DE4433554C1

DE4433554C1 - Androstenone determn. in fatty tissues of boar for human consumption

Info

Publication number: DE4433554C1
Application number: DE19944433554
Authority: DE
Inventors: Bernd Dr Axmann; Christian Dr Hentschel; Gisela Liebrich; Werner Dr Schoesler
Original assignee: SLT LABINSTRUMENTS DEUTSCHLAND; Imtec Immundiagnostika GmbH
Current assignee: SLT LABINSTRUMENTS DEUTSCHLAND; Imtec Immundiagnostika GmbH
Priority date: 1994-09-07
Filing date: 1994-09-07
Publication date: 1996-01-25
Anticipated expiration: 2014-09-08

Abstract

The androstenone is determined by melting the fat at pref. no more than 43 deg C, it is then drawn up with an extn. medium into a pipette, to be transferred into a warmed extn. vessel. Here it is repeatedly drawn up and dispensed, using the same pipette. Immediately afterwards, without cooling, the warm extn. medium, now contg. androstenone, is mixed with a sample dilution buffer, and a conjugate soln.. The determn. is then completed by means of known competitive immunological detection reactions. An appts. to carry out the process is also claimed.

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Bestimmung von Androstenon in Fettgewe ben gemäß der Oberbegriffe der Ansprüche 1 und 11.The invention relates to a method and a Device for the determination of androstenone in fat tissue ben according to the preambles of claims 1 and 11.

Die für den Geschlechtsgeruch des Ebers verantwortliche Substanz ist das Pheromon 5-α-Androst-16-en-3-on, ge nannt Androstenon. Androstenon gilt aus diesem Grunde als diagnostischer Marker für die Intensität des Geru ches von Eberfleisch. Die Anreicherung des Androstenons erfolgt insbesondere im Fettgewebe der männlichen Schweine. Dabei ist die anatomische Lage des Fettgewebes untergeordnet. Androstenon lagert sich so wohl im subkutanen Fett, im intramuskulären, intermus kulärem Fett und im Organ-Fett ab. Beim Zubereiten des Fleischs von Ebern, insbesondere beim Erwärmen, tritt ein äußerst störender Uringeruch auf. Auf der anderen Seite bringt die Ebermast aufgrund erheblicher Wachs tumsvorteile beachtenswerte wirtschaftliche Gewinne. Die Verwertung von Eberfleisch für die menschliche Er nährung erfordert aus diesem Grunde exakte Untersu chungsmöglichkeiten, um routinemäßig solche Tiere aus zusondern, deren Androstenongrenzwert überschritten ist. Aus Sicht des Fleischhygienikers sollte ein Bestim mungsverfahren von Androstenon in Fettgeweben geeignet sein, direkt parallel zur Schlachtroutine durchgeführt zu werden, um eine Weiterverarbeitung des zu testenden Schlachtkörpers nicht zu verzögern.The one responsible for the sexual smell of the boar The substance is the pheromone 5-α-androst-16-en-3-one, ge called Androstenon. Androstenone is considered for this reason as a diagnostic marker for the intensity of the Geru ches of boar meat. The enrichment of androstenone occurs especially in the adipose tissue of the male Pigs. The anatomical position of the Subordinate to adipose tissue. Androstenon is stored like this probably in subcutaneous fat, intramuscular, intermus specific fat and organ fat. When preparing the Meat from boars, especially when heated an extremely annoying smell of urine. On the other Boar fattening brings side due to considerable wax notable economic benefits. The use of boar meat for human consumption For this reason, nutrition requires exact investigation opportunities to routinely identify such animals separate, whose androstenone limit exceeded is. From the point of view of the meat hygienist, a determination should androstenone in fatty tissue be carried out directly parallel to the slaughter routine to become a further processing of the to be tested Carcass not to delay.

In der Deutschen Patentschrift DE 42 29 904 C1 wird ein Verfahren zur Bestimmung von Androstenongehalten von Fettgeweben beschrieben. Im ersten Verfahrensschritt erfolgt eine Verflüssigung einer Fettgewebeprobe durch Erwärmen auf eine vorgegebene Temperatur im Bereich von 45 bis 60°C. In einem zweiten Verfahrensschritt wird eine definierte Menge des flüssigen Fettes mit einem wasserlöslichen Lösemittel für das Androstenon bei der Temperatur des flüssigen Fettes gemischt. Hierbei geht sowohl das Androstenon als auch ein Teil des Fettes in das wasserlösliche Lösungsmittel über. Gemäß einem dritten Verfahrensschritt erfolgt nun ein Abkühlen dieser Fettlösemittelmischung auf eine vorgegebene Tem peratur, bei der wesentliche Anteile des im Lösemittel gelösten Fettes einerseits aus der Lösung ausgeschieden werden, und andererseits jedoch der überwiegende Teil des in der Lösemittelphase gelösten Androstenons im Lö semittel verbleiben soll. Nach Entnahme einer definier ten Menge der androstenonhaltigen Lösemittelphase und Verdünnung in einem vorgegebenen Verhältnis mit einer für das verwendete Nachweisverfahren verträglichen wäßrigen Pufferlösung erfolgt nun die Ermittlung des Androstenongehaltes der Lösemittel-Pufferlösungsphase mittels an sich bekannter kompetitiver immunologischer Nachweisreaktionen. In the German patent DE 42 29 904 C1 a Method for determining androstenone levels of Fat tissues described. In the first step a fat tissue sample is liquefied by Heating to a predetermined temperature in the range of 45 to 60 ° C. In a second process step a defined amount of liquid fat with one water soluble solvent for androstenone at the Temperature of the liquid fat mixed. Here goes both the androstenone and part of the fat in the water-soluble solvent. According to one The third process step is then cooled this fat solvent mixture to a predetermined tem temperature, at which substantial portions of the in the solvent dissolved fat is excreted from the solution and on the other hand the vast majority of the androstenone dissolved in the solvent phase in the solvent medium should remain. After removing a defin th amount of the androstenone-containing solvent phase and Dilution in a given ratio with a compatible with the detection method used aqueous buffer solution is now determined Androstenone content of the solvent buffer solution phase by means of competitive immunological known per se Detection reactions.

Dieses Verfahren weist einige Nachteile auf. So führt die Verflüssigung der Fettgewebeprobe durch Erwärmen auf einen Temperaturbereich zwischen 45 und 60°C un weigerlich zu Androstenonverlusten. Androstenon ist eine relativ leicht flüchtige Verbindung, die in diesem Temperaturbereich schon ohne weiteres analytisch fest stellbare Verluste zeigt, so daß Verfälschungen des Er gebnisses auftreten können.This method has several disadvantages. So leads the liquefaction of the fat tissue sample by heating to a temperature range between 45 and 60 ° C un inevitably to androstenone losses. Androstenone is a relatively volatile compound in this Temperature range already analytically fixed shows adjustable losses, so that adulteration of the Er result can occur.

Auch ist zu beobachten, daß merkliche Verluste an Ex traktionsmittel auftreten, die die Konzentrationsver hältnisse nachteilig verändern.It can also be observed that significant losses to Ex traction agents occur, the concentration Ver adversely change circumstances.

Bei der Extraktion des Androstenons mittels eines was serlöslichen Lösemittels aus dem flüssigen Fett bei der Temperatur des flüssigen Fettes gehen sowohl Androste non, als auch Anteile des Fettes in die Phase des was serlöslichen Lösemittels über.When extracting the androstenone using what water-soluble solvent from the liquid fat in the Temperature of the liquid fat go both androste non, as well as portions of the fat in the phase of what water-soluble solvent.

Unter Ausnutzung der unterschiedlichen Temperaturkoef fizienten des Löseverhaltens soll nun durch Abkühlung der Lösemittelphase das dort gelöste Fett ausgeschieden werden, während der überwiegende Teil des in der Lösemittelphase gelösten Androstenons im Lösemittel verbleiben soll. Diese Abkühlungsphase kostet viel Zeit, so daß der Gesamtdurchsatz an Proben dadurch verringert wird.Taking advantage of the different Temperaturkoef Efficiency of the dissolving behavior should now be achieved by cooling the fat dissolved in the solvent phase be while most of the in the Solvent phase of dissolved androstenone in the solvent should remain. This cooling phase costs a lot Time so that the total throughput of samples thereby is reduced.

Ein weiterer Nachteil ist die Tatsache, daß das abge schiedene Fett zusätzlich gelöste Anteile an Andro stenon enthält, was auf ein Zurückverschieben des Ver teilungsgleichgewichtes von Androstenon in Richtung Fettphase verursacht wird, und daß beim Abscheidungs prozeß es sich nicht immer vermeiden läßt, daß Teile des Fettes sich in der Lösemittelphase als schwer ab setzbare Tröpfchen verteilen und dadurch zu einer Trü bung der Lösemittelphase führen. Diese Trübung behin dert den nachfolgenden analytischen Schritt.Another disadvantage is the fact that the abge divorced fat additionally dissolved portions of Andro stenon contains what indicates a move back of the ver divisional equilibrium of androstenone towards Fat phase is caused, and that during deposition process it can not always be avoided that parts of the fat turns out to be heavy in the solvent phase distribute settable droplets and thereby into a cloudy lead the solvent phase. This cloudiness persists changes the subsequent analytical step.

Die weiterhin in dieser Druckschrift beschriebene Vor richtung zur automatisierten Durchführung des Verfah rens läßt eine Automatisierung des Verfahrens nicht er kennen.The further described in this document direction for the automated execution of the procedure rens does not allow automation of the process know.

Desweiteren ist aus EP 0 553 054 ein Verfahren zur Prüfung einzelner Stoffe auf Anwesenheit fettlöslicher Verbindungen unter Verwendung der HPLC-Analyse bekannt, das dadurch gekennzeichnet ist, daß die Analysenprobe in der mobilen Phase eine Vorsäule durchläuft, die sich vor der Trennungssäule befindet, und daß die Vorsäule anschließend in einer bestimmten Zeit getrennt gewaschen wird.Furthermore, EP 0 553 054 describes a method for testing of individual substances in the presence of fat-soluble compounds known using HPLC analysis, which thereby is characterized in that the analysis sample in the mobile phase passes through a guard column that is in front of the separation column located, and that the guard column is then in a certain Time is washed separately.

In DD 2 93 432 ist ein Verfahren zur Bestimmung von Androstenon in biologischem Material beschrieben. Bei diesem Verfahren werden von geschlachteten Tieren Fettproben genommen, die nach entsprechender Aufarbeitung und Extraktion chromatografisch auf HPTLC-Fertigplatten aufgetragen werden. Der Gehalt von Steroiden wie Androstenon wird semiquantitativ bestimmt und identifiziert. Die Aufarbeitung erfolgt durch Verseifen der Fettproben mit methanolischer Kalilauge bzw. enzymatischer Hydrolyse von Blutplasma oder Speichel.DD 2 93 432 describes a method for the determination of androstenone described in biological material. With this procedure fat samples are taken from slaughtered animals after: corresponding processing and extraction chromatographically HPTLC ready plates are applied. The salary of Steroids like androstenone is determined semi-quantitatively and identified. The processing takes place by saponification of the Fat samples with methanolic potassium hydroxide solution or enzymatic Hydrolysis of blood plasma or saliva.

Der Erfindung liegt nun die Aufgabe zugrunde, ein Ver fahren zur Bestimmung von Androstenon in Fettgeweben anzubieten, das es möglich macht, pro Zeiteinheit be deutend mehr Proben zu untersuchen und es gewährleistet ist, daß während der Aufbereitung und Verarbeitung der Proben keine Verluste an zu bestimmendem Androstenon und keine die Konzentration verändernden Verluste an Extraktionsmittel auftreten.The invention is based on the object, a Ver drive to the determination of androstenone in adipose tissue offer that makes it possible to be per unit of time to examine significantly more samples and it ensures is that during the preparation and processing of the Samples no loss of androstenone to be determined and no loss of concentration Extractants occur.

Weiterhin ist es Aufgabe der Erfindung, eine Vorrich tung anzubieten, mit der unter Verwendung eines an sich bekannten Pipettierautomaten ein hoher Automatisie rungsgrad bei der Bestimmung von Androstenon in Fettge weben erreicht werden kann.Furthermore, it is an object of the invention to provide a Vorrich offer with the use of one in itself known pipetting machines a high level of automation Degree of determination in the determination of androstenone in fat weaving can be achieved.

Die Lösung der Aufgabe erfolgt mit dem kennzeichnenden Teil der Ansprüche 1 und 11.The problem is solved with the characteristic Part of claims 1 and 11.

Das erfindungsgemäße Verfahren und die Vorrichtung wei sen verschiedene Vorteile auf. So wird gemäß dem Kenn zeichen des Anspruches 1 die geschmolzene Fettprobe und das Extraktionsmittel mit einem Pipettenhub aufgenom men. Das führt zu einer zusätzlichen Zeitersparnis. Das anschließende Überführen in ein temperiertes Extrak tionsgefäß mit der gleichen Pipette und das sofortige mehrfache Aufziehen und Dispensieren der Probe stellt eine weitere bedeutende Zeitersparnis dar und ermög licht die Automatisierung dieser Verfahrensschritte mittels eines Pipettierroboters. Das Verzichten auf einen Abkühlungsschritt und das sofortige Weiterver mischen des androstenonhaltigen Extraktionsmittels mit einem Probenverdünnungspuffer und einer Konjugatlösung stellt ebenfalls in einer besonderen Ausbildung der Er findung einen bedeutenden Rationalisierungsschritt dar, so daß anschließend zügig die Gehaltsermittlung mittels an sich bekannter kompetitiver immunologischer Nach weisreaktionen erfolgen kann.The inventive method and the device knows different advantages. So according to the Kenn The melted fat sample and the extractant is taken up with a pipette stroke men. This leads to an additional time saving. The Subsequent transfer to a temperature-controlled extract with the same pipette and the immediate one multiple aspiration and dispensing of the sample represents a further significant time saving and enables light the automation of these process steps using a pipetting robot. Refraining from a cooling step and immediate further processing mix with the androstenone-containing extractant a sample dilution buffer and a conjugate solution also provides the Er represents an important step of rationalization, so that then quickly the salary determination by means of known competitive immunological evidence white reactions can take place.

In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausbildung wird die Temperatur der Fettschmelze auf maximal 43°C festge legt. Diese Temperatur ist einerseits so hoch gewählt worden, daß das Fett in flüssigem Zustand gehalten wird und beim Eintauchen der kühlen Roboternadeln nicht an diesem erstarrt, andererseits jedoch so niedrig gewählt worden, daß keine nennenswerten Androstenonverluste durch Verdampfen aus dem Fett entstehen.In a further training according to the invention Fat melt temperature set to a maximum of 43 ° C sets. On the one hand, this temperature is chosen to be so high that the fat is kept in a liquid state and when the cool robotic needles are immersed this freezes, but on the other hand is chosen so low that no significant androstenone losses evolved from the fat.

Die Ausführungsform gemäß der Ansprüche 6 bis 8 ist insbesondere bei der manuellen Durchführung der An drostenonbestimmung bei geringen Probenzahlen vorteil haft anwendbar. Obwohl eine vollständige Phasentrennung zwischen Fett und Lösemittelphase bei automatischer An drostenonbestimmung überraschenderweise nicht erforder lich ist, ist diese Phasentrennung bei der manuellen Durchführung eher wünschenswert. Der Zusatz von Elek trolyten führt zu einer schnellen Phasentrennung und gleichzeitig zu einer Verringerung von Verdampfungsver lusten des Lösemittels, was die Genauigkeit der Be stimmung aufgrund des Verhinderns von unkontrollierba ren Konzentrationsveränderungen erhöht. The embodiment according to claims 6 to 8 is especially when performing the manual Drostenone determination is advantageous for small numbers of samples applicable. Although a complete phase separation between fat and solvent phase with automatic start Surprisingly, drostenone determination is not required is this phase separation in manual Implementation rather desirable. The addition of Elek trolytes leads to rapid phase separation and at the same time to a reduction in evaporation ver dissolve the solvent, which affects the accuracy of the loading mood due to the prevention of uncontrollable ren changes in concentration increased.

Die Weiterbildung gemäß Anspruch 9 Ethanol einzusetzen weist gegenüber des Einsatzes von Methanol insbesondere die folgenden Vorteile auf:The training according to claim 9 use ethanol points in particular to the use of methanol the following benefits:

- ethanol is significantly less toxic,
- it has a higher boiling point and is therefore lower volatile and therefore ecologically cheaper and guaranteed provides a higher level of concentration,
- Possibility of setting a higher extract temperature, resulting in a more effective process leads the race.

In einer weiteren Ausbildung wird erfindungsgemäß das Extraktionsmittel zum Zeitpunkt des Ansaugens mit der Pipette auf eine Temperatur von 37°C eingestellt. Die Temperatur von 37°C ist gewählt worden, damit zum ei nen möglichst wenig Extraktionsmittel verdampft und da mit die Belastung der Raumluft gering gehalten wird, zum anderen damit bei höheren Temperaturen partielle Vermischung von Extraktionsmedium und mit der im Pi pettensystem des Pipettierroboters befindlichen System flüssigkeit bei dem automatisierten Pipettierprozeß verhindert wird. Die Extraktion, die durch mehrfaches Aufziehen und Dispensieren der Probe erfolgt, wird er findungsgemäß bei ansteigender Temperatur zwischen 50 und 65°C durchgeführt. Beide Vorgänge, nämlich Mi schen und Erwärmen dienen dazu, möglichst viel Andro stenon möglichst schnell aus dem Fett in das Extrakti onsmittel zu überführen. Die erfindungsgemäße Vorricht ung erlaubt es, durch eine sinnvolle Kombination von verschiedenen Gefäßen eine weitgehende Automatisierung der Bestimmung des Androstenons zu erreichen. In a further training, the invention Extractant at the time of suction with the Pipette set to a temperature of 37 ° C. The Temperature of 37 ° C has been chosen so that the egg evaporated as little extractant as possible and there with the pollution of the indoor air is kept low, on the other hand partial at higher temperatures Mixing of extraction medium and with that in the Pi system of the pipetting robot liquid in the automated pipetting process is prevented. The extraction by multiple Pulling up and dispensing the sample takes place, it will according to the invention when the temperature rises between 50 and 65 ° C performed. Both processes, namely Wed Pouring and warming serve as much andro as possible stenon from the fat into the extract as quickly as possible to transfer funds. The device according to the invention allows a reasonable combination of various vessels, extensive automation the determination of androstenone.

In einer Weiterbildung der Erfindung gemäß Anspruch 12 wird ein sogenannter Fettprobenrack beschrieben, der zweiteilig aufgebaut ist und mit dem es möglich ist, aus der Fettgewebeprobe das auf seinen Androstenonge halt zu untersuchende Fett abzuscheiden und einen auto matischen Zugriff des Pipettierroboters möglich zu ma chen.In a development of the invention according to claim 12 a so-called fat sample rack is described, the is built in two parts and with which it is possible from the adipose tissue sample on his androstenonge stop shedding fat and get an auto automatic access of the pipetting robot possible to ma chen.

In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform ge mäß Anspruch 13 wird ein Extraktionsrack beschrieben, das aus einem Metallblock besteht und mit dem es vor teilhafterweise möglich ist, mittels des Pipettierrobo ters die Extraktionen automatisch durchzuführen.In a further embodiment according to the invention According to claim 13, an extraction rack is described, which consists of a metal block and with which it is in front is possible in part, by means of the pipetting robo ters perform the extractions automatically.

Die Anzahl der einzelnen Probeaufnahmestellen wird zweckmäßigerweise der Anzahl der Kavitäten der Mikro titrationsplatten angepaßt und die beträgt 96. Im Zu sammenwirken aller Teile der Vorrichtung entsteht mit den softwaregesteuerten Pipetten des Pipettierroboters ein außerordentlich rationeller Verfahrensablauf.The number of individual sampling points will expediently the number of cavities of the micro adapted titration plates and this is 96. In the Zu Interaction of all parts of the device arises with the software-controlled pipettes of the pipetting robot an extremely efficient process.

Die Erfindung wird nun an einem Ausführungsbeispiel nä her erläutert. Hierzu werden die Fig. 1 bis 10 zu grunde gelegt.The invention will now be explained using an exemplary embodiment. To this end, Figs. 1 to 10 are placed based.

Es zeigenShow it

Fig. 1 Einschießen der Fettgewebepfröpfchen in die Röhrchen des Fettprobenrackoberteils, Fig. 1 impingement of the Fettgewebepfröpfchen in the tubes of the Fettprobenrackoberteils,

Fig. 2 Sprengen der Fettgewebezellen im Mikrowel lenherd und Sammeln des Fettes im Unterteil des Fettprobenracks, Fig. Lenherd 2 Next the adipose tissue cells in the micro wave and collecting the fat in the lower part of the fat sample racks,

Fig. 3 Applikation der Androstenon-Standards in das Fettprobenrackunterteil, Fig. 3 Application of androstenone standards in the Fettprobenrackunterteil,

Fig. 4 Applikation des Fettprobenrackunterteils auf die Arbeitsplattform, Fig. 4 of the application Fettprobenrackunterteils on the work platform,

Fig. 5 Aufnahme des Extraktionsmittels, Fig. 5 receiving the extraction agent,

Fig. 6 Aufnahme der flüssigen Fettproben, Fig. 6 containing the liquid fat samples,

Fig. 7 Übertragen der Fettproben und des Extrakti onsmittels in das Extraktionsröhrchen und anschließendes Mischen zur Extraktion des Androstenon, Fig. 7 transmitting the fat samples and Extrakti, onsmittels into the extraction tube and then mixing for extraction of the androstenone

Fig. 8 Inkubation der Mikrotitrationsplatte im Thermoschüttler, Fig. 8 Incubation of the microtitration plate in a thermal shaker,

Fig. 9 Inkubation der Mikrotitrationsplatte im Dunkeln, Fig. 9 incubation of the microtiter plate in the dark,

Fig. 10 Photometrische Auswertung der Mikrotitrati onsplatte im Photometer. Fig. 10 Photometric evaluation of the Mikrotitrati onsplatte in the photometer.

Aus jeder vorliegenden Fettgewebeprobe wird mit einem speziellen Probenehmer, als Pistole 50 ausgebildet, ein Fettgewebepfröpfchen von 8 mm Durchmesser und ca. 20 bis 30 ml Länge entnommen und sogleich in ein Fett probenrack 30 eingebracht (Fig. 1). Das Fettprobenrack 30 besteht aus einem Unterteil 31 und einem Oberteil 32. Das Oberteil 32 ist ein spülmaschinenfester Po lyethylenblock der Abmessungen 200×135×40 mm. In diesem sind 96 Polyethylenröhrchen 36 der Länge 40 mm, Innendurchmesser 10 mm mit einem unten angesetztem Ab fluß 34 von 25 mm Länge und Innendurchmesser 1 mm senkrecht eingesetzt. Die Polyethylenröhrchen 36 sind mit glei chem Abstand in acht Reihen zu zwölf angeordnet. Das Unterteil 31, ebenfalls ein Polyethylenblock der Abmes sungen 200×135×70 mm, in welchen 96 Bohrungen 37 von 7 mm Durchmesser und 65 mm Tiefe so eingebracht sind, daß die Abflüsse 34 der Polyethylenröhrchen 36 nach dessen paßgenauen Aufsetzen auf das Unterteil 31 in dessen Bohrungen 37 hineingreifen. Wenn 88 Fettgewe befröpfchen in die Polyethylenröhrchen 36 des Oberteils 32 eingebracht worden sind, werden diese mit einer Abdeckfolie 33 aus Polypropylen verschlossen. Dann wird das Oberteil 32 auf das Unterteil 31 gesetzt. Die gesamte Einheit wird in einem handelsüblichen Haus haltsmikrowellenherd (Fig. 2) für vier Minuten mit ei ner Energie von 400 Watt bestrahlt, um die Zellen des Fettgewebes zu sprengen. Die Abdeckfolie des Oberteils 32 mit einer an sich handelsüblichen Folie für Mikro wellenherde ist notwendig, um zu verhindern, daß wäh rend des Bestrahlens unter Umständen explosionsartig aus dem Röhrchen 36 Probenanteile herausschießen. Das austretende flüssige Fett und ein geringer Wasseranteil aus dem Fettgewebe fließen durch die Abflüsse 34 in die Bohrung 37 des Unterteiles 31, während die Griebe, also die Fettgewebematrix, durch den verengten Abfluß 34 des Polyethylenröhrchens 36 im Oberteil 32 zurückgehalten wird. Zur Reinigung der Polyethylenröhrchen 36 lassen sich die Grieben später ohne Aufwand herausklopfen. Das Oberteil 32 wird dann in einer handelsüblichen Laborgerätespülmaschine gereinigt.A fat tissue plug of 8 mm in diameter and about 20 to 30 ml in length is removed from each fat tissue sample with a special sampler, designed as a pistol 50 , and immediately introduced into a fat sample rack 30 ( FIG. 1). The fat sample rack 30 consists of a lower part 31 and an upper part 32 . The upper part 32 is a dishwasher-safe polyethylene block measuring 200 × 135 × 40 mm. In this are 96 polyethylene tubes 36 of length 40 mm, inner diameter 10 mm with a flow from below 34 of 25 mm length and inner diameter 1 mm used vertically. The polyethylene tubes 36 are arranged in equal rows in eight rows by twelve. The lower part 31 , also a polyethylene block of the dimensions 200 × 135 × 70 mm, in which 96 holes 37 of 7 mm in diameter and 65 mm deep are introduced in such a way that the outlets 34 of the polyethylene tubes 36 after its fitting onto the lower part 31 in reach into the holes 37 . When 88 adipose tissues have been introduced into the polyethylene tubes 36 of the upper part 32 , these are closed with a cover sheet 33 made of polypropylene. Then the upper part 32 is placed on the lower part 31 . The entire unit is irradiated in a commercial household microwave oven ( Fig. 2) for four minutes with an energy of 400 watts to burst the cells of the adipose tissue. The cover film of the upper part 32 with a commercially available film for microwaves is necessary in order to prevent 36 sample portions from exploding from the tube during the irradiation. The escaping liquid fat and a small amount of water from the fatty tissue flow through the outlets 34 into the bore 37 of the lower part 31 , while the greaves, that is to say the fatty tissue matrix, are retained in the upper part 32 by the narrowed outflow 34 of the polyethylene tube 36 . To clean the polyethylene tubes 36 , the greaves can later be knocked out without effort. The upper part 32 is then cleaned in a commercially available laboratory dishwasher.

Nach der Mikrowellenbehandlung hat das flüssige Fett eine Temperatur von maximal 43°C, so daß Verluste durch Ausdampfen des recht flüchtigen Androstenons ge ring gehalten werden können. Die Untersuchung der Fett gewebeproben hat zum Ziel, deren Androstenongehalt quantitativ zu bestimmen, deshalb werden neben den Pro ben sechs Standards mit Konzentrationen von 0.0, 0.1, 0.3, 1.0, 3.0 und 9.0 µg Androstenon pro Gramm Fett im Analysengang mitgeführt. Diese Standards bestehen aus Schweineschmalz weiblicher Tiere, das mit Androstenon versetzt wurde. Die Standards werden in gleicher Weise wie die Fettgewebeproben nach der Mikrowellenbestrah lung durch den automatisierten Prozeß der Androstenon bestimmung mitgeführt. Somit ist gewährleistet, daß prozeßbedingte Androstenonverluste kompensiert werden. Das Fett der Standards, welches in Glasfläschchen zu 500 µl zur Verfügung gestellt wird, wird im Mikrowel lenherd verflüssigt und zwar bei etwa 1 Minute Be strahlung und 400 Watt. Mit einer Handpipette (Fig. 3) werden dann diese sechs Standardproben in die Bohrungen 37 des Unterteils 31 gegeben, die noch nicht mit Fett proben belegt sind.After the microwave treatment, the liquid fat has a maximum temperature of 43 ° C, so that losses due to evaporation of the volatile androstenone can be kept low. The aim of examining the fat tissue samples is to determine their androstenone content quantitatively, which is why, in addition to the samples, six standards with concentrations of 0.0, 0.1, 0.3, 1.0, 3.0 and 9.0 µg androstenone per gram of fat are included in the analysis. These standards consist of lard from female animals which has been mixed with androstenone. The standards are carried out in the same way as the adipose tissue samples after microwave irradiation by the automated process of androstenone determination. This ensures that process-related androstenone losses are compensated for. The fat of the standards, which is made available in 500 µl glass vials, is liquefied in the microwave oven at about 1 minute radiation and 400 watts. With a hand pipette ( Fig. 3) these six standard samples are then placed in the holes 37 of the lower part 31 , which are not yet occupied with fat samples.

Bei hohem Probenaufkommen, also bei mehrmaligem Einsatz eines Fettprobenracks pro Tag ist die Belegung mit Standards in der o.g. Art zu zeitaufwendig. Für diesen Fall ist eine Variante zur Applikation der Standards in das Probenrack entwickelt worden:With high sample volume, i.e. with multiple use of a fat sample rack per day is with Standards in the above Kind of time consuming. For this Case is a variant of the application of the standards in the sample rack has been developed:

Die Schmalzstandards werden in 5-ml-Einmalspritzen 38 aus Polyethylen (ohne Stahlnadel) bereitgehalten. Zur wiederholten Applikation der Schmalzstandards in das Fettprobenrack werden die mit Fett gefüllten Spritzen auf Raumtemperatur erwärmt und das Fett im pastösen Zu stand per Daumendruck direkt in die Bohrungen 37 des Racks 31 gepreßt (Fig. 3).The lard standards are kept in 5 ml disposable syringes 38 made of polyethylene (without steel needle). For repeated application of the lard standards in the fat sample rack, the syringes filled with fat are warmed to room temperature and the fat in the pasty state is pressed directly into the bores 37 of the rack 31 by thumb pressure ( FIG. 3).

Nach etwa 20 Minuten ist die Probenvorbereitung abge schlossen. Bisheriger Zeitbedarf für die automatisierte Androstenonbestimmung ca. 55 Minuten.After about 20 minutes the sample preparation is finished closed. Previous time required for the automated Androstenone determination approx. 55 minutes.

Das Unterteil 31 des Fettprobenracks 30, belegt mit den Fettproben und den Standards, wird auf der vorgesehenen Halterung einer Arbeitsplattform 20 (Fig. 4) eines Pi pettierroboters 10 installiert. Diese Halterung mit integrierter elektronisch geregelter Heizung 28 hält die Temperatur des Fettprobenracks 30 konstant bei 43°C. Eine weitere Halterung mit integrierter elektro nisch geregelter Heizung 28 hält in einem Extraktions mittelbehälter 21 mit den Maßen 170×80×67 mm 850 ml Ex traktionsmedium bei konstant 37°C. Die Halterung, die das Extraktionsrack 40 aufnimmt, sichert mit elektro nisch geregelter Heizung 28 eine Temperatur von kon stant 59°C während des Extraktionsprozesses.The lower part 31 of the fat sample rack 30 , occupied by the fat samples and the standards, is installed on the intended holder of a work platform 20 ( FIG. 4) of a pipetting robot 10 . This holder with integrated electronically controlled heating 28 keeps the temperature of the fat sample rack 30 constant at 43 ° C. Another holder with integrated electronically controlled heater 28 holds in an extraction medium container 21 with the dimensions 170 × 80 × 67 mm 850 ml of extraction medium at a constant 37 ° C. The holder, which receives the extraction rack 40 , ensures a temperature of constant 59 ° C during the extraction process with electronically controlled heating 28 .

Weiterhin befindet sich auf der Arbeitsplattform 20 des Pipettierroboters 10 ein Spülmediumgefäß 22 mit den Innenmaßen 190×50×70 mm, in der etwa 500 ml zwei prozentige wäßrige Extranlösung bei ca. 55°C gehalten werden. In dieser Lösung werden die Pipettiernadeln 12 des Pipettierroboters 10 nach dem Pipettieren der Fettproben innen gespült, um Kontamination mit Fett und damit Verschleppen von Androstenon auszuschließen.Furthermore, on the working platform 20 of the pipetting robot 10 there is a rinsing medium vessel 22 with the internal dimensions 190 × 50 × 70 mm, in which approximately 500 ml of two percent aqueous extran solution are kept at approximately 55 ° C. In this solution, the pipetting needles 12 of the pipetting robot 10 are rinsed inside after the fat samples have been pipetted in order to rule out contamination with fat and thus carryover of androstenone.

Zwei weitere Halterungen zur Aufnahme der ELISA-Mikro titrationsplatte 24 und zweier Reagenzwännchen 25 be finden sich ebenfalls auf der Arbeitsplattform 20. Sie sind nicht temperiert. Das Fast-Wash-Modul 26, das sich ebenfalls auf der Arbeitsplattform 20 befindet, ist Bestandteil der serienmäßigen Ausrüstung des Pi pettierroboters 10 und dient dem Spülen des Nadelsyste mes mit destilliertem Wasser.Two further holders for receiving the ELISA micro titration plate 24 and two reagent tins 25 are also found on the work platform 20 . You are not tempered. The fast-wash module 26 , which is also located on the work platform 20 , is part of the standard equipment of the pipetting robot 10 and is used to rinse the needle system with distilled water.

Der Pipettierroboter 10 (Fig. 5) ist im Prinzip eine Vier-Kanal-Pipette 11, deren vier Pipettiernadeln 12 über ca. 80 cm lange druckfeste Teflonschläuche mit ih ren Hubkolben 15 verbunden sind. Der Hubkolben 15 wird statt mit dem Daumen wie bei einer Pipette mit einem hochpräzisen Schrittmotor bewegt. Der Kolbendruckhub oder -saughub wird über eine Systemflüssigkeit 13 in den Teflonschläuchen, in der Regel ist das Wasser, auf die Pipettiernadeln 12 und damit auf die zu pipettie rende Probenflüssigkeit übertragen. Die Probenflüssig keit und die Systemflüssigkeit 13 sind durch eine Luft blase 14 voneinander getrennt. Die Pipettiernadel 12 wird nach dem Pipettierschritt nicht wie bei einer Handpipette verworfen, sondern durch einen automati schen Spülprozeß gereinigt. Die vier Pipettenadeln 12 sind an einem Roboterarm 16 fixiert. Jede Pipettierna del 12 wird so programmgesteuert, daß sie jeden belie bigen Punkt auf der Arbeitsplattform 20 und jede be liebige Höhe anfahren kann.The pipetting robot 10 ( FIG. 5) is in principle a four-channel pipette 11 , the four pipetting needles 12 of which are connected to their reciprocating pistons 15 by means of pressure-resistant Teflon tubes of approximately 80 cm long. The reciprocating piston 15 is moved with a high-precision stepper motor instead of with the thumb as in a pipette. The piston pressure stroke or suction stroke is transmitted via a system liquid 13 in the Teflon tubes, usually the water is transferred to the pipetting needles 12 and thus to the sample liquid to be pipetted. The sample liquid speed and the system liquid 13 are separated by an air bubble 14 . The pipetting needle 12 is not discarded after the pipetting step as in a manual pipette, but is cleaned by an automatic rinsing process. The four pipette needles 12 are fixed to a robot arm 16 . Each Pipettierna del 12 is program controlled so that it can approach any point on the work platform 20 and any height.

Erfindungsgemäß nimmt nun der Pipettierroboter 10 (Fig. 5 und 6) mit seinen vier Pipettiernadeln 12 jeweils 970 µl Extraktionsmittel von 37°C durch einen 50 mm lan gen und 5 mm breiten Schlitz des Extraktionsmediumgefä ßes 21 auf, ohne das Extraktionsmittel aus den Pipet tiernadeln 12 abzugeben, wird sofort anschließend aus dem Unterteil 31 des Fettprobenracks 30 zusätzlich 30 µl flüssige Fettproben oder Standard von 43°C entnom men. Als Extraktionsmittel wird vorteilhafterweise ein Gemisch aus 9 Volumenteilen 96%igen Äthanol, 1 Teil destilliertes Wasser und Natriumchlorid in einer Kon zentration von 0,05 m eingesetzt. Die 30 µl Fettprobe und die 970 µl Extraktionsmittel pro Pipettennadel 12 werden in einem Hub gemeinsam in eines der 96 Röhrchen des Extraktionsrackes 40 gedrückt. Diese Polyethylen röhrchen, die in den Bohrungen 43 des Extraktionsrackes 40 stecken, haben einen Innendurchmesser von 6 mm und nehmen 1,3 ml auf. Sie sind in einem Aluminiumblock 42 der Abmessungen 128×98×28 mm in acht Reihen zu zwölf Bohrungen 43 von 7 mm Durchmesser fixiert. Das ist die gleiche Matrix wie bei der international ein heitlichen Mikrotitrationsplatte 24. Das Extraktions rack 40 wird mittels einer elektronisch geregelten Hei zung 44 konstant bei 65°C gehalten. Die etwas kühlere flüssige Fettprobe und Extraktionsmittelprobe werden unmittelbar in die 65°C warmen Polyethylenröhrchen eingespritzt (Fig. 7). Hierbei erfolgt ein Temperatur anstieg der Probenflüssigkeit auf 65°C. Durch vierma liges Aufziehen und Dispensieren von 500 µl bei tief in die Polyethylenröhrchen 36 eintauchenden Pipettierna deln 12 wird intensiv gemischt. Das Extraktions rack 40 läßt sich nach Gebrauch problemlos in einer handelsüblichen Laborgerätespülmaschine reinigen und steht dann für einen erneuten Einsatz bereit. Das be deutet, daß bei dem gesamten bisherigen Prozeß der Pro bennahme, Probenverteilung und Extraktion keinerlei Einwegartikel eingesetzt werden und somit auch nicht entsorgt werden müssen.According to the invention, the pipetting robot 10 ( FIGS. 5 and 6) with its four pipetting needles 12 each contains 970 μl of extraction medium at 37 ° C. through a 50 mm long and 5 mm wide slit of the extraction medium vessel 21 , without the extraction medium from the pipetting animal needles 12 , immediately afterwards an additional 30 µl of liquid fat samples or standard of 43 ° C are taken from the lower part 31 of the fat sample rack 30 . A mixture of 9 parts by volume of 96% ethanol, 1 part of distilled water and sodium chloride in a concentration of 0.05 m is advantageously used as the extractant. The 30 μl fat sample and the 970 μl extraction agent per pipette needle 12 are pressed together in one stroke into one of the 96 tubes of the extraction rack 40 . These polyethylene tubes, which are in the bores 43 of the extraction rack 40 , have an inner diameter of 6 mm and take up 1.3 ml. They are fixed in an aluminum block 42 of dimensions 128 × 98 × 28 mm in eight rows of twelve bores 43 of 7 mm in diameter. This is the same matrix as for the internationally standardized microtitration plate 24 . The extraction rack 40 is kept constant at 65 ° C by means of an electronically controlled heating 44 . The slightly cooler liquid fat sample and extractant sample are injected directly into the 65 ° C polyethylene tubes ( Fig. 7). The temperature of the sample liquid rises to 65 ° C. By pulling and dispensing 500 µl four times with pipetting needles 12 immersed deeply into the polyethylene tubes 36 , mixing is carried out intensively. The extraction rack 40 can be easily cleaned after use in a standard laboratory dishwasher and is then ready for use again. This means that no disposable items are used in the entire previous process of sampling, sample distribution and extraction and therefore do not have to be disposed of.

Bereits während mit dem Pipettierroboter 10 das Ex traktionsprogramm gefahren wird, erfolgt die Vorberei tung zur Durchführung des Androstenon-Enzymimmunoassay in der Mikrotitrationsplatte 24. Die Mikrotitrations platte 24 hat das international einheitliche Maß von 128 × 96 mm und besteht aus einem Rahmen, in den zwölf Streifen mit je acht Flachbodennäpfchen von 6 mm Durchmesser und einem Fassungsvermögen von 350 µl ein gesetzt sind. Die Näpfchenböden sind innen bereits mit Kaninchen-Anti-Androstenon-Antikörpern beschichtet. Jedes Näpfchen der für die Androstenonbestimmungsre aktion in den Rahmen eingesetzten Streifen wird zweimal mit je 300 µl Waschpufferlösung gefüllt und abgesaugt, um die Antikörperbeschichtung zu aktivieren. Der Wasch puffer wird durch 1+9-Verdünnen des bereitgestellten Waschpufferkonzentrates mit destilliertem Wasser herge stellt. Hierbei ist es sehr vorteilhaft, wenn das Vorwaschen der Näpfchen in einem separaten Waschauto maten durchgeführt wird, da gleichzeitig der Pipet tierroboter 10 das Extraktionsprogramm abfährt. Im wei teren Ablauf des erfindungsgemäßen Verfahrens wird je ein Reagenzwännchen 25 mit 13 ml Probenverdünnungspuffer und 8 ml Konjugatlösung in den dafür vorgesehenen Halterungen auf der Arbeitsplattform 20 des Pipettier roboters 10 plaziert. Die Konjugatlösung ist eine wäß rige 1 : 100-Verdünnung eines Konzentrats von Peroxidase-gelabelten Androstenon. Das Androstenonkonjugat und das Probenandrostenon konkurrieren um die Bindung an die Antikörerbeschichtung im Näpfchen der Mikro titrationsplatte 24.Already while the extraction program is being operated with the pipetting robot 10 , the preparation for carrying out the androstenone enzyme immunoassay in the microtitration plate 24 is carried out . The microtitration plate 24 has the internationally uniform size of 128 × 96 mm and consists of a frame in which twelve strips with eight flat-bottomed cells with a diameter of 6 mm and a capacity of 350 µl are inserted. The inside of the wells are already coated with rabbit anti-androstenone antibodies. Each well of the strips used for the androstenone determination reaction in the frame is filled twice with 300 μl wash buffer solution and suctioned off in order to activate the antibody coating. The wash buffer is prepared by 1 + 9 dilution of the wash buffer concentrate provided with distilled water. It is very advantageous here if the prewashing of the cells is carried out in a separate washing machine, since at the same time the pipette animal robot 10 executes the extraction program. In the further course of the method according to the invention, one reagent 25 each with 13 ml sample dilution buffer and 8 ml conjugate solution is placed in the holders provided on the work platform 20 of the pipetting robot 10 . The conjugate solution is an aqueous 1: 100 dilution of a concentrate of peroxidase-labeled androstenone. The androstenone conjugate and the sample androstenone compete for binding to the antibody coating in the well of the micro titration plate 24 .

Nach Abschluß des Vorwaschprogrammes auf dem Waschauto maten 70 wird die Mikrotitrationsplatte 24 in der ent sprechenden Halterung auf der Arbeitsplattform 20 be festigt.After completion of the prewash program on the washing machine 70 , the microtitration plate 24 is fastened in the appropriate holder on the work platform 20 be.

Ist das Extraktionsprogramm auf dem Pipettierroboter 10 ausgeführt, wird anschließend das Programm zur Übertra gung der Androstenonextraktionsmedium-Lösung vom Ex traktionsrack 40 in die Mikrotitrationsplatte 24 ge startet. Im ersten Pipettierschritt legt der Pipet tierroboter 10 100 µl Probenverdünnungspuffer aus der Reagenzwanne 25 in jedem Näpfchen der Mikrotitrations platte vor. Dann nimmt jede Pipettiernadel 12 50 µl Konjugatlösung aus der Reagenzwanne 25 und sofort an schließend 10 µl androstenonhaltiges Extraktionsmedium aus einem Röhrchen des Extraktionsrackes 40 auf. Beide Lösungen werden gemeinsam in das mit Probenverdünnungs puffer belegte entsprechende Näpfchen der Mikrotitra tionsplatte 24 pipettiert. Hierbei erfolgt die Zugabe mit hoher Geschwindigkeit (ca. 300 µl pro Sekunde). Dadurch werden die drei Lösungen sofort verwirbelt. Ein Inaktivieren der Antikörperbeschichtung durch das al koholhaltige Extraktionsmedium ist so ausgeschlossen. Bei der oben beschriebenen automatischen Übertragung des 65°C warmen und fetthaltigen Extraktionsmittels in die mit Probenpuffer belegten Näpfchen der Mikro titrationsplatte 24 wurde überraschenderweise niemals eine Trübung durch Fett oder eine Störung der ELISA-Re aktion beobachtet. Es ist für die Ökonomie des Bestim mungsverfahrens außerordentlich vorteilhaft, daß an dieser Stelle auf eine zeit- und androstenonraubende Kühl- und Wartephase nach der Extraktion verzichtet werden kann.If the extraction program is carried out on the pipetting robot 10 , the program for transferring the androstenone extraction medium solution from the extraction rack 40 into the microtitration plate 24 is then started. In the first pipetting step, the pipetting animal robot places 10 100 μl sample dilution buffer from the reagent well 25 in each well of the microtitration plate. Then each pipetting needle 12 picks up 50 .mu.l conjugate solution from the reagent well 25 and immediately afterwards 10 .mu.l extraction medium containing androstenone from a tube of the extraction rack 40 . Both solutions are pipetted together into the corresponding well of the microtitration plate 24 covered with sample dilution buffer. The addition takes place at high speed (approx. 300 µl per second). This immediately swirls the three solutions. An inactivation of the antibody coating by the alcohol-containing extraction medium is excluded. In the automatic transfer of the 65 ° C. warm and fatty extractant described above into the wells of the micro titration plate 24 covered with sample buffer, surprisingly never a clouding by fat or a disturbance of the ELISA reaction was observed. It is extremely advantageous for the economy of the determination method that a time and androstenone-consuming cooling and waiting phase after the extraction can be dispensed with at this point.

Während das Probenübertragungsprogramm abläuft (Dauer etwa 20 Minuten), bleibt dem Laboranten bereits wieder Zeit, die Probenvorbereitung für das nächste Fettpro benrack 30, das mittlerweile vom Schlachtband einge troffen sein könnte, zu beginnen.While the sample transfer program is running (takes about 20 minutes), the laboratory technician already has time to start preparing the samples for the next fat sample rack 30 , which may have arrived on the slaughter line.

Nach Abschluß des Probenübertragungsprogrammes wird die belegte Mikrotitrationsplatte 24 zur Bindung von Enzym-gelabeltem bzw. Probenandrostenon an die Antikörperbe schichtung im Näpfchen der Mikrotitrationsplatte 24 für 30 Minuten in einen temperierten Thermoschüttler 80 ge geben (Fig. 8). Dieser Thermoschüttler 80 ist eine auf konstant 40°C +/- 0,1°C geregelte Kammer, in der die Mikrotitrationsplatte mit einer Frequenz von 250 Schwingungen pro Minute bewegt wird.After completion of the sample transfer program, the occupied microtitration plate 24 for binding enzyme-labeled or sample androstenone to the antibody coating in the well of the microtitration plate 24 is placed for 30 minutes in a temperature-controlled thermoshaker 80 ( FIG. 8). This thermal shaker 80 is a chamber regulated to a constant 40 ° C +/- 0.1 ° C, in which the microtitration plate is moved at a frequency of 250 vibrations per minute.

Während dieser Inkubationszeit bleibt dem Laboranten wiederum Gelegenheit, die Probenvorbereitung für den nächsten Bestimmungszyklus zu beenden und die Reagen zien für den nächsten Reaktionsschritt vorzubereiten. Als Substrat werden ortho-Phenylendiamin-Tabletten be reitgestellt, die in destilliertem Wasser unter Licht ausschluß gelöst werden. Diese Lösung wird im Reagen zwännchen 25 auf der Arbeitsplattform 20 bereitgestellt und mit einem Substrataktivator (Wasserstoffperoxid) versetzt. Nach Ablauf der Inkubationszeit im Thermo schüttler 80 werden die Näpfchen der Mikrotitrations platten 24 je vier mal mit 300 µl Waschpuffer gefüllt und nach einer Einwirkzeit von 25 Sekunden abgesaugt. Dieses Programm wird wieder selbständig vom Waschauto maten 70 durchgeführt. Nach dem Waschvorgang wird die Mikrotitrationsplatte 24 wieder auf der Arbeitsplatt form 20 aufgestellt und in jedem Näpfchen mit 150 µl Substratlösung belegt. Die Substratlösung ist anfangs farblos und wird durch das an die Antikörperbeschich tung gebundene Konjugatenzym unter Zuhilfenahme des Substrataktivators in eine gelbe lösliche Verbindung (oxidiertes o-Phenylendiamin) verwandelt. Bei steigen der Menge an gebundenem Proben-Androstenon (nicht Enzym-gelabelt) wird weniger Farbstoff gebildet. Da die Farbbildungsreaktion in geringem Maße auch durch di rekte Reaktion des Substrats mit Licht hervorgerufen wird, wird die Mikrotitrationsplatte 24 für 15 Minuten bei Raumtemperatur ohne Schütteln in eine lichtdichte Inkubationskammer 90 gestellt (Fig. 9).During this incubation period, the laboratory technician again has the opportunity to end sample preparation for the next determination cycle and to prepare the reagents for the next reaction step. As a substrate ortho-phenylenediamine tablets are provided, which are dissolved in distilled water under exclusion of light. This solution is provided in the reagent between 25 on the work platform 20 and mixed with a substrate activator (hydrogen peroxide). After the incubation period in the thermo shaker 80 , the wells of the microtitration plates 24 are filled four times with 300 μl of washing buffer and aspirated after an exposure time of 25 seconds. This program is again carried out independently by the washing machine 70 . After the washing process, the microtitration plate 24 is set up again on the work platform 20 and coated with 150 μl of substrate solution in each well. The substrate solution is initially colorless and is converted into a yellow soluble compound (oxidized o-phenylenediamine) by the conjugate enzyme bound to the antibody coating with the aid of the substrate activator. As the amount of bound androstenone (not labeled with an enzyme) increases, less dye is formed. Since the color formation reaction is also caused to a small extent by direct reaction of the substrate with light, the microtitration plate 24 is placed in a light-tight incubation chamber 90 for 15 minutes at room temperature without shaking ( FIG. 9).

Nach Beendigung der vorgegebenen Substratinkubations zeit wird die Farbbildung durch Zugabe eines Stopprea genzes, in diesem Falle 2n Schwefelsäure, zum Abschluß gebracht. Der Pipettierroboter 10 benötigt exakt die gleiche Dispensierzeit für die Zugabe der Substratlö sung, wie für die der Stopplösung, nämlich 90 Sekunden. Damit ist garantiert, daß allen Näpfchen der Mikro krotitrationsplatte 24 die gleiche Substrat inkubationszeit zur Verfügung steht. Die optische Dichte der Farblösungen in den einzelnen Näpfchen der Mikrotitrationsplatte 24 wird mit einem Fotometer 100 für Mikrotitrationsplatten bei 492 nm Meßwellenlänge gegen 620 nm Referenz Wellenlänge bestimmt (Fig. 10). Der mit dem Fotometer 100 verbundene Personalcomputer stellt mit einem speziellen Steuer- und Auswertepro gramm aus den gemessenen optischen Dichten der un tersuchten Fettproben und der Standards eine Standar deichkurve auf und entnimmt daraus den Androstenonge halt der Fettgewebeproben.After the specified substrate incubation time has ended, the color formation is brought to a conclusion by adding a stop reagent, in this case 2N sulfuric acid. The pipetting robot 10 requires exactly the same dispensing time for adding the substrate solution as for the stop solution, namely 90 seconds. This guarantees that all the wells of the micro crotitration plate 24 have the same substrate incubation time available. The optical density of the color solutions in the individual wells of the microtitration plate 24 is determined with a photometer 100 for microtitration plates at a measuring wavelength of 492 nm against a 620 nm reference wavelength ( FIG. 10). The personal computer connected to the photometer 100 uses a special control and evaluation program to create a standard dyke curve from the measured optical densities of the fat samples examined and the standards, and takes the androstenone content of the fat tissue samples from them.

Ausführungsbeispiel für eine manuelle Testdurchführung bei geringen Probenzahlen:Exemplary embodiment for a manual test execution with small number of samples:

Extraktion:
Ca. 2 g Fettgewebe werden in der Mikrowelle 4 min bei 180 Watt erhitzt. 50 µl flüssiges Fett werden in 1 ml auf 60°C erhitztes Extraktionsmittel (bevorzugt bestehend aus 9 Volumenteilen 96%igem Ethanol und 1 Volumenanteil destilliertes Wasser, 0,05 m NaCl) gegeben. Dann wird kurz und intensiv in einem geschlossenen Gefäß geschüttelt. Bei diesem Testregime erwies sich eine möglichst vollständige Phasentrennung Extraktionsmittel-Fett als günstig. Dies wird durch den Zusatz von beispielsweise NaCl und ein Abkühlen auf Raumtemperatur erreicht. Ebenso werden die Standardproben (0-9 µg Androstenon pro g Fett) behan delt.Extraction:
Approx. 2 g of adipose tissue are heated in the microwave for 4 min at 180 watts. 50 μl of liquid fat are added to 1 ml of extractant heated to 60 ° C. (preferably consisting of 9 parts by volume of 96% ethanol and 1 part by volume of distilled water, 0.05 M NaCl). Then shake briefly and intensively in a closed vessel. With this test regime, the most complete possible phase separation of extractant-fat proved to be beneficial. This is achieved by adding NaCl, for example, and cooling to room temperature. The standard samples (0-9 µg androstenone per g fat) are also treated.

Testdurchführung:
Die mit anti-Androstenon-Antikörpern beschichteten Mi krotiterstreifen werden zweimal mit je 300 µl Waschpuf fer (Phosphatpuffer, pH 7,2/Tween 20) gewaschen. Da nach werden 100 µl Probenverdünnungspuffer (Phosphatpuffer, pH 7,2, 0,1% Rinderserumalbumin), 5 µl Extrakt und sofort danach 50 µl Androstenon-Peroxidase- Konjugat in jede Vertiefung pipettiert. Die Immunreak tanden werden 1 h bei Raumtemperatur inkubiert und nicht gebundener Analyt bzw. Enzymkonjugat durch viermaliges Waschen mit je 300 µl Waschpuffer entfernt. Nach zehnminütiger Inkubation mit gebrauchsfertiger Substratlösung (Tetramethylbenzidin) wird die Substratreaktion durch Zugabe von 100 µl 0,5 n Schwefelsäure gestoppt. Die Bestimmung des Androstenongehaltes in den Fettproben erfolgt mittels bekannter quantitativer Auswertverfahren durch Messen der Extinktionen bei 450 nm mittels der mitgeführten Standards.Test execution:
The microtiter strips coated with anti-androstenone antibodies are washed twice with 300 μl wash buffer (phosphate buffer, pH 7.2 / Tween 20). Then 100 µl sample dilution buffer (phosphate buffer, pH 7.2, 0.1% bovine serum albumin), 5 µl extract and immediately afterwards 50 µl androstenone-peroxidase conjugate are pipetted into each well. The immune reactions are incubated for 1 h at room temperature and unbound analyte or enzyme conjugate is removed by washing four times with 300 μl wash buffer each. After incubation for ten minutes with ready-to-use substrate solution (tetramethylbenzidine), the substrate reaction is stopped by adding 100 μl of 0.5 N sulfuric acid. The determination of the androstenone content in the fat samples is carried out using known quantitative evaluation methods by measuring the extinctions at 450 nm using the standards carried.

BezugszeichenlisteReference list

10 Pipettierroboter
11 Pipette
12 Pipettennadel
13 Systemflüssigkeit
14 Luftblase
15 Hubkolben
16 Roboterarm
20 Arbeitsplattform
21 Extraktionsmittel
22 Spülmediumgefäß
23 Waschstation
24 Mikrotitrationsplatte
25 Reagenzwännchen
26 Fast-Wash-Modul
27 Reservoir
28 elektronisch geregelte Heizung
30 Fettprobenrack
31 Unterteil
32 Oberteil
33 Abdeckfolie
34 Abfluß
35 Aufsatzblock
36 Polyethylenröhrchen
37 Bohrung
38 Einmalspritze
39 Aufnahmebohrung
40 Extraktionsrack
41 Extraktionsröhrchen
42 Aluminiumblock
43 Bohrung
44 Heizung
50 Pistole
60 Mikrowellengerät
70 Waschautomat
80 Thermoschüttler
90 Inkubationskammer
100 Fotometer 10 pipetting robots
11 pipette
12 pipette needle
13 system fluid
14 air bubble
15 reciprocating pistons
16 robotic arm
20 working platform
21 extractant
22 flushing medium container
23 washing station
24 microtitration plate
25 test tubes
26 Fast wash module
27 reservoir
28 electronically controlled heating
30 fat sample rack
31 lower part
32 top
33 cover film
34 drain
35 top section
36 polyethylene tubes
37 hole
38 disposable syringe
39 Location hole
40 extraction rack
41 extraction tubes
42 aluminum block
43 hole
44 heating
50 pistol
60 microwave oven
70 washing machine
80 thermal shakers
90 incubation chamber
100 photometers

Claims

1. A method for determining androstenone in fatty tissue by melting the fat samples, extracting the androstenone and then determining the content by means of competitive immunological detection reactions, characterized in that
that the melted fat sample, which has a maximum temperature of 43 ° C, and an extraction medium taken up with a pipette stroke, transferred to a temperature-controlled extraction vessel, immediately drawn up and dispensed several times with the same pipette,
that immediately thereafter, without cooling step, the temperature-controlled, androstenone-containing extractant is mixed with a sample dilution buffer and a conjugate solution and then the content is determined in a manner known per se by means of competitive immunological detection reactions.

2. The method according to claim 1, characterized by that the extractant at the time of suction gens with the pipette to a temperature of 37 ° C points.

3. The method according to any one of claims 1 to 2, characterized by that the extraction in the temperature-controlled extraction vessel with increasing temperature between 50 ° C and 59 ° C is carried out.

4. The method according to any one of claims 1 to 3, characterized by that the volume ratio between fat sample and Extracting agent is 1 to 10 to 1 to 50.

5. The method according to any one of claims 1 to 4, characterized by the water-soluble solvent as an extractant are used, which ent ent water if necessary hold.

6. The method according to any one of claims 1 to 5, characterized, that the extractant contains electrolytes.

7. The method according to claim 6, characterized, that as electrolytes salts of alkali and alkaline earth limetals are used.

8. The method according to any one of claims 6 or 7, characterized, that as electrolyte sodium chloride in a conc tration of 0.05 m-0.5 m is used.

9. The method according to any one of claims 5 to 8, characterized, that as a water-soluble solvent lower alcohols such as methanol, ethanol, propanol, lower ketones such as acetone and / or aprotic solvents such as dimethyl sulfoxide, dime thylformamide can be used.

10. The method according to any one of claims 1 to 9, characterized, that androstenone standards on high samples come in single-use syringes, preferably from bottom lyethylene (without steel needle) ready for Application warmed to room temperature and in pa in a specimen container by thumb pressure be pressed.

11. Device for the determination of androstenone in fat tissue, consisting of a pipetting robot with a work platform on which sample, chemical and reaction vessels are arranged, a micro wave device and other additional devices for the treatment of microtiter plates, characterized in that on the work platform ( 20 ) of the pipetting robot ( 10 ) for the software-controlled pipettes ( 11 ) are arranged so that they can be reached

- an extractant vessel ( 21 ),
- a flushing medium vessel ( 22 ),
- a washing station ( 23 ),
- a microtitration plate ( 24 ),
- two reagent pans ( 25 ),
- a fast wash module ( 26 ),
- a fat sample rack ( 30 ),
- an extraction rack ( 40 ),
- a thermal shaker ( 80 ),

wherein the extractant vessel ( 21 ), the Fettpro benrack ( 30 ) and the extraction rack ( 40 ) have a separately controllable temperature control device.

12. The apparatus according to claim 11, characterized in that the fat sample rack ( 30 ) consists of a removable block-like upper part ( 32 ) and a block-like lower part ( 31 ) and both parts have bores lying one above the other, only the bores of the upper part ( 32 ) being continuous are and contain polyethylene tubes ( 36 ), the tapered drains ( 34 ) on the bottom in the holes in the lower part ( 31 ).

13. The device according to one of claims 11 or 12, characterized in that the extraction rack ( 40 ) consists of a metal block which contains bores in which extraction tubes ( 41 ) are removably inserted.

14. Device according to one of claims 11 to 13, characterized in that the number of holes in the fat sample rack ( 30 ), in the extraction rack ( 40 ) and in the microtiter plate ( 24 ) is identical.

15. The device according to one of claims 11 to 14, characterized in that the thermal shaker ( 80 ) for incubation in the microtiter plate ( 24 ) with a frequency of 100 to 300 vibrations per minute, preferably 250 vibrations per minute, and a temperature of 37 ° C works.