenden Kontrolluntersuchung angefertigt. Nach der Behandlung wird jede Katze einem weiteren Computertomografie-Scan unterzogen. Computertomografie-Scans und Thorax-Radiografien werden alle 8 Wochen danach beurteilt. Die Daten werden auf Unterschiede hinsichtlich Überleben, Reaktion und Toxizität im Vergleich zu Kontrollgruppen beurteilt. Eine positive Reaktion kann den Nachweis der Tumorregression, vorzugsweise mit Verbesserung der Lebensqualität und/oder erhöhter Lebenszeit erfordern.
Zusätzlich dazu können andere spontane Tier-Tumoren, wie z.B. Fibrosarkom, Adenokarzinom, Lymphom, Chondrom, Leiomyosarkom von Hunden, Katzen und Pavianen ebenfalls getestet werden. Von diesen ist das Mamma-Adenokarzinom bei Hunden und Katzen ein bevorzugtes Modell, da ihr Aussehen und Verhalten jedem beim Menschen sehr ähnlich ist. Jedoch ist die Brauchbarkeit dieses Modells aufgrund des seltenen Auftretens dieses Tumortyps bei Tieren beschränkt.
K. Screeningtests auf Medikament-Kandidaten
Screeningtests auf Medikament-Kandidaten sind so konstruiert, dass Verbindungen identifiziert werden, die an die von den hierin identifizierten Genen kodierten Polypeptide binden oder komplexieren oder die Wechselwirkung der kodierten Proteine mit anderen Zellproteinen anderweitig stören. Derartige Screeningtests umfassen Tests, die einem High-throughput-Screening chemischer Bibliotheken zugänglich sind, wodurch sie insbesondere zur Identifizierung von Medikament-Kandidaten kleiner Molekülgröße geeignet sind. Vorgesehene kleine Moleküle umfassen synthetische organische oder anorganische Verbindungen, einschließlich Peptide, vorzugsweise lösliche Peptide, (Poly)peptid-Immunglobulin-Fusionen und insbesondere Antikörper, einschließlich und ohne Einschränkung poly- und monoklonale Antikörper und Antikörperfragmente, einkettige Antikörper, antiidiotypische Antikörper und chimäre oder humanisierte Versionen derartiger Antikörper und Fragmente, sowie menschliche Antikörper und Antikörperfragmente. Die Tests können in einer Vielzahl von Formaten durchgeführt werden, einschließlich als Protein-Protein-Bindungstests, biochemische Screeningtests, Immuntests und auf Zellen basierende Tests, die auf dem Gebiet der Erfindung gut charakterisiert sind.
Alle Tests haben gemeinsam, dass sie das Kontaktieren des Medikament-Kandidaten mit einem von der hierin identifizierten Nucleinsäure kodierten Polypeptid unter Bedingungen und für eine Zeit erfordern, die ausreicht, um die Wechselwirkung dieser beiden Komponenten zu ermöglichen.
Bei Bindungstests ist die Wechselwirkung die Bindung und der gebildete Komplex kann aus dem Reaktionsgemisch isoliert und nachgewiesen werden. In einer speziellen Ausführungsform wird das vom hierin identifizierten Gen kodierte Polypeptid oder der Medikament-Kandidat an eine Festphase, z.B. an einer Mikrotiterplatte durch kovalente oder nicht-kovalente Anlagerungen immobilisiert. Die nicht-kovalente Anlagerung wird im Allgemeinen durch Beschichten der festen Oberfläche mit einer Lösung des Polypeptids und Trocknen erzielt. Alternativ dazu kann ein immobilisierter Antikörper, z.B. ein für das zu immobilisierende Polypeptid spezifischer monoklonaler Antikörper verwendet werden, um das Polypeptid an einer festen Oberfläche zu verankern. Der Test wird durchgeführt, indem die nicht immobilisierte Komponente, die mit einem detektierbaren Marker markiert sein kann, zur immobilisierten Komponente, z.B. der die verankerte Komponente enthaltenden, beschichteten Oberfläche zugegeben wird. Wenn die Reaktion beendet ist, werden die nichtumgesetzten Komponenten beispielsweise durch Waschen entfernt und die an der festen Oberfläche verankerten Komplexe nachgewiesen. Wenn die ursprünglich nicht immobilisierte Komponente einen detektierbaren Marker trägt, zeigt der Nachweis von an der Oberfläche immobilisiertem Marker an, dass eine Komplexierung aufgetreten ist. Wenn die ursprünglich nicht immobilisierte Komponente keinen Marker trägt, kann eine Komplexierung beispielsweise durch Verwendung eines markierten Antikörpers nachgewiesen werden, der spezifisch an den immobilisierten Komplex bindet.
Wenn die Kandidat-Verbindung mit dem speziellen, von einem hierin identifizierten Gen kodierten PRO7168-Polypeptid wechselwirkt, jedoch nicht daran bindet, kann ihre Wechselwirkung mit diesem Polypeptid mittels Verfahren getestet werden, die für den Nachweis von Protein-Protein-Wechselwirkungen wohlbekannt sind. Derartige Tests umfassen herkömmliche Ansätze, wie z.B. Vernetzung, Co-Immunfällung und Co-Reinigung über Gradienten oder chromatographische Säulen. Außerdem können Protein-Protein-Wechselwirkungen durch Verwendung eines genetischen Systems auf Basis von Hefe wie von Fields und Mitarbeitern beschrieben beobachtet werden (Fields und Song, Nature 340, 245–246 (1989); Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 9578–9582 (1991), wie offenbart von Chevray und Nathans, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 5789–5793 (1991)). Viele Transkriptionsaktivatoren, wie z.B. Hefe-GAL4, bestehen aus zwei physikalisch unterschiedlichen modularen Domänen, wovon eine als DNA-Bindungsdomäne agiert, während die andere als Transkriptionsaktivierungsdomäne agiert. Das in den vorangegangenen Veröffentlichungen beschriebene Hefe-Expressionssystem (allgemein als „Zwei-Hybrid-System" bezeichnet) nützt den Vorteil dieser Eigenschaft aus und setzt zwei Hybridproteine ein, und zwar eines, bei dem das Zielprotein an die DNA-bindende-Domäne von GAL4 fusioniert ist, und ein weiteres, bei dem aktivierende Kandidat-Proteine an die Aktivierungsdomäne fusioniert sind. Die Expression eines GAL1-lacZ-Reporter gens unter der Kontrolle eines GAL4-aktivierten Promotors hängt von der Wiederherstellung der GAL4-Aktivität über Protein-Protein-Wechselwirkung ab. Kolonien, die wechselwirkende Proteine enthalten, werden mit einem chromogenen Substrat für β-Galactosidase nachgewiesen. Ein vollständiges Set (MATCHMAKER^TM) zur Identifizierung von Protein-Protein-Wechselwirkungen zwischen zwei spezifischen Proteinen unter Verwendung der Zwei-Hybrid-Technik ist im Handel von Clontech erhältlich. Dieses System kann auch erweitert werden, um Proteindomänen zu kartieren, die an spezifischen Proteinwechselwirkungen beteiligt sind, sowie um Aminosäurereste genau festzustellen, die für diese Wechselwirkung entscheidend sind.
Verbindungen, welche die Wechselwirkung eines für PRO7168 kodierenden, hierin identifizierten Gens mit anderen intra- oder extrazellulären Komponenten stört, können wie folgt getestet werden: üblicherweise wird ein Reaktionsgemisch, welches das Produkt des amplifizierten Gens und die intra- oder extrazelluläre Komponente enthält, unter Bedingungen und für eine Zeit hergestellt, welche die Wechselwirkung und Bindung der beiden Produkte ermöglicht. Um die Fähigkeit einer Testverbindung zu testen, die Bindung zu hemmen, wird die Reaktion in Abwesenheit und Anwesenheit der Testverbindung durchgeführt. Außerdem kann ein Placebo einem dritten Reaktionsgemisch zugegeben werden, um als Kontrolle zu dienen. Die Bindung (Komplexbildung) zwischen Testverbindung und der intra- oder extrazellulären Verbindung, die in Gemisch vorhanden sind, wird wie hierin oben beschrieben beobachtet. Die Bildung eines Komplexes in der/den Kontrollreaktion(en), nicht jedoch im die Testverbindung enthaltendem Reaktionsgemisch zeigt an, dass die Testverbindung die Wechselwirkung der Testverbindung und ihrem Reaktionspartner stört.
Ein potenzieller PRO7168-Polypeptidantagonist ist ein Antisense-RNA- oder -DNA-Konstrukt, hergestellt unter Verwendung von Antisense-Technologie, worin z.B. ein Antisense-RNA- oder -DNA-Molekül so wirkt, dass es die Translation von mRNA durch Hybridisieren an Target-mRNA und Unterbinden von Proteintranslation blockiert. Antisense-Technologie kann verwendet werden, um Genexpression durch Tripelhelix-Bildung oder durch Antisense-DNA oder -RNA zu steuern, wobei beide Ver fahren auf Bindung eines Polynucleotids an DNA oder RNA basieren. Beispielsweise wird der 5'-Kodierabschnitt der Polynucleotidsequenz, die für das reife PRO7168-Polypeptid hierin kodiert, verwendet, um ein Antisense-RNA-Oligonucleotid mit einer Länge von etwa 10 bis 40 Basenpaare zu entwerfen. Ein DNA-Oligonucleotid wird so entworfen, dass es komplementär zu einer Region des Gens ist, das in Transkription eingebunden ist (Tripelhelix – siehe Lee et al., Nucl. Acids. Res. 6, 3073 (1979); Cooney et al., Science 241, 456 (1988); Dervan et al., Science 251, 1360 (1991)), wodurch Transkription und die Produktion des PRO7168-Polypeptids unterbunden werden. Das Antisense-RNA-Oligonucleotid hybridisiert an die mRNA in vivo und blockiert Translation des mRNA-Moleküls zum PRO7168-Polypeptid (Antisense – Okano, Neurochem. 56, 560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press: Boca Raton, FL (1988)). Die zuvor beschriebenen Oligonucleotide können auch Zellen zugeführt werden, sodass die Antisense-RNA oder -DNA in vivo exprimiert werden kann, um die Produktion des PRO7168-Polypeptids zu hemmen. Wird Antisense-DNA verwendet, so werden Oligodesoxyribonucleotide, die von der Translationsstartstelle, z.B. zwischen den Positionen von etwa –10 und +10 der Targetgen-Nucleotidsequenz, abstammen, bevorzugt.
Antisense-RNA- oder -DNA-Moleküle weisen im Allgemeinen eine Länge von zumindest 5 Basen, eine Länge von etwa 10 Basen, eine Länge von etwa 15 Basen, eine Länge von etwa 20 Basen, eine Länge von etwa 25 Basen, eine Länge von etwa 30 Basen, eine Länge von etwa 35 Basen, eine Länge von etwa 40 Basen, eine Länge von etwa 45 Basen, eine Länge von etwa 50 Basen, eine Länge von etwa 55 Basen, eine Länge von etwa 60 Basen, eine Länge von etwa 65 Basen, eine Länge von etwa 70 Basen, eine Länge von etwa 75 Basen, eine Länge von etwa 80 Basen, eine Länge von etwa 85 Basen, eine Länge von etwa 90 Basen, eine Länge von etwa 95 Basen, eine Länge von etwa 100 Basen oder mehr auf.
Ribozyme sind enzymatische RNA-Moleküle, die in der Lage sind, die spezifische Spaltung von RNA zu katalysieren. Ribozyme wirken durch sequenzspezifische Hybridisierung an die komplementäre Target-RNA, gefolgt von endonucleolytischer Spaltung. Spezifische Ribozym-Spaltungsstellen innerhalb eines potenziellen RNA- Targets können durch bekannte Verfahren identifiziert werden. Für nähere Details siehe z.B. Rossi, Current Biology 5, 469–471 (1994), und die PCT-Veröffentlichung Nr. WO 97/33551 (veröffentlicht am 18. September 1997).
Nucleinsäuremoleküle in Tripelhelix-Formation, die verwendet werden, um Transkription zu hemmen, sollten einzelsträngig und aus Desoxynucleotiden zusammengesetzt sein. Die Basenzusammensetzung dieser Oligonucleotide ist so bestimmt, dass sie Tripelhelix-Formation gemäß den Hoogsteen-Basenpaarungsregeln fördert, die im Allgemeinen relativ große Abschnitte mit Purinen oder Pyrimidinen an einem Strang eines Duplex erfordern. Für nähere Details siehe z.B. die PCT-Veröffentlichung Nr. WO 97/33551 , s.o.
Diese kleinen Moleküle können durch einen oder mehrere der Screeningtests, die hierin erläutert werden, und/oder durch irgendein anderes Screeningverfahren, das Fachleuten bekannt ist, identifiziert werden.
L.
Antisense- und Ribozym-Moleküle, Tripelhelix-Moleküle usw. hemmen die Expression und/oder Aktivität des Ziel-Genprodukts.
Beispielsweise wirken Antisense-RNA und RNA-Molekül, um die Translation von mRNA durch Hybridisieren an Target-mRNA und Verhinderung der Proteintranslation direkt zu blockieren. Wenn Antisense-DNA verwendet wird, sind Oligodesoxyribonucleotide bevorzugt, die von der Translationsinitiationsstelle stammen, z.B. von einer Position zwischen ungefähr –10 und +10 der Ziel-Gen-Nucleotidsequenz.
Ribozyme sind enzymatische RNA-Moleküle, die fähig sind, die spezifische Spaltung von RNA zu katalysieren. Ribozyme agieren durch sequenzspezifische Hybridisierung an die komplementäre Ziel-RNA, gefolgt von endonucleolytischer Spaltung. Spezifische Ribozym-Spaltstellen innerhalb eines potentiellen RNA-Ziels können mit Hilfe bekannter Techniken identifiziert werden. Für weitere Einzelheiten siehe z.B. Rossi, Current Biology 4, 469–471 (1994) und PCT-Veröffentlichung Nr. WO 97/33551 (veröffentlicht am 18.September 1997).
Nucleinsäuremoleküle in Tripelhelix-Formation, die zur Hemmung der Transkription verwendet werden, sollten einzelsträngig und aus Desoxynucleotiden zusammengesetzt sein. Die Basenzusammensetzung dieser Oligonucleotide ist so konstruiert, dass sie die Tripelhelix-Bildung über Hoogsteen-Basenpaarungsgesetz fördert, was im Allgemeinen beträchtliche Abschnitte von Purinen oder Pyrimidinen an einem Strang eines Duplex erfordert. Für weitere Einzelheiten siehe z.B. PCT-Veröffentlichung Nr. WO 97/33551 , s.o.
Diese Moleküle können durch ein beliebiges oder durch jegliche Kombination der hierin oben erörterten Screeningtests und/oder durch jegliche andere Screeningtests identifiziert werden, die dem Fachkundigen auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannt sind.
M. Antikörper
1. Polyklonale Antikörper
Verfahren zur Herstellung polyklonaler Antikörper sind dem Fachmann bekannt. Polyklonale Antikörper können in einem Säugetier hergestellt werden, beispielsweise durch eine oder mehrere Injektionen eines immunisierenden Mittels und, falls erwünscht, eines Adjuvans. Typischerweise wird das immunisierende Mittel und/oder Adjuvans durch mehrfache subkutane oder intraperitoneale Injektionen in das Säugetier injiziert. Das immunisierende Mittel kann das PRO7168-Polypeptid oder ein Fusionsprotein davon umfassen. Es kann zweckdienlich sein, das immunisierende Mittel an ein Protein zu konjugieren, das im zu immunisierenden Säugetier bekanntermaßen immunogen ist. Beispiele derartiger immunogener Proteine umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin, Serumalbumin, Rinderthyroglobulin und Sojabohnen-Trypsininhibitor. Beispiele für Adjuvantien, die eingesetzt werden können, umfassen Freund'sches komplettes Adjuvans und MPL-TDM-Adjuvans (Monophosphoryl-Lipid A, synthetisches Trehalose-Dicorynomycolat). Das Immunisierungsprotokoll kann von einem Fachmann auf dem Gebiet der Erfindung ohne übermäßiges Experimentieren gewählt werden.
2. Monoklonale Antikörper
Die Anti-PRO7168-Antikörper können alternativ dazu monoklonale Antikörper sein. Monoklonale Antikörper können unter Verwendung von Hybridomverfahren, wie z.B. jenen von Kohler und Milstein, Nature 256, 495 (1975) beschriebenen hergestellt werden. Bei einem Hybridomverfahren wird eine Maus, ein Hamster oder ein anderes geeignetes Wirtstier typischerweise mit einem immunogenen Mittel immunisiert, um Lymphozyten hervorzurufen, die Antikörper produzieren oder dazu fähig sind, Antikörper zu produzieren, die spezifisch an das immunisierende Mittel binden. Alternativ dazu können die Lymphozyten in vitro immunisiert werden.
Das immunisierende Mittel wird typischerweise das PRO7168-Polypeptid, einschließlich Fragmente oder ein Fusionsprotein einer derartigen Proteins oder eines Fragments davon, umfassen. Im Allgemeinen werden entweder Peripherblut-Lymphozyten („PBLs") verwendet, falls Zellen menschlichen Ursprungs gewünscht sind, oder Milzzellen oder Lymphknotenzellen, falls nicht-menschliche Säugetierquellen gewünscht sind. Die Lymphozyten werden dann mit einer immortalisierten Zelllinie unter Verwendung eines geeigneten Fusionierungsmittels, wie z.B. Polyethylenglykol fusioniert, um eine Hybridomzelle zu bilden (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, S. 59–103 (1986)). Immortalisierte Zelllinien sind üblicherweise transformierte Säugetierzellen, insbesondere Myelomzellen von Nagern, Rindern oder menschlichen Ursprungs. Üblicherweise werden Ratten- oder Maus-Myelomzelllinien eingesetzt. Die Hybridomzellen können in einem geeigneten Kulturmedium kultiviert werden, das vorzugsweise eine oder mehrere Substanzen enthält, die das Wachstum oder Überleben nicht fusionierter, immortalisierter Zellen hemmt. Wenn beispielsweise den elterlichen Zellen das Enzym Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase (HGPRT oder HPRT) fehlt, wird das Medium typi scherweise Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin („HAT-Medium") umfassen, wobei diese Substanzen das Wachstum HGPRT-defizienter Zellen verhindert.
Bevorzugte immortalisierte Zelllinien sind jene, die effizient fusionieren, eine stabile Expression des Antikörpers durch die selektierten Antikörper-produzierenden Zellen im hohen Ausmaß aufrecht erhalten und gegen ein Medium, wie z.B. HAT-Medium empfindlich sind. Bevorzugtere immortalisierte Zelllinien sind Maus-Myelomlinien, die beispielsweise vom Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Kalifornien und der American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, Virginia erhalten werden können. Menschliche Myelom- und Maus-Mensch-Heteromyelomzelllinien sind zur Produktion menschlicher monoklonaler Antikörper ebenfalls beschrieben worden (Kozbor, J. immunol. 133, 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker Inc., New York, S. 51–63 (1987)).
Das Kulturmedium, in dem die Hybridomzellen kultiviert werden, kann dann auf die Gegenwart von Antikörpern getestet werden, die gegen PRO7168 gerichtet sind. Vorzugsweise wird die Bindungsspezifität der von den Hybridomzellen produzierten monoklonalen Antikörper mittels Immunopräzipitation oder durch einen In-vitro-Bindungstest, wie z.B. Radioimmuntest (RIA) oder Enzyme-linked-immunoabsorbentassay (ELISA) ermittelt. Derartige Techniken und Tests sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Die Bindungsaffinität des monoklonalen Antikörpers kann beispielsweise mittels Scatchard-Analyse von Munson und Pollard, Anal. Biochem. 107, 220 (1980) ermittelt werden.
Nachdem die gewünschten Hybridomzellen identifiziert worden sind, können die Klone durch Grenzverdünnungsverfahren subkloniert und mittels Standardverfahren gezüchtet werden (Goding, s.o.). Geeignete Kulturmedien zu diesem Zweck umfassen beispielsweise Dulbecco's Modified Eagle's Medium und RPMI-1640-Medium. Alternativ dazu können die Hybridomzellen in vivo als Aszites in einem Säugetier gezüchtet werden.
Die von den Subklonen sekretierten monoklonalen Antikörper können durch herkömmliche Immunglobulin-Reinigungsverfahren, wie z.B. Protein A-Sepharose, Hydroxylapatitchromatographie, Gelelektrophorese, Dialyse oder Affinitätschromatographie aus dem Kulturmedium oder Aszites isoliert oder gereinigt werden.
Die monoklonalen Antikörper können außerdem durch DNA-Rekombinationsverfahren hergestellt werden, wie z.B. jene, die im US-Patent Nr. 4.816.567 beschrieben sind. Für die monoklonalen Antikörper der Erfindung kodierende DNA kann unter Verwendung herkömmlicher Verfahren (z.B. durch Verwendung von Oligonucleotidsonden, die fähig sind, spezifisch an Gene zu binden, die für die Schwer- und Leichtketten von Maus-Antikörpern kodieren) leicht isoliert und sequenziert werden. Die Hybridomzellen der Erfindung dienen als bevorzugte Quelle derartiger DNA. Wenn sie einmal isoliert ist, kann die DNA in Expressionsvektoren gesetzt werden, die dann in Wirtszellen, wie z.B. Simian-COS-Zellen, Chinahamsterovarial- (CHO-) Zellen oder Myelomzellen transfiziert werden, die ansonsten kein Immunglobulinprotein produzieren, um die Synthese monoklonaler Antikörper in den rekombinanten Wirtszellen zu erzielen. Die DNA kann auch modifiziert werden, beispielsweise durch Substituieren der kodierenden Sequenz für konstante Schwer- und Leichtkettendomänen anstelle der homologen Maus-Sequenzen ( US-Patent Nr. 4. 816.567 ; Morrison et al., s.o.) oder durch kovalentes Verbinden der gesamten oder eines Teils der kodierenden Sequenz für ein Nicht-Immunglobulin-Polypeptid mit der für Immunglobulin kodierenden Sequenz. Die konstanten Domänen eines Antikörpers der Erfindung oder die variablen Domänen einer der Antigen-kombinierenden Stellen eines Antikörpers der Erfindung können durch ein derartiges Nicht-Immunglobulin-Polypeptid ersetzt werden, um einen chimären bivalenten Antikörper zu erzeugen.
Die Antikörper können monovalente Antikörper sein. Verfahren zur Herstellung monovalenter Antikörper sind auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannt. Beispielsweise umfasst eines der Verfahren die rekombinante Expression der Immunglobulin-Leichtkette und der modifizierten Schwerkette. Die Schwerkette ist im Allgemeinen an einer beliebigen Stelle in der Fc-Region trunkiert, um die Schwerkettenvernetzung zu verhindern. Alternativ dazu werden die maßgeblichen Cysteinreste mit einem an deren Aminosäurerest substituiert oder werden deletiert, um eine Vernetzung zu verhindern.
In-vitro-Verfahren sind zur Herstellung monovalenter Antikörper ebenfalls geeignet. Der Verdau von Antikörpern, um Fragmente davon, insbesondere Fab-Fragmente herzustellen, kann unter Verwendung von Routinetechniken, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, erzielt werden.
3. Menschliche und humanisierte Antikörper
Die Anti-PRO7168-Antikörper können außerdem humanisierte oder menschliche Antikörper umfassen. Humanisierte Formen nicht-menschlicher (z.B. Maus-) Antikörper sind chimäre Immunglobuline, Immunglobulinketten oder Fragmente davon (wie z.B. Fv, Fab, Fab', F(ab')₂ oder andere antigenbindende Untersequenzen von Antikörpern), die eine vom nicht-menschlichen Immunglobulin stammende Minimalsequenz enthalten. Humanisierte Antikörper umfassen menschliche Immunglobuline (Empfänger-Antikörper), in denen Reste einer Complementary-determining-region (CDR) des Empfängers durch Reste einer CDR einer nicht-menschlichen Spezies (Spender-Antikörper), wie z.B. Maus, Ratte oder Kaninchen mit der gewünschten Spezifität, Affinität und Kapazität ersetzt sind. In manchen Fällen werden Fv-Gerüstregionen des menschlichen Immunglobulins durch entsprechende nicht-menschliche Reste ersetzt. Humanisierte Antikörper können außerdem Reste umfassen, die sich weder im Empfänger-Antikörper, noch in den importierten CDR- oder Gerüstsequenzen finden. Im Allgemeinen umfasst der humanisierte Antikörper im Wesentlichen alle von zumindest einer und typischerweise zwei variablen Domänen, in denen alle oder im Wesentlichen alle der CDR-Regionen jenen des nicht-menschlichen Immunglobulins entsprechen und alle oder im Wesentlichen alle der FR-Regionen jene einer menschlichen Immunglobulin-Konsensussequenz sind. Der humanisierte Antikörper umfasst im Optimalfall außerdem zumindest einen Teil einer konstanten Immunglobulinregion (Fc), typischerweise jenen eines menschlichen Immunglobulins (Jones et al., Nature 321, 522–525 (1986); Riechmann et al., Nature 332, 323–329 (1988); und Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2, 593–596 (1992)).
Verfahren zur Humanisierung nicht-menschlicher Antikörper sind auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannt. Im Allgemeinen weist ein humanisierter Antikörper einen oder mehrere Aminosäurereste auf, die aus einer nicht-menschlichen Quelle in diesen eingeführt sind. Diese nicht-menschlichen Aminosäurereste werden häufig als „Import"-Reste bezeichnet, die typischerweise einer variablen „Import"-Domäne entnommen sind. Die Humanisierung kann im Wesentlichen nach dem Verfahren von Winter et al. (Jones et al., Nature 321, 522–525 (1986); Riechmann et al., Nature 332, 323–327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239, 1534–1536 (1988)) durchgeführt werden, indem die entsprechenden Sequenzen eines menschlichen Antikörpers durch Nager-CDRs oder CDR-Sequenzen substituiert werden. Demgemäß sind derartige „humanisierte" Antikörper chimäre Antikörper( US-Patent Nr. 4.816.567 ), worin im Wesentlichen weniger als eine intakte menschliche variable Domäne mit der entsprechenden Sequenz aus einer nicht-menschlichen Spezies substituiert worden ist. In der Praxis sind humanisierte Antikörper typischerweise menschlichen Antikörper, bei denen manche CDR-Reste und möglicherweise manche FR-Reste durch Reste aus analogen Stellen in Nager-Antikörpern substituiert sind.
Menschliche Antikörper können ebenfalls hergestellt werden, und zwar unter Verwendung verschiedener, auf dem Gebiet der Erfindung bekannter Techniken, einschließlich Phagen-Display-Bibliotheken (Hoogenboom und Winter, J. Mol. Biol. 227, 381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581 (1991)). Die Techniken von Cole et al. und Boerner et al. sind zur Herstellung menschlicher monoklonaler Antikörper ebenfalls verfügbar (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, S. 77 (1985) und Boerner et al., J. Immunol. 147(1), 86–95 (1991)). Gleichermaßen können menschliche Antikörper durch Einführen menschlicher Immunglobulin-Loci in transgene Tiere hergestellt werden, z.B. in Mäuse, bei denen die endogenen Immunglobulingene teilweise oder vollständig inaktiviert worden sind. Bei Exposition wird eine Produktion menschlicher Antikörper beobachtet, die der im Menschen beobachteten in allen Aspekten, einschließlich Gen-Umordnung, Assemblierung und Antikörper-Repertoire sehr nahe kommt. Dieser Ansatz wird beispielsweise in den US-Patenten Nr. 5.545.807 ; 5.545.806 ; 5.569.852 ; 5.625.126 ; 5.633.425 ; 5.661.016 und in den folgenden wissenschaftlichen Veröffentlichungen beschrieben: Marks et al., Bio/ Technology 10, 779–783 (1992); Lonberg et al., Nature 368, 856–859 (1994); Morrison, Nature 368, 812–13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845–51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996); Lonberg und Huszar, intern. Rev. Immunol. 13, 65–93 (1995).
5. Bispezifische Antikörper
Bispezifische Antikörper sind monoklonale, vorzugsweise menschliche oder humanisierte, Antikörper, die Bindungsspezifitäten für zumindest zwei verschiedene Antigene aufweisen. Im vorliegenden Fall ist eine der Bindungsspezifitäten für das PRO7168, die andere ist für jedes beliebige andere Antigen, und vorzugsweise für ein(en) Zelloberflächen-Protein oder -Rezeptor oder eine Rezeptoruntereinheit.
Verfahren zur Herstellung bispezifischer Antikörper sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Herkömmlicherweise basiert die Produktion von bispezifischen Antikörpern auf der Co-Expression von zwei Immunglobulin-Schwerketten/Leichtketten-Paaren, worin die zwei schweren Ketten unterschiedliche Spezifitäten aufweisen (Milstein & Cuello, Nature 305, 537–539 (1983)). Aufgrund der zufälligen Auswahl an Immunglobulinschwer- und -leichtketten produzieren diese Hybridome (Quadrome) ein potenzielles Gemisch von zehn verschiedenen Antikörpermolekülen, von denen nur eines die korrekte bispezifische Struktur aufweist. Die Reinigung des korrekten Moleküls erfolgt üblicherweise durch Affinitätschromatographieschritte. Ähnliche Verfahren sind in der WO 93/08829 , veröffentlicht am 13. Mai 1993, und in Traunecker et al., EMBO J. 10, 3655–3659 (1991), offenbart.
Variable Antikörperdomänen mit den erwünschten Bindungsspezifitäten (Antikörper-Antigen-Kombinationsstellen) können an Immunglobulinkonstantdomänen-Sequenzen fusioniert werden. Die Fusion erfolgt vorzugsweise mit einer Immunglobulin-Schwerkettenkonstantdomäne, umfassend zumindest einen Teil der Gelenks-, CH2- und CH3-Regionen. Es wird bevorzugt, dass die erste Schwerketten-Konstantregion (CH1) die Stelle enthält, die für Leichtkettenbindung, vorhanden in zumindest einer der Fusionen, erforderlich ist. DNAs, die für die Immunglobulin-Schwerkettenfusio nen und, sofern erwünscht, für die Immunglobulin-Leichtkette kodieren, werden in getrennte Expressionsvektoren insertiert und werden in geeignete Wirtsorganismen co-transfiziert. Für nähere Details zur Herstellung von bispezifischen Antikörpern siehe beispielsweise Suresh et al., Methods in Enzymology 121, 210 (1986).
Gemäß einem anderen Ansatz, der in der WO 96/27011 beschrieben wird, kann die Grenzfläche zwischen einem Paar von Antikörpermolekülen bearbeitet werden, um den Prozentsatz an Heterodimeren, die aus rekombinanter Zellkultur gewonnen werden, zu maximieren. Die bevorzugte Grenzfläche umfasst zumindest einen Teil der CH3-Region einer konstanten Antikörperdomäne. In diesem Verfahren werden eine oder mehr kurze Aminosäureseitenketten von der Grenzfläche des ersten Antikörpermoleküls durch längere Seitenketten (z.B. Tyrosin oder Tryptophan) ersetzt. Kompensations-"Hohlräume" von identischer oder ähnlicher Größe wie die lange(n) Seitenkette(n) werden an der Grenzfläche des zweiten Antikörpermoleküls durch Ersetzen der langen Aminosäureseitenketten durch kürzere (z.B. Alanin oder Threonin) geschaffen. Dies liefert einen Mechanismus zur Steigerung der Ausbeute des Heterodimers im Vergleich zu unerwünschten Endprodukten wie beispielsweise Homodimeren.
Bispezifische Antikörper können als Volllängenantikörper oder Antikörperfragmente (z.B. bispezifische F(ab')₂-Antikörper) hergestellt werden. Verfahren zur Herstellung bispezifischer Antikörper aus Antikörperfragmenten wurden in der Literatur bereits beschrieben. Beispielsweise können bispezifische Antikörper unter Verwendung chemischer Bindung hergestellt werden. Brennan et al., Science 229, 81 (1985), beschreiben ein Verfahren, worin intakte Antikörper proteolytisch gespaltet werden, um F(ab')₂-Fragmente zu bilden. Diese Fragmente werden in Gegenwart des Dithiol-Komplexbildners Natriumarsenit reduziert, um vicinale Dithiole zu stabilisieren und intermolekulare Disulfidbildung zu unterbinden. Die gebildeten Fab'-Fragmente werden dann zu Thionitrobenzoat- (TNB-) Derivaten umgesetzt. Eines der Fab'-TNB-Derivate wird dann zum Fab'-Thiol durch Reduktion mit Mercaptoethylamin rekonvertiert und mit einer äquimolaren Menge des anderen Fab'-TNB-Derivats vermischt, um den bispezifischen Antikörper zu bilden. Die produzierten bispezifischen Antikör per können als Mittel für die selektive Immobilisierung von Enzymen verwendet werden.
Fab'-Fragmente können direkt aus E. coli gewonnen und chemisch gebunden werden, um bispezifische Antikörper zu bilden. Shalaby et al., J. Exp. Med. 175, 217–225 (1992), beschreiben die Produktion eines vollständig humanisierten bispezifischen F(ab')₂-Antikörper-Moleküls. Jedes Fab'-Fragment wurde separat aus E. coli sekretiert und gerichteter chemischer Bindung in vitro unterzogen, um den bispezifischen Antikörper zu bilden. Der so gebildete bispezifische Antikörper war in der Lage, sich an Zellen zu binden, die den ErbB2-Rezeptor überexprimierten, sowie an normale menschliche T-Zellen, und konnte die lytische Aktivität menschlicher zytotoxischer Lymphozyten gegen menschliche Brusttumortargets steigern.
Verschiedene Techniken zur Herstellung und Isolierung bispezifischer Antikörperfragmente direkt aus rekombinanten Zellkulturen wurden auch beschrieben. Beispielsweise wurden bispezifische Antikörper unter Verwendung von Leucin-Zipper hergestellt. Kostelny et al., J. Immunol. 148(5), 1547–1553 (1992). Die Leucin-Zipper-Peptide aus den Fos- und Jun-Proteinen wurden an die Fab'-Abschnitte von zwei verschiedenen Antikörpern durch Genfusion gebunden. Die Antikörper-Homodimere wurden an der Gelenksregion reduziert, um Monomere zu bilden, und dann reoxidiert, um die Antikörper-Heterodimere zu bilden. Dieses Verfahren kann auch zur Herstellung von Antikörper-Homodimeren verwendet werden. Die von Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6444–6448 (1993), beschriebene „Diabody"-Technologie stellt einen alternativen Mechanismus zur Herstellung bispezifischer Antikörperfragmente bereit. Die Fragmente umfassen eine variable Schwerkettendomäne (V_H), die über einen Linker an eine variable Leichtkettendomäne (V_L) gebunden ist, der zu kurz ist, um Paarung zwischen den zwei Domänen an derselben Kette zu ermöglichen. Demgemäß werden die V_H- und V_L-Domänen eines Fragments gezwungen, Paare mit den komplementären V_L- und V_H-Domänen eines anderen Fragments zu bilden, wodurch zwei Antigen-Bindungsstellen gebildet werden. Auch eine andere Vorgehensweise zur Herstellung bispezifischer Antikörperfragmente durch die Ver wendung von einkettigen Fv- (sFv-) Dimeren wurde bereits beschrieben. Siehe Gruber et al., J. Immunol. 152, 5368 (1994).
Antikörper mit mehr als zwei Wertigkeiten werden ebenfalls erwogen. Beispielsweise können tispezifische Antikörper hergestellt werden. Tutt et al., J. Immunol. 147, 60 (1991).
Beispielhafte bispezifische Antikörper können sich an zwei verschiedene Epitope an einem gegebenen Polypeptid der vorliegenden Erfindung binden. Alternativ dazu kann ein Anti-Polypeptidarm mit einem Arm kombiniert werden, der sich an ein Trigger-Molekül an einem Leukozyten wie beispielsweise ein T-Zellrezeptormolekül (z.B. CD2, CD3, CD28 oder B7) oder Fc-Rezeptoren für IgG (FcγR), wie z.B. FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) und FcγRIII (CD16), bindet, sodass zelluläre Abwehrmechanismen auf die Zelle fokussiert werden, die das bestimmte Polypeptid exprimiert. Bispezifische Antikörper können auch verwendet werden, um zytotoxische Mittel an Zellen lokalisieren, die eihn bestimmtes Polypeptid exprimieren. Diese Antikörper besitzen einen Bindungsarm und einen Arm, der ein zytotoxisches Mittel oder einen Radionuclidchelatbildner bindet, wie z.B. EOTUBE, DPTA, DOTA oder TETA. Ein anderer bispezifischer Antikörper von Interesse bindet das Polypeptid und bindet weiters Gewebefaktor („tissue factor", TF).
6. Heterokonjugierte Antikörper
Heterokonjugierte Antikörper setzen sich aus zwei kovalent gebundenen Antikörpern zusammen. Solche Antikörper wurden beispielsweise vorgeschlagen, um Immunsystemzellen auf unerwünschte Zellen zu richten [ US-Patent Nr. 4.676.980 ] sowie zur Behandlung von HIV-Infektion [ WO 91/00360 ; WO 92/200373 ; EP 03089 ]. Es wird erwogen, dass die Antikörper in vitro unter Verwendung von Verfahren, die auf dem Gebiet der synthetischen Proteinchemie bekannt sind, hergestellt werden können, einschließlich jener, die Vernetzungsmittel einbinden. Beispielsweise können Immunotoxine unter Verwendung einer Disulfid-Austauschreaktion oder durch Bildung ei ner Thioetherbindung konstruiert werden. Beispiele für geeignete Reagenzien für diesen Zweck umfassen Iminothiolat und Methyl-4-mercaptobutyrimidat sowie jene Reagenzien, die beispielsweise im US-Patent Nr. 4.676.980 offenbart sind.
7. Effektorfunktionsbearbeitung
Es kann wünschenswert sein, den Antikörper der Erfindung beispielsweise hinsichtlich der Effektorfunktion zu modifizieren. Beispielsweise können ein oder mehrere Cysteinreste in die Fc-Region eingeführt werden, wodurch die Bildung von Disulfidbindungen zwischen den Ketten in dieser Region ermöglicht wird. Der so gebildete homodimere Antikörper kann verbesserte Internalisierungsfähigkeit und/oder gesteigerte komplementvermittelte Zellabtötung und antikörpervermittelte zelluläre Zytotoxizität (ADCC) aufweisen. Siehe Caron et al., J. Exp. Med. 176, 1191–1195 (1992), und Shopes, J. Immunol. 148, 2918–2922 (1992). Homodimere Antikörper mit gesteigerter Anti-Tumor-Aktivität können auch unter Verwendung heterobifunktioneller Vernetzer hergestellt werden, wie in Wolff et al., Cancer Research 53, 2560–2565 (1993), beschrieben wird. Alternativ dazu kann ein Antikörper so bearbeitet werden, dass er duale Fc-Regionen aufweist und dadurch über gesteigerte Komplementlyse- und ADCC-Fähigkeiten verfügen kann. Siehe Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3, 219–230 (1989).
B. Immunkonjugate
Immunkonjugate, die einen Antikörper umfassen, der an ein zytotoxisches Mittel wie beispielsweise ein chemotherapeutisches Mittel, Toxin (z.B. ein enzymatisch aktives Toxin oder ein Toxin bakteriellen, pflanzlichen oder tierischen Ursprungs oder auch von Pilzen oder Fragmente davon oder ein kleinmolekulares Toxin) oder an ein radioaktives Isotop (d.h. ein Radiokonjugat) konjugiert ist, können hergestellt werden.
Chemotherapeutische Mittel, die zur Herstellung solcher Immunkonjugate nützlich sind, wurden oben beschrieben. Enzymatisch aktive Protein-Toxine und Fragmente davon, die verwendet werden können, umfassen Diphtherie-A-Kette, nichtbindende aktive Fragmente von Diphtherietoxin, Choleratoxin, Botulinustoxin, Exotoxin-A-Kette (aus Pseudomonas aeruginosa), Ricin-A-Kette, Abrin-A-Kette, Modeccin-A-Kette, α-Sarcin, Aleurites-fordii-Proteine, Dianthin-Proteine, Phytolaca-americana-Proteine (PAPI, PAPII und PAP-S), Momordica-charantia-Inhibitor, Curcin, Crotin, Sapaonaria-officinalis-Inhibitor, Gelonin, Saporin, Mitogellin, Restrictocin, Phenomycin, Enomycin und die Tricothecene. Kleinmolekulare Toxine umfassen beispielsweise Calicheamincine, Maytansinoide, Palyoxin und CC1065. Zahlreiche verschiedene Radionuclide sind zur Herstellung von radiokonjugierten Antikörpern erhältlich. Beispiele umfassen ²¹²Bi, ¹³¹I, ¹³¹In, ⁹⁰Y und ¹⁸⁶Re.
Konjugate des Antikörpers und des zytotoxischen Mittels werden unter Verwendung zahlreicher verschiedener bifunktioneller Proteinbindungsmittel wie z.B. N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithiol)propionat (SPDP), Iminothiolan (IT), bifunktionellen Derivaten von Imidoestern (wie z.B. Dimethyladipimidat-HCl), aktiver Ester (wie z.B. Disuccinimidylsuberat), Aldehyden (wie Glutaraldehyd), Bisazido-Verbindungen (wie z.B. Bis(p-azidobenzoyl)hexandiamin), Bisdiazonium-Derivaten (wie z.B. Bis(p-diazoniumbenzoyl)ethylendiamin), Diisocyanaten (wie Toluol-2,6-diisocyanat) und bis-aktiven Fluorverbindungen (wie z.B. 1,5-Difluor-2,4-dinitrobenzol) hergestellt. Beispielsweise kann ein Ricinimmunotoxin wie in Vitetta et al., Science 238, 1098 (1987), beschrieben hergestellt werden. C-14-markierte 1-Isothiocyanatobenzyl-3-methyldiethylentriaminpentaessigsäure (MX-DTPA) ist ein beispielhafter Chelatbildner zur Konjugation von Radionucleotid an den Antikörper. Siehe die WO 94/11026 .
In einer anderen Ausführungsform kann der Antikörper an einen „Rezeptor" (wie Streptavidin) zur Verwendung bei Tumor-Pretargeting konjugiert werden, worin das Antikörper-Rezeptor-Konjugat dem Patienten verabreicht wird, gefolgt von der Entfernung ungebundenen Konjugats aus dem Blutkreislauf unter Verwendung eines Klärungsmittels und der anschließenden Verabreichung eines „Liganden" (z.B. Avidin), der an ein zytotoxisches Mittel (z.B. ein Radionucleotid) konjugiert ist.
9. Immunoliposomen
Die hierin offenbarten Antikörper können auch als Immunoliposomen formuliert werden. Liposomen, die den Antikörper enthalten, werden durch auf dem Gebiet der Erfindung bekannte Verfahren hergestellt, wie sie beispielsweise in Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4030 (1980); und den US-Patenten Nr. 4.485.045 und 4.544.545 beschrieben werden. Liposomen mit gesteigerter Zirkulationsdauer sind im US-Patent Nr. 5.013.556 offenbart.
Besonders nützliche Liposomen können durch das Umkehrphasen-Vverdampfungsverfahren mit einer Lipidzusammensetzung, die Phosphatidylcholin, Cholesterin und PEG-derivatisiertes Phosphatidylethanolamin (PEG-PE) umfasst, hergestellt werden. Liposomen werden durch Filter von definierter Porengröße filtriert, um Liposomen mit dem erwünschten Durchmesser zu ergeben. Fab'-Fragmente des Antikörpers der vorliegenden Erfindung können an die Liposomen wie in Martin et al., J. Biol. Chem. 257, 286–288 (1982), beschrieben mittels einer Disulfid-Austauschreaktion konjugiert werden. Ein Chemotherapeutikum (wie beispielsweise Doxorubicin) ist gegebenenfalls im Liposom enthalten. Siehe Gabizon et al., J. National Cancer Inst. 81(19), 1484 (1989).
Q. Diagnose und Prognose von Tumoren
Während Zelloberflächenproteine, wie z.B. in gewissen Tumoren überexprimierte Wachstumsrezeptoren hervorragende Ziele für Medikament-Kandidaten oder Tumor- (z.B. Krebs-) Behandlung sind, finden dieselben Proteine gemeinsam mit sekretierten, von den in Tumorzellen amplifizierten Genen kodierten Proteinen weitere Anwendungen bei der Diagnose und Prognose von Tumoren. Beispielsweise können Antikörper, die gegen Proteinprodukte von in Tumorzellen amplifizierten Genen gerichtet sind, als Tumor-Diagnostika oder Prognostika verwendet werden. Beispielsweise können Antikörper, einschließlich Antikörperfragmente, verwendet werden, um die Expression der von den amplifizierten Genen kodierten Proteine („Markergenprodukte") qualitativ oder quantitativ nachzuweisen. Der Antikörper ist vorzugsweise mit einem detektierbaren, z.B. fluoreszierenden Marker ausgestattet, und die Bindung kann mittels Lichtmikroskopie, Durchflusszytometrie oder anderen auf dem Gebiet der Erfindung bekannten Techniken beobachtet werden. Diese Techniken sind besonders geeignet wenn das amplifizierte Gen für ein Zelloberflächenprotein, z.B. einen Wachstumsfaktor kodiert. Derartige Bindungstests werden im Wesentlichen wie im obigen Abschnitt 5 beschrieben durchgeführt.
Der In-situ-Nachweis der Antikörperbindung an die Markergenprodukte kann beispielsweise mittels Immunfluoreszenz oder Immunelektronenmikroskopie durchgeführt werden. Zu diesem Zweck wird eine histologische Probe aus dem Patienten entfernt und ein markierter Antikörper auf diese vorzugsweise durch Überschichten der biologischen Probe mit dem Antikörper aufgebracht. Dieses Verfahren ermöglicht die Bestimmung der Verteilung des Markergenprodukts im untersuchten Gewebe. Für den qualifizierten Fachmann ist offensichtlich, dass eine breite Vielfalt an histologischen Verfahren für den In-situ-Nachweis leicht verfügbar ist.
Die folgenden Beispiele werden ausschließlich zu illustrativen Zwecken bereitgestellt und beabsichtigen in keiner Weise eine Einschränkung des Schutzumfangs der vorliegenden Erfindung.
BEISPIELE
Im Handel erhältliche Reagenzien, auf die in den Beispielen Bezug genommen wird, wurden, sofern nicht anders angegeben, gemäß den Anleitungen des Herstellers verwendet. Die Quelle jener Zellen, die in den folgenden Beispielen und in der gesamten Patentbeschreibung durch ATCC-Zugangsnummern gekennzeichnet sind, ist die American Type Culture Collection, Manassas, VA. Alle Originalhinterlegungen, auf die in der vorliegenden Anmeldung Bezug genommen wird, erfolgten gemäß den Vorschriften des Budapester Vertrages über die internationale Anerkennung der Hin terlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren und den darunter gültigen Bestimmungen (Budapester Vertrag). Dies sichert die Erhaltung einer lebensfähigen Kultur der Hinterlegung 30 Jahre lang ab dem Zeitpunkt der Hinterlegung. Die Hinterlegungen werden von der ATCC gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrages und gemäß einem Abkommen zwischen Genentech, Inc., und ATCC verfügbar gemacht, das permanente und uneingeschränkte Verfügbarkeit der Nachkommenschaft der Kultur der Hinterlegung für die Öffentlichkeit bei Ausgabe des betreffenden US-Patents oder bei Offenlegung für die Öffentlichkeit entweder der US- oder einer ausländischen Patentanmeldung, je nachdem, was zuerst kommt, garantiert und das die Verfügbarkeit der Nachkommenschaft für jemanden, der durch den Präsident des Patentamts der Vereinigten Staaten hierzu gemäß 35 USC § 122 und den dazu gültigen Bestimmungen (einschließlich 37 CFR § 1.14 unter besonderem Verweis auf 886 OG 638) befugt ist, sicherstellt.
Sofern nicht anders angegeben, verwendet die vorliegende Erfindung Standardverfahren der DNA-Rekombinationstechnologie, wie z.B. jene, die hierin oben und in den folgenden Lehrbüchern beschrieben sind: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laborstory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y. (1989); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989); Innis et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press Inc., N.Y. (1990); Harlow et al., Antibodies: A Laborstory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor (1988); M.J. Gait, Oligonucleotide Synthesis, IRL Press, Oxford (1984); R.I. Freshney, Animal Cell Culture (1987); Coligan et al., Current Protocols in Immunology (1991).
BEISPIEL 1
Screening von extrazellulärer Domänenhomologie zur Identifikation neuer Polypeptide und von dafür kodierender cDNA
Die extrazellulären Domänen- (ECD-) Sequenzen (einschließlich der Sekretionssignalsequenz, sofern vorhanden) aus etwa 950 bekannten sekretierten Proteinen aus der öffentlich zugänglichen Swiss-Prot-Datenbank wurden verwendet, um EST- Datenbanken zu durchsuchen. Die EST-Datenbanken umfassten öffentliche Datenbanken (z.B. Dayhoff, GenBank) und private Datenbanken (z.B. LIFESEQ^TM, Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA). Die Suche wurde unter Verwendung des Computerprogramms BLAST oder BLAST-2 (Altschul et al., Methods in Enzymology 266, 460–480 (1996)) in Form eines Vergleichs der ECD-Proteinsequenzen mit einer 6-Raster-Translation der EST-Sequenzen durchgeführt. Diese Vergleiche mit einem BLAST-Score von 70 (oder in manchen Fällen von 90) oder mehr, die nicht für bekannte Proteine kodierten, wurden gruppiert und mit dem Programm „phrap" (Phil Green, University of Washington, Seattle, WA) zu Consensus-DNA-Sequenzen zusammengebaut.
Unter Verwendung dieses Homologie-Screens der extrazellulären Domänen wurden Consensus-DNA-Sequenzen in Bezug auf die anderen identifizierten EST-Sequenzen unter Verwendung von phrap angeordnet. Weiters wurden die erhaltenen Consensus-DNA-Sequenzen häufig (jedoch nicht immer) mittels Wiederholungszyklen von BLAST oder BLAST-2 und phrap verlängert, um die Consensus-Sequenz so weit wie möglich unter Verwendung der Quellen von zuvor erläuterten EST-Sequenzen zu verlängern.
Auf Grundlage der wie zuvor beschrieben erhaltenen Consensus-Sequenzen wurden Oligonucleotide anschließend synthetisiert und verwendet, um mittels PCR eine cDNA-Bibliothek zu identifizieren, die die Sequenz von Interesse enthielt, und wurden auch als Sonden eingesetzt, um einen Klon der Volllängen-Kodiersequenz für ein PRO-Polypeptid zu isolieren. Vorwärts- und Rückwärts-PCR-Primer weisen im Allgemeinen 20 bis 30 Nucleotide auf und sind oft so beschaffen, dass sie ein PCR-Produkt mit einer Länge von etwa 100–1.000 bp ergeben. Die Sondensequenzen weisen typischerweise eine Länge von 40–55 bp auf. In manchen Fällen werden zusätzliche Oligonucleotide synthetisiert, wenn die Consensussequenz länger als etwa 1–1,5 kbp ist. Um mehrere Bibliotheken auf einen Volllängenklon zu screenen, wurde DNA aus den Bibliotheken durch PCR-Amplifikation, wie von Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, beschrieben, mit dem PCR-Primerpaar gescreent. Eine positive Bibliothek wurde dann verwendet, um unter Verwendung des Sonden- Oligonucleotids und eines der Primerpaare Klone zu isolieren, die für das Gen von Interesse kodieren.
Die cDNA-Bibliotheken, die zur Isolierung der cDNA-Klone verwendet wurden, wurden mittels herkömmlicher Verfahren unter Verwendung von im Handel erhältlichen Reagenzien wie jenen von Invitrogen, San Diego, CA, konstruiert. Die cDNA wurde mit Oligo-dT, das eine NotI-Stelle enthielt, geprimt, mit dem Blunt-Ende an hemikinasierte SalI-Adaptoren gebunden, mit NotI gespaltet, auf geeignete Weise durch Gelelektrophorese klassiert und in einer definierten Ausrichtung in einen geeigneten Kloniervektor (wie z.B. pRKB oder pRKD; pRK5B ist ein Vorläufer von pRK5D, der die SfiI-Stelle nicht enthält; siehe Holmes et al., Science 253, 1278–1280 (1991)) in den einmaligen XhoI- und NotI-Stellen kloniert.
BEISPIEL 2
Isolierung von cDNA-Klonen unter Verwendung von Signalalgorithmusanalyse
Verschiedene für Polypeptide kodierende Nucleinsäuresequenzen wurden durch Anwendung eines geschützten Signalsequenzfindungs-Algorithmus, entwickelt von Genentech, Inc., (South San Francisco, CA) an ESTs sowie gruppierten und angeordneten EST-Fragmenten aus öffentlichen (z.B. GenBank) und/oder privaten (LIFE-SEQ^®, Incyte Pharmaceuticals, Inc., Palo Alto, CA) Datenbanken identifiziert. Der Signalsequenzalgorithmus berechnet einen Sekretionssignalwert auf Grundlage der Eigenschaft der DNA-Nucleotide, die das erste und gegebenenfalls das zweite Methionincodon (ATG) am 5'-Ende der untersuchten Sequenz oder des untersuchten Sequenzfragments umgeben. Die Nucleotide, die an das erste ATG anschließen, müssen für zumindest 35 eindeutige Aminosäuren ohne jegliche Stoppcodons kodieren. Weist das erste ATG die erforderlichen Aminosäuren auf, so wird das zweite nicht untersucht. Wird keines der beiden den Anforderungen gerecht, so wird die Kandidatensequenz nicht bewertet. Um zu bestimmen, ob die EST-Sequenz eine authentische Signalsequenz enthält, werden die DNA und die entsprechenden Aminosäuresequenzen, die das ATG-Codon umgeben, unter Verwendung eines Satzes aus sieben Sensoren (Evaluationsparameter), die für ihre Assoziation mit Sekretionssignalen bekannt sind, bewertet. Die Verwendung dieses Algorithmus führte zur Identifikation zahlreicher, für Polypeptid kodierender Nucleinsäuresequenzen.
BEISPIEL 3
Isolierung von cDNA-Klonen, die für menschliches PRO7168 kodieren
DNA102846-2742 wurde durch Anwendung des im obigen Beispiel 2 beschriebenen geschützten Signalsequenzfindungs-Algorithmus identifiziert. Die Verwendung des oben beschriebenen Signalsequenzalgorithmus ermöglichte die Identifizierung einer EST-Cluster-Sequenz aus der LIFESEQ^®-Datenbank, Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA, die hierin als CLU122441 bezeichnet wird. Die EST-Cluster-Sequenz wurden dann mit verschiedenen Datenbanken von exprimierten sequenzmarkierten Stellen (EST) verglichen, welche die öffentlichen EST-Datenbanken (z.B. GenBank) und eine private EST-DNA-Datenbank (LIFESEQ^®, Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA) umfassten, um bestehende Homologien zu identifizieren. Die Homologiesuche wurde unter Verwendung des Computerprogramms BLAST oder BLAST2 (Altschul et al., Methods in Enzymology 266, 460–480 (1996)) durchgeführt. Diese Vergleiche, die zu einem BLAST-Wert von 70 (oder in manchen Fällen von 90) oder mehr führten, die nicht für bekannte Proteine kodierten, wurden gruppiert und mit dem Programm „phrap" (Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington) zu einer Consensus-DNA-Sequenz assembliert. Die daraus gewonnene Consensus-Sequenz wird hierin als DNA57953 bezeichnet.
In Anbetracht der Sequenzhomologie zwischen der DNA57953-Sequenz und einer Incyte-EST-Sequenz, die im Klon Nr. 4181351 von der Datenbank LIFESEQ^®, Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA, enthalten ist, wurde der Klon Nr. 4181351 gekauft, und das cDNA-insert wurde gewonnen und sequenziert. Die Sequenz dieses cDNA-Inserts ist in 1 (Seq.-ID Nr. 1) dargestellt und wird hierin als DNA102846-2742 bezeichnet.
Die gesamte für DNA102846-2742 kodierende Sequenz ist in 1 dargestellt (Seq.-ID Nr. 1). Der Klon DNA102846-2742 enthält einen einzelnen offenen Leseraster mit einer eindeutigen Translationsstartstelle an Nucleotidpositionen 23-25 und endet mit dem Stoppcodon an Nucleotidpositionen 2540-2542 (1). Der vorhergesagte Polypeptidvorläufer ist 839 Aminosäuren lang (2, Seq.-ID Nr. 2). Das in 2 gezeigte Volllängen-PRO7168-Protein weist ein geschätztes Molekulargewicht von etwa 87.546 Dalton und einen pl von etwa 4,84 auf. Eine Analyse der in 2 (Seq.-ID Nr. 2) gezeigten Volllängen-PRO7168-Sequenz beweist die Gegenwart zahlreicher verschiedener wichtiger Polypeptiddomänen, worin die für jene wichtigen Polypeptiddomänen angegebenen Positionen, wie oben beschrieben, nur ungefähre Werte sind. Eine Analyse der in 2 gezeigten Volllängen-PRO7168-Sequenz zeigte Folgendes: ein Signalpeptid von etwa Aminosäure 1 bis etwa Aminosäure 25; eine Transmembrandomäne von etwa Aminosäure 663 bis etwa Aminosäure 686; N-Glykosylierungsstellen von etwa Aminosäure 44 bis etwa Aminosäure 48, von etwa Aminosäure 140 bis etwa Aminosäure 144, von etwa Aminosäure 198 bis etwa Aminosäure 202, von etwa Aminosäure 297 bis etwa Aminosäure 301, von etwa Aminosäure 308 bis etwa Aminosäure 312, von etwa Aminosäure 405 bis etwa Aminosäure 409 und von etwa Aminosäure 520 bis etwa Aminosäure 524; Glycosaminoglycan-Anheftungsstellen von etwa Aminosäure 490 bis etwa Aminosäure 494, von etwa Aminosäure 647 bis etwa Aminosäure 651 und von etwa Aminosäure 813 bis etwa Aminosäure 817; eine cAMP- und cGMP-abhängige Proteinkinase-Phosphorylierungsstelle von etwa Aminosäure 655 bis etwa Aminosäure 659; Tyrosinkinase-Phosphorylierungsstellen von etwa Aminosäure 154 bis etwa Aminosäure 163 und von etwa Aminosäure 776 bis etwa Aminosäure 783; N-Myristoylierungsstellen von etwa Aminosäure 57 bis etwa Aminosäure 63, von etwa Aminosäure 102 bis etwa Aminosäure 108, von etwa Aminosäure 255 bis etwa Aminosäure 261, von etwa Aminosäure 294 bis etwa Aminosäure 300, von etwa Aminosäure 366 bis etwa Aminosäure 372, von etwa Aminosäure 426 bis etwa Aminosäure 432, von etwa Aminosäure 441 bis etwa Aminosäure 447, von etwa Aminosäure 513 bis etwa Aminosäure 519, von etwa Aminosäure 517 bis etwa Aminosäure 523, von etwa Aminosäure 530 bis etwa Aminosäure 536, von etwa Aminosäure 548 bis etwa Aminosäure 554, von etwa Aminosäure 550 bis etwa Aminosäure 556, von etwa Aminosäure 581 bis etwa Aminosäure 587, von etwa Aminosäure 592 bis etwa Aminosäure 598, von etwa Aminosäure 610 bis etwa Aminosäure 616, von etwa Aminosäure 612 bis etwa Aminosäure 618, von etwa Aminosäure 623 bis etwa Aminosäure 629, von etwa Aminosäure 648 bis etwa Aminosäure 654, von etwa Aminosäure 666 bis etwa Aminosäure 672, von etwa Aminosäure 667 bis etwa Aminosäure 673, von etwa Aminosäure 762 bis etwa Aminosäure 768, von etwa Aminosäure 763 bis etwa Aminosäure 769, von etwa Aminosäure 780 bis etwa Aminosäure 786, von etwa Aminosäure 809 bis etwa Aminosäure 815, von etwa Aminosäure 821 bis etwa Aminosäure 827 und von etwa Aminosäure 833 bis etwa Aminosäure 839; und eine extrazelluläre Caderine-Wiederholungsdomänen-Signatur von etwa Aminosäure 112 bis etwa Aminosäure 123. Der Klon DNA102846-2742 wurde am 17. August 1999 bei der ATCC hinterlegt und bekam die ATCC-Hinterlegungs-Nr. PTA-545 zugewiesen.
Eine Analyse der Dayhoff-Datenbank (Version 35.45 SwissProt 35) unter Verwendung der WU-BLAST2-Sequenzangleichungsanalyse der in 2 gezeigten Sequenz voller Länge (Seq.-ID Nr. 2) zeigte die Sequenzidentität zwischen der PRO7168-Aminosäuresequenz und den folgenden Dayhoff-Sequenzen auf:
CELT22D1_9, B48013, AF100960_1, MUC2_HUMAN, PRP3_MOUSE, S53363, A39066, HUMSPRPA_1, AF053091_1 und S80905_1.
BEISPIEL 4
Genamplifikation
Dieses Beispiel zeigt, dass die für PRO7168 kodierenden Gene im Genom gewisser menschlicher Lungen-, Kolon- und/oder Brustkarzinom-Zelllinien amplifiziert werden. Die Amplifikation ist mit der Überexpression des Genprodukts assoziiert, was darauf hinweist, dass die Polypeptide zweckdienliche Ziele für die therapeutische Intervention bei gewissen Karzinomen, wie z.B. Kolon-, Lungen-, Brust- oder anderen Karzinomen, sein können. Therapeutische Mittel können die Form von Antagonisten von PRO7168-Polypeptiden einnehmen, beispielsweise Maus-Mensch-chimäre, humanisierte oder menschliche Antikörper gegen ein PRO7168-Polypeptid.
Das Ausgangsmaterial für das Screening war aus einer Reihe von Karzinomen isolierte genomische DNA. Die DNA wird z.B. fluorimetrisch exakt quantifiziert. Als negative Kontrolle wurde DNA aus den Zellen von zehn normalen gesunden Individuen isoliert, die gepoolt und als Testkontrollen für die Genkopiezahl in gesunden Individuen verwendet wurden (nicht dargestellt). Der 5'-Nuclease-Test (zum Beispiel TaqMan^TM) und die quantitative Echtzeit-PCR (zum Beispiel ABI Prizm 7700 Sequence Detection System^TM (Perkin Elmer, Applied Biosystems Division, Foster City, CA)) wurden verwendet, um Gene aufzufinden, die möglicherweise bei gewissen Karzinomen amplifiziert werden. Die Ergebnisse wurden verwendet, um zu ermitteln, ob für PRO7168 kodierende DNA in irgendwelchen der gescreenten primären Lungen- oder Kolon-Karzinome oder -Karzinomzelllinien oder Brustkarzinomzelllinien überrepräsentiert war. Die primären Lungenkarzinome wurden aus Individuen mit Tumoren des in Tabelle 6 angeführten Typs und Stadiums erhalten. Eine Erklärung der für die Bezeichnung der in Tabelle 6 aufgezählten Primärtumoren und der Primärtumoren und Zelllinien verwendeten Abkürzungen, auf die in diesem Beispiel durchwegs Bezug genommen wird, ist oben gegeben worden.
Die Ergebnisse des TagMan^TM-Tests sind in Delta-(Δ-) Ct-Einheiten angegeben. Eine Einheit entspricht einem PCR-Zyklus oder ungefähr einer zweifachen Amplifikation im Vergleich zur normalen, zwei Einheiten entsprechen einer vierfachen, 3 Einheiten einer achtfachen Amplifikation und so weiter. Die Quantifizierung wurde unter Verwendung von Primern und einer TagMan^TM-Fluoreszenzsonde erlangt, die vom für PRO7168 kodierenden Gen hergeleitet wurde. PRO7168-Regionen, die mit der höchsten Wahrscheinlichkeit einzigartige Nucleinsäuresequenzen enthalten und die mit geringster Wahrscheinlichkeit herausgespleißte Introns aufweisen, sind zur Herleitung von Primer und Sonde bevorzugt, z.B. eine 3'-untranslatierte Region. Die Sequenzen für die Primer und Sonden (vorwärts, rückwärts und Sonde), die für die PRO7168-Genamplifikationsanalyse verwendet wurden, waren die folgenden:
PRO7168 (DNA102846-2742):
102846.tm.f1
5'-GAGCCGGTGGTCTCAAAC-3' (Seq.-ID Nr. 3)
102846.tm.p1:
5'-CCGGGGGTCCTAGTCCCCTTC-3' (Seq.-ID Nr. 4)
96869.tm.r1:
5'-TTTACTGCTGCGCTCCAA-3' (Seq.-ID Nr. 5)
Die 5'-Nucleasetestreaktion ist eine auf PCR basierende Fluoreszenztechnik, welche die 5'-Exonucleaseaktivität des Taq-DNA-Polymeraseenzyms einsetzt, um die Amplifikation in Echtzeit zu beobachten. Es werden zwei Oligonucleotidprimer verwendet, um ein für eine PCR-Reaktion typisches Amplicon zu erzeugen. Ein drittes Oligonucleotid oder eine Sonde wird konstruiert, um die zwischen den beiden PCR-Primern befindliche Sequenz nachzuweisen. Die Sonde ist vom Taq-DNA-Polymeraseenzym nicht verlängerbar und ist mit einem Reporter-Fluoreszenzfarbstoff und einem Quencher-Fluoreszenzfarbstoff markiert. Eine laserinduzierte Emission aus dem Reporter-Farbstoff wird vom Quench-Farbstoff gequencht, wenn die beiden Farbstoffe nahe beieinander liegen, wie es an der Sonde der Fall ist. Während der Amplifikationsreaktion spaltet das Taq-DNA-Polymeraseenzym die Sonde auf Templat-abhängige Weise. Die resultierenden Sondenfragmente dissoziieren in Lösung und das Signal aus dem freigesetzten Reporter-Farbstoff ist frei von der Quench-Wirkung des zweiten Fluorophors. Ein Molekül des Reporter-Farbstoffs wird je neu synthetisiertes Molekül freigesetzt und der Nachweis des nicht gequenchten Reporter-Farbstoffs stellt die Basis für die quantitative Interpretation der Daten bereit.
Die 5'-Nuclease-Prozedur wird an einem quantitativen Echtzeit-PCR-Gerät durchgeführt, wie z.B. der ABI Prism 7700^TM Sequence Detection. Das System besteht aus einem Thermocycler, Laser, einer Kamera mit hochauflösendem Bildpunktfeld (CCD-Kamera) und einem Computer. Das System amplifiziert Proben im 96-Well-Format am Thermocycler. Während der Amplifikation wird das laserinduzierte Fluoreszenzsignal in Echtzeit durch Faseroptikleitungen für alle 96 Wells gesammelt und an der CCD-Kamera detektiert. Das System umfasst Software zum Betrieb des Geräts und zur Datenanalyse.
5'-Nucleasetestdaten werden anfänglich als Ct oder Schwellenwert-Zyklus ausgedrückt. Dieser ist als jener Zyklus definiert, bei dem das Reporter-Signal über das Hintergrundausmaß der Fluoreszenz hinaus akkumuliert. Die ΔCt-Werte werden als quantitative Messung der relativen Anzahl an Anfangskopien einer bestimmten Zielsequenz in einer Nucleinsäure beim Vergleich von Karzinom-DNA-Ergebnissen mit DNA-Ergebnissen normaler menschlicher DNA verwendet.

Tabelle 6 beschreibt das Stadium, T-Stadium und N-Stadium verschiedener Primärtumoren, die verwendet wurden, um die PRO7168-Verbindungen der Erfindung zu screenen. Tabelle 6 Primäre Lungen- und Kolon-Tumorprofile

Primärtumor	Stadium	Anderes Stadium	Dukes- Stm.	T- Stm.	N- Stm.
Menschlicher Lungentumor Adeno (SRCC724) [LT1]	IIA			T1	N1
Menschlicher Lungentumor SgCCa (SRCC725) [LT1a]	IIB			T3	N0
Menschlicher Lungentumor AdenoCa (SRCC726) [LT2]	IB				N0
Menschlicher Lungentumor AdenoCa (SRCC727) [LT3]	IIA			T1	N2
Menschlicher Lungentumor AdenoCa (SRCC728) [LT4]	IB			T2	N0
Menschlicher Lungentumor SgCCa (SRCC729) [LT6]	IB			T2	N0
Menschlicher Lungentumor Aden/SgCCa (SRCC730) [LT7]	IA			T1	N0
Menschlicher Lungentumor AdenoCa (SRCC731) [LT9]	IB			T2	N0
Menschlicher Lungentumor SgCCa (SRCC732) [LT10]	IIB			T2	N1
Menschlicher Lungentumor SgCCa (SRCC733) [LT11]	IIA			T1	N1
Menschlicher Lungentumor AdenoCa (SRCC734) [LT12]	IV			T2	N0
Menschlicher Lungentumor AdenoSgCCa (SRCC735) [LT13]	IB			T2	N0
Menschlicher Lungentumor SgCCa (SRCC736) [LT15]	IB			T2	N0
Menschlicher Lungentumor SgCCa (SRCC737) [LT16]	IB			T2	N0
Menschlicher Lungentumor SgCCa (SRCC738) [LT17]	IIB			T2	N1
Menschlicher Lungentumor SgCCa (SRCC739) [LT18]	IB			T2	N0
Menschlicher Lungentumor SgCCa (SRCC740) [LT19]	IB			T2	N0
Menschlicher Lungentumor LCCa (SRCC741) [LT21]	IIB			T3	N1
Menschlicher Lungen-AdenoCa (SRCC811) [LT22]	1A			T1	N0
Menschlicher Kolon-AdenoCa (SRCC742) [CT2]		M1	D	pT4	N0
Menschlicher Kolon-AdenoCa (SRCC743) [CT3]			B	pT3	N0
Menschlicher Kolon-AdenoCa (SRCC744) [CT8]			B	T3	N0
Menschlicher Kolon-AdenoCa (SRCC745) [CT10]			A	pT2	N0
Menschlicher Kolon-AdenoCa (SRCC746) [CT12]		MO, R1	B	T3	N0
Menschlicher Kolon-AdenoCa (SRCC747) [CT14]		pMO, RO	B	pT3	pN0
Menschlicher Kolon-AdenoCa (SRCC748) [CT15]		M1, R2	D	T4	N2
Menschlicher Kolon-AdenoCa (SRCC749) [CT16]		pMO	B	pT3	pN0
Menschlicher Kolon-AdenoCa (SRCC750) [CT17]			C1	pT3	pN1
Menschlicher Kolon-AdenoCa (SRCC751) [CT1]		MO, R1	B	pT3	N0
Menschlicher Kolon-AdenoCa (SRCC752) [CT4]			B	pT3	M0
Menschlicher Kolon-AdenoCa (SRCC753) [CT5]		G2	C1	pT3	pN0
Menschlicher Kolon-AdenoCa (SRCC754) [CT6]		pMO, RO	B	pT3	pN0
Menschlicher Kolon-AdenoCa (SRCC755) [CT7]		G1	A	pT2	pN0
Menschlicher Kolon-AdenoCa (SRCC756) [CT9]		G3	D	pT4	pN2
Menschlicher Kolon-AdenoCa (SRCC757) [CT11]			B	T3	N0
Menschlicher Kolon-AdenoCa (SRCC758) [CT18]		MO, RO	B	pT3	pN0

DNA-Herstellung:
DNA wurde aus kultivierten Zelllinien, Primärtumoren und normalem menschlichen Blut hergestellt. Die Isolierung wurde unter Verwendung von Reinigungsset, Pufferset und Protease (alle von Quiagen) nach den Anleitungen des Herstellers und der unten stehenden Beschreibung durchgeführt.
Zellkulturlyse:
Zellen wurden in einer Konzentration von 7,5 × 10⁸ pro Spitze gewaschen und trypsinisiert und mittels Zentrifugation bei 1.000 U/min für 5 Minuten bei 4°C pelletiert, gefolgt von nochmaligem Waschen mit ½ Volumen PBS und neuerlicher Zentrifugation. Die Pellets wurden ein drittes Mal gewaschen, die suspendierten Zellen gesammelt und 2 × mit PBS gewaschen. Die Zellen wurden dann in 10 ml PBS suspendiert. Puffer C1 wurde bei 4°C äquilibriert. Quiagen-Protease Nr. 19155 wurde in 6,25 ml kaltes ddH₂O auf eine Endkonzentration von 20 mg/ml verdünnt und bei 4°C äquilibriert. 10 ml G2-Puffer wurde durch Verdünnen von Quiagen-RNAse A-Stammlösung (100 mg/ml) auf eine Endkonzentration von 200 μg/ml hergestellt.
Puffer C1 (10 ml, 4°C) und ddH₂O (40 ml, 4°C) wurden dann den 10 ml Zellsuspension zugegeben, durch Kippen vermischt und für 10 Minuten auf Eis inkubiert. Die Zellkerne wurden mittels Zentrifugation in einem Beckmann-Ausschwingrotor bei 2.500 U/min bei 4°C für 15 Minuten pelletiert. Der Überstand wurde verworfen und die Kerne mit einem Vortex in 2 ml Puffer C1 (bei 4°C) und 6 ml ddH₂O suspendiert, gefolgt von einer zweiten Zentrifugation bei 2.500 U/min für 15 Minuten bei 4°C. Die Kerne wurden dann unter Verwendung von 200 μl pro Spitze in Restpuffer resuspendiert. G2-Puffer (10 ml) wurde den suspendierten Kernen bei schonendem Vortexen zugegeben. Nach vollständiger Pufferzugabe wurde mittels Vortex für 30 Sekunden kräftig geschüttelt. Quiagen-Protease (200 μl, wie oben angegeben hergestellt) wurde zugegeben und bei 50°C für 60 Minuten inkubiert. Die Inkubation und Zentrifugation wurden wiederholt, bis die Lysate klar waren (z.B. Inkubieren für weitere 30–60 Minuten, pelletieren bei 3.000 × g für 10 Minuten, 4°C).
Herstellung und Lyse einer menschlichen massiven Tumorprobe:
Tumorproben wurden gewogen und in konische 50-ml-Röhrchen gegeben und auf Eis gehalten. Die Verarbeitung war auf nicht mehr als 250 mg Gewebe pro Präparation (1 Spitze/Präparation) beschränkt. Die Protease-Lösung wurde durch Verdünnen in 6,25 ml kaltem ddH₂O auf eine Endkonzentration von 20 mg/ml frisch hergestellt und bei 4°C gelagert. G2-Puffer (20 ml) wurde durch Verdünnen von DNAse A auf eine Endkonzentration von 200 mg/ml hergestellt (aus einer Stammlösung mit 100 mg/ml). Das Tumorgewebe wurde in 19 ml G2-Puffer für 60 Sekunden unter Verwendung der großen Spitze des Polytrons in einer Laminar-TC-Werkbank homogenisiert, um die Inhalation von Aerosolen zu vermeiden, und bei Raumtemperatur. gehalten. Zwischen den Proben wurde das Polytron durch Zentrifugieren bei 2 × 30 Sekunden jeweils in 2 l ddH₂O, gefolgt von G2-Puffer (50 ml) gereinigt. Falls nach wie vor Gewebe an der Generator-Spitze vorhanden war, wurde der Apparat zerlegt und gereinigt.
Quiagen-Protease (wie oben angegeben hergestellt, 1,0 ml) wurde zugegeben, gefolgt von Vortexen und Inkubation bei 50°C für 3 Stunden. Die Inkubation und Zentrifugation wurde wiederholt bis die Lysate klar waren (z.B. Inkubieren für weitere 30–60 Minuten, pelletieren bei 3.000 × g für 10 Minuten, 4°C).
Herstellung und Lyse von menschlichem Blut
Blut wurde freiwilligen gesunden Spendern unter Verwendung von standardmäßigen Infektionsmittel-Protokollen abgenommen und in 10 ml Proben je Spitze titriert. Quiagen-Protease wurde durch Verdünnen in 6,25 ml kaltem ddH₂O auf eine Endkonzentration von 20 mg/ml frisch hergestellt und bei 4°C gelagert. G2-Puffer wurde durch Verdünnen von RNAse A auf eine Endkonzentration von 200 μg/ml aus einer Stammlösung mit 100 mg/ml hergestellt. Das Blut (10 ml) wurde in ein konisches 50-ml-Röhrchen gegeben und es wurden 10 ml C1-Puffer und 30 ml ddH₂O zugegeben (beide vorher auf 4°C äquilibriert) und die Komponenten durch Kippen vermischt und für 10 Minuten auf Eis gehalten. Die Kerne wurden mit einem Beckman-Aus schwingrotor bei 2.500 U/min, 4°C für 15 Minuten pelletiert und der Überstand verworfen. Mit einem Vortex wurden die Kerne in 2 ml C1-Puffer (4°C) und 6 ml ddH₂O (4°C) suspendiert. Das Vortexen wurde wiederholt, bis das Pellet weiß war. Die Kerne wurden dann unter Verwendung einer 200-ml-Spitze in den Restpuffer suspendiert. G2-Puffer (10 ml) wurde den suspendierten Pellets unter sanftem Vortexen zugegeben, gefolgt von kräftigem Vortexen für 30 Sekunden. Quiagen-Protease wurde zugegeben (200 μl) und bei 50°C für 60 Minuten inkubiert. Die Inkubation und Zentrifugation wurde wiederholt, bis die Lysate klar waren (z.B. Inkubieren für weitere 30–60 Minuten, pelletieren bei 3.000 × g für 10 Minuten, 4°C).
Reinigung der geklärten Lysate:
(1) Isolierung genomischer DNA
Genomische DNA wurde mit 10 ml QBT-Puffer äquilibriert (1 Probe je Maxi-Spitzen-Präparat). QF-Elutionspuffer wurde bei 50°C äquilibriert. Die Proben wurden für 30 Sekunden gevortext, anschließend auf Äquilibrierungsspitzen aufgegeben und mittels Gravitation entleert. Die Spitzen wurden mit 2 × 15 ml QC-Puffer gewaschen. Die DNA wurde in silanisierte, autoklavierte 30-ml-Cortex-Röhrchen mit 15 ml QF-Puffer (50°C) eluiert. Isopropanol (10,5 ml) wurde jeder Probe zugegeben, die Röhrchen mit Paraffin verschlossen und durch wiederholtes Kippen vermischt, bis die DNA ausfiel. Die Proben wurden durch Zentrifugation im SS-34-Rotor bei 15.000 U/min für 10 Minuten bei 4°C pelletiert. Die Lage des Pellets wurde markiert, der Überstand verworfen und 10 ml 70 %iges Ethanol (4°C) zugegeben. Die Proben wurden wiederum durch Zentrifugation am SS-34-Rotor bei 10.000 U/min für 10 Minuten bei 4°C pelletiert. Die Lage des Pellets wurde markiert und der Überstand verworfen. Die Röhrchen wurden dann in einem Trockengestell auf die Seite gelegt und 10 Minuten bei 37°C getrocknet, wobei darauf geachtet wurde, die Proben nicht zu stark zu trocknen.
Nach dem Trocknen wurden die Pellets in 1,0 ml TE (pH 8,5) aufgelöst und für 1–2 Stunden bei 50°C aufbewahrt. Die Proben wurden über Nacht bei 4°C gehalten, wobei sich das Auflösen fortsetzte. Die DNA-Lösung wurde dann in 1,5-ml-Röhrchen mit einer Injektionsnadel Nr. 26 an einer Tuberkulinspritze überführt. Die Überführung wurde 5-mal wiederholt, um die DNA zu scheren. Die Proben wurden dann für 1–2 Stunden bei 50°C aufbewahrt.
(2) Quantifizierung genomischer DNA und Herstellung für den Genamplifikationstest
Die DNA-Mengen in jedem Röhrchen wurden mittels standardmäßiger A₂₆₀,A₂₈₀-Spektralphotometrie bei einer Verdünnung von 1:20 (5 μl DNA + 95 μl ddH₂O) unter Verwendung der 0,1-ml-Quarzküvetten im Beckman-Spektralphotometer DU640 quantifiziert. Die A₂₆₀/A₂₈₀-Verhältnisse lagen im Bereich von 1,8–1,9. Jede DNA-Probe wurde dann auf ungefähr 200 ng/ml in TE (pH 8,5) weiter verdünnt. Falls das Ausgangsmaterial hochkonzentriert war (etwa 700 ng/μl), wurde das Material bis zur Resuspension für mehrere Stunden bei 50°C aufbewahrt.
Eine fluorimetrische DNA-Quantifizierung wurde dann am verdünnten Material (20–600 ng/ml) durchgeführt, wobei die wie unten angegeben modifizierten Richtlinien des Herstellers verwendet wurden. Dies wurde erzielt, indem ein Fluorimeter DyNA Quant 200 von Hoeffer für etwa 15 Minuten aufgewärmt wurde. Die Hoechst-Farbstoff-Arbeitslösung (Nr. H33258, 10 μl, hergestellt innerhalb von 12 Stunden der Verwendung) wurde in 100 ml 1 × TNE-Puffer verdünnt. Eine 2-ml-Küvette wurde mit der Fluorimeter-Lösung gefüllt, in das Gerät gegeben und das Gerät auf Null abgeglichen. pGEM 3Zf(+) (2 μl, Charge Nr. 360851026) wurde zu 2 ml Fluorimeter-Lösung zugegeben und auf 200 Einheiten kalibriert. Weitere 2 μl pGEM 3Zf(+)-DNA wurden dann getestet und die Messung bei 400 +/– 10 Einheiten bestätigt. Jede Probe wurde dann zumindest in dreifacher Ausführung gemessen. Wenn 3 Proben innerhalb von 10 % lagen, wurde ihr Mittelwert genommen und dieser Wert als Quantifizierungswert verwendet.
Die fluorimetrisch ermittelte Konzentration wurde dann verwendet, um jede Probe auf 10 ng/μl in ddH₂O zu verdünnen. Dies wurde gleichzeitig an allen Templat-Proben für einen einzigen TagMan^TM-Plattentest vorgenommen und mit ausreichend Material zur Durchführung von 500–1.000 Tests. Die Proben wurden in dreifacher Ausführung mit TaqMan^TM-Primern und B-Actin- sowie GAPDH-Sonde an einer einzigen Platte mit normaler menschlicher DNA und Kontrollen ohne Templat getestet.
Die verdünnten Proben wurden unter der Voraussetzung verwendet, dass der von der Test-DNA subtrahierte Ct-Wert normaler menschlicher DNA +/– 1 Ct betrug. Die verdünnte, chargenqualifizierte genomische DNA wurde in 1-ml-Aliquoten bei –80°C gelagert. Aliquoten, die anschließend im Genamplifikationstest zu verwenden waren, wurden bei 4°C gelagert. Jede 1-ml-Aliquote reichte für 8–9 Platten oder 64 Tests aus.
Genamplifikationstest:

Die Verbindungen der Erfindung wurden in den folgenden Primärtumoren gescreent, und die resultierenden ΔCt-Werte sind in Tabelle 7 angegeben. Tabelle 7 ΔCt-Werte in Lungen- und Kolon-Primärtumor- und Zelllinien-Modellen

Primärtumor	PRO7168
HF-000631	1,43
HF-000641	–
HF-000643	–
HF-000840	2,65
HF-000842	1,73
HBL100	–
MB435s	–
T47D	–
MB468	–
MB175	–
MB361	–
BT20	–
MCF7	–
SKBR3	–

PRO7168 (DNA102846-2742):
Die ΔCt-Werte für DNA102846-2742 in verschiedenen Tumoren sind in Tabelle 7 zusammengefasst. Ein ΔCt-Wert > 1 wurde typischerweise als Schwellenwert für die Bewertung der Amplifikation verwendet, da dieser Wert eine Verdoppelung der Genkopieanzahl darstellt. Tabelle 7 weist darauf hin, dass eine signifikante Amplifikation von DNA102846-2742, die für PRO7168 kodiert, in Lungen-Primärtumoren: HF000631, HF000840 und HF-000842 auftrat.
Da die Amplifikation von DNA102846-2742 in verschiedenen Tumoren auftritt, spielt sie wahrscheinlich eine signifikante Rolle bei der Tumorbildung und beim Tumorwachstum. Als Ergebnis kann von Antagonisten (z.B. Antikörpern), die sich gegen das von DNA102846-2742 kodierte Protein (PRO7168) richten, erwartet werden, dass sie in der Krebstherapie nützlich sind.
BEISPIEL 5
In-situ-Hybridisierung
Die In-situ-Hybridisierung ist eine leistungsfähige und vielseitige Technik zum Nachweis und zur Lokalisierung von Nucleinsäuresequenzen in Zell- oder Gewebepräparaten. Sie kann beispielsweise zweckdienlich sein, um Orte der Genexpression zu identifizieren, die Gewebeverteilung der Transkription zu analysieren, Virusinfektion zu identifizieren und zu lokalisieren, Veränderungen der spezifischen mRNA-Synthese zu verfolgen und die Chromosomen-Kartierung zu unterstützen.
Die In-situ-Hybridisierung wurde nach einer optimierten Version des Protokolls von Lu und Gillett, Cell Vision 1, 169–176 (1994) unter Verwendung von PCR-erzeugten ³³P-markierten durchgeführt. Zusammenfassend wurden in Formalin fixierte, in Paraffin eingebettete menschliche Gewebe geschnitten, vom Paraffin befreit, in Proteinase K (20 g/ml) für 15 Minuten bei 37°C deproteiniert und wie von Lu und Gillett, s.o., beschrieben für die In-situ-Hybridisierung weiterverarbeitet. Eine [³³P]-UTP-markierte Antisense-Ribosonde wurde aus einem PCR-Produkt erzeugt und bei 55°C über Nacht hybridisiert. Die Objektträger wurden in Kernemulsion Kodak NTB2 getaucht und für 4 Wochen Film damit belichtet.
³³P-Ribosondensynthese
6,0 μl (125 mCi) ³³P-UTP (Amersham BF 1002, SA<2.000 Ci/mmol) wurden mittels Speed-Vac getrocknet. Jedem Röhrchen, das getrocknetes ³³P-UTP enthielt, wurden die folgenden Bestandteile zugegeben:
2,0 μl 5x Transkriptionspuffer
1,0 μl DTT (100 mM)
2,0 μl NTP-Gemisch (2,5 mM : 10 μl; jeweils 10 mM GTP, CTP und ATP +10 μl H₂O)
1,0 μl UTP (50 μM)
1,0 μl RNAsin
1,0 μl DNA-Templat (1 μg)
1,0 μl H₂O
1,0 μl RNA-Polymerase (für PCR-Produkte T3 = AS, T7 = S, üblicherweise)
Die Röhrchen wurden bei 37°C für 1 Stunde inkubiert. 1,0 μl RQ1-DNase wurden zugegeben, gefolgt von einer Inkubation bei 37°C für 15 Minuten. 90 μl TE (Tris pH 7,6/1 mM EDTA pH 8,0) wurden zugegeben und das Gemisch auf DE81-Papier pipettiert. Die verbleibende Lösung wurde auf eine Microcon-50-Ultrafiltrationseinheit geladen und unter Verwendung von Programm 10 (6 Minuten) zentrifugiert. Die Filtrationseinheit wurde über ein zweites Röhrchen invertiert und unter Verwendung von Programm 2 (3 Minuten) zentrifugiert. Nach der letzten Zentrifugation zur Gewinnung wurden 100 μl TE zugegeben. 1 μl des Endprodukts wurde auf DE81-Papier pipettiert und in 6 ml Biofluor II gezählt.
Die Sonde wurde an einem TBE/Harnstoff-Gel laufen gelassen. 1–3 μl der Sonde oder 5 μl RNA Mrk III wurden zu 3 μl Beladungspuffer zugegeben. Nach dem Erhitzen in einem Heizblock bei 95°C für drei Minuten wurde das Gel sofort auf Eis ge geben. Die Wells des Gels wurden gespült, die Probe aufgegeben und bei 180–250 Volt für 45 Minuten laufen gelassen. Das Gel wurde in eine Kunststofffolie (Marke SARAM^TM) eingewickelt und bei –70°C im Gefrierschrank für eine Stunde bis über Nacht damit XAR-Film mit einer Verstärkerfolie belichtet.
³³P-Hybridisierung
A. Vorbehandlung gefrorener Schnitte
Die Objektträger wurden dem Gefrierschrank entnommen, auf Aluminiumschalen gelegt und bei Raumtemperatur für 5 Minuten aufgetaut. Die Schalen wurden für 5 Minuten bei 55°C in einen Inkubator gelegt, um die Kondensation zu vermindern. Die Objektträger wurden für 10 Minuten in 4 % Paraformaldehyd auf Eis in einem Abzug fixiert und in 0,5 × SSC für 5 Minuten bei Raumtemperatur gewaschen (25 ml 20 × SSC + 975 ml SQ-H₂O). Nach Deproteinierung in 0,5 μg/ml Proteinase K für 10 Minuten bei 37°C (12,5 μl einer Stammlösung mit 10 mg/ml in 250 ml vorgewärmtem RNase-freiem RNAse-Puffer) wurden die Schnitte in 0,5 × SSC für 10 Minuten bei Raumtemperatur gewaschen. Die Schnitte wurden für jeweils 2 Minuten in 70 %, 95 %, 100 % Ethanol entwässert.
B. Vorbehandlung von in Paraffin eingebetteten Schnitten
Die Objektträger wurden vom Paraffin befreit, in SQ-H₂O gegeben und zweimal in 2 × SSC bei Raumtemperatur für jeweils 5 Minuten gespült. Die Schnitte wurden in 20 μg/ml Proteinase K (500 μl einer Lösung mit 10 mg/ml in 250 ml RNase-freiem RNase-Puffer; 37°C, 15 Minuten) bei einem menschlichen Embryo oder 8x Proteinase K (100 μl in 250 ml RNase-Puffer, 37°C, 30 Minuten) bei Formalingewebe deproteiniert. Anschließendes Spülen in 0,5 × SSC und Entwässerung wurden wie oben beschrieben durchgeführt.
C. Vorhybridisierung
Die Objektträger wurden in einer mit Box-Puffer (4 × SSC, 50 % Formamid) gesättigtem Filterpapier ausgekleideten Kunststoffbox ausgelegt. Das Gewebe wurde mit 50 μl Hybridisierungspuffer (3,75 g Dextransulfat + 6 ml SQ-H₂O) bedeckt, gevortext und in einer Mikrowelle für 2 Minuten mit gelockerten Kappen erhitzt. Nach Abkühlen auf Eis wurden 18,75 ml Formamid, 3,75 ml 20 × SSC und 9 ml SQ-H₂O zugegeben, das Gewebe gut gevortext und bei 42°C für 1–4 Stunden inkubiert.
D. Hybridisierung
1,0 × 10⁶ cpm Sonde und 1,0 μl tRNA 850 mg/ml Stammlösung) je Objektträger wurden bei 95°C für 3 Minuten erhitzt. Die Objektträger wurden auf Eis gekühlt, und es wurden 48 μl Hybridisierungspuffer je Objektträger zugegeben. Nach dem Vortexen wurden 50 μl ³³P-gemisch zu 50 μl Vorhybridisierung am Objektträger zugegeben. Die Objektträger wurden über Nacht bei 55°C inkubiert.
E. Waschungen
Das Waschen wurde für 2 × 10 Minuten mit 2 × SSC, EDTA bei Raumtemperatur durchgeführt (400 ml 20 × SSC + 16 ml 0,25 M EDTA, V_f=4 I), gefolgt von RNAseA-Behandlung bei 37°C für 30 Minuten (500 μl einer Lösung von 10 mg/ml in 250 ml Rnase-Puffer = 20 μg/ml). Die Objektträger wurden 2 × 10 Minuten mit 2 × SSC, EDTA bei Raumtemperatur gewaschen. Die Stringenz-Waschbedingungen waren die folgenden: 2 Stunden bei 55°C, 0,1 × SSC, EDTA (20 ml 20 × SSC + 16 ml EDTA, V_f=4 I).
BEISPIEL 6
Verwendung von PRO7168 als Hybridisierungssonde
Das folgende Verfahren beschreibt die Verwendung einer für ein PRO7168-Polypeptid kodierenden Nucleotidsequenz als Hybridisierungssonde.
DNA, welche die kodierende Sequenz eines Volllängen- oder reifen „PRO7168"-Polypeptids wie hierin offenbart und/oder Fragmente davon umfasst, kann als Sonde eingesetzt werden, um auf homologe DNAs (wie z.B. jene, die für natürlich vorkommende Varianten von PRO7168 kodieren) in menschlichen cDNA-Bibliotheken oder menschlichen genomischen Gewebe-Genom-Bibliotheken zu screenen.
Die Hybridisierung und das Waschen von Filtern, die eine der beiden Bibliothek-DNAs enthalten, wird unter den folgenden Stringenzbedingungen durchgeführt. Die Hybridisierung der radioaktiv markierten PRO7168-Sonde an die Filter wird in einer Lösung von 50 % Formamid, 5x SSC, 0,1 % SDS, 0,1 % Natriumpyrophosphat, 50 mM Natriumphosphat, pH 6,8, 2x Denhardt-Lösung und 10 % Dextransulfat bei 42°C für 20 Stunden durchgeführt. Das Waschen der Filter wird in einer wässrigen Lösung aus 0,1x SSC und 0,1 % SDS bei 42°C durchgeführt.
DNAs, welche die gewünschte Sequenzidentität mit der für das Nativsequenz-POR7168 voller Länge kodierenden DNA aufweisen, können dann unter Verwendung von Standardtechniken, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, identifiziert werden.
BEISPIEL 7
Expression von PRO7168-Polypeptiden in E. coli
Dieses Beispiel illustriert die Herstellung einer unglykosylierten Form von PRO7168 mittels rekombinanter Expression in E. coli.
Die für das PRO-Polypeptid von Interesse kodierende DNA-Sequenz wird zunächst unter Verwendung gewählter PCR-Primer amplifiziert. Die Primer sollten Restriktionsenzymstellen aufweisen, die den Restriktionsenzymstellen am gewählten Expressionsvektor entsprechen. Es kann eine Vielzahl von Expressionsvektoren eingesetzt werden. Ein Beispiel eines geeigneten Vektors ist pBR322 (aus E. coli stammend; siehe Bolivar et al., Gene 2, 95 (1977)), der Gene für Ampicillin- und Tetracyclin-Resistenz enthält. Der Vektor wird mit Restriktionsenzym verdaut und dephosphoryliert. Die PCR-amplifizierten Sequenzen werden dann in den Vektor ligiert. Der Vektor wird vorzugsweise Sequenzen umfassen, die für eine Antibiotikum-Resistenzgen-, eine trp-Promotor-, eine poly-his-Leader- (einschließlich die ersten sechs STII-Codons, poly-his-Sequenz und Enterokinase-Spaltstelle) Sequenz, die für PRO7168 kodierende Region, λ-Transkriptionsterminator und ein argU-Gen kodieren.
Das Ligationsgemisch wird dann verwendet, um einen gewählten E.-coli-Stamm unter Verwendung der in Sambrook et al., s.o., beschriebenen Verfahren zu transformieren. Transformanten werden aufgrund ihrer Fähigkeit identifiziert, auf LB-Platten zu wachsen und es werden dann Antibiotika-resistente Kolonien selektiert. Plasmid-DNA kann isoliert und mittels Restriktionsanalyse und DNA-Sequenzierung bestätigt werden.
Selektierte Klone können über Nacht in Flüssigmedium, wie z.B. mit Antibiotika ergänzter LB-Bouillon gezüchtet werden. Die Übernacht-Kultur kann anschließend verwendet werden, um eine Kultur größeren Maßstabs zu inokulieren. Die Zellen werden dann auf eine gewünschte optische Dichte gezüchtet, währenddessen der Expressionspromotor angeschaltet wird.
Nach dem Kultivieren der Zellen für mehrere weitere Stunden können die Zellen mittels Zentrifugation geerntet werden. Das mittels Zentrifugation erlangte Zellpellet kann unter Verwendung verschiedener, auf dem Gebiet der Erfindung bekannter Mittel solubilisiert werden, und das solubilisierte PRO7168-Protein kann dann unter Ver wendung einer metallchelatierenden Säule unter Bedingungen gereinigt werden, welche die feste Bindung des Proteins ermöglichen.
Ein PRO-Protein kann in E. coli unter Verwendung des folgenden Verfahrens in polyhis-markierter Form exprimiert werden. Die für das PRO kodierende DNA wird zunächst unter Verwendung gewählter PCR-Primer amplifiziert. Die Primer enthalten Restriktionsenzymstellen, die den Restriktionsenzymstellen am gewählten Expressionsvektor entsprechen, und andere zweckdienliche Sequenzen, die für eine effiziente und verlässliche Translationsinitiation, schnelle Reinigung an einer metallchelatierenden Säule und proteolytische Entfernung mit Enterokinase sorgen. Die PCR-amplifizierten, poly-his-markierten Sequenzen werden dann in einen Expressionsvektor ligiert, der dann verwendet wird, um einen auf Stamm 52 (W3110 fuhA(tonA) Ion ga'E rpoHts(htpTrs) clpP(laclq)) basierenden E.-coli-Wirt zu transformieren. Transformanten werden zuerst in 50 mg/ml Carbenicillin enthaltendem LB bei 30°C unter Schütteln gezüchtet, bis eine O.D.600 von 3–5 erreicht ist. Die Kulturen wurden dann 50- bis 100fach in CRAP-Medium (hergestellt durch Vermischen von 3,57 g (NH₄)SO₄, 0,71 g Natriumcitrat.2H₂O, 1,07 g KCl, 5,36 g Difco-Hefeextrakt, 5,36 g Sheffield-Hycase SF in 500 ml Wasser, sowie 110 mM MPOS, pH 7,3, 0,55 % (Gew./Vol.) Glucose und 7 mM MgSO₄) verdünnt und für ungefähr 20–30 Stunden bei 30°C unter Schütteln gezüchtet. Es werden Proben entnommen, um die Expression mittels SDS-PAGE-Analyse zu verifizieren und der Hauptanteil der Kultur wird zentrifugiert, um die Zellen zu pelletieren. Zellpellets werden bis zur Reinigung und Neufaltung eingefroren.
E.-coli-Paste aus Fermentationen von 0,5 bis 1 l (6–10 g Pellets) wird in 10 Volumina (Gew./Vol.) 7 M Guanidin, 20 mM Tris-Puffer, pH8, resuspendiert. Festes Natriumsulfit und Natriumtetrathionat werden zugegeben, bis eine Endkonzentration von 0,1 M bzw. 0,02 M erreicht ist, und die Lösung über Nacht bei 4°C gerührt. Dieser Schritt resultiert in einem denaturierten Protein, bei dem alle Cysteinreste durch Sulfitolierung blockiert sind. Die Lösung wird bei 40.000 U/min in einer Beckman-Ultrazentrifuge für 30 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wird mit 3–5 Volumina Metallchelatsäulenpuffer (6 M Guanidin, 20 mM Tris, pH 7,4) verdünnt und zur Klärung durch 0,22-μm-Filter filtriert. Der geklärte Extrakt wird auf eine im Metallchelatsäulenpuffer äquilibrierte 5-ml-Qiagen-Ni-NTA-Metallchelatsäule aufgegeben. Die Säule wird mit weiterem Puffer gewaschen, der 50 mM Imidazol (Calbiochem, Utrol-Qualität), pH 7,4 enthält. Das Protein wird mit 250 mM Imidazol enthaltendem Puffer eluiert. Das gewünschte Protein enthaltende Fraktionen werden vereinigt und bei 4°C gelagert. Die Proteinkonzentration wird durch Absorption bei 280 nm unter Verwendung des auf Basis seiner Aminosäuresequenz berechneten Extinktionskoeffizienten abgeschätzt.
Das Protein wird neu gefaltet, indem die Probe langsam in frisch hergestelltem Neufaltungspuffer verdünnt wird, der aus 20 mM Tris, pH 8,6, 0,3 M NaCl, 2,5 M Harnstoff, 5 mM Cystein, 20 mM Glycin und 1 mM EDTA besteht. Neufaltungs-Volumina werden so gewählt, dass die Protein-Endkonzentration zwischen 50 und 100 Mikrogramm/ml liegt. Die Neufaltungslösung wird bei 4°C für 12–16 Stunden sanft gerührt. Die Neufaltungsreaktion wird durch Zugabe von TFA auf eine Endkonzentration von 0,4 % (pH von ungefähr 3) gequencht. Vor der weiteren Reinigung des Proteins wird die Lösung durch ein 0,22-μm-Filter filtriert und es wird Acetonitril in einer Endkonzentration von 2–10 % zugegeben. Das neugefaltete Protein wird an einer Poros R1/H-Umkehrphasensäule unter Verwendung eines mobilen Puffers von 0,1 % TFA mit Elution mit einem Gradienten von Acetonitril von 10 bis 80 % chromatographiert. Aliquoten von Fraktionen mit A₂₈₀-Absorption werden an SDS-Polyacrylamidgelen analysiert und Fraktionen, die homogenes neugefaltetes Protein enthalten, werden vereinigt. Im Allgemeinen werden die richtig gefalteten Spezies der meisten Proteine bei den niedrigsten Acetonitril-Konzentrationen eluiert, da jene Spezies die kompaktesten sind und ihr hydrophober Innenbereich von der Wechselwirkung mit dem Umkehrphasenharz abgeschirmt ist. Aggregierte Spezies werden üblicherweise bei höheren Acetonitril-Konzentrationen eluiert. Zusätzlich zur Auftrennung fehlgefalteter Proteinformen von der gewünschten Form entfernt der Umkehrphasenschritt auch Endotoxin aus den Proben.
Fraktionen, welche das gewünschte gefaltete PRO-Protein enthalten, werden vereinigt und das Acetonitril mit einem leichten, auf die Lösung gerichteten Stickstoff strom entfernt. Proteine werden in 20 mM Hepes, pH 6,8, mit 0,14 M Natriumchlorid und 4 % Mannit mittels Dialyse oder Gelfiltration unter Verwendung von in Formulierungspuffer äquilibrierten G25 Superfine- (Pharmacia) Harzen formuliert und sterilfiltriert.
BEISPIEL 8
Expression von PRO7168 in Säugetierzellen
Dieses Beispiel illustriert die Herstellung einer möglicherweise glykosylierten Form von PRO7168 mittels rekombinanter Expression in Säugetierzellen.
Der Vektor pRK5 (siehe EP 307.247 , veröffentlicht am 15. März 1989) wird als Expressionsvektor eingesetzt. Gegebenenfalls wird die PRO7168-DNA in pRK5 mit gewählten Restriktionsenzymen ligiert, um die Insertion der PRO7168-DNA unter Verwendung von Ligationsverfahren, wie z.B. jenen, die in Sambrook et al., s.o., beschrieben sind, zu ermöglichen. Der resultierende Vektor wird pRK5-PRO7168 genannt.
In einer der Ausführungsformen können die gewählten Wirtszellen 293-Zellen sein. Menschliche 293-Zellen (ATCC CCL 1573) werden in Gewebekulturplatten in Medium, wie z.B. in mit fötalem Kälberserum und, gegebenenfalls, mit Komponenten und/oder Antibiotika ergänztem DMEM zur Konfluenz gezüchtet. Etwa 10 μg pRK5-PRO7168-DNA wird mit etwa 1 μg DNA, die für das VA-RNA-Gen kodiert (Thimmappaya et al., Cell 31, 543 (1982)), vermischt und in 500 μl 1 mM Tris-HCl, 0,1 M EDTA, 0,227 M CaCl₂ gelöst. Diesem Gemisch werden tropfenweise 500 μl 50 mM HEPES (pH 7,35), 280 mM NaCl, 1,5 mM NaPO₄ zugegeben und die Bildung eines Präzipitats für 10 Minuten bei 25°C ermöglicht. Das Präzipitat wird suspendiert und den 293-Zellen zugegeben und für etwa vier Stunden bei 37°C absetzen gelassen. Das Kulturmedium wird abgesaugt und es werden 2 ml 20 %iges Glycerin in PBS für 30 Sekunden zugegeben. Die 293-Zellen werden dann mit serumfreiem Medium gewaschen, es wird frisches Medium zugegeben und die Zellen für ungefähr 5 Tage inkubiert.
Ungefähr 24 Stunden nach den Transfektionen wird das Kulturmedium entfernt und durch Kulturmedium (alleine) oder Kulturmedium ersetzt, das 200 μCi/ml ³⁵S-Cystein und 200 μCi/ml ³⁵S-Methionin enthält. Nach einer Inkubation für 12 Stunden wird das konditionierte Medium gesammelt, an einem Zentrifugenfilter konzentriert und auf ein 15 %iges SDS-Gel geladen. Das verarbeitete Gel kann getrocknet und für eine gewählte Zeitspanne damit ein Film belichtet werden, um die Gegenwart des PRO7168-Polypeptids zu offenbaren. Die Kulturen, die transfizierte Zellen enthalten, können einer weiteren Inkubation (in serumfreiem Medium) unterzogen und das Medium in gewählten Biotests getestet werden.
In einer alternativen Technik kann PRO7168-DNA unter Verwendung des von Somparyrac et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 12, 7575 (1981) beschriebenen Dextransulfat-Verfahrens vorübergehend in 293-Zellen eingeführt werden. 293-Zellen werden in einer Zentrifugenflasche auf maximale Dichte gezüchtet, und es werden 700 μg pRK5-PRO7168-DNA zugegeben. Die Zellen werden zuerst mittels Zentrifugation aus der Zentrifugenflasche konzentriert und mit PBS gewaschen. Das DNA-Dextran-Präzipitat wird am Zellpellet für vier Stunden inkubiert. Die Zellen werden mit 20 % Glycerin für 90 Sekunden behandelt, mit Gewebekulturmedium gewaschen und wieder in die Gewebekulturmedium, 5 μg/ml Rinderinsulin und 0,1 μg/ml Rindertransferrin enthaltende Zentrifugenflasche eingebracht. Nach etwa vier Tagen wird das konditionierte Medium zentrifugiert und filtriert, um Zellen und Trümmer zu entfernen. Die exprimiertes PRO7168 enthaltende Probe kann dann eingeengt und mit jeglichem gewählten Verfahren, wie z.B. Dialyse und/der Säulechromatographie, gereinigt werden.
In einer weiteren Ausführungsform kann PRO7168 in CHO-Zellen exprimiert werden. Der pRK5-PRO7168-Vektor kann unter Verwendung bekannter Reagenzien, wie z.B. CaPO₄ oder DEAE-Dextran in CHO-Zellen transfiziert werden. Wie oben beschrieben können die Zellkulturen inkubiert und das Medium durch Kulturmedium (alleine) oder Kulturmedium ersetzt werden, das einen radioaktiven Marker, wie z.B. ³⁵S-Methionin enthält. Nach der Ermittlung der Gegenwart des PRO7168-Polypeptids kann das Kulturmedium durch serumfreies Medium ersetzt werden. Vorzugsweise werden die Kulturen für etwa 6 Tage inkubiert und dann das konditionierte Medium geerntet. Das das exprimierte PRO7168 enthaltende Medium kann dann mit jeglichem gewählten Verfahren konzentriert und gereinigt werden.
Epitopmarkiertes PRO7168 kann ebenfalls in Wirts-CHO-Zellen exprimiert werden. Das PRO7168 kann aus dem pRK5-Vektor subkloniert werden. Das Subklon-Insert kann einer PCR unterzogen werden, um In-frame mit einem gewählten Epitopmarker, wie z.B. einem poly-his-Marker, in einem Baculovirus-Expressionsvektor zu fusionieren. Das poly-his-markierte PRO7168-Insert kann dann in einem SV40-angetriebenen Vektor subkloniert werden, der einen Selektionsmarker, wie z.B. DHFR zur Selektion stabiler Klone enthält. Schließlich können die CHO-Zellen mit dem SV40-angetriebenen Vektor (wie oben beschrieben) transfiziert werden. Die Markierung kann wie oben beschrieben durchgeführt werden, um die Expression zu verifizieren. Das das poly-his-markierte PRO7168 enthaltende Kulturmedium kann dann mit jeglichem gewählten Verfahren, wie z.B. Ni²⁺-Chelat-Affinitätschromatographie, konzentriert und gereinigt werden. Die Expression in CHO- und/oder COS-Zellen kann auch durch ein vorübergehendes Expressionsverfahren erfolgen.
Ein PRO-Protein kann durch ein stabiles Expressionsverfahren oder durch ein vorübergehendes Verfahren exprimiert werden. Die stabile Expression in CHO-Zellen wird unter Verwendung des folgenden Verfahrens durchgeführt. Die Proteine werden als IgG-Konstrukt (Immunoadhäsin) exprimiert, in dem die kodierenden Sequenzen für die löslichen Formen (z.B. extrazellulären Domänen) der jeweiligen Proteine an eine IgG1-Sequenz der konstanten Region fusioniert sind, welche die Gelenks-, CH2- und CH2-Domänen enthält und/oder eine poly-his-markierte Form ist.
Nach der PCR-Amplifikation werden die jeweiligen DNAs in einem CHO-Expressionsvektor subkloniert, und zwar unter Verwendung von Standardtechniken, die in Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Unit 3.16, John Wiley und Sons (1997) beschrieben sind. CHO-Expressionsvektoren werden so konstruiert, das sie kompatible Restriktionsstellen 5' und 3' der DNA von Interesse aufweisen, um das zweckmäßige Shuttling von cDNAs zu ermöglichen. Der zur Expression im CHO- Zellen verwendete Vektor ist in Lucas et al., Nucl. Acids Res. 24, 9 (1774–1779 (1996) beschrieben und verwendet den frühen SV40-Promotor/Enhancer, um die Expression der cDNA von Interesse und Dihydrofolatreductase (DHFR) anzutreiben. Die DHFR-Expression erlaubt die Selektion auf stabile Erhaltung des Plasmids nach der Transfektion.
Zwölf Mikrogramm der gewünschten Plasmid-DNA werden in ungefähr 10 Millionen CHO-Zellen unter Verwendung der im Handel erhältlichen Transfektionsreagenzien Superfect^® (Quiagen), Dosper^® oder Fugene^® (Böhringer Mannheim) eingeführt. Die Zellen werden wie in Lucas et al., s.o., beschrieben gezüchtet. Ungefähr 3 × 10 Zellen werden für die unten beschriebene weitere Züchtung und Produktion in einer Ampulle eingefroren.
Die Plasmid-DNA enthaltenden Ampullen werden aufgetaut, indem sie in ein Wasserbad gestellt und mittels Vortex gemischt werden. Die Inhalte werden in ein 10 ml Medium enthaltendes Zentrifugenröhrchen pipettiert und bei 1.000 U/min für 5 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wird abgesaugt und die Zellen in 10 ml Selektivmedium (0,2-μm-filtriertes PS20 mit 5 % 0,2-μm-diafiltriertes fötales Rinderserum) resuspendiert. Die Zellen werden dann in eine 100-ml-Zentrifugenflasche aliquotiert, die 90 ml Selektivmedium enthält. Nach 1–2 Tagen werden die Zellen in eine mit 150 ml Selektivwachstumsmedium gefüllte 250-ml-Zentrifugenflasche überführt und bei 37°C inkubiert. Nach weiteren 2–3 Tagen wird eine 250-ml-, 500-ml- und 2.000-ml-Zentrifugenflasche mit 3 × 10⁵ Zellen/ml beimpft. Das Zellmedium wird mittels Zentrifugation und Resuspension in Produktionsmedium durch frisches Medium ausgetauscht. Obgleich jegliches geeignete CHO-Medium eingesetzt werden kann, wird tatsächlich ein im am 16. Juni 1992 erteilten US-Patent Nr. 5.122.469 beschriebenes Produktionsmedium verwendet. Eine 3 I-Produktionszentrifugenflasche wird mit 1,2 × 10⁶ Zellen/ml beimpft. Am Tag 0 werden Zellzahl und pH bestimmt. Am Tag 1 werden der Zentrifugenflasche Proben entnommen und die Belüftung mit filtrierter Luft begonnen. Am Tag 2 werden der Zentrifugenflasche Proben entnommen, die Temperatur auf 33°C umgestellt und 30 ml einer Lösung von 500 g/l Glucose und 0,6 ml 10 % Antischaum (z.B. 35 % Polydimethylsiloxan-Emulsion, Dow Corning 365 Medi cal Grade Emulsion) zugegeben. Während der gesamten Produktionszeit wird der pH wie erforderlich eingestellt, um einen pH von etwa 7,2 aufrecht zu erhalten. Nach 10 Tagen oder wenn die Lebensfähigkeit auf unter 70 % sinkt, wird die Zellkultur mittels Zentrifugation und Filtration durch ein 0,22-μm-Filter geerntet. Das Filtrat wird entweder bei 4°C gelagert oder sofort zur Reinigung auf Säulen aufgegeben.
Für die poly-his-markierten Konstrukte werden die Proteine unter Verwendung einer Ni-NTA-Säule (Qiagen) gereinigt. Vor der Reinigung wird dem konditionierten Meqdium Imidazol auf eine Konzentration an 5 mM zugegeben. Das konditionierte Medium wird bei einer Durchflussrate von 4–5 ml/min bei 4°C auf eine Ni-NTA-Säule gepumpt, die mit 0,3 M NaCl und 5 mM Imidazol enthaltendem, 20 mM Hepes-Puffer, pH 7,4, äquilibriert ist. Nach der Beladung wird die Säule mit zusätzlichem Äquilibrierungspuffer gewaschen und das Protein mit 0,25 M Imidazol enthaltendem Äquilibrierungspuffer eluiert. Das höchst gereinigte Protein wird anschließend mit einer G25 Superfine- (Pharmacia) Säule in Lagerungspuffer entsalzt, der 10 mM Hepes, 0,14 M NaCl und 4 % Mannit, pH 6,8 enthält und bei –80°C gelagert.
Immunoadhäsin- (Fc enthaltende) Konstrukte von Proteinen werden aus dem konditionierten Medium wie folgt gereinigt. Das konditionierte Medium wird auf eine 5-ml-Protein A-Säule (Pharmacia) gepumpt, die in 20 mM Natriumphosphatpuffer, pH 8, äquilibriert worden ist. Nach der Beladung wird die Säule ausgiebig mit Äquilibrierungspuffer gewaschen, bevor sie mit 100 mM Zitronensäure, pH 3,5, eluiert wird. Das eluierte Protein wird durch Sammeln von 1-ml-Fraktionen in 275 1 M Tris-Puffer, pH 9, enthaltende Röhrchen sofort neutralisiert. Das höchst gereinigte Protein wird anschließend wie oben für die poly-his-markierten Proteine beschrieben in Lagerungspuffer entsalzt. Die Homogenität der Proteine wird mittels SDS-PAGE und N-terminale Aminosäuresequenzierung mittels Edman-Abbau verifiziert.
BEISPIEL 9
Expression von PRO7168 in Hefe
Das folgende Verfahren beschreibt die rekombinante Expression von PRO7168 in Hefe.
Zuerst werden Expressionsvektoren zur intrazellulären Produktion oder Sekretion von PRO7168 aus dem ADH2/GAPDH-Promotor konstruiert. Für PRO7168 kodierende DNA und der Pomotor werden in geeignete Restriktionsenzymstellen in das gewählte Plasmid insertiert, um die intrazelluläre Expression von PRO7168 zu steuern. Zur Sekretion kann für PRO7168 kodierende DNA gemeinsam mit für der für ADH2/GAPDH-Promotor kodierenden DNA, einem nativen PRO7168-Signalpeptid oder einem anderen Säugetier-Signalpeptid oder beispielsweise einer Hefe-α-Faktor- oder Invetase-Sekretionssignal-/Leader-Sequenz und Linkersequenzen (falls benötigt) zur Expression von PRO7168 in das gewählte Plasmid kloniert werden.
Hefezellen, wie z.B. Hefestamm AB110, können dann mit den oben beschriebenen Expressionsplasmiden transformiert und in gewählten Fermentationsmedien kultiviert werden. Die Überstände der transformierten Hefen können mittels Präzipitation mit 10 % Trichloressigsäure und Trennung mittels SDS-PAGE, gefolgt von der Färbung der Gele mit Coomassieblau-Farbstoff analysiert werden.
Rekombinantes PRO7168 kann anschließend durch Entfernen der Hefezellen aus dem Fermentationsmedium mittels Zentrifugation und anschließendes Konzentrieren des Mediums unter Verwendung gewählter Kartuschenfilter isoliert und gereinigt werden. Das PRO7168 enthaltende Konzentrat kann unter Verwendung gewählter Säulenchromatographieharze weiter gereinigt werden.
BEISPIEL 10
Expression von PRO7168 in Baculovirus-infizierten Insektenzellen
Das folgende Verfahren beschreibt die rekombinante PRO7168-Expression in Baculovirus-infizierten Insektenzellen.
Die für PRO7168 kodierende Sequenz wird stromauf eines Epitopmarkers, der in einem Baculovirus-Expressionsvektor enthalten ist, fusioniert. Derartige Epitopmarker umfassen poly-his-Marker und Immunglobulin-Marker (wie z.B. Fc-Regionen von IgG). Es kann eine Vielzahl von Plasmiden eingesetzt werden, einschließlich Plasmide, die von im Handel erhältlichen Plasmiden, wie z.B. pVL1393 (Novagen) stammen. Zusammenfassend wird die für PRO7168 oder den gewünschten Abschnitt der kodierenden Sequenz von PRO7168 (wie z.B. die für die extrazelluläre Domäne eines Transmembranproteins kodierende Sequenz oder die für das reife Protein kodierende Sequenz, falls das Protein extrazellulär ist) kodierende Sequenz mittels PCR mit Primern amplifiziert, die zu den 5'- und 3'-Regionen komplementär sind. Der 5'-Primer kann flankierende (selektierte) Restriktionsenzymstellen beinhalten. Das Produkt wird dann mit diesen gewählten Restriktionsenzymen verdaut und in den Expressionsvektor subkloniert.
Ein rekombinantes Baculovirus wird durch Co-transfizieren des obigen Plasmids und der BaculoGold^TM-Virus-DNA (Pharmingen) in Spodoptera frugiperda- („Sf9"-) Zellen (ATCC CRL 1711) unter Verwendung von Lipofectin (im Handel erhältlich von GIBCO-BRL) erzeugt. Nach 4–5 Tagen Inkubation bei 28°C werden die freigesetzten Viren geerntet und für weitere Amplifikationen verwendet. Virusinfektion und Proteinexpression werden wie von O'Reilley et al., Baculovirus expression vectors: A Laborstory Manual, Oxford, Oxford University Press (1994) beschrieben durchgeführt.
Exprimiertes poly-his-markiertes PRO7168 kann dann beispielsweise wie folgt mittels Ni²⁺-Chelat-Affinitätschromatographie gereinigt werden. Es werden Extrakte aus rekombinanten, virusinfizierten Sf9-Zellen wie von Rupert et al., Nature 362, 175–179 (1993) beschrieben hergestellt. Zusammenfassend werden Sf9-Zellen gewaschen, in Beschallungspuffer (25 ml Hepes, pH 7,9; 12,5 mM MgCl₂; 0,1 mM EDTA; 10 % Glycerin; 0,1 % NP-40; 0,4 M KCl) resuspendiert und zweimal für 20 Sekunden auf Eis beschallt. Die beschallten Proben werden mittels Zentrifugation geklärt und der Überstand 50fach in Beladungspuffer (50 mM Phosphat, 300 mM NaCl, 10 % Glycerin, pH 7,8) verdünnt und durch ein 0,45-μm-Filter filtriert. Eine Ni² ⁺-Agarosesäule (im Handel erhältlich von Quiagen) wird mit einem Bettvolumen von 5 ml hergestellt, mit 20 ml Wasser gewaschen und mit 25 ml Beladungspuffer äquilibriert. Der filtrierte Zellextrakt wird mit 0,5 ml pro Minute auf die Säule geladen. Die Säule wird bis zur Grundlinien-A₂₈₀ mit Beladungspuffer gewaschen, wobei zu diesem Zeitpunkt die Fraktionsabnahme beginnt. Als nächstes wird die Säule mit einem zweiten Waschpuffer (50 mM Phosphat; 300 mM NaCl, 10 % Glycerin, pH 6,0) gewaschen, wodurch unspezifisch gebundenes Protein eluiert wird. Nach dem neuerlichen Erreichen der A₂₈₀-Grundlinie wird die Säule mit einem 0→500 mM Imidazol-Gradienten im zweiten Waschpuffer entwickelt. Fraktionen von 1 ml werden gesammelt und mittels SDS-PAGE und Silberfärbung oder Western-Blot mit Ni²⁺-NTA-konjugierter alkalischer Phosphatase (Quiagen) analysiert. Fraktionen, die eluiertes, His₁₀-markiertes PRO7168 enthalten, werden vereinigt und gegen Beladungspuffer dialysiert.
Alternativ dazu kann die Reinigung des IgG-markierten (oder Fc-markierten) PRO7168 unter Verwendung bekannter Chromatographietechniken durchgeführt werden, die beispielsweise Protein-A- oder Protein-G-Chromatographie umfassen.
Obwohl die Expression tatsächlich in einem Maßstab von 0,5 bis 2 l durchgeführt wird, kann sie leicht in einem größeren Maßstab für größere (z.B. 8 l) Präparate durchgeführt werden. Die Proteine werden als IgG-Konstrukt (Immunoadhäsin) exprimiert, bei dem die extrazelluläre Proteinregion an eine IgG1-Sequenz der konstanten Region fusioniert ist, welche die Gelenk-, CH2- und CH3-Domänen enthält, und/oder als poly-his-markierte Formen.
Nach der PCR-Amplifikation werden die jeweiligen kodierenden Sequenzen in einen Baculovirus-Expressionsvektor (pb.PH.IgG für IgG-Fusionen und pb.PH.His.c für poly-his-markierte Proteine) subkloniert, und der Vektor und BaculoGold^®-Baculovirus- DNA (Pharmingen) werden in 105 Spodoptera-frugiperda- („Sf9"-) Zellen (ATCC CRL 1711) unter Verwendung von Lipofectin (Gibco BRL) co-transfiziert.pb.PH.IgG und pb.PH.His sind Modifikationen des im Handel erhältlichen Baculovirus-Expressionsvektors pVL1393 (Pharmingen) mit modifizierten Polylinker-Regionen, die His- oder Fc-Marker-Sequenzen umfassen. Die Zellen werden in Hink-TNM-FH-Medium gezüchtet, das mit 10 % FBS (Hyclone) ergänzt ist. Die Zellen werden für 5 Tage bei 28°C inkubiert. Der Überstand wird geerntet und anschließend für die erste virale Amplifikation durch Infizieren von Sf9-Zellen in mit 10 % FBS ergänztem Hink-TNM-FH-Medium bei einer ungefähren Infektionsmultiplizität (MOI) von 10 verwendet. Die Zellen werden für 3 Tage bei 28°C inkubiert. Der Überstand wird geerntet und die Expression der Konstrukte im Baculovirus-Expressionsvektor ermittelt, und zwar mittels Chargen-Bindung von 1 ml Überstand an 25 ml Ni²⁺-NTA-Perlen (Qiagen) für Histidin-markierte Proteine oder Protein-A-Sepharose-CL-4B-Perlen (Pharmacia) für IgG-markierte Proteine, gefolgt von SDS-PAGE-Analyse und Vergleich mit einer bekannten Konzentration von Proteinstandard mittels Coomassieblau-Färbung.
Der Überstand der ersten viralen Amplifikation wird verwendet, um eine Zentrifugenflaschen-Kultur (500 ml) von in ESF-921-Medium (Expression Systems LLC) gezüchteten Sf9-Zellen bei einer ungefähren MOI von 0,1 zu infizieren. Die Zellen werden für 3 Tage bei 28°C inkubiert. Der Überstand wird geerntet und filtriert. Die Chargen-Bindungs- und SDS-PAGE-Analyse werden wie erforderlich wiederholt, bis die Expression der Zentrifugenflaschen-Kultur bestätigt ist.
Das konditionierte Medium aus den transfizierten Zellen (0,3 bis 3 l) wird zur Entfernung der Zellen mittels Zentrifugation geerntet und durch 0,22-μm-Filter filtriert. Für die poly-his-markierten Konstrukte werden die Proteinkonstrukte mittels Ni-NTA-Säule (Quiagen) gereinigt. Vor der Reinigung wird dem konditionierten Medium Imidazol auf eine Konzentration von 5 mM zugegeben. Das konditionierte Medium wird bei einer Durchflussrate von 4–5 ml/min bei 4°C auf eine 6 ml Ni²⁺-NTA-Säule gepumpt, die in 0,3 M NaCl und 5 mM Imidazol enthaltendem, 20 mM Hepes-Puffer, pH 7,4, äquilibriert war. Nach der Beladung wird die Säule mit zusätzlichem Äquilibrierungspuffer gewaschen und das Protein mit 0,25 M Imidazol enthaltendem Äquilibrie rungspuffer eluiert. Das höchst gereinigte Protein wird anschließend mit einer G25 Superfine-Säule (Pharmacia) von 25 ml in einen 10 mM Hepes, 0,14 M NaCl und 4 % Mannit, pH 8, enthaltenden Lagerungspuffer entsalzt und bei –80°C gelagert.
Immunoadhäsin- (Fc enthaltende) Konstrukte von Proteinen werden aus dem konditionierten Medium wie folgt gereinigt. Das konditionierte Medium wird auf eine 5-ml-Protein A-Säule (Pharmacia) gepumpt, die in 20 mM Na-Phosphatpuffer, pH 8, äquilibriert worden ist. Nach der Beladung wurde die Säule ausgiebig mit Äquilibrierungspuffer gewaschen, bevor sie mit 100 mM Zitronensäure, pH 3,5, eluiert wurde. Das eluierte Protein wird durch Sammeln von 1-ml-Fraktionen in 275 ml 1 M Tris-Puffer, pH 9, enthaltende Röhrchen sofort neutralisiert. Das höchst gereinigte Protein wird anschließend wie oben für die poly-his-markierten Proteine beschrieben in Lagerungspuffer entsalzt. Die Homogenität der Proteine wird mittels SDS-PAGE und N-terminale Aminosäuresequenzierung mittels Edman-Abbau verifiziert.
Alternativ dazu kann ein modifiziertes Baculovirus-Verfahren verwendet werden, das High-5-Zellen inkorporiert. In diesem Verfahren wird die für die erwünschte Sequenz kodierende DNA mit geeigneten Systemen, wie z.B. Pfu (Stratagene), amplifiziert oder stromauf einer Epitopmarkierung (5' davon), die innerhalb eines Baculovirus-Expressionsvektors enthalten ist, fusioniert. Solche Epitopmarkierungen umfassen poly-his-Markierungen und Immunglobulinmarkierungen (wie Fc-Regionen von IgG). Zahlreiche Plasmide können verwendet werden, einschließlich Plasmide, die von handelsüblichen Plasmiden wie z.B. pIE1-1 (Novagen) abstammen. Die pIE1-1- und pIE1-2-Vektoren sind zur konstitutiven Expression rekombinanter Proteine aus dem Baculovirus-ie1-Promotor in stabil transformierten Insektenzellen (1) entworfen. Die Plasmide unterscheiden sich nur in der Ausrichtung der mehrfachen Klonierstellen und enthalten alle Promotorsequenzen, die dafür bekannt sind, dass sie für ie1-vermittelte Genexpression in nicht infizierten Insektenzellen wichtig sind, sowie das hr5-Enhancerelement. pIE1-1 und pIE1-2 umfassen die Translationsinitiationsstelle und können verwendet werden, um Fusionsproteine zu produzieren. Kurz zusammengefasst wird die erwünschte Sequenz oder der erwünschte Abschnitt der Sequenz (wie z.B. der Sequenz, die für die extrazelluläre Domäne eines transmembranen Proteins kodiert) mittels PCR mit Primern, die zu den 5'- und 3'-Regionen komplementär sind, amplifiziert. Der 5'-Primer kann flankierende (selektierte) Restriktionsenzymstellen inkorporieren. Das Produkt wird dann mit jenen selektierten Restriktionsenzymen verdaut und in den Expressionsvektor subkloniert. Derivate von pIE1-1 beispielsweise können die Fc-Region von menschlichem IgG (pb.PH.IgG) oder eine 8-Histidin- (pb.PH.His) Markierung stromab der erwünschten Sequenz (3' davon) umfassen. Vorzugsweise wird das Vektorkonstrukt zur Bestätigung sequenziert.
High-5-Zellen werden bis zu einer Konfluenz von 50 % unter den Bedingungen: 27°C, kein CO₂, kein Pen/Strep; gezüchtet. Für jede 150-mm-Platte werden 30 μg von pIE-basiertem Vektor, der die Sequenz enthält, mit 1 ml Ex-Cell-Medium (Medium: Ex-Cell 401 + 1/100 L-Glu JRH Biosciences Nr. 14401-78P (Anmerkung: dieses Medium ist lichtempfindlich)) vermischt, und in einem separaten Röhrchen werden 100 μl CellFectin (CellFECTIN (GibcoBRL Nr. 10362-010) (durch Zentrifugieren vermischt)) mit 1 ml Ex-Gell-Medium vermischt. Die zwei Lösungen werden vereinigt und bei Raumtemperatur 15 min lang inkubieren gelassen. 8 ml von Ex-Cell-Medium werden zu 2 ml von DNA/CellFECTIN-Gemisch zugesetzt, und dies wird auf High-5-Zellen aufgeschichtet, die davor einmal mit Ex-Cell-Medium gewaschen wurden. Die Platte wird dann in Dunkelheit 1 h lang bei Raumtemperatur inkubiert. Das DNA/CellFECTIN-Gemisch wird anschließend abgesaugt, und die Zellen werden einmal mit Ex-Cell gewaschen, um überschüssiges CellFECTIN zu entfernen, 30 ml frisches Ex-Cell-Medium werden zugesetzt, und die Zellen werden 3 Tage lang bei 28°C inkubiert. Der Überstand wird geerntet, und die Expression der Sequenz im Baculovirus-Expressionsvektor wird durch Chargenbindung von 1 ml Überstand an 25 ml von Ni²⁺-NTA-Perlen (QIAGEN) für Histidin-markierte Proteine oder Protein-A-Sepharose-CL-4B-Perlen (Pharmacia) für IgG-markierte Proteine bestimmt, gefolgt von SDS-PAGE-Analyse, die einen Vergleich mit einer bekannten Konzentration von Proteinstandard mittels Coomassie-Blaufärbung anstellt.
Das konditionierte Medium aus den transfizierten Zellen (0,5 bis 3 l) wird mittels Zentrifugation geerntet, um die Zellen zu entfernen, und durch 0,22-μm-Filter filtriert. Für die poly-his-markierten Konstrukte wird das Protein, das die Sequenz umfasst, unter Verwendung einer Ni²⁺-NTA-Säule (Qiagen) gereinigt. Vor der Reinigung wird Imidazol zum konditionierten Medium in einer Konzentration von 5 mM zugesetzt. Das konditionierte Medium wird auf eine 6-ml-Ni² ⁺-NTA-Säule, die in 20 mM Hepes-Puffer, pH 7,4, der 0,3 M NaCl und 5 mM Imidazol enthält, äquilibriert ist, bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 4–5 ml/min bei 48°C gepumpt. Nach dem Laden wird die Säule mit zusätzlichem Äquilibrierungspuffer gewaschen, und das Protein wird mit Äquilibrierungspuffer, der 0,25 M Imidazol enthält, eluiert. Das hochgereinigte Protein wird daraufhin in einen Lagerungspuffer, der 10 mM Hepes, 0,14 M NaCl und 4 % Mannit, pH 6,8, enthält, mit einer 25-ml-G25-Superfine-Säule (Pharmacia) entsalzt und bei –80°C gelagert.
(Fc-hältige) Immunoadhäsin-Konstrukte von Proteinen werden aus dem konditionierten Medium wie folgt gereinigt. Das konditionierte Medium wird auf eine 5-ml-Protein-A-Säule (Pharmacia) gepumpt, die in 20 mM Na-Phosphatpuffer, pH 6,8, äquilibriert wurde. Nach dem Laden wird die Säule ausführlich mit Äquilibrierungspuffer gewaschen, bevor mit 100 mM Zitronensäure, pH 3,5, eluiert wird. Das eluierte Protein wird unverzüglich durch Sammeln von 1-ml-Fraktionen in Röhrchen, die 275 ml von 1 M Tris-Puffer, pH 9, enthält, neutralisiert. Das hochgereinigte Protein wird daraufhin in Lagerungspuffer, wie zuvor für die poly-his-markierten Proteine beschrieben, entsalzt. Die Homogenität der Sequenz wird durch SDS-Polyacrylamidgele und durch Sequenzieren N-terminaler Aminosäuren durch Edman-Abbau und andere Analysenverfahren, je nach Bedarf und Wunsch, bewertet.
BEISPIEL 11
Herstellung von Antikörpern, die PRO7168 binden
Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung monoklonaler Antikörper, die sich spezifisch an PRO7168 binden können.
Verfahren zur Herstellung der monoklonalen Antikörper sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und werden beispielsweise in Goding, s.o., beschrieben. Immuno gene, die verwendet werden können, umfassen gereinigtes PRO7168, Fusionsproteine, die PRO7168 enthalten, und Zellen, die rekombinantes PRO7168 an der Zelloberfläche exprimieren. Die Auswahl des Immunogens können Fachleute ohne übermäßiges Experimentieren treffen.
Mäuse, wie z.B. Balb/c, werden mit dem PRO7168-Immunogen immunisiert, das in komplettem Freundschem Adjuvans emulgiert und subkutan oder intraperitoneal in einer Menge von 1 bis 100 μg injiziert wird. Alternativ dazu wird das Immunogen in MPL-TDM-Adjuvans (Ribi Immunochemical Research, Hamilton, MT) emulgiert und in die Fußballen der Hinterläufe der Tiere injiziert. Die immunisierten Mäuse werden dann 10 bis 12 Tage später mit zusätzlichem Immunogen, das im ausgewählten Adjuvans emulgiert ist, geboostet. Hiernach können die Mäuse auch für mehrere Wochen mit zusätzlichen Immunisierungsinjektionen geboostet werden. Serumproben können den Mäusen durch retroorbitale Blutabnahme zum Testen mittels ELISA-Tests zur Detektion von Anti-PRO7168-Antikörpern in periodischen Abständen entnommen werden.
Nachdem ein geeigneter Antikörpertiter nachgewiesen wurde, kann den Tieren mit „positiven" Antikörperwerten eine letzte intravenöse Injektion von PRO7168 verabreicht werden. Drei oder vier Tage später werden die Mäuse getötet und die Milzzellen geerntet. Die Milzzellen werden dann an eine selektierte Mausmyelomzelllinie wie z.B. P3X63AgU.1, die bei der ATCC, Nr. CRL 1597, erhältlich ist, (unter Verwendung von 35 % Polyethylenglykol) fusioniert. Die Fusionen bilden Hybridomzellen, die dann in 96-Well-Gewebekulturplatten, welche HAT- (Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin) Medium enthalten, ausplattiert werden, um Proliferation von nicht-fusionierten Zellen, Myelomhybriden und Milzzellhybriden zu hemmen.
Die Hybridomzellen werden in einem ELISA auf Reaktivität gegen PRO7168 gescreent. Bestimmung von „positiven" Hybridomzellen, die die erwünschten monoklonalen Antikörper gegen PRO7168 sekretieren, liegt im Bereich der Erfindung:
Die positiven Hybridomzellen können intraperitoneal in syngenetische Balb/c-Mäuse injiziert werden, um Ascites zu produzieren, die die monoklonalen Anti-PRO7168-Antikörper enthalten. Alternativ dazu können die Hybridomzellen in Gewebekulturkolben oder Rollflaschen gezüchtet werden. Reinigung der monoklonalen Antikörper, die in Ascites produziert werden, kann unter Verwendung von Ammoniumsulfatfällung, gefolgt von Gelausschlusschromatographie, erfolgen. Alternativ dazu kann Affinitätschromatographie basierend auf Bindung von Antikörper an Protein A oder Protein G verwendet werden.
Hinterlegung von Material
Die folgenden Materialien wurden bei der American Type Culture Collection, 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209, USA, (ATCC) hinterlegt:

Material ATCC-Hinterlegungsnr. Hinterlegungsdatum

DNA102846-2742 PTA-545 17. August 1999
Diese Hinterlegung erfolgte gemäß den Vorschriften des Budapester Vertrages über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren und den darunter gültigen Bestimmungen (Budapester Vertrag). Dies sichert die Erhaltung einer lebensfähigen Kultur der Hinterlegung 30 Jahre lang ab dem Zeitpunkt der Hinterlegung. Die Hinterlegungen werden von der ATCC gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrages und gemäß einem Abkommen zwischen Genentech, Inc., und ATCC verfügbar gemacht, das permanente und uneingeschränkte Verfügbarkeit der Nachkommenschaft der Kultur der Hinterlegung für die Öffentlichkeit bei Ausgabe des betreffenden US-Patents oder bei Offenlegung für die Öffentlichkeit entweder der US- oder einer ausländischen Patentanmeldung, je nachdem, was zuerst kommt, garantiert und das die Verfügbarkeit der Nachkommenschaft für jemanden, der durch den Präsident des Patentamts der Vereinigten Staaten hierzu gemäß 35 USC § 122 und den dazu gültigen Bestimmungen (einschließlich 37 CFR § 1.14 unter besonderem Verweis auf 886 OG 638) befugt ist, sicherstellt.
Der Zessionar der vorliegenden Anmeldung hat sich einverstanden erklärt, dass, sofern eine Kultur der hinterlegten Materialien, die unter geeigneten Bedingungen kultiviert wurde, absterben oder verloren gehen oder zerstört werden sollte, die Materialien unverzüglich nach Benachrichtigung durch neue derselben Art ersetzt werden. Verfügbarkeit des hinterlegten Materials ist nicht als eine Lizenz zur Ausführung der Erfindung in Widerspruch mit den unter der Behörde einer beliebigen Regierung gemäß ihrer Patentgesetze garantierten Rechte zu verstehen.
Die obige schriftliche Beschreibung wird als ausreichend erachtet, um Fachleuten die Möglichkeit zu geben, die Erfindung durchzuführen. Die vorliegende Erfindung soll in ihrem Schutzumfang durch das hinterlegte Konstrukt nicht als eingeschränkt gelten, da die hinterlegte Ausführungsform einzig als Veranschaulichung bestimmter Aspekte der Erfindung zu verstehen ist, und jegliche Konstrukte, die funktionell äquivalent sind, liegen innerhalb des Schutzumfangs dieser Erfindung. Die Hinterlegung von Material hierin stellt weder ein Eingeständnis dar, dass die hierin enthaltene schriftliche Beschreibung inadäquat sei, die praktische Durchführung irgendeines Aspekts der Erfindung, einschließlich der besten Ausführungsform davon, zu ermöglichen, noch ist sie als eine Einschränkung des Schutzumfangs der Ansprüche zu den spezifischen Veranschaulichungen, die sie darstellt, zu verstehen. In der Tat sind für Fachleute ausgehend von der obigen Beschreibung neben den hierin angeführten und beschriebenen noch zahlreiche andere Modifikationen der Erfindung möglich, und diese liegen ebenfalls im Schutzumfang der beiliegenden Ansprüche. Sequenzprotokoll

Claims

Isolierte Nucleinsäure, die (a) für ein Polypeptid mit zumindest 80 % Aminosäuresequenzidentität mit: (i) der in 2 dargestellten Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 2), (ii) der in 2 dargestellten Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 2) ohne Signalpeptid, (iii) der extrazellulären Domäne der in 2 dargestellten Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 2) mit dem Signalpeptid, (iv) der extrazellulären Domäne der in 2 dargestellten Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 2) ohne Signalpeptid oder (v) der Aminosäuresequenz, für welche die PRO7168-Kodiersequenz voller Länge von DNA102846-2742 kodiert, die unter der ATCC-Zugangsnummer PTA545 hinterlegt ist, kodiert; oder (b) zumindest 80 % Nucleinsäuresequenzidentität mit: (i) der in 1 dargestellten Nucleotidsequenz (Seq.-ID Nr. 1), (ii) der PRO7168-Kodiersequenz voller Länge der in 1 dargestellten Nucleotidsequenz (Seq.-ID Nr. 1), (iii) der PRO7168-Kodiersequenz voller Länge von DNA102846-2742, die unter der ATCC-Zugangsnummer PTA-545 hinterlegt ist, (iv) der Sequenz aus 1 (Seq.-ID Nr. 1), die für die in 2 dargestellte Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 2) kodiert, der das Signalpeptid fehlt, (v) der Sequenz aus 1 (Seq.-ID Nr. 1), die für die extrazelluläre Domäne der in 2 dargestellten Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 2) kodiert, die das Signalpeptid aufweist, oder (vi) der Sequenz aus 1 (Seq.-ID Nr. 1), die für die extrazelluläre Domäne der in 2 dargestellten Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 2) kodiert, der das Signalpeptid fehlt, aufweist, worin die Nucleinsäure- oder Aminosäuresequenzidentität unter Verwendung des ALIGN-2-Computerprogramms bestimmt wird.
Nucleinsäure nach Anspruch 1, worin der Identitätsgrad zumindest 90 % beträgt.
Nucleinsäure nach Anspruch 2, worin der Identitätsgrad zumindest 95 % beträgt.
Nucleinsäure nach Anspruch 3, die (a) für ein Polypeptid mit: (i) der in 2 dargestellten Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 2), (ii) der in 2 dargestellten Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 2) ohne Signalpeptid, (iii) der extrazellulären Domäne der in 2 dargestellten Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 2) mit dem Signalpeptid, (iv) der extrazellulären Domäne der in 2 dargestellten Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 2) ohne Signalpeptid oder (v) der Aminosäuresequenz, für welche die PRO7168-Kodiersequenz voller Länge von DNA102846-2742 kodiert, die unter der ATCC-Zugangsnummer PTA545 hinterlegt ist, kodiert; oder (b) Folgendes aufweist: (i) die in 1 dargestellte Nucleotidsequenz (Seq.-ID Nr. 1), (ii) die Kodiersequenz voller Länge der in 1 dargestellten Nucleotidsequenz (Seq.-ID Nr. 1), (iii) die PRO7168-Kodiersequenz voller Länge von DNA102846-2742, die unter der ATCC-Zugangsnummer PTA-545 hinterlegt ist, (iv) die Sequenz aus 1 (Seq.-ID Nr. 1), die für die in 2 dargestellte Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 2) kodiert, der das Signalpeptid fehlt, (v) die Sequenz aus 1 (Seq.-ID Nr. 1), die für die extrazelluläre Domäne der in 2 dargestellten Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 2) kodiert, die das Signalpeptid aufweist, oder (vi) die Sequenz aus 1 (Seq.-ID Nr. 1), die für die extrazelluläre Domäne der in 2 dargestellten Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 2) kodiert, der das Signalpeptid fehlt.
Nucleinsäure nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin das Signalpeptid aus den Aminosäuren 1 bis 25 ± 5 aus 2 (Seq.-ID Nr. 2) besteht.
Nucleinsäure nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin die extrazelluläre Domäne mit dem Signalpeptid aus den Resten 1 bis 662 ± 5 aus 2 (Seq.-ID Nr. 2) besteht oder die extrazelluläre Domäne ohne Signalpeptid aus den Resten 26 ± 5 bis 662 ± 5 aus 2 (Seq.-ID Nr. 2) besteht.
Vektor, eine Nucleinsäure nach einem der vorangegangenen Ansprüche umfassend.
Vektor nach Anspruch 7, der operabel an Kontrollsequenzen gebunden ist, die von einer mit dem Vektor transformierten Wirtszelle erkannt werden.
Wirtszelle, einen Vektor nach Anspruch 8 umfassend.
Wirtszelle nach Anspruch 9, worin die Zelle eine CHO-Zelle, ein E. coli, eine Hefezelle oder eine Baculovirus-infizierte Insektenzelle ist.
Verfahren zur Herstellung eines PRO7168-Polypeptids, umfassend das Kultivieren einer Wirtszelle nach Anspruch 10 unter Bedingungen, die für die Expression des Polypeptids geeignet sind, und das Gewinnen des Polypeptids aus der Zellkultur.
Isoliertes Polypeptid mit zumindest 80 % Aminosäuresequenzidentität mit: (i) der in 2 dargestellten Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 2), (ii) der in 2 dargestellten Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 2) ohne Signalpeptid, (iii) der extrazellulären Domäne der in 2 dargestellten Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 2) mit dem Signalpeptid, (iv) der extrazellulären Domäne der in 2 dargestellten Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 2) ohne Signalpeptid oder (v) der Aminosäuresequenz, für welche die PRO7168-Kodiersequenz voller Länge von DNA102846-2742 kodiert, die unter der ATCC-Zugangsnummer PTA-545 hinterlegt ist, worin die Nucleinsäure- oder Aminosäuresequenzidentität unter Verwendung des ALIGN-2-Computerprogramms bestimmt wird.
Polypeptid nach Anspruch 12, worin der Identitätsgrad zumindest 90 % beträgt.
Polypeptid nach Anspruch 13, worin der Identitätsgrad zumindest 95 % beträgt.
Polypeptid nach Anspruch 14, das: (i) die in 2 dargestellte Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 2), (ii) die in 2 dargestellte Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 2) ohne Signalpeptid, (iii) die extrazellulären Domäne der in 2 dargestellten Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 2) mit dem Signalpeptid, (iv) die extrazelluläre Domäne der in 2 dargestellten Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 2) ohne Signalpeptid oder (v) die Aminosäuresequenz, für welche die PRO7168-Kodiersequenz voller Länge von DNA102846-2742 kodiert, die unter der ATCC-Zugangsnummer PTA-545 hinterlegt ist, aufweist.
Polypeptid nach einem der Ansprüche 12 bis 15, worin das Signalpeptid aus den Aminosäuren 1 bis 25 ± 5 aus 2 (Seq.-ID Nr. 2) besteht.
Polypeptid nach einem der Ansprüche 12 bis 16, worin die extrazelluläre Domäne mit dem Signalpeptid aus den Resten 1 bis 662 ± 5 aus 2 (Seq.-ID Nr. 2) besteht oder die extrazelluläre Domäne ohne Signalpeptid aus den Resten 26 ± 5 bis 662 ± 5 aus 2 (Seq.-ID Nr. 2) besteht.
Chimäres Molekül, ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 12 bis 17 umfassend.
Chimäres Molekül nach Anspruch 18, worin die heterologe Aminosäuresequenz eine Epitop-Markierungssequenz oder eine Fc-Region eines Immunglobulins ist.
Antikörper, der spezifisch an ein Polypeptid nach Anspruch 15 bindet.
Antikörper nach Anspruch 20, worin der Antikörper ein monoklonaler Antikörper, ein humanisierter Antikörper oder ein einkettiger Antikörper ist.
Antikörper nach Anspruch 20, der ein monoklonaler Antikörper ist, welcher eine nichtmenschliche komplementaritätsbestimmende Region (CDR) oder eine menschliche Gerüstregion (FR) umfasst.
Antikörper nach Anspruch 20, der markiert ist.
Antikörper nach Anspruch 20, der ein Antikörperfragment oder ein einkettiger Antikörper ist.
Isoliertes Nucleinsäuremolekül, das für einen Antikörper nach Anspruch 20 kodiert.
Vektor, ein Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 25 umfassend.
Wirtszelle, einen Vektor nach Anspruch 26 umfassend.
Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers, der an ein Polypeptid nach Anspruch 15 bindet, wobei das Verfahren das Kultivieren der Wirtszelle nach Anspruch 27 unter Bedingungen, die ausreichen, um den Antikörper zu exprimieren, und das Gewinnen des Antikörpers aus der Zellkultur umfasst.
Isoliertes Nucleinsäuremolekül, das unter stringenten Hybridisierungsbedingungen und Waschbedingungen an eine Nucleinsäuresequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 6 hybridisiert, oder das Komplement davon, worin stringente Bedingungen wie folgt aussehen: (i) Hybridisierung bei 42°C in 50 % Formaldehyd mit 0,1 % BSA/0,1 % Ficoll/0,1 % Polyvinylpyrrolidon/50 mM Natriumphosphatpuffer bei pH 6,5 mit 750 mM Natriumchlorid, 75 mM Natriumcitrat, gefolgt von einem Waschschritt bei 50°C in 0,015 M Natriumchlorid/0,00015 M Natriumcitrat/0,1 % Natriumdodecylsulfat; oder (ii) Hybridisierung bei 42°C in 50 % Formamid, 5 × SSC, 50 mM Natriumphosphat, 0,1 % Natriumpyrophosphat, 5 × Denhardts Lösung, beschallter Lachssperma-DNA (50 μg/ml), 0,1 % SDS und 10 % Dextransulfat, gefolgt von Waschschritten bei 55°C bei 42 C in 0,2 × SSC und 50 % Formamid, gefolgt von einem Waschschritt bei 55°C in 0,1 × SSC mit EDTA.
Verfahren zur Bestimmung der Gegenwart eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 12 bis 17 in einer Probe, die vermutlich das Polypeptid enthält, wobei das Verfahren das Aussetzen der Proben gegenüber einem Antikörper nach Anspruch 20 und das Bestimmen der Bindung des Antikörpers an das Polypeptid in der Probe umfasst.
Verfahren nach Anspruch 30, worin die Probe eine Zelle umfasst, die vermutlich das Polypeptid enthält.
Verfahren nach Anspruch 31, worin die Zelle eine Krebszelle ist.
Verfahren zur Diagnose eines Lungentumors in einem Säugetier, wobei das Verfahren das Detektieren des Expressionsausmaßes eines für ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 12 bis 17 kodierenden Gens in (a) einer Probe von Gewebezellen vom Säugetier und (b) einer Kontrollprobe von bekannten normalen Gewebezellen desselben Zelltyps umfasst, worin ein höheres Expressionsausmaß in der Probe im Vergleich zur Kontrollprobe die Gegenwart eines Tumors im Säugetier, von dem die Testgewebezellen erhalten wurden, anzeigt.
Verfahren zur Diagnose eines Lungentumors in einem Säugetier, wobei das Verfahren (a) das Kontaktieren eines Antikörpers nach Anspruch 20 mit einer Probe von Gewebezellen vom Säugetier und (b) das Detektieren der Bildung eines Komplexes aus dem Antikörper und einem Polypeptid nach einem der Ansprüche 12 bis 17 in der Probe umfasst, worin die Bildung eines Komplexes die Gegenwart eines Tumors im Säugetier anzeigt.
Verfahren nach Anspruch 34, worin der Antikörper detektierbar markiert ist.
Verfahren nach Anspruch 33, worin die Probe von Gewebezellen von einem Individuum stammt, das vermutlich neoplastische(s) Zellwachstum oder -proliferation aufweist.
Krebsdiagnoseset, umfassend einen Antikörper nach Anspruch 20 und einen Träger in einer geeigneten Verpackung.
Set nach Anspruch 37, das weiters Anleitungen zum Einsatz des Antikörpers zur Detektion der Gegenwart eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 12 bis 17 in einer Probe, die dieses vermutlich enthält, umfasst.
Verfahren zur Identifikation einer Verbindung, welche die Expression eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 12 bis 17 in Zellen, die das Polypeptid exprimieren, hemmt, worin das Verfahren das Kontaktieren der Zellen mit einer Kanndida tenverbindung und das Bestimmen, ob die Expression des Polypeptids gehemmt wird, umfasst.
Verfahren nach Anspruch 39, worin die Kandidatenverbindung ein Antisense-Oligonucleotid ist.