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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von freiem Apoprotein (a) (Apo (a)).
Apoprotein (a) spielt bei der Inhibierung von Plasminogen und anderen fibrinolytisch wirkenden Proteasen sowie bei der Einlagerung von Cholesterolestem und anderen Lipiden in die Intima arterieller Gefässe bei der Atherogenese eine wichtige Rolle.
Apoprotein (a) (Apo (a)) bildet gemeinsam mit dem Apoprotein B 100 (Apo B-100) und einem Lipidanteil das Lipoprotein (a) (Lp(a)). Der Lipidanteil besteht aus einem Oberflächenfilm aus polaren Lipiden, der einen mit Cholesterol gefüllten Innenraum umgibt. Der Lipidanteil mit dem assoziierten Apo-B-100 entspricht dem low-density Lipoprotein (LDL) (Berg et al Acta Path 59(3) (1963) 369). Lp(a) gilt als unabhängiger Risikofaktor bei der Entstehung von Atherosklerose (Kostner et al, Atherosklerosis 38 (1981) 51), wobei die Einflüsse der einzelnen Apoproteine nicht geklärt sind. Das Apo (a) ein hochglykosyliertes Protein, von dem angenommen wird, das es mit dem Apo-B-100 über eine oder mehrere Disulfidbrücken verbunden ist (Utermann et al, J. Clin.
Invest. 80 (1987) 458, Gaubatz et al, J. Biol. Chem 258 (7) (1983) 4582; Gaubatz et al, J. D.J. Lipid Res. 28 (1987) 69 ; et al, W. FEBS Lett. 154 (2) (1983) 357, Seman et al, W. C Biochem Cell Biol. 64 (1986) 999; Fless et al., J. Biol Chem 261 (19) (1986) 8712, Kraft et al., C. J. Clin Invest. 80 (1987) 458) Seman et al, l.c. fanden für das Apo (a) einenKohlenhydratanteil von 22,5 % und Fless et al., l.c. einen solchen von 54,1 %.
Das Apo (a) ist mit dem Plasminogen eng verwandt Die Homologie konnte durch Proteinsequenzierung und cDNA-Klonierung bewiesen werden (McLean et al, Nature 300 (1987) 132). Das Proenzym (Zymogen) Plasminogen enthält 5 cysteinreiche Sequenzen von je 80-114 Aminosäuren, den sogenannten "Kringles", die von I bis V numeriert sind Es handelt sich dabei um Proteinstrukturen, die durch drei inteme Disulfidbrücken zwischen dem ersten und sechsten, dem zweiten und vierten und dem dritten und fünften Cystein stabilisiert werden Zusätzlich ist nach dem Kringle V, dem C-terminalen Ende folgend, eine Serin-Protease-Domäne enthalten (Utermann et al, l.c.).
Die im Plasminogen enthaltende Signalsequenz, der Kringle IV, der Kringle V und die Proteasedomäne sind auch im Apo (a) mit grosser Sequenzhomologie zu Plasminogen vorhanden
Kringle V des Plasminogens kommt in Apo (a) einmal und Kringel IV in 10 verschiedenen Varianten (Kringle 1-10 im Apo (a)) vor. Der Apo (a) -Kringle 2 kommt seinerseits wieder in identischen Kopien unterschiedlicher Anzahl (n=1 bis ca. 28) vor. Die hieraus resultierenden Unterschiede im Molekulargewicht führen zur Einteilung des Lp (a)- und/oder Apo (a) -Moleküls in Isoformen (Utermann et al, l.c, Eaton et al., Proc. Natl Acad Sci USA 84 (1987) 3224). Je nach Nomenklatur wird heute zwischen 6 und 37 Isoformen unterschieden (Lackner et al., J. Clin. Invest 87(1991)2153-2161).
Die vorletzte Kopie des Kringle IV enthält einen weiteren Cystein-Rest, der wahrscheinlich die Brücke zu Apo-B-100 bildet (Eaton et al. l.c.) Aufgrund der grossen Homologie zwischen den Apo (a)-Kringeln und Kringle IV des Plasminogens wird angenommen, dass auch Apo (a) Lysin- Bindungsstellen besitzt Dies konnte mittels Säulenchromatographie über Lysin-Sepharose bestätigt werden.
Die Kringle-Domänen des Plasminogens enthalten spezifische Bindungsstellen für Fibrin, 2- Antiplasmin und Lysin. Kringle I bis V binden Lysin, wobei Kringle I und IV die grösste Affinität zeigen (Eaton et al, l.c.) Kringle-Strukturelemente sind in einer Reihe weiterer Proteine, wie z. B. t- PA, Urokinase, Thrombin, Faktor XII, usw. enthalten.
Das Apo (a) enthält eine komplette Protease Domäne Diese ist enzymatisch inaktiv bzw. kann nicht durch Streptokinase, Urokinase oder t-PA wie vergleichbares Protein gespalten werden Im Falle des Plasminogens wird dies durch Spaltung bei Arginin560 (Arg560) erreicht. Im Apo (a) ist jedoch der für die Spaltung essentielle Arginin-Rest durch Serin ersetzt (Eaton et al., l.c.).
Der Kohlenhydratanteil des Apo (a) ist für die hydrophilen Eigenschaften des Proteins verantwortlich. Mit ca. 45 % ist er im Vergleich zum Plasminogen (5 %) wesentlich höher und bedingt einen wichtigen Teil der antigenen Eigenschaften dieses Proteins Es lassen sich vorwiegend Hexosen (Galaktose und Mannose) sowie N-Acetyl-D-Galaktosamin (GaINAc) und N- Acetyl-D-Glucosamin nachweisen. Im Apo (a) sind die Anteile der Hexosen etwa gleich gross, während im LDL der Gehalt an Mannose grösser als der von Galaktose ist. GaINAc ist im LDL etwa sechsmal häufiger vertreten als im Apo (a). Der Neuraminsäureanteil lässt sich durch Behandlung mit Neuraminidase abspalten, wodurch das Molekulargewicht des Moleküls deutlich
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sinkt (Kraft et al., l.c., Utermann et al., J. Clin. Invest. 80 (1987) 458).
Die räumliche Struktur von Apo (a) ist noch nicht endgültig aufgeklärt. Untersuchungen biophysikalischer Art liegen erst über rekombinantes Apo (a) (r-Apo (a)) vor. Wie Philips et al, Biochemistry 32 (1993) 3722 an rekombinantem Apo (a) (nach Koschiensky et al, Biochemistry 30 (1991) 5044) zeigten, handelt es sich um ein Protein mit einem Stokesradius von 94 A, das sehr asymmetrisch oder ein random coil zu sein scheint. Im Elektronenmikroskop konnte es als lange hochflexible Kette visualisiert werden, die grosse offenspiralige Domänen bildet. Dabei liegen ca.
10 % des Proteins als polymeres Aggregat vor. Das Molekulargewicht des r-Apo (a) lag bei 500 kD (Koschinsky et al, l.c.), das Molekulargewicht von humanem Apo (a) liegt, je nach Isoform, zwischen 280 und 800 kD Das monomere Gesamtmolekül hat eine Länge von ca. 800 A und besteht aus einer Kette von 19 flexibel verbundenen Domänen mit einer durchschnittlichen Grösse von jeweils 42,1 A Ein Vergleich mit der t-PA-Kringlestruktur, die röntgenkristallographisch aufgeklärt wurde, lässt vermuten, dass es sich bei den Apo (a)-Domänen ebenfalls um oblate Ellipsoide mit einer ungefähren Dimension von 28 x 30 x 11A handelt, die durch Ketten mit einer ungefähren Länge von 36 Aminosäuren verbunden sind, die die Flexibilität des Moleküls gewährleisten (vgl. Philips et al, Biochemistry 22 (1993) 3722, mit bildlicher Darstellung der Struktur von Lp (a)).
Wie schon in anderen Arbeiten gezeigt (Chiesa et al, J. Biol. Chem 34 (1992) 24369, Lawn et al., Nature 360 (1992) 670, Breslow et al, Proc Natl Acad. Sci USA 90 (1993) 8314) gelingt es auch hier, eine nicht kovalente Bindung von Apo (a) und Apo-B-100, bzw dem ganzen LDL-Molekül zu zeigen. So ist r-Apo (a) mit mindestens einem Kringle, wahrscheinlich allerdings einigen, an LDL fixiert und ragt in kompakter Form in den umgebenden Raum Diese Bindung kann mit 50 mM 6-Aminohexansäure aufgehoben werden und ist somit nicht kovalent.
Vielmehr scheint sie prinzipiell ionischer Natur zu sein, denn die Affinität nimmt mit steigender Salzkonzentration ab. Eine kovalente Bindung, wie sie in vivo als Disulfidbrücke vorliegt, scheint sich aber in vitro nicht einzustellen (Philips et al, l.c.).
Der repetitive Kringle 2 weist, wie die Kringle 10 bis 1, eine hohe Homologie zum Kringle IV des Plasminogens auf. Kringle 11 ist im Gegensatz zu den übrigen dem Kringle V des Plasminogens ähnlich (Eaton et al., l.c.).
Aus dieser Homologie lässt sich ableiten, dass freies Apo (a) bzw. Lp (a) ins fibrinolytische System eingreifen kann (Harpel et al., Proc. Natl. Acad Sci USA 86 (1989) 3847-3851; Loscalzo et al, Ateriosclerosis 10 (1990) 240-245).
Obwohl die Plasmakonzentration von Lp (a) genetisch determiniert ist und sich somit weitgehend der medikamentösen und diätetischen Beeinflussbarkeit entzieht (Berg et al., Series Haematologica I (1968) 111), ist die Bestimmung der Plasmakonzentration trotzdem von grossem diagnostischen Interesse, weil Konzentrationen von über 300 g/ml ein erhöhtes Risiko für koronare Herzkrankheiten (KHK) darstellen (Berg et al, Clin Genetics 8 (6) (1974) 230 ; et al.,
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genauere Begutachtung der klassischen Risikofaktoren für KHK erfordern. Das Auftreten von freiem Apo (a) in Körperflüssigkeiten wäre ein überraschender Befund. Apo (a) ist über eine oder mehrere Disulfidbrücken an Apo B 100 gebunden.
Diese Disulfidbrücken werden aber nur in hepatitischen Zellen geschlossen und definitionsgemäss (Alberts et al., The Cell (1983) 113-114) nicht extrazellular gelöst.
Nach bekannten Verfahren wird die Lp (a)-Bestimmung praktisch ausschliesslich mittels immunologischer Methoden durchgeführt. Hierbei steht für die quantitative Messung ein Enzymimmunoassay (EIA) , neben RIA, radialer Immundiffusion und Nephelometrie, im Vordergrund. Darüberhinaus kann ein qualitativer Nachweis von Lp (a) mit einem Immunblot (Westem Blot) geführt werden. Hierbei wird zunächst das Antigen über eine Gelelektrophorese (z. B. mit 4 bis 15 % Polyacrylamid auf Trägerfolie (Molinari et al., Lp (a) Phenotyping of the Phast System-Pharmacia ; 55 th Annual Meeting of the European Atherosclerosis Society (EAS), Brugge, Belgium, May 17-19,1990); oder mit 4 % Polyacrylamid/PEG (modifiziert nach Righetti et al., Electrophoresis 13 (1992) 587) aufgetrennt. Anschliessend werden die auf dem Gel befindlichen Proteine auf eine geeignete Membran (z.B.
Nitrocellulose) transferiert (Towbin et al, Proc. Natl.
Acad Scr USA 76 (1979) 4350). Die dort immobilisierten Proben können dann mit einem geeigneten Antikörper-Enzym-Konjugat spezifisch nachgewiesen werden. Prinzipiell eignen sich für die Detektion zwei im Lp (a) vorhandene Antigene, Apo (a) und Apo B-100. Die dabei
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resultierenden Festphasen-Testsysteme gestatten somit bei einer Kombination von anti-Apo (a)- Antikörpem im Konjugat und an der festen Phase die Bestimmung von Lp (a) und dem gleichzeitig vorhandenen freien Apo (a), nicht aber die Differenzierung zwischen beiden Apo (a)-Formen und die Bestimmung des freien Apo (a). Wird dagegen ein Apo B-Antikörper im Konjugat verwendet, ist nur Lp (a) nachweisbar.
Eine umgekehrte Konstellation, d. h. anti-Apo B an der festen Phase und anti-Apo (a) im Konjugat, ist für den Lp (a)-Nachweis nur bedingt geeignet, da der Überschuss von Apo B im LDL zur Kompetition um die Bindung am Festphasenantikörper führt.
Einphasensysteme, wie die Nephelometrie oder Turbidimetrie, führen durch den Zusatz von anti-Apo (a) -Antikörpern zur Bildung von messbaren, lichtstreuenden oder lichttrübenden Immunkomplexen und könnten somit auch nicht zwischen freiem und an Lp (a) gebundenem Apo (a) unterscheiden
Damit lässt sich unter der Einbeziehung der vorstehenden Ausführungen, wonach anzunehmen ist, dass freies Apo (a) in die Pathogenese der Atherosklerose eingreift, auch die Diskrepanz zwischen dem gebundenen Lp (a)-Spiegel und dem relativen Risiko der Sclerosierung arterieller Gefässe erklären. Wie bereits vorstehend angesprochen, ist aber für den Nachweis von freiem Apo (a) bisher keine Bestimmungsmethode bekannt.
In Giunta et al (New York Academy of Sciences 673 (1992), Seiten 342-349 wird die elektrophoretische Trennung von freiem Apolipoprotein A1 (apo A-1), das mit "high-densitiy"- Lipoprotein assoziiert vorliegt, mittels Immunfixation (IFE) beschrieben. Apo A-1 ist das hauptsächliche Apoprotein in "high density"-Lipoproteinen und unterscheidet sich grundlegend von Apo (a) in Lp (a), und zwar sowohl genetisch als auch proteinchemisch
Gemäss Hoff et al. (Chem. Phys Lipids 67/68 (1994), Seiten 271-280) werden sowohl Plasma als auch Plaque-Extrakte einer Elektrophorese auf Agarose und SDS unter reduzierenden und nicht reduzierenden Bedingungen unterzogen.
Anschliessend wurde mittels immunchemischer Methoden unter Verwendung eines polyklonalen Antiserums, welches mit Plasminogen kreuzreagiert, bzw. eines anti-humanen Apo (a)-Antikörpers auf Vorhandensein von Lipidfreiem Apo (a) geprüft.
Die immunpositive Bande tritt nach elektrophoretischer Auftrennung auf Agarose in einer Dichtefraktion grösser 1,21 auf. In der SDS-Elektrophorese (unter reduzierenden und unter nicht re- duzierenden Bedingungen) zeigt sich, dass die stark gefärbte immunpositive Bande im Molekulargewichtsbereich von humanem IgG liegt, dass also eine Reaktivität mit humanem IgG oder mit IgG assoziiertem Material vorliegt. Es wird zwar vermutet, dass möglicherweise Apo (a) Fragmente nachgewiesen worden sind, welche an IgG konvalent gebunden vorliegen, es wird aber auch spekuliert, dass die eingesetzten Antigene tatsächlich an IgG binden. Auch dieses Dokument enthält daher keine Anleitung zur Bestimmung von freiem Apo(a), welches weder an Lipide noch an Apo B gebunden ist.
Aufgabenstellung der vorliegenden Erfindung ist deshalb die Bereitstellung eines Verfahrens zur Bestimmung von freiem Apoprotein (a) in einer menschlichen Körperflüssigkeit.
Diese Aufgabenstellung wird mit dem Gegenstand der vorliegenden Erfindung gelöst
Gegenstand der Erfindung ist ein diagnostisches Testverfahren zur Bestimmung von Lipoprotein-Stoffwechselstörungen bzw. des bei einem Patienten vorliegenden atherogenen Risikos, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man eine Bestimmung von freiem Apo (a) in einer menschlichen Körperflüssigkeit, die ein an Lipide und/oder an Apo B gebundenes Apo (a) enthält, durchführt.
Zweckmässige Ausgestaltungen dieses Verfahrens sind Gegenstand der Ansprüche 2 bis 7.
In dem erfindungsgemässen Verfahren zur Bestimmung von freiem Apo (a) in einer menschlichen Körperflüssigkeit wird das an Lipide gebundene Apo (a) nach an sich bekannten Methoden, die auf Unterschieden in den physikalischen, physikochemischen und/oder chemischen Eigenschaften des an Lipide gebundenen Apo (a) gegenüber freiem Apo (a) beruhen, abgetrennt, und vorzugsweise nach einer der folgenden Methoden : durchGelchromatographie (aufgrund des höheren Molekulargewichts des an Lipide gebundenen Apo (a)), durch Bindung an einen Affinitätsträger (aufgrund der von freiem Apo (a) verschiedenen Bindungsfähigkeit von an Lipide gebundenen Apo (a) an einem Affinitätsträger) und z. B. nach an sich bekannten Affinitätschromatographieverfahren.
Als Affinitätsträger werden in diesen Verfahren insbesondere immobilisiertes Lysin,
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immobilisierte Proteine mit entständigem Lysin, immobilisierte, z. B. chemisch an einen Träger gebundene Aminocarbonsäuren, insbesondere s-Aminocarbonsäuren, Amine und/oder Heparin verwendet.
Zur Abtrennung von an Lipide gebundenem Apo (a) kann es auch zweckmässig sein, ein oder mehrere gleiche oder verschiedene Trennmethoden, insbesondere eine oder mehrere der vorstehend als bevorzugt genannten Trennmethoden, miteinander zu kombinieren.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Verfahren zur Bestimmung von freiem Apo (a) in einer menschlichen Körperflüssigkeit, die freies Apo (a) und ein an Lipide gebundenes Apo (a) enthält, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man das freie Apo (a) in einer Immunreaktion mit Antikörpern bestimmt, die gegen das freie, aber nicht gegen das gebundene Apo (a) gerichtet sind.
Zweckmässige Ausgestaltungen dieses Verfahrens sind Gegenstand der Ansprüche 9 und 10.
Die Immunreaktion mit den Antikörpern kann dabei auf eine für derartige Immunreaktionen an sich bekannte Weise durchgeführt werden Vorzugsweise wird die Immunreaktion mittels eines Immunoassays unter Verwendung von geeigneten markierten Antikörpern durchgeführt.
Die Antikörper sind vorzugsweise durch Enzyme, Antigene, Radionuklide, Fluorogenen oder Luminogene markiert.
Je nach der verwendeten Markierung der Antikörper kann der Immunoassay deshalb z. B. nach einem allgemein üblichen Enzymimmunoassay (EIA), insbesondere ELISA, oder einem Radioimmunoassay (RIA) durchgeführt werden.
Als immunologische Technik zur Durchführung der erfindungsgemässen Immunreaktion mit Antikörpern hat sich insbesondere auch die Methode des Immun-Blot (Westem Blot) erwiesen, nach der Proteine aus einem Elektrophorese-Gel, z. B. nach der Auftrennung in einer Polyacrylamid-GelElektrophorese auf eine immobilisierende Matrix (z.B. Nitrocellulose-Filter) übertragen werden, was in erster Linie durch Elektrotransfer erfolgt, und anschliessend durch eine immunologische Reaktion (z B. durch radioaktiv oder Enzym-markierte Antikörper) nachgewiesen werden.
Die erfindungsgemässen Verfahren zur Bestimmung von freiem Apo (a) eignen sich zur Bestimmung von rekombinantem, modifiziertem und/oder synthetischen freiem Apo (a), sowie auch zur Bestimmung dieser in Form von Aggregaten vorliegenden Apo (a)s.
Die erfindungsgemässen Verfahren, mit denen freies, in einer menschlichen Körperflüssigkeit vorhandenes Apo (a) bestimmt werden kann, eignet sich zur Verwendung für eine aussagekräftige Bestimmung von Lipoproteinstoffwechselstörungen und Beurteilung des bei einem Patienten vorliegenden atherogenen Risikos. Es ist anzunehmen, dass freies Apo (a) in die Pathogenex der Atherosklerose eingreift, was die Diskrepanz zwischen dem gebundenen Lp (a) -Spiegel und dem relativen Risiko der Sklerosierung arterieller Gefässe erklärt. Auf der Grundlage der Bestimmung des in einer menschlichen Körperflüssigkeit vorhandenen freien Apo (a) ist gegenüber bekannten Bestimmungsverfahren eine aussagekräftigere Beurteilung möglich.
Weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Bestimmung von Lipoproteinstoffwechselstörungen bzw. des bei einem Patienten vorliegenden artherogenen Risikos, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man das erfindungsgemässe Verfahren zur Bestimmung von freiem Apo (a) in einer dem Patienten entnommenen Körperflüssigkeit vornimmt.
Als Körperflüssigkeit wird vorzugsweise eine Blut-, Serum- oder Plasmaprobe verwendet.
Die nachfolgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern, ohne den Rahmen der Erfindung auf diese Ausführungsformen zu beschränken.
Beispiele
Nachfolgend werden bevorzugte Ausführungsformen der erfindungsgemässen Verfahren die auch den Beispielen zugrundeliegen, für die Abtrennung von an Lipide gebundenem Apo (a) sowie für die Bestimmung des freien Apo (a), und bevorzugte Kombinationen dieser Verfahrensstufen, beschrieben.
Zum Nachweis von freiem Apo (a) wird das im Lp (a) gebundene Apo (a) abgetrennt. Dies wird vorzugsweise über Festphasentechniken (Bindung an einem Antikörper, der nur freies Apo (a) erkennt) oder aber durch Trennung auf der Basis des verschiedenen Molekulargewichts, der
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verschiedenen Ladung und anderer physikalisch-chemischer Eigenschaften vorgenommen.
Zur Abtrennung auf der Basis verschiedener Ladungen eignen sich insbesondere Elektrophoresetechniken, nach denen, wie z. B. bei der SDS-Elektrophorese, nach Molekulargewicht, oder, wie z. B. bei der Agar-Gelelektrophorese, nach elektrophoretischer Mobilität getrennt werden kann.
In einer zweiten Schritt wird dann das freie Apo (a) nachweisbar gemacht. Dies geschieht insbesondere mittels geeigneter immunologischer Methoden. Mit einem modifizierten Western Blot (Towbin et al, l.c.) wird z. B. die Immobilisierung aller Proteine auf einer Nitrocellulosemembran durchgeführt; dann kann z. B. ein Antikörper verwendet werden, der sowohl das freie als auch das im Lp (a) gebundene Apo (a) erkennt. Ist dieser Antikörper direkt markiert (z.
B. mit einem Enzym), so können durch eine Farbreaktion die Stellen auf der Membran sichtbar gemacht werden, an denen Apo (a) als Antigen erkannt wird Durch den Vergleich mit der Reaktion mit einem anti-Apo B-Antikörper (die entweder ebenfalls direkt, aber mit einem anderen Markerenzym markiert durchgeführt werden kann, oder auch auf einem parallelen Blotstreifen) lässt sich dann das freie Apo (a) feststellen und, wenn erwünscht, durch eine an sich bekannte Methode auch quantitativ erfassen.
Zur Abtrennung der Lipoproteine aus dem Plasma ist insbesondere eine Lipidelektrophorese mit einem Albumin enthaltendem Agarmedium, bei welchem Lipoproteine durch Polyanionen im Gel präzipitiert werden (Lipidophor Immuno AG, vgl. Seidel et al., Clin. Chem Acta 19/7 (1973) 737-739, Hieland et al., Clin. Chem. Acta 19/10 (1973 1139-1141 ; et al., Clin. Chem. Acta 23/78 (1977) 1296-1300; Wieland et al., Innere Medizin (1978 190-300)) geeignet Nach dieser Methode wandert das Lp (a) mit dem LDL. Es hat sich herausgestellt, dass freies Apo (a) eine höhere elektrophoretische Immobilität besitzt und deshalb vor dem Lp (a) erscheint.
Der Nachweis beider Apo (a)-Formen ist nach einem (elektrophoretischen) Transfer auf eine proteinbindende Membran, die vorzugsweise eine Nitrocellulose-Membran ist, mit einem Enzym-markierten AntiApo (a)-Antikörper möglich Dieser setzt an den Stellen auf der Membran, wo das Antigen erkannt wurde, ein wasserunlösliches Substrat um. Im Kontrollblot wird das Apo B analog mit einem antiApo B-Antikörper dargestellt. Der Vergleich beider Blots zeigt einen Bereich mit beiden darstellbaren Proteinen und einen weiteren, an dem nur eine Reaktion des anti-Apo (a) Antikörpers auftrat.
Beispiel 1
Durchführung der Lipidelektrophorese
100 l Plasma werden mit der gleichen Menge Agarmedium gemischt und 10 l des Gemisches auf das Gel aufgetragen. Anschliessend wird die Auftragstelle mit einem Tropfen Agar verschlossen. Nach Einlegen der Gele in die mit Elektrophoresepuffer (62,1 % 5,5' Diethylbarbitursäure Natriumsalz; 29,2 % Natriumacetat, 8,7 % Citrat, pH 8,6) gefüllte
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Auftragsstellen befüllt werden.
Transfer
Die in Blottingpuffer (25 mM TrisIHCI, 0,2 mM Glycin, 20 % v/v Methanol) benetzte Nitrocellulosemembran (Schleicher und Schuell) wird auf das Gel gelegt. Der Transfer erfolgt trocken bei 70 C innerhalb einer Stunde.
Entwicklung
Die vom Gel befreite Membran wird 1 h in 3 % TBS/BSA blockiert und nach viermaligem Waschen in 1 % TBSIBSA mit einem polyklonalen Kaninchen Anti-Apo (a) - bzw. Anti-Apo B-100- Antikörper über Nacht inkubiert. Nach viermaligem Waschen mit 1 % TBS/BSA inkubiert man mit mit Peroxidase (POD) -markiertem Maus-anti-Kaninchen Antikörper. Die Entwicklung des Blots erfolgt mit Diaminobenzidin. Der Vergleich der Apo (a) und Apo-B-100 Blots zeigt das freie Apo (a) an.
Ergebnisse
Der Westem Blot der Lipidelektrophorese zeigt für einen KHK-Patienten (Nr. 8) eindeutig zwei und für einen gesunden Plasmaspender (Q 10027) nur eine mit dem anti-Apo (a) darstellbare Bande. Mit dem anti-Apo B können die LDL und das Lp (a) angefärbt werden. Dabei entspricht die
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untere Anfärbung mit anti-Apo (a) und anti-Apo B dem Lp (a), die obere Anfärbung dagegen dem freien Apo (a). Das Blotmuster des Plasmaspenders (Q10027) weist in der Region des LDL (anfärbar mit anti-Apo B) keine Apo (a)-Bande auf, woraus zu schliessen ist, dass in Lipidophor das freie Apo (a) etwa die gleiche elektrophoretische Mobilität wie LDL besitzt (Fig. 1).
Die
Darstellung der beiden Lipoproteine nach dem Westem Blot aus Lipidophor unter reduzierenden
Bedingungen zeigt, dass die Doppelbandigkeit (ohne #-Mercaptoethanol) aufgehoben wird Dabei bleiben die LDL (Anfärbung mit anti-ApoB) unbeeinflusst. Auch dies kann als Nachweis für freies
Apo (a) gewertet werden (Fig. 2)
Beispiel 2
Um freies Apo (a) nachweisen zu können, wird das im Lp (a) gebundene Apo (a) abgetrennt.
'Dies kann durch Trennung nach Molekulargewicht vorgenommen werden. Hierfür eignen sich insbesondere Elektrophoresetechniken wie die SDS-Elektrophorese. Auch hier wird nach der
Trennung das Lipoprotein durch Transfer auf eine proteinbindende Membran immobilisiert um dann wiederum immunologisch nachgewiesen zu werden.
Die SDS-Elektrophorese ist als Methode geeignet, um Lipoproteine aus dem Plasma nach
Molekulargewicht aufzutrennen. Dabei wandert das Lp (a) mit LDL Freies Apo (a) besitzt eine höhere elektrophoretische Mobilität und ist somit vor Lp (a) zu finden Der Nachweis beider Apo (a) -Formen ist nach einem (elektrophoretischen) Transfer auf eine proteinbildende (Nitrocellulose)-
Membran mit einem Enzym-markierten anti-Apo (a)-Antikörper möglich. Dieser setzt an den
Stellen auf der Membran, wo das Antigen erkannt wurde, ein wasserunlösliches Substrat um. Im
Kontrollblot wird das ApoB analog mit einem anti-Apo B-Antikörper dargestellt. Der Vergleich beider Blots zeigt einen Bereich mit beiden darstellbaren Proteinen und einen weiteren, an dem nur der anti-Apo (a)-Antikörper reagiert hat.
Durchführung der Elektrophorese
Die Trennung der Proben erfolgt in einem Polyacrylamidgel (T 4,2 % , C 0,8 %) dem
Agaroselösung (60 %, 1,22 g in 100 ml) zugesetzt ist. 750 mg Agarose werden in 25 ml
Trenngelpuffer (0,4 % SDS, 1,5 mol/l TrisIHCI, Ph 8,8) und 62,5 ml Aqua dest. im Wasserbad (kochend) geschmolzen und nach Zugabe von 12,5 ml monomerer Stammlösung (Acrylamid 30 %,
N,N-Methylenbisacrylamid 0,8 %) auf 60 C abgekühlt. Nach Zugabe von 150 l TEMED und 2,5 ml einer 10 %igen Ammoniumpersulfatlösung wird die Lösung blasenfrei zwischen zwei vorgewärmte Borsilikatglasplatten gegeben Die Polymerisation findet innerhalb von 5-60 min statt.
Zur Herstellung des Sammelgels werden 0,5 ml monomere Stammlösung, 1,25 ml
Sammelgelpuffer (0,4 % SDS, 0,5 mol/l TrisIHCI, pH 6,8), 3,25 ml Aqua dest., 12 l TEMED und
150 l einer 10 %igen Ammoniumpersulfatlösung gemischt, um damit das Trenngel zu überschichten Das maximale Probenvolumen beträgt bei einer Geldicke von 2,25 mm ca. 100 l.
Die Elektrophorese findet ca. 5 h unter 25 mA const./Gel in einem 25 mmolll Tris/HCI, 0,2 mol/l
Glycin, 0,1 % SDS, pH 8,0 Elektrophoresepuffer statt. Alternativ zu diesen SDS-PAGE können die
Lipidophorgele auch in einem modifizierten SDS-PAGE (modifiziert nach Righett et al.,
Electrophoresis 13 (1992) 587) getrennt werden.
Transfer
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Methanol, 16 h, 15 C). Die in Blottingpuffer benetzte Nitrocellulosemembran (Schleicher und Schuell) wird auf das Gel gelegt. Der Transfer erfolgt in anodischer Richtung.
Entwicklung
Die vom Gel befreite Membran wird 1 h in 3 % TBS/BSA blockiert und nach viermaligem Waschen in 1 % TBS/BSA mit einem polyklonalen Kaninchen Anti-Apo (a) - bzw. Anti-Apo B-100- Antikörper über Nacht inkubiert. Nach viermaligem Waschen mit 1 % TBS/BSA inkubiert man mit mit Peroxidase (POD) markiertem Maus-anti-Kaninchen Antikörper. Die Entwicklung des Blots erfolgt mit Diaminobenzidin. Der Vergleich der Apo (a) und Apo B-100 Blots zeigt das freie Apo (a) an.
Ergebnisse
Die hochmolekulare antigene Bande, die m'rt dem anti-Apo (a) und dem anti-Apo B-Antikörper erhalten wird, entspricht dem Lp (a). Beide Proteine sind über eine Disulfidbrücke verbunden, die sich unter reduzierenden Bedingungen mit #-Mercaptoethanol spalten lässt Auch mit dieser
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Methode wird mit dem anti-Apo (a) -Antikörper wieder unterhalb des Lp (a) eine weitere antigene Bande sichtbar. Diese entspricht dem im Plasma vorhandenen freien Apo (a).
Beispiel 3
Um freies Apo (a) nachweisen zu können, lassen sich auch die unter Beispiel 1 und Beispiel 2 beschriebenen Techniken zu einer zweidimensionalen Elektrophorese kombinieren. Dabei wird in der ersten Dimension mit Lipidophor nach elektrophoretischer Mobilität getrennt und in der zweiten Dimension nach Molekulargewicht. Der Nachweis des freien Apo (a) erfolgt wieder wie in den Beispielen 1 und 2 beschrieben.
- Lipidelektrophorese mit Lipidophor in Kombination mit SDS-PAGE
Die Lipidelektrophorese mit Lipidophor wird wie im Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Für die SDS-Elektrophorese werden die Gele in Probenpuffer durch 2 x 5 minütiges Einlegen umgepuffert. Nachdem überschüssige Flüssigkeit entfernt ist, können die Gele auf den wie beschrieben vorbereiteten SDS-Gelen im Sammelgel einpolymerisiert werden. Alternativ zu der vorstehend beschriebenen SDS-PAGE können die Lipidophorgele auch in einem modifizierten SDS-PAGE nach Righetti (modifiziert nach Righetti et al., Electrophoresis 13 (1992) 587) getrennt werden. Hier wird dann statt der Agarose 1 % PEG 20000 zur Stammlösung zugegeben.
Gleichermassen wird mit dem Sammelgel verfahren. Die Elektrophorese sowie der Transfer und der Nachweis des freien Apo (a) erfolgen wie vorstehend beschrieben.
Entwicklung
Die vom Gel befreite Membran wird 1h in 3 % TBSIBSA blockiert und nach viermaligem Waschen in 1 % TBS/BSA mit einem polyklonalen POD-markierten Kaninchen Anti-Apo (a) - bzw.
AP-markierten Anti-Apo B-100-Antikörper über Nacht inkubiert. Nach viermaligem Waschen mit 1 % TBS/BSA erfolgt die Anfärbung des AP-markierten Antikörpers mit Neufuchsin oder Nitrotetrazoliumblau (0,05 % v/v 2 molll MgCI2, 0,001 % v/v Nitrotetrazoliumblau, 0,002 % v/v 5- Bromo-4-chloro-3-indoxylphosphat Na-Salz; (BCIP, Merck AG, Darmstadt, BRD) in 200 mmol/l 1 % TBS/BSA oder 0,04 % v/v (-)- 2,3,5,6 - Tetrahydro - 6 - phenylimidazo [2, 1 - b] thiazol (Levamisol), 0,02 % v/v NaN02, 0,05 % v/v Naphthol-As-Bis-Triphosphat in DMF, 0,005 % v/v Neufuchsin in 0,1 molll Tris/HCI pH 8,8). Nachfolgend kann dann der POD-Anteil wie oben beschrieben nachgewiesen werden. Diese Technik gestattet den Nachweis beider Proteine in einem Schritt. Freies Apo (a) ist dort nur mit der POD-Reaktion nachzuweisen.
Doppelfärbungen an einem Spot weisen auf das Vorhandensein beider Proteine (Apo (a) und Apo B) hin.
Ergebnisse
Nach der zweidimensionalen Elektrophorese werden mit dem anti-Apo (a)-Antikörper drei Spots angefärbt. Dabei entsprechen die anodisch (1. Dimension = Lipidophor#) gewanderten, immunologisch angezeigten Proteine dem Lp (a) mit dem höchsten Molekulargewicht, und die mit geringerem Molekulargewicht als deutliche Doppelbande den beiden Isotypen des freien Apo (a).
Die kathodisch anfärbbaren Apo (a)-Spots verfügen über kein darüber liegendes Lp (a), so dass diese eindeutig als freies Apo (a) identifiziert werden können.
Hier kann festgestellt werden, dass das Apo (a) einerseits frei im Plasma vorkommt, andererseits aber auch eine Form existiert, die dem Apo (a) zusammen mit dem Apo B (ohne kovalente Bindung an letzteres) die gleiche elektrophoretische Mobilität in Lipidophor verleiht.
Durch Reduktion der Proteine nach der Trennung in Lipidophor (Fig 3) verschwindet der Lp (a) - Spot und es wird ausschliesslich Apo (a) und Apo B in den für das jeweilige Molekulargewicht typischen Spots sichtbar (Fig. 4).
Beispiel 4
Um freies Apo (a) nachweisen zu können, wird das im Lp (a) gebundene Apo (a) abgetrennt.
Dies erfolgt hier durch die Trennung nach Molekulargewicht mittels Gelfiltration. Das freie Apo (a) besitzt ein geringeres Molekulargewicht und eluiert somit unter geeigneten Chromatographiebedingungen (kovalent an stark vemetzten Agarose - Kügelchen gebundenes Dextran Superdex 200 XK), Flussrate 7,5 ml/cm2/h (200 mmolll Tris/HCI, pH 8,0) später als das im Lp(a) befindliche Apo (a) Der Nachweis ist mit geeigneten Enzym- oder Radioimmunoassays möglich, wobei sowohl an der festen Phase als auch im Konjugat ein anti-Apo (a)-Antikörper (IMMUNOZYM Lp (a) der Fa. Immuno) verwendet werden kann.
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Durchführung der Gelfiltration
Die Gelfiltration der Proben erfolgt über Superdex 200 XK (Pharmacia, Uppsala, Schweden).
Entsprechend der Säulengrösse (26/70) werden ca. 2,5 ml Probe aufgetragen. Die Trennung
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Nachweis im EIA
Die quantitative Bestimmung von Lp (a) erfolgt mit einem kommerziellen Einschritt - Lp (a) - ELISA nachdem Sandwich-Prinzip IMMUNOZYM Lp (a) ELISA (IMMUNO GmbH, Heidelberg, BRD). Mit einem Anti Apo (a)-Fab-POD-Konjugat wird Apo (a) detektiert. Die fünf verwendeten Kalibratoren weisen Konzentrationen von 0,150, 300,500 und 800 g/ml Lp (a) auf, die internen Qualitätskontrollen von 320-480 und 160-250 g/ml. Die Standards und Kontrollen liegen als Lyophylisat vor und müssen mit Inkubations- /Waschpuffer rekonstituiert werden Ein Tris/HCI- Puffer pH 8,4 mit nichtionogenen Polyalkylenglykolen auf Basis von Blockpolymeren aus Ethylen - und Propylenoxid (Pluronic als Detergens bildet den Inkubations- /Waschpuffer. Der für die Substratreaktion verwendete Puffer ist ein Acetatpuffer (pH 5/0) mit H202.
Als Substrat benutzt man Tetramethylbenzidin in Ethanol/DMSO. Die Reaktion wird mit 2 molll Schwefelsäure gestoppt Anschliessend werden die Extinktionen mit einem ELISA-Reader ermittelt und am angeschlossenen Computer ausgewertet.
Ergebnisse
Sowohl im Ausschlussvolumen als auch im inneren Volumen eluiert Protein, das im EIA Apo (a)-Antigenität besitzt. Das komplette Lp (a) kann bei der verwendeten Trennmatrix nur im Ausschlussvolumen zu finden sein. Somit liegt nahe, dass das Apo (a)-Antigen als freies oder ungebundenes Apo (a) vorliegt (Fig. 5).
Beispiel 6
Um freies Apo (a) nachweisen zu können, muss das im Lp (a) gebundene Apo (a) abgetrennt werden. Dies erfolgt hier durch die Trennung nach Lysinbindungsfähigkeit. Das freie Apo (a) besitzt die Fähigkeit Lysin zu binden, was seinen Ausdruck in der Bindung von Apo (a) an dreidimensional vernetzte Agerose mit a-NH2- gebundenen Lysinresten (Lysin-Sepharose) findet. Unter geeigneten Chromatographiebedingungen (0,05 mol/l PB, pH 7,5, Elution mit einem linearen ¼- Aminocapronsäuregradienten) eluiert freies Apo (a) später als das im Lp (a) befindliche Apoprotein.
Der Nachweis ist mit geeigneten Enzym- oder Radioimmunoassays möglich, die sowohl an der festen Phase als auch im Konjugat einen anti-Apo (a)-Antikörper (IMMUNOZYM Lp (a) der Fa.
Immuno AG) verwenden können.
Durchführung der Affinitätschromatographie
Die Lp (a) -haltige Probe wird vor dem Auftrag auf die Säule (Lysin-Sepharose, 4B, C 16/40, Pharmacia, Gelvolumen 16ml) mit Auftragspuffer verdünnt (1:5). Nach Waschen mit Auftragspuffer wird mit einem linearen s-Aminocapronsäuregradienten (e-ACA) eluiert. Die Regeneration erfolgt mit mindestens 3 Säulenvolumina Waschpuffer (1 mol/l NaCI, 0,5 molll e-Aminocapronsäure, 0,05 mol/l PB, pH 7,5). Die Flussrate beträgt 30 ml/cm2/h. Der Verlauf der Chromatographie wird mit einem Durchflussphotometer mit angeschlossenem Schreiber verfolgt.
Nachweis im EIA
Der Nachweis im EIA erfolgt wie im Beispiel 4 beschrieben.
Ergebnisse
Unter geeigneten, wie vorstehend beschriebenen Auftragsbedingungen bindet das im Lp (a) gebundene Apo (a) nicht an Lysin-Sepharose und ist im Durchlauf mittels EIA nachweisbar. Mit e-ACA ist dann freies Apo (a) eluierbar (Fig 6).
Beispiel 6
Ew wird der spezifische Nachweis von Apo (a) ohne vorherige Abtrennung von Lp (a) im Enzymimmunoassay beschrieben. Dazu wird ein Antikörper zur Verfügung gestellt, welcher in der Lage ist, zwischen beiden Formen zu differenzieren. Ein solcher Antikörper kann nur Regionen am Apo (a) erkennen, die beispielsweise nach der Bindung von Apo (a) an Apo B verändert oder sterisch nicht mehr zugänglich sind. Im Test ist es ausreichend, wenn ein Antikörper mit diesen Eigenschaften an der festen Phase verwendet wird.
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Antikörpergewinnung
Antikörper, die spezifisch freies Apo (a) erkennen, können beispielsweise durch gezielte Immunisierung mit Proteinfragmenten erzeugt werden. Die Proteinfragmente können durch enzymatischen oder chemischen Abbau von Apo (a) durch gentechnologische Expression oder in Form synthetischer Peptide gewonnen werden. Solche Antikörper können auch durch sorgfältige Reinigung eines polyklonalen Anti-Apo (a)-Plasmas über Affinitätschromatographie erhalten werden. Dabei werden alle Antikörper, die Lp (a) erkennen, entfernt und Antikörper, die freies Apo (a) erkennen, angereichert.
Testaufbau (a) Quantitative Bestimmung von freiem Apo (a) Für die quantitative Bestimmung von freiem Apo (a) werdenMikrotiterplatten mit einem Antikörper beschichtet, der spezifisch freies Apo (a) und kein Lp (a) erkennt. Der Test kann als simultaner oder sukzessiver Zweiseitenbindungsassay aufgebaut werden.
Als Konjugat wird ein Anti-Apo (a)-Antikörper eingesetzt, der neben Apo (a) auch Lp (a) erkennen darf (b) Bestimmung des Lp (a) /Apo (a)-Verhältnis
Für eine quantitative Bestimmung des Verhältnisses von gebundenem zu freiem Apo (a) werden Mikrotiterplatten mit einem Anti-Lp (a) -Antikörper beschichtet, der beide Formen erkennt Nach der Probeninkubation wird mit zwei verschiedenen Konjugaten und ihren entsprechenden Substraten detektiert, und zwar mit einem Anti-Apo B-AP-Konjugat zur Quantifizierung von komplettem Lp (a), und mit einem Anti-Apo (a)-POD-Konjugat zur Quantifizierung von freiem Apo (a).
In den Figuren bedeuten:
Figur 1 Western Blot aus der Lipidophor-Darstellung von Apo B und freiem Apo (a) bei einem KHK-Patienten (Nr. 8) und Spender (Q10027) (siehe Beispiel 1) ;
Figur 2 bedeutet Westem Blot aus Lipidophor; Darstellung des Apo (a) und Apo B aus Plasma des Spenders (Q10027) unter reduzierenden und nicht reduzierenden Bedingungen;
Figur 3 stellt Western Blot nach zweidimensionaler Elektrophorese dar : Erste Dimension Lipidophor, zweite Dimension PAA-Agarose-Gelelektrophorese nach Molinari unter nicht reduzierenden Bedingungen (Probe eines KHK Patienten (Nr. 8) ) ; die Figur 4 zeigt Western Blot nach zweidimensionaler Elektrophorese.
Erste Dimension Lipidophor, zweite Dimension PAA-Agarose-Gelelektrophorese nach Molinari unter reduzierenden Bedingungen (Probe eines KHK-Patienten (Nr. 8)) ; die Figur 5 zeigt ein Elutionsdiagramm der Lp (a) -Isolierung über Gelfiltration mit Superdex 200 XK mit Plasma eines Spenders (Q10027), und zwar den Verlauf des Apo (a) -Gehalts nach der Isolierung eines Ultrazentrifugats; und die Figur 6 zeigt das Elutionsdiagramm der Affinitätschromatograpie des Ultrazentrifugats aus Spenderplasma (Q10027) über Lysin-Sepharose.
PATENTANSPRÜCHE:
1. Diagnostisches Testverfahren zur Bestimmung von Lipoprotein-Stoffwechselstörungen bzw. des bei einem Patienten vorliegenden atherogenen Risikos, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Bestimmung von freiem Apo (a) einer menschlichen Körperflüssigkeit, die ein an Lipide und/oder an Apo B gebundenes Apo(a) enthält, durchführt.
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The invention relates to a method for the determination of free apoprotein (a) (Apo (a)).
Apoprotein (a) plays an important role in atherogenesis in the inhibition of plasminogen and other fibrinolytic proteases and in the storage of cholesterol esters and other lipids in the intima of arterial vessels.
Apoprotein (a) (Apo (a)) together with apoprotein B 100 (Apo B-100) and a lipid portion forms lipoprotein (a) (Lp (a)). The lipid portion consists of a surface film made of polar lipids that surrounds an interior filled with cholesterol. The lipid portion with the associated Apo-B-100 corresponds to the low-density lipoprotein (LDL) (Berg et al Acta Path 59 (3) (1963) 369). Lp (a) is considered an independent risk factor in the development of atherosclerosis (Kostner et al, Atherosklerosis 38 (1981) 51), although the influences of the individual apoproteins have not been clarified. Apo (a) is a highly glycosylated protein which is believed to be linked to Apo-B-100 via one or more disulfide bridges (Utermann et al, J. Clin.
Invest. 80 (1987) 458, Gaubatz et al, J. Biol. Chem 258 (7) (1983) 4582; Gaubatz et al, J.D.J. Lipid Res. 28 (1987) 69; et al, W. FEBS Lett. 154 (2) (1983) 357, Seman et al, W.C. Biochem Cell Biol. 64 (1986) 999; Fless et al., J. Biol Chem 261 (19) (1986) 8712, Kraft et al., C. J. Clin Invest. 80 (1987) 458) Seman et al, l.c. found a carbohydrate content of 22.5% for Apo (a) and Fless et al., l.c. 54.1%.
Apo (a) is closely related to plasminogen. Homology was demonstrated by protein sequencing and cDNA cloning (McLean et al, Nature 300 (1987) 132). The proenzyme (zymogen) plasminogen contains 5 cysteine-rich sequences, each of 80-114 amino acids, the so-called "Kringles", which are numbered from I to V. These are protein structures which are separated by three intimate disulfide bridges between the first and sixth, the second and fourth and third and fifth cysteine can be stabilized. In addition, after the Kringle V, following the C-terminal end, a serine protease domain is contained (Utermann et al, lc).
The signal sequence contained in the plasminogen, the Kringle IV, the Kringle V and the protease domain are also present in Apo (a) with a large sequence homology to plasminogen
Kringle V of the plasminogen occurs once in Apo (a) and Kringel IV in 10 different variants (Kringle 1-10 in Apo (a)). The Apo (a) ring 2 in turn occurs in identical copies of different numbers (n = 1 to approx. 28). The resulting differences in molecular weight lead to the division of the Lp (a) and / or Apo (a) molecule into isoforms (Utermann et al, lc, Eaton et al., Proc. Natl Acad Sci USA 84 (1987) 3224) . Depending on the nomenclature, a distinction is now made between 6 and 37 isoforms (Lackner et al., J. Clin. Invest 87 (1991) 2153-2161).
The penultimate copy of Kringle IV contains another cysteine residue, which is likely to bridge Apo-B-100 (Eaton et al. Lc). Due to the large homology between the Apo (a) squirrels and Kringle IV of the plasminogen, it is assumed that Apo (a) also has lysine binding sites. This could be confirmed by column chromatography over lysine-Sepharose.
The Kringle domains of the plasminogen contain specific binding sites for fibrin, 2-antiplasmin and lysine. Kringle I to V bind lysine, with Kringle I and IV showing the greatest affinity (Eaton et al, l.c.). Kringle structural elements are found in a number of other proteins, such as, for example, B. t-PA, urokinase, thrombin, factor XII, etc. included.
The Apo (a) contains a complete protease domain. This is enzymatically inactive or cannot be cleaved by streptokinase, urokinase or t-PA like comparable protein. In the case of plasminogen, this is achieved by cleavage at Arginin560 (Arg560). In Apo (a), however, the arginine residue essential for the cleavage is replaced by serine (Eaton et al., L.c.).
The carbohydrate portion of Apo (a) is responsible for the hydrophilic properties of the protein. At approx. 45%, it is significantly higher than that of plasminogen (5%) and causes an important part of the antigenic properties of this protein. Mainly hexoses (galactose and mannose) as well as N-acetyl-D-galactosamine (GaINAc) and N can be found - Detect acetyl-D-glucosamine. In apo (a) the proportions of hexoses are approximately the same, while in LDL the mannose content is greater than that of galactose. GaINAc is represented about six times more often in the LDL than in Apo (a). The proportion of neuraminic acid can be split off by treatment with neuraminidase, which makes the molecular weight of the molecule clear
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decreases (Kraft et al., I.C., Utermann et al., J. Clin. Invest. 80 (1987) 458).
The spatial structure of Apo (a) has not yet been finally clarified. Biophysical studies are only available on recombinant apo (a) (r-apo (a)). As Philips et al, Biochemistry 32 (1993) 3722 on recombinant Apo (a) (according to Koschiensky et al, Biochemistry 30 (1991) 5044) showed, it is a protein with a Stokes radius of 94 A, which is very asymmetrical or a seems to be random coil. In the electron microscope, it could be visualized as a long, highly flexible chain that forms large, open-spiral domains. There are approx.
10% of the protein as a polymeric aggregate. The molecular weight of r-apo (a) was 500 kD (Koschinsky et al, lc), the molecular weight of human apo (a), depending on the isoform, between 280 and 800 kD. The total monomeric molecule has a length of approx. 800 A and consists of a chain of 19 flexibly connected domains with an average size of 42.1 A each.A comparison with the t-PA Kringles structure, which was elucidated by X-ray crystallography, suggests that the Apo (a) domains are are also oblate ellipsoids with an approximate dimension of 28 x 30 x 11A, which are connected by chains with an approximate length of 36 amino acids, which ensure the flexibility of the molecule (cf. Philips et al, Biochemistry 22 (1993) 3722, with pictorial representation of the structure of Lp (a)).
As already shown in other works (Chiesa et al, J. Biol. Chem 34 (1992) 24369, Lawn et al., Nature 360 (1992) 670, Breslow et al, Proc Natl Acad. Sci USA 90 (1993) 8314) Here, too, it is possible to show a non-covalent bond between Apo (a) and Apo-B-100, or the entire LDL molecule. Thus, r-apo (a) is attached to LDL with at least one kringle, but probably a few, and protrudes in compact form into the surrounding space. This bond can be broken with 50 mM 6-aminohexanoic acid and is therefore not covalent.
Rather, it seems to be of an ionic nature in principle, because the affinity decreases with increasing salt concentration. However, a covalent bond, such as that present as a disulfide bridge in vivo, does not appear to occur in vitro (Philips et al, l.c.).
Repetitive Kringle 2, like Kringle 10 to 1, has a high homology to Kringle IV of the plasminogen. In contrast to the others, Kringle 11 is similar to Kringle V of the plasminogen (Eaton et al., L.c.).
From this homology it can be deduced that free Apo (a) or Lp (a) can intervene in the fibrinolytic system (Harpel et al., Proc. Natl. Acad Sci USA 86 (1989) 3847-3851; Loscalzo et al, Ateriosclerosis 10 (1990) 240-245).
Although the plasma concentration of Lp (a) is genetically determined and therefore largely beyond medicinal and dietetic influence (Berg et al., Series Haematologica I (1968) 111), the determination of the plasma concentration is nevertheless of great diagnostic interest because concentrations of above 300 g / ml pose an increased risk of coronary heart disease (CHD) (Berg et al, Clin Genetics 8 (6) (1974) 230; et al.,
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require more detailed assessment of the classic risk factors for CHD. The appearance of free apo (a) in body fluids would be a surprising finding. Apo (a) is bound to Apo B 100 via one or more disulfide bridges.
However, these disulfide bridges are only closed in hepatic cells and, by definition (Alberts et al., The Cell (1983) 113-114), are not solved extracellularly.
According to known methods, the Lp (a) determination is carried out practically exclusively by means of immunological methods. For quantitative measurement, an enzyme immunoassay (EIA) stands in the foreground, in addition to RIA, radial immunodiffusion and nephelometry. In addition, qualitative detection of Lp (a) can be carried out with an immunoblot (Western blot). First, the antigen is gel electrophoresis (e.g. with 4 to 15% polyacrylamide on a carrier film (Molinari et al., Lp (a) Phenotyping of the Phast System-Pharmacia; 55th Annual Meeting of the European Atherosclerosis Society (EAS ), Brugge, Belgium, May 17-19, 1990); or with 4% polyacrylamide / PEG (modified according to Righetti et al., Electrophoresis 13 (1992) 587). The proteins on the gel are then placed on a suitable membrane (e.g.
Nitrocellulose) transferred (Towbin et al, Proc. Natl.
Acad Scr USA 76 (1979) 4350). The samples immobilized there can then be specifically detected with a suitable antibody-enzyme conjugate. In principle, two antigens present in Lp (a), Apo (a) and Apo B-100, are suitable for detection. The one there
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The resulting solid-phase test systems thus allow a combination of anti-apo (a) antibodies in the conjugate and on the solid phase to determine Lp (a) and the free apo (a) present at the same time, but not the differentiation between the two apo ( a) forms and the determination of free apo (a). However, if an Apo B antibody is used in the conjugate, only Lp (a) is detectable.
An opposite constellation, i.e. H. anti-Apo B on the solid phase and anti-Apo (a) in the conjugate is only of limited suitability for Lp (a) detection, since the excess of Apo B in the LDL leads to competition for binding to the solid phase antibody.
Single-phase systems such as nephelometry or turbidimetry, through the addition of anti-apo (a) antibodies, lead to the formation of measurable, light-scattering or light-clouding immune complexes and could therefore not differentiate between free and Lp (a) bound apo (a)
This also explains the discrepancy between the bound Lp (a) level and the relative risk of sclerosis of arterial vessels, taking into account the above statements, according to which it can be assumed that free apo (a) intervenes in the pathogenesis of atherosclerosis. As already mentioned above, no determination method is known for the detection of free apo (a).
Giunta et al (New York Academy of Sciences 673 (1992), pages 342-349) describe the electrophoretic separation of free apolipoprotein A1 (apo A-1), which is associated with "high-density" lipoprotein, by means of immunofixation (IFE Apo A-1 is the main apoprotein in "high density" lipoproteins and differs fundamentally from Apo (a) in Lp (a), both genetically and protein-chemically
According to Hoff et al. (Chem. Phys Lipids 67/68 (1994), pages 271-280), both plasma and plaque extracts are subjected to electrophoresis on agarose and SDS under reducing and non-reducing conditions.
The presence of lipid-free apo (a) was then checked using immunochemical methods using a polyclonal antiserum which cross-reacts with plasminogen or an anti-human apo (a) antibody.
The immunopositive band occurs after electrophoretic separation on agarose in a density fraction greater than 1.21. SDS electrophoresis (under reducing and non-reducing conditions) shows that the strongly colored immunopositive band is in the molecular weight range of human IgG, that is to say there is reactivity with human IgG or with material associated with IgG. Although it is suspected that Apo (a) fragments may have been detected that are bound to IgG, it is also speculated that the antigens used actually bind to IgG. Therefore, this document also does not contain any instructions for the determination of free Apo (a), which is neither bound to lipids nor to Apo B.
The object of the present invention is therefore to provide a method for the determination of free apoprotein (a) in a human body fluid.
This object is achieved with the subject matter of the present invention
The invention relates to a diagnostic test method for determining lipoprotein metabolic disorders or the atherogenic risk present in a patient, which is characterized in that a determination of free apo (a) in a human body fluid which contains lipids and / or contains Apo (a) bound to Apo B, is carried out.
Appropriate embodiments of this method are the subject of claims 2 to 7.
In the method according to the invention for the determination of free apo (a) in a human body fluid, the apo (a) bound to lipids is determined according to methods known per se, which are based on differences in the physical, physicochemical and / or chemical properties of the apo ( a) based on free apo (a), separated, and preferably by one of the following methods: by gel chromatography (due to the higher molecular weight of the lipid-bound apo (a)), by binding to an affinity carrier (due to that of free apo (a) different binding ability of lipids bound Apo (a) to an affinity carrier) and z. B. according to known affinity chromatography methods.
In these processes, immobilized lysine,
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immobilized proteins with final lysine, immobilized, e.g. B. chemically bound to a carrier aminocarboxylic acids, especially s-aminocarboxylic acids, amines and / or heparin used.
To separate apo (a) bound to lipids, it can also be expedient to combine one or more identical or different separation methods, in particular one or more of the separation methods mentioned above as preferred.
The present invention also relates to a method for determining free apo (a) in a human body fluid which contains free apo (a) and an apo (a) bound to lipids, which is characterized in that the free apo (a) a) determined in an immune reaction with antibodies which are directed against the free but not against the bound Apo (a).
Appropriate embodiments of this method are the subject of claims 9 and 10.
The immune reaction with the antibodies can be carried out in a manner known per se for such immune reactions. The immune reaction is preferably carried out by means of an immunoassay using suitable labeled antibodies.
The antibodies are preferably labeled by enzymes, antigens, radionuclides, fluorogens or luminogens.
Depending on the labeling of the antibodies used, the immunoassay can, for. B. after a commonly used enzyme immunoassay (EIA), in particular ELISA, or a radioimmunoassay (RIA).
The immunological blot (Western blot) method, according to which proteins are obtained from an electrophoresis gel, eg. B. after separation in a polyacrylamide gel electrophoresis transferred to an immobilizing matrix (e.g. nitrocellulose filter), which is done primarily by electrotransfer, and then detected by an immunological reaction (e.g. by radioactive or enzyme-labeled antibodies) become.
The methods according to the invention for determining free apo (a) are suitable for determining recombinant, modified and / or synthetic free apo (a), as well as for determining these apo (a) s which are present in the form of aggregates.
The method according to the invention, with which free apo (a) present in a human body fluid can be determined, is suitable for use for a meaningful determination of lipoprotein metabolism disorders and assessment of the atherogenic risk present in a patient. Free apo (a) is thought to interfere with the pathogenex of atherosclerosis, which explains the discrepancy between bound Lp (a) levels and the relative risk of sclerotherapy of arterial vessels. On the basis of the determination of the free apo (a) present in a human body fluid, a more meaningful assessment is possible compared to known determination methods.
The invention further relates to a method for determining lipoprotein metabolic disorders or the artherogenic risk present in a patient, which is characterized in that the method according to the invention for determining free apo (a) is carried out in a body fluid removed from the patient.
A blood, serum or plasma sample is preferably used as body fluid.
The following examples are intended to explain the invention in more detail without restricting the scope of the invention to these embodiments.
Examples
Preferred embodiments of the methods according to the invention, which also form the basis of the examples, for the separation of apo (a) bound to lipids and for the determination of free apo (a), and preferred combinations of these method stages, are described below.
To detect free apo (a), the apo (a) bound in Lp (a) is separated. This is preferably done via solid phase techniques (binding to an antibody that only recognizes free Apo (a)) or by separation based on the different molecular weights
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different charge and other physico-chemical properties.
For separation on the basis of different charges, electrophoresis techniques are particularly suitable, according to which, e.g. B. in SDS electrophoresis, by molecular weight, or, such as. B. in agar gel electrophoresis, can be separated after electrophoretic mobility.
In a second step, the free apo (a) is then made detectable. This is done in particular by means of suitable immunological methods. With a modified Western blot (Towbin et al, l.c.) z. B. performed the immobilization of all proteins on a nitrocellulose membrane; then z. For example, an antibody can be used which recognizes both the free and the Apo (a) bound in Lp (a). If this antibody is directly labeled (e.g.
With an enzyme), a color reaction can be used to visualize the locations on the membrane at which Apo (a) is recognized as an antigen By comparison with the reaction with an anti-Apo B antibody (which is either also direct , but can be carried out labeled with another marker enzyme, or also on a parallel blot strip), the free apo (a) can then be determined and, if desired, also quantitatively recorded by a method known per se.
To separate the lipoproteins from the plasma, lipid electrophoresis with an agar medium containing albumin is particularly important, in which lipoproteins are precipitated by polyanions in the gel (Lipidophor Immuno AG, cf. Seidel et al., Clin. Chem Acta 19/7 (1973) 737- 739, Hieland et al., Clin. Chem. Acta 19/10 (1973 1139-1141; et al., Clin. Chem. Acta 23/78 (1977) 1296-1300; Wieland et al., Internal Medicine (1978 190 -300)) suitable According to this method the Lp (a) migrates with the LDL. It has been found that free Apo (a) has a higher electrophoretic immobility and therefore appears before the Lp (a).
Detection of both apo (a) forms is possible after an (electrophoretic) transfer to a protein-binding membrane, which is preferably a nitrocellulose membrane, with an enzyme-labeled anti-apo (a) antibody, which sets in at the sites on the membrane, where the antigen was recognized, a water-insoluble substrate. In the control blot, the Apo B is displayed analogously with an antiApo B antibody. The comparison of both blots shows an area with both representable proteins and another area where only a reaction of the anti-apo (a) antibody occurred.
example 1
Performance of lipid electrophoresis
100 l of plasma are mixed with the same amount of agar medium and 10 l of the mixture are applied to the gel. The job site is then sealed with a drop of agar. After placing the gels in the filled with electrophoresis buffer (62.1% 5.5 'diethylbarbituric acid sodium salt; 29.2% sodium acetate, 8.7% citrate, pH 8.6)
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Order points are filled.
transfer
The nitrocellulose membrane (Schleicher and Schuell) wetted in blotting buffer (25 mM TrisIHCI, 0.2 mM glycine, 20% v / v methanol) is placed on the gel. The transfer takes place dry at 70 C within one hour.
development
The membrane freed from the gel is blocked for 1 h in 3% TBS / BSA and, after washing four times in 1% TBSIBSA, incubated with a polyclonal rabbit anti-apo (a) or anti-apo B-100 antibody overnight. After washing four times with 1% TBS / BSA, one incubates with peroxidase (POD) -labeled mouse anti-rabbit antibody. The blot is developed with diaminobenzidine. The comparison of the Apo (a) and Apo-B-100 blots shows the free Apo (a).
Results
The western blot of lipid electrophoresis clearly shows two bands for a CHD patient (No. 8) and only one band for the healthy plasma donor (Q 10027) that can be visualized with the anti-apo (a). With the anti-Apo B the LDL and the Lp (a) can be stained. The corresponds to
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lower staining with anti-Apo (a) and anti-Apo B with Lp (a), the upper staining with free Apo (a). The blot pattern of the plasma donor (Q10027) shows no Apo (a) band in the region of the LDL (can be stained with anti-Apo B), from which it can be concluded that the free Apo (a) in lipidophore has approximately the same electrophoretic mobility as LDL has (Fig. 1).
The
Representation of the two lipoproteins according to the Western blot from lipidophore under reducing
Conditions shows that the double banding (without -M-mercaptoethanol) is removed. The LDL (staining with anti-ApoB) remains unaffected. This can also be used as proof of free
Apo (a) are evaluated (Fig. 2)
Example 2
In order to be able to detect free apo (a), the apo (a) bound in the lp (a) is separated off.
'This can be done by molecular weight separation. Electrophoresis techniques such as SDS electrophoresis are particularly suitable for this. Here too, after the
Separation of the lipoprotein is immobilized by transfer to a protein-binding membrane and then in turn to be detected immunologically.
SDS electrophoresis is suitable as a method to detect lipoproteins from the plasma
To separate molecular weight. The Lp (a) migrates with LDL-free Apo (a) has a higher electrophoretic mobility and can therefore be found before Lp (a). The detection of both Apo (a) forms is after an (electrophoretic) transfer to a protein-forming (nitrocellulose) ) -
Membrane with an enzyme-labeled anti-apo (a) antibody possible. This puts on the
Place a water-insoluble substrate on the membrane where the antigen was recognized. in the
Control blot, the ApoB is displayed analogously with an anti-Apo B antibody. The comparison of the two blots shows an area with both representable proteins and another area to which only the anti-apo (a) antibody reacted.
Execution of electrophoresis
The samples are separated in a polyacrylamide gel (T 4.2%, C 0.8%)
Agarose solution (60%, 1.22 g in 100 ml) is added. 750 mg agarose are in 25 ml
Separating gel buffer (0.4% SDS, 1.5 mol / l TrisIHCI, Ph 8.8) and 62.5 ml distilled water. melted in a water bath (boiling) and after adding 12.5 ml of monomeric stock solution (acrylamide 30%,
N, N-methylenebisacrylamide 0.8%) cooled to 60 ° C. After adding 150 l of TEMED and 2.5 ml of a 10% ammonium persulfate solution, the solution is placed bubble-free between two preheated borosilicate glass plates. The polymerization takes place within 5-60 min.
0.5 ml of monomeric stock solution, 1.25 ml
Collection gel buffer (0.4% SDS, 0.5 mol / l TrisIHCI, pH 6.8), 3.25 ml aqua dest., 12 l TEMED and
150 l of a 10% ammonium persulfate solution mixed in order to cover the separating gel. The maximum sample volume for a gel thickness of 2.25 mm is approx. 100 l.
The electrophoresis takes about 5 hours under 25 mA const./gel in a 25 mmolll Tris / HCl, 0.2 mol / l
Glycine, 0.1% SDS, pH 8.0 electrophoresis buffer instead. As an alternative to these SDS-PAGE, the
Lipidophore gels also in a modified SDS-PAGE (modified according to Righett et al.,
Electrophoresis 13 (1992) 587).
transfer
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Methanol, 16 h, 15 C). The nitrocellulose membrane (Schleicher and Schuell) wetted in blotting buffer is placed on the gel. The transfer takes place in the anodic direction.
development
The membrane freed from the gel is blocked for 1 h in 3% TBS / BSA and, after washing four times in 1% TBS / BSA, incubated overnight with a polyclonal rabbit anti-apo (a) or anti-apo B-100 antibody. After washing four times with 1% TBS / BSA, one incubates with mouse anti-rabbit antibody labeled with peroxidase (POD). The blot is developed with diaminobenzidine. The comparison of the Apo (a) and Apo B-100 blots shows the free Apo (a).
Results
The high molecular weight antigenic band obtained with the anti-Apo (a) and the anti-Apo B antibody corresponds to the Lp (a). Both proteins are linked by a disulfide bridge, which can be cleaved with -M-mercaptoethanol under reducing conditions
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With the anti-Apo (a) antibody, another antigenic band is visible again below the Lp (a). This corresponds to the free apo (a) present in the plasma.
Example 3
In order to be able to detect free Apo (a), the techniques described in Example 1 and Example 2 can also be combined to form a two-dimensional electrophoresis. The first dimension separates with lipidophore according to electrophoretic mobility and in the second dimension according to molecular weight. Free apo (a) is again detected as described in Examples 1 and 2.
- Lipid electrophoresis with lipidophore in combination with SDS-PAGE
Lipid electrophoresis with lipidophore is carried out as described in Example 1. For SDS electrophoresis, the gels are buffered in sample buffer by inserting them for 2 x 5 minutes. After excess liquid has been removed, the gels can be polymerized on the SDS gels prepared as described in the bulk gel. As an alternative to the SDS-PAGE described above, the lipidophore gels can also be separated in a modified SDS-PAGE according to Righetti (modified according to Righetti et al., Electrophoresis 13 (1992) 587). Here, 1% PEG 20000 is then added to the stock solution instead of the agarose.
The same applies to the collective gel. The electrophoresis and the transfer and detection of the free apo (a) are carried out as described above.
development
The membrane freed from the gel is blocked for 1 hour in 3% TBSIBSA and, after washing four times in 1% TBS / BSA, with a polyclonal POD-labeled rabbit anti-apo (a) - or
AP labeled anti-Apo B-100 antibody incubated overnight. After washing four times with 1% TBS / BSA, the AP-labeled antibody is stained with neufuchsin or nitrotetrazolium blue (0.05% v / v 2 molll MgCl2, 0.001% v / v nitrotetrazolium blue, 0.002% v / v 5- bromo-4 -chloro-3-indoxylphosphate Na salt; (BCIP, Merck AG, Darmstadt, FRG) in 200 mmol / l 1% TBS / BSA or 0.04% v / v (-) - 2,3,5,6 - Tetrahydro - 6 - phenylimidazo [2, 1 - b] thiazole (levamisole), 0.02% v / v NaN02, 0.05% v / v naphthol as-bis-triphosphate in DMF, 0.005% v / v neufuchsin in 0.1 molll Tris / HCl pH 8.8). The POD content can then be demonstrated as described above. This technique allows the detection of both proteins in one step. Free Apo (a) can only be detected there with the POD reaction.
Double staining on a spot indicates the presence of both proteins (Apo (a) and Apo B).
Results
After two-dimensional electrophoresis, three spots are stained with the anti-apo (a) antibody. The anodically (1. dimension = lipidophore #) migrated, immunologically displayed proteins correspond to Lp (a) with the highest molecular weight, and those with lower molecular weight as a clear double band correspond to the two isotypes of free Apo (a).
The cathodically stainable Apo (a) spots have no Lp (a) above them, so that they can be clearly identified as free Apo (a).
Here it can be stated that the apo (a) occurs freely in the plasma on the one hand, but on the other hand there is also a form that gives the apo (a) together with the apo B (without covalent binding to the latter) the same electrophoretic mobility in lipidophore.
By reducing the proteins after separation into lipidophore (FIG. 3), the Lp (a) spot disappears and only Apo (a) and Apo B are visible in the spots typical for the respective molecular weight (FIG. 4).
Example 4
In order to be able to detect free apo (a), the apo (a) bound in the lp (a) is separated off.
This is done here by separation by molecular weight using gel filtration. The free apo (a) has a lower molecular weight and thus elutes under suitable chromatography conditions (dextran Superdex 200 XK covalently bound to strongly crosslinked agarose beads), flow rate 7.5 ml / cm2 / h (200 mmolll Tris / HCl, pH 8, 0) later than the apo (a) located in Lp (a) Detection is possible with suitable enzyme or radioimmunoassays, whereby an anti-apo (a) antibody (IMMUNOZYM Lp (a ) from Immuno) can be used.
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Implementation of gel filtration
The samples are gel filtered using Superdex 200 XK (Pharmacia, Uppsala, Sweden).
Approx. 2.5 ml sample is applied according to the column size (26/70). The separation
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Evidence in the EIA
The quantitative determination of Lp (a) is carried out using a commercial one-step Lp (a) ELISA according to the sandwich principle IMMUNOZYM Lp (a) ELISA (IMMUNO GmbH, Heidelberg, FRG). Apo (a) is detected with an Anti Apo (a) -Fab-POD conjugate. The five calibrators used have concentrations of 0.150, 300.500 and 800 g / ml Lp (a), the internal quality controls of 320-480 and 160-250 g / ml. The standards and controls are available as lyophilisate and must be reconstituted with incubation / washing buffer A Tris / HCl buffer pH 8.4 with non-ionic polyalkylene glycols based on block polymers of ethylene and propylene oxide (Pluronic as detergent forms the incubation / washing buffer. The buffer used for the substrate reaction is an acetate buffer (pH 5/0) with H202.
Tetramethylbenzidine in ethanol / DMSO is used as the substrate. The reaction is stopped with 2 molll of sulfuric acid. The extinctions are then determined with an ELISA reader and evaluated on the connected computer.
Results
Protein which has apo (a) antigenicity in the EIA elutes both in the exclusion volume and in the inner volume. With the separation matrix used, the complete Lp (a) can only be found in the exclusion volume. It is therefore obvious that the apo (a) antigen is present as free or unbound apo (a) (FIG. 5).
Example 6
In order to be able to detect free apo (a), the apo (a) bound in Lp (a) must be separated. This is done here by the separation according to lysine binding ability. The free apo (a) has the ability to bind lysine, which is expressed in the binding of apo (a) to three-dimensionally cross-linked agerose with a-NH2-bound lysine residues (lysine-Sepharose). Under suitable chromatography conditions (0.05 mol / l PB, pH 7.5, elution with a linear ¼-aminocaproic acid gradient), free apo (a) elutes later than the apoprotein in Lp (a).
Detection is possible with suitable enzyme or radioimmunoassays which contain an anti-apo (a) antibody (IMMUNOZYM Lp (a) from the company both on the solid phase and in the conjugate.
Immuno AG) can use.
Performing affinity chromatography
The Lp (a) -containing sample is diluted (1: 5) with application buffer before application to the column (lysine-Sepharose, 4B, C 16/40, Pharmacia, gel volume 16 ml). After washing with application buffer, elution is carried out using a linear s-aminocaproic acid gradient (e-ACA). The regeneration is carried out with at least 3 column volumes of washing buffer (1 mol / l NaCl, 0.5 mol / l e-aminocaproic acid, 0.05 mol / l PB, pH 7.5). The flow rate is 30 ml / cm2 / h. The course of the chromatography is monitored with a flow photometer with a connected recorder.
Evidence in the EIA
Evidence in the EIA is as described in Example 4.
Results
Under suitable application conditions as described above, the apo (a) bound in Lp (a) does not bind to lysine-Sepharose and can be detected in the run by means of EIA. Free apo (a) can then be eluted with e-ACA (FIG. 6).
Example 6
Ew describes the specific detection of Apo (a) without prior separation of Lp (a) in the enzyme immunoassay. For this purpose, an antibody is made available which is able to differentiate between the two forms. Such an antibody can only recognize regions on the apo (a) which, for example, change after the binding of apo (a) to apo B or are no longer sterically accessible. In the test, it is sufficient if an antibody with these properties is used on the solid phase.
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Antibody production
Antibodies that specifically recognize free Apo (a) can be generated, for example, by targeted immunization with protein fragments. The protein fragments can be obtained by enzymatic or chemical degradation of Apo (a) by genetic engineering expression or in the form of synthetic peptides. Such antibodies can also be obtained by careful purification of an anti-apo (a) polyclonal plasma via affinity chromatography. All antibodies that recognize Lp (a) are removed and antibodies that recognize free Apo (a) are enriched.
Test setup (a) Quantitative determination of free apo (a) For the quantitative determination of free apo (a), microtiter plates are coated with an antibody which specifically recognizes free apo (a) and no Lp (a). The test can be set up as a simultaneous or successive two-sided binding assay.
An anti-apo (a) antibody is used as conjugate, which, in addition to apo (a), can also recognize Lp (a) (b) Determination of the Lp (a) / Apo (a) ratio
For a quantitative determination of the ratio of bound to free apo (a), microtiter plates are coated with an anti-Lp (a) antibody, which recognizes both forms. After the sample incubation, detection is carried out with two different conjugates and their corresponding substrates, namely with one Anti-Apo B-AP conjugate for the quantification of complete Lp (a), and with an anti-Apo (a) -POD conjugate for the quantification of free Apo (a).
In the figures:
FIG. 1 Western blot from the lipidophore representation of Apo B and free Apo (a) in a CHD patient (No. 8) and donor (Q10027) (see Example 1);
Figure 2 means western blot of lipidophore; Representation of the Apo (a) and Apo B from plasma of the donor (Q10027) under reducing and non-reducing conditions;
FIG. 3 shows Western blot after two-dimensional electrophoresis: first dimension lipidophore, second dimension PAA-agarose gel electrophoresis according to Molinari under non-reducing conditions (sample from a CHD patient (No. 8)); FIG. 4 shows Western blot after two-dimensional electrophoresis.
First dimension lipidophore, second dimension PAA agarose gel electrophoresis according to Molinari under reducing conditions (sample from a CHD patient (No. 8)); FIG. 5 shows an elution diagram of the Lp (a) isolation via gel filtration with Superdex 200 XK with plasma from a donor (Q10027), namely the course of the Apo (a) content after the isolation of an ultracentrifugate; and FIG. 6 shows the elution diagram of the affinity chromatography of the ultracentrifugate from donor plasma (Q10027) over lysine-Sepharose.
PATENT CLAIMS:
1. Diagnostic test method for determining lipoprotein metabolic disorders or the atherogenic risk present in a patient, characterized in that a determination of free apo (a) of a human body fluid which contains an apo bound to lipids and / or to apo B ( a) contains, carries out.