DE4432905A1

DE4432905A1 - Method for the determination of free apoprotein (a)

Info

Publication number: DE4432905A1
Application number: DE19944432905
Authority: DE
Inventors: Stephan T Dr Kiesig; Kai Dipl Biol Wolter; Josef Dr Friedrich; Renate Dipl Biol Dr Spohn
Original assignee: IMMUNO GmbH
Current assignee: Progen Biotechnik GmbH
Priority date: 1994-09-15
Filing date: 1994-09-15
Publication date: 1996-03-28
Anticipated expiration: 2014-09-16
Also published as: DE4432905C2; JPH10505897A; EP0781416A1; ATA152695A; AT406713B; WO1996008724A1

Abstract

A process is disclosed for identifying free apo (a) in a human body fluid containing free apo (a) and a lipid-bound apo (a). The proposed process involves (a) separating the apo (a) bound to the lipids and subsequently identifying the free apo (a) by known methods; or (b) identifying the free apo (a) in an immune reaction with antibodies which react to the free, but not to bound, apo (a). This process provides a powerful tool for assessing disturbances in lipoprotein metabolism or a patient's atherogenic risk.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von freiem Apoprotein (a) (Apo(a)). Apoprotein (a) spielt bei der Inhibierung von Plasminogen und anderen fibrinolytisch wirkenden Proteasen sowie bei der Einlagerung von Cholesterolestern und anderen Lipiden in die Intima arterieller Gefäße bei der Atherogenese eine wichtige Rolle.The invention relates to a method for determining free Apoprotein (a) (Apo (a)). Apoprotein (a) plays in the Inhibition of plasminogen and other fibrinolytic acting proteases and in the storage of Cholesterol esters and other lipids in the intima arterial vessels play an important role in atherogenesis.

Apoprotein (a) (Apo(a)) bildet gemeinsam mit dem Apoprotein B 100 (Apo B-100) und einem Lipidanteil das Lipoprotein (a) (Lp(a)). Der Lipidanteil besteht aus einem Oberflächenfilm aus polaren Lipiden, der einen mit Cholesterol gefüllten Innenraum umgibt. Der Lipidanteil mit dem assoziierten Apo-B-100 entspricht dem low-density Lipoprotein (LDL) (Berg et al. Acta Path 59(3) (1963) 369). Lp(a) gilt als unabhängiger Risikofaktor bei der Entstehung von Atherosklerose (Kostner et al, Atherosklerosis 38 (1981) 51), wobei die Einflüsse der einzelnen Apoproteine nicht geklärt sind. Das Apo(a) ist ein hochglykosyliertes Protein, von dem angenommen wird, das es mit dem Apo-B-100 über eine oder mehrere Disulfidbrücken verbunden ist (Utermann et al, J. Clin. Invest. 80 (1987) 458; Gaubatz et al, J. Biol. Chem. 258 (7) (1983) 4582; Gaubatz et al, J.D.J. Lipid Res. 28 (1987) 69; Utermann et al, W.FEBS Lett. 154 (2) (1983) 357; Seman et al, W.C. Biochem. Cell Biol. 64 (1986) 999; Fless et al., J. Biol. Chem. 261 (19) (1986) 8712; Kraft et al., C.J. Clin. Invest. 80 (1987) 458). Seman et al, l.c. fanden für das Apo(a) einen Kohlenhydratanteil von 22,5% und Fless et al., l.c. einen solchen von 54,1%.Apoprotein (a) (Apo (a)) forms together with apoprotein B 100 (Apo B-100) and a lipid portion the lipoprotein (a) (Lp (a)). The lipid portion consists of a surface film polar lipids, the interior of which is filled with cholesterol surrounds. The lipid portion associated with the Apo-B-100 corresponds to low-density lipoprotein (LDL) (Berg et al. Acta Path 59 (3) (1963) 369). Lp (a) is considered to be more independent Risk factor in the development of atherosclerosis (Kostner et al, Atherosklerosis 38 (1981) 51), the influences of individual apoproteins have not been clarified. The apo (a) is a highly glycosylated protein believed to be with the Apo-B-100 via one or more disulfide bridges (Utermann et al, J. Clin. Invest. 80 (1987) 458; Gaubatz et al, J. Biol. Chem. 258 (7) (1983) 4582; Gaubatz et al, J.D.J. Lipid Res. 28 (1987) 69; Utermann et al, W. FEBS Lett. 154 (2) (1983) 357; Seman et al, W.C. Biochem. Cell Biol. 64 (1986) 999; Fless et al., J. Biol. Chem. 261 (19) (1986) 8712; Kraft et al., C.J. Clin. Invest. 80 (1987) 458). Seman et al, l.c. found one for Apo (a) 22.5% carbohydrate content and Fless et al., L.c. one those of 54.1%.

Das Apo(a) ist mit dem Plasminogen eng verwandt. Die Homologie konnte durch Proteinsequenzierung und cDNA-Klonierung bewiesen werden (McLean et al, Nature 300 (1987) 132). Das Proenzym (Zymogen) Plasminogen enthält 5 cysteinreiche Sequenzen von je 80-114 Aminosäuren, den sogenannten "Kringles", die von I bis V numeriert sind. Es handelt sich dabei um Proteinstrukturen, die durch drei interne Disulfidbrücken zwischen dem ersten und sechsten, dem zweiten und vierten und dem dritten und fünften Cystein stabilisiert werden. Zusätzlich ist nach dem Kringle V, dem C-terminalen Ende folgend, eine Serin-Protease-Domäne enthalten (Utermann et al, l.c.). Die im Plasminogen enthaltende Signalsequenz, der Kringle IV, der Kringle V und die Proteasedomäne sind auch im Apo(a) mit großer Sequenzhomologie zu Plasminogen vorhanden.Apo (a) is closely related to plasminogen. The homology could be proven by protein sequencing and cDNA cloning (McLean et al, Nature 300 (1987) 132). The proenzyme (Zymogen) Plasminogen contains 5 cysteine-rich sequences each 80-114 amino acids, the so-called "Kringles", which range from I to V are numbered. These are protein structures, by three internal disulfide bridges between the first and sixth, second and fourth and third and fifth Cysteine can be stabilized. In addition is after the Kringle V, following the C-terminal end, a serine protease domain included (Utermann et al, l.c.). The one in the plasminogen containing signal sequence, the Kringle IV, the Kringle V and the protease domain is also large in Apo (a) Sequence homology to plasminogen available.

Kringle V des Plasminogens kommt in Apo(a) einmal und Kringel IV in 10 verschiedenen Varianten (Kringle 1-10 im Apo(a)) vor. Der Apo(a)-Kringle 2 kommt seinerseits wieder in identischen Kopien unterschiedlicher Anzahl (n=1 bis ca. 28) vor. Die hieraus resultierenden Unterschiede im Molekulargewicht führen zur Einteilung des Lp(a)- und/oder Apo(a)-Moleküls in Isoformen (Utermann et al, l.c.; Eaton et al., Proc. Natl. Acad Sci USA 84 (1987) 3224). Je nach Nomenklatur wird heute zwischen 6 und 37 Isoformen unterschieden (Lackner et al., J. Clin. Invest. 87 (1991) 2153-2161).Kringle V of the plasminogen comes once in Apo (a) and Kringel IV in 10 different variants (Kringle 1-10 in Apo (a)). The Apo (a) ring 2 comes in turn again in identical Copies of different numbers (n = 1 to about 28). The resulting differences in molecular weight to divide the Lp (a) and / or Apo (a) molecule into Isoforms (Utermann et al, l.c .; Eaton et al., Proc. Natl. Acad Sci USA 84 (1987) 3224). Depending on the nomenclature today distinguish between 6 and 37 isoforms (Lackner et al., J. Clin. Invest. 87 (1991) 2153-2161).

Die vorletzte Kopie des Kringle IV enthält einen weiteren Cystein-Rest, der wahrscheinlich die Brücke zu Apo-B-100 bildet (Eaton et al. l.c.). Aufgrund der großen Homologie zwischen den Apo(a)-Kringeln und Kringle IV des Plasminogens wird angenommen, daß auch Apo(a) Lysin-Bindungsstellen besitzt. Dies konnte mittels Säulenchromatographie über Lysin- Sepharose bestätigt werden.The penultimate copy of Kringle IV contains another one Cysteine residue, which is probably the bridge to Apo-B-100 forms (Eaton et al. l.c.). Because of the great homology between the Apo (a) squiggles and Kringle IV of the plasminogen it is believed that apo (a) lysine binding sites owns. This could be done by means of column chromatography over lysine Sepharose to be confirmed.

Die Kringle-Domänen des Plasminogens enthalten spezifische Bindungsstellen für Fibrin, 2-Antiplasmin und Lysin. Kringle I bis V binden Lysin, wobei Kringle I und IV die größte Affinität zeigen (Eaton et al, l.c.). Kringle-Strukturelemente sind in einer Reihe weiterer Proteine, wie z. B. t-PA, Urokinase, Thrombin, Faktor XII, usw. enthalten.The plasminogen's Kringle domains contain specific ones Binding sites for fibrin, 2-antiplasmin and lysine. Kringle I to V bind lysine, with Kringle I and IV being the largest Show affinity (Eaton et al, l.c.). Kringle structural elements are in a number of other proteins, such as. B. t-PA, Urokinase, thrombin, factor XII, etc. included.

Das Apo(a) enthält eine komplette Protease Domäne. Diese ist enzymatisch inaktiv bzw. kann nicht durch Streptokinase, Urokinase oder t-PA wie vergleichbares Protein gespalten werden. Im Falle des Plasminogens wird dies durch Spaltung bei Arginin⁵⁶⁰ (Arg⁵⁶⁰) erreicht. Im Apo(a) ist jedoch der für die Spaltung essentielle Arginin-Rest durch Serin ersetzt (Eaton et al., l.c.).Apo (a) contains a complete protease domain. This is enzymatically inactive or cannot be caused by streptokinase, Urokinase or t-PA cleaved like comparable protein will. In the case of plasminogen, this is caused by cleavage Arginine⁵⁶⁰ (Arg⁵⁶⁰) reached. In Apo (a), however, that is for the Cleavage essential arginine residue replaced by serine (Eaton et al., l.c.).

Der Kohlenhydratanteil des Apo(a) ist für die hydrophilen Eigenschaften des Proteins verantwortlich. Mit ca. 45% ist er im Vergleich zum Plasminogen (5%) wesentlich höher und bedingt einen wichtigen Teil der antigenen Eigenschaften dieses Proteins. Es lassen sich vorwiegend Hexosen (Galaktose und Mannose) sowie N-Acetyl-D-Galaktosamin (GalNAc) und N- Acetyl-D-Glucosamin nachweisen. Im Apo(a) sind die Anteile der Hexosen etwa gleich groß, während im LDL der Gehalt an Mannose größer als der von Galaktose ist. GalNAc ist im LDL etwa sechsmal häufiger vertreten als im Apo(a). Der Neuraminsäureanteil läßt sich durch Behandlung mit Neuraminidase abspalten, wodurch das Molekulargewicht des Moleküls deutlich sinkt (Kraft et al., l.c., Utermann et al., J. Clin. Invest. 80 (1987) 458).The carbohydrate portion of Apo (a) is for the hydrophilic Properties of the protein responsible. With about 45% it is compared to the plasminogen (5%) much higher and requires an important part of the antigenic properties of this protein. Mainly hexoses (galactose and mannose) and N-acetyl-D-galactosamine (GalNAc) and N- Detect acetyl-D-glucosamine. In Apo (a) the proportions are the Hexoses about the same size, while in the LDL the mannose content is larger than that of galactose. GalNAc is about in the LDL represented six times more often than in Apo (a). Of the Neuraminic acid content can be treated with Cleave neuraminidase, reducing the molecular weight of the Molecule decreases significantly (Kraft et al., L.c., Utermann et al., J. Clin. Invest. 80 (1987) 458).

Die räumliche Struktur von Apo(a) ist noch nicht endgültig aufgeklärt. Untersuchungen biophysikalischer Art liegen erst über rekombinantes Apo(a) (r-Apo(a)) vor. Wie Philips et al, Biochemistry 32 (1993) 3722 an rekombinantem Apo(a) (nach Koschiensky et al, Biochemistry 30 (1991) 5044) zeigten, handelt es sich um ein Protein mit einem Stokesradius von 94 A, das sehr asymmetrisch oder ein random coil zu sein scheint. Im Elektronenmikroskop konnte es als lange hochflexible Kette visualisiert werden, die große offenspiralige Domänen bildet. Dabei liegen ca. 10% des Proteins als polymeres Aggregat vor. Das Molekulargewicht des r-Apo(a) lag bei 500 kD (Koschinsky et al, l.c.); das Molekulargewicht von humanem Apo(a) liegt, je nach Isoform, zwischen 280 und 800 kD. Das monomere Gesamtmolekül hat eine Länge von ca. 800 A und besteht aus einer Kette von 19 flexibel verbundenen Domänen mit einer durchschnittlichen Größe von jeweils 42,1 A. Ein Vergleich mit der t-PA-Kringlestruktur, die röntgenkristallographisch aufgeklärt wurde, läßt vermuten, daß es sich bei den Apo(a)- Domänen ebenfalls um oblate Ellipsoide mit einer ungefähren Dimension von 28×30×11 A handelt, die durch Ketten mit einer ungefähren Länge von 36 Aminosäuren verbunden sind, die die Flexibilität des Moleküls gewährleisten (vgl. Philips et al, Biochemistry 22 (1993) 3722, mit bildlicher Darstellung der Struktur von Lp(a)). Wie schon in anderen Arbeiten gezeigt (Chiesa et al, J. Biol. Chem. 34 (1992) 24369, Lawn et al., Nature 360 (1992) 670, Breslow et al, Proc. Natl Acad. Sci USA 90 (1993) 8314) gelingt es auch hier, eine nicht kovalente Bindung von Apo(a) und Apo-B-100, bzw. dem ganzen LDL-Molekül zu zeigen. So ist r-Apo(a) mit mindestens einem Kringle, wahrscheinlich allerdings einigen, an LDL fixiert und ragt in kompakter Form in den umgebenden Raum. Diese Bindung kann mit 50 mM 6-Aminohexansäure aufgehoben werden und ist somit nicht kovalent. Vielmehr scheint sie prinzipiell ionischer Natur zu sein, denn die Affinität nimmt mit steigender Salzkonzentration ab. Eine kovalente Bindung, wie sie in vivo als Disulfidbrücke vorliegt, scheint sich aber in vitro nicht einzustellen (Philips et al, l.c.).The spatial structure of Apo (a) is not yet final enlightened. Biophysical investigations are still pending via recombinant Apo (a) (r-Apo (a)). As Philips et al, Biochemistry 32 (1993) 3722 on recombinant apo (a) (after Koschiensky et al, Biochemistry 30 (1991) 5044) showed is a protein with a Stokes radius of 94 A that appears to be very asymmetrical or a random coil. In the electron microscope, it could be a long, highly flexible chain can be visualized, which forms large off-spiral domains. About 10% of the protein is present as a polymeric aggregate. The molecular weight of the r-Apo (a) was 500 kD (Koschinsky et al, l.c.); the molecular weight of human apo (a) is depending on the isoform, between 280 and 800 kD. The monomeric The total molecule has a length of approx. 800 A and consists of a chain of 19 flexibly connected domains with one average size of 42.1 A each. A comparison with the t-PA Kringles structure, the X-ray crystallography was elucidated, suggests that Apo (a) - Domains also around oblate ellipsoids with an approximate Dimension of 28 × 30 × 11 A acts through chains with an approximate length of 36 amino acids ensure the flexibility of the molecule (cf. Philips et al, Biochemistry 22 (1993) 3722, with a graphic representation the structure of Lp (a)). As already shown in other works (Chiesa et al, J. Biol. Chem. 34 (1992) 24369, Lawn et al., Nature 360 (1992) 670, Breslow et al, Proc. Natl Acad. Sci USA 90 (1993) 8314) also succeeds here, a non-covalent one Binding of Apo (a) and Apo-B-100, or the entire LDL molecule to show. So is r-Apo (a) with at least one kringle, probably some, however, fixed to LDL and sticking out compact form in the surrounding space. This bond can with 50 mM 6-aminohexanoic acid can be canceled and is therefore not covalent. Rather, it seems to be of an ionic nature in principle be, because the affinity increases with increasing Salt concentration. A covalent bond, as in vivo is present as a disulfide bridge, but does not appear to be in vitro discontinued (Philips et al, l.c.).

Der repetitive Kringle 2 weist, wie die Kringle 10 bis 1, eine hohe Homologie zum Kringle IV des Plasminogens auf. Kringle 11 ist im Gegensatz zu den übrigen dem Kringle V des Plasminogens ähnlich (Eaton et al., l.c.). The repetitive Kringle 2, like the Kringle 10 to 1, has one high homology to Kringle IV of the plasminogen. Kringle 11 is in contrast to the rest of the Kringle V of the plasminogen similar (Eaton et al., l.c.).

Aus dieser Homologie läßt sich ableiten, daß freies Apo(a) bzw. Lp(a) ins fibrinolytische System eingreifen kann (Harpel et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 86 (1989) 3847-3851; Loscalzo et al, Ateriosclerosis 10 (1990) 240-245).From this homology it can be deduced that free Apo (a) or Lp (a) can intervene in the fibrinolytic system (Harpel et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 86: 3847-3851 (1989); Loscalzo et al, Ateriosclerosis 10 (1990) 240-245).

Obwohl die Plasmakonzentration von Lp(a) genetisch determiniert ist und sich somit weitgehend der medikamentösen und diätetischen Beeinflußbarkeit entzieht (Berg et al., Series Haematologica I (1968) 111), ist die Bestimmung der Plasmakonzentration trotzdem von großem diagnostischen Interesse, weil Konzentrationen von über 300 µg/ml ein erhöhtes Risiko für koronare Herzkrankheiten (KHK) darstellen (Berg et al, Clin Genetics 8(6) (1974) 230; Berg et al., Clin Genetics 16 (1979) 374; Kostner et al, Atherosklerosis 38 (1981) 151) und somit eine genauere Begutachtung der klassichen Risikofaktoren für KHK erfordern. Das Auftreten von freiem Apo (a) in Körperflüssigkeiten wäre ein überraschender Befund. Apo(a) ist über eine der mehrere Disulfidbrücken an Apo B 100 gebunden. Diese Disulfidbrücken werden aber nur in hepatischen Zellen geschlossen und definitionsgemäß (Alberts et al., The Cell (1983) 113-114) nicht extrazellulär gelöst).Although the plasma concentration of Lp (a) is genetic is determined and thus largely the drug and dietary influenceability (Berg et al., Series Haematologica I (1968) 111), is the determination of the Plasma concentration nevertheless of great diagnostic Interest because of concentrations above 300 µg / ml pose an increased risk of coronary heart disease (CHD) (Berg et al, Clin Genetics 8 (6) (1974) 230; Berg et al., Clin Genetics 16: 374 (1979); Kostner et al, Atherosclerosis 38 (1981) 151) and thus a more detailed assessment of the require classic risk factors for CHD. The appearance of free apo (a) in body fluids would be a surprising one Finding. Apo (a) is on via one of the several disulfide bridges Apo B 100 bound. These disulfide bridges are only in hepatic cells closed and by definition (Alberts et al., The Cell (1983) 113-114) not extracellularly resolved).

Nach bekannten Verfahren wird die Lp(a)-Bestimmung praktisch ausschließlich mittels immunologischer Methoden durchgeführt. Hierbei steht für die quantitative Messung ein Enzymimmunoassay (EIA), neben RIA, radialer Immundiffusion und Nephelometrie, im Vordergrund. Darüberhinaus kann ein qualitativer Nachweis von Lp(a) mit einem Immunblot (Western Blot) geführt werden. Hierbei wird zunächst das Antigen über eine Gelelektrophorese (z. B. mit 4 bis 15% Polyacrylamid auf Trägerfolie (Molinari et al., Lp(a) Phenotyping of the Phast System-Pharmacia; 55 th Annual Meeting of the European Atherosclerosis Society (EAS), Brugge, Belgium, May 17-19, 1990); oder mit 4% Polyacrylamid/PEG (modifiziert nach Righetti et al., Electrophoresis 13 (1992) 587) aufgetrennt. Anschließend werden die auf dem Gel befindlichen Proteine auf eine geeignete Membran (z. B. Nitrocellulose) transferiert (Towbin et al, Proc. Natl. Acad Sci USA 76 (1979) 4350). Die dort immobilisierten Proben können dann mit einem geeigneten Antikörper-Enzym-Konjugat spezifisch nachgewiesen werden. Prinzipiell eignen sich für die Detektion zwei im Lp(a) vorhandene Antigene, Apo(a) und Apo B-100. Die dabei resultierenden Festphasen-Testsysteme gestatten somit bei einer Kombination von anti-Apo(a)-Antikörpern im Konjugat und an der festen Phase die Bestimmung von Lp(a) und dem gleichzeitig vorhandenen freien Apo(a), nicht aber die Differenzierung zwischen beiden Apo(a)-Formen und die Bestimmung des freien Apo(a). Wird dagegen ein Apo B- Antikörper im Konjugat verwendet, ist nur Lp(a) nachweisbar. Eine umgekehrte Konstellation, d. h. anti-Apo B an der festen Phase und anti-Apo(a) im Konjugat, ist für den Lp(a)-Nachweis nur bedingt geeignet, da der Überschuß von Apo B im LDL zur Kompetition um die Bindung am Festphasenantikörper führt.According to known methods, the Lp (a) determination becomes practical carried out exclusively by means of immunological methods. Here stands for the quantitative measurement Enzyme immunoassay (EIA), in addition to RIA, radial immunodiffusion and Nephelometry, in the foreground. In addition, a qualitative detection of Lp (a) with an immunoblot (Western Blot). Here, the antigen is first over gel electrophoresis (e.g. with 4 to 15% polyacrylamide Carrier film (Molinari et al., Lp (a) Phenotyping of the Phast System pharmacia; 55th Annual Meeting of the European Atherosclerosis Society (EAS), Brugge, Belgium, May 17-19, 1990); or with 4% polyacrylamide / PEG (modified from Righetti et al., Electrophoresis 13 (1992) 587). The proteins on the gel are then exposed a suitable membrane (e.g. nitrocellulose) is transferred (Towbin et al, Proc. Natl. Acad Sci USA 76 (1979) 4350). The Samples immobilized there can then be used with a suitable Antibody-enzyme conjugate can be specifically detected. In principle, two are suitable for detection in Lp (a) existing antigens, Apo (a) and Apo B-100. The one there resulting solid-phase test systems thus allow a combination of anti-Apo (a) antibodies in the conjugate and on the solid phase the determination of Lp (a) and the free Apo (a) present at the same time, but not the Differentiation between both Apo (a) forms and the Determination of the free apo (a). However, if an Apo B- Antibody used in the conjugate, only Lp (a) is detectable. An opposite constellation, i.e. H. anti-Apo B on the fixed Phase and anti-apo (a) in the conjugate, is for the Lp (a) detection only suitable to a limited extent, since the excess of Apo B in the LDL for Competition for binding to the solid phase antibody leads.

Einphasensysteme wie die Nephelometrie oder Turbidimetrie führen durch den Zusatz von anti-Apo(a)-Antikörpern zur Bildung von meßbaren, lichtstreuenden oder lichttrübenden Immunkomplexen und könnten somit auch nicht zwischen freiem und an Lp(a) gebundenem Apo(a) unterscheiden.Single-phase systems such as nephelometry or turbidimetry lead to the addition of anti-Apo (a) antibodies Formation of measurable, light scattering or light opacifying Immune complexes and therefore could not be between free and distinguish Apo (a) bound to Lp (a).

Der Nachweis von freiem Apo (a) wurde bislang noch nicht versucht.The detection of free Apo (a) has not been done yet tries.

Aufgabenstellung der vorliegenden Erfindung ist deshalb die Bereitstellung eines Verfahrens zur Bestimmung von freiem Apoprotein (a) in einer menschlichen Körperflüssigkeit.The object of the present invention is therefore Providing a method for determining free Apoprotein (a) in a human body fluid.

Diese Aufgabenstellung wird mit dem Gegenstand der vorliegenden Erfindung gelöst.This task is the subject of present invention solved.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Bestimmung von freiem Apo(a) in einer menschlichen Körperflüssigkeit, die freies Apo(a) und ein an Lipide gebundenes Apo(a) enthält, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man das gebundene Apo(a) abtrennt und das freie Apo(a) dann mittels einer dafür an sich bekannten Methode bestimmt.The invention relates to a method for determining free apo (a) in a human body fluid that contains free apo (a) and a lipid-bound apo (a) which characterized in that the bound apo (a) separates and the free apo (a) by means of a for itself known method.

Zweckmäßige Ausgestaltungen dieses Verfahrens sind Gegenstand der Ansprüche 2 bis 6.Appropriate embodiments of this method are the subject of claims 2 to 6.

In dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Bestimmung von freiem Apo(a) in einer menschlichen Körperflüssigkeit wird das an Lipide gebundene Apo(a) nach an sich bekannten Methoden, die auf Unterschieden in den physikalischen, physikochemischen und/oder chemischen Eigenschaften des an Lipide gebundenen Apo(a) gegenüber freiem Apo(a) beruhen, abgetrennt, und vorzugsweise nach einer der folgenden Methoden: durch Gelchromatographie (aufgrund des höheren Molekulargewichts des an Lipide gebundenen Apo(a)), durch Bindung an einen Affinitätsträger (aufgrund der von freiem Apo(a) verschiedenen Bindungsfähigkeit von an Lipide gebundenen Apo(a) an einem Affinitätsträger), und z. B. nach an sich bekannten Affinitätschromatographieverfahren.In the method according to the invention for determining free Apo (a) in a human body fluid turns this on Lipid-bound apo (a) according to methods known per se, which on differences in physical, physicochemical and / or chemical properties of the lipid-bound Apo (a) based on free Apo (a), separated, and preferably by one of the following methods: by Gel chromatography (due to the higher molecular weight of the Apo (a)) bound to lipids by binding to a Affinity carrier (due to the different from free Apo (a) Binding ability of lipids bound Apo (a) to one Affinity bearer), and z. B. according to known Affinity chromatography method.

Als Affinitätsträger werden in diesen Verfahren insbesondere immobilisiertes Lysin, immobilisierte Proteine mit entständigem Lysin, immobilisierte, z. B. chemisch an einen Träger gebundene Aminocarbonsäuren, insbesondere ε- Aminocarbonsäuren, Amine und/oder Heparin verwendet. In these processes, particular affinity carriers are used immobilized lysine, immobilized proteins with Entligtes lysine, immobilized, e.g. B. chemically to one Supported amino carboxylic acids, especially ε- Aminocarboxylic acids, amines and / or heparin are used.

Zur Abtrennung von an Lipide gebundenem Apo(a) kann es auch zweckmäßig sein, ein oder mehrere gleiche oder verschiedene Trennmethoden, insbesondere eine oder mehrere der vorstehend als bevorzugt genannten Trennmethoden, miteinander zu kombinieren.It can also be used to separate Apo (a) bound to lipids be appropriate, one or more of the same or different Separation methods, especially one or more of the above separation methods mentioned as preferred combine.

Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Verfahren zur Bestimmung von freiem Apo(a) in einer menschlichen Körperflüssigkeit, die freies Apo(a) und ein an Lipide gebundenes Apo(a) enthält, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man das freie Apo(a) in einer Immunreaktion mit Antikörpern bestimmt, die gegen das freie, aber nicht gegen das gebundene Apo(a) gerichtet sind.Another object of the present invention is a Method for the determination of free Apo (a) in one human body fluid, the free apo (a) and an at Contains lipid-bound apo (a), which is characterized is that the free Apo (a) in an immune reaction with Antibodies determined against the free but not against the bound Apo (a) are directed.

Zweckmäßige Ausgestaltungen dieses Verfahrens sind Gegenstand der Ansprüche 8 und 9.Appropriate embodiments of this method are the subject of claims 8 and 9.

Die Immunreaktion mit den Antikörpern kann dabei auf eine für derartige Immunreaktionen an sich bekannte Weise durchgeführt werden. Vorzugsweise wird die Immunreaktion mittels eines Immunoassays unter Verwendung von geeigneten markierten Antikörpern durchgeführt.The immune reaction with the antibodies can be one for such immune reactions are carried out in a manner known per se will. The immune reaction is preferably carried out by means of a Immunoassays using appropriate labeled Antibodies performed.

Die Antikörper sind vorzugsweise durch Enzyme, Haptene, Radionuklide, Fluorogenen oder Luminogene markiert.The antibodies are preferably by enzymes, haptens, Radionuclides, fluorogens or luminogens marked.

Je nach der verwendeten Markierung der Antikörper kann der Immunoassay deshalb z. B. nach einem allgemein üblichen Enzymimmunoassay (EIA), insbesondere ELISA, oder einem Radioimmunoassay (RIA) durchgeführt werden.Depending on the labeling of the antibodies used, the Immunoassay therefore z. B. according to a common practice Enzyme immunoassay (EIA), especially ELISA, or a Radioimmunoassay (RIA) can be performed.

Als immunologische Technik zur Durchführung der erfindungsgemäßen Immunreaktion mit Antikörpern hat sich insbesondere auch die Methode des Immun-Blot (Western Blot) erwiesen, nach der Proteine aus einem Elektrophorese-Gel, z. B. nach der Auftrennung in einer Polyacrylamid-Gel- Elektrophorese, auf eine immobilisierende Matrix (z. B. Nitrocellulose-Filter) übertragen werden, was in erster Linie durch Elektrotransfer erfolgt, und anschließend durch eine immunologische Reaktion (z. B. durch radioaktiv oder Enzym markierte Antikörper) nachgewiesen werden.As an immunological technique for performing the immune reaction according to the invention with antibodies has especially the method of immunoblot (Western blot) proved after the proteins from an electrophoresis gel, e.g. B. after separation in a polyacrylamide gel Electrophoresis, on an immobilizing matrix (e.g. Nitrocellulose filters) are transmitted in the first place done by electrical transfer, and then by a immunological reaction (e.g. by radioactive or enzyme labeled antibodies) can be detected.

Die erfindungsgemäßen Verfahren zur Bestimmung von freiem Apo(a) eignen sich zur Bestimmung von rekombinantem, modifiziertem und/oder synthetischen freiem Apo(a), sowie auch zur Bestimmung dieser in Form von Aggregaten vorliegenden Apo(a)′s.The method according to the invention for determining free Apo (a) are suitable for the determination of recombinant, modified and / or synthetic free Apo (a), as well to determine this in the form of aggregates Apo (a) ′ s.

Die erfindungsgemäßen Verfahren, mit denen freies, in einer menschlichen Körperflüssigkeit vorhandenes Apo(a) bestimmt werden kann, eignet sich zur Verwendung für eine aussagekräftige Bestimmung von Lipoproteinstoffwechselstörungen und Beurteilung des bei einem Patienten vorliegenden atherogenen Risikos. Es ist anzunehmen, daß freies Apo(a) in die Pathogenex der Atherosklerose eingreift, was die Diskrepanz zwischen dem gebundenen Lp(a)- Spiegel und dem relativen Risiko der Sklerosierung arterieller Gefäße erklärt. Auf der Grundlage der Bestimmung des in einer menschlichen Körperflüssigkeit vorhandenen freien Apo(a) ist gegenüber bekannten Bestimmungsverfahren eine aussagekräftigere Beurteilung möglich.The inventive methods with which free, in a human body fluid present Apo (a) determined can be used for a meaningful determination of Lipoprotein metabolic disorders and assessment of one Patients present atherogenic risk. It can be assumed, that free apo (a) in the pathogenex of atherosclerosis intervenes what the discrepancy between the bound Lp (a) - Level and the relative risk of arterial sclerotherapy Vessels explained. Based on the determination of the in a human body fluid is available free Apo (a) compared to known determination methods More meaningful assessment possible.

Weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Bestimmung von Lipoproteinstoffwechselstörungen bzw. des bei einem Patienten vorliegenden artherogenen Risikos, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man das erfindungsgemäße Verfahren zur Bestimmung von freiem Apo(a) in einer dem Patienten entnommenen Körperflüssigkeit vornimmt.Another object of the invention is a method for Determination of lipoprotein metabolic disorders or at a patient's existing artherogenic risk, which is characterized in that the inventive method for Determination of free Apo (a) in a patient withdrawn body fluid.

Als Körperflüssigkeit wird vorzugsweise eine Blut-, Serum- oder Plasmaprobe verwendet. A blood, serum, or plasma sample used.

Die nachfolgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern, ohne den Rahmen der Erfindung auf diese Ausführungsformen zu beschränken.The following examples are intended to illustrate the invention explain without departing from the scope of the invention on this Limit embodiments.

Examples

Nachfolgend werden bevorzugte Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Verfahren die auch den Beispielen zugrundeliegen, für die Abtrennung von an Lipide gebundenem Apo(a) sowie für die Bestimmung des freien Apo(a), und bevorzugte Kombinationen dieser Verfahrensstufen, beschrieben.Preferred embodiments of the method according to the invention also the examples underlying, for the separation of bound to lipids Apo (a) and for the determination of the free Apo (a), and preferred combinations of these process stages described.

Zum Nachweis von freiem Apo(a) wird das im Lp(a) gebundene Apo(a) abgetrennt. Dies wird vorzugsweise über Festphasentechniken (Bindung an einem Antikörper, der nur freies Apo(a) erkennt) oder aber durch Trennung auf der Basis des verschiedenen Molekulargewichts, der verschiedenen Ladung und anderer physikalisch-chemischer Eigenschaften vorgenommen.To detect free Apo (a), the one bound in Lp (a) is used Apo (a) separated. This is preferably about Solid phase techniques (binding to an antibody that is only free apo (a) recognizes) or by separation on the basis of the different molecular weight, the different charge and other physico-chemical properties.

Zur Abtrennung auf der Basis verschiedener Ladungen eignen sich insbesondere Elektrophoresetechniken, nach denen, wie z. B. bei der SDS-Elektrophorese, nach Molekulargewicht, oder, wie z. B. bei der Agar-Gelelektrophorese, nach elektrophoretischer Mobilität getrennt werden kann.Suitable for separation based on different loads particular electrophoresis techniques, according to how e.g. B. in SDS electrophoresis, by molecular weight, or, such as B. in agar gel electrophoresis, after electrophoretic mobility can be separated.

In einer zweiten Schritt wird dann das freie Apo(a) nachweisbar gemacht. Dies geschieht insbesondere mittels geeigneter immunologischer Methoden. Mit einem modifizierten Western Blot (Towbin et al, l.c.) wird z. B. die Immobilisierung aller Proteine auf einer Nitrocellulosemembran durchgeführt; dann kann z. B. ein Antikörper verwendet werden, der sowohl das freie als auch das im Lp(a) gebundene Apo(a) erkennt. Ist dieser Antikörper direkt markiert (z. B. mit einem Enzym), so können durch eine Farbreaktion die Stellen auf der Membran sichtbar gemacht werden, an denen Apo(a) als Antigen erkannt wird. Durch den Vergleich mit der Reaktion mit einem anti-Apo B-Antikörper (die entweder ebenfalls direkt, aber mit einem anderen Markerenzym markiert durchgeführt werden kann, oder auch auf einem parallelen Blotstreifen) läßt sich dann das freie Apo(a) feststellen und, wenn erwünscht, auch quantitativ erfassen.In a second step the free Apo (a) made verifiable. This is done in particular by means of suitable immunological methods. With a modified Western blot (Towbin et al, l.c.) is used e.g. B. the Immobilization of all proteins on a nitrocellulose membrane carried out; then z. B. an antibody can be used which contains both the free and the apo (a) bound in Lp (a) recognizes. Is this antibody directly labeled (e.g. with a Enzyme), the sites on the Membrane can be made visible, on which Apo (a) acts as an antigen is recognized. By comparing it with the reaction with a anti-Apo B antibodies (which are also either direct, but with another marker enzyme can be carried out labeled, or on a parallel blot strip) determine the free apo (a) and, if desired, also quantify.

Zur Abtrennung der Lipoproteine aus dem Plasma ist ins besondere eine Lipidelektrophorese mit Lipidophor® (Immuno AG; (vgl. Seidel et al., Clin. Chem. Acta 19/7 (1973) 737-739; Hieland et al., Clin. Chem. Acta 19/10 (1973) 1139-1141; Heck et al., Clin. Chem.-Acta 23/7 (1977) 1296-1300; Wieland et al.; Innere Medizin (1978) 290-300)) geeignet. Nach dieser Methode wandert das Lp(a) mit dem LDL. Es hat sich herausge stellt, daß freies Apo(a) eine höhere elektrophoretische Immobilität besitzt und deshalb vor dem Lp(a) erscheint. Der Nachweis beider Apo(a)-Formen ist nach einem (elektropho retischen) Transfer auf eine proteinbindende Membran, die vorzugsweise eine Nitrocellulose-Membran ist, mit einem Enzym markierten Anti-Apo(a)-Antikörper möglich. Dieser setzt an den Stellen auf der Membran, wo das Antigen erkannt wurde, ein wasserunlösliches Substrat um. Im Kontrollblot wird das Apo B analog mit einem anti-Apo B-Antikörper dargestellt. Der Ver gleich beider Blots zeigt einen Bereich mit beiden darstell baren Proteinen und einen weiteren, an dem nur eine Reaktion des anti-Apo(a)-Antikörpers auftrat.To separate the lipoproteins from the plasma is ins especially lipid electrophoresis with Lipidophor® (Immuno AG; (see Seidel et al., Clin. Chem. Acta 19/7 (1973) 737-739; Hieland et al., Clin. Chem. Acta 19/10 (1973) 1139-1141; Rear et al., Clin. Chem. Acta 23/7 (1977) 1296-1300; Wieland et al .; Internal medicine (1978) 290-300)). After this Method migrates the Lp (a) with the LDL. It turned out represents that free Apo (a) is a higher electrophoretic Has immobility and therefore appears before Lp (a). Of the Detection of both Apo (a) forms is based on an (electropho retic) transfer to a protein binding membrane which is preferably a nitrocellulose membrane with an enzyme labeled anti-apo (a) antibody possible. This puts on the Set on the membrane where the antigen was recognized water-insoluble substrate. The Apo B represented analogously with an anti-Apo B antibody. The Ver both blots show an area with both represent proteins and another that only has one reaction of the anti-Apo (a) antibody.

example 1 Performance of lipid electrophoresis

100 µl Plasma werden mit der gleichen Menge Agarmedium gemischt und 10 µl des Gemisches auf das Gel aufgetragen. Anschließend wird die Auftragsstelle mit einem Tropfen Agar verschlossen. Nach Einlegen der Gele in die mit Elektropho resepuffer (62,1% 5,5′Diethylbarbitursäure Natriumsalz; 29,2 % Natriumacetat, 8,7% Citrat, pH 8,6) gefüllte Elektropho resekammer läuft die Trennung 180 min mit 15 mA const./Gel. Je Probe müssen zwei Auftragsstellen befüllt werden. 100 µl plasma are mixed with the same amount of agar medium mixed and 10 µl of the mixture applied to the gel. Then the application point is covered with a drop of agar locked. After inserting the gels in the electrophoresis Resepuffer (62.1% 5.5'-diethylbarbituric acid sodium salt; 29.2 % Sodium acetate, 8.7% citrate, pH 8.6) filled electropho Resekammer the separation runs 180 min with 15 mA const./gel. Each Sample must be filled at two order points.

transfer

Die in Blottingpuffer (25 mM Tris/HCl, 0,2 mM Glycin, 20% v/v Methanol) benetzte Nitrocellulosemembran (Schleicher und Schuell) wird auf das Gel gelegt. Der Transfer erfolgt trocken bei 70°C innerhalb einer Stunde.The in blotting buffer (25 mM Tris / HCl, 0.2 mM glycine, 20% v / v Methanol) wetted nitrocellulose membrane (Schleicher and Schuell) is placed on the gel. The transfer is dry at 70 ° C within an hour.

development

Die vom Gel befreite Membran wird 1 h in 3% TBS/BSA blockiert und nach viermaligem Waschen in 1% TBS/BSA mit einem polyklonalen Kaninchen Anti-Apo(a) - bzw. Anti-Apo B-100- Antikörper über Nacht inkubiert. Nach viermaligem Waschen mit 1% TBS/BSA inkubiert man mit mit Peroxidase (POD)-markiertem Maus-anti-Kaninchen Antikörper. Die Entwicklung des Blots erfolgt mit Diaminobenzidin. Der Vergleich der Apo(a) und Apo- B-100 Blots zeigt das freie Apo(a) an.The membrane freed from the gel is blocked for 1 h in 3% TBS / BSA and after washing four times in 1% TBS / BSA with a polyclonal rabbit anti-apo (a) - or anti-apo B-100- Antibodies incubated overnight. After washing four times 1% TBS / BSA is incubated with labeled with peroxidase (POD) Mouse anti-rabbit antibody. The development of the blot is done with diaminobenzidine. The comparison of the Apo (a) and Apo B-100 blots indicate the free apo (a).

Results

Der Western Blot der Lipidelektrophorese zeigt für einen KHK- Patienten (Nr. 8) eindeutig zwei und für einen gesunden Plasmaspender (Q 10027) nur eine mit dem anti-Apo(a) darstellbare Bande. Mit dem anti-Apo B können die LDL und das Lp(a) angefärbt werden. Dabei entspricht die untere Anfärbung mit anti-Apo(a) und anti-Apo B dem Lp(a), die obere Anfärbung dagegen dem freien Apo(a). Das Blotmuster des Plasmaspenders (Q10027) weist in der Region des LDL (anfärbar mit anti-Apo B) keine Apo(a)-Bande auf, woraus zu schließen ist, daß in Lipidophor® das freie Apo(a) etwa die gleiche elektrophoretische Mobilität wie LDL besitzt (Fig. 1). Die Darstellung der beiden Lipoproteine nach dem Western Blot aus Lipidophor® unter reduzierenden Bedingungen zeigt, daß die Doppelbandigkeit (ohne β-Mercaptoethanol) aufgehoben wird. Dabei bleiben die LDL (Anfärbung mit anti-ApoB) unbeeinflußt. Auch dies kann als Nachweis für freies Apo(a) gewertet werden (Fig. 2). The Western blot of lipid electrophoresis shows for a CHD Patients (No. 8) clearly two and for a healthy one Plasma dispenser (Q 10027) only one with the anti-apo (a) representable gang. With the anti-Apo B, the LDL and that Lp (a) are stained. The lower staining corresponds with anti-Apo (a) and anti-Apo B the Lp (a), the upper staining against the free Apo (a). The blot pattern of the plasma dispenser (Q10027) shows in the region of the LDL (can be stained with anti-Apo B) no Apo (a) band, from which it can be concluded that in Lipidophor® the free Apo (a) about the same has electrophoretic mobility such as LDL (Fig. 1). The Representation of the two lipoproteins according to the Western blot Lipidophor® under reducing conditions shows that the Double banding (without β-mercaptoethanol) is lifted. The LDL (staining with anti-ApoB) remains unaffected. This can also be seen as evidence of free apo (a) (Fig. 2).

Example 2

Um freies Apo(a) nachweisen zu können, wird das im Lp(a) gebundene Apo(a) abgetrennt. Dies kann durch Trennung nach Molekulargewicht vorgenommen werden. Hierfür eignen sich insbesondere Elektrophoresetechniken wie die SDS- Elektrophorese. Auch hier wird nach der Trennung das Lipoprotein durch Transfer auf eine proteinbindende Membran immobilisiert um dann wiederum immunologisch nachgewiesen zu werden.In order to be able to demonstrate free Apo (a), this is done in Lp (a) bound apo (a) separated. This can be done by separation Molecular weight can be made. Are suitable for this especially electrophoresis techniques such as SDS Electrophoresis. Here too, after the separation Lipoprotein by transfer to a protein binding membrane immobilized and then immunologically proven will.

Die SDS-Elektrophorese ist als Methode geeignet, um Lipoproteine aus dem Plasma nach Molekulargewicht aufzutrennen. Dabei wandert das Lp(a) mit LDL. Freies Apo(a) besitzt eine höhere elektrophoretische Mobilität und ist somit vor Lp(a) zu finden. Der Nachweis beider Apo(a)-Formen ist nach einem (elektrophoretischen) Transfer auf eine proteinbildende (Nitrocellulose)-Membran mit einem Enzym markierten anti-Apo(a)-Antikörper möglich. Dieser setzt an den Stellen auf der Membran, wo das Antigen erkannt wurde, ein wasserunlösliches Substrat um. Im Kontrollblot wird das ApoB analog mit einem anti-Apo B-Antikörper dargestellt. Der Vergleich beider Blots zeigt einen Bereich mit beiden darstellbaren Proteinen und einen weiteren, an dem nur der anti-Apo(a)-Antikörper reagiert hat.SDS electrophoresis is suitable as a method to Lipoproteins from plasma by molecular weight to separate. The Lp (a) migrates with LDL. Free Apo (a) has a higher electrophoretic mobility and is therefore before Lp (a). The proof of both Apo (a) forms is after an (electrophoretic) transfer to a protein-forming (nitrocellulose) membrane with an enzyme labeled anti-apo (a) antibody possible. This puts on the Set on the membrane where the antigen was recognized water-insoluble substrate. The ApoB represented analogously with an anti-Apo B antibody. Of the Comparison of both blots shows an area with both representable proteins and another on which only the anti-Apo (a) antibody has reacted.

Execution of electrophoresis

Die Trennung der Proben erfolgt in einem Polyacrylamidgel (T 4,2% , C 0,8%) dem Agaroselösung (60%, 1,22 g in 100 ml) zugesetzt ist. 750 mg Agarose werden in 25 ml Trenngelpuffer (0,4% SDS, 1,5 mol/l Tris/HCl, Ph 8,8) und 62,5 ml Aqua dest. im Wasserbad (kochend) geschmolzen und nach Zugabe von 12,5 ml monomerer Stammlösung (Acrylamid 30%, N,N- Methylenbisacrylamid 0,8%) auf 60 C abgekühlt. Nach Zugabe von 150 µl TEMED und 2,5 ml einer 10%igen Ammoniumpersulfatlösung wird die Lösung blasenfrei zwischen zwei vorgewärmte Borsilikatglasplatten gegeben. Die Polymerisation findet innerhalb von 5-60 min statt. Zur Herstellung des Sammelgels werden 0,5 ml monomere Stammlösung, 1,25 ml Sammelgelpuffer (0,4% SDS, 0,5 mol/l Tris/HCl, pH 6,8), 3,25 ml Aqua dest., 12 µl TEMED und 150 µl einer 10 %igen Ammoniumpersulfatlösung gemischt, um damit das Trenngel zu überschichten. Das maximale Probenvolumen beträgt bei einer Geldicke von 2,25 mm ca. 100 µl. Die Elektrophorese findet ca. 5 h unter 25 mA const./Gel in einem 25 mmol/l Tris/HCl, 0,2 mol/l Glycin, 0,1% SDS, pH 8,0 Elektrophoresepuffer statt. Alternativ zu diesen SDS-PAGE können die Lipidophorgele auch in einem modifizierten SDS-PAGE (modifiziert nach Righett et al., Electrophoresis 13 (1992) 587) getrennt werden.The samples are separated in a polyacrylamide gel (T 4.2%, C 0.8%) the agarose solution (60%, 1.22 g in 100 ml) is clogged. 750 mg agarose are in 25 ml separating gel buffer (0.4% SDS, 1.5 mol / l Tris / HCl, Ph 8.8) and 62.5 ml aqua dest. melted in a water bath (boiling) and after adding 12.5 ml monomeric stock solution (acrylamide 30%, N, N- Methylene bisacrylamide 0.8%) cooled to 60 C. After encore of 150 µl TEMED and 2.5 ml of a 10% Ammonium persulfate solution will bubble free between given two preheated borosilicate glass plates. The Polymerization takes place within 5-60 min. For 0.5 ml of monomeric stock solution, 1.25 ml stacking gel buffer (0.4% SDS, 0.5 mol / l Tris / HCl, pH 6.8), 3.25 ml aqua dest., 12 µl TEMED and 150 µl 10 % ammonium persulfate solution mixed to make the separating gel to overlay. The maximum sample volume is one Gel thickness of 2.25 mm approx. 100 µl. Electrophoresis takes place approx. 5 h under 25 mA const./gel in a 25 mmol / l Tris / HCl, 0.2 mol / l glycine, 0.1% SDS, pH 8.0 electrophoresis buffer instead. As an alternative to these SDS-PAGE, the lipidophore gels can also in a modified SDS-PAGE (modified according to Righett et al., Electrophoresis 13 (1992) 587).

transfer

Der Transfer erfolgt hier vorzugsweise im Tankblot (25 mmol Tris/HCl, pH 8,3, 20% v/v Methanol, 16 h, 15°C). Die in Blottingpuffer benetzte Nitrocellulosemembran (Schleicher und Schuell) wird auf das Gel gelegt. Der Transfer erfolgt in anodischer Richtung.The transfer is preferably carried out in a tank blot (25 mmol Tris / HCl, pH 8.3, 20% v / v methanol, 16 h, 15 ° C). In the Blotting buffer wetted nitrocellulose membrane (Schleicher and Schuell) is placed on the gel. The transfer takes place in anodic direction.

development

Die vom Gel befreite Membran wird 1 h in 3% TBS/BSA blockiert und nach viermaligem Waschen in 1% TBS/BSA mit einem polyklonalen Kaninchen Anti-Apo(a)- bzw. Anti-Apo B-100- Antikörper über Nacht inkubiert. Nach viermaligem Waschen mit 1% TBS/BSA inkubiert man mit mit Peroxidase (POD) markiertem Maus-anti-Kaninchen Antikörper. Die Entwicklung des Blots erfolgt mit Diaminobenzidin. Der Vergleich der Apo(a) und Apo B-100 Blots zeigt das freie Apo(a) an.The membrane freed from the gel is 1 h in 3% TBS / BSA blocked and after washing four times in 1% TBS / BSA with a polyclonal rabbit Anti-Apo (a) - or Anti-Apo B-100- Antibodies incubated overnight. After washing four times 1% TBS / BSA is incubated with labeled with peroxidase (POD) Mouse anti-rabbit antibody. The development of the blot is done with diaminobenzidine. The comparison of the Apo (a) and Apo B-100 blots indicate the free apo (a).

Results

Die hochmolekulare antigene Bande, die mit dem anti-Apo(a) und dem anti-Apo B-Antikörper erhalten wird, entspricht dem Lp(a). Beide Proteine sind über eine Disulfidbrücke verbunden, die sich unter reduzierenden Bedingungen mit β-Mercaptoethanol spalten läßt. Auch mit dieser Methode wird mit dem anti- Apo(a)-Antikörper wieder unterhalb des Lp(a) eine weitere antigene Bande sichtbar. Diese entspricht dem im Plasma vorhandenen freien Apo(a).The high molecular antigenic band associated with the anti-apo (a) and anti-Apo B antibody is obtained corresponds to Lp (a). Both proteins are connected via a disulfide bridge, the under reducing conditions with β-mercaptoethanol can split. With this method too, the anti Apo (a) antibody again below Lp (a) another antigenic band visible. This corresponds to that in the plasma existing free apo (a).

Example 3

Um freies Apo(a) nachweisen zu können, lassen sich auch die unter Beispiel 1 und Beispiel 2 beschriebenen Techniken zu einer zweidimensionalen Elektrophorese kombinieren. Dabei wird in der ersten Dimension mit Lipidophor® nach elektrophoretischer Mobilität getrennt und in der zweiten Dimension nach Molekulargewicht. Der Nachweis des freien Apo(a) erfolgt wieder wie in den Beispielen 1 und 2 beschrieben.In order to be able to demonstrate free Apo (a), the techniques described in Example 1 and Example 2 a two-dimensional electrophoresis. Doing so in the first dimension with Lipidophor® electrophoretic mobility separately and in the second Dimension by molecular weight. Evidence of free Apo (a) takes place again as in Examples 1 and 2 described.

Lipid electrophoresis with Lipidophor® in combination with SDS PAGE

Die Lipidelektrophorese mit Lipidophor® wird wie im Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Für die SDS-Elektrophorese werden die Gele in Probenpuffer durch 2×5 minütiges Einlegen umgepuffert. Nachdem überschüssige Flüssigkeit entfernt ist, können die Gele auf den wie beschrieben vorbereiteten SDS- Gelen im Sammelgel einpolymerisiert werden. Alternativ zu der vorstehend beschriebenen SDS-PAGE können die Lipidophorgele auch in einem modifizierten SDS-PAGE nach Righetti (modifiziert nach Righetti et al., Electrophoresis 13 (1992) 587) getrennt werden. Hier wird dann statt der Agarose 1% PEG 20000 zur Stammlösung zugegeben. Gleichermaßen wird mit dem Sammelgel verfahren. Die Elektrophorese sowie der Transfer und der Nachweis des freien Apo(a) erfolgen wie vorstehend beschrieben. Lipid electrophoresis with Lipidophor® is the same as in Example 1 described. For SDS electrophoresis the gels in sample buffer by 2 × 5 minutes buffered. After excess liquid is removed, can the gels on the SDS prepared as described Gels are polymerized in the bulk gel. Alternatively to that SDS-PAGE described above can use the lipidophore gels also in a modified SDS-PAGE according to Righetti (modified from Righetti et al., Electrophoresis 13 (1992) 587) can be separated. Here then instead of the agarose 1% PEG 20000 added to the stock solution. The same applies to the collective gel. The Electrophoresis as well as the transfer and detection of free Apo (a) are carried out as described above.

development

Die vom Gel befreite Membran wird 1 h in 3% TBS/BSA blockiert und nach viermaligem Waschen in 1% TBS/BSA mit einem polyklonalen POD-markierten Kaninchen Anti-Apo(a)- bzw. AP- markierten Anti-Apo B-100-Antikörper über Nacht inkubiert. Nach viermaligem Waschen mit 1% TBS/BSA erfolgt die Anfärbung des AP-markierten Antikörpers mit Neufuchsin oder Nitrotetrazoliumblau (0,05% v/v 2 mol/l MgCl2, 0,001% v/v Nitrotetrazoliumblau, 0,002% v/v 5-Bromo-4-chloro-3- indoxylphosphat Na-Salz; (BCIP, Merck AG, Darmstadt, BRD) in 200 mmol/l 1% TBS/BSA oder 0,04% v/v Levamisol, 0,02% v/v NaNO2, 0,05% v/v Naphthol-As-Bis-Triphosphat in DMF, 0,005% v/v Neufuchsin in 0,1 mol/l Tris/HCl pH 8,8). Nachfolgend kann dann der POD-Anteil wie oben beschrieben nachgewiesen werden. Diese Technik gestattet den Nachweis beider Proteine in einem Schritt. Freies Apo(a) ist dort nur mit der POD-Reaktion nachzuweisen. Doppelfärbungen an einem Spot weisen auf das Vorhandensein beider Proteine (Apo(a) und Apo B) hin.The membrane freed from the gel is blocked for 1 h in 3% TBS / BSA and after washing four times in 1% TBS / BSA with a polyclonal POD-labeled rabbit anti-apo (a) - or AP- labeled anti-Apo B-100 antibody incubated overnight. Staining is carried out after four washes with 1% TBS / BSA of the AP-labeled antibody with Neufuchsin or Nitrotetrazolium blue (0.05% v / v 2 mol / l MgCl2, 0.001% v / v Nitrotetrazolium blue, 0.002% v / v 5-bromo-4-chloro-3- indoxyl phosphate Na salt; (BCIP, Merck AG, Darmstadt, FRG) in 200 mmol / l 1% TBS / BSA or 0.04% v / v levamisole, 0.02% v / v NaNO2, 0.05% v / v naphthol as-bis-triphosphate in DMF, 0.005% v / v Neufuchsin in 0.1 mol / l Tris / HCl pH 8.8). Below can then the POD content can be detected as described above. This technique allows the detection of both proteins in one Step. Free Apo (a) is only there with the POD reaction to prove. Double colorings on a spot indicate that Presence of both proteins (Apo (a) and Apo B).

Results

Nach der zweidimensionalen Elektrophorese werden mit dem anti- Apo(a)-Antikörper drei Spots angefärbt. Dabei entsprechen die anodisch (1. Dimension = Lipidophor®) gewanderten, immunologisch angezeigten Proteine dem Lp(a) mit dem höchsten Molekulargewicht, und die mit geringerem Molekulargewicht als deutliche Doppelbande den beiden Isotypen des freien Apo(a). Die kathodisch anfärbbaren Apo(a)-Spots verfügen über kein darüber liegendes Lp(a), so daß diese eindeutig als freies Apo(a) identifiziert werden können.After two-dimensional electrophoresis, the anti- Apo (a) antibody stained three spots. The correspond to migrated anodically (1st dimension = Lipidophor®), immunologically indicated proteins the Lp (a) with the highest Molecular weight, and those with lower molecular weight than clear double band between the two isotypes of free Apo (a). The apo (a) spots, which can be colored cathodically, have none Lp (a) lying above, so that these are clearly as free Apo (a) can be identified.

Hier kann festgestellt werden, daß das Apo(a) einerseits frei im Plasma vorkommt, andererseits aber auch eine Form existiert, die dem Apo(a) zusammen mit dem Apo B (ohne kovalente Bindung an letzteres) die gleiche elektrophoretische Mobilität in Lipidophor® verleiht. Durch Reduktion der Proteine nach der Trennung in Lipidophor® (Fig. 3) verschwindet der Lp(a)-Spot und es wird ausschließlich Apo(a) und Apo B in den für das jeweilige Molekulargewicht typischen Spots sichtbar (Fig. 4).Here it can be stated that Apo (a) is free on the one hand occurs in the plasma, but also a form exists that the Apo (a) together with the Apo B (without covalent bond to the latter) the same electrophoretic Gives mobility in Lipidophor®. By reducing the Proteins after separation in Lipidophor® (Fig. 3) the Lp (a) spot disappears and only Apo (a) and Apo B in the typical for the respective molecular weight Spots visible (Fig. 4).

Example 4

Um freies Apo(a) nachweisen zu können, wird das im Lp(a) gebundene Apo(a) abgetrennt. Dies erfolgt hier durch die Trennung nach Molekulargewicht mittels Gelfiltration. Das freie Apo(a) besitzt ein geringeres Molekulargewicht und eluiert somit unter geeigneten Chromatographiebedingungen (Superdex® 200 XK, Flußrate 7,5 ml/cm2/h (200 mmol/l Tris/HCl, pH 8,0) später als das im Lp(a) befindliche Apo(a). Der Nachweis ist mit geeigneten Enzym- oder Radioimmunoassays möglich, wobei sowohl an der festen Phase als auch im Konjugat ein anti-Apo(a)-Antikörper (IMMUNOZYM® Lp(a) der Fa. Immuno) verwendet werden kann.In order to be able to demonstrate free Apo (a), this is done in Lp (a) bound apo (a) separated. This is done here by the Separation by molecular weight using gel filtration. The free Apo (a) has a lower molecular weight and thus elutes under suitable chromatography conditions (Superdex® 200 XK, flow rate 7.5 ml / cm2 / h (200 mmol / l Tris / HCl, pH 8.0) later than the apo (a) in Lp (a). Of the Detection is possible with suitable enzyme or radioimmunoassays possible, both on the solid phase and in the conjugate an anti-apo (a) antibody (IMMUNOZYM® Lp (a) from Immuno) can be used.

Implementation of gel filtration

Die Gelfiltration der Proben erfolgt über Superdex® 200 XK (Pharmacia, Uppsala, Schweden). Entsprechend der Säulengröße (26/70) werden ca. 2,5 ml Probe aufgetragen. Die Trennung erfolgte mit einer Flußrate von 7,5 ml/cm²/h in einem 200 mmol/l Tris/HCl Puffer, pH 8,0.The gel filtration of the samples takes place via Superdex® 200 XK (Pharmacia, Uppsala, Sweden). According to the column size (26/70) approx. 2.5 ml sample are applied. The separation was carried out with a flow rate of 7.5 ml / cm² / h in a 200 mmol / l Tris / HCl buffer, pH 8.0.

Evidence in the EIA

Die quantitative Bestimmung von Lp(a) erfolgt mit einem kommerziellen IMMUNOZYM® Lp(a)ELISA (IMMUNO GmbH, Heidelberg, BRD). Mit einem Anti Apo(a)-Fab-POD-Konjugat wird Apo(a) detektiert. Die fünf verwendeten Kalibratoren weisen Konzentrationen von 0, 150, 300, 500 und 800 µg/ml Lp(a) auf, die internen Qualitätskontrollen von 320-480 und 160-250 µg/ml. Die Standards und Kontrollen liegen als Lyophylisat vor und müssen mit Inkubations-/Waschpuffer rekonstituiert werden. Ein Tris/HCl-Puffer pH 8,4 mit Pluronic® als Detergens bildet den Inkubations-/Waschpuffer. Der für die Substratreaktion verwendete Puffer ist ein Acetatpuffer (pH 5,0) mit H2O2. Als Substrat benutzt man Tetramethylbenzidin in Ethanol/DMSO. Die Reaktion wird mit 2 mol/l Schwefelsäure gestoppt. Anschließend werden die Extinktionen mit einem ELISA-Reader ermittelt und am angeschlossenen Computer ausgewertet.Lp (a) is determined quantitatively using a commercial IMMUNOZYM® Lp (a) ELISA (IMMUNO GmbH, Heidelberg, FRG). With an Anti Apo (a) Fab-POD conjugate, Apo (a) detected. The five calibrators used show Concentrations of 0, 150, 300, 500 and 800 µg / ml Lp (a) on, the internal quality controls of 320-480 and 160-250 µg / ml. The standards and controls are available as lyophilisate and must be reconstituted with incubation / wash buffer. Form a Tris / HCl buffer pH 8.4 with Pluronic® as detergent the incubation / wash buffer. The one for the substrate reaction The buffer used is an acetate buffer (pH 5.0) with H2O2. As Substrate is used tetramethylbenzidine in ethanol / DMSO. The The reaction is stopped with 2 mol / l sulfuric acid. Subsequently the extinctions are determined with an ELISA reader and evaluated on the connected computer.

Results

Sowohl im Ausschlußvolumen als auch im inneren Volumen eluiert Protein, das im EIA Apo(a)-Antigenität besitzt. Das komplette Lp(a) kann bei der verwendeten Trennmatrix nur im Ausschlußvolumen zu finden sein. Somit liegt nahe, daß das Apo(a)-Antigen als freies oder ungebundenes Apo(a) vorliegt (Fig. 5).Eluted both in the exclusion volume and in the internal volume Protein that has Apo (a) antigenicity in the EIA. The complete Lp (a) can only be used in the separation matrix Exclusion volume can be found. So it stands to reason that the Apo (a) antigen is present as free or unbound apo (a) (Fig. 5).

Example 6

Um freies Apo(a) nachweisen zu können, muß das im Lp(a) gebundene Apo(a) abgetrennt werden. Dies erfolgt hier durch die Trennung nach Lysinbindungsfähigkeit. Das freie Apo(a) besitzt die Fähigkeit Lysin zu binden, was seinen Ausdruck in der Bindung von Apo(a) an Lysin-Sepharose® findet. Unter geeigneten Chromatographiebedingungen (0,05 mol/l PB, pH 7,5, Elution mit einem linearen ε-Aminocapronsäuregradienten) eluiert freies Apo(a) später als das im Lp(a) befindliche Apoprotein. Der Nachweis ist mit geeigneten Enzym- oder Radioimmunoassays möglich, die sowohl an der festen Phase als auch im Konjugat einen anti-Apo(a)-Antikörper (IMMUNOZYM® Lp(a) der Fa. Immuno AG) verwenden können.In order to be able to demonstrate free Apo (a), this must be in Lp (a) bound Apo (a) are separated. This is done here separation according to lysine binding capacity. Free Apo (a) possesses the ability to bind lysine, which is what its expression in the binding of Apo (a) to Lysine-Sepharose®. Under suitable chromatography conditions (0.05 mol / l PB, pH 7.5, Elution with a linear ε-aminocaproic acid gradient) elutes free Apo (a) later than that in Lp (a) Apoprotein. Proof is with suitable enzyme or Radioimmunoassays possible, both on the solid phase and an anti-apo (a) antibody (IMMUNOZYM® Lp (a) from Immuno AG) can be used.

Performing affinity chromatography

Die Lp(a)-haltige Probe wird vor dem Auftrag auf die Säule (Lysin-Sepharose®, 4B, C 16/40, Pharmacia, Gelvolumen 16 ml) mit Auftragspuffer verdünnt (1 : 5). Nach Waschen mit Auftragspuffer wird mit einem linearen ε- Aminocapronsäuregradienten (ε-ACA) eluiert. Die Regeneration erfolgt mit mindestens 3 Säulenvolumina Waschpuffer (1 mol/l NaCl, 0,5 mol/l ε-Aminocapronsäure, 0,05 mol/l PB, pH 7,5). Die Flußrate beträgt 30 ml/cm²/h. Der Verlauf der Chromatographie wird mit einem Durchflußphotometer mit angeschlossenem Schreiber verfolgt.The sample containing Lp (a) is applied to the column before application (Lysine-Sepharose®, 4B, C 16/40, Pharmacia, gel volume 16 ml) diluted with application buffer (1: 5). After washing with Order buffer is filled with a linear ε- Aminocaproic acid gradient (ε-ACA) eluted. The regeneration is carried out with at least 3 column volumes of washing buffer (1 mol / l NaCl, 0.5 mol / l ε-aminocaproic acid, 0.05 mol / l PB, pH 7.5). The flow rate is 30 ml / cm² / h. The course of the Chromatography is using a flow photometer connected clerk pursued.

Evidence in the EIA

Der Nachweis im EIA erfolgt wie im Beispiel 4 beschrieben.Evidence in the EIA is as described in Example 4.

Results

Unter geeigneten, wie vorstehend beschriebenen Auftragsbedingungen bindet das im Lp(a) gebundene Apo(a) nicht an Lysin-Sepharose® und ist im Durchlauf mittels EIA nachweisbar. Mit ε-ACA ist dann freies Apo(a) eluierbar (Fig. 6).Under suitable ones as described above The terms of the contract do not bind Apo (a) bound in Lp (a) on Lysin-Sepharose® and is in progress using EIA detectable. Free apo (a) can then be eluted with ε-ACA (Fig. 6).

Example 6

Es wird der spezifische Nachweis von Apo(a) ohne vorherige Abtrennung von Lp(a) im Enzymimmunoassay beschrieben. Dazu wird ein Antikörper zur Verfügung gestellt, welcher in der Lage ist, zwischen beiden Formen zu differenzieren. Ein solcher Antikörper kann nur Regionen am Apo(a) erkennen, die beispielsweise nach der Bindung von Apo(a) an Apo B verändert oder sterisch nicht mehr zugänglich sind. Im Test ist es ausreichend, wenn ein Antikörper mit diesen Eigenschaften an der festen Phase verwendet wird.It will be the specific detection of Apo (a) without prior Separation of Lp (a) described in the enzyme immunoassay. To an antibody is made available, which in the It is able to differentiate between the two forms. On such antibodies can only recognize regions on Apo (a) that changed, for example, after the binding of Apo (a) to Apo B. or are no longer sterically accessible. In the test it is sufficient if an antibody with these properties is present the solid phase is used.

Antibody production

Antikörper, die spezifisch freies Apo(a) erkennen, können beispielsweise durch gezielte Immunisierung mit Proteinfragmenten erzeugt werden. Die Proteinfragmente können durch enzymatischen oder chemischen Abbau von Apo(a) durch gentechnologische Expression oder in Form synthetischer Peptide gewonnen werden. Solche Antikörper können auch durch sorgfältige Reinigung eines polyklonalen Anti-Apo(a)-Plasmas über Affinitätschromatographie erhalten werden. Dabei werden alle Antikörper, die Lp(a) erkennen, entfernt und Antikörper, die freies Apo(a) erkennen, angereichert.Antibodies that specifically recognize free Apo (a) can for example by targeted immunization with Protein fragments are generated. The protein fragments can by enzymatic or chemical breakdown of Apo (a) genetic engineering expression or in the form of synthetic Peptides are obtained. Such antibodies can also by thorough cleaning of a polyclonal anti-apo (a) plasma can be obtained via affinity chromatography. In doing so all antibodies that recognize Lp (a) are removed and antibodies, recognize the free Apo (a), enriched.

Test setup (a) Quantitative determination of free apo (a)

Für die quantitative Bestimmung von freiem Apo(a) werden Mikrotiterplatten mit einem Antikörper beschichtet, der spezifisch freies Apo(a) und kein Lp(a) erkennt. Der Test kann als simultaner oder sukzessiver Zweiseitenbindungsassay aufgebaut werden. Als Konjugat wird ein Anti-Apo(a)-Antikörper eingesetzt, der neben Apo(a) auch Lp(a) erkennen darf.For the quantitative determination of free apo (a) Microtiter plates coated with an antibody that specifically recognizes free Apo (a) and no Lp (a). The test can as a simultaneous or successive two-sided binding assay being constructed. An anti-apo (a) antibody is used as the conjugate used, which may recognize Lp (a) in addition to Apo (a).

(b) Determination of the Lp (a) / Apo (a) ratio

Für eine quantitative Bestimmung des Verhältnisses von gebundenem zu freiem Apo(a) werden Mikrotiterplatten mit einem Anti-Lp(a)-Antikörper beschichtet, der beide Formen erkennt. Nach der Probeninkubation wird mit zwei verschiedenen Konjugaten und ihren entsprechenden Substraten detektiert, und zwar mit einem Anti-Apo B-AP-Konjugat zur Quantifizierung von komplettem Lp(a), und mit einem Anti-Apo(a)-POD-Konjugat zur Quantifizierung von freiem Apo(a).For a quantitative determination of the ratio of bound to free Apo (a) are microtiter plates with a Anti-Lp (a) antibody coated that recognizes both forms. After sample incubation, use two different Conjugates and their corresponding substrates are detected, and with an anti-Apo B-AP conjugate for the quantification of complete Lp (a), and with an anti-Apo (a) -POD conjugate Quantification of free apo (a).

In den Figuren bedeuten:In the figures:

Fig. 1 Western Blot aus der Lipidophor®-Darstellung von Apo B und freiem Apo(a) bei einem KHK-Patienten (Nr. 8) und Spender (Q10027) (siehe Beispiel 1); Fig. 1 Western blot from the Lipidophor® representation of Apo B and free apo (a) in a CAD patients and donors (Q10027) (see Example 1) (Nr. 8);

Fig. 2 bedeutet Western Blot aus Lipidophor®; Darstellung des Apo (a) und Apo B aus Plasma des Spenders (Q10027) unter reduzierenden und nicht reduzierenden Bedingungen; Fig. 2 represents Western Blot of Lipidophor®; Representation of Apo (a) and Apo B from plasma of the donor (Q10027) under reducing and non-reducing conditions;

Fig. 3 stellt Western Blot nach zweidimensionaler Elektrophorese dar: Erste Dimension Lipidophor®, zweite Dimension PAA-Agarose-Gelelektrophorese nach Molinari unter nicht reduzierenden Bedingungen (Probe eines KHK Patienten (Nr. 8)); Fig. 3 illustrates Western blot after two dimensional electrophoresis are: First dimension Lipidophor®, second dimension PAA-agarose gel electrophoresis after Molinari under non-reducing conditions (sample of CHD patients (No. 8).);

die Fig. 4 zeigt Western Blot nach zweidimensionaler Elektrophorese. Erste Dimension Lipidophor®, zweite Dimension PAA-Agarose-Gelelektrophorese nach Molinari unter reduzierenden Bedingungen (Probe eines KHK-Patienten (Nr. 8)); FIG. 4 shows Western blot after two-dimensional electrophoresis. First dimension Lipidophor®, second dimension PAA agarose gel electrophoresis according to Molinari under reducing conditions (sample from a CHD patient (No. 8));

die Fig. 5 zeigt ein Elutionsdiagramm der Lp(a)-Isolierung über Gelfiltration mit Superdex® 200 XK mit Plasma eines Spenders (Q10027), und zwar den Verlauf des Apo(a)-Gehalts nach der Isolierung eines Ultrazentrifugats; und Figs. 5 shows an elution pattern of the Lp (a) by gel filtration with Superdex® 200 -insulation XK with plasma from a donor (Q10027), and that the course of the Apo (a) level after the isolation of a Ultrazentrifugats; and

die Fig. 6 zeigt das Elutionsdiagramm der Affinitätschromatograpie des Ultrazentrifugats aus Spenderplasma (Q10027) über Lysin-Sepharose®. Fig. 6 shows the elution of the affinity chromatography of Ultrazentrifugats from donor plasma (Q10027) over lysine-Sepharose.

Claims

1. Diagnostic test method for determining lipoprotein metabolic disorders or the atherogenic risk present in a patient, characterized in that a determination of free apo (a) is carried out in a human body fluid.

2. The method according to claim 1, characterized characterized that one is from human Body fluid, the free apo (a) and a lipid contains bound apo (a), separates the bound apo (a) and the free apo (a) using a method known per se certainly.

3. The method according to claim 1 and 2, characterized characterized in that the Apo (a) bound to lipids according to a method based on molecular weight.

4. The method according to any one of claims 1, 2 or 3, characterized in that the separation of lipids bound Apo (a) by gel chromatography.

5. The method according to claim 1, characterized characterized in that the separation of the bound to lipids Apo (a) by binding to an affinity carrier based which is different from free apo (a) binding ability.

6. The method according to claim 5, characterized characterized in that the separation by Affinity chromatography is done.

7. The method according to claim 5 or 6, characterized characterized in that the lipid-bound Apo (a) by binding of immobilized lysine, immobilized proteins with terminal lysine, immobilized to a carrier Aminocarboxylic acids, amines and / or heparin takes place.

8. Method for determining free Apo (a) in a human body fluid, the free Apo (a) and contains an apo (a) bound to lipids by determining the free Apo (a) in an immune reaction with antibodies that against the free but not against the bound Apo (a) are directed.

9. The method according to claim 8, characterized characterized in that the immune response by means of a Immunoassays using appropriate labeled Antibodies.

10. The method according to claim 8 or 9, characterized characterized that the antibodies with enzymes, antigens, Radionuclides, fluorogens or luminogens marked.

11. Method according to one of the preceding Claims, characterized in that recombinant, modified and / or synthetic free Apo (a) determined.

12. Method according to one of the preceding Claims, characterized in that aggregated apo (a) certainly.

13. Method according to one of the preceding Claims, characterized in that the body fluid is a blood, serum or plasma sample.

14. Antibody directed against free Apo (a) which Apo B bound Apo (a) does not bind.