DE4435919C1 - DNA encoding zinc finger protein - Google Patents

DNA encoding zinc finger protein

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Abstract

The invention concerns DNA coding for a zinc finger protein and a protein of this type. The invention further concerns the use of the DNA and the protein in diagnosis, therapy or gene therapy of tumors. The DNA coding for the zinc finger protein is an insert of the cDNA clone COS AP4-E1. This clone comes from a cDNA library of the cervix carcinoma cell line ME180, which contains the human papilloma virus 68 DNA, and has four zinc fingers in its exon sequences.

Description

Die Erfindung betrifft eine für ein Zinkfinger-Protein codierende DNA und ein solches Protein. Ferner betrifft die Erfindung die Verwendung der DNA und des Proteins.The invention relates to a DNA coding for a zinc finger protein and a such protein. The invention further relates to the use of the DNA and the Protein.

Die Umwandlung von normalen Zellen in Tumorzellen vollzieht sich in mehreren Teilschritten, bei denen es zu Veränderungen zellulärer Gene oder zum Erwerb viraler Onkogene kommt. Veränderungen zellulärer Gene umfassen die Aktivierung von Proto-Onkogenen durch Mutation, Genamplifikation, Überexpression oder Chromosomen-Translokationen sowie die Inaktivierung von Tumorsuppressorgenen durch Mutation oder Deletion.The conversion of normal cells into tumor cells takes place in several Partial steps that involve changes in cellular genes or acquisition viral oncogenes is coming. Changes in cellular genes include activation of proto-oncogenes by mutation, gene amplification, overexpression or Chromosome translocations and the inactivation of tumor suppressor genes by mutation or deletion.

Verschiedene Gene, deren Veränderungen bei der Tumorentstehung von Bedeu­ tung sind, konnten bislang identifiziert werden (vgl. Übersichtsartikel: Bishop, J. M., Cell 64 (1991), 235-248). Die Produkte solcher Gene haben verschiedene Funktionen. Sie wirken z. B. als Transkriptionsregulatoren, als Glieder unterschiedli­ cher Signaltransduktionsketten, wie Wachstumsfaktoren, Wachstumsfaktorrezep­ toren oder Proteinkinasen, bzw. als Aktivatoren oder Inhibitoren der Zellteilung.Different genes, their changes in the development of tumors of bedeu have been identified so far (see review article: Bishop, J.M. Cell 64: 235-248 (1991). The products of such genes have different ones Functions. You act z. B. as transcription regulators, as links differ signal transduction chains, such as growth factors, growth factor recipe tors or protein kinases, or as activators or inhibitors of cell division.

Beispiele von Transkriptionsregulatoren sind Zinkfinger-Proteine. Diese Proteine besitzen charakteristische, zwei Cystein- und zwei Histidinreste enthaltende Strukturen, die so zueinander positioniert sind, daß sie ein Zinkatom binden. Zinkfinger-Proteine sind DNA-bindende Proteine. Ein Beispiel für Zinkfinger-Proteine ist das Produkt des Wilms-Tumorsuppressorgen WT1, dessen Verlust bei der Entstehung von Wilms-Nierentumoren eine wesentliche Rolle spielt.Examples of transcription regulators are zinc finger proteins. These proteins have characteristic, containing two cysteine and two histidine residues Structures that are positioned so that they bind a zinc atom. Zinc finger proteins are DNA-binding proteins. An example of zinc finger proteins is the product of the Wilms tumor suppressor gene WT1, the loss of which in the Development of Wilms kidney tumors plays an important role.

Bis heute sind noch nicht alle an Tumorentstehung und -wachstum beteiligten Gene bzw. Genprodukte bekannt. Eine Tumordiagnose bzw. -therapie ist daher bisher nur begrenzt möglich.To date, not all have been involved in tumor development and growth Genes or gene products known. A tumor diagnosis or therapy is therefore so far only possible to a limited extent.

Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Mittel bereitzu­ stellen, mit dem Tumordiagnose bzw. -therapie umfassender betrieben werden kann. The present invention is therefore based on the object of providing a means with which tumor diagnosis and therapy are carried out more comprehensively can.  

Erfindungsgemäß wird dies durch die Gegenstände in den Patentansprüchen erreicht.According to the invention, this is the subject of the claims reached.

Gegenstand der Erfindung ist somit eine für ein Zinkfinger-Protein codierende DNA, die umfaßt:The invention thus relates to a DNA coding for a zinc finger protein, which includes:

  • (a) die DNA der Nukleotide 446-1476 von Fig. 1 oder einen Teil davon,(a) the DNA of nucleotides 446-1476 of FIG. 1 or a part thereof,
  • (b) eine mit der DNA von (a) hybridisierende DNA, oder(b) a DNA hybridizing with the DNA of (a), or
  • (c) eine mit der DNA von (a) oder (b) über den degenerierten genetischen Code verwandte DNA.(c) one with the DNA of (a) or (b) via the degenerate genetic code related DNA.

Der Ausdruck "hybridisierende DNA" weist auf eine DNA hin, die unter üblichen Bedingungen, insbesondere bei 20°C unter dem Schmelzpunkt der DNA, mit einer DNA von (a) hybridisiert.The term "hybridizing DNA" indicates a DNA that is commonly used Conditions, especially at 20 ° C below the melting point of the DNA, with a DNA hybridized from (a).

Fig. 1 zeigt das Insert des cDNA Klons COS AP4-E1. Dieser Klon entstammt einer cDNA-Bibliothek der Cervixcarcinomzellinie ME 180 (vgl. Reuter, M. S. et al, J. Virol. 65 (1991), 5564-5568). Diese Zellinie enthält die Human Papillomvirus 68- DNA (HPV 68-DNA) stabil integriert. Der Klon COS AP4-E1 enthält zwischen den Nukleotiden 1-21 HPV 68-DNA. Ferner enthält er zwischen den Nukleotiden 22- 1476 zelluläre Sequenzen, wobei diese zwischen den Nukleotiden 446-1476 Exon- Sequenzen eines Zinkfinger-Gens sind. Die Exon-Sequenzen codieren für 4 Zinkfin­ ger: Zinkfinger 1 : 1130-1191, Zinkfinger 2 : 1214-1275, Zinkfinger 3 : 1298-1360, Zinkfinger 4 : 1382-1432. Der Klon COS AP4-E1 wurde bei der DSM (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen unter DSM 9450 am 30. Sep­ tember 1994 hinterlegt. Fig. 1 shows the insert of the cDNA clone COS-AP4 E1. This clone comes from a cDNA library of the cervical carcinoma cell line ME 180 (cf. Reuter, MS et al, J. Virol. 65 (1991), 5564-5568). This cell line contains the human papillomavirus 68-DNA (HPV 68-DNA) stably integrated. The clone COS AP4-E1 contains HPV 68 DNA between nucleotides 1-21. It also contains cellular sequences between nucleotides 22-1476, these being exon sequences of a zinc finger gene between nucleotides 446-1476. The exon sequences code for 4 zinc fingers: zinc finger 1: 1130-1191, zinc finger 2: 1214-1275, zinc finger 3: 1298-1360, zinc finger 4: 1382-1432. The clone COS AP4-E1 was deposited with the DSM (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures under DSM 9450 on September 30, 1994).

Vorstehende Insert-DNA, insbesondere zwischen den Nukleotiden 446-1476, kann Teil einer für ein vollständiges Zinkfinger-Protein codierenden DNA sein. Eine solche DNA und das durch sie codierte Zinkfinger-Protein sind somit auch Gegen­ stand der Erfindung.The above insert DNA, especially between nucleotides 446-1476, can Be part of a DNA coding for a complete zinc finger protein. A such DNA and the zinc finger protein encoded by it are therefore also counter state of the invention.

Die Bereitstellung einer für vorstehendes Zinkfinger-Protein codierenden DNA erfolgt in üblicher Weise. Beispielhaft wird die Insert-DNA von COS AP4-E1, insbesondere die DNA zwischen den Nukleotiden 446-1476, als Sonde zur Hybri­ disierung einer allgemein erhältlichen cDNA-Bibliothek aus Leber, Gehirn, Plazenta oder Muskel, vorzugsweise Leber, verwendet. Auch kann eine cDNA-Bibliothek aus Blutzellen oder HeLa-Zellen verwendet werden. Die genannten Gewebe und Zellen enthalten ausreichend RNA-Transkripte, die mit der Insert-DNA von COS AP4-E1, insbesondere der DNA zwischen den Nukleotiden 446-1476 hybridisieren (vgl. Fig. 2). Erhaltene Klone werden einer Sequenzierung unterzogen und ausgehend von der Insert-DNA von COS AP4-E1, insbesondere der DNA zwischen den Nukleotiden 446-1476, wird die ein vorstehendes Zinkfinger-Protein codierende DNA bestimmt.A DNA coding for the above zinc finger protein is provided in the usual way. For example, the insert DNA from COS AP4-E1, in particular the DNA between nucleotides 446-1476, is used as a probe for hybridizing a generally available cDNA library from the liver, brain, placenta or muscle, preferably liver. A cDNA library from blood cells or HeLa cells can also be used. The tissues and cells mentioned contain sufficient RNA transcripts that hybridize with the insert DNA from COS AP4-E1, in particular the DNA between nucleotides 446-1476 (cf. FIG. 2). Clones obtained are subjected to sequencing and, starting from the insert DNA of COS AP4-E1, in particular the DNA between nucleotides 446-1476, the DNA coding for a zinc finger protein above is determined.

Des weiteren eignet sich die Insert-DNA von COS AP4-E1, insbesondere die DNA zwischen den Nukleotiden 446-1476, und ganz besonders die DNA zwischen den Nukleotiden 1240-1476, zur Identifizierung einer genomischen für vorstehendes Zinkfinger-Protein codierenden DNA. Hierzu wird die entsprechende DNA von COS AP4-E1, z. B. die DNA zwischen den Nukleotiden 1240-1476, als Sonde zur Hybri­ disierung einer genomischen DNA-Bibliothek verwendet. Eine solche kann aus den vorstehend genannten Geweben und Zellen erstellt sein.The insert DNA of COS AP4-E1 is also suitable, in particular the DNA between nucleotides 446-1476, and especially the DNA between the Nucleotides 1240-1476, used to identify a genomic for the above DNA encoding zinc finger protein. For this, the corresponding DNA from COS AP4-E1, e.g. B. the DNA between nucleotides 1240-1476, as a probe to the hybri used a genomic DNA library. Such can be found in the tissues and cells mentioned above.

Erfindungsgemäß wird der Klon COS 1 APM erhalten. Seine Insert-DNA enthält in einem 5,5 kb großen Sacl-Fragment die zur verwendeten Sonde, z. B. der DNA zwischen den Nukleotiden 1240-1476, entsprechende DNA. In den Fig. 3 und 4 ist diese DNA von COS 1 APM zwischen den Nukleotiden 256-492 präsentiert. Der Klon COS 1 APM wurde bei der DSM unter DSM 9462 am 07. 10. 1994 hinter­ legt. Gegenstand der Erfindung ist somit auch eine genomische, das vorstehende Zinkfinger-Protein codierende DNA sowie das durch sie codierte Protein.According to the invention, the clone COS 1 APM is obtained. Its insert DNA contains the 5.5 kb Sacl fragment that contains the probe used, e.g. B. DNA between nucleotides 1240-1476, corresponding DNA. In FIGS. 3 and 4, this DNA is presented APM 1 between nucleotides 256-492 of COS. The clone COS 1 APM was deposited with the DSM under DSM 9462 on October 7, 1994. The invention thus also relates to a genomic DNA encoding the above zinc finger protein and the protein encoded by it.

Erfindungsgemäß kann vorstehende für das Zinkfinger-Protein codierende DNA in einem Vektor bzw. Expressionsvektor vorliegen. Beispiele solcher sind dem Fach­ mann bekannt. Im Falle eines Expressionsvektors für E. coli sind dies z. B. pGE- MEX, pUC-Derivate und pGEX-2T. Für die Expression in Hefe sind z. B. pY100 und Ycpad1 zu nennen, während für die Expression in tierischen Zellen z. B. pKCR, pEF- BOS, cDM8 und pCEV4, anzugeben sind. Der Fachmann kennt geeignete Zellen, um vorstehende, in einem Expressionsvektor vorliegende DNA zu exprimieren. Beispiele solcher Zellen umfassen die E. coli-Stämme HB101, DH1, x1776, JM101 und JM109, den Hefe-Stamm Saccharomyces cerevisiae und die tierischen Zellen L, 3T3, FM3A, CHO, COS, Vero, und HeLa. Der Fachmann weiß, in welcher Weise vorstehende DNA in einen Expressionsvektor inseriert werden muß. Ihm ist auch bekannt, daß vorstehende cDNA in E. coli, Hefe oder tierischen Zellen exprimiert werden kann, während vorstehende genomische DNA nur in tierischen Zellen zu exprimieren ist. Des weiteren kennt der Fachmann Bedingungen, transformierte bzw. transfizierte Zellen zu kultivieren. Auch sind ihm Verfahren bekannt, das exprimierte Zinkfinger-Protein zu isolieren und zu reinigen. Ein vorstehendes, rekombinant hergestelltes Zinkfinger-Protein ist somit auch Gegenstand der Erfin­ dung.According to the invention, the above DNA coding for the zinc finger protein can be in a vector or expression vector. Examples of such are the subject man known. In the case of an expression vector for E. coli, these are e.g. B. pGE- MEX, pUC derivatives and pGEX-2T. For expression in yeast z. B. pY100 and To call Ycpad1, while for expression in animal cells z. B. pKCR, pEF-  BOS, cDM8 and pCEV4 must be specified. The person skilled in the art knows suitable cells to express the above DNA present in an expression vector. Examples of such cells include the E. coli strains HB101, DH1, x1776, JM101 and JM109, the yeast strain Saccharomyces cerevisiae and the animal cells L, 3T3, FM3A, CHO, COS, Vero, and HeLa. The expert knows how the above DNA must be inserted into an expression vector. He is too known to express the above cDNA in E. coli, yeast or animal cells can be, while the above genomic DNA only in animal cells express is. Furthermore, the person skilled in the art knows conditions, transformed or to transfect cells. He is also familiar with procedures that to isolate and purify expressed zinc finger protein. One above Recombinantly produced zinc finger protein is therefore also the subject of the Erfin dung.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein gegen ein vorstehendes Zinkfinger- Protein gerichteter Antikörper. Die Herstellung eines solchen erfolgt in üblicher Weise. Beispielsweise wird hierzu das Zinkfinger-Protein in BALB/c-Mäuse sub­ cutan injiziert. Diese Injektion wird im Abstand von jeweils 3 Wochen wiederholt. Etwa 2 Wochen nach der letzten Injektion wird das den Antikörper enthaltende Serum isoliert und in üblicher Weise getestet.Another object of the invention is an anti-zinc finger Protein-directed antibody. The production of such is done in the usual way Wise. For example, the zinc finger protein in BALB / c mice is sub cutan injected. This injection is repeated every 3 weeks. About 2 weeks after the last injection, the one containing the antibody will become Serum isolated and tested in the usual way.

In bevorzugter Ausführungsform ist der Antikörper ein monoklonaler Antikörper. Zu seiner Herstellung werden nach vorstehender vierten Injektion den Mäusen Milzzel­ len entnommen und diese in üblicher Weise mit Myelomzellen fusioniert. Die weitere Klonierung erfolgt ebenso nach bekannten Verfahren.In a preferred embodiment, the antibody is a monoclonal antibody. To After the fourth injection above, the mice are produced by Milzzel len removed and fused in the usual way with myeloma cells. The further cloning is also carried out according to known methods.

Die vorliegende Erfindung stellt eine bisher nicht gekannte Zinkfinger-DNA sowie ein durch sie codiertes Zinkfinger-Protein bereit. Die erfindungsgemäße DNA eignet sich als Sonde für diagnostische Zwecke. Darüberhinaus kann sie in einem dem Fachmann bekannten Expressionsvektor zur Gentherapie eingesetzt werden. Das erfindungsgemäße Protein eignet sich ebenfalls für therapeutische Zwecke. Hierzu kann es in einer üblichen pharmazeutischen Zusammensetzung verabreicht werden. The present invention provides a previously unknown zinc finger DNA as well a zinc finger protein encoded by them. The DNA according to the invention is suitable itself as a probe for diagnostic purposes. In addition, it can in one Expression vector known to those skilled in the art can be used for gene therapy. The Protein according to the invention is also suitable for therapeutic purposes. For this it can be administered in a conventional pharmaceutical composition.  

Des weiteren stellt die vorliegende Erfindung gegen das vorstehende Protein gerichtete Antikörper bereit. Diese eignen sich bestens zu diagnostischen Zwec­ ken.Furthermore, the present invention is against the above protein targeted antibodies ready. These are ideal for diagnostic purposes ken.

Somit liefert die vorliegende Erfindung neue Mittel zur Diagnose und Therapie von mit der erfindungsgemäßen DNA und dem durch sie codierten Protein zusammen­ hängenden Erkrankungen, insbesondere von Tumorerkrankungen.Thus, the present invention provides new means of diagnosing and treating with the DNA according to the invention and the protein encoded by them pending diseases, especially tumor diseases.

Kurze Beschreibung der Zeichnung:Brief description of the drawing:

Fig. 1 zeigt die Insert-cDNA des Klons COS AP4-E1, Fig. 1 shows the cDNA insert of clone COS-AP4 E1,

Fig. 2 zeigt die Hybridisierung von PolyA⁺RNA aus verschiedenen Zellen mit der DNA zwischen den Nukleotiden 1240-1476 von COS AP4-E1, Fig. 2 shows the hybridization of PolyA⁺RNA from different cells with the DNA between nucleotides 1240 to 1476 of COS-AP4 E1,

Fig. 3 zeigt eine Teilsequenz der genomischen Insert-DNA des Klons COS 1 APM, und Fig. 3 shows a partial sequence of the genomic insert DNA of clone COS 1 APM and

Fig. 4 zeigt den Vergleich der DNA zwischen den Nukleotiden 1240-1476 von Klon COS AP4-E1 und der DNA zwischen den Nukleotiden 256- 492 von Klon COS 1 APM. Figure 4 shows the comparison of the DNA between nucleotides 1240-1476 of clone COS AP4-E1 and the DNA between nucleotides 256-492 of clone COS 1 APM.

Die Erfindung wird durch das folgende Beispiel erläutert.The invention is illustrated by the following example.

Beispielexample Herstellung einer erfindungsgemäßen Zinkfinger-DNAProduction of a zinc finger DNA according to the invention

Eine aus HeLa-Zellen erstellte λ cDNA-Bibliothek wird einem üblichen Hybridis­ ierungsverfahren unterzogen. Hierzu werden die durch Infektion der Bakterien erhaltenen Phagenplaques mit dem ³²p-markierten DNA-Insert des Klons COS AP4- E1, insbesondere der DNA zwischen den Nukleotiden 1240-1476 (vgl. Fig. 1), inkubiert. Es wird eine Hybridisierung mit einzelnen Phagenplaques erhalten. Aus diesen wird die Phagen-DNA isoliert und mit EcoRI gespalten. Die erhaltenen Fragmente werden in einem 0,5%igen Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt. Das Agarosegel wird einem üblichen Blotting-Verfahren unterzogen, wodurch die DNA aus dem Agarosegel auf eine Nitrozellulosemembran übertragen wird. Diese wird in ein Hybridisierungsverfahren eingesetzt, in dem die entsprechende DNA des DNA-Inserts von Klon COS AP4-E1 als ³²p-markierte Probe verwendet wird. Es wird eine Hybridisierung mit einzelnen DNA-Fragmenten erhalten. Diese werden isoliert und in einem mit EcoRI gespaltenen, dephosphorylierten Plasmid-Vektor, z. B. pBluescript, kloniert. Einzelne Klone werden analysiert, und durch Restriktions­ spaltungen sowie Sequenzierung wird ein eine erfindungsgemäße Zinkfinger-DNA enthaltender Klon identifiziert.A λ cDNA library created from HeLa cells is subjected to a conventional hybridization process. For this, the phage plaques obtained by infection of the bacteria are incubated with the 32 p-labeled DNA insert of the clone COS AP4-E1, in particular the DNA between the nucleotides 1240-1476 (cf. FIG. 1). Hybridization with individual phage plaques is obtained. The phage DNA is isolated from these and cleaved with EcoRI. The fragments obtained are separated electrophoretically in a 0.5% agarose gel. The agarose gel is subjected to a conventional blotting process, whereby the DNA from the agarose gel is transferred to a nitrocellulose membrane. This is used in a hybridization process in which the corresponding DNA of the DNA insert from clone COS AP4-E1 is used as a 32 p-labeled sample. Hybridization with individual DNA fragments is obtained. These are isolated and in a dephosphorylated plasmid vector, digested with EcoRI, e.g. B. pBluescript, cloned. Individual clones are analyzed, and a clone containing a zinc finger DNA according to the invention is identified by restriction cleavage and sequencing.

Claims (8)

1. DNA, codierend für ein Zinkfinger-Protein, wobei die DNA umfaßt:
  • (a) die DNA der Nukleotide 446-1476 von Fig. 1, wobei diese DNA von Fig. 1 Bestandteil dieses Anspruchs ist, oder einen Teil davon,
  • (b) eine mit der DNA von (a) hybridisierende DNA, oder
  • (c) eine mit der DNA von (a) oder (b) über den degenerierten genetischen Code verwandte DNA.
1. DNA coding for a zinc finger protein, the DNA comprising:
  • (a) the DNA of nucleotides 446-1476 of FIG. 1, this DNA of FIG. 1 forming part of this claim, or a part thereof,
  • (b) a DNA hybridizing with the DNA of (a), or
  • (c) a DNA related to the DNA of (a) or (b) via the degenerate genetic code.
2. DNA nach Anspruch 1, nämlich die DNA der Nukleotide 256-492 von Fig. 3, wobei diese DNA von Fig. 3 Bestandteil dieses Anspruchs ist.2. DNA according to claim 1, namely the DNA of nucleotides 256-492 of FIG. 3, this DNA of FIG. 3 being part of this claim. 3. Protein, codiert durch die DNA nach Anspruch 1 oder 2.3. Protein encoded by the DNA of claim 1 or 2. 4. Expressionsvektor, umfassend eine für das Protein nach Anspruch 3 codie­ rende DNA.4. Expression vector comprising a code for the protein of claim 3 DNA. 5. Transformante, enthaltend den Expressionsvektor nach Anspruch 4.5. Transformant containing the expression vector according to claim 4. 6. Verfahren zur Herstellung des Proteins nach Anspruch 3, umfassend die Kultivierung der Transformante nach Anspruch 5 unter geeigneten Bedin­ gungen.6. A method for producing the protein of claim 3, comprising the Cultivation of the transformant according to claim 5 under suitable conditions gung. 7. Verwendung der DNA nach Anspruch 1 oder 2 als Reagens zur Diagnose und/oder Therapie.7. Use of the DNA according to claim 1 or 2 as a reagent for diagnosis and / or therapy. 8. Verwendung des Proteins nach Anspruch 3 als Reagens zur Therapie.8. Use of the protein according to claim 3 as a reagent for therapy.
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