DE60031518T2

DE60031518T2 - Verfahren zum Diagnostizieren oder Prognostizieren einer Depression oder zum Überwachen des Fortschritts oder zur Bewertung der Behandlung einer Depression auf der Basis von erhöhten Neurotrophin-3-Konzentrationen im Liquor

Info

Publication number: DE60031518T2
Application number: DE60031518T
Authority: DE
Inventors: Roger Nitsch; Christoph Hock; Uwe Otten
Original assignee: Evotec OAI AG
Current assignee: Evotec OAI AG
Priority date: 1999-05-03
Filing date: 2000-05-02
Publication date: 2007-08-30
Anticipated expiration: 2020-05-03
Also published as: ATE343793T1; EP1173768A1; EP1173768B1; US20080188435A1; DE60031518D1; AU4753800A; WO2000067032A1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Verfahren zum Diagnostizieren oder Prognostizieren einer Depression oder zum Überwachen des Fortschritts oder zur Bewertung der Behandlung einer Depression.
Bei der Suche nach biochemischen Veränderungen bei Patienten mit neuropsychiatrischen oder neurodegenerativen Störungen kann die Analyse des Liquors (CSF) ein geeignetes Verfahren sein, da der Liquor kontinuierlich in die extrazelluläre Flüssigkeit des Gehirns übergeht. Daher wurden eine Menge von Studien, die auf die Analyse von für das zentrale Nervensystem (ZNS) spezifischen Proteinen im Liquor abzielen, durchgeführt, um biochemische Marker für die neuronale und synaptische Funktion und Pathologie bei degenerativen Gehirnstörungen zu finden.
Neurotrophin 3 (NT-3) ist ein Mitglied der Neurotrophin-Genfamilie, die für das Überleben, die Differenzierung, Aufrechterhaltung und Reparatur von Neuronen bei Vertebraten sorgen (Bothwell, Ann. Rev. Neurosci. 8, 223-253, 1995; Ebadi et al., Neurochemistry International 30 (4-5), 347-374, 1997). In einem 6-Hydroxydopamin-Läsionsmodell zeigte sich, dass NT-3 den Tod von adulten zentralen noradrenergischen Neuronen des Locus coeruleus verhindert (Arenas et al., Nature 367 (6461), 368-371, 1994), einer neuronalen Population, die mit der Pathophysiologie der Major Depression (Typischen Depression) assoziiert ist (Leonard, J. Psychopharmacol., 11 (4), 39-47, 1997). Veränderungen in der Adrenorezeptordichte und -funktion und Änderungen bei Adrenorezeptoren, die mit der Funktion der hypophyse-adrenalen Achse assoziiert sind, implizieren stark eine Störung in der zentralen noradrenergischen Übertragung bei Major Depression (wegen einer Übersicht, siehe Leonard, J. Psychopharma 11 (4), 39-47, 1997). Diese Dysfunktion könnte mit der Aktivität von Tyrosin-Hydroxylase zusammenhängen, dem geschwindigkeitsbestimmenden Enzym in der Synthese von Catecholaminen. Alternativ dazu kann auch eine beeinträchtigte Aufnahme eines von einem Target abgeleiteten neurotrophen Faktors, wie NT-3, zur zentralen noradrenergischen Dysfunktion beitragen.
Die internationale Patentanmeldung WO 91/03569 bezieht sich auf NT-3 und seine Verwendung bei der Diagnose und/oder Behandlung von neurologischen Störungen einschließlich peripheren Neuropathien, wie diabetischer Neuropathien, toxischer und ernährungsbedingter Neuropathien, erblicher Neuropathien und mit AIDS zusammenhängender Neuropathien sowie degenerativen Krankheiten, wie Alzheimer-Krankheit.
Murase et al. (Clinica Chimica Acta, 227 (1-2), 23-36, 1994) entwickelten ein Enzym-Immunoassaysystem für NT-3 auf der Basis eines Biotin-Streptadivin-Nachweissystems. Dieses System wurde angewendet, um NT-3-Konzentrationen im sich entwickelnden Nervensystem der Ratte sowie bei normalen Probanden und Patienten mit Alzheimer-Krankheit zu messen.
Unter Verwendung von Zwei-Zentren-Enzym-Immunoassays maßen Narisawa-Saito et al. (Neuroreport 7 (18), 2925-2928, 1996) unter anderem NT-3 in den Gehirnbereichen (motorischer Cortex, Gyrus dentatus und entorhinaler Cortex) von Patienten mit Alzheimer-Krankheit und Kontrollindividuen.
Die internationale Patentanmeldung WO 93/09798 sorgt für ein therapeutisches und diagnostisches Verfahren auf der Basis der humanen NT-3-Expression, insbesondere das Potential zur Behandlung von Alzheimer-Krankheit und Chorea Huntington.
NT-3 wurde schon vorher im Liquor von Patienten mit einer Vielzahl von neuropsychiatrischen Zuständen einschließlich Hydrozephalus, Meningitis, Enzephalitis, Ventriculitis, Hirntumoren und multipler Sklerose mit Werten im Bereich von 4,8 bis 55,9 pg/ml bestimmt (Gilmore et al., Psychiatry Res. 73 (1-2) 109-113, 1997). In dem Bereich von Gilmore war NT-3 im Liquor von Patienten mit Schizophrenie nicht nachweisbar.
Bisher wurde noch über keine Studien über Konzentrationen von NT-3 im Liquor bei Major Depression von Älteren (DE) oder in depressiven Populationen jüngeren Alters berichtet.
Trotz seiner Relevanz für Qualitätspflegeinitiativen besitzt das Gebiet der Psychiatrie nur wenig wissenschaftliches Wissen bezüglich des Verlaufs einer laufenden Major Depression, wenn Patienten des Primärsektors mit der Störung unbemerkt bleiben. Die Gefahr, dass unbemerkt gebliebene Patienten Selbstmordgedanken entwickeln, sollte nicht unterschätzt werden. Daher werden Verfahren zum Diagnostizieren einer Depression, insbesondere einer Major Depression, sowie Behandlungsverfahren dringend gebraucht.
In einem Aspekt bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren gemäß Anspruch 1.
In einem weiteren Aspekt bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren gemäß Anspruch 2.
In noch einem weiteren Aspekt bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren gemäß Anspruch 3.
Gemäß der Erfindung wird eine Körperflüssigkeitsprobe verwendet, vorzugsweise eine Liquorprobe. Eine Erhöhung der Konzentration von Neurotrophin 3 im Liquor von dem Patienten relativ zu dem Referenzwert, der einen bekannten Gesundheitszustand darstellt, zeigt eine Diagnose oder Prognose oder ein erhöhtes Risiko einer Depression, insbesondere Major Depression, bei dem Patienten an. Insbesondere zeigt eine Konzentration an Neurotrophin 3 von ≥ 15 pg/ml in dem Liquor eine Diagnose oder Prognose oder ein erhöhtes Risiko einer Depression, insbesondere Major Depression, bei dem Patienten an. Insbesondere zeigt eine Konzentration an Neurotrophin 3 im Bereich von 15 pg/ml bis 50 pg/ml in dem Liquor eine Diagnose oder Prognose oder ein erhöhtes Risiko einer Depression, insbesondere Major Depression, bei dem Patienten an. Die Erhöhungen der Konzentrationen von NT-3 im Liquor können Störungen in der trophischen Unterstützung von spezifischen neuronalen Populationen, wie dem zentralen noradrenergischen System bei DE, widerspiegeln.
Es ist besonders bevorzugt, eine Konzentration oder eine Aktivität oder sowohl eine Konzentration als auch eine Aktivität von Neurotrophin 3 und/oder eines Transcriptionsprodukts eines Gens, das für Neurotrophin 3 codiert, in der Probe mit einer Konzentration von wenigstens einer der Substanzen in einer Reihe von Proben, die über einen Zeitraum hinweg von dem Patienten entnommen wurden, zu vergleichen. Der Patient ist ein Mensch und erhält vor einer oder mehreren der Probenentnahmen eine Behandlung. Neurotrophin 3 und/oder das Transcriptionsprodukt können vorzugsweise mit Hilfe eines Immunoassay und/oder eines Bindungsassays nachgewiesen werden.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung eines Kits gemäß Anspruch 11. Der Kit kann weiterhin Anweisungen zum Diagnostizieren oder Prognostizieren einer Depression oder zur Bestimmung eines erhöhten Risikos, eine Depression zu entwickeln, durch

(i) Nachweisen einer Konzentration oder einer Aktivität oder sowohl einer Konzentration als auch einer Aktivität von Neurotrophin 3 und/oder eines Transcriptionsprodukts eines Gens, das für Neurotrophin 3 codiert, in einer Probe von dem Patienten; und
(ii) Diagnostizieren oder Prognostizieren einer Depression oder Bestimmen, ob der Patient ein erhöhtes Risiko hat, eine Depression zu entwickeln;

Insbesondere zeigt eine Konzentration an Neurotrophin 3 von ≥ 15 pg/ml in dem Liquor eine Diagnose oder Prognose oder ein erhöhtes Risiko einer Depression, insbesondere Major Depression, bei dem Patienten an. Insbesondere zeigt eine Konzentration an Neurotrophin 3 im Bereich von 15 pg/ml bis 50 pg/ml in dem Liquor eine Diagnose oder Prognose oder ein erhöhtes Risiko einer Depression, insbesondere Major Depression, bei dem Patienten an. Außerdem umfasst der Kit vorzugsweise weiterhin wenigstens ein Reagens, das selektiv Nervenwachstumsfaktor oder ein Transcriptionsprodukt eines Gens, das für Nervenwachstumsfaktor codiert, nachweist. Das kombinierte Testen von NT-3 und NGF ist ein wertvolles Werkzeug bei der Diagnose, Prognose oder Risikobewertung der oben genannten Krankheiten (siehe Beispiel 3 und Tabelle 1).
1 bezieht sich auf Beispiel 1 und zeigt, dass Konzentrationen von NT-3 im Liquor in der DE-Gruppe sowohl im Vergleich zu der AD- als auch der CTR-Gruppe signifikant erhöht waren. Konzentrationen (pg/ml) sind angegeben als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts. Sternchen (*, **, ***) zeigen Signifikanz (p < 0,005) im Mann-Whitney-U-Test an. NT-3: * DE versus AD, p = 0,004; ** DE versus CTR, p < 0,001; *** AD versus CTR, p = 0,013. NT-3-Konzentrationen im Liquor der DE-Gruppe betrugen 35,7 ± 6,2 pg/ml (Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts; Bereich 2,3 bis 87,00, n = 14) im Vergleich zu 13,2 ± 2,8 pg/ml in der AD-Gruppe (Bereich: 2,0 to 41,0, n = 23) bzw. 3,7 ± 0,5 pg/ml in der CTR-Gruppe (Bereich: 0,00 bis 8,2, n = 14). Außerdem waren die Konzentrationen von NT-3 im Liquor in der AD-Gruppe signifikant höher als in der CTR-Gruppe. Es gab keine sichtbare Korrelation der Konzentrationen von NT- 3 im Liquor mit dem Alter, der Dauer der AD, MMS-, NOSGER- oder MADRS-Score.
2 bezieht sich auf Beispiel 1 und zeigt Konzentrationen von NT-3 im Liquor (pg/ml ± Standardfehler des Mittelwerts), gruppiert anhand der Anwesenheit von ApoE4-Allelen. Linkes Bild: Alzheimer-Gruppe, n = 22, Kruskal-Wallis: χ² = 7,495, p = 0,024. Rechtes Bild: Gesamtstichprobe von Patienten mit AD und Major Depression (DE), n = 36, Kruskal-Wallis-Test: χ² = 6,589, p = 0,037. Konzentrationen von NT-3 im Liquor nahmen mit zunehmender Häufigkeit des ApoE4-Allels in der Gesamtstichprobe von AD- und DE-Patienten und innerhalb der AD-Gruppe zu. Es gab keine sichtbare Wirkung der Anzahl der E4-Allele innerhalb der DE-Gruppe (n = 14, Kruskal-Wallis-Test: χ² = 1,508, p = 0,471).
3 bezieht sich auf Beispiel 2 und zeigt Konzentrationen von NT-3 im Liquor von Patienten mit Alzheimer-Krankheit (AD), Major Depression von Älteren (DE) und demenzfreien Kontrollprobanden (CTR). Die Konzentrationen (pg/ml) sind angegeben als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts. Sternchen (*, **, ***) zeigen Signifikanz (p < 0,05) im Mann-Whitney-U-Test an. * DE versus AD, p = 0,005; ** DE versus CTR, p < 0,000; *** AD versus CTR, p = 0,010. NT-3-Konzentrationen im Liquor waren in der DE-Gruppe sowohl im Vergleich zur AD- als auch zur CTR-Gruppe signifikant erhöht. Die Konzentrationen von NT-3 im Liquor waren in der AD-Gruppe im Vergleich zur CTR-Gruppe leicht, aber signifikant erhöht. NT-3-Konzentrationen im Liquor der DE-Gruppe betrugen 25,8 ± 4,3 pg/ml (Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts, Bereich: 0,0 bis 87,0, n = 23) im Vergleich zu 14,0 ± 1,6 pg/ml in der AD-Gruppe (Bereich: 0,0 bis 41,0, n = 39) bzw. 10,5 ± 1,6 pg/ml in der CTR-Gruppe (Bereich: 0,0 bis 67,0, n = 63).
4 bezieht sich auf Beispiel 3 und zeigt Konzentrationen von Nervenwachstumsfaktor (NGF) im Liquor von Patienten mit Alzheimer-Krankheit (AD), Major Depression von Älteren (DE) und demenzfreien Kontrollprobanden. Die Konzentrationen von NGF im Liquor wurden bestimmt, um einen Schwellenwert zu definieren, der in den in Tabelle 1 gezeigten kombinierten Tests verwendet werden soll. Konzentrationen (pg/ml) sind angegeben als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts. Sternchen (*, **, ***) zeigen Signifikanz (p < 0,05) im Mann-Whitney-U-Test an. * AD versus DE, p = 0,002; ** AD versus CTR, p = 0,000, *** DE versus CTR, p = 0,000. NGF-Konzentrationen im Liquor waren in der AD-Gruppe sowohl im Vergleich zur DE- als auch zur CTR-Gruppe signifikant erhöht. Die Konzentrationen von NGF im Liquor waren in der DE-Gruppe ebenfalls im Vergleich zur CTR-Gruppe signifikant erhöht. NGF-Konzentrationen im Liquor der AD-Gruppe betrugen 8,19 ± 0,91 pg/ml (Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts, Bereich: 0,00 bis 23,00, n = 40) im Vergleich zu 4,26 ± 0,97 pg/ml in der DE-Gruppe (Bereich: 0,00 bis 23,00, n = 22) bzw. 1,18 ± 0,35 pg/ml in der CTR-Gruppe (Bereich: 0,00 bis 7,20, n = 32).
5 zeigt Konzentrationen von NT-3 im Liquor von DE-Patienten (n = 2), gruppiert nach der Behandlung mit Antidepressiva: Substanzen, die die zentrale noradrenergische Neurotransmission beeinflussen (MAOI und TCA, n = 14); Substanzen, die selektiv die serotonergische Neurotransmission beeinflussen (SSRI, n = 6); keine Behandlung mit Antidepressiva zum Zeitpunkt der Lumbalpunktion (n = 3). Konzentrationen von NT-3 im Liquor (pg/ml) sind angegeben als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts. Sternchen (*) zeigen Signifikanz an (p < 0,05, t-Test mit unabhängigen Stichproben, MAOI/TCA versus SSRI). Interessanterweise zeigten Smith et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92 (19), 8788-8792, 1995), dass eine chronische Behandlung mit Antidepressiva, die die neuronale Noradrenalin-Aufnahme selektiv blockierten, die Expressionsniveaus von NT-3 im Locus coeruleus bei Ratten senkte. Dagegen veränderte die Behandlung mit selektiven Inhibitoren der Serotonin-Wiederaufnahme die NT-3-mRNA-Konzentrationen nicht. Diese Befunde lassen vermuten, dass einige Wirkungen von Antidepressiva auf die Funktion des Locus coeruleus eine Expression von NT-3 beinhalten. Aufgrund dieser Befunde ist es jedoch in hohem Maße unwahrscheinlich, dass die erhöhten Konzentrationen von NT-3 im Liquor von Patienten mit DE auf Wirkungen der Behandlung mit Antidepressiva zurückzuführen sind. Tatsächlich waren die Konzentrationen von NT-3 im Liquor innerhalb der DE-Gruppe bei Patienten, die mit Substanzen, die die zentrale noradrenergische Neurotransmission beeinflussen (MAOI/TCA), behandelt wurden, deutlich geringer als bei Patienten, die mit Substanzen, die selektiv die serotonergische Neurotransmission beeinflussen (SSRI), behandelt wurden, sowie bei Patienten, die zum Zeitpunkt der Lumbalpunktion nicht mit Antidepressiva behandelt wurden. Die Behandlung mit Antidepressiva, die die neuronale Noradrenalin-Aufnahme blockieren, kann also zuvor erhöhte Konzentrationen von NT-3 im Liquor von Patienten mit DE reduzieren.
Tabelle 1 bezieht sich auf die Beispiele 2 und 3. Diese Tabelle zeigt die diagnostische Genauigkeit von Liquormessungen von NT-3 und NGF bei Alzheimer-Krankheit und Major Depression von Älteren. Bei NT-3-Messungen wurden die Empfindlichkeit, Spezifität, positiver prädiktiver Wert (PPV) und negativer prädiktiver Wert (NPV) unter Verwendung eines Schwellenwerts von ≥ 15,0 pg/ml berechnet (insgesamt: n = 125, AD: n = 39, DE: n = 23, CTR: n = 63). Für kombinierte NT-3/NGF-Messungen bei der Diagnose von DE wurden Schwellenwerte von < 4 pg/ml NGF bzw. > 15 pg/ml NT-3 verwendet (insgesamt: n = 57, AD: n = 24, DE: n = 18, CTR: n = 15). Die Messung von NT-3-Konzentrationen im Liquor zeigte eine vielversprechende diagnostische Genauigkeit in Bezug auf Empfindlichkeit (73,9%) sowie Spezifität (86,1%). Der NT-3-Test ist also ein mögliches Werkzeug für die biochemische Diagnose einer Major Depression von Älteren. Im kombinierten Test für die DE-Diagnose ist die Spezifität leicht erhöht (89,7%). Für kombinierte NT-3/NGF-Messungen bei der Diagnose von AD wurden Schwellenwerte von < 15 pg/ml NT-3 bzw. ≥ 4 pg/ml NGF verwendet (insgesamt: n = 57; AD: n = 24, DE: n = 18, CTR: n = 15). Dieser kombinierte Test zeigt eine erhebliche Spezifität für die Diagnose von AD (90,1%). Im Allgemeinen haben kombinierte Tests von NT-3 und NGF mit geeigneten Schwellenwerten das Potential, bei der biochemischen Differenzierung zwischen diesen beiden häufigen Störungen bei Älteren verwendet zu werden.
Beispiel 1
Um eine Differentialdiagnose zu erreichen, beinhaltete die Studie nicht nur Patienten mit Major Depression (DE), sondern auch solche mit Alzheimer-Krankheit. Patienten mit Major Depression wurden gemäß dem ICD10- (F32.0x/Ix, F33.0x/Ix) und dem DSM-IIIR-Kriterium diagnostiziert (296.20-22,296.30-32). Die Diagnose einer wahrscheinlichen AD erfolgte gemäß den Kriterien des National Institute of Neuropsychiatric and Communicative Disorders and Stroke-Alzheimer's disease and Related Disorders Association (NINCDS-ADRDA; McKhann et al., Neurology 34, 939-944, 1984). Alle Patienten wurden von allgemeinen Ärzten, Neurologen und Psychiatern zu diagnostischen Zwecken und zur Durchmusterung für klinische Tests zur Forschungsstation überwiesen. Keiner der Patienten wurde stationär behandelt. Die Gruppe der gesunden Kontrollprobanden (CTR) bestand aus Patienten, die sich einer Lumbalpunktion aus orthopädischen oder neurologisch-diagnostischen Gründen unterzogen und bei denen sich zeigte, dass sie normale Liquorzellzahlen und Gesamtproteinkonzentrationen und keine Anzeichen einer Dysfunktion der Blutschranke oder einer zerebralen IgG-Synthese sowie keinerlei zerebrale Störungen aufwiesen.
DE-, AD- und CTR-Patienten wurden sorgfältig untersucht und erhielten eine gründliche klinische Aufarbeitung. Psychometrische Tests einschließlich des Mini Mental State (MMS; Folstein et al., J. Psychiatry Res. 12, 189-198, 1975) als globales Screening-Instrument für Demenz und des Nurses' Observation Scale for Geriatric Patients (NOSGER; Spiegel et al., J. Am. Geriatr. Soc. 39 (4), 339-347, 1991) als funktionelles Maß für die Schwere der Demenz. Die Patienten mit DE zeigten bei den klinischen Untersuchungen keine kognitiven Störungen, und die Mini-Mental-State-Scores lagen im normalen Bereich. Die Schwere der Depression wurde unter Verwendung des Montgomery Asberg Depression Rating Scale (MADRS) (Montgomery et al., Br. J. Psychiatry, 134: 382-389, 1979) eingestuft. Eine Apolipoprotein(ApoE)-Genotypbestimmung oder, wenn keine DNA zur Verfügung stand, ApoE-Phänotypbestimmung wurde in das Labor-Screening der DE- und AD-Patienten aufgenommen.
Bei den DE- und AD-Patienten, bei denen zuvor während der routinemäßigen diagnostischen Aufarbeitung keine Lumbalpunktion durchgeführt wurde, wurde Liquor für diagnostische Zwecke entnommen. Verschiedene Liquorvolumina standen für die Analyse der Neurotrophin-Proteine zur Verfügung. Dies erklärt die unterschiedlichen Probegrößen für die einzelnen Messungen. Alle verfügbaren Liquorproben wurden für die Analysen verwendet.
Die AD-Gruppe war wie folgt: n = 23, 12 Männer, 11 Frauen, mittleres Alter 63,9 ± 13,2 (Standardabweichung) Jahre, Bereich 39-86 Jahre, MMS-Score: Mittelwert 18,6 ± 5,6 (Standardabweichung).
Die DE-Gruppe war wie folgt: n = 14, 5 Männer, 9 Frauen, mittleres Alter 68,2 ± 13,6 (Standardabweichung) Jahre, Bereich 47-86 Jahre, MMS-Score: Mittelwert 28,1 ± 0,9 (Standardabweichung).
Die CTR-Gruppe war wie folgt: n = 14, 8 Männer, 6 Frauen, mittleres Alter 58,5 ± 16,2 (Standardabweichung) Jahre, Bereich 31-81 Jahre.
AD- und CTR-Patienten waren frei von psychotroper Medikation. Patienten mit einer Major Depression wurden mit verschiedenen antidepressiven Wirkstoffen einschließlich Inhibitoren der Serotonin-Wiederaufnahme, reversiblen Monoaminooxidase-A-Inhibitoren und tricyclischen Wirkstoffen behandelt. Vor der Untersuchung wurden jeder Patient und dessen Betreuer informiert und stimmten der Teilnahme zu. Die Studie wurde vom lokalen Ethikkomitee zugelassen. Alle Verfahren standen im Einklang mit der Helsinki-Erklärung von 1975 in der Neufassung von 1983. Innerhalb einer Woche von Demenztests wurde Liquor durch Lumbalpunktion erhalten. Um mögliche Einflüsse eines ventrikulo-lumbalen Gradienten auszugleichen, wurden die Lumbalpunktionen zwischen 7.30 und 8 Uhr morgens vor dem Frühstück durchgeführt, während die Patienten noch flach im Bett lagen. Liquorproben wurden unmittelbar nach der Entnahme am Bett in 0,5-ml-Aliquoten auf Trockeneis eingefroren und bis zur biochemischen Analyse bei –85°C aufbewahrt.
NT-3 wurde unter Verwendung von kommerziell erhältlichen ELISA-Systemen (Promega, Madison, WI) bestimmt. Die Bestimmung wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. 220 μl unverdünnter Liquor in Carbonatpuffer (pH 9,7) wurden in 96-Napf-Immunplatten (Nunc) gegeben und über Nacht bei 4°C gehalten. Polyklonale Anti-Human-NT-3-Antikörper (pAb) wurden als Abfangantikörper verwendet. Monoklonaler Anti-NT-3-Antikörper (mAb) wurde als Reporterantikörper verwendet. Nach der Inkubation mit einem speziesspezifischen Antikörper (Anti-Ratten-IgG), der mit Meerrettich-Peroxidase (HRP) als tertiärem Reaktanten konjugiert war, und Waschen wurde die Lösung mit dem chromogenen Substrat TMB (3,5,3',5'-Tetramethylbenzidin) inkubiert. Die Extinktion wurde bei 450 nm unter Verwendung eines Mikroplatten-Lesegeräts (Dynatech MR 700) gemessen. NT-3-ELISA: Bereich 4,7-300 pg/ml; Kreuzreaktion mit anderen Neurotrophinen bei 10 ng/ml < 3%; Nachweisgrenze 10,0 pg/ml. Alle Liquorproben wurden in doppelten Parallelansätzen bestimmt.
Die ApoE-Genotypbestimmung wurde unter Verwendung von INNO-LiPA ApoE, Innogenetics, Belgien, durchgeführt. Die ApoE-Phänotypbestimmung wurde nach McDowell et al. durchgeführt (Clin. Chem. 35 (10), 2070-2073, 1989). Die Verwendung des ApoE-Phänotyps synonym mit dem ApoE-Genotyp in den statistischen Analysen erschien zweckmäßig, da die ApoE-Genotypbestimmung im Vergleich zur Protein-Phänotypbestimmung in weniger als 2% der Fälle widersprüchliche Ergebnisse zeigte (Hansen et al., Clin. Chim. Acta, 224 (2), 131-137, 1994).
Statistische Datenanalysen wurden unter Verwendung des Mann-Whitney-U-Tests sowie t-Tests mit unabhängigen Stichproben für Gruppenvergleiche durchgeführt. Korrelationsanalysen wurden durch multiple Regression unter Verwendung von Konzentrationen von Neurotrophinen im Liquor sowie des ApoE-Genotyps (bzw. Phänotyps), Alters, der Krankheitsdauer bei AD, MMS-, NOSGER- und MADRS-Score durchgeführt. Eine nichtparametrische Korrelation wurde unter Verwendung des Kruskal-Wallis-Tests durchgeführt. Die Regressionsanalyse wurde durch eine Varianzanalyse (ANOVA) ergänzt, wobei man SPSS für Windows (Version 8.0) verwendete. Statistische Signifikanz wurde für p < 0,05 angenommen. Eine Bonferroni-Korrektur in Bezug auf mehrfaches Testen wurde angewendet.
Beispiel 2
Die in Beispiel 1 beschriebene Studie wurde auf eine größere Patientengruppe ausgedehnt, wie im Folgenden in diesem Beispiel 2 beschrieben ist.
Die Diagnose, klinische Untersuchung und Behandlung von Patienten sowie die Lumbalpunktion wurden so durchgeführt, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist.
Für NT-3-Messungen wurden 125 Liquorproben untersucht. DE-Gruppe: n = 23, 8 Männer, 15 Frauen, mittleres Alter 70,5 ± 11,9 (Standardabweichung) Jahre, Bereich 47-86 Jahre, MMS-Score: Mittelwert 27,2 ± 2,5 (Standardabweichung). AD-Gruppe: n = 39, 20 Männer, 19 Frauen, mittleres Alter 67,2 ± 11,5 (Standardabweichung) Jahre, Bereich 39-86 Jahre, MMS-Score: Mittelwert 19,1 ± 5,3 (Standardabweichung). CTR-Gruppe: n = 63, 35 Männer, 28 Frauen, mittleres Alter 56,0 ± 15.0 (Standardabweichung) Jahre, Bereich 28-84 Jahre.
NT-3 wurde unter Verwendung von kommerziell erhältlichen ELISA-Systemen (Promega, Madison, WI) gemäß den Anweisungen des Herstellers bestimmt. 120 μl unverdünnter Liquor in Carbonatpuffer (pH 9,7) wurden in 96-Napf-Immunplatten (Nunc) gegeben und über Nacht bei 4°C gehalten. Polyklonale Anti-Human-NT-3-Antikörper (pAb) wurden als Abfangantikörper verwendet. Anti-NT-3-mAb wurde als Reporterantikörper verwendet. Nach der Inkubation mit einem speziesspezifischen Antikörper (Anti-Ratten-IgG), der mit Meerrettich-Peroxidase (HRP) als tertiärem Reaktanten konjugiert war, und Waschen wurde die Lösung mit dem chromogenen Substrat TMB inkubiert. Die Extinktion wurde bei 450 nm unter Verwendung eines Mikroplatten-Lesegeräts (Dynatech MR 700) gemessen. NT-3-ELISA: linearer Bereich 4,7-300 pg/ml; Kreuzreaktion mit anderen Neurotrophinen bei 10 ng/ml < 3%; Nachweisgrenze 6,0 pg/ml.
AD- und CTR-Patienten waren frei von psychotroper Medikation. Patienten mit einer Major Depression wurden mit verschiedenen Antidepressiva behandelt: 11 wurden mit tricyclischen Wirkstoffen (TCA), 2 mit einem Monoamin-Oxidase-A-Inhibitor (MAOI), 1 mit einer Kombination von TCA mit MAOI, 6 mit selektiven Inhibitoren der Serotonin-Wiederaufnahme (SSRI) behandelt, und 3 waren zum Zeitpunkt der Lumbalpunktion frei von Antidepressiva.
Statistische Datenanalysen wurden unter Verwendung des Mann-Whitney-U-Tests für Gruppenvergleiche durchgeführt. Die Regressionsanalyse wurde durch eine Varianzanalyse (ANOVA) ergänzt, wobei man SPSS für Windows (Version 8.0) verwendete. Statistische Signifikanz wurde für p < 0,05 angenommen. Eine Bonferroni-Korrektur in Bezug auf mehrfaches Testen wurde angewendet.
Um die diagnostische Genauigkeit des Tests abzuschätzen, wurden a) Empfindlichkeiten und b) Spezifitäten, die wie folgt definiert sind, berechnet: a) Zahl der richtig positiven/(Zahl der richtig positiven plus Zahl der falsch negativen) und b) Zahl der richtig negativen/(Zahl der richtig negativen plus Zahl der falsch positiven). Um die Wahrscheinlichkeit einer Krankheit abzuschätzen, wurden prädiktive Werte der Tests berechnet. Der positive prädiktive Wert (PPV) wurde definiert als Zahl der richtig positiven/(Zahl der richtig positiven plus Zahl der falsch positiven). Der negative prädiktive Wert (NPV) wurde definiert als Zahl der richtig negativen/(Zahl der richtig negativen plus Zahl der falsch negativen).
Dann wurden DE-Patienten (n = 23) gruppiert gemäß der Behandlung mit Substanzen, die die zentrale noradrenergische Neurotransmission beeinflussen (MAOI und TCA, n = 14), und solchen, die selektiv die serotonergische Neurotransmission beeinflussen (SSRI, n = 6). Die Konzentrationen von NT-3 im Liquor waren in der MAOI/TCA-Gruppe signifikant niedriger als in der SSRI-Gruppe (p < 0,05, t-Test mit unabhängigen Stichproben). Die NT-3-Konzentrationen im Liquor der MAOI/TCA-Gruppe betrugen 19,7 ± 2,9 pg/ml (Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts, Bereich: 0,0 bis 35,0, n = 14) im Vergleich zu 34,9 ± 8,5 pg/ml in der SSR-Gruppe (Bereich: 14,0 bis 63,0, n = 6) und 35,7 ± 26,3 pg/ml in der Gruppe mit Patienten, die zum Zeitpunkt der Lumbalpunktion nicht mit Antidepressiva behandelt wurden (Bereich: 0,00 bis 87,0, n = 3) (5).
Beispiel 3
Der Zweck dieser Studie bestand darin, zu überprüfen, ob kombinierte Messungen der Konzentrationen von NT-3 im Liquor und des Nervenwachstumsfaktors (NGF), der ebenfalls in die Gruppe der Neurotrophine gehört, die diagnostische Genauigkeit des in Beispiel 2 beschriebenen NT-3-Tests verbessern.
In einem ersten Schritt wurden die NGF-Konzentrationen im Liquor bestimmt, um einen Schwellenwert zu definieren, der in den kombinierten Tests verwendet werden soll. Die Diagnose, klinische Untersuchung und Behandlung von Patienten, Lumbalpunktion und statistische Analysen wurden so durchgeführt, wie es in Beispiel 2 beschrieben ist. 94 Liquorproben wurden untersucht. Die AD-Gruppe (n = 40) bestand aus 18 Männern und 22 Frauen, mittleres Alter 68,8 ± 12,4 Jahre, Bereich 39-88 Jahre, MMS-Score: Mittelwert 19,3 ± 4,6 (Standardabweichung). Die DE-Gruppe (n = 22) bestand aus 8 Männern und 12 Frauen, mittleres Alter 69,8 ± 12,6 (Standardabweichung) Jahre, Bereich 47-86 Jahre, MMS-Score: Mittelwert 27,5 ± 2,1 (Standardabweichung). CTR-Gruppe: n = 32, 18 Männer, 14 Frauen, mittleres Alter 64,0 ± 14,9 Standardabweichung) Jahre, Bereich 29-96 Jahre. Die Konzentrationen von NGF im Liquor wurden durch einen ELISA gemessen, wie er von Weskamp et al. beschrieben wird (J. Neurochem. 48: 1779-1786, 1987). Schwarze 96-Napf-Mikroplatten (Nunc) wurden über Nacht bei 4°C mit in Carbonatpuffer, pH 9,2, verdünnten monoklonalen Anti-β(2.5 S, 7S)-NGF-Antikörpern (Ab) (Klon 27/21, Boehringer Mannheim) beschichtet. 120 μl Liquor und Standardlösungen wurden hinzugefügt und 20 Stunden lang bei 4°C inkubiert. Die Platten wurden gewaschen und 2½ Stunden lang bei Raumtemperatur (RT) mit Anti-β(2.5 S, 7S)-NGF-β-Galactosidase-Konjugat inkubiert. Nach einem zusätzlichen Waschschritt wurde das fluorogene Substrat 4-Methylumbelliferyl-β-D-galactopyranosid hinzugefügt, und die Platten wurden über Nacht bei 4°C inkubiert. Die Reaktion wurde nach 1 h bei RT abgebrochen, und das fluoreszente Produkt wurde in den Mikrotiternäpfen unter Verwendung eines Fluorometers (Labsystems Fluoroskan Ascent FL) bei 355 nm Anregungs- und 460 nm Emissionswellenlänge gemessen. Die Nachweisgrenze betrug 0,5 pg/ml; die Kreuzreaktivität mit anderen Neurotrophinen bei 10 ng/ml war < 2%, und der Assay war über einen Bereich von 0,5 bis 500 pg/ml linear.
57 Liquorproben waren für kombinierte NGF/NT-3-Messungen verfügbar. AD-Gruppe: n = 24, 13 Männer, 11 Frauen, mittleres Alter 64,9 ± 12,5 (Standardabweichung) Jahre, Bereich 47-82 Jahre, MMS-Score: Mittelwert 18,6 ± 5,4 (Standardabweichung). DE-Gruppe: n = 18, 7 Männer, 11 Frauen, mittleres Alter 69,5 ± 12,7 (Standardabweichung) Jahre, Bereich 47-84 Jahre, MMS-Score: Mittelwert 27,7 ± 2,1 (Standardabweichung). CTR-Gruppe: n = 15, 10 Männer, 5 Frauen, mittleres Alter 59,0 ± 15,9 (Standardabweichung) Jahre, Bereich 29-80 Jahre.

Claims

In-vitro-Verfahren zum Diagnostizieren oder Prognostizieren einer Depression, insbesondere einer Major Depression (Typischen Depression), oder zum Bestimmen eines erhöhten Risikos, eine Depression, insbesondere eine Major Depression, zu entwickeln, umfassend: Bestimmen einer Konzentration oder einer Aktivität oder sowohl einer Konzentration als auch einer Aktivität von Neurotrophin 3 und/oder eines Transcriptionsprodukts eines Gens, das für Neurotrophin 3 codiert, in einer Liquorprobe von einem Menschen; und Vergleichen der Konzentration oder der Aktivität oder sowohl der Konzentration als auch der Aktivität mit einem Referenzwert, der einen bekannten Krankheits- oder Gesundheitszustand darstellt; wobei eine Erhöhung der Konzentration des Neurotrophin 3 im Liquor des Menschen relativ zu dem Referenzwert, der einen bekannten Gesundheitszustand darstellt, eine Diagnose oder Prognose oder ein erhöhtes Risiko einer Depression, insbesondere Major Depression, bei dem Menschen anzeigt; wodurch eine Depression bei dem Menschen diagnostiziert oder prognostiziert wird oder bestimmt wird, ob der Mensch ein erhöhtes Risiko hat, eine Depression zu entwickeln.
In-vitro-Verfahren zur Überwachung des Fortschritts einer Depression, insbesondere einer Major Depression, umfassend: Bestimmen einer Konzentration oder einer Aktivität oder sowohl einer Konzentration als auch einer Aktivität von Neurotrophin 3 und/oder eines Transcriptionsprodukts eines Gens, das für Neurotrophin 3 codiert, in einer Liquorprobe von einem Menschen; und Vergleichen der Konzentration oder der Aktivität oder sowohl der Konzentration als auch der Aktivität mit einem Referenzwert, der einen bekannten Krankheits- oder Gesundheitszustand darstellt; wobei eine Erhöhung der Konzentration des Neurotrophin 3 im Liquor des Menschen relativ zu dem Referenzwert, der einen bekannten Gesundheitszustand darstellt, eine Diagnose oder Prognose oder ein erhöhtes Risiko einer Depression, insbesondere Major Depression, bei dem Menschen anzeigt; wodurch der Fortschritt der Depression bei dem Menschen überwacht wird.
In-vitro-Verfahren zur Bewertung einer Behandlung einer Depression, insbesondere einer Major Depression, umfassend: Bestimmen einer Konzentration oder einer Aktivität oder sowohl einer Konzentration als auch einer Aktivität von Neurotrophin 3 und/oder eines Transcriptionsprodukts eines Gens, das für Neurotrophin 3 codiert, in einer Liquorprobe von einem Menschen; und Vergleichen der Konzentration oder der Aktivität oder sowohl der Konzentration als auch der Aktivität mit einem Referenzwert, der einen bekannten Krankheits- oder Gesundheitszustand darstellt; wobei eine Erhöhung der Konzentration des Neurotrophin 3 im Liquor des Menschen relativ zu dem Referenzwert, der einen bekannten Gesundheitszustand darstellt, eine Diagnose oder Prognose oder ein erhöhtes Risiko einer Depression, insbesondere Major Depression, bei dem Menschen anzeigt; wodurch die Behandlung der Depression bewertet wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei eine Konzentration an Neurotrophin 3 von ≥ 15 pg/ml in dem Liquor eine Diagnose oder Prognose oder ein erhöhtes Risiko einer Depression, insbesondere Major Depression, bei dem Menschen anzeigt.
Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei eine Konzentration an Neurotrophin 3 im Bereich von 15 pg/ml bis 50 pg/ml in dem Liquor eine Diagnose oder Prognose oder ein erhöhtes Risiko einer Depression, insbesondere Major Depression, bei dem Menschen anzeigt.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Neurotrophin 3 und/oder das Transcriptionsprodukt mit Hilfe eines Immunoassays und/oder eines Bindungsassays nachgewiesen wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, das weiterhin Folgendes umfasst: Vergleichen einer Konzentration oder einer Aktivität oder sowohl einer Konzentration als auch einer Aktivität von Neurotrophin 3 und/oder eines Transcriptionsprodukts eines Gens, das für Neurotrophin 3 codiert, in der Liquorprobe mit einer Konzentration oder einer Aktivität oder sowohl einer Konzentration als auch einer Aktivität von wenigstens einer der Substanzen in einer Reihe von Liquorproben, die über einen Zeitraum hinweg von dem Menschen entnommen wurden.
Verfahren gemäß Anspruch 7, wobei der Mensch vor einer oder mehreren der Entnahmen der Liquorprobe eine Behandlung erhält.
Verfahren gemäß Anspruch 8, wobei die Konzentration oder die Aktivität oder sowohl die Konzentration als auch die Aktivität in der Liquorprobe vor und nach der Behandlung des Menschen bestimmt wird.
Verwendung eines Kits, der wenigstens ein Reagens umfasst, das selektiv Neurotrophin 3 oder ein Transcriptionsprodukt eines Gens, das für Neurotrophin 3 codiert, nachweist, für die In-vitro-Diagnose oder -Prognose einer Depression, insbesondere einer Major Depression, oder für die In-vitro-Bestimmung eines erhöhten Risikos, eine solche zu entwickeln.