DE4437163C1

DE4437163C1 - Liq. chromatography based on eluate quantity, improves sepn. and reproducibility,

Info

Publication number: DE4437163C1
Application number: DE19944437163
Authority: DE
Inventors: Wolfgang Dr Demmer; Thomas Ehlert; Khuong Tovinh; Juergen Kaiser; Dietmar Dr Nusbaumer
Original assignee: Sartorius AG
Current assignee: Sartorius AG
Priority date: 1994-10-18
Filing date: 1994-10-18
Publication date: 1995-12-14
Anticipated expiration: 2014-10-19
Also published as: WO1996012180A1

Abstract

The invention relates to a process and device for liquid-chromatographic analyses and substance separations on a laboratory, technical and production scale and is applicable to the fields of bio-technology, medicine, chemistry and the obtaining of valuable substances. It is the aim of the invention to provide an improved process for performing liquid-chromatographic analyses and substance separations distinguished in particular by great reproducibility in the results, improved separation power and possibly higher working rates, and a device for implementing the process. This aim is achieved in that the extinction of the eluted substances is determined as a function of the quantity of eluted liquid and/or the flow rate of eluted liquid is kept constant and a device for performing liquid-chromatographic analyses and substance separations is combined with one for determining the quantity of eluted liquid and/or with one for controlling the flow rate of eluted liquid. The quantity is preferably determined as a mass by means of electronic scales.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Durchführung flüssigkeitschromatographischer Analysen und Stofftrennungen, die mit hoher Reproduzierbarkeit, Genauigkeit und Geschwindigkeit ausführbar sind. Die Erfindung ist anwendbar im Labor, im technischen und im Produktionsmaßstab für die Realisierung von Chromatographieaufgaben in den Bereichen der Biotechnologie, Medizin, Chemie und zur Wertstoffgewinnung.The invention relates to a method and an apparatus for carrying it out liquid chromatographic analyzes and material separations with high Reproducibility, accuracy and speed are executable. The invention is applicable in the laboratory, on a technical and in production scale for implementation of chromatography tasks in the fields of biotechnology, medicine, chemistry and for the recovery of valuable materials.

Bekanntlich wird zur qualitativen und quantitativen Analyse und zur präparativen Stofftrennung mit Hilfe der Flüssigkeitschromatographie eine Probe eines Stoffgemisches auf einen chromatographischen Träger gegeben und mittels Elutionsflüssigkeiten (Eluenten), die unter Druck durch den Träger gepreßt werden, aufgetrennt. In Abhängigkeit vom Ausmaß der Wechselwirkung der Bestandteile der Probe mit dem Träger und den Elutionsflüssigkeiten werden die einzelne Bestandteile vom Träger unterschiedlich stark festgehalten und treten fraktioniert aus. Sie werden durch eine Detektionseinrichtung angezeigt und in einem Fraktionssammler gesammelt. Die an der Detektionseinrichtung angezeigten Extinktionen werden üblicherweise als Funktion der Zeit (Retentionszeit) aufgetragen. Anhand des Kurvenbildes können die aufgetrennten Stoffe qualitativ und quantitativ bestimmt werden.It is well known that qualitative and quantitative analysis and preparative are used Separation of substances using liquid chromatography is a sample of a mixture of substances placed on a chromatographic support and by means of elution liquids (Eluents), which are pressed under pressure through the carrier. In Depending on the extent of the interaction of the components of the sample with the Carrier and the elution liquids become the individual components of the carrier held to varying degrees and exited in fractions. You are going through a Detection device displayed and collected in a fraction collector. The on the Absorbances displayed are usually a function of the detection device Time (retention time). On the basis of the graph, the separated Substances can be determined qualitatively and quantitatively.

Die Probe kann derart auf den Träger aufgegeben werden, daß sie entweder nur einen Teil oder seine gesamte Kapazität einnimmt. Im letzteren Fall, der sogenannten frontalen Chromatographie, wird der Träger mit dem zu trennenden Stoffgemisch in einem Umfang beaufschlagt, bis der gewünschte Stoff am Auslaß des Moduls, der den Träger beinhaltet, erscheint. Mit geeigneten Elutionsflüssigkeiten kann er eluiert und von den anderen am Träger festgehaltenen Stoffen abgetrennt werden.The sample can be placed on the support in such a way that it is either only one Takes up part or all of its capacity. In the latter case, the so-called frontal Chromatography, the carrier with the mixture of substances to be separated in one Scope applied until the desired substance at the outlet of the module that supports the carrier includes appears. With suitable elution liquids, it can be eluted and from the other substances attached to the carrier are separated.

Die frontale Chromatographie wird auch zur Ermittlung von Durchbruchskurven benutzt, deren Kenntnis für die Beschreibung der Wirksamkeit des Trägers und des gesamten Moduls für den gewünschten Stofftrennprozeß erforderlich ist. Hierbei wird der Träger vollständig mit dem zu trennenden Stoffgemisch beladen und der zeitliche Verlauf der Extinktion im Ablauf des Trägers gemessen. Aus dem Verlauf der Extinktionskurve für diesen Stoff können Rückschlüsse auf die Qualität und Brauchbarkeit des Trennsystems gezogen werden. Wünschenswert ist ein möglichst steiler Anstieg der Extinktion.Frontal chromatography is also used to determine breakthrough curves used, their knowledge for the description of the effectiveness of the carrier and the entire module is required for the desired material separation process. Here will the carrier fully loaded with the mixture of substances to be separated and the temporal Absorbance measured in the runoff of the carrier. From the course of the Absorbance curve for this substance can draw conclusions about the quality and Usability of the separation system are drawn. One is desirable if possible steep increase in extinction.

Unter Flüssigkeitschromatographie werden in der Erfindungsbeschreibung Chromatographieverfahren verstanden wie HPLC, Säulenchromatographie und Separationschromatographie. Als Module werden die Baueinheiten bezeichnet, die zwischen Flüssigkeitseinlaß und -auslaß den chromatographischen Träger enthalten. Die Module sind bei der HPLC als Kapillare, bei der Säulenchromatographie als Säule und bei der Separationschromatographie als Dead-End-Module, wie sie in der Separationstechnik (Filtrationstechnik) gebräuchlich sind, ausgestaltet.Liquid chromatography is used in the description of the invention Chromatography methods understood like HPLC, column chromatography and Separation chromatography. The modules are the modules that contain the chromatographic support between the liquid inlet and outlet. The In HPLC modules are as capillaries, in column chromatography as columns and in separation chromatography as dead-end modules, as in the Separation technology (filtration technology) are used.

Als chromatographische Träger kommen alle bekannten Medien in Betracht, insbesondere Harze, Gele, poröse partikuläre und poröse nichtpartikuläre Adsorber und Ionenaustauscher, für die Separationschromatographie vorzugsweise poröse nichtpartikuläre polymere Adsorber wie Vliese oder Membranen (Membranadsorber) in Form von Röhren, Hohlfasern und flächigen Materialien. Nach der WO-A1 92/00805 sind poröse Membranadsorber Membranen, die an ihrer Oberfläche funktionelle Gruppen, Liganden oder Reaktanden tragen, die zur Wechselwirkung mit mindestens einer Komponente einer mit ihr in Kontakt stehenden flüssigen Phase befähigt sind. Der Transport der flüssigen Phase durch die Membran hindurch erfolgt dabei konvektiv. Die Bezeichnung Membranadsorber ist Oberbegriff für verschiedene Membranadsorbertypen wie Membranionenaustauscher, Ligandenmembranen und aktivierte Membranen. Vliese und Membranen werden zur Erhöhung der Modulkapazität vorzugsweise als Stapel eingesetzt.All known media can be used as chromatographic supports, in particular resins, gels, porous particulate and porous non-particulate adsorbers and Ion exchanger, preferably porous for separation chromatography non-particulate polymeric adsorbers such as fleeces or membranes (membrane adsorbers) in Form of tubes, hollow fibers and flat materials. According to WO-A1 92/00805 are porous membrane adsorber membranes that have a functional surface Carry groups, ligands or reactants that interact with at least a component of a liquid phase in contact with it. Of the The liquid phase is transported convectively through the membrane. The The term membrane adsorber is a generic term for various types of membrane adsorbers such as membrane ion exchangers, ligand membranes and activated membranes. Fleeces and membranes are preferably stacked to increase module capacity used.

Im Routinebetrieb, insbesondere bei automatisch ablaufenden Chromatographiereihen (Chargen), müssen die durchzuführenden Analysen und Stofftrennungen mit dem gleichen Modul wiederholbar sein und ein hohes Maß an Reproduzierbarkeit der Ergebnisse aufweisen. In der Praxis wird eine Reproduzierbarkeit nur unzureichend erreicht. Mit zunehmender Chargenanzahl der zu analysierenden Reihe fallen die Extintionen, die die einzelnen Stoffe charakterisieren, zeitlich nicht mehr zusammen oder sie überlappen stark. Die Zeitverschiebung und Überlappung erschwert die Zuordnung der einzelnen Extinktionen zu den dazugehörigen Stoffen und behindert somit ihre qualitative und quantitative Auswertung. Die Überlappung führt zu einer deutlichen Verschlechterung in der Auftrennung des Stoffgemisches in die gewünschten Komponenten. Die Durchbruchskurven verlaufen in der frontalen Chromatographie stark abgeflacht, so daß die Module für die jeweilige Trennaufgabe ungeeignet zu sein scheinen. Die Flußrate an Elutionsflüssigkeit durch den Modul nimmt mit zunehmender Dauer der Chromatographie, das heißt mit zunehmender Elutionszeit und Chargenanzahl ab.In routine operation, especially with automatic chromatographic series (Batches), the analyzes and material separations to be carried out must be carried out with the same module can be repeated and a high degree of reproducibility of the Show results. In practice, reproducibility becomes insufficient reached. As the number of batches in the series to be analyzed increases, the Extinctions that characterize the individual substances no longer occur together or they overlap strongly. The time difference and overlap make the assignment difficult of the individual extinctions to the associated substances and thus hinders theirs qualitative and quantitative evaluation. The overlap leads to a clear one Deterioration in the separation of the mixture into the desired Components. The breakthrough curves are strong in frontal chromatography flattened so that the modules are unsuitable for the respective separation task seem to be. The flow rate of elution liquid through the module increases with increasing Chromatography duration, i.e. with increasing elution time and number of batches from.

Die Zeitverschiebung der Extinktion und die damit verbundenen Nachteile sind in erster Linie zurückzuführen auf eine Abnahme der Flußrate an Elutionsflüssigkeit durch den Modul. Die Abnahme der Flußrate kann verursacht werden durch Leckagen auf der Druckseite der Vorrichtung, Qualitätsmängel in der Druckbeaufschlagung, z. B. durch mangelhafte Pumpen und durch Verringerung der Durchlaßfähigkeit des Moduls, z. B. wegen Verblockung der Poren des Trägers, wie Deckschichtbildung auf der Oberfläche (Membranfouling), unzulässiges Quellverhalten oder Verdichtungen des Trägers. Zur Beseitigung dieser Mängel wurden Maßnahmen vorgeschlagen wie, Verwendung von Hochleistungspräzisionspumpen, regelmäßige Überprüfung der Vorrichtung auf Undichtigkeiten und ihre Beseitigung, zusätzliche Regenerierungsschritte des Trägers, Eichungen mit internen Standardsubstanzen und Rekalkulation der Daten durch Computerprogramme.The time shift in absorbance and the associated disadvantages are first Line attributed to a decrease in the flow rate of elution liquid through the Module. The decrease in flow rate can be caused by leakage on the Pressure side of the device, quality deficiencies in the pressurization, e.g. B. by defective pumps and by reducing the permeability of the module, e.g. B. due to blocking of the pores of the support, such as the formation of a covering layer on the surface (Membrane fouling), impermissible swelling behavior or compression of the carrier. For Measures to remedy these shortcomings have been proposed, such as using High performance precision pumps, regular checking of the device Leaks and their elimination, additional regeneration steps of the wearer, Calibrations with internal standard substances and recalculation of the data Computer programs.

So ist aus DE-A1 36 08 227 eine Anordnung zur Flüssigkeitschromatographie bekannt, die ein genaues Analysenergebnis liefern soll, indem ein Korrekturfaktor aus einem frei vorwählbaren Soll-Durchfluß an zu eluierender Flüssigkeit und einem gemessenen Ist-Durchfluß ermittelt und zur Rekalkulation an die Auswerteeinheit übermittelt wird. Mit dieser Korrektur wird dafür gesorgt, daß Abweichungen der Ist-Flußrate am Detektor nicht zu einer Verfälschung des Analysenergebnisses führen. Die Ermittlung des Korrekturfaktors erfolgt mit einem speziellen dem Detektor nachgeschalteten Durchflußmesser für Mikromengen, die bis zu 0,1 Mikroliter pro Sekunde herunter gehen können.From DE-A1 36 08 227 an arrangement for liquid chromatography is known, the one should deliver accurate analysis results by using a correction factor from a free Preselectable target flow of liquid to be eluted and a measured Actual flow rate is determined and transmitted to the evaluation unit for recalculation. With this Correction ensures that deviations in the actual flow rate at the detector do not Falsify the analysis result. The correction factor is determined with a special flow meter downstream of the detector for micro quantities can go down to 0.1 microliters per second.

Alle diese Maßnahmen erhöhen den Aufwand zur Durchführung der Chromatographie oder sind im Routinebetrieb, insbesondere bei automatischen Chromatographiereihen nicht oder nur unzureichend realisierbar.All of these measures increase the effort required to carry out the chromatography or are in routine operation, especially with automatic chromatography series not or only insufficiently realizable.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein verbessertes Verfahren zur Durchführung flüssigkeitschromatographischer Analysen und Stofftrennungen zu schaffen, das sich insbesondere durch eine hohe Reproduzierbarkeit der Ergebnisse, eine verbesserte Trennleistung und gegebenenfalls durch eine höhere Geschwindigkeit auszeichnet, sowie eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens bereitzustellen.The invention is therefore based on the object of an improved method for Carrying out liquid chromatographic analyzes and separations create that especially through a high reproducibility of the results, a improved separation performance and possibly through a higher speed distinguished, as well as to provide a device for performing the method.

Die Aufgabe wird dadurch gelöst, daß die Extinktion der eluierten Stoffe als Funktion der Menge an eluierter Flüssigkeit bestimmt wird und/oder die Flußrate an eluierter Flüssigkeit konstant gehalten wird und daß eine Vorrichtung zur Durchführung flüssigkeitschromatographischer Analysen und Stofftrennungen mit einer Einrichtung zur Mengenbestimmung an eluierter Flüssigkeit und/oder mit einer Einrichtung zur Steuerung der Flußrate an eluierter Flüssigkeit kombiniert wird.The object is achieved in that the extinction of the eluted substances as a function the amount of eluted liquid is determined and / or the flow rate of eluted Liquid is kept constant and that a device for performing liquid chromatographic analyzes and separations with a device for Quantity determination of eluted liquid and / or with a device for Control of the flow rate of eluted liquid is combined.

Es wurde überraschenderweise gefunden, daß die Extinktionen, die als Funktion der Menge an eluierter Flüssigkeit gemessen wurden, zwischen den Chargen in hohem Maße übereinstimmen, während sie, wenn sie wie nach dem Stand der Technik über die Zeit gemessen werden, deutlich voneinander abwichen und damit zu nicht reproduzierbaren Ergebnissen oder Fehlinterpretationen in der Verwendbarkeit des chromatographischen Systems führten.It was surprisingly found that the extinctions, which function as the Amount of eluted liquid was measured between batches to a large extent match while they if they like the state of the art over time be measured, differ significantly from one another and thus become non-reproducible Results or misinterpretations in the usability of the chromatographic Systems led.

Weiter wurde gefunden, daß Trennaufgaben mit gleichbleibender Trennschärfe zwischen den Stoffen und hoher Reproduzierbarkeit durchgeführt werden können, wenn man die Flußrate konstant hält. Dazu wird die Förderleistung von Dosierpumpen in Abhängigkeit von der im Fraktionssammler gemessenen eluierten Menge so geregelt, daß die Flußleistung nach Passage des Moduls konstant ist. Das hat den Vorteil, daß die Vorrichtung kostengünstig aufgebaut werden kann, indem man auf die Verwendung von Präzisionspumpen und einen hohen Aufwand bei der Abdichtung des Systems verzichtet. Die Trennaufgaben sind im Routinebetrieb mit dem gleichen Zeitaufwand für jede Charge durchführbar. Dadurch, daß bei erfindungsgemäßer Durchführung des Verfahrens mit konstanter Flußrate eine nach dem Stand der Technik auftretende dramatische Verschiebung der Elutionspeaks, die durch Verblocken der Adsorber-Einheit hervorgerufen würde, verhindert wird, wird eine sichere Identifikation der einzelnen Substanzen auch im Routinebetrieb gewährleistet.It was also found that separation tasks with constant selectivity between the fabrics and high reproducibility can be carried out if the Flow rate keeps constant. The delivery rate of dosing pumps is dependent on this regulated by the eluted quantity measured in the fraction collector so that the Flow performance after passage of the module is constant. This has the advantage that the Device can be built inexpensively by relying on the use of Precision pumps and a great deal of effort in sealing the system are dispensed with. The separation tasks are in routine operation with the same amount of time for each batch feasible. The fact that when carrying out the method according to the invention with constant flow rate is a dramatic state of the art Displacement of the elution peaks caused by blocking the adsorber unit would be prevented, safe identification of the individual Substances guaranteed even in routine operation.

Die Bestimmung der Menge an eluierter Flüssigkeit wird vorzugsweise gravimetrisch oder volumetrisch vorgenommen. Alternativ oder zusätzlich erfolgt ausgehend von der gemessenen Menge an eluierter Flüssigkeit eine Rückkopplung auf die Druckbeaufschlagung des Moduls mit Elutionsflüssigkeit in der Weise, daß eine konstante Flußrate innerhalb einer Chromatographiecharge und über alle Chargen hinweg gewährleistet wird.The determination of the amount of eluted liquid is preferably gravimetric or made volumetrically. Alternatively or in addition, the measured amount of eluted liquid a feedback to the Pressurizing the module with elution liquid in such a way that a constant flow rate within one chromatography batch and across all batches is guaranteed.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung erfolgt die Bestimmung der Menge an eluierter Flüssigkeit gravimetrisch mittels einer Waage und die Konstanthaltung der Flußrate mittels einer Vorrichtung zum pulsationsfreien kontinuierlichen gravimetrischen Dosieren, wie sie beispielsweise aus der Deutschen Patentschrift 39 38 898 bekannt ist.In a preferred embodiment of the invention, the amount is determined on eluted liquid gravimetrically using a balance and keeping the Flow rate by means of a device for pulsation-free continuous gravimetric Dosing, as is known for example from German Patent 39 38 898.

Die Erfindung wird anhand der beiliegenden Zeichnungen und Beispiele näher beschrieben. Dabei zeigt:The invention will become more apparent from the accompanying drawings and examples described. It shows:

Fig. 1 die schematische Darstellung eines Ausführungsbeispiels einer erfindungsgemäßen Vorrichtung mit einer Einrichtung zur gravimetrischen Bestimmung der eluierten Flüssigkeit, Fig. 1 is a schematic representation of an embodiment of an inventive device with a device for the gravimetric determination of the eluted liquid,

Fig. 2 die schematische Darstellung eines Ausführungsbeispiels einer erfindungsgemäßen Vorrichtung mit einer Einrichtung zur Konstanthaltung der Flußrate, Fig. 2 is a schematic representation of an embodiment of an inventive device with a device for keeping constant the flow rate,

Fig. 3 Durchbruchskurven für ein Protein mit erfindungsgemäßer und ohne Regelung der Flußrate, Fig. 3 breakthrough curves for a protein of the invention and without control of the flow rate,

Fig. 4A ein Chromatogramm mit erfindungsgemäßer Regelung der Flußrate, in dem die Extinktionen als Funktion der Zeit dargestellt ist und Fig. 4A is a chromatogram with the inventive control of the flow rate, in which the extinctions is shown as a function of time and

Fig. 4B ein Chromatogramm, bei dem die Extinktionen als Funktion der Zeit dargestellt sind, wobei aber keine Regelung der Flußrate erfolgte. FIG. 4B is a chromatogram in which the absorbances are plotted as a function of time, but which was no control of the flow rate.

Das Ausführungsbeispiel gemäß Fig. 1 besteht aus einer Kombination einer HPLC-Vorrichtung, von der ein Eluentenreservoir 1, eine Dosierpumpe 2, eine Trennsäule 3, ein Detektor 4, ein Fraktionssammler 5 für eluierte Flüssigkeit und eine PC-gesteuerte Datenerfassungs-,-Steuer- und Auswerteeinheit 6 dargestellt ist, mit einer elektronischen Waage 7 zur Messung der Masse an eluierter Flüssigkeit. Der Detektor 4 und die elektronische Waage 7 sind mit der PC-gesteuerten Datenerfassungs-, Steuer- und Auswerteeinheit 6 datenverarbeitungstechnisch verbunden. Die PC-gesteuerte Datenerfassungs-, Steuer- und Auswerteeinheit 6 liefert Extinktionskurven als Funktion der Masse. . The embodiment according to Figure 1 consists of a combination of an HPLC apparatus, from which a Eluentenreservoir 1, a metering pump 2, a separation column 3, a detector 4, a fraction collector 5 for eluting liquid, and a PC-controlled data acquisition -, - control and evaluation unit 6 is shown, with an electronic balance 7 for measuring the mass of eluted liquid. The detector 4 and the electronic scale 7 are connected to the PC-controlled data acquisition, control and evaluation unit 6 for data processing purposes. The PC-controlled data acquisition, control and evaluation unit 6 delivers extinction curves as a function of mass.

example 1

Mit einer HPLC-Vorrichtung (Millenium 2010 mit Refraktometer Detektor der Waters GmbH) wird ein Lösungsgemisch von Dextranen mit einer Molekularmasse zwischen 4000 und 550 000 chromatographiert.With an HPLC device (Millenium 2010 with refractometer detector from Waters GmbH) a mixture of dextrans with a molecular mass between 4000 and 550 000 chromatographed.

In der Tabelle 1 sind die in einer ersten und einer 5. Charge gemessenen Extinktionswerte in bekannter Weise als Funktion der Zeit und erfindungsgemäß als Funktion der Masse an eluierter Flüssigkeit dargestellt. Es ist sichtbar, daß die Extinktionen, die als Funktion der Zeit gemessen wurden zwischen den Chargen deutlich voneinander abweichen, während sie nach dem erfindungsgemäßen Verfahren in einem hohen Maß übereinstimmen.Table 1 shows those measured in a first and a fifth batch Absorbance values in a known manner as a function of time and according to the invention as Function of the mass of eluted liquid is shown. It can be seen that the Absorbances that were measured as a function of time were evident between batches differ from one another, while they are in one high level match.

Tabelle 1 Table 1

Wie das Ausführungsbeispiel gemäß Fig. 2 zeigt, besteht die Vorrichtung aus einer Kombination einer Vorrichtung zur Separationschromatographie mit einem Modul 8, Gefäßen zur Aufnahme der zu separierenden Probenlösung 9, 9′, Eluentenreservoirs 1, 1′, einem Fraktionssammler 5 für eluierte Flüssigkeit, einem Detektor 4 und aus einer Vorrichtung zur gravimetrischen Dosierung eines Flüssigkeits-Massenstromes in Form einer elektronischen Waage 7, einer Schnittstelle 10, einer PC gesteuerten Datenerfassungs-, Steuer- und Auswerteeinheit 6 und Dosierpumpen 2, 2′. Der Modul 8 enthält einen chromatographischen Träger 11 in Form eines Membranadsorbers, vorzugsweise eines Membranadsorberstapels aus mindestens zwei Membranlagen, der fluiddicht zwischen einem Flüssigkeitseinlaß 12 und einem Flüssigkeitsauslaß 13 für Permeat (eluierte Flüssigkeit) angeordnet ist. Am Flüssigkeitsauslaß 13 für Permeat (eluierte Flüssigkeit) ist der Detektor 4 zur Messung der Extinktion der durch den Träger 11 durchbrechenden Stoffe angeordnet bevor der Flüssigkeitsauslaß 13 in einem auf einer elektronischen Waage 7 befindlichen Fraktionssammler 5 mündet. Die Lösung des zu behandelnden Stoffgemisches befindet sich in den Probengefäßen 9 oder 9′. Sie wird aus 9′ beispielsweise per Hand mittels Kolbenspritze oder aus 9 automatisch über die Dosierpumpe 2 oder einer wahlweise vorhandenen (Hilfs-) Dosierpumpe 2′, die druckseitig mit dem Flüssigkeitseinlaß 12 des Moduls 8 verbunden sind, auf den Träger 11 aufgegeben. Die Dosierpumpe 2 und die wahlweise vorhandene (Hilfs-) Dosierpumpe 2′ sind ansaugseitig mit den Eluentenreservoirs 1, 1′ verbunden.As the exemplary embodiment of FIG. 2, the device consists of a combination of an apparatus for separation chromatography with a module 8, vessels for receiving the to be separated sample solution 9, 9 ', Eluentenreservoirs 1, 1', a fraction collector 5 for eluting liquid, Detector 4 and from a device for gravimetric metering of a liquid mass flow in the form of an electronic balance 7 , an interface 10 , a PC-controlled data acquisition, control and evaluation unit 6 and metering pumps 2 , 2 '. The module 8 contains a chromatographic support 11 in the form of a membrane adsorber, preferably a membrane adsorber stack from at least two membrane systems, which is arranged in a fluid-tight manner between a liquid inlet 12 and a liquid outlet 13 for permeate (eluted liquid). At the liquid outlet 13 for permeate (eluted liquid), the detector 4 for measuring the extinction of the substances breaking through the carrier 11 is arranged before the liquid outlet 13 opens into a fraction collector 5 located on an electronic balance 7 . The solution of the mixture of substances to be treated is in the sample vessels 9 or 9 '. It is from 9 ', for example by hand using a syringe or from 9 automatically via the metering pump 2 or an optional (auxiliary) metering pump 2 ', which are connected on the pressure side to the liquid inlet 12 of the module 8 , on the carrier 11 . The metering pump 2 and the optionally available (auxiliary) metering pump 2 'are connected on the suction side to the eluent reservoirs 1 , 1 '.

Die Vorrichtung zur gravimetrischen Dosierung des Flüssigkeits-Massenstromes fördert die Flüssigkeit mit einem voreinstellbaren Wert aus dem Probengefäß 9 und den Eluentenreservoirs 1, 1′ mit der Dosierpumpe 2 oder den Dosierpumpen 2, 2′ über den Flüssigkeitseinlaß 12, den Träger 11 und den Flüssigkeitsauslaß 13 des Moduls 8 in den Fraktionssammler 5, der sich auf der elektronischen Waage 7 befindet. Mit Hilfe eines Datenerfassungs-, Steuer- und Auswerteprogramms der PC-gesteuerte Datenerfassungs-, Steuer- und Auswerteeinheit 6 wird aufgrund der Ausgangssignale der Waage 7 die Förderleistung der Dosierpumpe 2 beziehungsweise der Dosierpumpen 2, 2′ so geregelt, daß der voreingestellte Wert des Massenstromes an Flüssigkeit, der den Träger 11 passiert, konstant gehalten wird. Über die Schnittstelle 10 ist die PC gesteuerte Datenerfassungs-, Steuer- und Auswerteeinheit 6 mit der Waage 7, den Dosierpumpen 2, 2′ und dem Detektor 4 datenverarbeitungstechnisch verbunden.The device for gravimetric metering of the liquid mass flow conveys the liquid with a preset value from the sample vessel 9 and the eluent reservoirs 1 , 1 'with the metering pump 2 or the metering pumps 2 , 2 ' via the liquid inlet 12 , the carrier 11 and the liquid outlet 13 of the module 8 in the fraction collector 5 , which is located on the electronic scale 7 . With the help of a data acquisition, control and evaluation program of the PC-controlled data acquisition, control and evaluation unit 6 , the delivery rate of the metering pump 2 or the metering pumps 2 , 2 'is regulated on the basis of the output signals of the scale 7 so that the preset value of the mass flow of liquid that passes through the carrier 11 is kept constant. Via the interface 10 , the PC-controlled data acquisition, control and evaluation unit 6 is connected to the balance 7 , the metering pumps 2 , 2 'and the detector 4 in terms of data processing technology.

Example 2

Mit einer erfindungsgemäßen Vorrichtung gemäß Fig. 2 wurde die Durchbruchskurve eines Testproteins bei konstanter Flußrate bestimmt und mit einer Durchbruchskurve, die in herkömmlicher Weise ohne Regelung der Flußrate erhalten wurde, verglichen. Dazu wurden in beiden Fällen die Extinktionen als Funktion der Zeit dargestellt.With an inventive device according to FIG. 2, the break-through curve was determined at a constant flow rate of a sample protein and compared with a breakthrough curve obtained in a conventional manner without control of the flow rate. In both cases, the extinctions were shown as a function of time.

Zur Durchführung des Verfahrens wird ein Modul mit einem stark basischen Membranionenaustauscher von 3,4 cm² Fläche mit Rinderserumalbumin (0,5 mg/ml 0,01 M Kalium-Phosphat-Puffer, pH 7) beaufschlagt und die Extinktion im Ablauf des Moduls aufgezeichnet. Das Ergebnis wird durch die in der Fig. 3 dargestellten Kurven widergegeben, wobei die Kurve 2 ohne Regelung der Flußrate und die Kurve 1 erfindungsgemäß mit Regelung der Flußrate erhalten wurde. Aus dem verzögerten Beginn des Durchbruchs an Rinderserumalbumin (Kurve 2) wird eine höhere Kapazität des Membranadsorbers vorgetäuscht, als tatsächlich vorhanden ist. Außerdem könnte der flache Anstieg der Kurve 2 zu dem Schluß führen, daß das System für bestimmte Trennaufgaben unter den gewählten Bedingungen ungeeignet ist.To carry out the process, a module with a strongly basic membrane ion exchanger with a surface area of 3.4 cm 2 is exposed to bovine serum albumin (0.5 mg / ml 0.01 M potassium phosphate buffer, pH 7) and the absorbance recorded in the course of the module. The result is represented by the curves shown in FIG. 3, curve 2 being obtained without regulation of the flow rate and curve 1 according to the invention having regulation of the flow rate. The delayed start of the breakthrough in bovine serum albumin (curve 2 ) simulates a higher capacity of the membrane adsorber than is actually available. In addition, the flat rise of curve 2 could lead to the conclusion that the system is unsuitable for certain separation tasks under the chosen conditions.

Die Tabelle 2 gibt die gemessenen Flußraten gemäß Beispiel 2 am Beginn und Ende der Charge wider.Table 2 gives the measured flow rates according to Example 2 at the beginning and end of the Batch reflected.

Tabelle 2 Table 2

Example 3

Zur Trennung eines Proteingemisches mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung gemäß Fig. 2 wird ein Gemisch der drei kommerziell erhältlichen Proteine Chymotrypsinogen, Cytochrom C und Lysozym (je 0,5 mg/ml; Gesamtproteingehalt 1,5 mg/ml) in 0,01 M Natrium-Acetat-Puffer pH 5,0 gelöst und von dieser Lösung 1 ml durch einen stark sauren Membran-Ionenaustauscher-Modul gepumpt. Dabei war die Adsorption der Proteine vollständig, wie das Fehlen von Proteinen im Ablauf der Einheit zeigte. Durch Anlegen eines linearen Gradienten von 0-1 M Kalium-Chlorid in 0,01 M Natrium-Acetat pH 5,0 werden die Proteine in der Reihenfolge Chymotrypsinogen, Cytochrom C und Lysozym eluiert.To separate a protein mixture with the device according to the invention according to FIG. 2, a mixture of the three commercially available proteins chymotrypsinogen, cytochrome C and lysozyme (each 0.5 mg / ml; total protein content 1.5 mg / ml) in 0.01 M sodium Acetate buffer pH 5.0 dissolved and 1 ml of this solution pumped through a strongly acidic membrane ion exchanger module. The adsorption of the proteins was complete, as the absence of proteins in the outlet of the unit showed. The proteins are eluted in the order chymotrypsinogen, cytochrome C and lysozyme by applying a linear gradient of 0-1 M potassium chloride in 0.01 M sodium acetate pH 5.0.

Das mit der erfindungsgemäßen Regelung der Flußrate erhaltene Chromatogramm, in dem die Extinktionen als Funktion der Masse dargestellt ist, zeigt Fig. 4A. Ein Vergleich mit einem Chromatogramm, bei dem die Extinktionen als Funktion der Zeit dargestellt ist, und das unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 3 beschrieben erhalten wurde, wobei aber keine Regelung der Flußrate erfolgte (Fig. 4 B) zeigt, daß durch Verblocken der Adsorber-Einheit die Elutionspeaks dramatisch verschoben werden, so daß eine sichere Identifikation der einzelnen Substanzen nicht mehr gewährleistet ist.The chromatogram obtained with the regulation of the flow rate according to the invention, in which the extinction is shown as a function of mass, is shown in FIG. 4A. A comparison with a chromatogram, in which the extinctions are shown as a function of time, and which was obtained under the same conditions as described in Example 3, but with no regulation of the flow rate ( FIG. 4B), shows that by blocking the Adsorber unit the elution peaks are shifted dramatically, so that a reliable identification of the individual substances is no longer guaranteed.

Claims

1. Method for carrying out liquid chromatographic analyzes and substance separations by applying a substance mixture to a chromatographic support located in a module, pumping elution liquids through the module, detecting the substances present in the eluted liquid after passage of the module and collecting the eluted liquid in a fraction collector, characterized in that the mass of eluted liquid is measured with a balance and the detected extinction values of the substances are evaluated as a function of the mass of eluted liquid for analysis and material separation.

2. Procedure for performing liquid chromatographic analyzes and Separation of substances by applying a mixture of substances to one in a module located chromatographic support, pumping elution liquids through through the module by means of dosing pumps, detecting the passage of the module in the substances present in the eluted liquid, collecting the eluted liquid in one Fraction collector and display of the detected absorbance values as a function of time, characterized in that the flow rate of eluted liquid is measured after passage of the module; Measured values from a PC-controlled data acquisition, control and evaluation unit fed and processed in such a way that by controlling the metering pumps Flow rate of eluted liquid is kept constant at a preset value.

3. The method according to claim 2, characterized in that the flow rate of eluted liquid is measured gravimetrically or volumetrically.

4. The method according to claims 1 to 3, characterized in that the mixture of substances on membrane adsorber as in a module chromatographic support is applied.

5. The method according to claim 4, characterized in that the mixture of substances a membrane adsorber stack consisting of at least two flat blanks is applied.

6. Device for carrying out liquid chromatographic analyzes and Separations according to claim 1 consisting of a module with a Liquid inlet and outlet, between which there is a chromatographic support located metering pumps, the pressure side with the liquid inlet of the module and are connected on the suction side to sample vessels and eluent reservoirs, one Fraction collector, which is arranged after the liquid outlet of the module and one Detector at the liquid outlet, characterized in that the fraction collector with a balance for measuring the mass of eluted liquid is connected and optionally a PC-controlled data acquisition, control and Evaluation unit to the scale and the detector in terms of data processing technology is connected to the detected extinctions as a function of mass at eluted To represent liquid.

7. Device for carrying out liquid chromatographic analyzes and Separations according to claims 2 to 5 consisting of a module with a Liquid inlet and outlet, between which there is a chromatographic support located metering pumps, the pressure side with the liquid inlet of the module and are connected on the suction side to sample vessels and eluent reservoirs, one Fraction collector, which is arranged after the liquid outlet of the module and one Detector at the liquid outlet, characterized in that A PC-controlled data acquisition, control and Evaluation unit with a device for measuring the mass or volume in the Fraction collector of existing eluted liquid, the metering pumps and the Detector is connected to data processing technology in such a way that with the help of PC-controlled data acquisition, control and evaluation unit the conveying capacity of the Dosing pumps is controlled so that a preset value of a mass or Volume flow of eluted liquid that has passed the module is maintained.

8. The device according to claim 7, characterized in that the device for Mass is a scale.

9. Device according to claims 6 to 8, characterized in that the chromatographic support consists of membrane adsorbers.

10. The device according to claim 9, characterized in that the membrane adsorbers are present as a membrane adsorber stack consisting of at least two flat blanks existing.