DE19518488C1 - Autoantigen, suitable for determining a tendency to thrombosis - Google Patents
Autoantigen, suitable for determining a tendency to thrombosisInfo
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Abstract
Description
Die Erfindung betrifft ein Autoantigen, das sich zur Feststellung einer Thrombose neigung eignet, eine ein solches Autoantigen kodierende DNA und ein Verfahren zur Herstellung eines solchen Autoantigens und dessen Verwendung.The invention relates to an autoantigen, which is used to detect thrombosis inclination, such a DNA encoding such an autoantigen and a method for the production of such an autoantigen and its use.
Arterielle und venöse Thrombose ist eine häufige Komplikation, die bei einer Vielzahl von Multiorganerkrankungen und insbesondere bei längerer Bettlägrigkeit auftritt. Bisher gibt es noch keine Möglichkeit, vorherzusagen, ob ein Mensch zu einer Thrombose neigt oder ob keine Thrombosegefahr besteht. Es wäre aber sehr wünschenswert, dies feststellen zu können, da dann nicht standardmäßig bei längerer Bettlägrigkeit Blutverdünnungsmittel verabreicht werden müßten und andererseits eine Person mit festgestellter Thromboseneigung sehr viel eingehender betreut und therapiert werden könnte.Arterial and venous thrombosis is a common complication associated with a Variety of multi-organ diseases and especially in the case of prolonged bedriddenness occurs. So far, there is no way to predict whether a person will tends to thrombosis or if there is no risk of thrombosis. But it would be very desirable to be able to determine this, because then not by default prolonged bed sickness blood thinners would have to be administered and on the other hand, a person with a determined tendency to thrombosis is much more detailed could be cared for and treated.
Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Mittel bereitzu stellen, mit dem eine Thromboseneigung festgestellt werden kann.The present invention is therefore based on the object of providing a means with which a tendency to thrombosis can be determined.
Erfindungsgemäß wird dies durch die Bereitstellung der Gegenstände in den Patentansprüchen erreicht.According to the invention, this is achieved by providing the objects in the Claims achieved.
Gegenstand der Erfindung ist somit ein Autoantigen, das die Aminosäuresequenz von Fig. 2 oder ein funktionelles Derivat oder Fragment davon umfaßt.The invention thus relates to an autoantigen which comprises the amino acid sequence of FIG. 2 or a functional derivative or fragment thereof.
Die vorliegende Erfindung beruht auf der Erkenntnis des Anmelders, daß in Seren von Personen mit einer Thromboseneigung spezifische Autoantikörper vorliegen. Der Anmelder hat solche Seren zum Screenen einer humanen Lambda-Phagen- Expressionsbibliothek, z. B. λgt 11, Clontech # HL 1123 b (vgl. Huynh, T.V. et al., DNA Cloning, (1985), IRL Press Ltd., Oxford, England, Band 1) verwendet und positive Phagen erhalten. Die Inserts dieser Phagen wurden subkloniert und se quenziert, wodurch ein Insert, HMhk-D, gefunden wurde, das die in Fig. 1 angege bene Sequenz aufweist. Diese Sequenz umfaßt die Nukleotidsequenz und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz eines Autoantigens. Durch übliches PCR- Verfahren wurden Fragmente von HMhk-D hergestellt. Diese wurden mit vorste henden Seren inkubiert, wodurch die Bindungsstelle der Autoantikörper auf die in Fig. 2 angegebene Sequenz des Autoantigens eingegrenzt wurde.The present invention is based on the knowledge of the applicant that specific autoantibodies are present in sera from persons with a tendency to thrombosis. The applicant has such sera for screening a human lambda phage expression library, e.g. B. λgt 11, Clontech # HL 1123 b (cf. Huynh, TV et al., DNA Cloning, (1985), IRL Press Ltd., Oxford, England, Volume 1) and obtained positive phages. The inserts of these phages were subcloned and sequenced, whereby an insert, HMhk-D, was found which has the sequence given in FIG. 1. This sequence comprises the nucleotide sequence and the amino acid sequence of an autoantigen derived therefrom. Fragments of HMhk-D were prepared by conventional PCR methods. These were incubated with the above sera, whereby the binding site of the autoantibodies was limited to the sequence of the autoantigen shown in FIG. 2.
Der vorstehende Ausdruck "funktionelles Derivat oder Fragment der Aminosäurese quenz von Fig. 2" umfaßt jegliches Derivat oder Fragment dieser Aminosäurese quenz, gegen die ein Autoantikörper gebildet werden kann. Insbesondere betrifft der Ausdruck Epitope in der Aminosäuresequenz, die als Autoantigene wirken können. Auch kann die Aminosäuresequenz von Fig. 2 Additionen, Substitutionen und/oder Deletionen von ein oder mehreren Aminosäuren aufweisen, was auch für die funktionellen Derivate oder Fragmente gilt.The above term "functional derivative or fragment of the amino acid sequence of Fig. 2" includes any derivative or fragment of this amino acid sequence against which an autoantibody can be raised. In particular, the term refers to epitopes in the amino acid sequence that can act as autoantigens. The amino acid sequence of FIG. 2 can also have additions, substitutions and / or deletions of one or more amino acids, which also applies to the functional derivatives or fragments.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine für ein vorstehendes Autoantigen kodierende Nukleinsäure. Dies kann eine RNA oder eine DNA sein. Letztere kann z. B. eine genomische DNA oder eine cDNA sein. Bevorzugt ist eine DNA, die folgendes umfaßt:Another object of the invention is one for an autoantigen above coding nucleic acid. This can be an RNA or a DNA. The latter can e.g. B. be a genomic DNA or a cDNA. Preferred is a DNA that includes the following:
- (a) die DNA von Fig. 2 oder einen Teil davon,(a) the DNA of Figure 2 or a portion thereof,
- (b) eine mit der DNA von (a) hybridisierende DNA, oder(b) a DNA hybridizing with the DNA of (a), or
- (c) eine mit der DNA von (a) oder (b) über den degenerierten genetischen Code verwandte DNA.(c) one with the DNA of (a) or (b) via the degenerate genetic code related DNA.
Der Ausdruck "hybridisierende DNA" weist auf eine DNA hin, die unter üblichen Bedingungen, insbesondere bei 20°C unter dem Schmelzpunkt der DNA, mit einer DNA von (a) hybridisiert.The term "hybridizing DNA" indicates a DNA that is commonly used Conditions, especially at 20 ° C below the melting point of the DNA, with a DNA hybridized from (a).
Die DNA von Fig. 2 wurde bei der DSM (Deutsche Sammlung von Mikroorganis men und Zellkulturen) als pX-DIV1 unter DSM 9963 am 6. Mai 1995 hinterlegt.The DNA of FIG. 2 was deposited with the DSM (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures) as pX-DIV1 under DSM 9963 on May 6, 1995.
Zur Herstellung einer erfindungsgemäßen DNA ist es günstig, eine humane Lamb da-Phagen-Expressionsbibliothek, z. B. λgt11 Clontech # HL 1123 b (vgl. vor stehend) mit Seren von Patienten mit einer Thromboseneigung zu screenen. Von positiven Phagen können dann die Inserts subkloniert und sequenziert werden, wodurch die Autoantigen-kodierenden Sequenzen erkannt werden können. Weiter hin können die Bindungsstellen für die Autoantikörper eingegrenzt werden. Hierzu eignet es sich, durch ein PCR-Verfahren Fragmente der Phagen-Inserts herzustellen und diese mit den Seren zu inkubieren.To produce a DNA according to the invention, it is favorable to use a human Lamb da phage expression library, e.g. B. λgt11 Clontech # HL 1123 b (cf. standing) with sera from patients with a tendency to thrombosis. Of positive phages, the inserts can then be subcloned and sequenced, whereby the autoantigen coding sequences can be recognized. Next the binding sites for the autoantibodies can be limited. For this it is suitable to use a PCR method to produce fragments of the phage inserts and incubate them with the sera.
Eine erfindungsgemäße DNA kann in einem Vektor bzw. Expressionsvektor vor liegen. Beispiele solcher sind dem Fachmann bekannt. Im Falle eines Expressions vektors für E.coli sind dies z. B. λgt11, pGEMEX, pUC-Derivate, pGEX-2T, pET3b, pXa1 und pQE31. Für die Expression in Hefe sind z. B. pY100 und Ycpad1 zu nennen, während für die Expression in tierischen Zellen z. B. pKCR, pEFBOS, cDM8 und pCEV4, anzugeben sind. Für die Expression in Insektenzellen eignet sich besonders der Baculovirus-Expressionsvektor pAc SG His NT-A.A DNA according to the invention can exist in a vector or expression vector lie. Examples of such are known to the person skilled in the art. In the case of an expression vectors for E.coli are z. B. λgt11, pGEMEX, pUC derivatives, pGEX-2T, pET3b, pXa1 and pQE31. For expression in yeast z. B. pY100 and Ycpad1 too call, while for expression in animal cells z. B. pKCR, pEFBOS, cDM8 and pCEV4. Is suitable for expression in insect cells especially the baculovirus expression vector pAc SG His NT-A.
Der Fachmann kennt geeignete Zellen, um eine erfindungsgemäße, in einem Expressionsvektor vorliegende DNA zu exprimieren. Beispiele solcher Zellen um fassen die E.coli-Stämme Y1089, HB101, DH1, x1776, JM101, JM 109, BL21 und XL1 blue, den Hefe-Stamm Saccharomyces cerevisiae und die tierischen Zellen L, 3T3, FM3A, CHO, COS, Vero und HeLa sowie die Insektenzellen Sf9.The person skilled in the art knows suitable cells for expressing a DNA according to the invention which is present in an expression vector. Examples of such cells include the E. coli strains Y1089, HB101, DH1, x1776, JM101, JM 109, BL21 and XL1 blue, the yeast strain Saccharomyces cerevisiae and the animal cells L, 3 T3, FM3A, CHO, COS, Vero and HeLa and the insect cells Sf9.
Der Fachmann weiß, in welcher Weise eine erfindungsgemäße DNA in einen Expressionsvektor inseriert werden muß. Ihm ist auch bekannt, daß diese DNA in Verbindung mit einer für ein anderes Protein bzw. Peptid kodierenden DNA inse riert werden kann, so daß die erfindungsgemäße DNA in Form eines Fusions proteins exprimiert werden kann.The person skilled in the art knows in what way a DNA according to the invention is in a Expression vector must be inserted. He is also aware that this DNA is found in Connection with a DNA coding for another protein or peptide can be riert, so that the DNA of the invention in the form of a fusion proteins can be expressed.
Des weiteren kennt der Fachmann Bedingungen, transformierte bzw. transfizierte Zellen zu kultivieren. Auch sind ihm Verfahren bekannt, das exprimierte Auto antigen zu isolieren und zu reinigen. Ein vorstehendes, rekombinant hergestelltes Autoantigen, das auch ein Fusionsprotein sein kann, ist somit ebenfalls Gegen stand der Erfindung.Furthermore, the person skilled in the art knows conditions, transformed or transfected Cultivate cells. He is also familiar with processes, the expressed car isolate and purify antigen. A foregoing recombinantly made Autoantigen, which can also be a fusion protein, is therefore also a counter state of the invention.
Erfindungsgemäße Autoantigene zeichnen sich dadurch aus, daß sie in Personen mit einer Thromboseneigung spezifische Autoantikörper erkennen. Sie eignen sich daher als Mittel zur Feststellung (Diagnose) einer Thromboseneigung. Eine solche Feststellung kann durch übliche Nachweisverfahren, insbesondere einen Western Blot, einen ELISA, eine Immunpräzipitation oder durch Immunfluoreszenz, erfolgen. Hierzu können die erfindungsgemäßen Autoantigene, wenn es angebracht ist, markiert sein oder in Kombination mit markierten, gegen sie gerichteten Anti körpern eingesetzt werden. Auch können erfindungsgemäße Autoantigene in einem Biosensor-Verfahren verwendet werden.Autoantigens according to the invention are distinguished in that they are in persons recognize specific autoantibodies with a tendency to thrombosis. They are suitable therefore as a means of determining (diagnosing) a tendency to thrombosis. Such Detection can be carried out using standard detection methods, in particular a Western Blot, an ELISA, immunoprecipitation or by immunofluorescence. For this purpose, the autoantigens according to the invention, if appropriate, be marked or in combination with marked anti directed against them bodies are used. Autoantigens according to the invention can also be used in one Biosensor method can be used.
Ferner können erfindungsgemäße Autoantigene in einem Kit vorliegen. Dieser kann die Autoantigene, wie in vorstehender Form angegeben, zusammen mit üblichen Zusatzstoffen, wie Puffer, Trägermaterial und Kontrollen, enthalten. Ein solcher Kit ist ebenfalls Gegenstand der Erfindung.Furthermore, autoantigens according to the invention can be present in a kit. This can the autoantigens, as indicated in the above form, along with common ones Contain additives, such as buffers, carrier material and controls. Such a kit is also the subject of the invention.
Darüberhinaus eignen sich erfindungsgemäße Autoantigene auch für therapeuti sche Zwecke. Beispielsweise können durch sie Autoantikörper affinitätschromato graphisch aus dem Kreislauf von Patienten mit einer Thromboseneigung entfernt werden. Auch ist an eine Entfernung von für eine Thromboseneigung spezifischen Autoantikörper-produzierenden Lymphozyten durch Kopplung der erfindungs gemäßen Autoantigene an Zell-Toxine zu denken.In addition, autoantigens according to the invention are also suitable for therapeuti purposes. For example, they can have autoantibodies with affinity chromatography graphically removed from the circulation of patients with a tendency to thrombosis will. Also, removal is specific for a thrombotic tendency Autoantibody-producing lymphocytes by coupling the invention according to autoantigens of cell toxins.
Des weiteren eignen sich erfindungsgemäße Nukleinsäuren, insbesondere DNAs, für diagnostische Zwecke aller Art. Auch können solche Nukleinsäuren für thera peutische Maßnahmen verwendet werden. Beispielsweise können die Nukleinsäu ren in übliche Expressionsvektoren inseriert werden und diese in Personen mit einer Thromboseneigung eingeschleust werden. Durch Expression der Nukleinsäuren werden Autoantigene erhalten, die dann die Autoantikörper abfangen können.Also suitable are nucleic acids according to the invention, in particular DNAs, for diagnostic purposes of all kinds. Such nucleic acids can also be used for thera measures are used. For example, the nucleic acid can be inserted into conventional expression vectors and these into persons with a Thrombosis tendency to be introduced. By expression of the nucleic acids will receive autoantigens that can then intercept the autoantibodies.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen:Brief description of the drawings:
Fig. 1 zeigt die Nukleotidsequenz und die davon abgeleitete Aminosäurese quenz eines erfindungsgemäßen, durch HMhk-D kodierten Autoanti gens, und Fig. 1 shows the nucleotide sequence and the deduced sequence of a Aminosäurese invention, encoded by HMhk-D autoantibodies gens, and
Fig. 2 zeigt die Nukleotidsequenz und die davon abgeleitete Aminosäurese quenz der eingegrenzten Autoantikörper-Bindungsstelle des durch HMhk-D kodierten Autoantigens. Fig. 2 shows the nucleotide sequence and the deduced sequence of the Aminosäurese confined autoantibody binding site of the protein encoded by HMhk-D autoantigen.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.The following examples illustrate the invention.
Eine humane Lambda-Phagen-Expressionsbibliothek, λgt11 Clontech # HL 1123 b (vgl. vorstehend) wurde mit dem Serum einer eine Thromboseneigung aufweisen den Person HM gescreent. Es wurden positive Phagen erhalten. Die Inserts (EcoRI- Fragmente) dieser Phagen wurden in einem Vektor, pUC 18 (vgl. Yanisch-Perron, C. et al., Gene 33, (1985), 103) subkloniert und dann sequenziert. Es wurde ein Insert, HMhk-D, identifiziert, das die in Fig. 1 angegebene Sequenz aufweist. Diese umfaßt die Nukleotid (Aminosäure)sequenz eines erfindungsgemäßen Autoanti gens.A human lambda phage expression library, λgt11 Clontech # HL 1123 b (see above) was screened with the serum of a person HM who had a tendency to thrombosis. Positive phages were obtained. The inserts (EcoRI fragments) of these phages were subcloned in a vector, pUC 18 (cf. Yanisch-Perron, C. et al., Gene 33, (1985), 103) and then sequenced. An insert, HMhk-D, was identified which has the sequence given in FIG. 1. This includes the nucleotide (amino acid) sequence of an autoantigen according to the invention.
Durch ein übliches PCR-Verfahren wurden Fragmente von HMhk-D hergestellt. Diese Fragmente wurden mit dem Serum vorstehender Person inkubiert. Bei Verwendung der Primer:Fragments of HMhk-D were produced by a conventional PCR method. These fragments were incubated with the serum from the subject. At Use of the primers:
wurde ein Fragment, HMhk-DIV, erhalten, das mit dem Serum reagierte. Dieses Fragment ist ohne seine beiden Linker in Fig. 2 angegeben. Seine Sequenz umfaßt die Nukleotid (Aminosäure)sequenz der eingegrenzten Autoantikörper-Bindungs stelle des durch HMhk-D kodierten Autoantigens.a fragment, HMhk-DIV, was obtained which reacted with the serum. This fragment is shown in Fig. 2 without its two linkers. Its sequence comprises the nucleotide (amino acid) sequence of the delimited autoantibody binding site of the autoantigen encoded by HMhk-D.
- 1.1 Das Insert HMhk-D von Beispiel 1 wurde in die EcoRI-Stelle des Expressions vektors pXa1 (vgl. Produktinformation von Boehringer Mannheim) inseriert, wodurch das Expressionsplasmid pX-D erhalten wurde. Dieses kodiert für ein Fusionsprotein aus einem ß Gal-Anteil (N-terminaler Fusionspartner) und dem erfindungsgemäßen Autoantigen von Fig. 1 (C-terminaler Fusions partner). pX-D wurde zur Transformation von E.coli XL1 blue (vgl. Bullock, W.O. et al., Bio Techniques 5, (1987), 376-278) verwendet. Es wurde das vorstehende Fusionsprotein erhalten. Sein Nachweis erfolgte durch einen gegen den ß Gal-Anteil gerichteten Antikörper bzw. durch einen gegen das Autoantigen gerichteten Antikörper.1.1 The insert HMhk-D from Example 1 was inserted into the EcoRI site of the expression vector pXa1 (cf. product information from Boehringer Mannheim), whereby the expression plasmid pX-D was obtained. This codes for a fusion protein composed of a β Gal portion (N-terminal fusion partner) and the autoantigen according to the invention from FIG. 1 (C-terminal fusion partner). pX-D was used to transform E.coli XL1 blue (see Bullock, WO et al., Bio Techniques 5, (1987), 376-278). The above fusion protein was obtained. It was detected by an antibody directed against the ßGal portion or by an antibody directed against the autoantigen.
- 1.2 Das Insert HMhk-DIV von Beispiel 1 wurde zwischen die EcoRI- und PstI- Stellen von pXa1 (vgl. vorstehend 1.1) inseriert, wodurch das Expressions plasmid pX-DIV1 erhalten wurde. Dieses Expressionsplasmid wurde bei der DSM unter DSM 9963 am 6. Mai 1995 hinterlegt. pX-DIV1 kodiert für ein Fusionsprotein aus einem β Gal-Anteil (N-terminaler Fusionspartner) und dem erfindungsgemäßen Autoantigen von Fig. 2 (C-terminaler Fusions partner). pX-DIV1 wurde zur Transformation von E.coli XL1 blue (vgl. vor stehend 1.1) verwendet. Es wurde das vorstehende Fusionsprotein erhalten. Sein Nachweis erfolgte wie vorstehend unter 1. 1.1.2 The insert HMhk-DIV from Example 1 was inserted between the EcoRI and PstI sites of pXa1 (cf. 1.1 above), whereby the expression plasmid pX-DIV1 was obtained. This expression plasmid was deposited with the DSM under DSM 9963 on May 6, 1995. pX-DIV1 codes for a fusion protein consisting of a β Gal portion (N-terminal fusion partner) and the autoantigen according to the invention from FIG. 2 (C-terminal fusion partner). pX-DIV1 was used to transform E.coli XL1 blue (see 1.1 above). The above fusion protein was obtained. It was verified as in 1 above.
Das Insert HMhk-D von Beispiel 1 wurde in die EcoRI-Stelle des Expressionsvektors pAc SG His NT-A, B, C (vgl. Produktinformation der Firma PharMingen, Dianova, Raboisen) inseriert, wodurch das Expressionsplasmid pAc-D erhalten wurde. Dieses kodiert für ein Fusionsprotein aus einem Histidin-Anteil (N-terminaler Fusionspartner) und dem erfindungsgemäßen Autoantigen von Fig. 1 (C-terminaler Fusionspartner). pAc-D wurde zur Transformation von Sf9-Insektenzellen (vgl. Produktinformation vorstehend) verwendet. Es wurde das vorstehende Fusions protein erhalten. Sein Nachweis erfolgte durch einen gegen den Histidin-Anteil gerichteten Antikörper bzw. durch einen gegen das Autoantigen gerichteten Antikörper.The insert HMhk-D from Example 1 was inserted into the EcoRI site of the expression vector pAc SG His NT-A, B, C (see product information from PharMingen, Dianova, Raboisen), whereby the expression plasmid pAc-D was obtained. This codes for a fusion protein consisting of a histidine portion (N-terminal fusion partner) and the autoantigen according to the invention from FIG. 1 (C-terminal fusion partner). pAc-D was used to transform Sf9 insect cells (see product information above). The above fusion protein was obtained. It was detected by an antibody directed against the histidine portion or by an antibody directed against the autoantigen.
Das exprimierte Fusionsprotein von Beispiel 2, 1.1 bzw. Beispiel 2, 2. wurde einer Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterzogen und auf eine PVDF-Membran über tragen. Die Membran wurde nach üblichen Verfahren abgesättigt und mit Seren von vorstehender Person HM wie auch von Personen ohne Thromboseneigung in einer Verdünnung von 1 : 100 1 h bei 25°C inkubiert. Nach mehreren Wasch schritten mit PBS (0,05% Tween 20) wurde ein käuflicher POD-konjugierter Anti human Ig-Antikörper (1 : 1000, DAKO) zugegeben und ebenfalls 1 h inkubiert. Die Nachweisreaktion erfolgte nach mehreren Waschschritten mit dem POD-Substrat AEC (Aminoethylcarbazol, Sigma) nach Herstellerangaben, bis Banden sichtbar waren.The expressed fusion protein from Example 2, 1.1 and Example 2, 2. became one Subjected to polyacrylamide gel electrophoresis and transferred to a PVDF membrane carry. The membrane was saturated using conventional methods and with sera from the above person HM as well as from persons without a tendency to thrombosis in at a dilution of 1: 100 for 1 h at 25 ° C. After several washes PBS (0.05% Tween 20) became a commercially available POD-conjugated anti human Ig antibody (1: 1000, DAKO) added and also incubated for 1 h. The Detection reaction took place after several washing steps with the POD substrate AEC (Aminoethylcarbazol, Sigma) according to the manufacturer's instructions until bands are visible were.
Es zeigte sich, daß das erfindungsgemäße Autoantigen spezifische Autoantikörper im Serum einer eine Thromboseneigung aufweisenden Person erkennt.The autoantigen according to the invention was found to be specific autoantibodies in the serum of a person with a tendency to thrombosis.
Claims (7)
- (a) die DNA von Fig. 2, wobei Fig. 2 Bestandteil dieses Anspruchs ist, oder einen Teil davon, gegen dessen Aminosäuresequenz ein Auto antikörper gerichtet sein kann,
- (b) eine mit der DNA von (a) hybridisierende DNA oder
- (c) eine mit der DNA von (a) oder (b) über den degenerierten genetischen Code verwandte DNA.
- . (a) the DNA of Figure 2, Fig. 2 part of this claim, or a part thereof, against which the amino acid sequence of a car can be directed antibodies,
- (b) a DNA hybridizing with the DNA of (a) or
- (c) a DNA related to the DNA of (a) or (b) via the degenerate genetic code.
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Non-Patent Citations (1)
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| 8100 | Publication of the examined application without publication of unexamined application | ||
| D1 | Grant (no unexamined application published) patent law 81 | ||
| 8364 | No opposition during term of opposition | ||
| 8339 | Ceased/non-payment of the annual fee |