DE4432563C2

DE4432563C2 - Verwendung von amphiphilen Anionen zur Verminderung der Zytostatika-Resistenz durch Hemmung des durch das MRP-Protein vermittelten Membrantransports

Info

Publication number: DE4432563C2
Application number: DE19944432563
Authority: DE
Inventors: Gabriele Jedlitschky; Dietrich Prof Dr Keppler; Inka Leier
Original assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Current assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Priority date: 1994-09-13
Filing date: 1994-09-13
Publication date: 1997-07-24
Anticipated expiration: 2014-09-14
Also published as: DE4432563A1

Description

In der Tumorforschung stand man bisher vor dem Problem, daß einige Tumorarten nur sehr schlecht auf Zytostatika reagieren und man häufig von einer Zytostatika resistenz ausgehen mußte.

Die Zytostatikaresistenz ist ein bekanntes Phänomen in der Krebstherapie. So ist in der WO 94/06938 ein Verfahren beschrieben, die Mehrfachresistenz gegen Zytostatika in Krebszellen herabzusetzen. Dies geschieht durch den Einsatz von Protein-Kinase-Inhibitoren, um die Induktion des MDR1-Gens durch Chemothera peutika zu verhindern und die Ausschüttung von P-Glykoprotein zu beeinflussen.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung bestand nun darin, Mittel zu finden, um die Zytostatikaresistenz zu vermindern.

Es wurde von den Erfindern gefunden, daß ein Membranprotein, das den ATP-ab hängigen Transport von bestimmten Konjugaten, wie z. B. Glutathion-S-Kon jugaten, vermittelt, mit der Zytostatikaresistenz bestimmter Tumoren assoziiert ist. Dieses Membranprotein wird "Multidrug resistance-associated protein" oder abge kürzt "MRP" genannt. Die Überexpression dieses Proteins in Tumorzellen ist für die Resistenz vieler Tumorzelltypen gegen Zytostatika verantwortlich. Die Funktion des MRP-Proteins als Konjugat-Transporter wurde von den Erfindern entdeckt.

Die Resistenz der Tumorzelltypen gegen Zytostatika kommt dadurch zustande, daß in der Tumorzelle die Zytostatika z. B. in Glutathion S-, Glucuronsäure- oder Sulfat- Konjugate umgewandelt werden und dann durch das MRP-Protein erkannt werden und wieder aus der Zelle, ohne ihre Wirkung entfaltet zu haben, heraustransportiert werden.

Von den Erfindern wurde die Funktion von MRP aufgeklärt und es wurden Sub strate für MRP identifiziert. Es stellte sich heraus, daß amphiphile Anionen, die lipophile Verbindungen mit negativer Ladung sind und ein Molekulargewicht von 300-950 Dalton haben, Substrate für das MRP darstellen und dessen Fähigkeit, Zytostatika wieder aus der Tumorzelle herauszutransportieren, hemmen. Insbeson dere sind dies Verbindungen, die in der Regel Konjugate von lipophilen Verbindun gen mit anionischen Gruppen, wie z. B. mit Cysteinyl-, Carboxyl-, Cysteinylglycin-, Glutathion S-, Glururonsäure- oder Sulfatgruppen, sind. Als natürlich im Körper vorkommende Substrate für das MRP-Protein wurden das Glutathion S-Konjugat Leukotrien C₄ sowie die Leukotriene D₄ und E₄ identifiziert. Aus diesem Grund stellen zu den Leukotrienen C₄, D₄ und E₄ (LTC₄, LTD₄, LTE₄) strukturverwandte Stoffe wirksame Hemmstoffe für MRP dar. Als mit den Leukotrienen strukturver wandte Stoffe kommen z. B. Cysteinyl-Leukotrien-Rezeptorantagonisten in Frage. Unter diesen Rezeptorantagonisten, die mit C₄-, D₄- und E₄-Leukotrien-Rezeptoren reagieren, sollen auch zu den Rezeptorantagonisten strukturell verwandte Ver bindungen verstanden werden. Durch die Verwendung dieser Hemmstoffe kommt es zu einer Hemmung von MRP und dadurch zu einer drastischen Herabsetzung der Zytostatika-Resistenz in Tumoren, z. B. bei Bronchialkarzinomen und Leukämien.

Als Leukotrien-Rezeptorantagonisten kommen alle diejenigen in Frage, die bisher mit der Bronchodilatation bei Asthma in Verbindung gebracht worden waren, z. B. MK571 (erhältlich von der Firma Merck Sharp Dohme).

Die Applikation der Hemmstoffe kann durch alle denkbaren Applikationsmethoden erfolgen, bevorzugt ist jedoch die orale Verabreichung oder ganz bevorzugt die in travenöse Infusion.

Wieviel Hemmstoff zur Hemmung des MRP-Proteins notwendig ist, ist je nach verwendetem Hemmstoff unterschiedlich. Allgemein sollte die Konzentration am Wirkort 0,1-10 mikromolar sein bzw. es sollten 0,5-50 mg Hemmstoff/kg Körper gewicht des Patienten verabreicht werden. Bevorzugt ist eine Wirkort-Konzen tration von 0,5-7 mikromolar, ganz bevorzugt zwischen 1 und 5 mikromolar bzw. es sollten bevorzugt 1-20 mg Hemmstoff/kg Körpergewicht, ganz bevorzugt 5-15 mg Hemmstoff/kg Körpergewicht verabreicht werden.

Durch die Anwendung der Hemmstoffe ist es weiterhin möglich, das MRP-Protein, das als Transporter wirkt, an Zellen und Membranen direkt zu messen und Aus sagen darüber zu treffen, wie es zur Zytostatika-Resistenz kommt bzw. wie einer solchen entgegengewirkt werden kann. Durch diese Messungen lassen sich auch andere Hemmstoffe identifizieren. Dies geschieht bevorzugt mit einem Testsystem, das Membranvesikel und als Substrate für das MRP-Protein ATP und radio aktiv markiertes Leukotrien C₄, D₄ und/oder E₄ enthält. Die radioaktive Markierung der Leukotriene erfolgt bevorzugt über Markierung mit ³H. Wird zu diesem Testsy stem ein Hemmstoff-Kandidat hinzugegeben, kommt es in den meisten Fällen zu einer Kompetitions-Reaktion zwischen dem markierten Leukotrien und dem Hemm stoff-Kandidaten. Durch Auswertung des Ausmaßes der Kompetition kann eine Aus sage über die Stärke des Hemmstoffs bzw. überhaupt über dessen Eignung als Hemmstoff getroffen werden. Die Durchführung des Tests erfolgt analog zu Beispiel 2 in Verbindung mit den Fig. 1 und 4.

Die Erfindung wird anhand der anhängenden Figuren näher beschrieben, wobei

Fig. 1 den ATP-abhängigen Transport von [³H]LTC₄ (links) und S-(2,4-Dini trophenyl)-[³H]glutathion (rechts) durch Membranvesikeln von MRP-über exprimierenden HL60/ADR-Zellen und Kontroll-Zellen (Zytostati ka-sensitive parentale Zellen sowie Revertanten) zeigt;

Fig. 2 [³H]LTC₄-bindende Proteine und immunoreaktives MRP in Membranen von HL60/ADR-Zellen (A), revertanten HL60-Zellen (B) und parenta len, Cytostatika-sensitiven HL60-Zellen (C) zeigt. Ganz oben ist der Nachweis von MRP durch Immunoblot gezeigt, darunter die Moleku largewichte von Standardproteinen nach elektrophoretischer Tren nung und unten der Einbau von [³H]LTC₄ nach Photoaffinitätsmarkie rung und Trennung durch SDS-Polyacrylamid-Elektrophorese. Die Unterdrückung der [³H]LTC₄-Markierung von HL60/ADR-Membranen durch den Transporthemmstoff MK571 ist in der linken Abbildung (A) gezeigt;

Fig. 3 8-Azido[α-³²P]ATP-bindende Proteine in Membranen von HL60/ADR- Zellen und revertanten, Zytostatika-sensitiven Zellen zeigt;

Fig. 4 Hemmung des ATP-abhängigen Transports von LTC₄ durch den Leukotrien-Rezeptorantagonisten MK571 zeigt. Die Hemmung wird in doppelt-reziproker Darstellung (nach Lineweaver und Burk) gezeigt. Membranvesikel von MRP-überexprimierenden Zellen wurden hierbei in Gegenwart von ATP und LTC₄ über 2 Minuten bei 37°C inkubiert. Ohne den Hemmstoff (O) findet sich eine hohe Transportaktivität, wie auch in Abb. 1 (links) gezeigt. In Gegenwart des Hemmstoffs MK571 (5 mikromolar) ist der Transport weitgehend gehemmt. Der Hemmtyp ist kompetitiv. Die Hemmkonstante (K_i) beträgt 0,6 mikro molar.

Die Erfindung wird nun anhand der Beispiele weiter erläutert.

BEISPIEL 1 Präparation von Membranvesikel

HL60/ADR-Zellen (in Adriamycin gewachsene menschl. Leukämiezellen, die MRP überexprimieren) bzw. revertante HL60-Zellen bzw. parentale HL60-Zellen wurden nach Kultivierung in Zellkultur durch Zentrifugation geerntet und Plasmamem branvesikel wurden gemäß Standardmethoden präpariert. In Kürze beschrieben, heißt dies, daß die Zellen durch Inkubation in hypotonischem Puffer (0,5 mM Natriumphosphat (pH 7,0), 0,1 mM EDTA ergänzt mit Protease-Inhibitoren) für 1,5 Std. lysiert wurden, gefolgt von einer Homogenisation in einem Homogenisator. Nach Zentrifugation des Homogenats bei 12.000 × g (10 Min., 4°C) wurde der Überstand davon bei 100,000 × g für 45 Min. bei 4°C zentrifugiert. Das sich ergebende Pellet wurde in Inkubationspuffer (250 mM Sucrose-10 mM Tris-HCl, pH 7,4) homogenisiert und über 38% Sucrose in 5 mM 4(2-hydroxyethyl)-1-pi perazinethansulfonsäure/KOH, pH 7,4 geschichtet. Nach Zentrifugation bei 280,000 × g für 2 Stunden bei 4°C wurde die Interphase gesammelt, durch Zentrifugation in Inkubationspuffer (100,000 × g) gewaschen und 20 mal durch eine 27-gauge Nadel gedrückt. Die sich ergebenden Membranvesikel hatten eine angereicherte Plasmamembran mit mäßiger Kontamination durch endoplasmati sches Retikulum und Golgi-Apparat.

BEISPIEL 2 AtP-abhängiger Transport

Der AtP-abhängige Transport von [³H]LTC₄ und S-(2,4-dinitrophenyl)[³H]glutathion in Membranvesikel wurde durch schnelle Filtration gemessen. Membranvesikel (50 µg Protein) wurden in der Anwesenheit von 4 mM ATP, 10 mM MgCl₂, 10 mM Kreatininphosphat und das markierte Substrat in einem Inkubationspuffer enthal tend 250 mM Sucrose und 10 mM Tris-HCl, pH 7,4 inkubiert. Das Endvolumen war 110 µl. Aliquots von 20 µl wurden zu vorgebenen Zeiten abgenommen und in 1 ml eiskaltem Inkubationspuffer verdünnt. Die verdünnten Proben wurden sofort durch eine Nitrocellulosemembran (0,2 µm Porengröße) filtriert, in Inkubations puffer unter Verwendung einer Schnellfiltrationseinrichtung voreingeweicht und zweimal mit 5 ml Inkubationspuffer gespült. Die Filter wurden in Flüssigkeit gelegt und in einem Flüssig-Szintillationszähler vermessen. In einem Kontrollexperiment wurde ATP durch eine gleiche Konzentration 5′-AMP ersetzt. Alle Werte des ATP-ab hängigen Transports wurden durch Subtraktion der Werte, die mit 5′-AMP erhalten worden waren, von denen, die mit ATP gemessen worden waren, erhal ten.

Der aktive ATP-abhängige Transport von [³H]LTC₄, welcher in die Fraktion der "Inside-out"-orientierten Partikel stattfand, wurde während eines Zeitraums von 3 Minuten untersucht (Fig. 1). Mit Vesikeln aus den parentalen sowie den revertanten Zellen, welche beide eine geringe MRP-Expression zeigten, war die Rate des ATP-ab hängigen Transports von [³H]LTC₄ bei der Standardkonzentration von 50 nM unterhalb von 1 pmol × mg Protein^-1 × min^-1. Die HL60/ADR-Zellen, welche MRP überexprimierten, zeigten einen schnellen ATP-abhängigen Transport von LTC₄ (50 nM) bei einer anfänglichen Transportrate von 25 ± 2 pmol × mg Protein-^-1 × min^-1 (Fig. 1). Die Menge des durch die Vesikel aufgenommenen [3H]LTC₄ wurde durch das Anwachsen der Osmolarität des extravesikulären Mediums deutlich verringert. Dies bedeutet, daß [³H]LTC₄ in den intravesikulären Raum transportiert wurde.

Aus dem rechten Teil von Fig. 1 sieht man, daß der ATP-abhängige Transport von S-(2,4-Dinitrophenyl)-[³H]glutathion bei einer Konzentration von 5 µM im Falle von HL60/ ADR-Membranen 50 ± 4 pmol × mg Protein^-1 × min^-1 war. Die Transportrate der revertanten und parentalen HL60-Zellen war zehnfach niedriger.

Aus Fig. 4 sieht man weiter, daß der Rezeptorantagonist MK571 ein potenter Inhibitor des ATP-abhängigen LTC₄-Transports ist.

BEISPIEL 3 Photoaffinitätsmarkierung

Vesikelsuspensionen (200 µg Protein) wurden mit 74 kBq [³H]LTC₄ (150 nM) bei 37°C für 10 Minuten inkubiert, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei 300 nm für 5 Minuten bestrahlt. Für Kompetitionsstudien wurden die Vesikelpräparatio nen mit 50 µM MK571 für 30 Minuten bei 4°C vorinkubiert. Die Photoaffinitäts markierung mit 370 kBq 8-Azido-[α-³²P]ATP (10 µM) wurde auf ähnliche Weise wie oben ausgeführt, und zwar durch Inkubation für 2 Minuten bei 4°C und Bestrah lung bei 350 nm für 10 Minuten.

LTC₄-bindende Membranproteine wurden durch direkte Photoaffinitätsmarkierung unter Verwendung von [³H]LTC₄ als photolabilen Ligand nachgewiesen. Ein merk licher Unterschied im [³H]LTC₄-Markierungsmuster der Membranen der verschiede nen Zellinien wurde bei einem Molekulargewicht von 190 kDa (Fig. 2) beobachtet. Bei den HL60/ADR-Membranen wurde ein überwiegendes 190 kDa-Protein mar kiert (Fig. 2A), während bei den Membranen der revertanten und parentalen Zellen nur eine schwache Markierung in diesem Bereich gefunden wurde (Fig. 2B, 2C). Die [³H]LTC₄-Markierung des 190 kDa-Proteins wurde durch den Transport-Inhibi tor MK571 kompetitiv unterdrückt (Fig. 2A). Ein anderes signifikant markiertes Protein von 110 kDa wurde in den Membranen aller drei Zellinien beobachtet.

Auch die Photoaffinitätsmarkierung mit 8-Azido-[α-³²P]ATP zeigte eine stark markierte Bande eines 190 kDa-Proteins bei den Membranen aus HL60/ADR- Zellen, aber nicht bei den revertanten oder den parentalen Zellmembranen (Fig. 3).

Insgesamt konnte der Beweis erbracht werden, daß MRP das [³H]LTC₄-bindende Protein ist und durch Rezeptorantagonisten, wie z. B. MK571, gehemmt werden kann.

Claims

1. Verwendung von amphiphilen Anionen mit einem Molekulargewicht von 300-950 Dalton zur Verminderung der Zytostatika-Resistenz, wobei der durch das MRP-Protein vermittelte Membrantransport gehemmt wird.

2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die amphiphi len Anionen Konjugate lipophiler Verbindungen mit anionischen Gruppen ausgewählt aus Carboxyl-, Glucuronsäure-, Glutathion S-, Sulfat- und Cysteinylglycingruppen sind.

3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß zu den Leukotrienen C₄, D₄ bzw. E₄ strukturverwandte Stoffe als Hemmstoffe des MRP-Proteins eingesetzt werden.

4. Verwendung nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß Cysteinyl-Leukotrien-Rezeptorantagonisten und dazu strukturell verwandte Verbindungen als Hemmstoffe des MRP-Proteins eingesetzt werden.

5. Verwendung nach einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß der Hemmstoff in einer Konzentration von 0,5-50 mg/kg Körpergewicht des Patienten eingesetzt wird.

6. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration des Hemmstoffs am Wirkort 0,1-10 mikromolar ist.